TWI270672B

TWI270672B - A time-resolved fluoroimmunoassay method for detecting a cytokine in a biological fluid sample and a kit for the same

Info

Publication number: TWI270672B
Application number: TW089120101A
Authority: TW
Inventors: Kei Tashiro; Tasuku Honjo; Masaya Ikegawa; Kazuko Matsumoto
Original assignee: Japan Science & Tech Corp
Priority date: 1999-09-29
Filing date: 2000-10-25
Publication date: 2007-01-11
Also published as: WO2001023891A1; KR20020033208A; DE60027910D1; DE60027910T2; AU7448600A; CA2385613A1; US7255998B1; JP3586243B2; CN1402834A; CA2385613C; EP1221616B1; EP1221616A4; KR100542033B1; CN1227532C; EP1221616A1

Description

1270672

技術領域本發明是有關在生物流體樣品中偵測組織介素之以時間分析形螢光免疫測定（TR-FIA)法，且特別是利用螢光銪絡合物偵測生物流體樣品中組織介素之高感度分析法。背景存在於正常生物流體中之自由態組織介素或化學介素，如人類血漿中’其濃度是近乎或在傳統elisa分析法可偵測 4限度心下。例如，有報告指出，傳統的ELISA分析可偵測之限度是約6微微莫耳（PM)，無法自正常人類血漿内測出 IL-8 (Leonard et al·(文件1))。爲了達到化學介素濃度在生物流體樣品中有正確之測度，加強偵測之敏感度及減少和生物"iL fa樣ρα有關之非特異背景是主要解決的問題所在。近年來，已發展出一種利用銪絡合物之以時間分析形螢光測定法，-且已應用於臨床上（Kr〇pf et ah，（文件2))。自由態，絡合的銪離子（Ειι3+)，其放射波長（615毫微米）並不受激發波長（340¾微米）或與某些蛋白質有關之暫時背景勞光 (3 50-600當彳政米）所影響’此點是合宜的。以此原理爲基礎的種刀析型式已用DELFIA商品化（解離一加強之鍚〗系營光免疫測定；Pharmacia)，且已被用於分析tNf α及IL_6。然而，在正確地偵測血漿中此組織介素濃度上，delfia尚未成功（Ogataetal,(文件 3))。近來，由Matsumoto領導之團'體發展出以4,4匕雙 (1”，1”，2”，2”，3”，3”，4氟-4”，6”，-已烷二醯-6”-基）_績基_間二聯三苯（BHHCT)-Eu3+絡合物爲標記化合物。此絡合物可直本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------^---------

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1270672

五、發明說明（2 ) 接結合至蛋白質，經由以時間分析形螢光偵測可有高的感度分析。（Yuan et aL(，97)(文件 4)及 Yuan et ai (，98)(文件 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 5))。BHHCT有一個_二酮結構，且就Eu3+而言其結合穩定性常數高達ΙΟ1%!·1。因而生成之Eu>絡合物呈現極特性，可由超過400微秒（μ〇之壽命，及33〇毫微米及615毫微米之吸收及發射波長高峰證知。此絡合物已拮出可用於偵測α -胎兒蛋白（Yuan et al.(’98)(文件5)及免疫球蛋白e (IgE)(Yuan et al.(’97)(文件4))，其爲人類血漿中之腫瘤標幟。然而，尚無例子指出此Eu3+絡合物可由於偵測生物流體樣品中之組織介素。基質細胞一衍生之因子-1 (SDF-1)是屬於化學介素族中的一種組織介素，其最先於1993年自基質細胞系中被移殖出來（Tashiro et al·(文件6))。SDF-1是CXCR4受體的主要配體 (Bleul et al-.(—文件 7 )及 Oberlin et al.(文件 8 ))。已知此受體之作用是充作人類免疫缺失病毒1型（HI V-1)亞群之CD4輔受體。再者，近來的研究顯示，SDF-1基因的多形性涉及於後天免疫缺失症候群（AIDS)進展之減緩（如Winkler et al.(文件 9 )及Martin et al.(文件1 〇 ))。然而’其功能機制容納許多理論，且尚未被確立。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製也有報告指出，SDF-1在造血，心血管及神經系統的胚盤生成中扮演基本角色（如Zou et al·(文件1 1 )及Tachibana et al.(文件1 2))。另一方面，SDF-1的許多生物功能在成年人組織中尚是未知的。如上文所述，十分重要的是促進SDF-1的了解以發展出可 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1270672

五、發明說明（3 正確定量及追縱生物流體樣品中SDF]之技術。勿用說，在生物⑽樣品中正確的偵測法，在其他的化學介素及組織 :素中也可類似地有理論上及臨床上的貢獻。由此觀點，疋極需可以高感度偵測組織介素之分析方法。發明概要本1明目軚疋解決上述問題，並提出以較高感度及容易性在生物/死體樣品中偵測組織介素之方法。依據本發明，在此提出於生物流體樣品中偵測組織介素之以時間分析形螢光免疫測定法（TR_FIA)。此方法包括：形成-個複合物，其中結合有⑷一個第一抗體，包括結合至固相的部份及一個可與組織介素結合之區域；（…組織介素，（c) 一個第二抗體包括可與組織介素結合的區域，及已結合有生物素之部份；（d)一個共軛物包括鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，及可與鑭系金屬離子絡合的螢光結構部份；及（e)鑭系金屬離子，複合物係形成在固相上；及偵測已與鑭系金屬離子絡合之螢光結構部份之螢光，其中螢光結構部份可由下式（I)代表： -R-Ar-C(=0)-CHrC(=0)-CnF2n+rX ⑴ (其中R是殘基，其爲可與蛋白質形成共價鍵之官能基；Ar 是具有共軛雙鍵系之烴基團；n是相當於或大於丨之整數；且X是氟原子或由式（π)化表之基團： -C(=〇)=CH2-C(=0)-Ar-R- (I I) 在本發明的一個具體實例中，鑭系金屬離子可以是銪。在本發明的一個具體貫例中，螢光結構部份可以通式（ΙΠ) -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1270672

、發明說明（ 4 代表： ^R-Ar«(C(=〇).CHrC(=0).CnF2n+1)2 (III) (其中R，Ar及n具上示之相同定義）。在本發明的一個具體實例中，螢光結構部份可以是4,4，- 又（，1’’，1丨’，2”，2丨，，3丨丨，3，，4氟-4，，，6丨，-己烷二醯-6丨丨-基）-磺基_ 間-聯三苯基。在本發明的一個具體實例中，在共軛物中每莫耳鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白可有10至60單位的螢光結構部份。在本發明的一個具體實例中，偵測螢光之步驟可在未令複合物在固相上形成而解離之前進行。在本發明另一具體實例中，偵測螢光之步驟可在令複合物在固相上形成而解離之後進行。在本發明·的一個具體實例中，組織介素可爲屬於化學介素族的組織介素。在本發明的一個具體實例中，組織介素可以是CXC化學介素。在本發明的一個具體實例中，組織介素可以是基質細胞一衍生的因子-1 (SDF-1)。另外’在本發明的一個具體實例中，組織介素可以是以可溶性因子型式存在於血液循環中之組織介素，且其在微量下仍具有生物活性。、另外，本發明的一個具體實例中，組織介素可以是粒性細胞-巨嗤細胞·集落刺激因子（GM-CSF)或間白素-2 - (IL_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

· 11 ϋ ·ϋ emmmm ϋ n a -ϋ Μϋ 1 ϋ ϋ in I «» 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1270672 A7 B7 五、發明說明（經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2) 〇在本發明的一個或全。在本發明的一個具體實例中，在形成複合物之步驟前可進步包括以用來樣品稀釋之緩衝溶液稀釋生物流體樣品之步硬K ’且用於樣品稀釋之緩衝溶液可以是〇.〇 1至0· 1 Μ的氣氯酸，其ρΗ値是7·3至約8·3，緩衝溶液中含有〇1_ 〇·3/〇牛血清白蛋白，〇〇5-〇·2%疊氮化鈉，及〇m〇氯化在本發明的一個具體實例中，在形成複合物之步驟前進 7包括在未變性溫度條件下，以熱處理生物流體樣品之步驟。一在本發明的一個具體實例中，在偵測螢光之步驟前，進步包括以用來洗滌之緩衝溶液洗滌在固相上形成之複合物之，驟。且用以洗務複合物之缓衝溶液可爲GGd〇iM tns-氫氣酸，其pH値是8 5至約9 5，緩衝溶液含有〇·〇ι至 0.1%聚氧乙晞山梨聚醣單月桂酸酯。在本發明的一個具體實例中，固相可以是微滴定般，且有50至200毫微克/公分2之IgG吸附能力。皿’、再者，依據本發明，提出用於以時間分析形測定法（TR_FIA)之套組，用以制生物流體樣品中之㈣介素’其中含有：一個第-抗體包括結合至固相之部产、：及可與組織介素結合之區域；一個第二抗體包姓組織介素之區域及已結合有生物素之部 5至個共軛物包具體實例中，生物流體樣品可以是血漿 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -111 — — —— ·11111111 -- -8- 1270672 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（6 括鏈抗生物素蛋白尤生物辛&

Wh 及可與鑭系金屬離子、，口石的光結構部份，其中螢光結構部份以通式（I)代表：

-R-Ar-C(=〇).CHrC(=0).CnF2n+rX (其中R是殘基，其是可與蛋白質形成共價鍵之官能基；Ar 是f有共軛雙鍵系之烴基團；n是大於或等於!之整數；且 X是氟原子或以式（11)化表之基團： -C( = 0) = CH2-C( = 〇)-Ar-R- 附圖説明 ] 圖la是説明SDF_Ut正曲線之圖形。利用實例2所述之tr_ FIA方法偵測參考fflSDF-1。數據爲三次測定之平均値。 ★圖b是説明如圖1&之類似校正曲線，特別集中注意在低濃度範圍之偵測上。於圖中之線如下：γ=ΐ 3χ+ΐ 2 ( χ 10000 a.u.)-4=0.995。數據爲三次測定之平均値。圖lc是説明偵測在el-4細胞表面上CXCR4表現之結果，依據實例足追蹤SDF-1生物活性之方式。依據與與人類3]〇]^ 1 之對照組之比較爲準，計算出平均螢光強度（MFI)中之降低百分率。數據代表由三次實驗系列中選出之平均値。圖1 d疋说明就SDF-1評値TR-FIA特異性之各種化學介素之偵測結果。數據爲三次偵測之平均値。圖2是説明就SDF-1而言，tR_fia及DELFIA間之比較。在圖2之左側，示出以DELFIA及TR-FIA系統偵測人類SDF-10 參考溶液之結果，係利用如實例2所述之相同的捕獲抗體及偵測抗體組合。在圖2之右側爲以二個系統所得之血漿樣品 -9- 卜紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1270672 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（7 ) 中内源SDF-1濃度之結果。示於圖2右側之樣品並未加入參考用SDF-1。在圖2右側之數據及表1之數據代表不同樣品之偵測結果。數據爲三次偵測之平均値。圖3&説明以丁11*^1八偵測抗凝血劑及蛋白酶抑制劑對|§0?-1 之影響。血漿樣品以下列處理：EDTA ( 1毫克/毫升）；肝素 (30 IU/毫升）；擰檬酸鹽（檸檬酸鈉〇·38%);或EDTA ( 1毫克/亳升）含有抑胚酶（1微克/毫升）。空白橫線及有陰影線代表二次不同樣品之偵測結果。數據爲三次偵測之平均値。圖3b説明以TR-FIA偵測，在SDF-1上血漿樣品初步加熱之影響。在分析前，血槳樣品先在55 °C下培育30分鐘，或在無任何加熱下直接用於偵測。血漿樣品得自2 4個健康的日本人志願者。數據爲二次偵測之平均値。圖3〇説呢以TR_FIA偵測，在SDIM上血漿樣品稀釋之影響。各樣品稀釋在緩衝溶液4中。血漿樣品得自5個健康的曰本人志願者。數據爲三次偵測之平均。圖4a説明在IL-8之ELISA定量上血球細胞之影響，其作爲 SDF-1之對照組。在仏彳加至血漿樣品後，細胞團塊或是血槳與之混合。在37。(：下培育15分鐘後，可定量在血衆内之可溶性IL-8。空白的四方形代表未與細胞團塊或血漿混合之參考樣品；黑色的圈形代表與血漿混合之樣品；且空白圈代表有細胞團塊混合其中之樣品、。數據爲四次測度之平均値。圖4b說明MCP-1之ELISA定量上血液細胞之影響，此爲 _ -10· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮） " ---- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)

1270672 A7 B7 五、發明說明（8 ) (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) SDF-1之對照組。在MCP-1加至血漿樣品後，細胞團塊或血漿與之混合。在3 7 °C下培育1 5分鐘後，可定量出血漿内可溶性MCP-1。符號和圖4a的類似。數據示出四次偵測之平均値0 圖4c説明SDF-1之TR_FIA定量中血液細胞之影響。在SDF-1加至血漿樣品後，細胞團塊或血漿再與之混合。經在3 7乇下培育1 5分鐘後，可定量出血漿内之可溶性SDIM。符號類似圖4a。數據爲四次偵測之平均値。圖5説明來自3 6個健康日本人之人類血漿中SDIM之水平。在分析前所有的血漿樣品接受5 5。〇下之熱處理3 〇分鐘。數據爲二個分別偵測中三次測度之平均値。圖6説明由於蛋白質G-Sepharose，IgG耗盡在人類血漿樣品上之影響。來自7個健康日本人志願者之血漿樣品，與蛋白質G-Sepha«)Se共培育在冰上3 〇分鐘，再予以離心，並測出於上清液中SDF-1之含量。有陰影之橫線及黑色橫線分別代表未加熱及加熱的樣品（55°c，3 〇分鐘）。圖7説明GM-CSF之測定曲線。以TR_FIA*法測出參考用之GM-CSF。數據爲三次測定之平均値。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製圖8説明IL-2之測定曲線。以TR-FIA方法偵測參考用 2。數據爲三次測度之平均値。進行本發明之最佳模式下示中本發明將祥細説明。、本發明万法以由時間分析形之螢光免疫測定（tr_fia)技術爲基礎。以“時間分析形的榮光免疫測定”係指以螢光化 1270672 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（9 ) 合物標^測定個體士八4 、長*的勞井，/ 析万法，其經由免疫反應可放射出且較短命之北旦放、> 系屬離子複合物，且在 ’、、 θ取螢光消失後，自經標記個體中對螢光訊f 讀取以時間分析形型之測定。㈣Μ螢先心虎 >戍 ^又方法特別適用於生物流體樣品中組織介素咼感度I偵測。“生物、、云歸祥σ 、机祖樣卩口係指收集自活體動物，較、— ，且特別是人類，之液體物質。其具代表性之貫例包括血液（即人‘、廿、王血）及其邵份或血漿或血清，以及腦脊髓液，膽汁，羊水，肋臌^ τ 及細肋液，腹水，氣管支氣管分泌物，骨髓液，乳汁，滤、方 g、会、，、& 、、屄/夜鼻仏出液，心内膜液，動脈内流骨豆’唾液’精子，展治笔 ^ . 尿履寺。再者，生物流體樣品也包括動物等經培養細胞之上清液。在依據本發明之方法中，當利用全血，血漿，血清，或腦脊髓液時可提供顯著的; 用’且特別是當使用全血或血漿時。爲方便起見，生物流體樣品，如此中所用的，包括生物流體本身及已接受處理之液體樣品，如稀釋於載劑，此載劑係適於生物流體。 “組織介素’，指蛋白質之化學物f，其負t活體有機體細胞間資訊之傳送。對各自個別的組織介素而言，具特性之文體可在標的細胞表面上表現。與此受體之結合可造成生理活性之明示，如細胞生長及分化。一組織介素群總稱爲 “造血因子”，其包括血液細胞之分化及生長，包括集落刺激因子（CSFs)包括粒性細胞-巨噬細'胞·集落㈣)，幹細胞因子，促紅血球生成素，促血栓生成等。可控制淋巴細胞之間白素包括IL_2，IL_4，，Κ_6， -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） ^--------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1270672

五、發明說明（1〇 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) IL-10，IL-12，IL-13，IL_18等。一組織介素群總稱爲“生長口子包括TGF_y?族，EGF族，FGF族，IGF族，NGF族，血小 1 反衍生之生長因子（PDGFs)，肝細胞生長因子（HGFs)，血皆$皮細胞生長因子（VEGFs)等。一組織介素群總稱爲“腫瘤么死因子，包括TNF- a，TNF-々等。一組織介素群總稱馬“干擾素，，包括INFi，INFj，INF_r等。其他已知的組，介素包括内皮素，巨細胞一衍生之親神經因子（GDNFs) 寺。一群組織介素，其可對任一功能上成熟的血液細胞授予趨化性，特別稱爲化學介素。依據其N-末端區域中固有的半脱胺酸位置，化學介素可分成四類：cc，cxc，c，咬 cxxxc 〇依據本發明方法之偵測主題可爲上述任一種組織介素。再者，任何新發現的上述任一組織介素中任一成員，或任何不屬於上逑任一組織介素中之任一新發現的組織介素，也可爲依據本發明方法之偵測目標。特言之，依據本發明之方法可應用至以可溶性因子存在於血液循環中之組織介素，其在微量下具有生物活性，具涉及於各種病理學中。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製適用於本發明方法之偵測主題實例可爲更於上述組織介素於之組織介素，且特別是CXC化學介素，但未必限於此類。最適於本發明方法之偵測主題較佳實例是SDF-i。减在依據本發明的方法中，爲了選擇性捕獲及標記生物流樣w中足欲求的組織介素，在固相上形成含有此組織介素t複合物。特言之，在適合的固相上自以下組份中形成含有組織介素之複合物： -13-

1270672

五、發明說明（μ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (a) —個第一抗體，包括已結合至固相之部份，及可結合至組織介素之區域； (b) 組織介素； (C)一個第二抗體，包括可結合至組織介素之區域，及其中已結合有生物素之部份； (d) —個共軛物，包括鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，及一個可與鑭系金屬離子絡合之螢光結構部份；及 (e) 鑭系金屬離子。下文中説明個別的組份。如此中所指之“固相，，爲可被採用的任何形狀及材質之固骨豆物貝，，、要其上可結合有抗體且不致妨礙上述共軛物之形成及螢光之偵測（後述）。爲進行分析法方便，通常使用多槽式微滴定盤，但其他任何構型均可使用，如充填有珠粒的管柱（其—中珠粒的材料可爲sephar〇se，瓊脂糖等，雖然並未予以限制）。依據本發明，有中度蛋白質吸附能力之微滴定盤特別適用。如此中所用的，“中度蛋白質吸附能力，，指當免疫球蛋白（IgG)以參考蛋白夏吸附時，可呈現約5〇至約200毫微克/公分2之特性，較好約15_15〇亳微克/公分2，又更好約'、9 0至約120¾微克/公分2。微滴定盤之材料較好是聚苯乙烯，但不予以限制。組份（a)，或“第一抗體”指對上述固相以經結合狀態存在之抗體’且其可經由抗原一抗體反應結合至欲求之組織介素。在此意思下，第一抗體也可稱爲“捕獲抗體，，。在本發明説明中，“抗體”意以包括免疫球（Ig)及由免疫球蛋白一衍 -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -Γν— · I I I I I I I 訂— — — — — — — I-

IP 1270672 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（12 ) 生的任何型式分子，如多株抗體，單株抗體，Fab， (Fab)2，或嵌合抗體。所謂“抗體，，以廣義意義使用，只要可以類似免疫球蛋白之方式結合至組織介素，甚至包括有組織介素爲配體之受體。較佳抗體之實例是多株抗體或單株抗體。各種組織介素之抗體可買得到，如購自R&D System Inc. (Minnesota, US), Dako Immunonglobulins a/s (Denmark)， PharMingen (California， US)， Southern Biotechnology Associates (Alabama，US)等。另外，欲求組織介素之抗體可利用一般方法生成，如動物免疫接種或融合瘤技術。與固相之結合可以下列一般方法達成，如將第一抗體直接塗佈在微滴定盤上。第一抗體之“與固相結合部份”通常是指可部份吸附至固相之抗體Fc區域。然並予以限制。例如，也可使用可與固相結合及與抗體部份結合之雙官能連接子分子。' 組份（b)，各欲求的組織介素於生物流體樣品中，通常是以結合至第一抗體之方式固化至固相上。組織介素並不必是可與第一抗體接觸自由態狀況。例如，組織介素可在與第二抗體（下述）結合後結合至第一抗體。因此，依據本發明之共軛物調和物，依個別組份結合之次序而言並不受限。本發明者發現，對於含有欲求組織介素之生物流體樣品而言，欲南感度偵測組織介素時有必要在曝於抗體之前先以適合的緩衝溶液稀釋至適合的濃度，而此抗體係可與該組織介素結合者。生物流體樣品緩衝溶液之稀釋比例通常 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1270672 Α7

五、發明說明（13 ) 爲約1 : 1至約1 : 3 0，較好約1 : 2.5至約1 : 2 0，且又較好約 1 · 5至約1 : 1 5 ’按（生物流體樣品：緩衝溶液）體積爲基礎。稀釋比例之最適宜値可依生物流體樣品之種類及組織介素之種類等而定，且進一步依樣品稀釋所用的緩衝溶液組成物而定。用於樣品稀釋之適合的緩衝溶液是微鹼性緩衝溶液，其由叁（羥甲基）胺基甲烷（縮寫爲“Tds”）及無機酸所組成，且通常是tris-鹽酸，其pH値通約7.0至約8·6，較好約7.3至約 8.3，且更好約7.5至約8·1，其濃度通常爲約0.005至約〇·2莫耳（Μ)，較好約〇.〇1至〇·ι μ，且更好約0.025至約0.075 Μ。用於樣品稀釋之緩衝溶液進一步含有適量的血漿蛋白質組份及鹽類。血漿蛋白質組份通常是血清白蛋白，且較好是牛血清白蛋白（BSA)，其濃度通常約〇·05至約〇·5%，較好約0.1至約0_·3」/。，又更好是約0」5至約0.25%。鹽通常是疊氮化鋼（NaN3)及氣化鈉（NaCl)。NaN3濃度通常約〇.〇2至約 0.4%，較好約〇.〇5至約〇·2%，且更好由約0·05至約〇 15%。 NaCl之濃度通常是由約0·2至約3%，較好約〇·5至約ι.5〇/〇，且更好是約0.6至約〇. 12。應了解’用於樣品稀釋之緩衝溶液組成物並不限於上述條件’且允許有各種變化，此爲精藝者顯而易見的。例如’上述的鋼鹽，其部份或全部可以其他的鹼金屬鹽或相當的驗土金屬鹽替代。用於樣品稀釋之緩衝溶液ρ Η値及個別組份之濃度之最適宜數値，依偵測主題之組織介素種類而變化’且可依生物.流體樣品之稀釋比例而定。此種最適 -16 - 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

1270672 A7 B7 五、發明說明（14 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製宜値在精藝者所具有之-般條件範圍内可組份（C)，或“第二抗體，，，包括。域，如此可在有第一抗體之三明二：：至組織介素之區織介素。希望第一及第二抗體爲捕”組 r織介素分子上不同—不同的二，)::::: k。因此’就與欲求組織介素之結合能力…第二抗體需有適合的組合。例如，適合的組合；株抗體群中，其獲得是將已知或預測包括有午二長組織介素或其片段免疫接種至適合的動王合的組合可選自可確認不同表位的許多單株抗體中。此— 選擇可在經由初步實驗而無特殊困難下達成，先製備一個組織介素參考溶液，並八ν σ 行一般的ELISA方法。 [“考κ抗體組合進第二抗體可進-步包括已結合有生物素之部份，便可麵由榮光偵測偵測組織介素。在此定義中，第二抗體也稱: “偵測抗體，，。生物素是-種維生素，也稱之爲維生素Η 輔酶R，且可與胺基（如胚）形成醯胺鍵。第二抗體可由生素化及純化組織介素之抗體而製成，其爲依循_般方法偵測王題。“已結合有生物素之部份，，在第二抗體中指生素本身以及結合有生物素之抗體部份（通常是f c區域）。必要時，生物素及部份抗體可利用可與二者結合之雙官連接子分子鏈結。、 θ & 如此中所用的第二柷體” 一詞未必指單一分子，而表符合所需功能的任何結構單位（即可經由抗原一抗體反應適或物之物若能可代 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -17- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1270672

五、發明說明（π) 或配—文體鍵與組織介素結合之功能，及攜帶生物素之功叱）。同樣意思也可應用至上述的“第一抗體”。例如，欲求組織介素之抗體，及可與此抗一組織介素抗體結合之經生物素化抗-IgG抗體之組合，可應用於本發明中。在此例中，抗一組織介素抗體及絡生物素化抗-IgG抗體之組合；在此總稱爲“第二抗體”。經生物素化之抗_ IgG抗體因其可又通性因此疋合宜的。在此例中，當欲求組織介素之抗體基於某些理由抗阻生物化反應時，使用有生物素化抗· 抗體之組合是有用的。另一方面，由簡化分析步驟及便組織介素偵測之敏感性達到最高之遠景而言，在第二抗體較好可應用單一分子。組份（d)，或“共軛物，，是任何結構單位，包括鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，及可與鑭系金屬離子絡合的螢光結構部份，且較好是其中鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白^ 螢光結構邵份係經由共價键直接或間接鏈結之分子。鏈抗生物素蛋白一般已知爲由放線菌（Actin〇mycetes)產生之蛋白質，且具有約60,000的分子量，且可天然地與生物素強烈結合。然而在本發明中，“鏈抗生物素蛋白，，並不限於任定的微生物來源，但可包括其他任何微生物來源相當的蛋白質，以及其變化型，只是仍可實質地保有其與生物素之結合能力即可。抗生物素蛋白通常已知是具有約7〇,〇〇〇分= 里且含於蛋白中之蛋白質，本質上也可與生物素強烈纤合。在本發明中，“抗生物素蛋白，，未必限於天然的蛋白白質，也可包括其變化型，只要仍實質保有與生物素結合 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1270672

五、發明說明（16 ) 的能力即可。由上文原則中可看出’依據本發明的方法也可在替代組份⑷下，應用包括有可與組織介素結合的區域，及結合有鍵抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的部份之抗體；及在替代組份⑷下’應用包括有生物素及可與鑭系金屬離子絡合的榮光結構部份之共轭物。可與鑭系金屬離子絡合之組份⑷共軏物之螢光結構部份是一個部份結構，可由令相當的螢光化合物反應而得，如此可經由共價键與鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白直接或間接地鏈結。螢光結構部份可由下式（〗）代表： -R-Ar-C(=0)-CH2-C(=0)-C|F2n+rX ⑴ (在化式中，R..代表可與蛋形成共價鍵之官能基之殘基；Ar代表具有共軛雙鍵系之烴基；n是相當於或大於1 ; 且X是氟原-予或以式（II)代表之基團：，C(=0)_CHrC(=0)_Ar-R- (π) 在上通式中，“可與蛋白質形成共價鍵之官能基”，其定義R殘基，指任何有機官能基，其可經由與反應性基團（通常是胺基，羧基及羥基）包括在蛋白質之胺基酸殘基中，之反應可形成共價键。此官能基之實例包括下列：

-l^C^S, --只-0Η, -只-X, -只-QRA δ ο νη2+· X- -Md t〇fRA，-S〇3 CF3, Ο Ο 1—ORA, —S02x, -S03H, -SH, —X, -CX3; Ο •19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1270672 A7 B7 五、發明說明（17 -s〇2^O，- 0 _rs—SP，

- NHf(CH zM—o—n: 0 (其中 X 選自 i 原子，_〇s〇2CH3 , -0S02CF3 ^ .〇s〇 c F( -〇s〇2PhCHrP (其中Ph代表苯基）；RA選自燒基，=‘，. 基或芳烷基；RB是選自伸烷基，伸晞基，伸芳基，：伸; 烷基；p是0至5;且q是2至10)〇一 ‘ 在上化式-电，“具有共軛雙鍵系之烴基，，，其定日具=至少三個共扼雙鍵之烴基，^通常是具有至少= 基環之二價或三價芳族烴基。烴基中碳數目之上限通" 約50以下’且較好約3〇以下’然而並未此，一個以上的碳可爲雜原子所取代（如^W限制。名基A r之實例包括以下基團：氣或硫原子）。％ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1111111 ·1111111 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

(其中m是1至6之整數） 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公爱） 1 1270672 A7 五、發明說明（19 ) C3F7

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^可生成上述螢光結構部份之欲求的螢光化合物可利用例苇的有機合成反應予以合成。典型而言，其可由下列二個步驟組成之方法合成： (第步I)進灯乙醯化芳族化合物及全氟羧酸酯間之 claiSen縮合反應，在適合的溶劑中並有鹼性催化劑（如甲基内）之存在由是產生々·二酮化合物，其中乙醯基之 CHr已被全氟羰基化。 (第二步驟^將可與蛋白質形成共價鍵之官能基引入万-二酮化合物。例如’芳族濃之氫經由氯磺醯化反應，利用氯硫酸以氯續醯基（cls〇r)取代。在個別步驟之後，有必要可進行如再結晶或沉澱作用之純化步驟。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製令生j(螢光化合物與蛋白質在適舍的條件下反應，依在上述第二反應中引入的官能基種麴而定，由是生成令人感興趣之螢光結構部份。例如，氯磺醯基可與蛋白質内之胺基酸在鹼性反應條件下容易地形成醯胺。在本發明中’組份⑷之共軏物可由螢光化合物直接標記鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白而製成。另外，组份⑷之共軛物可先令鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白共軛至另一 -22 - ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮)--------- 1270672

2質(如牛血清白蛋白)再進一步標記下-般方法= 蛋白㈣之共㈣用，可利用以達成，如利用戊二醛行交又一聯社以螢光化合物對蛋白質之標記反應，其完。可:。質溶於緩衝溶液中，Α已㈣以，“ A成了先壯蛋白氯旙缺仆你田山λ八叶對反應凋至適合的pH値（如在中光化人你爲約Pl?)，並在其中加入已溶於適當溶劑成沪欠的《口（如乙醇或二甲替甲醯胺）如此劑量下可達、.：莫耳濃度比例。調整勞光化合物與蛋白質之莫耳 = 匕！：含有勞光化合物之溶液之濃度，可以控制共輛蛋白貝各分子之勞光化合物比例（也稱爲“共軏比例，，）。 ^軏比例相當於螢光結構部份之單位數目，其代表依據本 -明《共軛物中每分子的鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白。=軛作用比例通常是5至1〇〇單位，且較好是⑺至⑽單位。若共轭比例太小’將無法達到充份高感度的組織介素偵測。另-方面’爲改善偵測敏度，太高之共扼 ▲ 法達成。 … 依據本發明方法在固相上形成複合物，可如鑭系金屬離子之組伤（e)與上述螢光結構部份之絡合般完成。鑭系金屬離子實例包括：銪（Eu)，彭（Sm)，铽（Tb)，及鏑（Dy)。以銪 (Eu)爲較佳。鑭系金屬離子先與組份（d)之共轭物絡合，並以咸开/式用於複合物之形成。換言之，當鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白或生物素形成共軛作用時，螢光結構部份在此時已成爲保有Ειι3+之複合物。然而，此並不排除相對的步驟。 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4 ^(210 x 297 ^) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1270672 A7 B7_______ 五、發明說明（21 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明發現在组織介素高敏度偵測中，在固相上形成的複合物在螢光偵測前有必要先以適合的緩衝溶没適當洗條。在此，洗滌複合物所用的適合的緩衝溶液是由丁ris及無機酸組成的鹼性緩衝溶液，且通常是tris-鹽酸，其p H値通常是約8.2至約9.8，較好約8.5至約9.5，且較好約8·7至約 9·4，其濃度通常約〇·〇〇5至約0.2 Μ，較好约〇〇1至約〇1 Μ，且更好約〇.025至約〇.〇75 μ。用於洗滕複合物的緩衝溶液念有適量的非離子性界面活性劑’其具有蛋白質助溶溶解能力。非離子性界面活性劑通常是聚氧乙烯山梨聚醣單月桂酸酯，且較好是以商品名 “Tween 20”（分子量約1200可購得之聚氧乙烯山梨聚醣單月桂酸酯。具有實質上如Tween 2〇之其他非離子性界面活性劑（如羥基値約95至約115 ;皂化値約35至約55 ;及HLB (親水性一疏水性平衡）値約15至18))也可使用。非離子界面活劑之濃度通常是約0.005至约〇·2%，較好約〇.01至約〇 1%，且較好的0.025至約〇.〇75°/〇。應了解’用於洗滌複合物之本發明緩衝溶液之組成並不限於上述條件，且對於精藝著而言的容易的各種修飾均許 _口〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製下文將描述依據本發明方法在固相上形成複合物之步驟之典型實例。 1)第一抗體溶液，其已用塗佈之適合的緩衝溶液予以稀釋’施加至固相上（如於9 6 _孔洞微滴定盤之孔洞中），且第一抗體經由培育固化在固相上。因爲緩衝溶液是用於塗 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4 (210 χ 297 ) 1270672

五、發明說明（ 22 佈丄因此可應用如含有適量Nacl之嶙酸鹽缓衝溶液。典型而。，培育時間爲在約2 - 6 °C下歷約2 〇小時以上。其次’已塗佈有第一抗體的固相表面以用於洗滌之緩衝浴夜洗滌數次。因爲緩衝溶液是用於洗滌，因此可應用如微鹼性之tris-鹽酸，且必要時可加入適量具有蛋白^助溶溶解能力之非離子性界面活性劑。洗㈣，已塗佈之固相保存在約_2〇 C之低溫下，直到用於分析之前。口 3)如上述，身爲偵測主題之含有組織介素之生物流體樣 :，較好先以樣品稀釋所用之緩衝溶液先稀釋至適合水平。再於已塗佈之固相上施加以生物流體樣品，及必要時 <组織介素參考用溶液，並培育之。典型而言，培育條件爲約35-39 C，歷約4 〇分鐘至約2小時。培育之後，固相表面以如上用於洗滌之緩衝溶液洗滌數次。 4) 之後將已稀釋於適合緩衝溶液之第二抗體溶液，施加至固相上並培育之。在此，較好應用和上述樣品稀釋之相同緩衝溶液。培育條件和上述生物流體樣品的培育相似。培育後’固相表面以如上相同之洗滌緩衝溶液洗數次。 5) 將共耗物與鑭系金屬離子之鹽混合，以令形成螢光絡合物部份。在以適合的溶劑稀釋後，絡合的共軛物再施加至固相上並培育。培育和生物流體樣品及第二抗體之培育條件相似。在培育之後，在固相上形成的複合物以和上相同的方式以洗滌用緩衝溶液洗數次。其次’已以上述方式獲得之含有鑭系絡合物之複合物， -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) n mmmmM 1ϋ -ϋ mmmme n 訂---------

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1270672 五、發明說明（23 =固或液相中接受以時間分析形的勞光偵測。用於此螢叫仏/狀裝置已商品化。典型而言，制條件爲··約〇 2至和毫秒㈣之延遲時間；约㈣約〇6ms的窗二= 約0.5至約1.5 ms的閃點速率之激發波長；及⑽微米之偵測波長毛叫氮激光之波長）訂· 在固相勞光偵測例予中，攜有上述複合物之固相可如此 ;受勞光偵測條件。於液相勞光偵測例子中，複合物以適合的分解溶液處理，令含有勞光絡合部份之任何結構部^ =至溶液中，此溶液再接受螢光偵測條件。分解作用通吊疋弱驗性水性落液’含有三炫基麟氧化物及陰離予界面活=劑。至於分解溶液之實例，可使用碳酸氯鋼陶C⑹ 水浴欲’其中含彳畚（正辛基）氧膦（T0P0)及硫酸十二醋鈉 (SDS)。將攜有上述複合物之固相在約45-55°C下培育約4 〇分鐘至約冰時，可將與鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白或生物素之共軛作用分開，如此含有螢光絡合部份之共軛物可游離至溶液中。

、，上述的液相螢光偵測優點，可令有更大範圍的固相及材料型式選擇’因爲勞光偵測不涉及固相。另一方面，液相榮光偵測因爲需較固相更多的步驟，因此造成更複雜的步 ^ ^再者，在某些例子中，液相螢光偵測可提供較固相而。夕 > 較低之敏度，基於如在分解溶液處理步驟中易感受雜^的影響等理由。然而，應了解 '，由固相及液相螢光偵測可達成的個別的最大敏度，應依各種關於分析之條件之組合而定。 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐 1270672 A7 B7 五、發明說明（依據本發明，進一步提出推刀产，進订上述以時間分析形之螢弁 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) :::卿™)方法之套組。此套組通常包括至;二括：:=，⑷及⑷爲組份項目。換言之，第-抗體，包麵、、且織介素 < 區域；第二抗 ^ 包括可結合至組織介辛之ρ _ ^常之&域，及已結合有生物素之個共軏物包括鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，及可與㈣金屬離子絡合之勞光結構部份；及以對伯測者 ^整的方式提供之鑭系金屬離子，由是將可進行分析以偵測生物流體樣品中之組織介素。必要時，套組中可進一步包括-個參考用組織介素，±述的各種緩衝溶液（特別是 =於樣品稀釋之缓衝溶液’及用於複合物洗務之緩衝溶液）寺。套組中之組份項目通常可容納在其個別適合型式之小瓶中，並以完整方式配合説明或指示包裝好。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明是使得新穎方法可運用，其係在生物流體樣品中正確且高敏度地偵測組織介素，尤其是包括SDLii化學介素。依據本發明方法之偵測限度，通常在約i 〇〇微微克/毫升以下’較好約5 0微微克/耄升以下，且更好約3 〇微微克/ 毫升以下，和下述實例2有實質上相同的條件下。類似地，組織介素偵測之變化係數（CV)通常少於約10%，較好少於約 8 °/〇 ’且更好少於約7 %，和下實例2所述之實質上相同條件下。組織介素自血漿樣品中之回收率爲約7 〇 %以上，較好約8 0 %以上，且更好約9 〇 %，和下實例6所述之實質上相同條件下。再者，如在相同的個體及相同條件下衍生之血漿樣品，組織介素重覆於4個不同日子下進行偵測時，所得的 27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1270672 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（25 ) 偵測値漲落較好在約1 0至約2 0 %範圍中。如下實例所説明的，依據本發明利用由螢光化合物 BHHCT衍生之Eu3+絡合物，在血漿樣品中之偵測敏度和如 ELISA及DELFIA之傳統方法比較下，可改進2或3等級，尤其是就SDF-1而言。可正確地領悟SDF-1於活體内之行爲，並顯現其生理功能是高度重要的，以可加深對HI V-1感染之了解，並對AIDS治療開啓新的遠景。可證知，本發明對關於組織介素分子生物學之發展及應用，特別有顯著的貢獻。再者，如以下實例所説明的，利用依本發明之螢光化合物BHHCT衍生之Eu3+絡合物，組織介素比起組織介素族其他成員之偵測，如組織介素係以可溶因子存在於血液循環中且微量即有生物活性，且不僅涉及於各種病理學中也已有其治療性應甩，將可能可以如SDF-1之高敏度被偵測，且也有良好的再現性。實例下示，將經由實例詳述本發明。這些實例並不限於本發明。下文説明用於實例中之材料，裝置及偵測條件。抗體：抗-SDF-1抗血清之生成，是將含有人類SDF-1/?之 33-45 殘基（RFFESHIARANVK)之多重-抗原胚（Research Genetics，Alabama，U.S·)免疫接種至兔子。抗血清以親和力管柱純化再使用。人類SDF-1 之山羊多株抗體可購自R&D Systems Inc. (Minnesota，U.S.)。人類粒性細胞-巨嗤細胞-集 -28- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝

ϋ an n n 一 ον I tmmme am— I ϋ I ϋ ί I

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1270672 B7_ 五、發明說明（26 ) 落刺激因子（GM-CSF)之人類單株抗體購自PharMingen (California，U.S·)。人類間白素2 (IL-2)之單株抗體購自 PharMingen (California, U.S.) 0 化學介素：人類RANTES，人類MIP-Ια及卢，人類 MDC，及人類 fractalkine購自 DIACLONE Research (France)。人類 IL-8購自 ENDOGEN (Massachusetts，U.S.) 0 以商品化之ELISA套組用於偵測加至血漿中之老鼠IL-8及老氣 MCP-1。老藏 IL-8購自 Amersham Pharmacia Biotech (Sweden)，且老鼠MCP-1 購自 PharMingen (California， U.S·)。老鼠SDF-1汉，老鼠SDF-1汉，人類SDF-1汉及人類 SDF-1/?各贈自 Genetics Institute (Massachusetts，U.S.) 〇人類 GM-CSF購自 PharMingen (California，U.S.)。人類 IL-2購自 PharMingen (California，U.S·) 0 裝置及-偵_測條件：來自Wallac (Finland)及Amersham . Pharmacia Biotech (Sweden)的 1420 ARVO 多重-標幟計數器，於以下偵測條件中用於以時間-解決之螢光測定：0.20 ms之延遲時間，0.40 ms窗口時間，及1.00 ms閃點速率。爲了得到最敏感之TR-FIA分析系統，檢查購自Nunc (Denmark) 的五種微滴定盤，其中在測度參考用人類SDF-1 /?上， polysorp盤可產生最靈敏之螢光訊號。敏度次序如下：白色的 C96 maxisorp > C96 maxisorp > 白色 C8 maxisorp >黑色的 F16 maxisorp。於以下實驗中，二致地使用白色的C96 polysorp微滴定盤。 (實例1 : TR-FIA之初步研究） -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^--------tr---1-----. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1270672 A7 B7 五、發明說明（27 ) 最初，致力於鑑定出固相上一已結合之捕獲抗體及適於 SDF-1 ELISA-爲基礎之免疫分析系統測定之偵測抗體之組合。基於此目的，自共五種中研究各種組合，包括多株兔子抗· SDF-1抗體及多株山羊抗_ sdf-1抗體。在三個組合中觀察參考用SDF-1之特異偵測。然而，SDF-1在ELISA分析中之偵測限度從未超過約1 〇至2 〇毫微克/毫升。通常，存在於血漿中之SDF-1水平低至此偵測限度以下。因此，可確定的是實質上不可能自血漿樣品中以ELISA分析測出SDF-1 0 絡由如上文方式所見之多株抗體最佳組合之應用，可如下述變化一般的TR-FIA條件，進行SDF-1之偵測。 (實例2 : TR-FIA用於參考用SDF-1) 針對TR-FIA製備四種分析用緩衝溶液：緩衝溶液！以塗佈 9 6孔洞之微—滴定盤（0· 1 5 Μ磷酸鹽緩衝溶液（pbs)，含有 0·14 M NaCl);緩衝溶液2以洗滌盤子（〇.〇5 M Tris-HCl含有 0.05% Tween 20，pH 7.8);緩衝溶液3以洗滌盤子（0.05 Μ 丁1^七(：1，卩117.8)及緩衝溶液4以稀釋蛋白質溶液（〇.〇5^/[

Tris-HCl 含有 0.2% BSA，0.1% NaN3，及 0.9% NaCl，pH 7.8)。丑111^。丁之含成依循丫1^1161过1.(丨98)(文件5)所述之方法進行；並製備鏈抗生物素蛋白，牛血清白蛋白（SA-BSA)共軏物，再以BHHCT標記共軛物，並依、循Yuari et al. (，97)之方法（文件4 )。經標記之共軛物保存在_20°C下，並以下文之緩衝溶液（緩衝溶液4 )稀釋100 X。 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

1270672

五、發明說明（28 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以兔子多株抗-人類SDF-1々抗體或山羊多株抗-人類SDF-1々柷體爲捕獲抗體。其可產生類似的結果。已以緩衝溶液 /稀釋至1 〇微克/毫升之捕獲抗體（各6 〇微升）之溶液，培育在9 6孔洞微滴定盤之孔洞中，於4 〇c下2 4小時。接下來，此孔洞以緩衝溶液2洗二次，以緩衝溶液了洗一次。已以上述方式塗佈有抗-SDF-1抗體之盤子可保存在下至少一個月。將SDF_1參考用溶液（50微升）吸量至上述已塗佈之盤子中’並在3 7 C下培育1小時。經以溶液2及3洗盤後，已以緩衝溶液4稀釋1〇〇〇 X之5 〇微升經生物素化之山羊多株抗-人類SDF-1 0抗體（由以下方法生物素化來自R&D 之上述山羊抗體而得），在3 7 °C之孔洞中培育1小時。培育之後，盤以緩衝溶液2洗二次，以緩衝溶液3洗一次，且標以 BHHCT-Eu>之5 0微升BSA-SA溶液（5 0微升）在3 7 °C之孔洞中培育1小時，盤以含有〇〇5% Tween 2〇之〇.〇5 M 丁士_ HC1，pH 9.1洗4次。盤再接受固相螢光測定，利用i42〇 ARVO多重標幟計數器。在水溶液中之參考用SDF-1之校正曲線示於圖la&lb。以 TR-FIA所進行偵測限度可由以下方程式中計算出來 (依據 Kropf et al·(文件 2)): 3x[S〇]xsB / (S〇—B)，其中 [S〇]是參考用溶液之最小濃度；、 SB是2白組之標準偏差； S〇是參考用溶液在最小濃度時之螢光訊號強度；且本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 |!1 訂·! 1270672 A7 B7 五、發明說明（29 ) B是空白組之螢光訊號強度。由上式中知，TR-FIA之偵測限度是3 0微微克/毫升，其在上述參實例中，較以ELISA有3等級低之偵測限度（約1 〇至 2 〇亳微克/亳升）。由於每孔洞中使用5 〇微升溶液，以TR-FIA可測及之最低量sdF-Ι蛋白質是1.5微微克/孔洞。也示出，就偵測之再現性而言，TR—FIA可有所改進。以 TR-FIA偵測SDF-1之變化係數（CV)，對參考樣品在0.1毫微克/毫升至1024毫微克/毫升濃度範圍下而言，少於7%。此與ELISA在上述參考實例之cv値於1 〇毫微克/毫升至1〇〇〇毫微克/毫升之濃度範圍中爲超過丨〇 %，及DELFIA (見下文之比較實例）之CV値在0.1毫微克/毫升至1024毫微克/毫升濃度範圍中也超過1 〇 %相反。除了上述固相螢光測定之外，也研究液相螢光測定。特言之，以上述步驟在固相上形成之螢光複合物（多株抗_ SDF-1抗體-SDF-1生物素化的多株抗-SDF-1抗體-BHHCT-Eu標έ己之BSA-SA)以酸性後合的界面活性劑溶液處理（〇. 1 MNaHC03水溶液，含有loμMTOPO及0.05%SDS)，由是令經標記之BSA-SA共軛物可自固相中游離出來。利用1420 ARVO多重標幟計數器偵測在溶液内共軛物之螢光強度。在此例子中SDF-1偵測敏度爲約1 〇〇微微克/毫升，其和上述固相偵測値一樣高。 (實例3 : CXCR4爲人類SDF-ΙΘ之反.向調控）爲了證實實例2以TR-FIA所得之SDF-1偵測値及參考SDF· 1蛋白質之生物活性間之交互關係，於是偵測SDF-1受體之 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · ϋ IB ϋ I n 1 ϋ 一-口，讎 Μ· ΜΜ ΗΒΗ SMB ΜΙ· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 1270672 B7_ 五、發明說明（30 ) 試管内反向調控作用，此受體CXCR4是在EL-4細胞中於 SDF-1結合時謗生。 EL-4細胞培養在Dulbecco-修飾之伊耳格互培養基（Df MEM)，此中添加有1 〇%胎牛血清（FCS)，並在人類SDF-1 /? 存在或不存在之下（1，10，20，40，100，及1000毫微克/毫升）。在3 7 °C下培育6小時後，在細胞表面之CXCR4以FC-人類SDF-1 α嵌合蛋白質及FITC-結合之山羊F(ab’）2抗-人類 IgG (Southern Biotechnology Associates，Alabama，U.S·)染色。螢光強度以螢光計進行（FACSCalibur，BECTON DICKINSON，California，U.S.)。再由 CXCR4之染色之平均螢光強度（MFI)減少百分率中評估出CXCR4之反向調控作用。結果示於圖1 c。由圖lc中顯示，與人類SDF-1/?培養之EL-4細胞就CXCR4 表現而言，-以劑量一依賴方式反向調控，所得的結果與先、前的報告（Hesselgesser et al.(文件 1 3 )及 Amara et al.(文件 14))有極佳之符合，其中SDF-1泛及與CXCR4結合之Kd 値分別爲 5-10 nM及2.2-3.6 nM。 (實例4 :以TR-FIA偵測SDF-1之特異性）爲了證實就SDF-1而言，TR-FIA之特異性，對下列各種化學介素進行和實例2類似之TR-FIA偵測：C C化學介素（老鼠 MCP-1，人類 MIP-1 汉及 /?，人類 RANTES，人類 MDC)， CXC化學介素（人類IL-8，老鼠SDF-J α及老鼠SDF-1 ，人類SDF-1 α及人類SDF-1卢）及CXXXC化學介素（人類 fractalkine)。結果示於圖1 d。SDF-1以外的任何化學化素， ______-33-_ %張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

11 ϋ ϋ emmmm ϋ 1 · 1 1 mmmmM .ϋ 1 ·ϋ 1 I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1270672

五、發明說明（ 31 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在勞光強度上並未觀祭到有顯著的增加。因此，可證實，上I的TR-FIA可以兩度特異性偵測SDF-1。在人類及老鼠 SDF-la及SDIM/?間呈現出交叉反應性。 (實例5 :血漿樣品之製備）用於以下實例之血漿樣品，製備自3 6個年齡在丨8至3 〇歲之健康志願者（曰本人）之血液，並利用EDTA (丨毫克/毫升血液）爲柷凝血劑。特言之，將含有〇·5 μ EDTA之PBS充滿在塗佈有0.1 M EDTA之注射器中，如此在所收集之血液中每笔升存在有7微升此溶液。血液收集在此注射器中，並在 i溫下培育5分鐘，再以3000 rpm離心1 〇分鐘，由是可取得血桌。血漿樣品保存在-8〇°C下，直到使用前（除非另有所示）才以緩衝溶液4稀釋10 X。要確保在分析之前冷凍/解凍不會重複。 (實例6 :血漿樣品之TR—FIA) 對參考用之SDF-1溶液及上述的血漿樣品（得自5個個體）進行實例2之TR-FIA。對計算曲線進行比較，可計算出各血衆樣品中之SDF-1濃度（即在圖2左手側以黑色圈示出之直線圖）’其係由參考溶液偵測衍生而來。再者，爲了證實偵測之正確性，在各血漿樣品中加入〇·4或〇·8毫微克/毫升之參考SDF-1進行偵測，再計算出回收率。加有參考用SDF-1之血漿樣品，其所測得之螢光強度示於圖2右側（在TR-FIA之標題下）。在加入參考用SDF-1前及後’血漿樣品中SDF_1濃度及回收率示於下表1中。其中顯示，TR-FIA有可能偵測出血漿樣品中之SDF-1，如參考溶 ___— -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐) ' ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

m I n ttn n I ϋ ft—^OJa n ϋ ϋ n ϋ ϋ I

1270672 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（32 ) 液之例子般有高的回收率。 (比較實例·· DELFIA用於SDF-1) 依據廠商所提供之指示（Amersham Pharmacia Biotech ;下文爲“APB”），除非另有所示，進行DELFIA之下列偵測操作。所有的洗滌均以PBS/0.05% Tween 20進行。兔子抗-人類SDF-ly5抗體或山羊抗-人類SDF-1/?抗體（各 60微升）之溶液，已用PBS稀釋至1 0微克/毫升，吸附至透明的maxisorp盤上（Nunc，Denmark)，在4 °C下培育2 4小時，之後再洗一次。接下來，爲了阻斷非特異的結合，在室溫下施加180微升的DELFIA分析緩衝溶液（APB)，歷至少3 0分鐘0 盤經3次洗滌後，參考用SDF-1以DELFIA分析緩衝溶液稀釋，或1 0 X稀釋之血浆樣品以每孔洞5 0微升之量加入，並在4 °C下培育-至少6小時。盤子洗三次後，已稀釋至2 0毫微克/毫升之100微升Eu標記之鏈抗生物素蛋白（APB)加於分析緩衝溶液中，並在室溫下培育3 0分鐘。盤洗6次後，加入 DELFIA敏化溶液（APG)，令EU自結合至固相之EU-標記的抗體中解離。微量盤緩和震盪5分鐘後，以時間分析形之螢光計（ARVO 1420)偵測螢光。由參考用溶液之偵測中衍生之校正曲線，示於圖2之左手側（即以黑色方型示出之線圖）。依據實例2所述方程式所計算之偵測限度是130微微克/毫升。DELFIA可偵測參考溶液中之SDF-1，然而敏度較TR-FIA低。然而，血漿樣品（來自4 個個體）之偵測中無一者可成功地偵測内源性SDF-1。再 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·_ϋ ϋ H ϋ Βϋ ·1^-δ,， n n ϋ ·ϋ 1_1 em— # 1270672 A7 五、發明說明（ 33 者，加U0毫微克/毫升參考用SDF_i於各血漿樣品所得之# 測回收率，爲約20%以下，此較TR_FIA之結果低許多。在加有參考用SDF-1之血漿樣品中所測得之螢光強度，示於圖2右側（在標題爲“DELFIA，，下）。加入參考用至血漿樣品前後，SDF-m度及回收率之結果示於表！中。（應可注意到，於圖2及表1數據中所説明之血漿樣品，均接受、$ c之初步加熱達3 〇分鐘）。皇1 :加至人類血漿中SDF-1之回收率加入之 S D F -1 S D F -1 之偉測 -------- _ (毫微克/毫升）（毫微支/Φ4Μ二的總SDIM回收率

(a)TR-FIA 0 1 0 1 0 1 0 1.0 0 1.0 0 0 (b)DELFLA 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1.0 0 1.0 1.0 1.08 2.10 1.53 2.48 1.68 2.69 1.87 2.83 2.14 3.11 <D.L. 0.20 <D.L. 0.16 <D.L. 0.17 <D.L. 0.20

2.53 2.68 2.87 3.14 >1.0 ^1.0 1.0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 95 101 96 97 <20 <16 <17 訂--------- % <D.L. ^於偵測限度（13 0微微克/毫升) -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1270672 A7 B7 34 五、發明說明（ (實例7:抗凝血劑及蛋白酶抑制劑之影塑）減血劑及蛋白酶抑制劑據報告，可料組織介素之偵測（Thavasuetal 以研究TR指對聊」之偵測是否受此因素影響。下貫' 將以下蛋白酶抑制劑加至血聚樣品巾 (EDTAX1.0毫克/毫升），展奴 ro 380/, . r ^ , 肝素（30 IV~升），檸檬酸鈉 (0.38/。) ’或乙級(1.〇毫克/毫升）。以類似實例2的方法，二W?測SDF_1。結果示於圖3 a。可證實，抗凝血劑及A白酶抑制劑並不會顯著地影響以TR_FIA對血浆卿偵測。 (貫例8 ·血漿樣品初步加熱之影塑）在以TR-m偵測隊i之臨床應用上，有必要使源自血液〈樣品中（HIV病毒失去活性。因此，研究初步加孰對丁R- FIA偵測血漿—樣品之影響。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製或校首先，爲了檢查SDF-1蛋白質之熱穩定性，將sDF-丨參考溶液保持在0 °C下3 0分鐘；3 7 °C下3 0分鐘；5 5下3 〇分鐘；70°C下30分鐘；410(TCT1分鐘，之後接受分析。在 70C下30分鐘及100°C下1分鐘之條件下，可觀察到偵測量之減低，推測是由於SDF-1熱變性所致。換言之，在37 5 5 C下加熱3 0分鐘，可得到和未加熱樣品實質上相同的正曲線，且不影響SDF_ 1之偵測量。例類依據以上結果，使用來自24個假體之血漿樣品（見實 5)，可在分析前先於5 5°C下30分鐘，或無任何加熱，以_ 似實例2之方式以TR-FIA偵測SDF-1。（初步加熱在以緩衝溶 -37 1270672

五、發明說明（35) 液4稀釋血聚樣品前進行）έ士耍 "处仃）結果不於圖3 b中。在5 5 °C下初步加熱30分鐘，可使螢光強度平均加強約2〇%。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由這些結果可推知以下可能性，即血漿樣品中至少部份的SDF-1可以多元體型式存在及/或以與結合因子之結合型式存在’其可經熱解離或分解等。以此多元體及/或經結合型式存在的SDF-1可能可抑制與表位之結合。 (貫例9 ·血聚樣品稀釋之影響）先蓟的研九疋關於在血漿樣品中偵測化_8及MCP-! (Thavasu et al•(文件 i 5 )及 Kaijkawa et al (文件 6 ))已示出化學介素含量在未稀釋樣品之偵測上是無法估計的。因此’吾等研咒血漿樣品稀釋對於以TR-FIA偵測SDIM之影響。 ^ ^ 來自5個個體的血漿樣品，以由丨：丨至丨：2 〇的各種比例稀釋在緩衝溶液4中，再以類似實例2之方式，以TR_FIA偵測·· SDF-1。結果示於圖3 c。雖然稀釋比例由1 X增加至丨〇 X，仍可觀察到偵測敏度實質上一致的改善。另一方面，當稀釋比例由1 0 X增加至2 0 X，偵測敏度並無改善。因此，經評估10 X的稀釋（即，1〇份的緩衝溶液4對1份血漿樣品）是最有效的條件。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (實例1 0 :添加血液細胞至血漿樣品之影響）已有報告指出，添加IL-8及MCP-1至全血中可造成這些化學介素爲血液細胞所吸收（Amera et'al.(文件14)，Darbonne et al.(文件17)，及Neote et al.(文件18))。吾等研究血液細胞之吸收是否於SDF_ 1中可觀察到。 ___-38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1270672 A7 B7 五、發明說明（36 ) (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁} 和2 5 0彳政升全血接受微量離心，可令細胞沉積，血滎以 125微升上清液型式獲得。將IL-8，MCP-1或SDF-1加至125 微升血漿中，如此可達到預定的最後濃度。接下來，加有這些化學介素的血漿與細胞團塊混合，其爲125微升，或加上125微升血漿，且之後再於3 7 π下培育！ 5分鐘。接下來’和混合以細胞團塊之樣品一般，令細胞經由離心沉積再予以分離。在樣品内的可溶性IL_8及MCP-i以ELISA定量，且SDF-1及TR-FIA定量。結果示於圖4a至4c。加入的IL-8及MCP-1大多數可爲血液細胞所吸收（圖4 a及 4 b )。另一方面，在與血液細胞培育後，sdF- 1之減少低於 1 0 % (圖4 c )。在另一實驗中，SDF-1直接加至全血中；培育後，分離出血液細胞；且之後進行TR_FIA定量，其中可顯示與SDF-1加至血漿之對照組並無顯著的差異（數據未示出）。由上太一中，可證實SDF-1很少爲血液細胞所吸收。， (實例1 1 :血漿樣品中之TR-FIA-多重偵測）對於來自3 6個個體之血漿樣品，以類似實例2之方式，利用TR-FIA偵測SDF-1 ’並先經過5 5 °C之初步加熱歷3 〇分鐘 (見實例7)。結果示於圖5 c。人類血漿中之SDF-1水平具有〇.85±0·26毫微克/毫升之平均値及標準偏差。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製對來自相同的（三個）個體的血漿樣品，在相同條件的4個以上不同日子中重複進行偵測，偵測値顯出漲落在1 〇至 20%之内。此顯示以TR-FIA偵測之血漿SDIM有足夠高之信賴度。 (實例1 2 :血漿樣品中SDF-1與IgG之相關聯性） _-39- 氏張尺度適用中國國冢標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） 1270672

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（37 就如同IL-8及MCP-1，循環系統内自體抗體之結合或相關聯性《可能性’據報告是可能妨礙血漿樣品免疫分析之另一因素（Leonard et al.(文件 et al (文件 15))。在以下方式中，就與血漿中IgG之相關聯性來評估SDFd。。來自7個個體之血漿樣品，在未加熱或經熱處理後（55 C 3〇刀姜里），與蛋白質G_Sephar〇se共培育在冰上3 〇分叙由疋可耗盡1gG。樣品離心，且由此中取出上清液部份。上清液中之SDF-1再以丁R_FIA偵測。計算出和蛋白質G-Sepharose處理前血漿樣品偵測値比較下，螢光強度減低之比例。結果示於圖6。於圖6，有陰影之橫線及黑色橫線分別代表未加熱及加熱過（樣品。可看出，未加熱樣品較經加熱樣品更易感其蛋白質G-Sepharose處理之影響。在未加熱樣品中，以tr_fia 可測及之S13F-1水平由於IgG耗盡之故，減低23_37%(平均.· 3 0%)。另一方面，經加熱樣品之相當減低度爲6_22%(平均1 5 % )。因此，於實例8所示之初步加熱（圖3 b )作用，可解釋爲血漿樣品中的SDIM部份係以與IgG相關聯之型式存在’經由加熱而分解’如此轉化成可溶型式而可爲tr-fia 所測及。在另一實驗中，於參考SDFq中並未觀察到顯著的減低，其係加至血漿樣品中甚至是在蛋白質(34邛}1^〇〜處理之後 (數據未不出）。因此，SDF-1本身可吸附至蛋白質G_ Sepharose之可能性’及血漿樣品中抗_ IgG以外的抗 m或蛋白負可吸附至蛋白質G-Sepharose之可能性，及SDF-1 _ _— 国 * - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂-------- 1270672 A7 B7 五、發明說明（38 ) 被吸附至此抗體或蛋白質之可能性已被否定。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由以上結果可了解，人類血漿中可以TR_FIA測得之SDF-1 水平，和確實存在於血液中之生理性SDF-1水平極爲揍近。 (實例 13 :針對GM-CSF之TR-FIA) GM-CSF (50微升）之參考溶液，以類以實例2之方式接受固相螢光測定，除了利用抗-人類GM-CSF單株抗體爲捕獲抗體，及使用經生物素化之抗·人類GM-CSF單株抗體（由一般方法生物素化上述之PharMingen人類抗體而得），並產生參考用GM-CSF之校正曲線。結果示於圖7。再者，以類似貫例5之方法，自健康的日本人志願者中製備血漿樣品，如實例9所述以緩衝溶液4稀釋，並接受以TR-FIA偵測GM_ CSF，方式和參考溶液的相似。結果，對gm_csf而言，高敏度的偵測是可能的，且盡再現性所能可證實有極佳的結果。 —— (實例14 :針對IL-2之TR-FIA) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 IL-2的參考溶液（50微升）以類似實例2之方式接受固相螢光偵測，除了利用抗-人類IL-2單株抗體爲捕獲抗體，並使用生物素化之抗-人類比-2單株抗體（以一般方法生物素化上述PharMingen人類抗體而得），並產生參考用比_2之校正曲線。結果示於圖8。再者，以類似實例5之方式自健康日本人志願者中製備血漿樣品，如實例9所述以稀釋於緩衝溶液 4中，並以和參考溶液相似之方式，、利用π··偵測江} 結果，對IL-2而言，高敏度的IL-2偵測也是可能的，且盡再現性所能可證實有極佳的結果。

1270672 A7 B7 五、發明說明（39 ) 工業上的應用在此提出以時間分析形螢光免疫測定（TR_FIA)，其可在生物流體樣品中以極高的敏度偵測組織介素，特別是包括有SDF-1之化學介素，且使用容易，並提出用於此方法之套組。此方法及套組可應用至組織介素，其係以可溶性因子型式存在於血液循環中，且在微量下即具有生物活性，並涉及於各種病理學中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 裝

ϋ n i_i «1』-°J ·ϋ n amame ϋ ·ϋ ϋ I I

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱 1270672 A7 B7 五、發明說明（40 ) 參考書目經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1. Leonard, E.J. et al·, (1996) METHODS 10:150-157. 2. Kropf, J. et al. 7 (1991) Anal. Biochem. 197:258-265. 3 · Ogata, A. et al · , (1992 ) J · Immunol· Methods 148:15-22. 4. Yuan, J. et al · , ( 1997) Anal. Biochem 254(2): 283- 287. 5. Yuan, J· et al., (1998) Anal. Chem 70(3):596-601. 6. Tashiro, K· et al·, (1993) Science 26:600-603. 7. Bleul, C.C. et al., (1996) Nature 382:635-638· 8. Oberlin, E. et al., (1996) Nature 382:829-833. 9. Winkler, C. et al·, (1998) Science 279:389-393. ·/ 10. Martin, M.P. et al., (1998) Science 282:1907-1911. 11. Zou, Y-R. et al·, (1998) Nature 393:595-599. 12. Tachibana, K. et al., (1998) Nature 393:591-594. 13. Hesselgesser, J· 、et al·, (1998) J. Immunol. 160:877-883. 14. Amara, A. et al. , (1997) J. Exp. Med·, 186:139-146. 15. Thavasu, P·W. et al. , (1992) J·’. Immunol. Methods 153:115-124. 、 16. Kajikawa, 0. et al·, (1996) J.Immunol. Methods 197:19-29. 17· Darbonne, W. C. et al · , (1991) J. Clin. Invest. 88:1362-1369 . 18. Neote, K. (1994) Blood 84:44-52 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝訂---------.

Claims

A8 B8 C8 D8 號專利申請案土主直逢辜^範圍替換本(95年6月）

煩請委員明示年^ (\)正茶有無「超出原說明書或菌式所揭露之範圍且不得實質 ^ ^、BT & ^沾… 擴大或變更申請專利範園J。 J生物’聽樣品中組織介素之以時間分疫測定（TR-FIA)法，此方法包括：斤螢光免形成-種複合物，其中結合有：⑷一種第_抗_，勺括結合至固相的部份’及可結合至组織介素的區二：組織介素；（e卜種第二抗體’包括可結合至組織介素的區域及已結合有生物素之部份;⑷一種共軛物，包括鏈 L生物素蛋白或抗生物素蛋白，及可與鑭系金屬離子絡合的螢光結構部份；及⑷鑭系金屬.離子，複合物係在；相上形成；及偵測已絡合有鑭系金屬離子之螢光結構部份之螢光，其中該組織介素是屬於基質細胞衍生因子族（s D F hmily)、集落刺激因子族（CsF family)或間白素族（interleukin family)之組織介素，及該鑭系金屬為銪（Eu)、釤（Sm)、鉞（Tb)或鏑（Dy)，及其中螢光結構部份是以通式（I)代表： -R-Ar-C(=0)_CHrC(=0)-CnF2irX ⑴ (其中R是殘基，其是可與蛋白質形成共價键的官能基； Ar疋具有共輛雙键系統的輕基，η是等於或大於1的整數；且X是氟原子或以通式（11)代表的基團： -C(=0) = CH2-C(=0)-Ar_R- (II) 〇 2·根據申請專利範圍第1項之方法，其中的鑭系金屬是銪。 3·根據申請專利範圍第1項之方法，其中的螢光結構部份係以通式（III)代表： 66665-950621.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X 297公釐)

申請專利範

(III) 嗔之相同定 >K.Ar.(C( = 〇).CH2.C(^〇^c (其中R，Ar及n具有如申妓11 2n2 義）。％專利範圍第 4·根據申請專利範圍第3項之方、是心^-雙⑴^广丨^^”^^去^其中的螢光結構部份基）-磺基-鄰聯三苯。 1氣—4，6’’-已烷二酮-6，，- 5·根據申請專利範圍第丨項之方法並鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋，八其中在共軛物中每個位的螢光結構部份。白分子存在有10至6 0單 6·根據申請專利範圍第1項之是在未令在固相上形成之複八中偵/則螢光的步驟 7·根據中請專利範圍第，解之前進行。是在令在固相上形成之複合物分解：：測勞光的步驟 8·根據中請專利範圍第i项之進仃。質細胞衍生因子-；! (_」）。〃⑽組織介素是基其中的生物流體樣品其中在形成複合物之 9·根據申請專利範圍第1項之方法是血漿或全血。 1〇·根據申請專利範圍第1項之方法丰_义、y、 v ' 八|弘少从饭貧卿< 步包括以用於樣品稀釋之缓衝溶流體樣品之步驟， A其中用於樣品稀釋之緩衝溶液是G G1SG1 Μ心氯氯酸其PH值是7.3至8.3，緩衝溶液含有〇1至〇 3%牛血清白蛋白，0·05至〇·2%疊氮化鈉，及〇.5至15%氯化鈉。 U·根據申請專利範圍第1項的方法，其中在形成複合物之 -2 - 66665-950621.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 χ 297公釐） 1270672 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍步顯^進步包括將生物流體樣品在組織介素用之未變性溫度條件下接受熱處理。 12·根據申請專利範圍第1項之方法，其中在偵測螢光之步驟前進一步包括以用於洗滌之緩衝溶液洗滌在固相上形成之複合物之步驟，其中用於洗滌複合物之緩衝溶液是0 01至01 M 氳氯酸，其pH值是8·5至9·5，緩衝溶液含有〇〇1至〇 1%聚氧乙烯山梨聚醣單月桂酸酯。 i3·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該固相係具有吸附能力50-200 ng/cm2之微滴定盤。 14.種用以偵測生物流體樣品中組織介素之時間分析營光免疫測定（TR-FIA)法之套組，其中含有：一種第一抗體包括結合至固相之部份及可結合至組織介素之區域；一種第二抗體包括可結合至組織介素的區域及已結合有生物素之邵份；一種共軛物包括鏈抗生物素蛋白或抗生物素蛋白及可與鑭系金屬離子絡合的螢光結構部份；及鋼系金屬離子，其中該組織介素是屬於基質細胞衍生因子族（s D F family)、集落刺激因子族間白素族（interleukin family)之組織介素，及該鑭系金屬為銪（E u )、釤（S m )、铽（T b )或鏑（D y )之組織介素，及其中螢光結構部份是以通式（I)代表： -R-Ar-C(=0)-CHrC(=0)-CnF2n-X ⑴ (其中R是殘基，其是可與蛋白質形成共價鍵之官能Α· -3- 66665-950621.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4规格(210 X 297公釐) 8 8 8 8 A B c D 1270672 申請專利範圍 Ar是具有共軛雙键系之烴基；η是等於或大於1之整數且X是氟原子或以通式（II)代表的基團： -C(=0) = CH2-C(=0)-Ar-R- (II) 0 4- 66665-950621.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）