JP3551678B2 - ヘモグロビンA1cの測定法及びキット - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘモグロビンA1cを測定するための1ステップ免疫測定法及びそのキットに関する。
【0002】
【従来の技術】
ヘモグロビンA1c(HbA1c)はヘモグロビンの1種であって、ヘモグロビンβ鎖N末端アミノ酸のバリンのアミノ基にグルコースのアルデヒド基がシッフ塩基を形成して結合し、さらにアマドリ転位を受けてケトアミンを形成したもので、1〜2カ月前の平均血糖値を反映するところから、糖尿病患者の血糖コントロールの指標として臨床的に広く用いられている。
【0003】
従来HbA1cの測定には、イオン交換クロマトグラフィーを用いたHPLC法による測定機すなわちグリコヘモグロビン分析計が主に用いられていた。この方法は再現性に優れているが、専用の分析装置であること、検体処理数に制限があること、HbA1c以外のヘモグロビン画分を加味して測定してしまうこと、などの問題点が指摘されていた。また、装置のメンテナンスに多大な手間がかかることも問題である。
【0004】
近年になって、この問題点を解決するために、HPLC以外の方法によるHbA1cの測定系の開発が行なわれ、いくつかの測定試薬が上市された。中でも免疫測定は、特異性が高いことから注目を集めている。
【0005】
HbA1cの免疫測定系としては、例えば2つの抗体を用いたサンドイッチアッセイなどが考えられるが、ヘモグロビンの固相への物理吸着を利用して、固相に吸着したHbA1cをHbA1cに特異性の高い抗体で検知する方法が知られている。この固相にヘモグロビンを直接吸着させる方法では、ヘモグロビンが固相に対して過剰量存在するときには、血液中のHbA1cの割合と等しい割合で固相上にHbA1cが吸着される。臨床現場においてはHbA1cは総ヘモグロビン量に対する割合(%)で表されるため、固相上に血液中と等しい割合でHbA1cが吸着されると、HbA1cの絶対量を測定しなくても、血液中のHbA1c濃度(%)が求められることになる。この、ヘモグロビンを固相に吸着させる方法においては、固相上に十分にヘモグロビンが吸着することが必須である。従って、まずラテックスやポリスチレンなどの固相表面上にヘモグロビンを吸着させ、必要に応じて洗浄などにより未吸着のヘモグロビンを除去し、次にHbA1cを特異的に選択する抗HbA1c抗体により、HbA1cのみを特異的に認識するという2段階を経ることとなり、この方法によるEIA用キットも市販されている。
【0006】
この市販のEIA用キットを用いた2ステップ測定においては、中間洗浄操作が必要となるため、操作が繁雑になることはもちろん、吸着、洗浄、抗体結合の3段階を経ることにより時間がかかり、また洗浄により固相化されたヘモグロビンが脱落する可能性がある。さらにこれらのキットにおいては、β鎖N末のグリケート化N末端ペプチド残基を抗体結合に利用するために、固相化時に血液試料に強い変性処理を施すことが多いが、酵素標識抗体がこの条件下で失活する可能性が高いため、1ステップにすることは難しいという問題がある。また、これらのキットにおいてはこの強い変性条件のため、変性血液試料は調製後ただちに用いることが要求されており、時間が経過すると、沈澱の生成などにより値がばらついたり正確な値が得られなくなることから、大量処理には不適当であると考えられていた。
【0007】
他方、EIA以外にラテックス凝集法を利用した免疫測定法も開発されている。未感作ラテックス液中に溶血検体を添加しヘモグロビンを物理吸着させて固相化し、次にHbA1cと反応するモノクローナル抗体と抗マウスIgGポリクローナル抗体を添加して凝集を生じさせて、HbA1c(%)を測定する方法である。本方法においては洗浄操作は必要としないが、抗原を吸着させるためのラテックスを大量に必要とするため、非特異的な凝集反応が生じる可能性があり、異常値が出現したり、あるいはHbA1cの抗原抗体反応による濁度増加が検出されにくくなる恐れがあった。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
糖尿病を初めとする成人病は、老年人口の増加とともに確実に増加している。それとともに老人検診が必要となると、HbA1cのような血糖状態の指標として広く認知されている項目は検診の対象となるため、処理検体能力の向上は必須であり、簡便で正確にしかも大量に処理することが可能である測定試薬の開発は非常に求められるところである。従来の技術では、HPLC法では検体処理能力が小さく、簡便さの面で問題があり、専用機が必要であるという問題点があり、他方EIA法やラテックス凝集法は操作が繁雑である、正確性に欠けるなどの問題点があった。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特異性の高い免疫法を基本とし、かつより簡便で正確にHbA1c濃度を測定できる系を検討した結果、固相へのヘモグロビンの吸着及び抗原HbA1cと抗HbA1c抗体の結合を同時に行なわせる1ステップ系によりHbA1cを測定可能な系を構築し、本発明を完成するに至った。
【0010】
即ち本発明は、試料を、固相及び抗ヘモグロビンA1c抗体に同時に接触させ、反応により生成した固相化試料に結合した抗ヘモグロビンA1c抗体と、未反応の抗ヘモグロビンA1c抗体とを分離し、固相化試料に結合した抗ヘモグロビンA1c抗体または未反応の抗ヘモグロビンA1c抗体を検出することを特徴とするヘモグロビンA1cの測定法にある。
【0011】
また本発明は、固相及び抗ヘモグロビンA1c抗体とから成る、ヘモグロビンA1cの1ステップ免疫測定法用キットである。以下、本発明を更に詳細に説明する。
【0012】
本発明では、血液中のHbA1cを測定するため、試料となる血液はあらかじめ溶血させておく必要がある。溶血の方法には特に限定はなく、種々の方法を使用することができ、例えば水などの低等張液や界面活性剤を用いることができる。
【0013】
溶血させた後、続いて試料の前処理を行う。この前処理によって、HbA1cを変性させ、また不安定型HbA1cを除去することができる。前処理の方法には特に限定はなく、種々の方法を使用することができ、例えばKSCN塩などを用いることができる。しかしながら、次に行われる免疫測定系への悪影響を低減するため、すなわち、反応系に共存する前処理液により試料中に沈殿が精製するのを低減し、また酵素ラベル化抗体を用いた場合の酵素の失活を低減するため、前処理はよりマイルドな条件で、必要最小限の量を用いて行うことが好ましい。従って前処理は、例えば弱酸性条件下で行うことが好ましい。弱酸性条件下とは、好ましくはpH3.0〜6.9、さらに好ましくはpH4.0〜6.0である。このような条件下での前処理には、例えば脂肪族カルボン酸緩衝液またはほう酸緩衝液などを用いることが例示される。脂肪族カルボン酸緩衝液としては、モノカルボン酸、ジカルボン酸などの緩衝液が例示され、具体的にはコハク酸緩衝液、マロン酸緩衝液、フマル酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、グルタル酸緩衝液又は酢酸緩衝液などが例示される。この中でもコハク酸緩衝液、グルタル酸緩衝液又は酢酸緩衝液などが好ましく、特にコハク酸緩衝液が好ましい。
【0014】
このような弱酸性条件下で前処理を行うことにより、ヘモグロビンのα2β2の構造を保持したままHbA1cを変性させ、かつ不安定型HbA1cを除去することができる。なお溶血、前処理は順次行ってもよく、また同時に行ってもよい。
【0015】
このように溶血・前処理した試料を、固相及び抗HbA1c抗体に同時に接触させる。この時に用いられる固相は、ヘモグロビンが物理的に吸着しうるものであれば特に限定はされないが、例えばガラス、ポリスチレン、ラテックス、濾紙などの素材による、チューブ、玉、プレート、微粒子などが挙げられる。いずれにしても固相は表面積が大きいもののほうがヘモグロビンの吸着量が増し、ひいては測定感度の向上につながるので好ましい。
【0016】
一方、反応に用いられる抗HbA1c抗体は、HbA1cを特異的に認識する物であれば、特に限定はなく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体いずれであってもよく、またそれらをフラグメント化したものであってもよい。この抗HbA1c抗体には、免疫反応後の検出に便利なようにラベルをつけることが好ましい。このラベルは通常、免疫反応の検出に用いられるものであれば特に限定はなく、酵素、放射性同位元素、蛍光物質などが例示され、特に酵素標識が好ましい。具体的には、酵素としてはアルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−D−グルコシダーゼなどが、放射性同位元素としては125Iなどが、蛍光物質としてはフルオレセインイソチオシアネートなどが挙げられる。また抗HbA1c抗体がラベル化されない場合には、抗HbA1c抗体を認識する抗体(第2抗体)をラベル化し、それを反応させ検出に用いればよい。この時のラベルも前述のものが用いられる。なお抗HbA1c抗体は、固相化されたHbA1cと結合するのに十分な量を添加することが好ましい。
【0017】
本発明において試料は、固相及び抗HbA1c抗体に同時に接触させ反応を行わせる。このように試料の固相への反応及び抗HbA1c抗体への反応を1ステップで実施することが特徴である。このためには、試料に対して固相及び抗HbA1c抗体を同時に添加する方法や、また固相と抗HbA1c抗体をあらかじめ混合しそれらを試料に添加する方法などが挙げられる。試料の固相及び抗HbA1c抗体への反応条件としては特に限定はなく、通常の免疫測定反応時の条件を採用すればよい。ただし検出に支障がない限り、反応時間は短い方がよく、通常5〜60分、好ましくは5〜50分、さらに好ましくは5〜15分である。これは、測定効率の向上のためばかりでなく、反応系に共存する前処理液により試料中に沈殿が生成するのを低減し、また酵素ラベル化抗HbA1c抗体を用いた場合には、前処理液による酵素の失活を低減することができるからである。なお、抗HbA1c抗体がラベル化されていない場合は、ラベル化した第2抗体を添加し、反応させることが好ましい。
【0018】
試料の固相及び抗HbA1c抗体への反応後に、固相化試料に結合した抗HbA1c抗体と、未反応の抗HbA1c抗体とを分離し、必要に応じて洗浄を行ってもよい。次いで固相化試料に結合した抗HbA1c抗体、または、未反応の抗HbA1c抗体を検出し、試料中のHbA1c量を求めればよい。この時、抗HbA1c抗体がラベル化されている場合は、抗HbA1c抗体上のラベルによって検出すればよく、また抗HbA1c抗体がラベル化されていない場合は、第2抗体のラベルを検出すればよい。検出にはラベルにあった方法が適宜採用できる。
【0019】
本発明の測定法を実施するには、反応に使用する物をキット化することが好ましい。このキットは固相及び抗HbA1c抗体から成り、HbA1cの1ステップ免疫測定に用いられる。
【0020】
【発明の効果】
本発明により、HbA1cの1ステップ免疫測定が可能となった。これにより従来法の2段階によるHbA1cの測定に比べて、測定に要する時間が短縮化できる。このため、免疫反応を実施する際に、反応系に共存する前処理液との接触時間が短縮されるため、試料中に沈殿が生成するのを低減でき、また、酵素ラベル化抗HbA1c抗体を用いた場合には、前処理液による酵素の失活を低減する事ができる。さらに、反応した抗HbA1c抗体と未反応の抗HbA1c抗体との分離操作が1回で済むため、固相化されたヘモグロビンの脱落の恐れが少なくなった。
【0021】
更に本発明により、患者を問診する前に患者から採血しておけば、問診までに最新のA1c測定値を求めることが可能となり、また問診中に採血したとしても患者を待たせる事なく結果を入手できる。
【0022】
本方法と市販の自動免疫診断装置を組みあわせて用いれば、最初の溶血操作以外は全く自動で結果を得ることができる。また、反応途中に洗浄などの操作が必要ないことから、測定時間の短縮化が可能であり、診断効率の飛躍的な向上が可能である。
【0023】
さらに市販の全自動免疫診断装置にて測定が可能であるため、他の糖尿病のマーカー、例えばインスリンやC−ペプチドなどの検査を同時に行なうことができ、簡単に多くの情報を一度に得ることができる。
【0024】
【実施例】
実施例1 HbA1c測定法の確立と検量線の作成。
【0025】
アルカリ性ホスファターゼ標識抗HbA1c抗体は以下のように作製した。すなわち、抗HbA1cマウスモノクローナル抗体(ダコ社製)2mgと市販のウシ小腸由来アルカリ性ホスファターゼ(バイオザイム社製)2mgを用い、これをS−S結合により結合させた後、ゲル濾過(カラム:G3000SW、東ソー(株)製;溶出:150mM NaClを含む50mMリン酸緩衝液(pH7))を行なって精製した(石川栄治ら編集、酵素免疫測定法第3版、医学書院、117頁〜参照)。次に5%ウシ血清アルブミン、10mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、及び0.1%NaN3を含む0.1Mトリス緩衝液(pH8.0)に、調製したアルカリ性ホスファターゼ標識抗HbA1c抗体を1.5mA(1mAは280nmにおける吸光度が0.001)になるように加えた。この反応液100μlをカップに注入し、さらにポリスチレンビーズ(直径1.4〜1.6mm)12個を加えた。
【0026】
標準品は、6種のHbA1c濃度の患者の血液より血球成分を分離し洗浄した後、精製水を用いて溶血し、これを凍結乾燥したものを作製し、これを精製水を用いて再溶解後市販のグリコヘモグロビン分析計(HLC−723GHbIII型、東ソー(株)製)にて濃度決定を行なったものを使用した。この再溶解後の標準品20μlを、0.1%tritonX−100及び0.1%NaN3を含む0.1Mコハク酸緩衝液(pH5.0)580μlに加えて撹拌後さらに室温で30分放置して抗原溶液とした。
【0027】
上記の標識抗体を含む反応液及びビーズを入れたカップに、抗原溶液10μlを加えて、市販の全自動免疫装置(AIA−1200、東ソー(株)製)を用いて1ステップ免疫測定を行なった。即ち、37℃で40分間反応後、酵素標識抗HbA1c抗体と抗原HbA1cとからなる抗原抗体複合物の吸着したビーズを洗浄し、アルカリ性ホスファターゼの基質である4−メチルウンベリフェロンりん酸(4MUP)を0.26mg/mlの濃度で含有する基質溶液(pH10)220μlを添加し、4−メチルウンベリフェロン(4MU)の生成速度を、励起波長362nm、測定波長447nmにおいて測定した。なお、4MUPはアルカリ性ホスファターゼの作用により4MUに変化し、蛍光を発する。
【0028】
結果を図1に示す。横軸が標準品の濃度(グリコヘモグロビン分析計にて決定したもの)、縦軸が標識として用いたアルカリ性ホスファターゼによる基質分解速度を示す。HbA1c濃度(%)に依存して基質分解物である4−メチルウンベリフェロン(4MU)の生成速度が増加しており、標準曲線の作成が可能となった。
【0029】
実施例2 従来法(HPLC法)との相関。
【0030】
健常人及び糖尿病患者よりEDTA採血により採取した全血検体は、この20μlを0.1%tritonX−100及び0.1%NaN3を含む0.1Mコハク酸緩衝液(pH5.0)580μlに加えて撹拌後、さらに室温で30分放置して完全に溶血前処理を行ない抗原溶液として供した。患者全血検体中のHbA1c濃度については、あらかじめHPLC法である市販のグリコヘモグロビン分析計(HLC−723GHbIII型、東ソー(株)製)にて決定した。実施例1に従ってAIA−1200上で1ステップ測定を行ない、HbA1c濃度を決定した。
【0031】
結果を図2に示す。患者検体50例についての測定結果であり、横軸はHPLC法により決定されたHbA1c濃度(%)を、縦軸は本発明方法により決定された濃度を示す。両者の間には、相関式y=1.63+0.69x、相関係数r=0.907と良好な相関を認め、本方法と従来法(HPLC法)の挙動は一致することが示された。
【0032】
実施例3 同時再現性及び測定間再現性。
【0033】
前述の1ステップ免疫測定法による同時再現性を4種の異なる濃度のHbA1cを含む患者検体を用いて評価した。結果を表1に示す。
【0034】
【表1】
【0035】
どの濃度域においても同時再現性は3.5〜4.3%であり良好であった。また2種の濃度の検体を用いて測定間再現性を検討したところ、表2に示すように4%以下の良好な結果を得た。
【0036】
【表2】
【0037】
実施例4 10分測定系の構築。
【0038】
実施例1〜3の1ステップ免疫測定法は、いずれも40分のインキュベーションを行なっているが、検体処理効率を高めるために、インキュベーションを10分間に短縮した1ステップ免疫測定系を構築した。すなわち、実施例1におけるアルカリ性ホスファターゼ標識抗HbA1c抗体を5mAになるように加えた反応液を用いて免疫測定を行った。本方法における検量線を図3に示す。横軸が標準品の濃度(グリコヘモグロビン分析計にて決定したもの)、縦軸が標識として用いたアルカリ性ホスファターゼによる基質分解速度を示す。また、実施例2に従って、患者検体を用いて従来法と10分測定系の相関を検討した結果を図4に示す。患者検体50例についての測定結果であり、横軸は従来法(HLC−723GHbIII型)による測定結果、縦軸は本発明方法による測定結果を示す。HPLC法との相関は回帰式y=0.579x+1.125、回帰係数r=0.933と良好な相関が得られた。
【0039】
また、実施例3に示した40分測定系と同様に10分測定系における同時再現性を検討した結果を表3に、測定間再現性を検討した結果を表4に示す。
【0040】
【表3】
【0041】
【表4】
【0042】
同時再現性2.7〜4.0%、測定間再現性4%以下と良好な結果を示した。実施例2に示す40分系と本実施例に示す10分系の相関はy=0.493+0.721x、r=0.921と良好であった。
【0043】
実施例5 異常ヘモグロビンとの反応性。
【0044】
入手した異常ヘモグロビン6種(UBE2、HAMADEN、TAKAMATSU、CAPETOWN、RIYADH、及びHIKARI。UBE2及びCAPE TOWNはα鎖変異体、他はβ鎖変異体。)につき実施例1に記載の本発明の方法でHbA1c濃度測定を試みた。結果を表5に示す。
【0045】
【表5】
【0046】
変異ヘモグロビンは本方法においてはほとんど認識されないことが示されており、本方法は正常HbA1cのみに特異的であり、異常ヘモグロビンの影響はほとんど受けないことが示された。
【0047】
実施例6 前処理液の比較
健常人よりEDTA採血により採取した全血検体20μlに、前処理液Aとして0.1%tritonX−100及び0.1%NaN3を含む0.1Mコハク酸緩衝液(pH5.03)、または、前処理液Bとして0.1%tritonX−100及び0.1%NaN3を含む蒸留水(pH7.15)を580μl加えて撹拌後、さらに室温で30分放置して溶血前処理を行い抗原溶液とした。これを実施例4と同様にAIA−1200上で1ステップ測定を行い、HbA1c濃度を測定した。結果を表6に示す。
【0048】
【表6】
【0049】
表6から明らかなように、弱酸性条件下の前処理を行ったほうが1ステップ測定において高い測定値が得られた。
【0050】
なお全血検体中のHbA1c濃度については、グリコヘモグロビン分析計(HLC−723GHbIII型、東ソー(株)製)にて5.4%と測定された。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1で行った1ステップ免疫反応を用いた測定系における標準曲線を示す図である。
【図2】実施例2で行った1ステップ免疫測定方法と従来法との相関を示す図である。
【図3】実施例4で行ったインキュベーションを10分に短縮した1ステップ免疫測定系における標準曲線を示す図である。
【図4】実施例4で行ったインキュベーションを10分に短縮した1ステップ免疫測定系と従来法との相関を示す図である。
Claims (6)
- 試料を、固相及び抗ヘモグロビンA1c抗体に同時に接触させ、反応により生成した固相化試料に結合した抗ヘモグロビンA1c抗体と、未反応の抗ヘモグロビンA1c抗体とを分離し、固相化試料に結合した抗ヘモグロビンA1c抗体または未反応の抗ヘモグロビンA1c抗体を検出することを特徴とするヘモグロビンA1cの測定法。
- 請求項1に記載の測定法において、試料の前処理を弱酸性条件下で行うことを特徴とする測定法。
- 請求項2に記載の測定法において、弱酸性条件下がpH3.0〜6.9であることを特徴とする測定法。
- 請求項2または3に記載の測定法において、試料の前処理に脂肪族カルボン酸緩衝液又は硼酸緩衝液を用いることを特徴とする測定法。
- 請求項4に記載の測定法において、脂肪族カルボン酸緩衝液が、コハク酸緩衝液、マロン酸緩衝液、フマル酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、グルタル酸緩衝液又は酢酸緩衝液であることを特徴とする測定法。
- 固相及び抗ヘモグロビンA1c抗体とから成る、請求項1〜5いずれかに記載のヘモグロビンA1c測定法用キット。
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