JP3058673B2 - サイトカインの測定方法及びその測定用キット - Google Patents
サイトカインの測定方法及びその測定用キットInfo
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- JP3058673B2 JP3058673B2 JP2304741A JP30474190A JP3058673B2 JP 3058673 B2 JP3058673 B2 JP 3058673B2 JP 2304741 A JP2304741 A JP 2304741A JP 30474190 A JP30474190 A JP 30474190A JP 3058673 B2 JP3058673 B2 JP 3058673B2
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Description
【発明の詳細な説明】 A.産業上の利用分野 本発明は、サイトカインの測定方法及びその測定用キ
ットに関するものであり、さらにくわしくは、極微量の
サイトカインを高感度に測定する方法及びその測定用キ
ットに関するものである。
ットに関するものであり、さらにくわしくは、極微量の
サイトカインを高感度に測定する方法及びその測定用キ
ットに関するものである。
B.発明の概要 本発明は、サイトカインに、固相に固定化されたアフ
ィニティ精製処理抗サイトカイン抗体と標識物質で標識
した抗体を、それぞれ抗原抗体反応を利用して結合させ
た後、標識物質を化学発光法により測定し、その濃度に
対応したサイトカインの濃度を測定することにより、極
微量のサイトカインの測定を可能としたものである。
ィニティ精製処理抗サイトカイン抗体と標識物質で標識
した抗体を、それぞれ抗原抗体反応を利用して結合させ
た後、標識物質を化学発光法により測定し、その濃度に
対応したサイトカインの濃度を測定することにより、極
微量のサイトカインの測定を可能としたものである。
C.従来の技術 サイトカインは、リンパ球もしくは非リンパ球由来の
生理活性物質で細胞の分裂や増殖あるいは抑制などさま
ざまな生物活性を有する。
生理活性物質で細胞の分裂や増殖あるいは抑制などさま
ざまな生物活性を有する。
サイトカインには種々の因子が含まれており、例え
ば、コロニー刺激因子（CSF）やインターロイキン（I
L）などが知られている。CSFには顆粒球系を分化増殖す
る顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−CSF）の他にマクロフ
ァージを分化増殖するマクロファージコロニー刺激因子
（Ｍ−CSF），顆粒球もマクロファージも両方形成する
顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM−CS
F），顆粒球，マクロファージとそれらの前駆体細胞で
ある多能性骨髄幹細胞を増殖するマルチ・コロニー刺激
因子などがある。
ば、コロニー刺激因子（CSF）やインターロイキン（I
L）などが知られている。CSFには顆粒球系を分化増殖す
る顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−CSF）の他にマクロフ
ァージを分化増殖するマクロファージコロニー刺激因子
（Ｍ−CSF），顆粒球もマクロファージも両方形成する
顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM−CS
F），顆粒球，マクロファージとそれらの前駆体細胞で
ある多能性骨髄幹細胞を増殖するマルチ・コロニー刺激
因子などがある。
またILにはヘルパーＴ細胞からのＴ細胞増殖因子の産
生を誘導することを主機能とするIL−1,T細胞を増殖す
る働きのあるIL−2,肥満細胞や血流幹細胞の増殖因子で
あるIL−3,IgG型とIgE型の抗体を特異的に生産させる因
子であるIL−4,抗体を生産するＢ細胞の増殖と分化を誘
導する因子であるIL−5,さらにＢ細胞を増殖せずに分化
を誘導し、抗体の生産を促進する因子であるIL−６など
が挙げられる。
生を誘導することを主機能とするIL−1,T細胞を増殖す
る働きのあるIL−2,肥満細胞や血流幹細胞の増殖因子で
あるIL−3,IgG型とIgE型の抗体を特異的に生産させる因
子であるIL−4,抗体を生産するＢ細胞の増殖と分化を誘
導する因子であるIL−5,さらにＢ細胞を増殖せずに分化
を誘導し、抗体の生産を促進する因子であるIL−６など
が挙げられる。
サイトカインは生体内では極微量にしか存在していな
いが免疫調節等に深く影響をおよぼす因子である。それ
ゆえ、サイトカインは生体の異変によって、極微量の範
囲内ではあるがその生体中での濃度が増減することが知
られている。従って、サイトカインの濃度を測定するこ
とにより、生体の状況を適確に知得することは可能であ
り、病気の予防および治療の効果の確認等が期待されて
いる。
いが免疫調節等に深く影響をおよぼす因子である。それ
ゆえ、サイトカインは生体の異変によって、極微量の範
囲内ではあるがその生体中での濃度が増減することが知
られている。従って、サイトカインの濃度を測定するこ
とにより、生体の状況を適確に知得することは可能であ
り、病気の予防および治療の効果の確認等が期待されて
いる。
また、サイトカインの測定は、サイトカインを薬剤と
して生体内に投与する場合に、その投与量を予め判断す
ることにも有益である。
して生体内に投与する場合に、その投与量を予め判断す
ることにも有益である。
D.発明が解決しようとする課題 上記の点より、サイトカインの臨床的意義を明らかに
することは重要であり、その際に健康人の血中のサイト
カイン値を測定することが必要となる。
することは重要であり、その際に健康人の血中のサイト
カイン値を測定することが必要となる。
たとえば、Ｇ−CSFについては、アフィニティ精製処
理されていない抗Ｇ−CSF抗体と比色法の組み合わせに
基づく測定キットが市販され、検出限界が1,000pg/mlの
感度まで測定が可能となっている。
理されていない抗Ｇ−CSF抗体と比色法の組み合わせに
基づく測定キットが市販され、検出限界が1,000pg/mlの
感度まで測定が可能となっている。
しかしながら、サイトカインの健康人の血中の濃度
は、数pg/mlであると言われており、現在のところ健康
人の測定ができるような高感度測定法がなく、そのため
サイトカインの臨床的意義は未だ不明で実用的な臨床応
用もできなかった。
は、数pg/mlであると言われており、現在のところ健康
人の測定ができるような高感度測定法がなく、そのため
サイトカインの臨床的意義は未だ不明で実用的な臨床応
用もできなかった。
E.課題を解決するための手段 本発明は、固相に固定化された抗サイトカイン抗体
が、アフィニティ精製された抗サイトカイン抗体の緩衝
液に固相を浸漬して調製されたものから成り、 好ましくはサイトカインと固相に固定化されたアフィ
ニティ精製された抗サイトカイン抗体との抗原抗体反応
をリン酸緩衝液中で、かつ振とう状態で反応させ、 検出手段がルミノール溶液とフェリシアン化カリウム
水溶液を用いた化学発光法であり、 前記固相に固定化された抗サイトカイン抗体に抗原で
あるサイトカインを抗原抗体反応を利用して結合させた
後、該サイトカインに抗原抗体反応を利用して標識物質
で標識した抗サイトカイン抗体を結合させ、このサイト
カインに結合した標識物質を前記検出手段により測定す
ることにより、該標識物質の濃度に対応してサイトカイ
ンの濃度を測定する方法を提供する。
が、アフィニティ精製された抗サイトカイン抗体の緩衝
液に固相を浸漬して調製されたものから成り、 好ましくはサイトカインと固相に固定化されたアフィ
ニティ精製された抗サイトカイン抗体との抗原抗体反応
をリン酸緩衝液中で、かつ振とう状態で反応させ、 検出手段がルミノール溶液とフェリシアン化カリウム
水溶液を用いた化学発光法であり、 前記固相に固定化された抗サイトカイン抗体に抗原で
あるサイトカインを抗原抗体反応を利用して結合させた
後、該サイトカインに抗原抗体反応を利用して標識物質
で標識した抗サイトカイン抗体を結合させ、このサイト
カインに結合した標識物質を前記検出手段により測定す
ることにより、該標識物質の濃度に対応してサイトカイ
ンの濃度を測定する方法を提供する。
又、本発明は前記のサイトカインの高感度な測定方法
を実施するための測定用キットを提供するものである。
即ち、固相への固定化用のアフィニティ精製された抗サ
イトカイン抗体の緩衝液に固相を浸漬して調製された抗
サイトカイン抗体、化学発光検出を可能とする標識物質
で標識した抗サイトカイン抗体，からなる測定用キット
である。
を実施するための測定用キットを提供するものである。
即ち、固相への固定化用のアフィニティ精製された抗サ
イトカイン抗体の緩衝液に固相を浸漬して調製された抗
サイトカイン抗体、化学発光検出を可能とする標識物質
で標識した抗サイトカイン抗体，からなる測定用キット
である。
その他必要に応じて、標準抗原たるサイトカイン，標
識酵素用基質，およびリン酸緩衝液等を当該測定用キッ
トに付加する。
識酵素用基質，およびリン酸緩衝液等を当該測定用キッ
トに付加する。
F.作用 （１）抗体のアフィニティ精製は、目的とする成分とア
フィニティ（生物学的親和性）が強い物質をカラムに詰
めておき、目的成分を含む混合液を流し込み、カラム内
に残った目的成分を取り外す役割をもつ薬品を次工程で
流し込んで、目的成分を回収する方法である。
フィニティ（生物学的親和性）が強い物質をカラムに詰
めておき、目的成分を含む混合液を流し込み、カラム内
に残った目的成分を取り外す役割をもつ薬品を次工程で
流し込んで、目的成分を回収する方法である。
アフィニティ精製することにより抗サイトカイン抗体
は、サイトカインに特異的結合するもののみを取り出し
て使用することができ、これに起因して、抗原との親和
力が高められ、発光方法による高感度な測定を行うこと
ができる。
は、サイトカインに特異的結合するもののみを取り出し
て使用することができ、これに起因して、抗原との親和
力が高められ、発光方法による高感度な測定を行うこと
ができる。
（２）固相に固定化された抗サイトカイン抗体を得る
際、固相は、アフィニティ精製抗サイトカイン抗体の濃
度が0.3〜10（μg/ml）の緩衝液に浸漬される。
際、固相は、アフィニティ精製抗サイトカイン抗体の濃
度が0.3〜10（μg/ml）の緩衝液に浸漬される。
これは、後の実施例２の第２図からも明らかなよう
に、上記濃度範囲外では、発光法による測定の検出限界
が上昇してしまい、数pg/ml以下、特に5pg/ml以下の検
出が困難となるからである。
に、上記濃度範囲外では、発光法による測定の検出限界
が上昇してしまい、数pg/ml以下、特に5pg/ml以下の検
出が困難となるからである。
なお、固相に抗体を固定化する方法は、物理的な吸
着、あるいはグルタルアルデヒド法，ポリリジン法など
の化学的結合方法など、従来の方法を使用することがで
きる。
着、あるいはグルタルアルデヒド法，ポリリジン法など
の化学的結合方法など、従来の方法を使用することがで
きる。
ここで使用する固相は、一般に使用されているビー
ズ，プレートまたはチューブを用いることができ、その
材料としてはポリスチレン，ポリエチレンなどのプラス
チック、ガラス、その他のものを使用することができ
る。
ズ，プレートまたはチューブを用いることができ、その
材料としてはポリスチレン，ポリエチレンなどのプラス
チック、ガラス、その他のものを使用することができ
る。
（３）本発明のサイトカインの測定は次のように抗原抗
体反応と発光方法により行われる。
体反応と発光方法により行われる。
まず、固相に固定化された抗サイトカイン抗体（以
下、固相抗体。）に抗原であるサイトカインを結合させ
た後、この固相抗体に結合したサイトカインに、標識物
質を標識した抗サイトカイン抗体（以下、標識抗体。）
を結合させる。
下、固相抗体。）に抗原であるサイトカインを結合させ
た後、この固相抗体に結合したサイトカインに、標識物
質を標識した抗サイトカイン抗体（以下、標識抗体。）
を結合させる。
次に、サイトカインに結合した標識抗体の標識物質
および必要に応じ、他の試薬を用いて発光させる。
および必要に応じ、他の試薬を用いて発光させる。
の発光反応により発生する光量を化学発光法で測
定し、間接的にサイトカインの濃度を測定する。
定し、間接的にサイトカインの濃度を測定する。
上記固相抗体とサイトカインとの反応は、リン酸緩衝
液中で、しかも振とう状態で行うことが好ましい。後述
の実施例にも示す通り、他の緩衝液、例えば、ホウ酸緩
衝液を使用したときより、さらに低濃度の検出を行うこ
とができるからである。
液中で、しかも振とう状態で行うことが好ましい。後述
の実施例にも示す通り、他の緩衝液、例えば、ホウ酸緩
衝液を使用したときより、さらに低濃度の検出を行うこ
とができるからである。
また、振とうにより均一でしかも十分な、特異的な結
合が得られる。
合が得られる。
（４）上記の発光方法には、化学発光方法および生物発
光方法が含まれ、下記の反応式に従って発生する光量を
計測してサイトカインの濃度が測定される。
光方法が含まれ、下記の反応式に従って発生する光量を
計測してサイトカインの濃度が測定される。
発光法により直接的に測定されるのは、標識物質で
あり、標識物質は、抗サイトカイン抗体に標識される物
質をいう。またそれ自身10-18mol/ml程度まで検出可能
なものであり、しかも、抗サイトカイン抗体に標識され
た際、その活性度が低下しないものが好ましい。このよ
うに化学発光法で直接的に検出した標識物質の濃度に対
応して、生体試料中の極く微量なサイトカインの濃度を
測定する。
あり、標識物質は、抗サイトカイン抗体に標識される物
質をいう。またそれ自身10-18mol/ml程度まで検出可能
なものであり、しかも、抗サイトカイン抗体に標識され
た際、その活性度が低下しないものが好ましい。このよ
うに化学発光法で直接的に検出した標識物質の濃度に対
応して、生体試料中の極く微量なサイトカインの濃度を
測定する。
また化学発光法を使用する場合には、標識物質は、ア
クリジニウムエステル、イソルミノール誘導体、ジオキ
シセタン誘導体などの化学発光物質を、あるいは例えば
以下の式により間接的に発光を行うグルコースオキシタ
ーゼ（以下、GOD）のような酸化酵素を使用することが
できる。
クリジニウムエステル、イソルミノール誘導体、ジオキ
シセタン誘導体などの化学発光物質を、あるいは例えば
以下の式により間接的に発光を行うグルコースオキシタ
ーゼ（以下、GOD）のような酸化酵素を使用することが
できる。
なお、触媒には、フェリシアン化カリウム、ペルオキ
シターゼなど通常の化学発光法に使用されるものを使用
することができる。
シターゼなど通常の化学発光法に使用されるものを使用
することができる。
G.実施例 次にサイトカインを例示して、実施例を記述するが本
発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではな
い。
発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではな
い。
実施例１ （Ａ）抗Ｇ−CSF抗体のアフィニティ精製処理 CNBr−セファロース4B（ファルマシア社製）にＧ−CS
Fをカップリングさせたものを充てん剤とし、カラムに
Ｇ−CSFの抗血清の溶液を流し込み、カラム内に残った
抗Ｇ−CSFIgGを回収して、この抗Ｇ−CSF IgGから抗Ｇ
−CSF Ｆ（ab′）２および抗Ｇ−CSFFab′を得た。
Fをカップリングさせたものを充てん剤とし、カラムに
Ｇ−CSFの抗血清の溶液を流し込み、カラム内に残った
抗Ｇ−CSFIgGを回収して、この抗Ｇ−CSF IgGから抗Ｇ
−CSF Ｆ（ab′）２および抗Ｇ−CSFFab′を得た。
（Ｂ）固相抗体の調製 上記（Ａ）でアフィニティ精製された抗Ｇ−CSF
Ｆ（ab′）２あるいはアフィニティ精製されていない抗
Ｇ−CSF Ｆ（ab′）２を含むホウ酸緩衝液（pH8.5）中
に、固相としてポリスチレンビーズ（φ＝6.5mm）を浸
漬し、一晩静置した。
Ｆ（ab′）２あるいはアフィニティ精製されていない抗
Ｇ−CSF Ｆ（ab′）２を含むホウ酸緩衝液（pH8.5）中
に、固相としてポリスチレンビーズ（φ＝6.5mm）を浸
漬し、一晩静置した。
次にの固相をウシ血清アルブミン（BSA）を含む
ホウ酸緩衝液で洗浄して、アフィニティ精製された抗Ｇ
−CSF Ｆ（ab′）２あるいはアフィニティ精製されて
いない抗Ｇ−CSFF（ab′）２の固相抗体を得た。
ホウ酸緩衝液で洗浄して、アフィニティ精製された抗Ｇ
−CSF Ｆ（ab′）２あるいはアフィニティ精製されて
いない抗Ｇ−CSFF（ab′）２の固相抗体を得た。
（Ｃ）酵素標識抗体の調製 標識物質としてGODを用い、マレイミド法により調製
を行った。すなわち、 マレイミド化 GODを含む0.1mol/のリン酸緩衝液（pH7.0）に架橋
剤を含むジメチルホルムアミド溶液を加え、GODにマレ
イミド基を導入する。
を行った。すなわち、 マレイミド化 GODを含む0.1mol/のリン酸緩衝液（pH7.0）に架橋
剤を含むジメチルホルムアミド溶液を加え、GODにマレ
イミド基を導入する。
（ｉ） 上記（Ａ）で得られたアフィニティ精製され
た抗Ｇ−CSF Fab′およびアフィニティ精製されていな
い抗Ｇ−CSF Fab′を含むリン酸緩衝液（0.1mol/,pH
6.0）にβ−メルカプトエチルアミン1.1mg、EDTA5mmol/
含む0.1mol/リン酸緩衝液（pH6.0）を加えて、37℃
の温度で撹拌を行った。
た抗Ｇ−CSF Fab′およびアフィニティ精製されていな
い抗Ｇ−CSF Fab′を含むリン酸緩衝液（0.1mol/,pH
6.0）にβ−メルカプトエチルアミン1.1mg、EDTA5mmol/
含む0.1mol/リン酸緩衝液（pH6.0）を加えて、37℃
の温度で撹拌を行った。
（ii） 次にセファデックスＧ−25を充てんしたPD−10
カラム（ファルマシア社製）で脱塩を行った。
カラム（ファルマシア社製）で脱塩を行った。
GOD標識抗Ｇ−CSF抗体の調製 （ｉ） のマレイミド化GOD3mgを含む0.1mol/リン
酸緩衝液（pH6.0）にの抗Ｇ−CSF Fab′5.4mgを含む
0.1mol/リン酸緩衝液を加え、 （ii） さらに0.1mol/リン酸緩衝液（pH6.0）を加え
る。30℃の温度で撹拌を行い、４℃で静置する。
酸緩衝液（pH6.0）にの抗Ｇ−CSF Fab′5.4mgを含む
0.1mol/リン酸緩衝液を加え、 （ii） さらに0.1mol/リン酸緩衝液（pH6.0）を加え
る。30℃の温度で撹拌を行い、４℃で静置する。
（iii） 上記（ii）の混合溶液をTSK G 3000 SW（東
ソー社製）カラムで精製し、GOD標識抗Ｇ−CSF抗体を得
た。
ソー社製）カラムで精製し、GOD標識抗Ｇ−CSF抗体を得
た。
（Ｄ）上記（Ｂ）で得た固相抗体および（Ｃ）で得たGO
D標識抗体を用いて、次の手順で抗原抗体反応を行った
後、化学発光法によりＧ−CSFの検出限界を測定した。
D標識抗体を用いて、次の手順で抗原抗体反応を行った
後、化学発光法によりＧ−CSFの検出限界を測定した。
Ｇ−CSF溶液に上記（Ｂ）で得た固相抗体を添加し
た。
た。
さらにリン酸緩衝液（pH7.0）を加え、固相抗体
と、Ｇ−CSFとの抗原抗体反応を行った。
と、Ｇ−CSFとの抗原抗体反応を行った。
次に固相を洗浄し、（Ｃ）で得たGOD標識抗体を加
えて固相に結合しているＧ−CSFと抗原抗体反応を室温
で行った。
えて固相に結合しているＧ−CSFと抗原抗体反応を室温
で行った。
さらにの固相を洗浄し、別の試験管に移し0.5mol
/のグルコースを添加し、標識酵素のGODと反応させ
た。
/のグルコースを添加し、標識酵素のGODと反応させ
た。
の溶液に0.15NのHClを加えた後サンプリングを行
い、この溶液に２×10-7mol/ルミノール溶液および６
×10-3mol/のK3Fe（CN）６溶液を加え、16S〜45S後の
発光量をルミノメータ（明電舎製）で測定し、Ｇ−CSF
の検出限界を測定した。
い、この溶液に２×10-7mol/ルミノール溶液および６
×10-3mol/のK3Fe（CN）６溶液を加え、16S〜45S後の
発光量をルミノメータ（明電舎製）で測定し、Ｇ−CSF
の検出限界を測定した。
結果を第１表および第１図に示す。なお比較のた
め、比色法による測定結果をも第１表に示す。この場
合、標識酵素として、比色法においては、GODより感度
がよいといわれている西洋ワサビペルオキシターゼ（HR
P）を使用した。
め、比色法による測定結果をも第１表に示す。この場
合、標識酵素として、比色法においては、GODより感度
がよいといわれている西洋ワサビペルオキシターゼ（HR
P）を使用した。
第１表より、化学発光法による測定は、比色法による
測定より感度がよく、低濃度まで測定することができ
た。
測定より感度がよく、低濃度まで測定することができ
た。
また、固相抗体にアフィニティ処理を行った抗Ｇ−CS
F抗体を使用した場合、固相抗体にアフィニティ処理を
行っていないものよりさらに低濃度まで測定することが
できた。
F抗体を使用した場合、固相抗体にアフィニティ処理を
行っていないものよりさらに低濃度まで測定することが
できた。
実施例２ 実施例１（Ｂ）の固相抗体の精製において、固相が浸
漬される抗Ｇ−CSF抗体の浸漬濃度と検出限界との関係
を調べた。
漬される抗Ｇ−CSF抗体の浸漬濃度と検出限界との関係
を調べた。
アフィニティ精製されたヤギ抗Ｇ−CSF Ｆ（a
b′）２を0.1mol/のホウ酸緩衝液（pH8.5）で次の各
濃度に希釈した。
b′）２を0.1mol/のホウ酸緩衝液（pH8.5）で次の各
濃度に希釈した。
濃度;0.05,0.1,0.5,1,5,10,25（μg/ml） の各濃度の溶液中にポリスチレンビーズ（φ＝6.
5mm）を浸漬し、一晩静置した。
5mm）を浸漬し、一晩静置した。
の固相を0.1％BSAを含む0.1mol/ホウ酸緩衝液
（pH8.5）で洗浄して各浸漬液濃度に対する固相抗体を
得た。
（pH8.5）で洗浄して各浸漬液濃度に対する固相抗体を
得た。
次に標識酵素としてGOD、抗体としてアフィニティ
精製されたヤギ抗Ｇ−CSF Fab′およびアフィニティ精
製されていないヤギ抗Ｇ−CSF Fab′を用い実施例１
（Ｃ）に示す方法で酵素標識抗体を得た。
精製されたヤギ抗Ｇ−CSF Fab′およびアフィニティ精
製されていないヤギ抗Ｇ−CSF Fab′を用い実施例１
（Ｃ）に示す方法で酵素標識抗体を得た。
およびの固相抗体、酵素標識抗体を用いて実施
例１（Ｄ）の方法によりＧ−CSFの検出限界を測定し
た。結果を第２図に示す。
例１（Ｄ）の方法によりＧ−CSFの検出限界を測定し
た。結果を第２図に示す。
なお、固相抗体、酵素標識抗体およびＧ−CSFの抗原
抗体反応はリン酸緩衝液（pH7.0）中、振とう状態で行
った。
抗体反応はリン酸緩衝液（pH7.0）中、振とう状態で行
った。
第２図より、浸漬液濃度が0.3μg/ml〜10μg/mlであ
るとき数pg/ml以下、特に5pg/ml以下の濃度のＧ−CSFの
測定をすることができる。
るとき数pg/ml以下、特に5pg/ml以下の濃度のＧ−CSFの
測定をすることができる。
実施例３ 実施例１（Ｄ）の抗原抗体反応において、固相抗体と
Ｇ−CSFの反応をリン酸緩衝液中、振とう状態で行う場
合と、ホウ酸緩衝液を用いた場合で行ったものについ
て、化学発光法によるＧ−CSFの検出限界を比較した。
Ｇ−CSFの反応をリン酸緩衝液中、振とう状態で行う場
合と、ホウ酸緩衝液を用いた場合で行ったものについ
て、化学発光法によるＧ−CSFの検出限界を比較した。
固相抗体 アフィニティ ヤギ抗Ｇ−CSF F（ab′）
２ 標識抗体 GOD標識アフィニティ ヤギ抗Ｇ−CSF Fa
b′ 第２表より、リン酸緩衝液中、振とう状態で抗原抗体
反応を行うと、さらに検出限界を低下させ、低濃度まで
測定することができる。
２ 標識抗体 GOD標識アフィニティ ヤギ抗Ｇ−CSF Fa
b′ 第２表より、リン酸緩衝液中、振とう状態で抗原抗体
反応を行うと、さらに検出限界を低下させ、低濃度まで
測定することができる。
実施例４ 6.5mmφポリスチレンボールを0.3μg/ml〜10μg/mlの
アフィニティ精製抗Ｇ−CSF抗体溶液に浸漬して調製し
た固相抗体，マレイミド法により調製したGOD標識抗Ｇ
−CSF抗体の溶液，標準抗原（1.0,5.0,10,25,50pg/ml）
からなるＧ−CSF測定用キットを作成した。
アフィニティ精製抗Ｇ−CSF抗体溶液に浸漬して調製し
た固相抗体，マレイミド法により調製したGOD標識抗Ｇ
−CSF抗体の溶液，標準抗原（1.0,5.0,10,25,50pg/ml）
からなるＧ−CSF測定用キットを作成した。
実施例５ （Ａ）抗IL−２抗体のアフィニティ精製処理CNBr−セフ
ァロース4B（ファルマシア社製）にIL−２をカップリン
グさせたものを充てん剤とし、カラムに抗IL−２ IgG
分画（コラボレーティブ社製）の溶液を流し込み、カラ
ム内に残った抗IL−２ IgGを回収して、この抗IL−２
IgGから抗IL−２ Ｆ（ab′）２および抗IL−２ Fa
b′を得る。
ァロース4B（ファルマシア社製）にIL−２をカップリン
グさせたものを充てん剤とし、カラムに抗IL−２ IgG
分画（コラボレーティブ社製）の溶液を流し込み、カラ
ム内に残った抗IL−２ IgGを回収して、この抗IL−２
IgGから抗IL−２ Ｆ（ab′）２および抗IL−２ Fa
b′を得る。
（Ｂ）固相抗体の調製 上記（Ａ）でアフィニティ精製された抗IL−２ Ｆ
（ab′）２を含むホウ酸緩衝液（pH8.5）中に、固相と
してポリスチレンビーズ（φ＝6.5mm）を浸漬し、一晩
静置する。
（ab′）２を含むホウ酸緩衝液（pH8.5）中に、固相と
してポリスチレンビーズ（φ＝6.5mm）を浸漬し、一晩
静置する。
次にの固相をウシ血清アルブミン（BSA）を含む
ホウ酸緩衝液で洗浄して、アフィニティ精製された抗IL
−２ Ｆ（ab′）２の固相抗体を得る。
ホウ酸緩衝液で洗浄して、アフィニティ精製された抗IL
−２ Ｆ（ab′）２の固相抗体を得る。
（Ｃ）酵素標識抗体の調製 標識物質としてGODを用い、マレイミド法により調製
を行う。すなわち、 マレイミド化 GODを含む0.1mol/のリン酸緩衝液（pH7.0）に架橋
剤を含むジメチルホルムアミド溶液を加え、GODにマレ
イミド基を導入する。
を行う。すなわち、 マレイミド化 GODを含む0.1mol/のリン酸緩衝液（pH7.0）に架橋
剤を含むジメチルホルムアミド溶液を加え、GODにマレ
イミド基を導入する。
（ｉ） 上記（Ａ）で得られたアフィニティ精製され
たIL−２ Fab′を含むリン酸緩衝液（0.1mol/,pH6.
0）にβ−メルカプトエチルアミン1.1mg、EDTA5mmol/
含む0.1mol/リン酸緩衝液（pH6.0）を加えて、37℃の
温度で撹拌を行う。
たIL−２ Fab′を含むリン酸緩衝液（0.1mol/,pH6.
0）にβ−メルカプトエチルアミン1.1mg、EDTA5mmol/
含む0.1mol/リン酸緩衝液（pH6.0）を加えて、37℃の
温度で撹拌を行う。
（ii） 次にセファデックスＧ−25を充てんしたPD−10
カラム（ファルマシア社製）で脱塩を行う。
カラム（ファルマシア社製）で脱塩を行う。
GOD標識抗IL−２抗体の調製 （ｉ） のマレイミド化GOD3mgを含む0.1mol/リン
酸緩衝液（pH6.0）にの抗IL−２ Fab′5.4mgを含む
0.1mol/リン酸緩衝液を加え、 （ii） さらに0.1mol/リン酸緩衝液（pH6.0）を加え
る。30℃の温度で撹拌を行い、４℃で静置する。
酸緩衝液（pH6.0）にの抗IL−２ Fab′5.4mgを含む
0.1mol/リン酸緩衝液を加え、 （ii） さらに0.1mol/リン酸緩衝液（pH6.0）を加え
る。30℃の温度で撹拌を行い、４℃で静置する。
（iii） 上記（ii）の混合溶液をTSK G 3000 SW（東
ソー社製）カラムで精製し、GOD標識抗IL−２抗体を得
る。
ソー社製）カラムで精製し、GOD標識抗IL−２抗体を得
る。
（Ｄ）上記（Ｂ）で得た固相抗体および（Ｃ）で得たGO
D標識抗体を用いて、次の手順で抗原抗体反応を行った
後、化学発光法によりIL−２の検出限界を測定する。
D標識抗体を用いて、次の手順で抗原抗体反応を行った
後、化学発光法によりIL−２の検出限界を測定する。
IL−２溶液に上記（Ｂ）で得た固相抗体を添加す
る。
る。
さらにリン酸緩衝液（pH7.0）を加え、固相抗体
と、IL−２との抗原抗体反応を行う。
と、IL−２との抗原抗体反応を行う。
次に固相を洗浄し、（Ｃ）で得たGOD標識抗体を加
えて固相に結合しているIL−２と抗原抗体反応を室温で
行う。
えて固相に結合しているIL−２と抗原抗体反応を室温で
行う。
次にの固相を洗浄し、別の試験管に移し0.5mol/
のグルコースを添加し、標識酵素のGODと反応させ
る。
のグルコースを添加し、標識酵素のGODと反応させ
る。
の溶液に0.15NのHClを加えた後サンプリングを行
い、この溶液に２×10-7mol/ルミノール溶液および６
×10-3mol/のK3Fe（CN）６溶液を加え、16S〜45S後の
発光量をルミノメータ（明電舎製）で測定し、IL−２の
検出限界を測定する。
い、この溶液に２×10-7mol/ルミノール溶液および６
×10-3mol/のK3Fe（CN）６溶液を加え、16S〜45S後の
発光量をルミノメータ（明電舎製）で測定し、IL−２の
検出限界を測定する。
この系を用いると検出限界１〜10（pg/ml）のIL−２
の測定ができる。
の測定ができる。
実施例６ 6.5mmφポリスチレンボールを0.3μg/ml〜10μg/mlの
アフィニティ精製抗IL−２抗体溶液に浸漬して調製した
固相抗体，マレイミド法により調製したGOD標識抗IL−
２抗体の溶液，標準抗原（1.0,5.0,10,25,50pg/ml）か
らなるIL−２測定用キットを作成することができる。
アフィニティ精製抗IL−２抗体溶液に浸漬して調製した
固相抗体，マレイミド法により調製したGOD標識抗IL−
２抗体の溶液，標準抗原（1.0,5.0,10,25,50pg/ml）か
らなるIL−２測定用キットを作成することができる。
H.発明の効果 以上詳細に説明したように、本発明は抗原であるサイ
トカインに、固相に固定化された抗サイトカイン抗体と
標識物質で標識した抗サイトカイン抗体とをそれぞれ抗
原抗体反応を利用して結合させた後、前記標識物質を検
出手段により測定して、該標識物質の濃度に対応してサ
イトカインの濃度を測定する方法において、固相に固定
化された抗サイトカイン抗体が、0.3（μg/ml）〜10
（μg/ml）のアフィニティ精製された抗サイトカイン抗
体の緩衝液に固相を浸漬して調製されたものから成り、
サイトカインと固相に固定化された抗サイトカイン抗体
との抗原抗体反応をリン酸緩衝液中でかつ振とう状態で
行い、検出手段としてルミノール溶液とフェリシアン化
カリウム水溶液を用いた化学発光法で行うことにより、
標識物質の濃度に対応するサイトカインの濃度を測定す
ることによって健康人血清中の極く微量なサイトカイン
濃度を高感度で測定することができる。
トカインに、固相に固定化された抗サイトカイン抗体と
標識物質で標識した抗サイトカイン抗体とをそれぞれ抗
原抗体反応を利用して結合させた後、前記標識物質を検
出手段により測定して、該標識物質の濃度に対応してサ
イトカインの濃度を測定する方法において、固相に固定
化された抗サイトカイン抗体が、0.3（μg/ml）〜10
（μg/ml）のアフィニティ精製された抗サイトカイン抗
体の緩衝液に固相を浸漬して調製されたものから成り、
サイトカインと固相に固定化された抗サイトカイン抗体
との抗原抗体反応をリン酸緩衝液中でかつ振とう状態で
行い、検出手段としてルミノール溶液とフェリシアン化
カリウム水溶液を用いた化学発光法で行うことにより、
標識物質の濃度に対応するサイトカインの濃度を測定す
ることによって健康人血清中の極く微量なサイトカイン
濃度を高感度で測定することができる。
特に健康人の血中のサイトカインの濃度は数pg/mlと
いう微量であるが、サイトカインは本来免疫調節等にも
影響を及ぼす因子であって、生体の異変によって生体中
での濃度が増減するため、この濃度を測定することによ
って生体の状況を適確に知得することが可能となる。
いう微量であるが、サイトカインは本来免疫調節等にも
影響を及ぼす因子であって、生体の異変によって生体中
での濃度が増減するため、この濃度を測定することによ
って生体の状況を適確に知得することが可能となる。
従って極く微量のサイトカイン濃度の測定を可能とし
たことによってサイトカインの臨床的意義を高め、病気
の予防とか治療効果の確認等の実用的な臨床応用に資す
る効果が大きく、更にサイトカインを薬剤として用いる
場合の投与量を判断する基準を決定することができると
いう効果が得られる。
たことによってサイトカインの臨床的意義を高め、病気
の予防とか治療効果の確認等の実用的な臨床応用に資す
る効果が大きく、更にサイトカインを薬剤として用いる
場合の投与量を判断する基準を決定することができると
いう効果が得られる。
第１図は、Ｇ−CSFの検量線を示すグラフ、第２図は固
相の浸漬液濃度に対するＧ−CSFの検出限界を示すグラ
フである。
相の浸漬液濃度に対するＧ−CSFの検出限界を示すグラ
フである。
フロントページの続き (72)発明者 横山 和枝 神奈川県相模原市東林間６―６―28 (72)発明者 青柳 重夫 東京都新宿区須賀町11―７ (72)発明者 蒲池 信一 東京都保谷市新町５丁目17番31号 (56)参考文献 特開 昭62−180270（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−157997（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−22254（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−189453（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−57316（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−145960（ＪＰ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】抗原であるサイトカインを、固相に固定化
された抗サイトカイン抗体と標識物質で標識した抗サイ
トカイン抗体とでそれぞれ抗原抗体反応を利用して結合
させた後、前記標識物質を検出手段により測定し、該標
識物質の濃度に対応してサイトカインの濃度を測定して
成る方法において、 前記固相に固定化された抗サイトカイン抗体が、アフィ
ニティ精製され、かつＦ（ab′）２に調製された抗サイ
トカイン抗体0.3〜10μg/mlを含む緩衝液溶液に固相を
浸漬して調製されたものから成り、前記サイトカインと
固相に固定化された抗サイトカイン抗体ならびに標識物
質で標識した抗サイトカイン抗体との抗原抗体反応が、
リン酸緩衝液中でかつ振とう状態で行われ、前記標識物
質の検出手段がルミノール溶液とフェリシアン化カリウ
ム水溶液を用いた化学発光法であることを特徴とするサ
イトカインの測定方法。 - 【請求項２】前記検出手段が２×10-7（mol/）のルミ
ノール溶液と６×10-3（mol/）のフェリシアン化カリ
ウム水溶液を用いた化学発光法であることを特徴とする
請求項１記載のサイトカインの測定方法。 - 【請求項３】アフィニティ精製され、かつＦ（ab′）２
に調製された抗サイトカイン抗体0.3〜10μg/mlを含む
緩衝液溶液に固相を浸漬して調製された抗サイトカイン
抗体固定化固相，化学発光検出を可能とする標識物質で
標識した抗サイトカイン抗体，標準抗原たるサイトカイ
ン，標識酵素用基質，およびリン酸緩衝液からなるサイ
トカイン測定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2304741A JP3058673B2 (ja) | 1989-11-10 | 1990-11-09 | サイトカインの測定方法及びその測定用キット |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-292973 | 1989-11-10 | ||
| JP29297389 | 1989-11-10 | ||
| JP2304741A JP3058673B2 (ja) | 1989-11-10 | 1990-11-09 | サイトカインの測定方法及びその測定用キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03251763A JPH03251763A (ja) | 1991-11-11 |
| JP3058673B2 true JP3058673B2 (ja) | 2000-07-04 |
Family
ID=26559199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2304741A Expired - Fee Related JP3058673B2 (ja) | 1989-11-10 | 1990-11-09 | サイトカインの測定方法及びその測定用キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3058673B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
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| MY150687A (en) * | 2006-07-21 | 2014-02-28 | Femalon S P R L | Assay and kit for predicting implantation success in assisted fertilisation |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| DK487784A (da) * | 1983-10-13 | 1985-04-14 | Univ Georgia | Immunoassay |
| JPS61189453A (ja) * | 1985-02-19 | 1986-08-23 | Toyobo Co Ltd | 化学発光法による酵素免疫測定法 |
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| JPS63145960A (ja) * | 1986-06-23 | 1988-06-18 | Meidensha Electric Mfg Co Ltd | 標識抗体の非特異的吸着抑制薬 |
| GB8623850D0 (en) * | 1986-10-03 | 1986-11-05 | Ciba Geigy Ag | Lymphokine related peptide |
-
1990
- 1990-11-09 JP JP2304741A patent/JP3058673B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03251763A (ja) | 1991-11-11 |
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