KR100542033B1 - 고감도 면역분석 - Google Patents

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Abstract

고감도로 생물 유체 표본 내의 사이토킨을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 타임-리절브드 형광면역분석(TR-FIA) 방법은 라타노이드 금속과 복합되는 형광성 구조 부분을 포함하고, 사이토킨이 포획된 합성물을 고체상에 형성하고, 형광성 구조 부분의 형광도를 측정하는 단계로 구성된다. 합성물은 (a) 고체상에 결합되는 부분 및 사이토킨에 결합가능한 구역을 포함하는 첫 번째 항체; (b) 사이토킨; (c) 사이토킨에 결합가능한 구역 및 비오틴이 결합하는 부분을 포함하는 두 번째 항체; (d) 스트렙토아비딘(streptoavidin) 또는 아비딘 및 라타노이드(lathanoid) 금속 이온과 복합될 수 있는 형광성 구조 부분을 포함하는 컨쥬게이트(conjugate); 및 (e) 라타노이드 금속 이온이 결합된 구조로 형성된다. 형광성 구조 부분은 일반식 (Ⅰ)에 의해 표현된다.
Figure 112002009335310-pct00017
고감도, 생물 유체 표본, 사이토킨, 검출, 타임-리절브드, 형광면역분석

Description

고감도 면역분석{High sensitive immunoassay}
본 발명은 생물 유체(fluid) 표본 내의 사이토킨(cytokine)을 검출하기 위한 타임-리절브드 형광면역분석(time-resolved fluoroimmunoassay (TR-FIA)) 방법에 관한 것으로 특별하게는 형광 유로퓸(europium) 복합체를 이용함으로서 생물 유체 표본 내의 사이토킨을 고감도로 검출하는 분석 방법에 관한 것이다.
인간 플라스마와 같은 정상적인 생물 유체 내에 존재하는 자유 사이토킨 또는 케모킨(chemokine)의 농도는 통상적인 ELISA 분석의 검출 한계에 가깝거나 그 이하이다. 예를 들어 검출 한계가 약 6 피코몰(picomol)(PM)인 통상적인 ELISA 분석은 정상적인 인간 플라스마 내로부터의 IL-8을 검출할 수 없다고 보고되고 있다(Leonard et al. (Document 1)). 측정 감도의 강화 및 생물 유체 표본과 관련된 비-특이적 백그라운드(background)의 감소는 생물 유체 표본 내의 케모킨 농도의 정확한 측정을 달성하기 위해 해결되어야 할 주요한 문제점이다.
최근에 유로퓸 복합체를 이용한 타임-리절브드 형광면역분석 방법이 발달되었고, 임상적인 적용에 사용되고 있다(Krop et al., (Document 2)). 자유, 복합된 유로퓸 이온(Eu3+)의 방사 파장(615nm)은 특정한 단백질 타입에 여기(excitation) 파장(340nm) 또는 일시적 백그라운드 형광(350∼600nm)에 의해 영향을 받지 않으며 이는 편리하다. 이러한 원리에 기반을 둔 분석 방법의 하나의 타입은 DELFIA(dissociated-enhanced lanthanoid fluoroimmunoassay; Pharmacia)로 상용화되었고, TNF α 및 IL-6에 사용된다. 그러나 DELFIA는 플라스마 내의 이러한 사이토킨의 농도를 정확히 측정하는데 성공적이지 못하다(Ogata et al. (Document 3)).
최근에 Matsumoto가 이끄는 그룹이 표식 화합물로서 4,4'-비스(bis)(1",1",2",2",3",3",-헵타플루오로-4",6",-헥산디온(hexanedion)-6"-yl)-설포(sulpho)-o-테르페닐(terphenyl)(BHHCT)-Eu3+ 복합체를 발달시켰다. 이러한 복합체는 단백질에 직접적으로 결합하고, 타임-리절브드 타입의 형광 측정을 통한 고감도 분석을 가능하게 한다(Yuan et al. (1997)(Document 4)) 및 Yuan et al. (1998)(Document 5)). BHHCT는 β-다이케톤(diketone) 구조를 지니고, Eu3+에 대해 1010M-1 정도의 높은 결합 안정 상수를 지닌다. 결과적인 Eu3+ 복합체는 400 마이크로초(μs)를 초과하는 수명에 의해 증명되는 바와 같이 매우 우수한 성질을 나타내고, 흡수 및 방출 파장은 각각 최대 330nm 및 615nm이다. 이러한 복합체는 인간 플라스마 내에서의 종양 마커인 α-페토단백질(fetoprotein)(Yuan et al. (1998)(Document 5)) 및 면역글로불린 E(IgE)(Yuan et al. (1997)(Document 4))의 검출에 유용한 것으로 나타내었다. 그러나 이러한 Eu3+ 복합체가 생물 유체 표본 내의 사이토킨을 검출하는데 적용된다는 실례가 알려져 있지 않다.
스트로마(stroma) 세포-유도 인자-1(SDF-1)은 케모킨계에 속하는 사이토킨으로 1993년에 스토로마 세포주로부터 처음으로 클론되었다(Tashiro et al. (Document 6)). SDF-1은 CXCR4 수용체의 주요한 리간드(ligand)이다(Bleul et al. (Document 7)) 및 Oberlin et al. (Document 8)). 이러한 수용체는 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1)의 서브그룹(subgroup)의 CD4 공동-수용체로서 작용하는 것으로 알려져 있다. 더욱이 최근의 연구는 SDF-1 유전자의 다형성(polymorphism)이 후천적 면역결핍 증후군(AIDS)의 진행을 더디게 하는데 관련이 있는 것으로 나타내었다(즉, Winkler et al. (Document 9) 및 Martin et al. (Document 10)). 그러나 일부 이론의 기능적 메카니즘 허용은 아직 수립되어야 한다.
또한 SDF-1이 조혈, 심장혈관 및 신경 시스템의 배형성(embryogenesis)에 필수적인 역할을 한다고 알려져 있다(즉, Zou et al. (Document 11) 및 Tachibana et al. (Document 12)). 반대로 성인 조직 내의 SDF-1의 많은 생물적 기능은 아직 알려져 있지 않다.
상기에 기술된 바와 같이 SDF-1의 이해를 증진시키기 위해 생물 유체 표본 내의 SDF-1을 정확히 정량화하고 모니터링하기 위한 기술을 발달시키는 것이 매우 중요하다. 생물 유체 표본 내에서의 정확한 측정 방법은 다른 케모킨 및 사이토킨에도 유사한 학문적 및 임상적 공헌을 이룰 것이라는 것을 언급할 필요가 없다. 이러한 견지에서 고감도로 사이토킨을 검출하는 분석 방법이 기술된다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 전술된 문제를 해결하는 것이고, 고감도와 용이성을 지닌 생물 유체 표본 내의 사이토킨을 검출하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라 :
(a) 고체상에 결합되는 부분 및 사이토킨에 결합가능한 구역을 포함하는 첫 번째 항체; (b) 사이토킨; (c) 사이토킨에 결합가능한 구역 및 비오틴이 결합하는 부분을 포함하는 두 번째 항체; (d) 스트렙토아비딘(streptoavidin) 또는 아비딘 및 라타노이드(lathanoid) 금속 이온과 복합될 수 있는 형광성 구조 부분을 포함하는 컨쥬게이트(conjugate); 및 (e) 라타노이드 금속 이온이 결합된 고체상으로 형 성된 합성물을 형성하고;
라타노이드 금속 이온과 복합되는 형광성 구조 부분의 형광도를 측정하는 것으로 구성된 생물 유체 표본 내의 사이토킨을 검출하기 위한 타임-리절브드 형광면역분석(TR-FIA) 방법이 제공된다 :
상기 형광성 구조 부분은 일반식(Ⅰ)에 의해 표현된다 :
Figure 112005019575499-pct00033
(상기 R은 단백질과 공유결합 본드(bond)를 형성할 수 있는 기능적 그룹의 잔기이고; Ar은 컨쥬게이트된 이중본드 시스템을 지닌 탄화수소 그룹이고; n은 1과 동일하거나 더 큰 정수; 및 X는 불소 원자 또는 일반식(Ⅱ)에 의해 표현된 그룹이다 :)
Figure 112002009335310-pct00002
본 발명의 하나의 실시태양에서 라타노이드 금속 이온은 유로퓸일 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 형광성 구조 부분은 일반식(Ⅲ)에 의해 표현 될 수 있다 :
Figure 112002009335310-pct00003
(상기 R, Ar 및 n은 상기에 기술된 바와 동일)
본 발명의 하나의 실시태양에서 형광성 구조 부분은 4,4'-비스(bis)(1",1",2",2",3",3",-헵타플루오로-4",6",-헥산디온(hexanedion)-6"-yl)-설포(sulpho)-o-테르페닐(terphenyl)일 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 형광성 구조 부분의 10∼60 유니트는 컨쥬게이트 내의 스트렙토아비딘 또는 아비딘 분자 당 존재한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 형광도를 측정하는 단계는 고체상에 형성된 합성물을 분리시키지 않고 수행될 수 있다.
본 발명의 또다른의 실시태양에서 형광도를 측정하는 단계는 고체상에 형성된 합성물을 분리시킨 후 수행될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 사이토킨은 케모킨에 속하는 사이토킨일 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 사이토킨은 CXC 케모킨일 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 사이토킨은 스트로마 세포-유도 인자-1(SDF-1)일 수 있다.
또한 본 발명의 하나의 실시태양에서 사이토킨은 혈액 순환 내의 용해성 인자로 존재하고, 소량으로 생물 활성을 지니는 사이토킨일 수 있다.
또한 본 발명의 하나의 실시태양에서 사이토킨은 백혈구-대식세포-콜로니(colony) 자극 인자(GM-CSF) 또는 인터루킨(interleukin) 2(IL-2)일 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 생물 유체 표본은 플라스마 또는 전체 혈액일 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 표본 희석에 사용되는 완충액으로 생물 유체 표본을 희석시키는 단계는 합성물을 형성하는 단계 전에 더욱 포함될 수 있고, 표본 희석에 사용되는 완충액은 0.1∼0.3%의 소 혈청 알부민, 0.05∼0.2%의 아지드화 나트륨 및 0.5∼1.5%의 염화나트륨을 함유하는 약 pH 7.3∼8.3의 완충액인 0.01∼0.1M의 트리스-염산일 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 생물 유체 표본을 사이토킨에 대해서는 비-변성 온도 조건 하에서 열처리를 하는 단계가 합성물을 형성하는 단계 전에 더욱 포함될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 세척에 사용되는 완충액으로 고체상에 형성된 합성물을 세척하는 단계가 형광도를 측정하는 단계 전에 더욱 포함될 수 있고, 합성물 세척에 사용되는 완충액은 0.01∼0.1%의 폴리옥시에틸린소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylenesorbitan monolaurate)를 함유하는 약 pH 8.5∼9.5의 완충액인 0.01∼0.1M의 트리스-염산일 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 고체상은 50∼200ng/㎠의 IgG 흡착능을 지닌 마이크로타이터(microtiter) 플레이트일 수 있다.
더욱이 본 발명에 따라 :
고체상에 결합되는 부분 및 사이토킨에 결합가능한 구역을 포함하는 첫 번째 항체; 사이토킨에 결합가능한 구역 및 비오틴이 결합하는 부분을 포함하는 두 번째 항체; 스트렙토아비딘 또는 아비딘 및 라타노이드 금속 이온과 복합될 수 있는 형광성 구조 부분을 포함하는 컨쥬게이트; 및 라타노이드 금속 이온
으로 구성된, 생물 유체 표본 내의 사이토킨을 검출하기 위한 타임-리절브드 형광면역분석(TR-FIA) 방법용 키트가 제공된다.
상기 형광성 구조 부분은 일반식(Ⅰ)에 의해 표현된다 :
Figure 112002009335310-pct00004
(상기 R은 단백질과 공유결합 본드를 형성할 수 있는 기능적 그룹의 잔기이고; Ar은 컨쥬게이트된 이중본드 시스템을 지닌 탄화수소 그룹이고; n은 1과 동일하거나 더 큰 정수; 및 X는 불소 원자 또는 일반식(Ⅱ)에 의해 표현된 그룹이다 :)
Figure 112002009335310-pct00005
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 방법은 타임-리절브드 형광면역분석(TR-FIA) 기술에 기초를 둔다. "타임-리절브드 형광면역분석"은 면역반응을 통해 긴-수명의 형광을 방사하는 것이 가능한 즉, 본 발명에 따른 라타노이드 금속 이온 복합체와 같은 형광성 화합물로 측정 피실험체를 표식하고, 더욱 짧은 수명을 지닌 백그라운드 형광도가 사라진 후 표식된 피실험체로부터 형광 시그날의 타임-리절브드 타입 측정을 하는 분석 방법을 나타낸다.
본 발명에 따른 방법은 생물 유체 표본 내의 사이토킨의 고감도 검출에 특히 적당하다. "생물 유체 표본"은 살아있는 동물, 바람직하게는 포유류, 특히 인간으로부터 수집된 액상 물질을 나타낸다. 그의 대표적인 예는 뇌척수액, 담즙, 양수, 늑막액, 복수, 기관지 분비액, 골수액, 우유, 눈물, 코 배출물, 심장내막액, 내관절액, 타액, 정액, 소변 및 그와 유사한 것뿐만 아니라 혈액(즉, 전체 혈액) 및 그의 프랙션(fraction) 또는 플라스마 및 혈청을 포함한다. 더욱이 생물 유체 표본은 또한 동물 기원의 배양된 세포의 상청액 및 그와 유사한 것을 포함한다. 본 발명에 따른 방법에서 두드러지는 효과는 전체 혈액, 플라스마, 혈청 또는 뇌척수액을 사용할 경우 및 특별하게는 전체 혈액 또는 플라스마를 사용할 경우 제공될 수 있다. 편의를 위해 여기에 사용된 생물 유체 표본은 생물 유체 표본 그 자체 및 생물 유체에 적당한 캐리어(carrier) 내에서의 희석과 같이 처리된 액체 표본을 포함한다.
"사이토킨"은 살아있는 생물체에서 세포간 정보 전달에 중요한 역할을 하는 단백질성 화학 물질을 나타낸다. 각각의 사이토킨에 있어서 특성적인 수용체는 타겟 세포의 표면 상에서 발현된다. 이러한 수용체로의 결합은 세포 생장 및 분화와 같은 생리적 활성의 징후를 초래한다. 집합적으로 혈액 세포의 분화 및 생장을 포함하는 "조혈 인자"로 나타내지는 사이토킨 그룹은 백혈구-대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 포함하는 콜로니 자극 인자(CFS), 줄기 세포 인자, 에리트로포이에틴(erythropoietin), 트롬보포이에틴(thrombopoietin) 및 그와 유사한 것을 포함한다. 림파구를 제어하는 인터루킨은 IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18 및 그와 유사한 것을 포함한다. 집합적으로 "생장 인자"로 나타내지는 사이토킨의 그룹은 TGF-β계, EGF계, FGF계, IGF계, NGF계, 혈액 혈소판-유도 생장 인자(PDGF), 간세포 생장 인자(HGF), 혈관 내피세포 생장 인자(VEGF) 및 그와 유사한 것을 포함한다. 집합적으로 "종양 회저(necrosis) 인자"로 나타내지는 사이토킨 그룹은 TNF-α, TNF-β 및 그와 유사한 것을 포함한다. 집합적으로 "인터페론(interferon)으로 나타내지는 사이토킨 그룹은 INF-α, INF-β, INF-γ 및 그와 유사한 것을 포함한다. 다른 알려진 사이토킨은 엔토셀린(endotheline), 글리아세포-유도 신경영양 인자(GDNF) 및 그와 유사한 것을 포함한다. 기능적으로 성숙한 혈액 세포의 어느 하나에 케모탁시스(chemotaxis)를 전달하는 사이토킨 그룹은 특별히 케모킨으로 나타내진다. 그의 N-말단 구역에서의 보존된 시스테인 위치에 따라 케모킨은 4개의 카테고리로 분류된다 : CC, CXC, C 또는 CXXXC.
본 발명에 따른 방법을 위한 검출 피실험체는 전술된 사이토킨의 어느 하나일 수 있다. 더욱이 전술된 사이토킨의 그룹의 어느 하나의 새롭게 발견된 멤버 또는 전술된 사이토킨의 그룹의 어느 하나에도 속하지 않는 새롭게 발견된 사이토킨이 본 발명에 따른 방법에 검출 피실험체가 될 수도 있다. 특히 본 발명에 따른 방법은 소량으로 생물적 활성을 지닌 혈액 순환 내에 용해성 인자로 존재하는 사이토킨에 적용가능하고, 다양한 병리학에도 관련된다.
본 발명에 따른 방법을 위한 검출 피실험체의 예는 전술된 케모킨계에 속하는 사이토킨일 수 있고, 특히 CXC 케로킨일 수 있으나 이러한 카테고리에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 방법을 위한 검출 피실험체의 가장 바람직한 예는 SDF-1이다.
본 발명에 따른 방법에서 생물 유체 표본 내의 원하는 사이토킨을 선택적으로 포획하고 표식하기 위해 사이토킨을 함유하는 합성물은 고체상으로 형성된다. 특히 사이토킨-함유 합성물은 적당한 고체상으로 하기의 구성성분으로부터 형성된다 :
(a) 고체상에 결합되는 부분 및 사이토킨에 결합가능한 구역을 포함하는 첫 번째 항체;
(b) 사이토킨;
(c) 사이토킨에 결합가능한 구역 및 비오틴이 결합하는 부분을 포함하는 두 번째 항체;
(d) 스트렙토아비딘 또는 아비딘 및 라타노이드 금속 이온과 복합될 수 있는 형광성 구조 부분을 포함하는 컨쥬게이트; 및
(e) 라타노이드 금속 이온
이하, 각각의 구성성분을 설명한다.
"고체상"과 같이 어떤 모양이나 물질의 고체 물질은 그것에 항체가 결합하게 할 수 있는 한 사용되고, 전술된 컨쥬게이트의 형성 및 형광도 측정(하기에 기술됨)을 방해하지 않는다. 분석 방법 수행의 편의를 위해 멀티웰(multiwell) 타입의 마이크로타이터 플레이트가 일반적으로 사용되나 구슬로 채워진 컬럼과 같이 어떤 다른 형상도 사용된다(구슬의 물질은 세파로스(sepharose), 아가로스(agarose)일 수 있으나 이에 한정적인 것은 아님). 본 발명에 따라 중간 단백질 흡착능을 나타내는 마이크로타이터 플레이트가 특히 적당하다. 여기에 사용된 바와 같이 "중간 단백질 흡착능"은 면역글로불린 G(IgG)가 참조 단백질로서 흡착될 때 일반적으로 약 50∼200ng/㎠을 나타내고, 바람직하게는 약 15∼150ng/㎠, 더욱 바람직하게는 약 90∼120ng/㎠을 나타내는 성질을 나타낸다. 마이크로타이터 플레이트의 물질은 바람직하게는 폴리스티렌(polystyrene)이나 이에 한정적인 것은 아니다.
구성성분 (a) 또는 "첫 번째 항체"는 전술한 고체상에 결합된 상태를 나타내고, 항원-항체 반응을 통해 원하는 사이토킨에 결합하는 것이 가능한 항체이다. 이러한 점에서 첫 번째 항체는 또한 "포획된 항체"로 나타내진다. 본 발명의 명세서에서 "항체"는 면역글로불린(Ig) 및 어떤 타입의 면역글로불린-유도 분자, 즉 폴리클론(polyclonal) 항체, 단일클론 항체, Fab, (Fab)2 또는 키메릭(chemeric) 항체를 포함하는 것을 의미한다. "항체"라는 용어는 광범위한 의미로 사용되고, 면역글로불린에 유사한 방식으로 사이토킨에 결합하는 것이 가능한한 리간드로서 사이토킨을 지닌 수용체도 포함한다. 바람직한 항체의 예는 폴리클론 항체 또는 단일클론 항체이다. 다양한 사이토킨의 항체는 예를 들어 R&D System Inc.(미국, 미네소타), Dako Immunoglobulins a/s(덴마크), PharMingen(미국, 캘리포니아), Southern Biotechnology Associates(미국, 알라바마) 및 그와 유사한 곳으로부터 상업적으로 유용하다. 또한 원하는 사이토킨에 대한 항체는 동물 면역법 또는 잡종세포 기술과 같은 일반적인 방법을 이용함으로서 생성될 수 있다.
고체상으로의 결합으로 하기의 일반적인 방법, 즉 마이크로타이터 플레이트상에 첫 번째 항체를 직접 코팅함으로서 달성될 수 있다. 첫 번째 항체의 "고체상에 결합된 부분"은 일반적으로 고체상에 특별하게 흡착되는 항체의 Fc 구역을 나타내나 이에 한정적인 것을 아니다. 예를 들어 고체상 및 항체의 부분에 결합하는 것이 가능한 이중기능성 링커(linker) 분자가 사용될 수 있다.
구성성분 (b) 또는 생물 유체 표본 내에 존재하는 원하는 사이토킨은 일반적으로 첫 번째 항체에 결합함으로서 고체상에 고정된다. 사이토킨은 첫 번째 항체와 접촉하기 위해 자유 상태로 있을 필요는 없다. 예를 들어 사이토킨은 두 번째 항체(하기에 기술됨)에 결합한 후에 첫 번째 항체에 결합될 수도 있다. 따라서 본 발명에 따른 컨쥬게이트 형성은 각각의 구성의 결합 순서에 대해 제한을 두지 않는다.
발명자들은 고감도 사이토킨 검출에는 원하는 사이토킨을 함유한 생물 유체 표본이 사이토킨에 결합가능한 항체에 노출되기 전에 적당한 완충액으로 적당한 농도까지 희석되는 것이 필수적이라는 것을 발견하였다. 생물 유체 표본 완충액에 의한 희석 비율은 부피 기준으로 표현하면(생물 유체 표본 : 완충액) 일반적으로 약 1 : 1 ∼ 1 : 30, 바람직하게는 약 1 : 2.5 ∼ 1 : 20, 더욱 바람직하게는 약 1 : 5 ∼ 1 : 15이다. 희석 비율의 최적치는 생물 유체 표본의 종류 및 사이토킨의 종류에 따라 다르고, 더욱이 표본 희석에 사용된 완충액의 조성에 따라 더욱 달라진다.
표본 희석에 사용되는 적당한 완충액은 트리스(하이드록시메틸(hydroxymethyl)아미노메탄(aminomethane)(약자로 "Tris") 및 무기산으로 구성된 약알칼리성 완충액이고, 일반적으로는 pH는 약 7.0∼8.6, 바 람직하게는 약 7.3∼8.3, 더욱 바람직하게는 약 7.5∼8.1이고 농도는 약 0.005∼0.2 mol(M), 바람직하게는 약 0.01∼0.1M, 더욱 바람직하게는 약 0.025∼0.075M인 트리스-염산이다.
표본 희석에 사용된 완충액은 적당한 양의 플라스마 단백질 구성성분 및 염을 더욱 포함한다. 플라스마 단백질 구성성분은 일반적으로 혈청 알부민이고, 바람직하게는 농도가 일반적으로 약 0.05∼0.5%, 바람직하게는 약 0.1∼0.3%, 더욱 바람직하게는 약 0.15∼0.0.25%인 소 혈청 알부민(BSA)이다. 염은 일반적으로 아지드화나트륨(NaN3) 및 염화나트륨(NaCl)이다. NaN3의 농도는 일반적으로 약 0.02∼0.4%, 바람직하게는 약 0.05∼0.2%, 더욱 바람직하게는 약 0.05∼0.15%이다. NaCl의 농도는 일반적으로 약 0.2∼3%, 바람직하게는 약 0.5∼1.5%, 더욱 바람직하게는 약 0.6∼0.12%이다.
표본 희석에 사용된 완충액의 조성은 전술된 조건에 한정적인 것은 아니고, 당 분야의 숙련자에게 용이하도록 다양한 변형이 허용된다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어 전술한 나트륨염의 일부 또는 전체를 다른 알칼리성 금속염 또는 상응하는 알칼리성 지구 금속염으로 대치하는 것이 가능하다. 표본 희석에 사용된 완충액 pH의 최적 부피 및 각각의 구성성분의 최적 농도는 검출 피실험체인 사이토킨의 종류에 따라 달라지고, 생물 유체 표본의 희석 비율에 따라서도 달라진다. 이러 한 최적화는 당 분야의 숙련자에 의한 일반적인 조건 셋팅 과정의 범위 내에서 달성될 수 있다.
구성성분 (c) 또는 "두 번째 항체"는 첫 번째 항체에 샌드위치 형태로 원하는 사이토킨을 포획하도록 사이토킨에 결합가능한 구역을 포함한다. 첫 번째 항체 및 두 번째 항체는 서로 방해작용없이 동일한 사이토킨 분자의 다른 사이트(즉, 다른 에피토프(epitope)를 인식하는 항-펩타이드 항체인 것이 바람직하다. 따라서 첫 번째 항체 및 두 번째 항체는 원하는 사이토킨과의 결합능에 의해 적당한 결합을 만드는 것이 필수적이다. 예를 들어 적당한 결합은 전체-길이 사이토킨 또는 다수의 에피토프를 포함한다고 알려지거나 추측되는 사이토킨의 단편으로 적당한 동물을 면역시킴으로서 수득된 다수의 폴리클론 항체로부터 선택될 수 있다. 또한 적당한 결합은 다른 에피토프를 인식하는 다수의 단일클론 항체로부터 선택될 수 있다. 이러한 선택은 예를 들어 사이토킨의 참조 용액의 제조 및 고려되는 항체의 결합에 대한 일반적인 ELISA 방법의 수행을 포함하는 예비실험을 통해 특별한 어려움 없이 달성될 수 있다.
두 번째 항체는 비오틴이 결합하여 형광도 측정을 통해 사이토킨의 검출을 가능하게 하는 부분을 더욱 포함한다. 이러한 점에서 두 번째 항체는 또한 "검출 항체"로 나타내진다. 비오틴은 비타민 H 또는 조효소 R과 같은 비타민이고, 펩타이드와 같은 아미노 그룹과 아미노 본드를 형성하는 것이 가능하다. 두 번째 항 체는 일반적인 방법을 따른 검출 피실험체인 사이토킨에 항체를 비오틴화하고 정제함으로서 준비될 수 있다. 두 번째 항체의 "비오틴이 결합되는 부분"은 비오틴이 결합된 항체의 부분(일반적으로 Fc 구역)뿐만 아니라 비오틴 자체를 나타낸다. 필요한 경우 비오틴 및 항체의 부분은 양쪽 모두에 결합할 수 있는 이중기능성 링커 분자를 이용함으로서 연결된다.
여기 사용된 바와 같이 "두 번째 항체"라는 표현은 단일 분자를 나타낼 필요는 없으나 필요한 기능(즉, 항원-항체 반응 또는 리간드-수용체 본드를 통해 사이토킨에 결합할 수 있는 기능 및 비오틴 운반 기능)을 충족시킬 때까지 어떤 구조적 유니트를 표현한다. 또한 전술된 "첫 번째 항체"에도 동일하게 적용된다. 예를 들어 원하는 사이토킨의 항체와 이러한 항-사이토킨 항체에 결합하는 것이 가능한 비오틴화된 항-IgG 항체의 결합은 본 발명에서 사용될 수 있다. 이러한 경우 항-사이토킨 항체와 비오틴화된 항-IgG 항체의 결합은 집합적으로 "두 번째 항체"로 나타내진다. 비오틴화된 항-IgG 항체는 그의 융통성으로 인해 편리하다. 원하는 사이토킨의 항체가 어떤 이유로 인해 비오틴화 반응에 대해 저항성을 지니는 경우 비오틴화된 항-IgG 항체와의 결합을 이용하는 것이 유용하다. 반대로 분석 절차를 단순화하고 사이토킨 검출 감도를 최대화하는 견지에서는 두 번째 항체로 단일 분자를 이용하는 것이 바람직하다.
구성성분 (d) 또는 "컨쥬게이트"는 스트렙토아비딘 또는 아비딘 및 라타노이 드 금속 이온과 복합될 수 있는 형광성 구조 부분을 포함하는 구조적 단위이고, 일반적으로 스트렙토아비딘 또는 아비딘 및 형광성 구조 부분이 공유결합 본드를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 분자이다. 일반적으로 스트렙토아비딘은 방선균류(Actinomycetes)에 의해 생성된 약 60,000의 분자량을 지닌 잘-알려진 단백질이고, 자연적으로 비오틴에 강하게 결합한다. 그러나 본 발명에서 "스트렙토아비딘"은 어떤 특정한 미생물적 기원에 한정적인 것은 아니고 비오틴에 대한 결합능을 실질적으로 보유하는 한 그의 변형뿐만 아니라 다른 미생물적 기원의 상응하는 단백질도 포함한다. 일반적으로 아비딘은 달걀 흰자 내에 함유된 약 70,000의 분자량을 지닌 잘-알려진 단백질이고, 자연적으로 비오틴에 강하게 결합한다. 본 발명에서 "아비딘"은 자연적 달걀 흰자 단백질에 한정적인 것은 아니고 그의 비오틴에 대한 결합능이 실질적으로 보유되는 한 그의 변형을 포함한다.
전술된 원리에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 방법은 또한 구성성분 (c) 대신에 사이토킨에 결합가능한 구역 및 스트렙토아비딘 또는 아비딘이 결합되는 부분을 포함한 항체를 이용하고; 구성성분 (d) 대신에 비오틴 및 라타노이드 금속 이온과 복합될 수 있는 형광성 구조 부분을 포함하는 컨쥬게이트를 이용함으로서 수행될 수 있다.
라타노이드 금속 이온과 복합될 수 있는 구성성분 (d)의 컨쥬게이트의 형광성 구조 부분은 상응하는 형광성 화합물을 스트렙토마이신 또는 아비딘과의 공유결 합을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 연결되도록 반응시킴으로서 수득된 부분적 구조이다. 형광성 구조 부분은 하기의 일반식(Ⅰ)에 의해 표현된다 :
Figure 112002009335310-pct00006
(식에서 R은 단백질과 공유결합 본드를 형성할 수 있는 기능적 그룹의 잔기이고; Ar은 컨쥬게이트된 이중본드 시스템을 지닌 탄화수소 그룹이고; n은 1과 동일하거나 더 큰 정수; 및 X는 불소 원자 또는 일반식(Ⅱ)에 의해 표현된 그룹이다 :
Figure 112002009335310-pct00007
상기 일반식에서 잔기 R로 정의된 "단백질과 공유결합 본드를 형성할 수 있는 기능적 그룹"은 단백질 내의 아미노산 잔기 내에 포함된 반응적 그룹(일반적으로 아미노 그룹, 카르복실 그룹 및 하이드록실 그룹)과 반응함으로서 공유결합 본드를 형성할 수 있는 유기성 기능적 그룹을 나타낸다. 이러한 기능적 그룹의 예는 하기의 그룹을 포함한다 :
Figure 112002009335310-pct00008
(상기 X는 할로겐화물 원자, -OSO2CH3, -OSO2F, -OSO2CF3 , -OSO2C4F9 또는 -OSO2PhCH3-p (상기 Ph는 페닐 그룹을 나타냄)로부터 선택되고; RA는 알킬(alkyl) 그룹, 알케닐(alkenyl) 그룹, 아릴(aryl) 그룹 또는 아랄킬(aralkyl) 그룹으로부터 선택되고; RB는 알킬렌(alkylene) 그룹, 알케닐렌(alkenylene) 그룹, 아릴렌(arylene) 그룹 또는 아랄킬렌(aralkylene) 그룹으로부터 선택되고; p는 0∼5이고; q는 2∼10이다.
상기 일반식에서 Ar로 정의된 "컨쥬게이트된 이중 본드 시스템을 지닌 탄화수소 그룹"은 적어도 3개 이상의 컨쥬게이트된 이중 본드를 지닌 탄화수소 그룹이고, 일반적으로 적어도 하나 이상의 페닐 고리를 지닌 2가 또는 3가 방향성 탄화수소 그룹이다. 탄화수소 그룹 내의 탄소수의 상위 한계는 일반적으로 약 50이하이고, 바람직하게는 약 30이하이나 이에 한정적인 것은 아니다. 여기서 하나 이상의 탄소는 이것에 대한 원자(산소 또는 황 원자)에 의해 치환된다. 탄화수소 그룹 Ar의 예는 하기의 그룹을 포함한다 :
Figure 112002009335310-pct00009
바람직하게는 탄화수소 그룹 Ar은 3가이고, 형광성 구조 부분은 일반식(Ⅲ)에 의해 표현된다 :
Figure 112002009335310-pct00010
여기서 Ar의 더욱 바람직한 예는 4,4' 위치에서 2개의 β-다이케톤(kiketone) 그룹에 결합하는 o-테르페닐(terphenyl)이다. 또다른 Ar의 유사하게 바람직한 예는 2개의 β-다이케톤 그룹이 o-테르페닐과 결합된 β-다이케톤 그룹의 위치에 대해 유사한 위치 또는 실질적으로 동일한 공간적 거리에 위치하도록 할 수 있다.
상기 일반식에서 n은 1 또는 그 이상의 정수, 일반적으로 1∼6, 바람직하게는 2∼4이다.
본 발명에서 특히 바람직한 형광성 구조 부분은 4,4'-비스(1",1",2",2",3",3",-헵타플루오로-4",6",-헥산디온-6"-yl)-설포-o-테르페닐이다. 이는 상응하는 형광성 화합물 4,4'-비스(1",1",2",2",3",3",-헵타플루오로-4",6",-헥산디온-6"-yl)-클로로설포(chlorosulpho)-o-테르페닐(약자로 "BHHCT")로부터 수득된다. BHHCT의 구조 도면은 하기에 나타나 있다 :
Figure 112002009335310-pct00011
전술된 형광성 구조 부분을 제공하는 기술된 형광성 화합물은 통상의 유기성 합성 반응을 이용함으로서 합성될 수 있다. 일반적으로 하기의 2가지의 단계로 구성된 절차를 따름으로서 합성될 수 있다 :
(첫 번째 단계)
아세틸화된 방향성 화합물과 펄플루오로카르복실레이트(perfluorocarboxy-
late) 에스테르 사이의 클라이센(claisen) 축합 반응이 염기성 촉매의 존재하에 적당한 용매 내에서 수행되어 아세틸 그룹의 CH3-가 펄플루오로카르보닐화되는 β-다이케톤 화합물을 생성한다.
(두 번째 단계)
단백질과 공유결합 본드를 형성할 수 있는 기능적 그룹이 β-다이케톤 화합 물 내로 도입된다. 예를 들어 방향성 고리의 수소는 클로로설폰산을 이용한 클로로설포닐화 반응을 통해 클로로설포닐 그룹(ClSO2-)에 의해 치환된다. 각각의 단계 후 재결정화 또는 침전과 같은 정제가 필요에 따라 수행될 수 있다.
결과적인 형광성 화합물은 전술된 두 번째 단계 동안 도입된 기능적 그룹의 종류에 따라 적당한 조건 하에서 단백질과 반응하게 되어 목적 형광성 구조 부분을 제공한다. 예를 들어 클로로설포닐 그룹은 염기성 반응 조건 하에서 단백질 내 아미노산과 아미드(amide)를 용이하게 형성한다.
본 발명에서 구성성분 (d)의 컨쥬게이트는 형광성 화합물로 스트렙토아비딘 또는 아비딘을 직접 표식함으로서 제조될 수 있다. 또한 구성성분 (d)의 컨쥬게이트는 먼저 스트렙토아비딘 또는 아비딘을 다른 단백질(즉, 소 혈청 알부민)과 컨쥬게이트하게 하고, 그 후 이를 표식함으로서 제조될 수 있다. 스트렙토아비딘과 아비딘 사이의 컨쥬게이션은 일반적인 방법, 즉 글루타르알데하이드를 이용한 교차-결합 반응에 의해 달성될 수 있다.
형광성 화합물로의 단백질의 표식 반응은 일반적으로 반응을 위해 적당한 pH(즉, 클로로설폰닐화의 경우 약 pH 9)로 적정된 완충액 내에 단백질을 용해시키고, 이에 적당한 용매(즉, 원하는 몰 비율을 이루는 양의 에탄올 또는 디메틸포름 아마이드(dimethylformamide) 내에 용해된 형광성 화합물을 첨가함으로서 수행될 수 있다. 단백질에 대한 형광성 화합물이 몰 비율 및 형광성 화합물을 포함하는 용액의 농도를 적정함으로서 단백질의 각각의 분자에 컨쥬게이트하는 형광성 화합물의 비율(또한 "컨쥬게이션 비율"로도 나타내짐)을 제어하는 것이 가능하다. 컨쥬게이션 비율은 본 발명에 따른 컨쥬게이트 내의 스트렙토아비딘 또는 아비딘 분자 당 존재하는 형광성 구조 부분의 유니트 수에 상응한다. 컨쥬게이션 비율은 일반적으로 약 5∼100 유니트, 바람직하게는 10∼60 유니트이다. 컨쥬게이션 비율이 너무 작을 경우 충분히 높은 사이토킨 검출 감도는 수득되지 않는다. 반대로 컨쥬게이션 비율이 너무 높을 경우 검출 감도를 증가시키지 않는다.
본 발명에 따른 방법에서 고체상의 합성물 형성은 전술된 형광성 구조 부분과의 라타노이드 금속 이온 복합체의 구성성분(e)로 완성된다. 라타노이드 금속 이온의 예는 유로퓸(Eu), 사미륨(Sm), 테르븀(Tb) 및 다이스프로슘(Dy)을 포함한다. 유로퓸(Eu)이 바람직하다. 라타노이드 금속 이온은 미리 구성성분 (d)의 컨쥬게이트와 복합되고, 그 형태로 합성물 형성에 사용된다. 즉, 일반적으로 형광성 구조 부분은 스트렙토아비딘 또는 아비딘 또는 비오틴과의 컨쥬게이션이 형성될 때 이미 Eu3+을 보유하는 복합체가 된다. 그러나 이는 반대 절차를 배제하지 않는다.
발명자들은 고감도 사이토킨 검출에는 고체상으로 형성된 합성물이 형광도 측정에 앞서 적당한 완충액으로 알맞게 세척되는 것이 필수적이라는 것을 발견하였다. 여기서 합성물을 세척하는데 사용된 적당한 완충액은 트리스 및 무기산으로 구성된 알칼리성 완충액이고, 일반적으로 pH는 일반적으로 약 8.2∼9.8, 바람직하게는 약 8.5∼9.5, 더욱 바람직하게는 약 8.7∼9.4이고, 농도는 일반적으로 약 0.005∼0.2M, 바람직하게는 약 0.01∼0.1M, 더욱 바람직하게는 약 0.025∼0.075M인 트리스-염산이다.
합성물을 세척하는데 사용된 완충액은 단백질 용해능을 지닌 적당한 양의 비이온성 계면활성제를 더욱 포함한다. 비이온성 계면활성제는 일반적으로 폴리옥시에틸린소르비탄 모노라우레이트이고, 바람직하게는 상품명 "Tween(등록상표) 20"(분자량 : 약 1200)으로 상용되는 폴리옥시에틸린소르비탄 모노라우레이트이다. Tween(등록상표) 20과 실질적으로 동일한 성질(즉, 약 95∼115의 수산기 수치; 약 35∼55의 감화값; 약 15∼18의 HLB(친수성-소수성 균형))을 지닌 다른 비이온성 계면활성제가 또한 바람직하게 사용될 수 있다. 비이온성 계면활성제의 농도는 일반적으로 약 0.005∼0.2%, 바람직하게는 약 0.01∼0.1%, 더욱 바람직하게는 약 0.025∼0.075%이다.
합성물의 세척에 사용된 완충액의 조성은 전술된 조건에 한정적인 것은 아니고, 당업자에게 용이한 다양한 변형이 허용되는 것으로 간주된다. pH의 최대치, 각각 구성성분의 농도는 검출되는 사이토킨의 종류에 따라 달라진다. 이러한 최적화는 당업자에 의한 일반적인 조건 셋팅 처리의 범위 내에서 달성될 수 있다.
이하, 본 발명의 방법에 따른 고체상의 합성물 형성을 위한 절차의 일반적인 예가 기술된다.
1) 코팅에 사용되는 적당한 완충액으로 희석된 첫 번째 항체의 용액은 고체상에 적용되고(즉, 96-웰 마이크로타이터 플레이트 내), 첫 번째 항체는 인큐베이션을 통해 고체상에 고정된다. 코팅에 사용되는 완충액과 같이 예를 들어 적당한 양의 NaCl을 함유한 인산염 완충액이 사용된다. 일반적으로 인큐베이션 조건은 약 2∼6℃에서 약 20시간 이상이다.
2) 다음에 첫 번째 항체로 코팅된 고체상의 표면은 세척에 사용되는 완충액으로 여러 차례 세척된다. 세척에 사용되는 완충액과 같이 예를 들어 약알칼리성 트리스-염산이 사용되고, 단백질 용해능을 지닌 적당한 양의 비이온성 계면활성제가 필요에 따라 첨가된다. 세척 후 코팅된 고체상은 분석에 사용되기 바로 전까지 약 -20℃의 낮은 온도에서 보관된다.
3) 상기에 기술된 바와 같이 바람직하게는 사이토킨을 함유한 검출 피실험체인 생물 유체 표본은 표본 희석에 사용된 완충액으로 적당한 레벨까지 미리 희석된 다. 생물 유체 표본 및 필요한 경우에는 사이토킨의 참조 용액이 코팅된 고체상으로 적용되고, 인큐베이트된다. 일반적으로 인큐베이션 조건은 약 35∼39℃에서 약 40분∼2시간이다. 인큐베이션 후 고체상의 표면은 상기와 같이 세척에 사용된 완충액으로 여러 차례 세척된다.
4) 이 후 적당한 완충액으로 희석된 두 번째 항체 용액이 고체상으로 적용되고, 인큐베이트된다. 여기서 상기에 기술된 바와 같이 표본 희석에 사용된 것과 동일한 완충액을 사용하는 것이 바람직하다. 인큐베이션 조건은 전술된 생물 유체 표본의 인큐베이션 조건과 유사하다. 인큐베이션 후 고체상의 표면은 상기와 같이 세척에 사용된 완충액으로 여러 차례 세척된다.
5) 컨쥬게이트는 형광성 복합체 부분이 형성되도록 라타노이드 금속 이온의 염 용액과 혼합된다. 적당한 용매로 희석된 후 복합된 컨쥬게이트는 고체상으로 적용되고, 인큐베이트된다. 인큐베이션 조건은 전술된 생물 유체 표본 및 두 번째 항체의 인큐베이션 조건과 유사하다. 인큐베이션 후 고체상에 형성된 합성물은 전술된 방식대로 합성물 세척에 사용된 적당한 완충액으로 여러 차례 세척된다.
다음으로 전술된 방식으로 수득된 라타노이드 복합체를 함유한 합성물은 고체상 또는 액상으로 타임-리절브드 형광도 측정이 이루어진다. 이러한 형광도 측정용 기구는 상용된다. 일반적으로 측정 조건은 : 약 0.2∼0.3 밀리세컨드(ms)의 지연 시간; 약 0.2∼0.6ms의 윈도우 시간; 약 0.5∼1.5ms의 플래쉬(flash) 비율; 337.1nm의 방출 파장(질소 레이저의 파장); 및 615nm의 측정 파장.
고체상 형광도 측정의 경우 전술된 합성물을 지닌 고체상은 그 상태로 형광도 측정 조건에 맞춰진다. 액상 형광도 측정의 경우 합성물은 형광성 복합체 부분을 함유하는 어떤 구조적 유니트가 용액 내로 해리되도록 하기 위해 적당한 분해 용액으로 처리하고, 이러한 용액은 형광도 측정 조건에 맞춰진다. 일반적으로 분해는 트리알킬포스피녹사이드(trialkylphosphinoxide) 및 음이온성 계면활성제를 포함하는 약-염기성 수용액이다. 분해 용액의 예로는 트리스(n-옥틸(octyl)포스피녹사이드(TOPO) 및 황산도데실나트륨(SDS)을 함유한 탄산수소나트륨(NaHCO3)이 사용된다. 전술된 합성물을 지닌 고체상을 약 45∼55℃에서 약 40분∼2시간 동안 인큐베이트함으로서 스트렙토아비딘 또는 아비딘 또는 비오틴과의 컨쥬게이션이 충족되어 형광성 복합체를 함유한 컨쥬게이트가 용액 내로 해리된다.
전술된 액상 형광도 측정의 장점은 형광도 측정이 고체상을 포함하지 않기 때문에 선택되는 고체상 및 물질의 타입의 더욱 넓은 범위를 허용한다는 것이다. 반대로 액상 형광도 측정은 고체상 형광도 측정과 비교하여 가외의 단계를 필요로 하기 때문에 복잡한 절차를 거친다. 더욱이 액상 형광도 측정은 일부의 경우 분해 용액 처리 단계 동안 불순물의 방해작용 혐의와 같은 원인으로 고체상 형광도 측정 보다 낮은 다소 감도를 나타낸다. 그러나 고체 및 액체 형광도 측정에 의해 달성되는 각각의 최대 감도는 분석하는 다양한 조건의 결합에 따라 달라진다.
본 발명에 따라 전술된 타임-리절브드 형광면역분석(TR-FIA) 방법을 수행하기 위한 키트가 더욱 제공된다. 이러한 키트는 일반적으로 구성성분 아이템으로서 적어도 전술된 구성성분 (a), (c), (d) 및 (e)를 포함한다. 즉,
고체상에 결합되는 부분 및 사이토킨에 결합가능한 구역을 포함하는 첫 번째 항체; 사이토킨에 결합가능한 구역 및 비오틴이 결합하는 부분을 포함하는 두 번째 항체; 스트렙토아비딘 또는 아비딘 및 라타노이드 금속 이온과 복합될 수 있는 형광성 구조 부분을 포함하는 컨쥬게이트; 및 라타노이드 금속 이온이 측정기에 정수로 제공되어 생물 유체 표본 내의 사이토킨을 검출하기 위한 분석을 수행가능하도록 한다. 필요에 따라서 키트는 참조 사이토킨, 전술된 다양한 완충액(특히 표본 희석에 사용되는 완충액 및 합성물 세척에 사용되는 완충액) 및 그와 유사한 것을 더욱 포함한다. 키트의 구성성분 아이템은 일반적으로 각각 적당한 형태로 용기 내에 설비되고, 사용하기 위한 설명서 또는 안내서와 함께 정수로 포장된다.
본 발명은 정확하게 고감도로 생물 유체 표본 내의 사이토킨, 특히 SDF-1을 포함하는 케모킨을 검출할 수 있는 신규한 방법을 제공한다. 검출 한계는 하기에 기술된 실시예 2에서와 실질적으로 동일한 조건 하에서 일반적으로 약 100pg/ml 또 는 그 이하, 바람직하게는 약 50pg/ml 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 약 30pg/ml 또는 그 이하이다. 유사하게 사이토킨 측정을 위한 편차(variation) 계수(CV)는 하기에 기술된 실시예 2에서와 실질적으로 동일한 조건 하에서 일반적으로 약 10% 이하, 바람직하게는 약 8% 이하, 더욱 바람직하게는 7% 이하이다. 플라스마 표본으로부터의 사이토킨 회복율은 하기에 기술된 실시예 6에서와 실질적으로 동일한 조건 하에서 일반적으로 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상이다. 더욱이 측정이 동일한 조건 하에서 동일한 개인으로부터의 추출된 플라스마 표본 내의 사이토킨에 대해 4일 또는 그 이상의 다른 날에 반복될 때 수득된 측정치의 불안정은 약 10∼20%의 범위 내에 있다.
하기 실시예에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 형광성 화합물 BHHCT로부터 유도된 Eu3+ 복합체를 이용함으로서 플라스마 표본 내의 검출 감도는 특히 SDF-1에 대해 ELISA 및 DELFIA와 같은 통상적인 방법 보다 2 또는 1000배까지 증진되었다. HIV-1 감염의 이해를 심화하고, AIDS 치료의 새로운 전망을 개진하기 위해 생체 내에서의 SDF-1의 행동을 정확하게 파악하고, 그의 생리적 기능을 나타내는 것은 매우 중요하다. 본 발명은 사이토킨에 관한 분자생물학의 발달 및 적용에 특히 중요한 공헌을 할 수 있다는 것은 자명하다.
더욱이 하기의 실시예 내에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 형광성 화합물 BHHCT로부터 유도된 Eu3+ 복합체를 이용함으로서 사이토킨계, 즉 용해성 인자로 혈액 순환 내에 존재하고, 소량으로도 생물 활성을 지니며 다양한 병리학에 연관되어 있을 뿐만 아니라 이미 치료에 적용되고 있는 사이토킨의 측정이 SDF-1과 같이 고감도로 가능하고 또한 좋은 재현성을 나타낸다.
도 1a는 SDF-1의 눈금 곡선을 나타낸 그래프이다. 참조 SDF-1은 실시예 2에서 기술된 TR-FIA 방법을 이용함으로서 측정되었다. 데이터는 3반복 측정의 평균치를 나타낸다.
도 1b는 낮은 농도 범위에서의 특정한 초점으로 도 1a와 유사한 눈금 곡선을 나타내는 그래프이다. 그래프에서의 직선은 하기와 같다 : Y = 1.3X + 1.2( ×10000 a.u.); r = 0.995. 데이터는 3반복 측정의 평균치를 나타낸다.
도 1c는 SDF-1의 생물 활성을 모니터링하기 위한 방법으로 실시예 3에서 기술된 프로토콜에 따라 EL-4 세포 표면 상에서의 CXCR4 발현 결과 측정을 나타내는 그래프이다. 평균 형광 강도(MFI)의 백분율 감소는 인간 SDF_1 β없이 인큐베이트된 대조군과의 비교에 의거하여 산출되었다. 데이터는 실험 시리즈의 3번 수행 으로부터 선택된 중수(median)을 나타낸다.
도 1d는 SDF-1에 대한 TR-FIA의 특이성을 평가하기 위한 다양한 케모킨의 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 데이터는 3반복 측정의 평균치를 나타낸다.
도 2는 SDF-1에 대한 TR-FIA와 DELFIA 사이의 비교를 나타낸 그래프이다. 도 2의 좌측면은 실시예 2에서 사용된 것과 같은 포획(capture) 항체와 검출 항체의 동일한 조합을 사용함으로서 DELFIA 및 TR-FIA 시스템에 의한 인간 SDF-1 β의 참조 용액의 측정 결과를 나타낸다. 도 2의 우측면은 2개의 시스템에 의해 수득된 플라스마 표본 내의 내생적 SDF-1의 농도 결과를 나타낸다. 도 2의 우측면에 상에 나타난 표본은 첨가된 참조 SDF-1을 지니지 않는다. 도 2의 우측면의 데이터 및 표 1의 데이터는 다른 표본의 측정 결과를 나타낸다. 데이터는 3반복 측정 결과의 평균치를 나타낸다.
도 3a는 TR-FIA에 의한 SDF-1 측정 상의 응고방해물(anticoagulant) 및 프로테아제 억제자의 작용을 나타낸 그래프이다. 플라스마 표본은 EDTA(1mg/ml); 헤파린(30IU/ml); 구연산염(구연산나트륨 0.38%); 또는 EDTA(1mg/ml) 함유 아프로티닌(aprotinin)(1㎍/ml)으로 처리되었다. 검정색 바(bar) 및 빗금친 바는 2개의 다른 표본의 측정 결과를 나타낸다. 데이터는 3반복 측정의 평균치를 나타낸다.
도 3b는 TR-FIA에 의한 SDF-1 측정 상의 플라스마 표본의 초기 가열의 작용을 나타낸 그래프이다. 플라스마 표본은 분석 전에 30분 동안 55℃에서 미리 인큐베이트되거나 또는 어떤 가열 없이 측정에 직접적으로 사용되었다. 플라스마 표본은 24명의 건강한 일본인 지원자로부터 수득되었다. 데이터는 2반복 측정의 평균치를 나타낸다.
도 3c는 TR-FIA에 의한 SDF-1 측정 상의 플라스마 표본 희석의 작용을 나타내는 그래프이다. 각각의 표본은 완충액 4로 희석되었다. 플라스마 표본은 5명의 건강한 일본인 지원자로부터 수득되었다. 데이터는 3반복 측정의 평균치를 나타낸다.
도 4a는 SDF-1의 대조군으로서 IL-8의 ELISA 정량화 상의 혈액 세포의 작용을 나타낸 그래프이다. IL-8이 플라스마 표본 내에 첨가된 후 세포 펠렛(pellet) 또는 플라스마는 그것과 함께 혼합되었다. 15분 동안 37℃에서의 인큐베이션 후 플라스마 내의 용해성 IL-8이 정량화되었다. 빈 사각형은 세포 펠렛 또는 플라스마와 혼합하지 않은 참조 표본을 나타내고; 검정색 원형은 플라스마와 혼합된 참조 표본을 나타내고; 또한 빈 원형은 세포 펠렛과 혼합된 표본을 나타낸다. 데이터는 4반복 측정의 평균치를 나타낸다.
도 4b는 SDF-1의 대조군으로서 MCP-1의 ELISA 정량화 상의 혈액 세포의 작용 을 나타낸 그래프이다. MCP-1이 플라스마 표본 내로 첨가된 후 세포 펠렛 또는 플라스마는 그것과 함께 혼합되었다. 15분 동안 37℃에서의 인큐베이션 후 플라스마 내의 용해성 IL-8이 정량화되었다. 심볼은 도 4a와 유사하다. 데이터는 4반복 측정의 평균치를 나타낸다.
도 5는 36명의 건강한 일본인 지원자로부터의 인간 플라스마 내의 SDF-1의 레벨을 나타내는 그래프이다. 모든 플라스마 표본은 분석 전에 55℃에서 30분 동안 열처리되었다. 데이터는 2개의 별개의 측정으로부터의 3반복 측정의 평균치를 나타낸다.
도 6은 인간 플라스마 표본 상의 단백질 G-세파로스(sepharose)로 인한 IgG 고갈의 작용을 나타낸 그래프이다. 7명의 건강한 일본인 지원자로부터의 플라스마 표본은 단백질 G-세파로스와 함께 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이트되었고, 원심분리되었으며 상청액 내의 SDF-1의 양이 측정되었다. 빗금친 바 및 검정색 바는 각각 가열되지 않은 표본 및 가열된 표본(30분 동안 55℃)을 나타낸다.
도 7은 GM-CSF의 눈금 곡선을 나타내는 그래프이다. 참조 GM-CSF는 TR-FIA 방법에 의해 측정되었다. 데이터는 3반복 측정의 평균치를 나타낸다.
도 8은 IL-2의 눈금 곡선을 나타내는 그래프이다. 참조 IL-2는 TR-FIA 방 법에 의해 측정되었다. 데이터는 3반복 측정의 평균치를 나타낸다.

이하, 본 발명은 실시예에 의해 더욱 상세히 설명된다. 이러한 실시예는 본 발명에 한정적인 것은 아니다.
실시예에 사용된 재료, 기구 및 측정 조건은 하기에 기술된다.
항체 : 항-SDF-1 항혈청은 인간 SDF-1β의 잔기 33-45(RFFESHIARANVK)를 포함하는 다중-항원 펩타이드(Research Genetics, 미국 알라바마)로 토끼를 면역시킴으로서 수득되었다. 항혈청은 어피니티 컬럼에 의해 정제되었고, 사용되었다. 인간 SDF-1에 대한 염소 폴리클론 항체는 R&D Systems Inc.(미국, 미네소타)로부터 구입하였다. 인간 백혈구-대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)에 대한 인간 단일클론 항체는 PharMigen(미국, 캘리포니아)에서 구입하였다. 인간 인터루킨 2(IL-2)에 대한 단일클론 항체는 PharMigen(미국, 캘리포니아)에서 구입하였다.
케모킨 : 인간 RANTES, 인간 MIP-1α 및 β, 인간 MDC 및 인간 프랙탈킨(fractalkine)은 DIACLONE Research(프랑스)에서 구입하였다. 인간 IL-8은 ENDOGEN(미국, 메사츄세츠)에서 구입하였다. 상용되는 ELISA 키트는 플라스마 에 첨가되는 마우스 IL-8 및 마이스 MCP-1의 측정에 사용되었다. 마우스 IL-8은 Amersham Pharmacia Biotech(스웨덴)에서 구입하였고, 마우스 MCP-1은 PharMigen(미국, 캘리포니아)에서 구입하였다. 마우스 SDF-1α, 마우스 SDF-1β, 인간 SDF-1α 및 인간 SDF-1β는 각각 Genetics Institute(미국, 메사츄세츠)로부터 기증받았다. 인간 GM-CSF는 PharMigen(미국, 캘리포니아)에서 구입하였다. 인간 IL-2는 PharMigen(미국, 캘리포니아)에서 구입하였다.
기구 및 측정 조건 : Wallac(핀란드) 및 Amersham Pharmacia Biotech(스웨덴)사의 1420 ARVO 다중-라벨 카운터가 하기의 측정 조건 하에서 타임-리절브드 형광도 측정에 사용되었다 : 약 0.20 밀리세컨드(ms)의 지연 시간, 약 0.40ms의 윈도우 시간, 약 1.00ms의 플래쉬(flash) 비율. 가장 민감한 TR-FIA 분석 시스템을 수득하기 위해 폴리소프(polysorp) 플레이트가 참조 인간 SDF-1β의 측정에서 가장 민감한 형광 신호를 생성하는 것 중에서 Nunc(덴마크)에서 구입한 5가지 타입의 마이크로타이터 플레이트가 측정되었다. 감도의 순서는 하기와 같았다 : 흰색 C96 맥시포스(maxisorp) > C96 맥시소프 > 흰색 C8 맥시소프 > 검정색 F16 맥시소프. 하기의 실험에서 흰색 C96 폴리소프 마이크로타이터 플레이트가 일관되게 사용되었다.
(실시예 1) TR-FIA의 예비 연구
먼저 SDF-1 측정을 위한 ELISA-기초 면역분석 시스템에 적당한 고체-상-결합된 포획 항체의 결합 및 항체의 검출을 확인하기 위한 노력이 이루어졌다. 이러한 목적으로 다양한 결합은 폴리클론 토끼 항-SDF-1 항체 및 폴리클론 염소 항-SDF-1 항체를 포함한 총 5가지 종류에 대해 이루어졌다. 참조 SDF-1의 특이적 검출은 3가지의 결합에서 관찰되었다. 그러나 ELISA에서 SDF-1의 검출 한계는 약 10∼20ng/ml을 결코 넘지 않았다. 일반적으로 플라스마 내에 존재하는 SDF-1의 레벨은 이러한 검출 한계보다 훨씬 낮다. 따라서 ELISA 분석으로 플라스마 표본 내의 SDF-1을 검출하는 것은 실제로 불가능하다고 확신하였다.
전술된 방식에서 발견된 폴리클론 항체의 가장 바람직한 결합을 사용함으로서 SDF-1 검출은 하기에 기술된 일반적인 TR-FIA 조건의 변형에 의해 수행되었다.
(실시예 2) 참조 SDF-1의 TR-FIA
4가지 종류의 분석 완충액이 TR-FIA용으로 준비되었다 : 96-웰 마이크로타이터 플레이트 코팅용 완충액 1(0.14M NaCl을 함유한 0.15M 인산염 완충액(PBS)); 플레이트 세척용 완충액 2(0.05% Tween 20을 함유한 0.05M 트리스-HCl, pH 7.8); 플레이트 세척용 완충액 3(0.05M 트리스-HCl, pH 7.8); 및 단백질 용액 희석용 완충액 4(0.2% BSA, 0.1% NaN3 및 9% NaCl을 함유한 0.05M 트리스-HCl, pH 7.8).

BHHCT의 합성은 Yuan et al(1998)(Document 5)에서 기술된 방법에 따라 수행되었고; 스트렙토아비딘-소 혈청 알부민(SA-BSA) 컨쥬게이트의 준비 및 BHHCT와의 컨쥬게이트의 표식은 Yuan et al(1997)(Document 4)에서 기술된 방법에 따라 수행되었다. 표식된 컨쥬게이트 용액은 -20℃에서 보관되었고, 사용되기 바로 전에 하기의 용액(완충액 4)으로 100 ×로 희석되었다.
토끼 폴르클론 항-인간 SDF-1β항체 또는 염소 폴리클론 항-인간 SDF-1β항체는 포획 항체로 사용되었다. 이들은 유사한 결과를 나타내었다. 완충액 1로 10㎍/ml까지 희석된 포획 항체 용액(각각 60㎕)은 4℃에서 24시간 동안 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰 내에서 인큐베이트되었다. 다음으로 이러한 웰은 완충액 2로 2번 세척되었고, 완충액 3으로 1번 세척되었다. 상기 방식으로 항-SDF-1 항체로 코팅된 플레이트는 -20℃에서 적어도 한달 이상 동안 보관될 수 있다.
SDF-1의 참조 용액(50㎕)은 전술된 코팅된 플레이트 상에 피펫으로 옮겨졌고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트되었다. 완충액 2 및 3으로 플레이트를 세척한 후 염소 폴리클론 항-인간 SDF-1β항체로 비오틴화되고(일반적인 방법에 따라 R&D System 사의 전수된 염소 항체를 비오틴화함으로서 수득된), 완충액 4로 1000 ×까지 희석된 용액의 50㎕은 37℃에서 1시간 동안 웰 내에서 인큐베이트되었다. 인큐베이션 후 플레이트는 완충액 2로 2번 세척되었고, 완충액 3으로 1번 세척되었 으며 BHHCT-Eu3+로 표식된 BSA-SA 용액(50㎕)의 50㎕이 37℃에서 1시간 동안 웰 내에서 인큐베이트되었다. 이러한 플레이트는 1420 ARVO 다중-라벨 카운터를 이용함으로서 고체 형광도 측정이 이루어졌다.
수용액 내의 참조 SDF-1의 눈금 곡선은 도 1a 및 1b에 나타나 있다. TR-FIA에 의한 SDF-1의 검출 한계는 하기의 식(Kropf et al. (Document 2))으로부터 산출될 수 있다 :
3 ×[SO] ×SB / (SO - B)
[SO]는 참조 용액의 최소 농도이고;
SB는 블랭크의 표준편차이고;
SO는 최소 농도에서의 참조 용액의 형광 신호 강도이고;
B는 블랭크의 형광 신호 강도이다.
상기의 식에서 TR-FIA의 검출 한계는 30pg/ml로 산출되었고, 이는 전술된 참조 실시예에서 ELISA에 의한 검출 한계(약 10∼20ng/ml) 보다 1000배 더 낮은 것이다. 50㎕의 용액이 웰 당 사용되기 때문에 TR-FIA에 의해 검출가능한 SDF-1 단백 질의 최소량은 1.5pg/well이다.
TR-FIA는 또한 측정 재현성에 있어서 증진된 것으로 나타났다. TR-FIA에 의한 SDF-1 검출의 편차 계수(CV)는 0.1ng/ml 내지 1024ng/ml의 농도 범위 내의 참조 표본의 7% 보다 더 작다. 이는 상기-기술된 참조 실시예의 ELISA의 CV 값이 0.1ng/ml 내지 1024ng/ml의 농도 범위 내에서 10%를 초과하고, DELFIA의 CV 값(하기의 비교실시예를 참고)도 또한 0.1ng/ml 내지 1024ng/ml의 농도 범위 내에서 10%를 초과한다는 사실과는 대조적이다.
전술된 고체상 형광도 측정에 더하여 액상 형광도 측정도 또한 연구되었다. 특히 전술된 절차에 의해 고체상에 형성된 형광성 합성물(폴리클론 항-SDF-1 항체-SDF-1-비오틴화된 폴리클론 항-SDF-1 항체 BHHCT-Eu3+ 표식된 BSA-SA)은 산성 킬레이트된 계면활성제 용액(10μM TOPO 및 0.05% SDS를 함유한 0.1M NaHCO3 수용액)으로 처리되어 표식된 BSA-SA 컨쥬게이트가 고체상으로부터 해리되도록 하였다. 용액 내의 컨쥬게이트의 형광 강도는 1420 ARVO 다중-라벨 카운터를 이용하여 측정되었다. 이러한 경우 SDF-1 검출 감도는 약 100pg/ml이고, 이는 전술된 고체상 측정 만큼 높지 않다.
(실시예 3) 인간 SDF-1β에 의한 CXCR4의 다운 모듈레이션(down modulation)

실시예 2에 따른 TR-FIA에 의한 SDF-1 측정치와 참조 SDF-1 단백질의 생물 활성 사이의 상호관계를 확인하기 위해 SDF-1의 결합시 EL-4 세포 내에서 유도되는 SDF-1 수용체의 실험실 내에서의 다운 모듈레이션이 측정되었다.
EL-4 세포는 인간 SDF-1β(1, 10, 20, 40, 100 및 1000ng/ml)의 존재 또는 부재의 조건 하에 10%의 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 Dulbeco-변형된 Eagle 배지(D' MEM) 내에서 배양되었다. 37℃에서 6시간 동안의 인큐베이션 후 세포 표면 상의 CXCR4는 Fc-인간 SDF-1α키메릭 단백질 및 FITC-결합된 염소 F(ab')2 항-인간 IgG(Southern Biotechnology Associates, 미국 알라바마)로 염색되었다. 형광 강도 측정은 플루오로사이토메트리(fluorocytometry)(FACSACalibur, BECTON DICKINSON, 미국 캘리포니아)에 의해 수행되었다. CXCR4의 다운 모듈레이션은 CXCR4 염색의 평균 형광 강도(MFI)의 백분율 감소를 산출함으로서 측정되었다. 결과는 도 1c에 나타나 있다.
도 1c에서 인간 SDF-1과 인큐베이트된 EL-4 세포는 양-의존적 형태로 CXCR4 발현에 있어서 다운 모듈레이트된다는 것을 나타낸다. 수득된 결과는 SDF-1α 및 β가 각각 5∼10nM aldc 2.2∼3.6nM의 Kd 값으로 CXCR4에 결합한다는 이전의 보고(Hesselgesser et al. (Document 13) 및 Amara et al. (Document 14)와 일치하 였다.
(실시예 4) TR-FIA에 의한 SDF-1 측정의 특이성
SDF-1에 있어서 TR-FIA의 특이성을 확인하기 위해 실시예 2에서 기술된 것과 유사한 TR-FIA 측정이 하기의 다양한 케모킨에 대해 이루어졌다 : CC 케모킨(마우스 MCP-1, 인간 MIP-1α 및 β, 인간 RANTES, 인간 MDC), CXC 케모킨(인간 IL-8, 마우스 SDF-1α 및 마우스 SDF-1β, 인간 SDF-1α 및 인간 SDF-1β) 및 CXXXC 케모킨(인간 프랙탈킨). 결과는 도 1d에 나타나 있다. SDF-1과 같은 케모킨 내에서 형광 강도의 유의적인 증가가 없는 것으로 관찰되었다. 따라서 전술된 TR-FIA 가 고감도로 SDF-1을 검출하는 것이 가능하다는 것을 확인하였다. 교차-반응성은 인간과 마우스 SDF-1α 및 SDF-1β사이에서 나타났다.
(실시예 5) 플라스마 표본의 준비
하기의 실시예에 사용된 플라스마 표본은 EDTA(혈액의 1mg/ml)를 혈액응고방지제로 사용함으로서 18∼30세의 36명의 건강한 지원자(일본인)로부터 준비되었다. 특히 이것의 0.7㎕가 수집된 혈액의 1ml 당 존재하게 하기 위해 0.1M EDTA로 코팅된 주사기에 0.5M EDTA 함유 PBS가 채워졌다. 혈액은 이러한 주사기 내로 수집되었고, 5분 동안 상온에서 인큐베이트되었으며 그 후 10분 동안 3000 rpm으로 원심 분리되어 플라스마를 수득하였다. 플라스마 표본은 -80℃에서 보관되었고, 특별한 경우가 아니면 사용하기 바로 전에 완충액 4로 10 ×까지 희석되었다. 동결/해동이 분석 전에 반복되면 안된다.
(실시예 6) 플라스마 표본의 TR-FIA
실시예 2에서 기술된 TR-FIA는 참조 SDF-1 용액 및 전술된 플라스마 표본(5명으로부터 수득된)에 대해 수행되었다. 각각의 플라스마 표본 내의 SDF-1 농도는 참조 용액의 측정으로부터 유도된 눈금 곡선(즉, 도 2의 좌측면 상에 검정색 원으로 그려진 선 그래프)에 대한 비교에 의해 산출되었다. 더욱이 측정의 정확도를 확인하기 위해 측정은 각각의 플라스마 표본에 0.4 또는 0.8ng/ml의 참조 SDF-1을 첨가함으로서 수행되었고, 회복율이 산출되었다.
첨가된 참조 SDF-1을 지닌 플라스마 표본의 측정된 형광 강도는 도 2의 우측 면상에 나타나 있다("TR-FIA"라는 표제 하에). 참조 SDF-1의 첨가 전후의 SDF-1 농도 및 플라스마 표본의 회복율은 하기의 표 1에 나타나 있다. TR-FIA가 참조 용액의 경우와 같이 플라스마 표본 내에서 높은 회복율로 SDF-1을 검출하는 것을 가능하게 한다는 것을 나타내었다.
(비교실시예) SDF-1의 DELFIA

DELFIA의 하기의 측정 실행은 특별한 경우가 아니면 제조사(Amersham Pharmacia Biotech; 이하 "APB")에서 제공된 지침서에 따라 수행되었다. 모든 세척은 PBS/0.05% Tween 20을 이용하여 이루어졌다.
10㎍/ml까지 PBS로 희석된 토끼 항-인간 SDF-1β항체 또는 염소 항-인간 SDF-1β항체(각각 60㎕)의 용액은 투명한 맥시소프 플레이트(Nunc, 덴마크)에 흡착되었고, 4℃에서 24시간 동안 인큐베이트되었으며 그 후 1번 세척되었다. 다음에 비-특이적 결합을 차단하기 위해 180㎕의 DELFIA 분석 완충액(APB)이 상온에서 적어도 30분 이상 적용되었다.
플레이트가 3번 세척된 후 DELFIA 분석 완충액으로 희석된 참조 SDF-1 또는 10 ×로 희석된 플라스마 표본이 웰 당 50㎕의 양으로 첨가되었고, 4℃에서 적어도 6시간 동안 인큐베이트되었다. 플레이트가 3번 세척된 후 20ng/ml까지 희석된 100㎕의 스트렙토아비딘으로 표식된 Eu(APB)가 분석 완충액 내로 첨가되었고, 상온에서 30분 동안 인큐베이트되었다. 플레이트가 6번 세척된 후 Eu3+가 고체상에 결합된 Eu-표식된 항체로부터 분리되게 하기 위해 DELFIA 감작한(sensitizing) 용액(APG)이 첨가되었다. 5분 동안 마이크로플레이트를 천천히 진탕한 후 형광도가 타임-리절브드 플루오로미터(fluorometer)(ARVO 1420)로 측정되었다.

참조 용액의 측정으로부터 유도된 눈금 곡선은 도 2의 좌측면 상에 나타나 있다(즉, 검정색 사각형으로 그려진 선 그래프). 실시예에서 기술된 식에 따라 산출된 검출 한계는 130pg/ml이다. DELFIA는 TR-FIA에 의한 것 보다는 낮은 감도지만 참조 용액 내의 SDF-1을 검출할 수 있었다. 그러나 플라스마 표본의 측정은 내생적 SDF-1을 성공적으로 검출하지 못했다. 더욱이 각각의 플라스마 표본 내로 1.0ng/ml의 참조 SDF-1의 첨가에 의한 측정의 회복율은 약 20% 이하로 이는 TR-FIA에 의한 것보다 훨씬 낮다.
참조 SDF-1이 첨가된 플라스마 표본에 대해 측정된 형광 강도는 도 2의 우측면 상에 나타나 있다("DELFIA"라는 표제하에). 참조 SDF-1의 첨가 전후의 플라스마 표본의 SDF-1 농도 및 회복율은 표 1에 나타나 있다. (도 2에 나타난 플라스마 표본 및 표 1의 데이터는 모두 55℃에서 30분 동안 미리 가열된 것이라는 점이 주지되어야 한다.)
인간 플라스마에 첨가된 SDF-1의 회복율
첨가된 참조 SDF-1 (ng/ml) SDF-1 측정 (ng/ml) 예상 총 SDF-1 (ng/ml) 회복율 (%)
(a) TR-FIA 0 1.08 -
1.0 2.10 2.08 102
0 1.53 -
1.0 2.48 2.53 95
0 1.68 -
1.0 2.69 2.68 101
0 1.87 -
1.0 2.83 2.87 96
0 2.14 -
1.0 3.11 3.14 97
(b) DELFIA 0 < D.L.
1.0 0.20 > 1.0 < 20
0 < D.L.
1.0 0.16 > 1.0 < 16
0 < D.L.
1.0 0.17 > 1.0 < 17
0 < D.L.
1.0 0.20 > 1.0 < 20

(실시예 7) 혈액응고방지제 및 프로테아제 억제자의 작용
혈액응고방지제 및 프로테아제 억제자는 인간 플라스마 표본 내의 사이토킨 측정에 영향을 미친다고 보고되었다(Thavasu et al. (Document 15)). 하기의 실험은 TR-FIA에 의한 SDF-1 측정이 이러한 인자에 의해 영향을 받는 여부를 연구하기 위해 수행되었다.
에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)(1.0mg/ml), 헤파린(heparin)(30IU/ml), 구연산나트륨(0.38%) 또는 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)(1.0mg/ml) 및 프로테아제 억제자인 아프로티닌(aprotinin)(1㎍/ml)이 플라스마 표본 내에 첨가되었다. 실시예 2와 같은 방식으로 SDF-1은 첨가와 함께 각 표본에 대해 TR-FIA에 의해 측정되었다. 결과는 도 3a에 나타나 있다. 혈액응고방지제 및 프로테아제 억제자는 TR-FIA에 의한 플라스마 SDF-1 측정에 유의적인 영향을 미치지 않는다고 확인하였다.
(실시예 8) 플라스마 표본의 예비 가열의 작용
TR-FIA에 의한 SDF-1 측정의 임상적 적용에서 혈액-기원의 표본에 존재하는 HIV 바이러스를 불활성화시키는 것이 필요하다. 따라서 TR-FIA 시의 플라스마 표본의 예비 가열의 작용이 연구되었다.
먼저 SDF-1 단백질의 열 안정성을 측정하기 위해 SDF-1 참조 용액을 0℃에서 30분 동안; 37℃에서 30분 동안; 55℃에서 30분 동안; 70℃에서 30분 동안; 또는 100℃에서 1분 동안 방치한 후 분석되었다. 70℃에서 30분 동안 및 100℃에서 1분 동안의 조건 하에서 아마도 SDF-1의 열 변성에 기인한 검출된 양의 감소가 관찰되었다. 반대로 37℃ 또는 55℃에서 30분 동안의 가열은 비-가열된 표본과 실질적으로 동일한 눈금 곡선을 나타내었고, SDF-1의 검출된 양에 영향을 미치지 않았다.
상기의 결과에 기초하여 실시예 2에서와 유사한 방식으로 TR-FIA에 의해 SDF-1을 측정하기 위해 24명으로부터의 플라스마 표본이 분석 전에 55℃에서 30분 동안 미리 인큐베이션하거나 가열 없이 사용되었다. (예비 가열은 완충액 4로 플 라스마 표본을 희석하기 전에 수행되었다.) 결과는 도 3b에 나타나 있다. 55℃에서 30분 동안의 예비 가열은 평균 수치 약 20%의 형광 강도를 유발하였다.
이러한 결과는 적어도 플라스마 표본 내의 SDF-1의 부분이 멀티머(multimer)의 형태 및/또는 열적으로 분리되거나, 분해되는 등의 결합 인자에 결합된 형태로 존재한다는 것을 제시한다. 이러한 멀티머 및/또는 결합된 형태 내에 존재하는 SDF-1이 에피토프에 결합하는 것을 방해받는 것이 가능하다.
(실시예 9) 플라스마 표본 희석의 작용
플라스마 표본 내의 IL-8 및 MCP-1의 측정에 관한 이전의 연구(Thavasu et al. (Document 15) 및 Kajikawa et al. (Document 16))는 존재하는 케모킨의 양이 비-희석된 표본의 측정에서 측정되지 않았다는 것을 나타내었다. 따라서 TR-FIA에 의한 SDF-1 측정시의 플라스마 표본의 희석 작용을 연구하였다.
1 : 1 ∼ 1 : 20의 다양한 비율로 희석된 5명으로부터의 플라스마 표본은 실시예 2에서와 유사한 방식으로 TR-FIA에 의해 SDF-1을 측정하는데 사용되었다. 결과는 도 3c에 나타나 있다. 희석비율이 1 ×에서 10 ×까지 증가될 때 검출 감도의 실질적인 증가가 관찰되었다. 반대로 희석 비율이 10 ×에서 20 ×까지 증가될 때 검출 감도의 어떤 증가도 없었다. 따라서 10 ×희석(즉, 플라스마 표본 1에 대해 완충액 4의 10)이 가장 효과적인 조건으로 측정되었다.
(실시예 10) 플라스마 표본 내로의 혈액 세포의 첨가 작용
전체 혈액 내로의 IL-8 및 MCP-1의 첨가는 이러한 케모킨이 혈액 세포에 의해 흡수되는 것을 유발한다고 보고되었다(Amara et al. (Document 14), Darbonne et al. (Document 17), 및 Neote et al. (Document 18)). 혈액 세포에 의한 유사한 흡수가 SDF-1에 대해 관찰되는지 여부를 연구하였다.
세포를 침전시키기 위해 전체 혈액의 250㎕를 마으크로원심분리함으로서 125㎕의 상청액 프랙션의 플라스마가 수득되었다. IL-8, MCP-1 또는 SDF-1는 125㎕의 플라스마 내로 첨가되어 미리측정된 최종 농도가 얻어졌다. 다음으로 이러한 케로킨이 첨가된 플라스마가 부피로 125㎕인 세포 펠렛 또는 125㎕의 플라스마로 혼합되었고, 그 후 37℃에서 15분 동안 인큐베이트되었다. 다음에 세포 펠렛이 혼합된 표본의 경우 세포는 원심분리를 통해 침전되고 분리되었다. 표본 내의 용해성 IL-8 및 MCP-1은 ELISA에 의해 정량화되었고, SDF-1은 TR-FIA에 의해 정량화되었다. 결과는 도 4a∼4c에 나타나 있다.
대부분의 첨가된 IL-8 및 MCP-1은 혈액 세포에 의해 흡수되었다(도 4a 및 4b). 반대로 혈액 세포와의 인큐베이션 후 SDF-1의 감소는 10% 이하였다(도 4c). 또다른 실험에서 SDF-1은 전체 혈액에 직접적으로 첨가되었고; 인큐베이션 후 혈액 세포가 분리되었고; 또한 그 후 TR-FIA 정량화가 수행되었으며 이는 SDF-1을 플라스마 내로 첨가함으로서 수득된 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 상기로부터 SDF-1이 혈액 세포에 의해 거의 흡수되지 않는다는 것을 확인하였다.
(실시예 11) 플라스마 표본 내의 TR-FIA - 다중 검출
36명으로부터의 플라스마 표본에 대해 SDF-1이 55℃에서 30분 동안의 예비 가열 후 실시예 2와 유사한 방식으로 TR-FIA에 의해 측정되었다(실시예 7 참고). 결과는 도 5c에 나타나 있다. 인간 플라스마 내의 SDF-1의 레벨은 0.85 ±0.26ng/ml의 평균치와 표준편차를 지닌다.
측정은 4일 또는 그 이상의 다른 날에 동일한 조건으로 동일한 사람(3명)으로부터의 플라스마 표본에 대해 반복적으로 이루어졌고, 이에 따라 측정치는 10∼20% 내의 변동을 나타내었다. 이는 TR-FIA에 의한 플라스마 SDF-1 측정이 충분히 높은 재현성을 지님을 나타낸다.
(실시예 12) 플라스마 표본 내에서의 SDF-1과 IgG의 결합
IL-8 및 MCP-1과 같이 순환계 내에서의 자가항체와의 결합 가능성이 플라스마 표본의 면역분석을 방해하는 또다른 인자로 보고되었다(Leonard et al. (Document 1) 및 Thavasu et al. (Document 15)). 하기의 방식으로 SDF-1은 플라스마 내의 IgG와의 결합에 대해 측정되었다.
열처리 없이 또는 열처리 후(55℃, 30분) 7명으로부터의 플라스마 표본이 30분 동안 단백질 G-세파로스(sepharose)와 함께 얼음 상에서 인큐베이트되었고, 이에 의해 IgG를 제거하였다. 표본은 원심분리되고, 그로부터 상청액 프랙션을 취하였다. 상청액 내의 SDF-1은 TR-FIA에 의해 측정되었다. 단백질 G-세파로스 처리 전의 플라스마 표본의 측정치에 대한 형광 강도의 감소 비율이 산출되었다. 결과는 도 6에 나타나 있다.
도 6에서 빗금친 바와 검정색 바는 각각 가열되지 않은 표본과 가열된 표본을 나타낸다. 이는 가열되지 않은 표본이 가열된 표본 보다 단백질 G-세파로스 처리의 작용에 영향을 받기 쉬운 것을 나타낼 수 있다. 가열되지 않은 표본에서 TR-FIA에 의해 측정가능한 SDF-1 레벨이 IgG의 제거로 인해 23∼37%까지 감소하였다. 반대로 가열된 표본에 있어서 상응하는 감소는 6∼22%였다(평균 15%). 따라서 실시예 8에서 나타난 예비 가열의 효과는 플라스마 내의 SDF-1의 부분이 IgG와 결합된 형태로 존재하고, 가열을 통해 분리되어 TR-FIA에 의해 측정가능한 용해성 형태로 변환된다는 가설에 의해 설명될 수 있다.

또다른 실험에서 단백질 G-세파로스 처리 후 플라스마 표본 내로 첨가된 참조 SDF-1에 대해서는 어떤 유의적인 감소도 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 따라서 단백질 G-세파로스에 흡착되는 SDF-1 자체의 가능성 및 단백질 G-세파로스에 흡착되는 플라스마 표본 내의 항-SDF-1 IgG 외의 항체 또는 단백질의 가능성 및 이러한 항체 또는 단백질에 흡착되는 SDF-1이 부정되었다.
상기의 결과로부터 TR-FIA에 의해 측정가능한 인간 플라스마 내의 SDF-1 레벨은 혈액 내에 실제로 존재하는 생리학적 SDF-1 레벨과 매우 가깝다는 것을 이해할 수 있다.
(실시예 13) GM-CDF의 TR-FIA
GM-CSF이 참조 용액(50㎕)은 포획 항체로서 항-인간 GM-CSF 단일클론 항체를 사용하고, 비오틴화된 항-인간 GM-CSF 단일클론 항체(일반적인 방법을 따름으로서 전술된 PharMingen 인간 항체를 비오틴화함으로서 수득된)를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2와 유사한 방식으로 고체상 형광도가 측정되었고, 참조 GM-CSF에 대한 눈금 곡선이 생성되었다. 결과는 도 7에 나타나 있다. 더욱이 플라스마 표본은 실시예 5와 유사한 방법에 의해 건강한 일본인 지원자로부터 준비되었고, 실시예 9에서 기술된 바와 같이 완충액 4로 희석되었으며 참조 용액과 유사한 방식으 로 TR-FIA에 의한 GM-CSF 측정이 이루어졌다. 그 결과로서 고감도의 측정이 GM-CSF에 대해 가능하였고, 우수한 결과가 재현성까지 확인되었다.
(실시예 14) IL-2의 TR-FIA
IL-2의 참조 용액(50㎕)은 포획 항체로서 항-인간 IL-2 단일클론 항체를 사용하고, 비오틴화된 항-인간 IL-2 단일클론 항체(일반적인 방법을 따름으로서 전술된 PharMingen 인간 항체를 비오틴화함으로서 수득된)를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2와 유사한 방식으로 고체상 형광도가 측정되었고, 참조 IL-2에 대한 눈금 곡선이 생성되었다. 결과는 도 8에 나타나 있다. 더욱이 플라스마 표본은 실시예 5와 유사한 방법에 의해 건강한 일본인 지원자로부터 준비되었고, 실시예 9에서 기술된 바와 같이 완충액 4로 희석되었으며 참조 용액과 유사한 방식으로 TR-FIA에 의한 IL-2 측정이 이루어졌다. 그 결과로서 고감도의 측정이 IL-2에 대해 가능하였고, 우수한 결과가 재현성까지 확인되었다.
생물 유체 표본 내의 사이토킨 특히 SDF-1을 포함하는 케모킨을 고감도로 용이하게 검출하는 것이 가능한 타임-리절브드 형광면역분석(TR-FIA) 방법뿐만 아니라 상기 방법에 의한 키트가 제공된다. 상기 방법 및 키트는 혈액 순환 내의 용 해성 인자로서 존재하고, 소량으로 생물 활성을 지니는 사이토킨에 적용가능하고, 다양한 병리학에 연관된다.

Claims (16)

  1. 케모카인(chemokine)계 사이토킨을 검출하기 위한 시간분해 형광면역분석방법에 있어서, (a) 고체상에 결합되는 부분 및 사이토킨에 결합가능한 구역을 포함하는 첫 번째 항체; (b) 케모카인계 사이토킨; (c) 사이토킨에 결합가능한 구역 및 비오틴이 결합하는 부분을 포함하는 두 번째 항체; (d) 스트렙토아비딘(streptoavidin) 또는 아비딘 1분자 당량 당 란타노이드(lanthanoid) 금속 이온과 착체 형성 되는 10∼60 당량의 형광성 구조 부분을 포함하는 컨쥬게이트(conjugate); 및 (e) 란타노이드 금속 이온이 순차 결합된 복합체(composite)를 상기 고체상에 형성시키는 단계;
    상기 란타노이드 금속 이온과 착체 형성된 형광성 구조 부분의 형광도를 측정하는 단계로 구성된 생물 유체 표본 내의 케모카인계 사이토킨을 검출하기 위한 타임-리절브드 형광면역분석(TR-FIA) 방법.
    상기 형광성 구조 부분은 일반식(Ⅰ)에 의해 표현되고
    Figure 712005002241082-pct00034
    (상기 R은 단백질과 공유결합을 형성할 수 있는 관능 그룹의 잔기이고; Ar은 컨쥬게이트된 이중결합 시스템을 지닌 탄화수소 그룹이고; n은 1과 동일하거나 더 큰 정수; 및 X는 불소 원자 또는 일반식(Ⅱ)에 의해 표현된 그룹이다.)
    Figure 712005002241082-pct00013
  2. 제 1항에 있어서, 상기 라타노이드 금속 이온은 유로퓸임을 특징으로 하는 방법
  3. 제 1항에 있어서, 상기 형광성 구조 부분은 일반식(Ⅲ)에 의해 표현됨을 특징으로 하는 방법 :
    Figure 112002009335310-pct00014
    (상기 R, Ar 및 n은 상기에 기술된 바와 동일)
  4. 제 3항에 있어서, 상기 형광성 구조 부분은 4,4'-비스(bis)(1",1",2",2",
    3",3",-헵타플루오로-4",6",-헥산디온(hexanedion)-6"-yl)-설포(sulpho)-o-테르페닐(terphenyl)임을 특징으로 하는 방법
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 형광도 측정하는 단계는 고체상에 형성된 합성물을 분리시키지 않고 수행됨을 특징으로 하는 방법
  7. 제 1항에 있어서, 상기 형광도 측정하는 단계는 고체상에서 형성된 합성물을 분리시킨 후 수행됨을 특징으로 하는 방법
  8. 삭제
  9. 제 1항에 있어서, 상기 케모카인계 사이토킨은 CXC 케모카인임을 특징으로 하는 방법
  10. 제 1항에 있어서, 상기 케모카인계 사이토킨은 스트로마 세포-유도 인자-1(SDF-1)임을 특징으로 하는 방법
  11. 제 1항에 있어서, 상기 생물 유체 표본은 플라스마 또는 전체 혈액임을 특징으로 하는 방법
  12. 제 1항에 있어서, 표본 희석에 사용되는 완충액으로 생물 유체 표본을 희석시키는 단계가 합성물을 형성하는 단계 전에 더욱 포함됨을 특징으로 하고,
    상기 표본 희석에 사용되는 완충액은 0.1∼0.3%의 소 혈청 알부민, 0.05∼0.2%의 아지드화나트륨 및 0.5∼1.5%의 염화나트륨을 함유하는 약 pH 7.3∼8.3의 완충액인 0.01∼0.1M의 트리스-염산임을 특징으로 하는 방법
  13. 제 1항에 있어서, 사이토킨에 대해서 비-변성 온도 조건 하에 생물 유체 표본을 열처리를 하는 단계가 합성물을 형성하는 단계 전에 더욱 포함됨을 특징으로 하는 방법
  14. 제 1항에 있어서, 세척에 사용되는 완충액으로 고체상에 형성된 합성물을 세척하는 단계가 형광도를 측정하는 단계 전에 더욱 포함됨을 특징으로 하고,
    상기 합성물 세척에 사용되는 완충액은 0.01∼0.1%의 폴리옥시에틸린소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylenesorbitan monolaurate)를 함유하는 약 pH 8.5∼9.5의 완충액인 0.01∼0.1M의 트리스-염산임을 특징으로 하는 방법
  15. 제 1항에 있어서, 상기 고체상은 50∼200ng/㎠의 IgG 흡착능을 지닌 마이크로타이터(microtiter) 플레이트임을 특징으로 하는 방법
  16. 케모카인(chemokine)계 사이토킨을 검출하기 위한 시간분해 형광면역분석용 키트에 있어서, 고체상에 결합되는 부분 및 사이토킨에 결합가능한 구역을 포함하는 첫 번째 항체; 사이토킨에 결합가능한 구역 및 비오틴이 결합하는 부분을 포함하는 두 번째 항체; 스트렙토아비딘 또는 아비딘 1분자 당량 당 란타노이드 금속 이온과 착체 형성 되는 10∼60 당량의 형광성 구조 부분을 포함하는 컨쥬게이트; 및 란타노이드 금속 이온으로 구성된 생물 유체 표본 내의 케모카인계 사이토킨을 검출하기 위한 타임-리절브드 형광면역분석(TR-FIA)용 키트.
    상기 형광성 구조 부분은 일반식(Ⅰ)에 의해 표현되고
    Figure 712005002241082-pct00035
    (상기 R은 단백질과 공유결합을 형성할 수 있는 관능 그룹의 잔기이고; Ar은 컨쥬게이트된 이중결합 시스템을 지닌 탄화수소 그룹이고; n은 1과 동일하거나 더 큰 정수; 및 X는 불소 원자 또는 일반식(Ⅱ)에 의해 표현된 그룹이다.)
    Figure 712005002241082-pct00016
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