CN117886803A - N-乙酰神经氨酸半抗原、n-乙酰神经氨酸半抗原人工抗原及其制备方法 - Google Patents

N-乙酰神经氨酸半抗原、n-乙酰神经氨酸半抗原人工抗原及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种N‑乙酰神经氨酸半抗原，其特征在于，其结构式如下：或：Chemical Formula：C27H8N5O11Molecular Weight：578.385所示结构式为N‑乙酰神经氨酸半抗原。上述N‑乙酰神经氨酸半抗原通过酰胺键与蛋白载体偶联，获得N‑乙酰神经氨酸人工抗原。

Description

N-乙酰神经氨酸半抗原、N-乙酰神经氨酸半抗原人工抗原及 其制备方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种N-乙酰神经氨酸半抗原和利用该半抗原制备N-乙酰神经氨酸人工抗原，及半抗原和人工抗原的制备方法。
背景技术
N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)是最常见的一种唾液酸(Sialic acid，SA)，为大脑神经节苷脂的重要组成部分，对大脑中信息的传递和存储起着至关重要的作用。N-乙酰神经氨酸参与许多生理和病理过程，例如细胞识别、细胞粘附、受精、病毒入侵和肿瘤发生。其作为食品补充剂的成分，具有耐受性良好没有明显副作用的特点；N-乙酰神经氨酸还具有抗氧化活性，可以渗透角质层并作用于黑色素细胞，达到美白效果；此外，N-乙酰神经氨酸作为一个关键的前体可用于生产一些抗流感病毒药物和靶向癌症治疗。N-乙酰神经氨酸因其多功能的生物学特性在食品、化妆品、和制药行业具有巨大的应用前景。因此寻找合适的N-乙酰神经氨酸含量测定方法，不仅可为评估正常和病理的细胞过程提供指导，也为食品功能因子分析提供依据。
目前，测定N-乙酰神经氨酸含量常用方法包括放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫分析法(ELISA)、液-质联用(HPLC-MS)和传感器检测法等方法。其中，免疫学检测方法在小分子分析物半定量检测上具有独一无二的优势，其成本低，灵敏度高，特异性强，一次性可同时分析的样本多，弥补了传统仪器分析的不足，更重要的是，对样本处理方法和操作上都较为简单，检测过程中抗基质性强。
归根到底，影响免疫学检测方法的决定性因素是抗原抗体特异性结合亲和的问题，尤其对于小分子来说，半抗原的修饰水平直接决定了抗体的灵敏度与特异性。因此，半抗原的设计与合成是产生特异性抗体和建立免疫学检测方法的前提，也是最关键、最重要的步骤
发明内容
本发明的目的是提供一种N-乙酰神经氨酸半抗原、一种N-乙酰神经氨酸人工抗原及制备方法。
本发明N-乙酰神经氨酸的人工抗原是在N-乙酰神经氨酸半抗原基础上得到的。
一种N-乙酰神经氨酸半抗原，其结构式如下所示：
Chemical Formula：C27H8N5O11
Molecular Weight：578.385
具体的，本发明的第一个目的是提供一种N-乙酰神经氨酸半抗原、N-乙酰神经氨酸人工抗原制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将己二酸半醛甲酯259μL、NaCNBH30.135 mg和乙酸100μL添加到含2-硝基-1,4-苯二胺(250mg，1.63mM)的MeOH中。室温下搅拌2-3小时待反应混合物蒸发，加入NaCl，用Et2O萃取，干燥并浓缩，通过硅胶色谱法纯化，得到6-(4-氨基-3-硝基-苯基氨基)己酸甲酯(化合物A)；
(2)在步骤(1)中得到的12mg的化合物A中加入盐酸(11μL，0.128mM)和钯-活性炭5mg一起溶解在THF-EtOH体积比为3：1的溶液中。用Ar和H2洗涤反应混合物，氮气保护下放置2小时，离心去除钯-活性炭，浓缩混合物获得邻苯二胺衍生物6-(3,4-二氨基-苯基氨基)己酸甲酯(化合物B)；
(3)取20mg步骤(2)得到的化合物B溶于10mL的乙酸中，加入β-巯基乙醇700μL、Na2S2O425 mg和N-乙酰神经氨酸6mg混合并加热至50℃，反应2小时，将反应混合物冷却至室温并浓缩，通过C18 Sep-Pak柱进行纯化。用H2O-MeCN体积比10：1洗脱产物并浓缩得到喹喔啉酮-N-乙酰神经氨酸(化合物C)；
(4)将5.3mg步骤(3)得到的化合物C溶于NaOH(30mL，30mM)中，并在室温下搅拌30分钟后用1M盐酸中和并浓缩，通过C18 Sep-Pak柱纯化并浓缩得到6-(3,4-二氨基-苯基氨基)己酸唾液酸(化合物D)；
(5)将1.0mg步骤(4)得到的化合物D与TSTU(0.9mg，2.94μM)一起加入到含二戊烷1mL、DMF 1mL和H2O 0.5mL的溶液中，待反应完全后旋转蒸发掉DMF，残余产物通过C18-SepPak柱浓缩和纯化，得到N-乙酰神经氨酸半抗原；
(6)将半抗原9mg溶于pH 7.4的PBS(0.5mL，0.1M)中，然后加入0.5mL BSA溶液，室温放置过夜，使用离心过滤器纯化得到N-乙酰神经氨酸人工抗原，用H2O洗涤两次并冻干，于-20℃待用。
除BSA外，所用载体蛋白还可以是OVA、KLH、HAS、BTG、MSA、RSA、PDL当中的任意一种。
本发明的第二个目的是提供一种抗N-乙酰神经氨酸抗体制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)N-乙酰神经氨酸人工抗原合成，其中，免疫抗原采用N-乙酰神经氨酸和BSA偶联合成，检测抗原采用N-乙酰神经氨酸和OVA合成，即所述N-乙酰神经氨酸人工抗原通过上述方法制备得到；
(2)制备抗N-乙酰神经氨酸人工抗原的特异性抗体，其中，向蛋鸡体内注射所述发明目的一得到的免疫抗原，收集所述禽类所生产的鸡蛋，并做标记于4℃保存；
(3)提取IgY，其中，从上述收集的鸡蛋中分离卵黄和卵清后，提取IgY多克隆抗体。
需要说明的是，所述制备免疫球蛋白方法如下：用N-乙酰神经氨酸人工抗原向16周龄产蛋鸡进行初次免疫注射，免疫抗原剂量为300μg，采用胸肌多点注射免疫；初次免疫后14天进行第二次免疫，免疫抗原剂量为250μg，二次免疫后14天进行第三次免疫，免疫抗原剂量为250μg；三次免疫后14天进行第四次免疫，免疫抗原剂量为250μg。
需要说明的是，所述提取IgY的方法如下：
(1)将所述收集的鸡蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS按照体积比1：2进行稀释；
(2)向稀释液加入质量体积比为3.5％的PEG6000，摇床上200rpm室温反应30-60分钟；
(3)将上述混合液离心，用滤纸过滤收集上清，滤液加入质量体积比为8.5％的PEG6000，摇床上200rpm室温反应30-60分钟；
(4)将混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10mL的PBS悬浮，加入质量体积比为12％的PEG6000，摇床上200rpm室温反应30分钟后10000rpm离心10-15分钟，获得沉淀物；
(5)将所述沉淀物使用2mL PBS溶解后，使用透析袋进行透析，使用PBS透析过夜，获得IgY抗体并保存在-20℃备用。
需要说明的是，所述PBS的pH值为7.2-7.4。
本发明的第三个目的是建立一种用于检测食品、化妆品、医疗制品等中N-乙酰神经氨酸含量的间接竞争酶联免疫检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)包被：100ng/mL的BSA偶联物100μL每孔，4℃过夜后弃去孔内液体用PBS-T洗板3次；
(2)封闭：5％脱脂奶粉200μL每孔封闭，37℃孵育2小时后弃去孔内液体，洗板；
(3)加一抗和标准品稀释液：在偶联物预包被的酶标板中加入1：80000的一抗和标准品稀释液各50μL，4℃孵育40分钟后弃去孔内液体，洗板；
需要说明的是，所述N-乙酰神经氨酸标准品的制备是用PBS稀释半抗原至不同浓度。
(4)加酶标二抗：加入稀释比为1：5000的兔抗鸡酶标二抗100μL每孔，37℃孵育40分钟后弃去孔内液体，洗板；
(5)显色与读数：每孔加入TMB底物液100μL显色，37℃反应15-20分钟后每孔加硫酸(50μL，2M)终止反应，在450nm波长处用酶标仪测吸光度值；
(6)计算与判定：各标准品的平均吸光值，除以0ng/mL时的吸光度，乘以100％即可得到各标准品对应吸光度的百分比即B/B0。然后以各标准品吸光度的比值为纵坐标，以不同浓度的N-乙酰神经氨酸的log值为横坐标绘制曲线，即可得到该间接ELISA的竞争抑制率曲线，并得出该曲线的线性范围和半抑制率IC50。
在本发明的一个具体实施方式中，所述待测样品中N-乙酰神经氨酸含量是根据标准曲线计算获得。
本发明的第四个目的是提供一种用于检测N-乙酰神经氨酸含量的ic-ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括：包被抗原、一抗、酶标二抗、N-乙酰神经氨酸标准品、信号试剂等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述包被抗原是纯化的N-乙酰神经氨酸偶联载体蛋白后所得的人工抗原。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述一抗是抗N-乙酰神经氨酸多克隆IgY抗体。
在本发明的另一个具体实施方式中，优选地，所述酶标二抗是兔抗鸡IgG-HRP。
本发明的有益效果是：
本发明的检测试剂盒将多克隆抗体技术与间接竞争酶联免疫检测技术相结合，具有快速、灵敏、准确、稳定等特点，具有良好的特异性、准确性、灵敏度、精密度和可靠性，线性关系好，线性范围广。本试剂盒可用于N-乙酰神经氨酸保健品、化妆品、临床样品等的快速、批量检测，具有极为重要的应用价值。
与现有技术相比，本发明所开发的N-乙酰神经氨酸抗原具有较高的免疫原性，产生的抗体特异性和灵敏度高，检测效果好，制备该抗原的方法步骤简单、便捷。
附图说明：
图1：合成N-乙酰神经氨酸人工抗原的反应方程式；
图2：N-乙酰神经氨酸人工抗原紫外分光光谱图；
图3：纯化N-乙酰神经氨酸抗原SDS-PAGE电泳图；
图4：N-乙酰神经氨酸人工抗原的结构式；
图5：纯化抗N-乙酰神经氨酸IgY抗体SDS-PAGE电泳图；
图6：间接ELISA竞争抑制率曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：一种N-乙酰神经氨酸人工抗原的合成包括以下步骤：
(1)将己二酸半醛甲酯259μL、NaCNBH30.135 mg和乙酸100μL添加到含2-硝基-1,4-苯二胺(250mg，1.63mM)的MeOH中。室温下搅拌2-3小时待反应混合物蒸发，加入NaCl，用Et2O萃取，干燥并浓缩，通过硅胶色谱法纯化，得到6-(4-氨基-3-硝基-苯基氨基)己酸甲酯(化合物A)；
(2)在步骤(1)中得到的12mg的化合物A中加入盐酸(11μL，0.128mM)和钯-活性炭5mg一起溶解在THF-EtOH体积比为3：1的溶液中。用Ar和H2洗涤反应混合物，氮气保护下放置2小时，离心去除钯-活性炭，浓缩混合物获得邻苯二胺衍生物6-(3,4-二氨基-苯基氨基)己酸甲酯(化合物B)；
(3)取20mg步骤(2)得到的化合物B溶于10mL的乙酸中，加入β-巯基乙醇700μL、Na2S2O425 mg和N-乙酰神经氨酸6mg混合并加热至50℃，反应2小时，将反应混合物冷却至室温并浓缩，通过C18 Sep-Pak柱进行纯化。用H2O-MeCN体积比10：1洗脱产物并浓缩得到喹喔啉酮-N-乙酰神经氨酸(化合物C)；
(4)将5.3mg步骤(3)得到的化合物C溶于NaOH(30mL，30mM)中，并在室温下搅拌30分钟后用1M盐酸中和并浓缩。通过C18 Sep-Pak柱纯化并浓缩得到6-(3,4-二氨基-苯基氨基)己酸唾液酸(化合物D)；
(5)将1.0mg步骤(4)得到的化合物D与TSTU(0.9mg，2.94μM)一起加入到含二戊烷1mL、DMF 1mL和H2O 0.5mL的溶液中，待反应完全后旋转蒸发掉DMF，残余产物通过C18-SepPak柱浓缩和纯化，得到N-乙酰神经氨酸半抗原；
(6)将半抗原9mg溶于pH 7.4的PBS(0.5mL，0.1M)中，然后加入0.5mL BSA溶液，室温放置过夜，使用离心过滤器纯化得到N-乙酰神经氨酸人工抗原，用H2O洗涤两次并冻干，于-20℃待用。
偶联蛋白不限于BSA，其他载体蛋白，如OVA、KLH、HAS、BTG、MSA、RSA、PDL，化合物与载体蛋白反应比例在5：1～50：1之间均属于本专利的保护范围。
实施例2：抗N-乙酰神经氨酸禽源多克隆抗体的制备
本发明为一种抗N-乙酰神经氨酸IgY的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)N-乙酰神经氨酸人工抗原合成，其中，免疫抗原采用N-乙酰神经氨酸和BSA合成，检测抗原采用N-乙酰神经氨酸和OVA合成；
(2)制备抗N-乙酰神经氨酸人工抗原的特异性抗体，其中，向蛋鸡体内注射所述免疫抗原，收集所述禽类所生产的鸡蛋，并做标记于4℃保存；
(3)提取IgY，其中，从上述收集的鸡蛋中分离卵黄和卵清后，提取获得所述卵黄抗体。
需要说明的是，所述制备免疫球蛋白方法如下：用实施例1得到的N-乙酰神经氨酸人工抗原向16周龄产蛋鸡进行初次免疫注射，免疫抗原剂量为300μg，采用胸肌多点注射免疫；初次免疫后14天进行第二次免疫，免疫抗原剂量为250μg，二次免疫后14天进行第三次免疫，免疫抗原剂量为250μg；三次免疫后14天进行第四次免疫，免疫抗原剂量为250μg。
需要说明的是，所述提取IgY的方法如下：
(1)将所述收集的蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS按照体积比1：2进行稀释；
(2)向稀释液加入质量体积比为3.5％的PEG6000，摇床上200rpm室温反应30-60分钟；
(3)将上述混合液离心，用滤纸过滤收集上清，滤液加入质量体积比为8.5％的PEG6000，摇床上200rpm室温反应30-60分钟；
(4)将混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10mL的PBS悬浮，加入质量体积比为12％的PEG6000，摇床上200rpm室温反应30分钟后10000rpm离心10-15分钟，获得沉淀物；
(5)将所述沉淀物使用2mL PBS溶解后，使用透析袋进行透析，使用PBS透析过夜，获得IgY抗体并保存在-20℃备用。
本专利不限于PBS，pH值在7-8范围内的碳酸盐、Tris-HCl或者其他盐的缓冲液均属于本专利保护范围。
需要说明的是，所述PBS的pH值为7.2-7.4。
实施例3：间接竞争酶联免疫检测方法的建立
(1)包被：100ng/mL的BSA偶联物置于96孔酶标板，100μL每孔4℃过夜，用PBS-T洗板3次；
(2)封闭：弃除包被液，用5％脱脂奶粉，200μL每孔封闭2小时，37℃孵育后弃去孔内液体，洗板；
除5％脱脂奶粉外，酪蛋白、明胶、聚乙二醇(PEG)等常见的封闭剂均可用于封闭，均属于本专利保护范围。
(3)在偶联物预包被的酶标板中加入1：80000的一抗和标准品稀释液各50μL，于4℃孵育40分钟后弃去孔内液体，洗板；
需要说明的是，所述N-乙酰神经氨酸标准品制备方法如下：
用PBS稀释N-乙酰神经氨酸半抗原至不同浓度，浓度范围为0ng/mL～400ng/mL，具体地，其浓度梯度为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL和0ng/mL。
(4)加酶标二抗：加入稀释比为1：5000的兔抗鸡酶标二抗，每孔100μL 37℃孵育40分钟；
除了兔抗鸡酶标二抗外，其他如鼠抗鸡、马抗鸡、羊抗鸡的HRP酶标二抗等都可应用到所建立的免疫检测方法及本试剂盒，但是不限于这些HRP酶标二抗，生物素标记抗体与链霉亲和素标记的辣根过氧化物(biotin/SA-HRP)体系均属于本专利的保护范围。
(5)显色与读数：洗板后，每孔100μL TMB底物液显色，37℃孵育15分钟，最后每孔加硫酸(50μL，2M)终止反应，在450nm波长处用酶标仪测吸光度值；
(6)计算与判定：各标准品的平均吸光值，除以0ng/mL时的吸光度，乘以100％即可得到各标准品对应吸光度的百分比即B/B0。然后以各标准品吸光度的比值为纵坐标，以不同浓度的N-乙酰神经氨酸半抗原的log值为横坐标绘制曲线，即可得到该间接ELISA的竞争抑制率曲线，并得出该曲线的线性范围0.93-215.72ng/mL，半抑制率IC50为7.5ng/mL。结果见图6。
实施例4：使用本发明ic-CLEIA检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：
(1)取出试剂盒中包被有检测抗原的酶标板，设阳性对照3孔、阴性对照3孔；
(2)向样本孔加入50μL稀释后的样本，阴阳对照孔加入50μL的阴阳对照，再向以上各孔中加入50μL一抗，在4℃条件下孵育40分钟；
(3)将各孔的液体弃入废液筒，用PBS-T洗涤3-4次，每次洗涤后应弃去孔内的液体，在最后一次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干，每孔加入100μL酶标二抗，于37℃孵育40分钟后弃去孔内液体并用0.01M PBS-T清洗3-4次并拍干；
(4)每孔加入50μL显色液A和50μL显色液B，立刻用酶标仪读取化学发光信号强度；
(5)计算待测样品中N-乙酰神经氨酸含量。

Claims (8)

1.一种N-乙酰神经氨酸半抗原，其特征在于，其结构式如下：
Chemical Formula：C27H8N5O11
Molecular Weight：578.385
所示结构式为N-乙酰神经氨酸半抗原。
2.一种N-乙酰神经氨酸半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将己二酸半醛甲酯259μL、NaCNBH30.135 mg、乙酸100μL添加到含2-硝基-1,4-苯二胺(250mg，1.63mM)的MeOH中；室温下搅拌2-3小时待反应混合物蒸发，加入NaCl，用Et2O萃取，干燥并浓缩，通过硅胶色谱法纯化，得到6-(4-氨基-3-硝基-苯基氨基)己酸甲酯(化合物A)；
(2)在步骤(1)中得到的12mg的化合物A中加入盐酸(11μL，0.128mM)和钯-活性炭5mg一起溶解在THF-EtOH体积比为3：1的溶液中；用Ar和H2洗涤反应混合物，氮气保护下放置2小时，离心去除钯-活性炭，浓缩混合物获得邻苯二胺衍生物6-(3,4-二氨基-苯基氨基)己酸甲酯(化合物B)；
(3)取20mg步骤(2)得到的化合物B溶于10mL的乙酸中，加入β-巯基乙醇700μL、Na2S2O425 mg和N-乙酰神经氨酸6mg混合并加热至50℃，反应2小时，将反应混合物冷却至室温并浓缩，通过反相C18 Sep-Pak柱进行纯化，用H2O-MeCN体积比10：1洗脱产物并浓缩得到喹喔啉酮-N-乙酰神经氨酸(化合物C)；
(4)将5.3mg步骤(3)得到的化合物C溶于NaOH(30mL，30mM)中，并在室温下搅拌30分钟后用1M盐酸中和并浓缩，通过C18 Sep-Pak柱纯化并浓缩得到6-(3,4-二氨基-苯基氨基)己酸唾液酸(化合物D)；
(5)将1.0mg步骤(4)得到的化合物D与2-琥珀酰亚胺-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸铵(TSTU)(0.9mg，2.94μM)一起加入到含二戊烷1mL、二甲基甲酰胺(DMF)1mL和H2O 0.5mL的溶液中，待反应完全后旋转蒸发掉DMF，残余产物通过C18 Sep-Pak柱浓缩和纯化，得到N-乙酰神经氨酸半抗原。
3.一种N-乙酰神经氨酸人工抗原，其特征在于：使用权利要求1或2任一所述的N-乙酰神经氨酸半抗原与载体蛋白偶联得到N-乙酰神经氨酸人工抗原。
4.根据权利要求3所述的N-乙酰神经氨酸人工抗原，其特征在于：载体蛋白是牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)、牛甲状腺白蛋白(BTG)、鼠血清白蛋白(MSA)、兔血清白蛋白(RSA)或多聚赖氨酸(PDL)中的其中一种。
5.根据权利要求3或4所述的N-乙酰神经氨酸人工抗原，其特征在于：将权利要求1或2任一说书的半抗原通过酰胺键与蛋白载体偶联，获得N-乙酰神经氨酸人工抗原，半抗原与蛋白载体反应比例为5：1～50：1之间。
6.一种N-乙酰神经氨酸人工抗原的制备方法，其特征在于：将权利要求1或2任一所述的N-乙酰神经氨酸半抗原9mg溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液(0.5mL，0.1M)(PBS)中，然后加入0.5mL BSA溶液，室温放置过夜，使用离心过滤器纯化得到N-乙酰神经氨酸人工抗原，用H2O洗涤两次并冻干，于-20℃待用。
7.一种用于检测样品中N-乙酰神经氨酸含量的免疫试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～2所述的或者是所制备得到的N-乙酰神经氨酸半抗原。
8.一种用于检测样品中N-乙酰神经氨酸含量的免疫试剂盒，其特征在于，包含权利要求6所述的N-乙酰神经氨酸人工抗原。
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