JP3395673B2 - 微小酸素電極を利用した特異的結合対測定方法 - Google Patents
微小酸素電極を利用した特異的結合対測定方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗原／抗体、受容
体／リガンド等の特異的結合対の構成員間の特異的結合
反応を利用した、簡易、迅速且つ安価な測定方法及びそ
のための装置に関する。
体／リガンド等の特異的結合対の構成員間の特異的結合
反応を利用した、簡易、迅速且つ安価な測定方法及びそ
のための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗原／抗体、受容体／リガンド等の特異
的に結合する構成員の対（特異的結合対と称する）を構
成する各構成員、すなわち抗原、抗体、受容体、該受容
体に対するリガンド等を測定する方法として種々の方法
が知られている。いずれの方法も、特異的結合対の一方
の構成員を被験物質として測定する方法において、該被
験物質の存否や量を、該特異的結合対の構成員間の特異
的結合を介して、標識の結合量に反映させ、そして結合
した標識又は未結合の標識の存否又は量を測定すること
により前記被験物質の存否又は量を決定する点において
共通である。
的に結合する構成員の対（特異的結合対と称する）を構
成する各構成員、すなわち抗原、抗体、受容体、該受容
体に対するリガンド等を測定する方法として種々の方法
が知られている。いずれの方法も、特異的結合対の一方
の構成員を被験物質として測定する方法において、該被
験物質の存否や量を、該特異的結合対の構成員間の特異
的結合を介して、標識の結合量に反映させ、そして結合
した標識又は未結合の標識の存否又は量を測定すること
により前記被験物質の存否又は量を決定する点において
共通である。
【０００３】この際に使用される標識としては、酵素標
識、蛍光等の化学発光体標識、放射能標識等種々の標識
が使用されており、酵素標識の１種として酸化還元酵
素、例えばグルコースオキシダーゼを使用し、酸化還元
反応を発色や酸素電極により検出又は測定する方法が知
られている。特開平５−７２１７３号公報には、抗原−
抗体反応の反応液を電極と接触せしめ、該反応液を撹拌
しながら検出を行う方法が記載されている。しかしなが
ら、この方法においては、多量の反応液が必要であり、
検出に当ってはそれを撹拌なければならず、測定操作が
複雑であり、測定に時間がかかり、且つ家庭用ディスポ
ーサブル装置により、簡便、安価に且つ迅速に測定を行
うことができない、等の問題点を有する。
識、蛍光等の化学発光体標識、放射能標識等種々の標識
が使用されており、酵素標識の１種として酸化還元酵
素、例えばグルコースオキシダーゼを使用し、酸化還元
反応を発色や酸素電極により検出又は測定する方法が知
られている。特開平５−７２１７３号公報には、抗原−
抗体反応の反応液を電極と接触せしめ、該反応液を撹拌
しながら検出を行う方法が記載されている。しかしなが
ら、この方法においては、多量の反応液が必要であり、
検出に当ってはそれを撹拌なければならず、測定操作が
複雑であり、測定に時間がかかり、且つ家庭用ディスポ
ーサブル装置により、簡便、安価に且つ迅速に測定を行
うことができない、等の問題点を有する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、例え
ば種々の病気の診断の目安となる尿、唾液等の体液中の
物質を、簡便、迅速且つ安価に、家庭においても検出・
測定できるような方法、及び該方法に使用する装置、例
えばディスポーサブルな装置を提供しようとするもので
ある。
ば種々の病気の診断の目安となる尿、唾液等の体液中の
物質を、簡便、迅速且つ安価に、家庭においても検出・
測定できるような方法、及び該方法に使用する装置、例
えばディスポーサブルな装置を提供しようとするもので
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、本発明は、特異的結合対の一構成員を特異的結合反
応と酸化還元反応とにより測定する方法において、酸化
還元触媒により標識された特異的結合対の一構成員又は
それに対して特異的に結合する物質と、該触媒の基質と
を酸素電極の感知表面に接触した多孔性支持体で反応せ
しめ、前記一構成員を検出又は測定する方法を提供す
る。ここで好ましい態様においては、前記多孔性支持体
が反応液を含んでおり、該反応液と接触する酸素電極の
表面種が１mm2 以下であり、且つ該酸素電極上の反応溶
液の厚さが０．１mm〜５mmである。
め、本発明は、特異的結合対の一構成員を特異的結合反
応と酸化還元反応とにより測定する方法において、酸化
還元触媒により標識された特異的結合対の一構成員又は
それに対して特異的に結合する物質と、該触媒の基質と
を酸素電極の感知表面に接触した多孔性支持体で反応せ
しめ、前記一構成員を検出又は測定する方法を提供す
る。ここで好ましい態様においては、前記多孔性支持体
が反応液を含んでおり、該反応液と接触する酸素電極の
表面種が１mm2 以下であり、且つ該酸素電極上の反応溶
液の厚さが０．１mm〜５mmである。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明において、「特異的結合
対」とは、抗原と抗体、受容体とそれに対するリガンド
等、相互に特異的に結合する一対を意味する。また、特
異的結合対の「構成員」とは、前記の特異的結合対を構
成する各要素を意味し、例えば特異的結合対が抗原／抗
体対である場合、その構成員は「抗原」又は「抗体」で
あり、特異的結合対が受容体／リガンド対である場合に
は、その構成員は「受容体」又は「リガンド」である。
対」とは、抗原と抗体、受容体とそれに対するリガンド
等、相互に特異的に結合する一対を意味する。また、特
異的結合対の「構成員」とは、前記の特異的結合対を構
成する各要素を意味し、例えば特異的結合対が抗原／抗
体対である場合、その構成員は「抗原」又は「抗体」で
あり、特異的結合対が受容体／リガンド対である場合に
は、その構成員は「受容体」又は「リガンド」である。
【０００７】本発明においては、いかなる抗原、又はそ
れに対する抗体であっても測定の対象とすることができ
るが、特に興味ある測定対象は、尿、唾液、血液、血液
成分、例えば血清、血漿等、に含まれる抗原又は抗体で
あって、ある種の疾患の存在を示す成分であり、例えば
糖尿病性腎症の初期マーカーとして有用な尿中アルブミ
ンである。
れに対する抗体であっても測定の対象とすることができ
るが、特に興味ある測定対象は、尿、唾液、血液、血液
成分、例えば血清、血漿等、に含まれる抗原又は抗体で
あって、ある種の疾患の存在を示す成分であり、例えば
糖尿病性腎症の初期マーカーとして有用な尿中アルブミ
ンである。
【０００８】本発明は、一般的な意味において、特異的
結合対の一構成員を特異的結合反応と酸化還元反応とに
より測定する方法において、酸化還元触媒により標識さ
れた特異的結合対の一構成員又は該構成員と特異的に結
合する物質と、該触媒の基質とを、酸素電極の感知表面
に接触した反応液中で反応せしめ、ここで該反応液と接
触する該酸素電極の表面が好ましくは１mm2 以下であ
り、且つ該酸素電極上の反応液の厚さが好ましくは０．
１mm〜５mmであり、さらに好適には０．１mm〜１mmであ
ることを特徴とする方法、並びにこの方法の実施のため
の装置に関する。
結合対の一構成員を特異的結合反応と酸化還元反応とに
より測定する方法において、酸化還元触媒により標識さ
れた特異的結合対の一構成員又は該構成員と特異的に結
合する物質と、該触媒の基質とを、酸素電極の感知表面
に接触した反応液中で反応せしめ、ここで該反応液と接
触する該酸素電極の表面が好ましくは１mm2 以下であ
り、且つ該酸素電極上の反応液の厚さが好ましくは０．
１mm〜５mmであり、さらに好適には０．１mm〜１mmであ
ることを特徴とする方法、並びにこの方法の実施のため
の装置に関する。
【０００９】免疫反応を利用した抗原の測定において、
酸化還元電極を使用する方法は、特開平５−７２１７３
号公報に記載されている。この方法においては、反応液
を密閉容器に収容し、撹拌しながら該反応液を電極の表
面に接触せしめる。この方法においては、複雑で高価な
装置を要し、分析操作は容易ではなく、家庭において簡
便に測定を行うことができない。本発明によれば、検知
表面が１mm2 以下という、非常に小形の酸素電極を用い
ることにより、人工的な撹拌を必要としないで、標識さ
れた分子の自然の（熱力学的）拡散により極めて迅速に
測定を行うことができる。なお、酸素電極の検知表面は
１mm2 以下である必要があるが、好ましくは０．５mm2
以下であり、さらに好ましくは０．２mm2 以下、例えば
０．２mm 2 である。
酸化還元電極を使用する方法は、特開平５−７２１７３
号公報に記載されている。この方法においては、反応液
を密閉容器に収容し、撹拌しながら該反応液を電極の表
面に接触せしめる。この方法においては、複雑で高価な
装置を要し、分析操作は容易ではなく、家庭において簡
便に測定を行うことができない。本発明によれば、検知
表面が１mm2 以下という、非常に小形の酸素電極を用い
ることにより、人工的な撹拌を必要としないで、標識さ
れた分子の自然の（熱力学的）拡散により極めて迅速に
測定を行うことができる。なお、酸素電極の検知表面は
１mm2 以下である必要があるが、好ましくは０．５mm2
以下であり、さらに好ましくは０．２mm2 以下、例えば
０．２mm 2 である。
【００１０】酸化還元触媒により標識された反応成分を
含有する溶液（基質を含有しない）を酸素電極の感知表
面に接触させると、空気中の酸素と平衡した溶液中の酸
素により酸素電極は一定のベースライン電流を出力する
が、それに基質を添加すると酸化反応が生じて溶液中の
酸素が消費されるため溶液中の酸素濃度が低下し、その
結果が酸素電極からの電流の増加として出力される。こ
の場合、電流の変化の初速度、又は基質添加により反応
が開始して一定時間後の電流値を測定することにより、
酸化還元触媒標識の濃度を知ることができるが、上記電
流変化の初速度を測定するには、電流の変化を０．５〜
２分間、例えば約１分間にわたって測定すればよい。ま
た、一定の時間後に電流値を測定する場合には、反応開
始後３〜５分間の間に測定を行えばよい。
含有する溶液（基質を含有しない）を酸素電極の感知表
面に接触させると、空気中の酸素と平衡した溶液中の酸
素により酸素電極は一定のベースライン電流を出力する
が、それに基質を添加すると酸化反応が生じて溶液中の
酸素が消費されるため溶液中の酸素濃度が低下し、その
結果が酸素電極からの電流の増加として出力される。こ
の場合、電流の変化の初速度、又は基質添加により反応
が開始して一定時間後の電流値を測定することにより、
酸化還元触媒標識の濃度を知ることができるが、上記電
流変化の初速度を測定するには、電流の変化を０．５〜
２分間、例えば約１分間にわたって測定すればよい。ま
た、一定の時間後に電流値を測定する場合には、反応開
始後３〜５分間の間に測定を行えばよい。
【００１１】この様に非常に短時間に測定可能であるた
め、測定中の空気からの酸素の侵入による影響はほとん
どないので、開放系において測定を行うことができる。
すなわち、一般に、基質の酸化により反応液中の酸素が
消費されると、溶液中に空気中の酸素が溶解するため、
反応による酸素濃度の低下が打ち消される結果になり、
長時間の測定においては、この酸素の侵入を防止するた
め反応を密閉系で行う必要がある。しかしながら、本発
明のように短時間で測定が行われる場合には、溶液中で
の反応による酸素の消費速度に比べて空気からの酸素の
溶解速度の方ははるかに低いので、酸化還元反応を開放
系において行うことができる。
め、測定中の空気からの酸素の侵入による影響はほとん
どないので、開放系において測定を行うことができる。
すなわち、一般に、基質の酸化により反応液中の酸素が
消費されると、溶液中に空気中の酸素が溶解するため、
反応による酸素濃度の低下が打ち消される結果になり、
長時間の測定においては、この酸素の侵入を防止するた
め反応を密閉系で行う必要がある。しかしながら、本発
明のように短時間で測定が行われる場合には、溶液中で
の反応による酸素の消費速度に比べて空気からの酸素の
溶解速度の方ははるかに低いので、酸化還元反応を開放
系において行うことができる。
【００１２】すなわち、酸化還元触媒とその基質との反
応は、例えば酸素電極の感知表面に接する多孔性支持体
中に含まれる反応液中で行うことができ、該反応液は密
閉する必要がなく、この多孔性支持体としては、免疫測
定の方法において常用されているフィルター、例えばセ
ルロース製濾紙、セルロース誘導体フィルター、ガラス
繊維フィルター、ポリアミドフィルター、ポリスルホン
フィルター、ポリプロピレンフィルター、ポリ塩化ビニ
ルフィルター、多孔性セラミック、カーボンファイバ
ー、金属ウールなどを使用することができる。
応は、例えば酸素電極の感知表面に接する多孔性支持体
中に含まれる反応液中で行うことができ、該反応液は密
閉する必要がなく、この多孔性支持体としては、免疫測
定の方法において常用されているフィルター、例えばセ
ルロース製濾紙、セルロース誘導体フィルター、ガラス
繊維フィルター、ポリアミドフィルター、ポリスルホン
フィルター、ポリプロピレンフィルター、ポリ塩化ビニ
ルフィルター、多孔性セラミック、カーボンファイバ
ー、金属ウールなどを使用することができる。
【００１３】なお、酸素電極に接する反応溶液の厚さが
薄すぎると、空気中から侵入する酸素の影響が生ずるの
で、反応液の厚さは０．１mm以上である必要があり、ま
たあまり厚くしても特別の効果は生じない。従って反応
液の厚さは０．１mm〜５mmであり、実用的に便利なのは
０．１〜１mmである。従って、上記の多孔性支持体とし
ては、０．１〜１mmの厚さの濾紙などが特に好ましい。
薄すぎると、空気中から侵入する酸素の影響が生ずるの
で、反応液の厚さは０．１mm以上である必要があり、ま
たあまり厚くしても特別の効果は生じない。従って反応
液の厚さは０．１mm〜５mmであり、実用的に便利なのは
０．１〜１mmである。従って、上記の多孔性支持体とし
ては、０．１〜１mmの厚さの濾紙などが特に好ましい。
【００１４】本発明の酸化還元触媒としては、酸化還元
酸素、及び金属触媒が挙げられ、酸化還元酵素が特に好
ましい。酵素、及びそのための基質（カット内）として
は、例えばグルコースオキシダーゼ（グルコース）、キ
サンチンオキシダーゼ（キサチン）、アミノ酸オキシダ
ーゼ（アミノ酸）、アスコルビン酸オキシダーゼ（アス
コルビン酸）、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（アシルＣ
ｏＡ）、コレステロールオキシダーゼ（コレステロー
ル）、ガラクトースオキシダーゼ（ガラクトース）、シ
ュウ酸オキシダーゼ（シュウ酸）、ザルコシンオキシダ
ーゼ（ザルコシン）等が挙げられる。
酸素、及び金属触媒が挙げられ、酸化還元酵素が特に好
ましい。酵素、及びそのための基質（カット内）として
は、例えばグルコースオキシダーゼ（グルコース）、キ
サンチンオキシダーゼ（キサチン）、アミノ酸オキシダ
ーゼ（アミノ酸）、アスコルビン酸オキシダーゼ（アス
コルビン酸）、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（アシルＣ
ｏＡ）、コレステロールオキシダーゼ（コレステロー
ル）、ガラクトースオキシダーゼ（ガラクトース）、シ
ュウ酸オキシダーゼ（シュウ酸）、ザルコシンオキシダ
ーゼ（ザルコシン）等が挙げられる。
【００１５】金属触媒としては、白金、金、酸化チタン
等が挙げられ、例えば酸化チタン（ＴｉＯ2 ）の場合、
アルデヒド等の有機基質の存在下で光を照射することに
より酸化反応を生じさせることができる。本発明は、抗
原／抗体反応等、特異的結合対が関与する種々の測定系
において使用することができる。
等が挙げられ、例えば酸化チタン（ＴｉＯ2 ）の場合、
アルデヒド等の有機基質の存在下で光を照射することに
より酸化反応を生じさせることができる。本発明は、抗
原／抗体反応等、特異的結合対が関与する種々の測定系
において使用することができる。
【００１６】１つの態様によれば、（１）被験物質であ
る特異的結合対の一方の構成員を含有すると予想される
試料溶液と、該特異的結合対の他方の構成員であって酸
化還元触媒により標識されたものとを溶液中で接触せし
め、これによって該特異的結合対の両構成員を結合せし
め、（２）前記工程（１）からの溶液を、前記標識され
た構成員と特異的に結合することができる物質を固定化
した部材と接触せしめることにより、工程（１）におい
て反応しなかった、標識された特異的結合対の構成員を
固定化除去し、そして（３）前記工程（２）からの、特
異的結合対の一方の構成員である被験物質と、該特異的
結合対の他方の構成員であって標識されたものとの結合
物を含有する反応液を、酸素電極の感知表面に接触せし
める、工程を含んで成る方法である。
る特異的結合対の一方の構成員を含有すると予想される
試料溶液と、該特異的結合対の他方の構成員であって酸
化還元触媒により標識されたものとを溶液中で接触せし
め、これによって該特異的結合対の両構成員を結合せし
め、（２）前記工程（１）からの溶液を、前記標識され
た構成員と特異的に結合することができる物質を固定化
した部材と接触せしめることにより、工程（１）におい
て反応しなかった、標識された特異的結合対の構成員を
固定化除去し、そして（３）前記工程（２）からの、特
異的結合対の一方の構成員である被験物質と、該特異的
結合対の他方の構成員であって標識されたものとの結合
物を含有する反応液を、酸素電極の感知表面に接触せし
める、工程を含んで成る方法である。
【００１７】この方法の実施のための装置としては、例
えば、図１において、（イ）被験物質である特異的結合
対の一方の構成員とは異る他方の構成員であり酸化還元
触媒により標識されているものを収容する部材１であっ
て、その一部に試料添加部位４を有するもの、（ロ）前
記（イ）における標識された構成員と特異的に結合する
ことができる物質が固定された部材２、及び（ハ）前記
酸化還元触媒のための基質を収容し、且つ１mm2 以下の
感知表面を有する酸素電極に接している部材３、を有
し、前記部材（イ）の試料添加部位と前記部材（ハ）の
酸素電極接触部とが部材（ロ）を介して毛細管作用によ
り流体連結されていることを特徴とする装置が使用され
る。
えば、図１において、（イ）被験物質である特異的結合
対の一方の構成員とは異る他方の構成員であり酸化還元
触媒により標識されているものを収容する部材１であっ
て、その一部に試料添加部位４を有するもの、（ロ）前
記（イ）における標識された構成員と特異的に結合する
ことができる物質が固定された部材２、及び（ハ）前記
酸化還元触媒のための基質を収容し、且つ１mm2 以下の
感知表面を有する酸素電極に接している部材３、を有
し、前記部材（イ）の試料添加部位と前記部材（ハ）の
酸素電極接触部とが部材（ロ）を介して毛細管作用によ
り流体連結されていることを特徴とする装置が使用され
る。
【００１８】前記の方法及び装置において、「標識され
た構成員と特異的に結合することができる物質」とは、
最も端適には被験物質と同一の物質である。しかしなが
ら、例えば被験物質が体液中に存在する糖蛋白質である
場合、前記「特異的に結合することができる物質」と
は、遺伝子工学的に調製したグリコシル化されていない
蛋白質や、該蛋白質の断片や、アミノ酸配列が修飾され
た蛋白質等でもよい。但し、被験物質である抗原に対す
る抗体と結合することができるものでなければならな
い。
た構成員と特異的に結合することができる物質」とは、
最も端適には被験物質と同一の物質である。しかしなが
ら、例えば被験物質が体液中に存在する糖蛋白質である
場合、前記「特異的に結合することができる物質」と
は、遺伝子工学的に調製したグリコシル化されていない
蛋白質や、該蛋白質の断片や、アミノ酸配列が修飾され
た蛋白質等でもよい。但し、被験物質である抗原に対す
る抗体と結合することができるものでなければならな
い。
【００１９】上記の方法において、１例として、被験物
である特異的結合対の一方の構成員を抗原とし、特異的
結合対の他方の構成員を前記被験物質（抗原）に対する
抗体とし、標識された構成員（抗体）に特異的に結合す
ることができる物質を抗原とし、前記酸化還元触媒をグ
ルコースオキシダーゼとして、前記装置を図１に模式的
に示しながら説明する。
である特異的結合対の一方の構成員を抗原とし、特異的
結合対の他方の構成員を前記被験物質（抗原）に対する
抗体とし、標識された構成員（抗体）に特異的に結合す
ることができる物質を抗原とし、前記酸化還元触媒をグ
ルコースオキシダーゼとして、前記装置を図１に模式的
に示しながら説明する。
【００２０】図１において、１は前記の装置における部
材（イ）であり、その部分に試料添加部位４が設けられ
ている。これには、特異的結合対の他方の構成員である
抗体であってグルコースオキシダーゼにより標識された
ものが収容されている。２は前記装置における部材
（ロ）であって、これには前記抗体と特異的に結合する
ことができる物質、例えば抗原が固定化されている。３
は前記装置における部材（ハ）であって、グルコースオ
キシダーゼのための基質であるグルコースが収容されて
おり、且つ１mm2 以下の感知表面を有する酸素電極５と
接している。
材（イ）であり、その部分に試料添加部位４が設けられ
ている。これには、特異的結合対の他方の構成員である
抗体であってグルコースオキシダーゼにより標識された
ものが収容されている。２は前記装置における部材
（ロ）であって、これには前記抗体と特異的に結合する
ことができる物質、例えば抗原が固定化されている。３
は前記装置における部材（ハ）であって、グルコースオ
キシダーゼのための基質であるグルコースが収容されて
おり、且つ１mm2 以下の感知表面を有する酸素電極５と
接している。
【００２１】今、被験物質である抗原を含有する試料溶
液を試料添加部位４に添加すれば、該試料溶液は毛細管
作用により部材（イ）１中に拡散し、その中に収容され
ている、グルコースオキシダーゼ標識された抗体と接触
し、抗原と抗体が結合して、抗原／抗体複合体が生成す
る。なお、部材（イ）１にはグルコースオキシダーゼに
より標識された抗体が過剰量収容されているので、被験
抗原が定量的にグルコースオキシダーゼ標識抗体と結合
した後、未反応のグルコースオキシダーゼ標識抗体が残
る。
液を試料添加部位４に添加すれば、該試料溶液は毛細管
作用により部材（イ）１中に拡散し、その中に収容され
ている、グルコースオキシダーゼ標識された抗体と接触
し、抗原と抗体が結合して、抗原／抗体複合体が生成す
る。なお、部材（イ）１にはグルコースオキシダーゼに
より標識された抗体が過剰量収容されているので、被験
抗原が定量的にグルコースオキシダーゼ標識抗体と結合
した後、未反応のグルコースオキシダーゼ標識抗体が残
る。
【００２２】部材（イ）１において反応した反応溶液
は、毛細管作用によりさらに部材（ロ）２に移送され
る。なお、試料溶液の容量が、装置全体に行きわたるに
は少なすぎる場合には、試料溶液を添加した後、適当な
水性媒体、例えば緩衝液を試料添加部位４から追加注入
することにより反応物質の移送を助けることができる。
部材（ロ）２には抗原が固定化されているので、部材
（イ）１において未反応であったグルコースオキシダー
ゼ標識された抗体は、この固定化された抗原と結合し、
捕捉される。従って、被験物質抗原と、グルコースオキ
シダーゼ標識された抗体との複合体のみが部材（ハ）３
に移行する。
は、毛細管作用によりさらに部材（ロ）２に移送され
る。なお、試料溶液の容量が、装置全体に行きわたるに
は少なすぎる場合には、試料溶液を添加した後、適当な
水性媒体、例えば緩衝液を試料添加部位４から追加注入
することにより反応物質の移送を助けることができる。
部材（ロ）２には抗原が固定化されているので、部材
（イ）１において未反応であったグルコースオキシダー
ゼ標識された抗体は、この固定化された抗原と結合し、
捕捉される。従って、被験物質抗原と、グルコースオキ
シダーゼ標識された抗体との複合体のみが部材（ハ）３
に移行する。
【００２３】次に、前記複合体のグルコースオキシダー
ゼは部材（ハ）３に収容されているグルコースを酸化
し、その結果として部材（ハ）３中の溶液中の酸素濃度
が低下し、この酸素濃度の変化が酸素電極５によって検
出・測定される。
ゼは部材（ハ）３に収容されているグルコースを酸化
し、その結果として部材（ハ）３中の溶液中の酸素濃度
が低下し、この酸素濃度の変化が酸素電極５によって検
出・測定される。
【００２４】本発明の他の態様によれば、（１）被験物
質である特異的結合対の一方の構成員と、該特異的結合
対の他方の構成員であって酸化還元触媒により標識され
たもの（標識された構成員）とを溶液中で接触せしめ
て、該特異的結合対の両構成員を結合せしめ、（２）前
記工程（１）からの溶液を、前記被験物質に特異的に結
合する物質（固定化された特異的結合物質）が固定化さ
れている部材であって酸素電極の感知表面に接触してい
るもの、に供給することにより、前記工程（１）におけ
る被験物質と結合した前記標識された構成員とを、前記
固定化された特異的結合物質を介して前記部材に固定せ
しめ、（３）前記工程（１）において被験物質と結合し
なかった前記標識された構成員を、前記工程（２）にお
ける酸素電極の感知表面に接する前記部材から除去し、
そして（４）前記工程（２）において酸素電極の感知表
面に接する部材に固定された標識された構成員に、前記
酸化還元触媒の基質を接触せしめる、ことを特徴とする
方法が提供される。
質である特異的結合対の一方の構成員と、該特異的結合
対の他方の構成員であって酸化還元触媒により標識され
たもの（標識された構成員）とを溶液中で接触せしめ
て、該特異的結合対の両構成員を結合せしめ、（２）前
記工程（１）からの溶液を、前記被験物質に特異的に結
合する物質（固定化された特異的結合物質）が固定化さ
れている部材であって酸素電極の感知表面に接触してい
るもの、に供給することにより、前記工程（１）におけ
る被験物質と結合した前記標識された構成員とを、前記
固定化された特異的結合物質を介して前記部材に固定せ
しめ、（３）前記工程（１）において被験物質と結合し
なかった前記標識された構成員を、前記工程（２）にお
ける酸素電極の感知表面に接する前記部材から除去し、
そして（４）前記工程（２）において酸素電極の感知表
面に接する部材に固定された標識された構成員に、前記
酸化還元触媒の基質を接触せしめる、ことを特徴とする
方法が提供される。
【００２５】上記の方法は、例えば、（イ）被験物質で
ある特異的結合対の一方の構成員ではない他方の構成員
であって酸化還元触媒により標識されているものを収容
しており、その一部分に試料添加部位を有する部材、
（ロ）前記被験物質に特異的に結合する物質（固定化さ
れた特異的結合物質）が固定化されている部材であって
１mm2 以下の感知面積を有する酸素電極に接しているも
の、及び（ハ）液体吸収部材を有し、前記部材（イ）の
試料添加部位と前記液体吸収部材（ハ）とが、前記部材
（ロ）を介して毛管作用により流体連絡されていること
を特徴とする装置により実施することができる。
ある特異的結合対の一方の構成員ではない他方の構成員
であって酸化還元触媒により標識されているものを収容
しており、その一部分に試料添加部位を有する部材、
（ロ）前記被験物質に特異的に結合する物質（固定化さ
れた特異的結合物質）が固定化されている部材であって
１mm2 以下の感知面積を有する酸素電極に接しているも
の、及び（ハ）液体吸収部材を有し、前記部材（イ）の
試料添加部位と前記液体吸収部材（ハ）とが、前記部材
（ロ）を介して毛管作用により流体連絡されていること
を特徴とする装置により実施することができる。
【００２６】上記の方法及び装置において、被験物質に
特異的に結合する物質（固定化された特異的結合物質）
は、このような特性を有するものであれば特に限定され
ないが、被験物質が抗原である場合、該被験物質抗原に
対する、標識された抗体とは異る第二の抗体であること
ができる。例えば、一方がモノクローナル抗体であっ
て、他方がポリクローナル抗体であってもよく、またエ
ピトープを異にする２種類のモノクローナル抗体であっ
てもよい。
特異的に結合する物質（固定化された特異的結合物質）
は、このような特性を有するものであれば特に限定され
ないが、被験物質が抗原である場合、該被験物質抗原に
対する、標識された抗体とは異る第二の抗体であること
ができる。例えば、一方がモノクローナル抗体であっ
て、他方がポリクローナル抗体であってもよく、またエ
ピトープを異にする２種類のモノクローナル抗体であっ
てもよい。
【００２７】この態様を、被験物質である特異的結合対
の一方の構成員を抗原とし、他方の構成員を抗体とし、
酸化還元触媒をグルコースオキシダーゼとし、該酸化還
元酵素の基質をグルコースとして、上記の装置を模式的
に示す図２に言及しながら説明する。図２において、１
１は部材（イ）であって、試料添加部位１４を有し、被
験物質に対する抗体であってグルコースオキシダーゼに
より標識されたものを収容している。１２は部材（ロ）
であって、前記被験物質に特異的に結合する物質である
第二の抗体を固定化しており、且つ１mm2 以下の感知面
積を有する酸素電極に接しており、そして１３は部材
（ハ）であって、液体を吸収する部材である。
の一方の構成員を抗原とし、他方の構成員を抗体とし、
酸化還元触媒をグルコースオキシダーゼとし、該酸化還
元酵素の基質をグルコースとして、上記の装置を模式的
に示す図２に言及しながら説明する。図２において、１
１は部材（イ）であって、試料添加部位１４を有し、被
験物質に対する抗体であってグルコースオキシダーゼに
より標識されたものを収容している。１２は部材（ロ）
であって、前記被験物質に特異的に結合する物質である
第二の抗体を固定化しており、且つ１mm2 以下の感知面
積を有する酸素電極に接しており、そして１３は部材
（ハ）であって、液体を吸収する部材である。
【００２８】まず、部材（イ）１１の試料添加部位１４
に被験物質抗原を含有する試料溶液を添加すれば、これ
が毛細管作用によって拡散し、部材（イ）１１中に拡が
る。部材（イ）１１中には被験物質抗原に対する抗体
（第１抗体）であってグルコースオキシダーゼにより標
識されているものが収容されているので、被験物質抗原
と標識された抗体とが免疫結合して抗原／抗体複合体を
形成する。標識された抗体は過剰に存在するので、被験
物質抗原は標識された抗体と定量的に結合し、標識され
た抗体の１部は未反応のまま残る。
に被験物質抗原を含有する試料溶液を添加すれば、これ
が毛細管作用によって拡散し、部材（イ）１１中に拡が
る。部材（イ）１１中には被験物質抗原に対する抗体
（第１抗体）であってグルコースオキシダーゼにより標
識されているものが収容されているので、被験物質抗原
と標識された抗体とが免疫結合して抗原／抗体複合体を
形成する。標識された抗体は過剰に存在するので、被験
物質抗原は標識された抗体と定量的に結合し、標識され
た抗体の１部は未反応のまま残る。
【００２９】次に、部材（イ）１１で生じた抗原／抗体
複合体と未反応の標識された抗体は、毛細管作用による
試料溶液の移行により部材（ロ）１２に移送される。な
お、試料溶液の量が、反応生成物を移送するのに十分で
ない場合は、試料添加部位１４に緩衝液等を追加するこ
とにより移送を助けることができる。
複合体と未反応の標識された抗体は、毛細管作用による
試料溶液の移行により部材（ロ）１２に移送される。な
お、試料溶液の量が、反応生成物を移送するのに十分で
ない場合は、試料添加部位１４に緩衝液等を追加するこ
とにより移送を助けることができる。
【００３０】部材（ロ）１２には第二の抗体が固定化さ
れているので、部材（イ）１１から移送された抗原／抗
体複合体中の被験物質抗原が、固定化されている第二の
抗体に結合し、標識された抗体（第一抗体）は、被験物
質抗原と、あらかじめ固定化されていた第二抗体とを介
して部材（ロ）１２に固定化される。次に、この部材
（ロ）にグルコースオキシダーゼ標識の基質であるグル
コースを添加することにより、グルコースオキシダーゼ
によるグルコースの酸化が生じ、溶液の酸素濃度が低下
し、その濃度変化が部材（ロ）１２に接する酸素電極１
５により検出される。この態様においては、被験物質抗
原は酸素電極１５に接する部材（ロ）１２中に蓄積する
ので、被験物質を高感度で測定することができる。
れているので、部材（イ）１１から移送された抗原／抗
体複合体中の被験物質抗原が、固定化されている第二の
抗体に結合し、標識された抗体（第一抗体）は、被験物
質抗原と、あらかじめ固定化されていた第二抗体とを介
して部材（ロ）１２に固定化される。次に、この部材
（ロ）にグルコースオキシダーゼ標識の基質であるグル
コースを添加することにより、グルコースオキシダーゼ
によるグルコースの酸化が生じ、溶液の酸素濃度が低下
し、その濃度変化が部材（ロ）１２に接する酸素電極１
５により検出される。この態様においては、被験物質抗
原は酸素電極１５に接する部材（ロ）１２中に蓄積する
ので、被験物質を高感度で測定することができる。
【００３１】本発明の第三の態様によれば、（１）被験
物質である特異的結合対の一方の構成員（被験物質）
（ａ）と、該特異的結合対の他方の構成員と特異的に結
合することができる物質であって酸化還元触媒により標
識されているもの（標識された特異的結合物質）（ｂ）
とを混合し、（２）前記工程（１）からの混合物を、前
記特異的結合対の他方の構成員（ｃ）が固定されている
部材であって酸素電極の感知表面と接しているものに供
給することにより、前記被験物質（ａ）と前記標識され
た特異的結合物質（ｂ）とを、前記酸素電極の感知表面
に接する部材に固定化された他方の構成員（ｃ）に対し
て競合せしめ、（３）前記工程（２）において固定化さ
れている他の構成員（ｃ）に結合しなかった被験物質
（ａ）及び標識された特異的結合物質（ｂ）を除去し、
そして（４）前記酸素電極の感知表面に接する部材に、
前記酸化還元触媒のための基質を接触せしめる、ことを
特徴とする方法が提供される。
物質である特異的結合対の一方の構成員（被験物質）
（ａ）と、該特異的結合対の他方の構成員と特異的に結
合することができる物質であって酸化還元触媒により標
識されているもの（標識された特異的結合物質）（ｂ）
とを混合し、（２）前記工程（１）からの混合物を、前
記特異的結合対の他方の構成員（ｃ）が固定されている
部材であって酸素電極の感知表面と接しているものに供
給することにより、前記被験物質（ａ）と前記標識され
た特異的結合物質（ｂ）とを、前記酸素電極の感知表面
に接する部材に固定化された他方の構成員（ｃ）に対し
て競合せしめ、（３）前記工程（２）において固定化さ
れている他の構成員（ｃ）に結合しなかった被験物質
（ａ）及び標識された特異的結合物質（ｂ）を除去し、
そして（４）前記酸素電極の感知表面に接する部材に、
前記酸化還元触媒のための基質を接触せしめる、ことを
特徴とする方法が提供される。
【００３２】この方法の実施のためには、例えば、図３
において、（イ）被験物質（ａ）である特異的結合対の
一方の構成員でない他方の構成員に対して特異的に結合
する物質であって酸化還元触媒により標識されているも
の（標識された特異的結合物質）（ｂ）を収容してお
り、その一部分に試料添加部位を有する部材、（ロ）前
記特異結合対の他方の構成員（ｃ）が固定されている部
材であって、１mm2 以下の感知表面を有する酸素電極に
接しているもの、及び（ハ）液体吸収部材を有し、前記
部材（イ）の試料添加部位と前記液体吸収部材（ハ）と
が前記部材（ロ）を介して毛細管作用により液体連絡さ
れていることを特徴とする装置が使用される。
において、（イ）被験物質（ａ）である特異的結合対の
一方の構成員でない他方の構成員に対して特異的に結合
する物質であって酸化還元触媒により標識されているも
の（標識された特異的結合物質）（ｂ）を収容してお
り、その一部分に試料添加部位を有する部材、（ロ）前
記特異結合対の他方の構成員（ｃ）が固定されている部
材であって、１mm2 以下の感知表面を有する酸素電極に
接しているもの、及び（ハ）液体吸収部材を有し、前記
部材（イ）の試料添加部位と前記液体吸収部材（ハ）と
が前記部材（ロ）を介して毛細管作用により液体連絡さ
れていることを特徴とする装置が使用される。
【００３３】前記の方法及び装置において、「被験物質
である特異的結合対の一方の構成員ではない他方の構成
員に対して特異的に結合する物質」とは、最も端適には
被験物質と同一の物質である。しかしながら、例えば被
験物質が体液中に存在する糖蛋白質である場合、前記
「特異的に結合する物質」とは、遺伝子工学的に調製し
たグリコシル化されていない蛋白質や、該蛋白質の断片
や、アミノ酸配列が修飾された蛋白質等でもよい。但
し、被験物質である抗原に対する抗体と結合することが
できるものでなければならない。
である特異的結合対の一方の構成員ではない他方の構成
員に対して特異的に結合する物質」とは、最も端適には
被験物質と同一の物質である。しかしながら、例えば被
験物質が体液中に存在する糖蛋白質である場合、前記
「特異的に結合する物質」とは、遺伝子工学的に調製し
たグリコシル化されていない蛋白質や、該蛋白質の断片
や、アミノ酸配列が修飾された蛋白質等でもよい。但
し、被験物質である抗原に対する抗体と結合することが
できるものでなければならない。
【００３４】上記の装置を模式的に示す図３において、
２１は部材（イ）であり、被験物質抗原に対する抗体に
対して特異的に結合することができる物質、例えば、被
験物質抗原と同一の物質又はその修飾体等であってグル
コースオキシダーゼにより標識されているものを収容し
ており、その一部に試料添加部位２４を有する。２２は
部材（ロ）であって、酸素電極２５の感知表面に接して
おり、被験物質抗原に対する抗体が固定化されている。
２３は部材（ハ）であり液体吸収部材である。
２１は部材（イ）であり、被験物質抗原に対する抗体に
対して特異的に結合することができる物質、例えば、被
験物質抗原と同一の物質又はその修飾体等であってグル
コースオキシダーゼにより標識されているものを収容し
ており、その一部に試料添加部位２４を有する。２２は
部材（ロ）であって、酸素電極２５の感知表面に接して
おり、被験物質抗原に対する抗体が固定化されている。
２３は部材（ハ）であり液体吸収部材である。
【００３５】測定に当っては、被験物質抗原を含有する
試料溶液を部材（イ）２１の試料添加部位２４に添加す
る。添加された試料溶液は毛細管作用により部材（イ）
２１に拡散し、それに収容されている標識された特異的
結合物質、例えば標識された抗原と混合される。この混
合物は、毛細管作用による試料溶液の移動により、部材
（ロ）２２に移送される。なお、試料溶液の量が、反応
物質を移送するのに十分でない場合には、試料添加部位
２４に緩衝液等の輸送媒体を添加することができる。
試料溶液を部材（イ）２１の試料添加部位２４に添加す
る。添加された試料溶液は毛細管作用により部材（イ）
２１に拡散し、それに収容されている標識された特異的
結合物質、例えば標識された抗原と混合される。この混
合物は、毛細管作用による試料溶液の移動により、部材
（ロ）２２に移送される。なお、試料溶液の量が、反応
物質を移送するのに十分でない場合には、試料添加部位
２４に緩衝液等の輸送媒体を添加することができる。
【００３６】部材（ロ）２２に移送された未知量（濃
度）の被験物質抗原と、既知量（濃度）の標識された抗
原とは、部材（ロ）２２に固定化された抗体に対して競
合的に結合し、試料由来の被験物質の量（濃度）に反比
例する量（濃度）の標識された抗原が、固定化されてい
る抗体と結合し、捕捉される。結合しなかった被験物質
抗原及び標識抗原は、毛細管作用により液体吸収部材
（ハ）に移送され、部材（ロ）２２にグルコースを添加
すれば、部材（ロ）２２に固定化されたグルコースオキ
シダーゼ標識によりグルコースが酸化され、それによっ
て生ずる酸素濃度の低下が、部材（ロ）２２に接する酸
素電極２５により検出される。
度）の被験物質抗原と、既知量（濃度）の標識された抗
原とは、部材（ロ）２２に固定化された抗体に対して競
合的に結合し、試料由来の被験物質の量（濃度）に反比
例する量（濃度）の標識された抗原が、固定化されてい
る抗体と結合し、捕捉される。結合しなかった被験物質
抗原及び標識抗原は、毛細管作用により液体吸収部材
（ハ）に移送され、部材（ロ）２２にグルコースを添加
すれば、部材（ロ）２２に固定化されたグルコースオキ
シダーゼ標識によりグルコースが酸化され、それによっ
て生ずる酸素濃度の低下が、部材（ロ）２２に接する酸
素電極２５により検出される。
【００３７】なお、この態様の変法として、図３におけ
る部材（イ）２１を省略し、被験物質抗原を含有する試
料溶液と、標識された抗原とを試験管内で混合した後、
直接に図３の部材（ロ）２２に添加してもよい。
る部材（イ）２１を省略し、被験物質抗原を含有する試
料溶液と、標識された抗原とを試験管内で混合した後、
直接に図３の部材（ロ）２２に添加してもよい。
【００３８】本発明の第四の態様によれば、
（１）被験物質である特異的結合対の一方の構成員（被
験物質）（ａ）と同一の物質であるか又は該特異的結合
対の他方の構成員（ｂ）と特異的に結合する物質（特異
的結合物質）であって、酸化還元触媒により標識された
もの（標識された競合物質）（ｃ）を、部材に固定化し
た前記特異的結合対の他方の構成員（ｂ）に結合させて
おき、 （２）前記部材に、被験物質（ａ）を含有する試料を添
加することにより、該被験物質（ａ）と前記標識された
競合物質（ｃ）とを、前記部材に固定化された他方の構
成員（ｂ）に対して競合せしめることにより、前記標識
された競合物質（ｃ）の一部を被験物質（ａ）の量に依
存する量で遊離せしめ、 （３）前記工程（２）において遊離した標識された競合
物質と結合したままの標識された結合物質とを分離し、
そして （４）前記工程（３）において分離された、遊離した標
識された競合物質又は結合したままの標識された結合物
質のいずれかと、前記酸化還元触媒標識の基質とを、酸
素電極の感知表面と接する部材中で反応せしめる、こと
を特徴とする方法が提供される。
験物質）（ａ）と同一の物質であるか又は該特異的結合
対の他方の構成員（ｂ）と特異的に結合する物質（特異
的結合物質）であって、酸化還元触媒により標識された
もの（標識された競合物質）（ｃ）を、部材に固定化し
た前記特異的結合対の他方の構成員（ｂ）に結合させて
おき、 （２）前記部材に、被験物質（ａ）を含有する試料を添
加することにより、該被験物質（ａ）と前記標識された
競合物質（ｃ）とを、前記部材に固定化された他方の構
成員（ｂ）に対して競合せしめることにより、前記標識
された競合物質（ｃ）の一部を被験物質（ａ）の量に依
存する量で遊離せしめ、 （３）前記工程（２）において遊離した標識された競合
物質と結合したままの標識された結合物質とを分離し、
そして （４）前記工程（３）において分離された、遊離した標
識された競合物質又は結合したままの標識された結合物
質のいずれかと、前記酸化還元触媒標識の基質とを、酸
素電極の感知表面と接する部材中で反応せしめる、こと
を特徴とする方法が提供される。
【００３９】この方法の内、上記工程（４）において、
遊離した標識された競合物質を測定するためには、例え
ば、図４において、（イ）被験物質である特異的結合対
の一方の構成員（被験物質）（ａ）ではない他方の構成
員（ｂ）が固定されている部材、ここで該被験物質
（ａ）と同一の物質であるか又は該他方の構成員（ｂ）
と特異的に結合する物質（特異的結合物質）であって、
酸化還元触媒により標識されたもの（標識された競合物
質）（ｃ）が、前記固定化された他方の構成員（ｂ）に
結合しており、該部材の一部は試料添加部位を構成して
いる；並びに（ロ）前記酸化還元触媒のための基質を収
容し、且つ１mm2 以下の感知表面を有する酸素電極に接
している部材；を有し、前記部材（イ）の試料添加部位
と部材（ロ）の酸素電極接触部が毛管作用により液体連
絡されていることを特徴とする装置が使用される。
遊離した標識された競合物質を測定するためには、例え
ば、図４において、（イ）被験物質である特異的結合対
の一方の構成員（被験物質）（ａ）ではない他方の構成
員（ｂ）が固定されている部材、ここで該被験物質
（ａ）と同一の物質であるか又は該他方の構成員（ｂ）
と特異的に結合する物質（特異的結合物質）であって、
酸化還元触媒により標識されたもの（標識された競合物
質）（ｃ）が、前記固定化された他方の構成員（ｂ）に
結合しており、該部材の一部は試料添加部位を構成して
いる；並びに（ロ）前記酸化還元触媒のための基質を収
容し、且つ１mm2 以下の感知表面を有する酸素電極に接
している部材；を有し、前記部材（イ）の試料添加部位
と部材（ロ）の酸素電極接触部が毛管作用により液体連
絡されていることを特徴とする装置が使用される。
【００４０】前記の方法及び装置において、「被験物質
である特異的結合対の一方の構成員（被験物質）（ａ）
ではない他方の構成員（ｂ）に対して特異的に結合する
物質（特異的結合物質）」とは、最も端適には被験物質
と同一の物質である。しかしながら、例えば被験物質が
体液中に存在する糖蛋白質である場合、前記「特異的に
結合する物質」とは、遺伝子工学的に調製したグリコシ
ル化されていない蛋白質や、該蛋白質の断片や、アミノ
酸配列が修飾された蛋白質等でもよい。但し、被験物質
である抗原に対する抗体と結合することができるもので
なければならない。
である特異的結合対の一方の構成員（被験物質）（ａ）
ではない他方の構成員（ｂ）に対して特異的に結合する
物質（特異的結合物質）」とは、最も端適には被験物質
と同一の物質である。しかしながら、例えば被験物質が
体液中に存在する糖蛋白質である場合、前記「特異的に
結合する物質」とは、遺伝子工学的に調製したグリコシ
ル化されていない蛋白質や、該蛋白質の断片や、アミノ
酸配列が修飾された蛋白質等でもよい。但し、被験物質
である抗原に対する抗体と結合することができるもので
なければならない。
【００４１】上記の装置を模式的に示す図４において、
３１は部材（イ）であり、これには前記被験物質（ａ）
ではない他方の構成員（ｂ）が固定化されており、被験
物質（ａ）と同一の物質であるか又は前記他方の構成員
（ｂ）と特異的に結合する物質（特異的結合物質）であ
って、酸化還元触媒により標識されたもの（標識された
競合物質）（ｃ）が、前記部材（イ）に固定化された他
方の構成員（ｂ）に結合している。この部材（イ）３１
は、その一部が試料添加部位３４を構成している。３２
は材料（ロ）であって、これには感知表面積が１mm2 以
下の酸素電極が、その感知表面において接している。
３１は部材（イ）であり、これには前記被験物質（ａ）
ではない他方の構成員（ｂ）が固定化されており、被験
物質（ａ）と同一の物質であるか又は前記他方の構成員
（ｂ）と特異的に結合する物質（特異的結合物質）であ
って、酸化還元触媒により標識されたもの（標識された
競合物質）（ｃ）が、前記部材（イ）に固定化された他
方の構成員（ｂ）に結合している。この部材（イ）３１
は、その一部が試料添加部位３４を構成している。３２
は材料（ロ）であって、これには感知表面積が１mm2 以
下の酸素電極が、その感知表面において接している。
【００４２】測定に当っては、被験物質（例えば抗原）
を含有する試料溶液を部材（イ）３１の試料添加部位３
４に添加する。これにより、試料溶液中の被験物質
（ａ）と、部材（イ）３１に固定化された他方の構成員
（ｂ）である抗体に結合している標識された競合物質
（ｃ）（典型的には被験物質（ａ）と同じ物質、例えば
抗原であって酸化還元触媒により標識されたもの）と
が、前記固定化された抗体に対して競合し、該固定化さ
れた抗体に結合していた標識された競合物質（ｃ）（抗
原）の一部が、被験物質抗原の量に依存して遊離する。
を含有する試料溶液を部材（イ）３１の試料添加部位３
４に添加する。これにより、試料溶液中の被験物質
（ａ）と、部材（イ）３１に固定化された他方の構成員
（ｂ）である抗体に結合している標識された競合物質
（ｃ）（典型的には被験物質（ａ）と同じ物質、例えば
抗原であって酸化還元触媒により標識されたもの）と
が、前記固定化された抗体に対して競合し、該固定化さ
れた抗体に結合していた標識された競合物質（ｃ）（抗
原）の一部が、被験物質抗原の量に依存して遊離する。
【００４３】前記試料添加部位３４に添加された試料溶
液は毛管作用により部材（イ）３１を通って部材（ロ）
３２に移行し、この移行により、前記遊離した標識され
た競合物質（ｃ）（抗原）は部材（ロ）３２に移行す
る。なお、試料溶液が、前記遊離した競合物質（ｃ）を
部材（ロ）３２に移行せしめるのに十分でない場合に
は、試料添加部位３４に緩衝液等の輸送媒体を添加する
ことができる。部材（ロ）には前記酸化還元触媒の基質
（例えばグルコース）が収容されており（又は基質を添
加し）、部材（ロ）に移送された標識された競合物質
（ｃ）に結合した酸化還元触媒標識と前記基質とが反応
し、それにより生ずる酸素濃度の低下が部材（ロ）３２
に接する酸素電極３５により検出される。
液は毛管作用により部材（イ）３１を通って部材（ロ）
３２に移行し、この移行により、前記遊離した標識され
た競合物質（ｃ）（抗原）は部材（ロ）３２に移行す
る。なお、試料溶液が、前記遊離した競合物質（ｃ）を
部材（ロ）３２に移行せしめるのに十分でない場合に
は、試料添加部位３４に緩衝液等の輸送媒体を添加する
ことができる。部材（ロ）には前記酸化還元触媒の基質
（例えばグルコース）が収容されており（又は基質を添
加し）、部材（ロ）に移送された標識された競合物質
（ｃ）に結合した酸化還元触媒標識と前記基質とが反応
し、それにより生ずる酸素濃度の低下が部材（ロ）３２
に接する酸素電極３５により検出される。
【００４４】また、前記第４の態様の内、前記工程
（４）において、結合したままの標識された競合物質を
測定するためには、例えば、図５において、 （イ）被験物質である特異的結合対の一方の構成員（被
験物質）（ａ）とは異る他方の構成員（ｂ）が固定され
ている部材、ここで該被験物質（ａ）と同一物質である
か又は該他方の構成員（ｂ）と特異的に結合する物質
（特異的結合物質）であって、酸化還元触媒により標識
されたもの（標識された競合物質）（ｃ）が、前記固定
化された他方の構成員（ｂ）に結合しており、該部材の
試料添加部位を構成しており、且つ該部材は１mm2 以下
の感知表面を有する酸素電極に接している；並びに （ロ）液体吸収部材； を有し、前記部材（イ）の試料添加部位と前記部材
（ロ）が毛管作用により液体連絡していることを特徴と
する装置が使用される。
（４）において、結合したままの標識された競合物質を
測定するためには、例えば、図５において、 （イ）被験物質である特異的結合対の一方の構成員（被
験物質）（ａ）とは異る他方の構成員（ｂ）が固定され
ている部材、ここで該被験物質（ａ）と同一物質である
か又は該他方の構成員（ｂ）と特異的に結合する物質
（特異的結合物質）であって、酸化還元触媒により標識
されたもの（標識された競合物質）（ｃ）が、前記固定
化された他方の構成員（ｂ）に結合しており、該部材の
試料添加部位を構成しており、且つ該部材は１mm2 以下
の感知表面を有する酸素電極に接している；並びに （ロ）液体吸収部材； を有し、前記部材（イ）の試料添加部位と前記部材
（ロ）が毛管作用により液体連絡していることを特徴と
する装置が使用される。
【００４５】前記の方法及び装置において、「被験物質
である特異的結合対の一方の構成員（被験物質）（ａ）
ではない他方の構成員（ｂ）に対して特異的に結合する
物質（特異的結合物質）」とは、最も端適には被験物質
と同一の物質である。しかしながら、例えば被験物質が
体液中に存在する糖蛋白質である場合、前記「特異的に
結合する物質」とは、遺伝子工学的に調製したグリコシ
ル化されていない蛋白質や、該蛋白質の断片や、アミノ
酸配列は修飾された蛋白質等でもよい。但し、被験物質
である抗原に対する抗体と結合することができるもので
なければならない。
である特異的結合対の一方の構成員（被験物質）（ａ）
ではない他方の構成員（ｂ）に対して特異的に結合する
物質（特異的結合物質）」とは、最も端適には被験物質
と同一の物質である。しかしながら、例えば被験物質が
体液中に存在する糖蛋白質である場合、前記「特異的に
結合する物質」とは、遺伝子工学的に調製したグリコシ
ル化されていない蛋白質や、該蛋白質の断片や、アミノ
酸配列は修飾された蛋白質等でもよい。但し、被験物質
である抗原に対する抗体と結合することができるもので
なければならない。
【００４６】上記装置を模式的に示す図５において、４
１は部材（イ）であり、これには前記被験物質（ａ）で
はない他方の構成員（ｂ）が固定化されており、被験物
質（ａ）と同一の物質であるか又は前記他方の構成員
（ｂ）と特異的に結合する物質（特異的結合物質）であ
って、酸化還元触媒により標識されたもの（標識された
競合物質）（ｃ）が、部材（イ）に固定化された他方の
構成員（ｂ）に結合している。この部材（イ）４１は、
その一部が試料添加部位４４を構成している。この部材
（イ）４１には、酸素電極４５が接している。４３は部
材（ハ）であり、液体吸収部材である。
１は部材（イ）であり、これには前記被験物質（ａ）で
はない他方の構成員（ｂ）が固定化されており、被験物
質（ａ）と同一の物質であるか又は前記他方の構成員
（ｂ）と特異的に結合する物質（特異的結合物質）であ
って、酸化還元触媒により標識されたもの（標識された
競合物質）（ｃ）が、部材（イ）に固定化された他方の
構成員（ｂ）に結合している。この部材（イ）４１は、
その一部が試料添加部位４４を構成している。この部材
（イ）４１には、酸素電極４５が接している。４３は部
材（ハ）であり、液体吸収部材である。
【００４７】測定に当っては、被験物質（例えば抗原）
を含有する試料溶液を部材（イ）４１の試料添加部位４
４に添加する。これにより、試料溶液中の被験物質抗原
（ａ）と、部材（イ）４１に固定された他方の構成員
（ｂ）（例えば前記抗原に対する抗体）に結合している
標識された競合物質（ｃ）（典型的には被験物質（ａ）
と同じ物質、例えば抗原であって酸化還元触媒により構
成されたもの）とが、前記固定化された抗体に対して競
合し、該固定化された抗体に結合した標識された競合物
質（ｃ）（抗原）の一部が、被験物質抗原の量に依存し
て遊離する。
を含有する試料溶液を部材（イ）４１の試料添加部位４
４に添加する。これにより、試料溶液中の被験物質抗原
（ａ）と、部材（イ）４１に固定された他方の構成員
（ｂ）（例えば前記抗原に対する抗体）に結合している
標識された競合物質（ｃ）（典型的には被験物質（ａ）
と同じ物質、例えば抗原であって酸化還元触媒により構
成されたもの）とが、前記固定化された抗体に対して競
合し、該固定化された抗体に結合した標識された競合物
質（ｃ）（抗原）の一部が、被験物質抗原の量に依存し
て遊離する。
【００４８】前記試料添加部位４４に添加された試料溶
液は毛管作用により部材（イ）４１を通って液体吸収部
材（ハ）４３に移行し、この移行により、前記遊離した
標識された競合物質（ｃ）（抗原）は吸収部材（ハ）４
３に移行する。なお、試料溶液が、前記遊離した競合物
質（ｃ）を部材（ハ）４３に移行せしめるために十分で
ない場合には、試料添加部位４４に緩衝液等の輸送媒体
を添加することができる。
液は毛管作用により部材（イ）４１を通って液体吸収部
材（ハ）４３に移行し、この移行により、前記遊離した
標識された競合物質（ｃ）（抗原）は吸収部材（ハ）４
３に移行する。なお、試料溶液が、前記遊離した競合物
質（ｃ）を部材（ハ）４３に移行せしめるために十分で
ない場合には、試料添加部位４４に緩衝液等の輸送媒体
を添加することができる。
【００４９】次に、部材（イ）４１に、前記酸化還元触
媒の基質、例えばグルコース溶液を添加する。これによ
り、部材（イ）４１に固定された抗体に結合したままの
競合物質（ｃ）（抗原）に結合した酸化還元触媒（例え
ばグルコースオキシダーゼ）と、前記基質（グルコー
ス）とが反応して部材（イ）４１中の酸素濃度が低下
し、それは部材（イ）４１に接する酸素電極４５により
検出される。
媒の基質、例えばグルコース溶液を添加する。これによ
り、部材（イ）４１に固定された抗体に結合したままの
競合物質（ｃ）（抗原）に結合した酸化還元触媒（例え
ばグルコースオキシダーゼ）と、前記基質（グルコー
ス）とが反応して部材（イ）４１中の酸素濃度が低下
し、それは部材（イ）４１に接する酸素電極４５により
検出される。
【００５０】以上、本発明が適用できる４つの態様につ
いて説明したが、本発明の適用範囲はこれらに限定され
るものではなく、免疫測定の種々の方式に対して適用可
能である。例えば図１〜５に示すような本発明の装置に
おいて、部材（イ）、（ロ）及び（ハ）の材質は、毛細
管作用により液体を輸送することができるものであれ
ば、特に限定されず、例えば濾紙、例えばセルロース製
の１片の濾紙片により部材（イ）、（ロ）及び（ハ）を
構成してもよい。
いて説明したが、本発明の適用範囲はこれらに限定され
るものではなく、免疫測定の種々の方式に対して適用可
能である。例えば図１〜５に示すような本発明の装置に
おいて、部材（イ）、（ロ）及び（ハ）の材質は、毛細
管作用により液体を輸送することができるものであれ
ば、特に限定されず、例えば濾紙、例えばセルロース製
の１片の濾紙片により部材（イ）、（ロ）及び（ハ）を
構成してもよい。
【００５１】あるいは、多孔性材料、例えばセルロース
粉末、セルロース誘導体、ガラス繊維、フッ素化合物材
料、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ
塩化ビニル、多孔性セラミック、カーボンファイバー、
金属性ウール等の材料の多孔性材料等を柱状（カラム
状）に成形又は充填してもよい。あるいはまた、図６に
示すように部材（イ）、（ロ）及び（ハ）を別個の材
料、例えば濾紙片等から構成し、それらの端部を相互に
重ねることにより、毛細管作用による液体連絡を完成し
てもよい。
粉末、セルロース誘導体、ガラス繊維、フッ素化合物材
料、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ
塩化ビニル、多孔性セラミック、カーボンファイバー、
金属性ウール等の材料の多孔性材料等を柱状（カラム
状）に成形又は充填してもよい。あるいはまた、図６に
示すように部材（イ）、（ロ）及び（ハ）を別個の材
料、例えば濾紙片等から構成し、それらの端部を相互に
重ねることにより、毛細管作用による液体連絡を完成し
てもよい。
【００５２】なお、本発明において、「毛管作用により
液体連絡されている」とは、試料溶液又は他の輸送媒体
（液体）が毛細管作用により輸送されるように構成され
ていることを意味する。また、部材（イ）、（ロ）及び
（ハ）を濾紙片等で構成する場合、それ自体単独で構成
してもよいが、物理的強度を改良する観点から、図７に
示すごとく、液体不透過性の支持体（３０）、例えば合
成樹脂板等の表面に載置してもよい。
液体連絡されている」とは、試料溶液又は他の輸送媒体
（液体）が毛細管作用により輸送されるように構成され
ていることを意味する。また、部材（イ）、（ロ）及び
（ハ）を濾紙片等で構成する場合、それ自体単独で構成
してもよいが、物理的強度を改良する観点から、図７に
示すごとく、液体不透過性の支持体（３０）、例えば合
成樹脂板等の表面に載置してもよい。
【００５３】
【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。実施例１ 糖尿病性腎炎の早期の診断の目安となる尿中アルブミン
の測定のためのモデル実験として、人尿及び対照として
緩衝液中にアルブミンを加えて、アルブミン濃度０μｇ
／ml, ２０μｇ／ml，５０μｇ／ml，１００μｇ／ml及
び２００μｇ／mlの尿及び水溶液を調製した。
説明する。実施例１ 糖尿病性腎炎の早期の診断の目安となる尿中アルブミン
の測定のためのモデル実験として、人尿及び対照として
緩衝液中にアルブミンを加えて、アルブミン濃度０μｇ
／ml, ２０μｇ／ml，５０μｇ／ml，１００μｇ／ml及
び２００μｇ／mlの尿及び水溶液を調製した。
【００５４】Ｂａｌｂ／Ｃマウスにヒトアルブミンを感
作させ、その脾臓を摘出し、マウスシエムーマ細胞と融
合させて抗アルブミン抗体を産生するハイブリドーマを
得た。ハイブリドーマの内、アフィニティーの高い抗体
を産生するものを選択してモノクローン化した。このハ
イブリドーマ細胞をマウス腹腔内に注入して数週間後に
腹水を採取し、腹水から、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ固定カラ
ムにより抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体を
精製した。
作させ、その脾臓を摘出し、マウスシエムーマ細胞と融
合させて抗アルブミン抗体を産生するハイブリドーマを
得た。ハイブリドーマの内、アフィニティーの高い抗体
を産生するものを選択してモノクローン化した。このハ
イブリドーマ細胞をマウス腹腔内に注入して数週間後に
腹水を採取し、腹水から、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ固定カラ
ムにより抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体を
精製した。
【００５５】前記のようにして得た抗ヒトアルブミンモ
ノクローナル抗体のグルコースオキシダーゼによる標識
は次のようにして行った。０．８mlの水中２mgのグルコ
ースオキシダーゼの溶液に１００μｌの０．１Ｍ Ｎａ
ＩＯ3 を添加し、２５℃にて３０分間反応せしめた。こ
れに５０μｌのエチレングリコールを添加し２５℃にて
５分間インキュベートした後、２mM ＣＨ3 ＣＯＯＨａ
（pH４．４）で脱塩ゲル濾過を行い、アルデヒド化グル
コースオキシダーゼを得た。２mgのアルデヒド化グルコ
ースオキシダーゼに２mlのＰＢＳ中１０mgのモノクロー
ナル抗体の溶液及び１００μｌの１Ｍ ＮａＣＯ3 （pH
９．５）を添加し、２５℃にて２時間反応せしめた。次
に４０μｌの４mg／ml ＮａＢＨ4 を加えて４℃にて２
時間反応させた後濃縮後、ゲル濾過し、グルコースオキ
シダーゼにより標識された抗ヒトアルブミンマウスモノ
クローナル抗体を得た。
ノクローナル抗体のグルコースオキシダーゼによる標識
は次のようにして行った。０．８mlの水中２mgのグルコ
ースオキシダーゼの溶液に１００μｌの０．１Ｍ Ｎａ
ＩＯ3 を添加し、２５℃にて３０分間反応せしめた。こ
れに５０μｌのエチレングリコールを添加し２５℃にて
５分間インキュベートした後、２mM ＣＨ3 ＣＯＯＨａ
（pH４．４）で脱塩ゲル濾過を行い、アルデヒド化グル
コースオキシダーゼを得た。２mgのアルデヒド化グルコ
ースオキシダーゼに２mlのＰＢＳ中１０mgのモノクロー
ナル抗体の溶液及び１００μｌの１Ｍ ＮａＣＯ3 （pH
９．５）を添加し、２５℃にて２時間反応せしめた。次
に４０μｌの４mg／ml ＮａＢＨ4 を加えて４℃にて２
時間反応させた後濃縮後、ゲル濾過し、グルコースオキ
シダーゼにより標識された抗ヒトアルブミンマウスモノ
クローナル抗体を得た。
【００５６】前記のようにして調製した、種々の濃度
（０μｇ／ml〜２００μｇ／ml）の人尿中アルブミン溶
液及び緩衝液中アルブミン溶液のそれぞれを、前記のよ
うにして調製したグルコースオキシダーゼ標識抗体と反
応せしめ、次にこの反応液をヒトアルブミンを固定性カ
ラムに通すことにより、未反応のグルコースオキシダー
ゼ標識抗体を除去しアルブミンと標識抗体との結合物を
含有する溶液を得た。他方、次に感知面積が０．０４mm
2 の酸素電極を水非吸収性担体上に載置し、その上を、
グルコース溶液を吸収させた後に乾燥させた濾紙により
覆った。
（０μｇ／ml〜２００μｇ／ml）の人尿中アルブミン溶
液及び緩衝液中アルブミン溶液のそれぞれを、前記のよ
うにして調製したグルコースオキシダーゼ標識抗体と反
応せしめ、次にこの反応液をヒトアルブミンを固定性カ
ラムに通すことにより、未反応のグルコースオキシダー
ゼ標識抗体を除去しアルブミンと標識抗体との結合物を
含有する溶液を得た。他方、次に感知面積が０．０４mm
2 の酸素電極を水非吸収性担体上に載置し、その上を、
グルコース溶液を吸収させた後に乾燥させた濾紙により
覆った。
【００５７】この濾紙上に上記の前記のアルブミンと標
識抗体との結合物を含有する溶液を滴上し、その前後に
わたって酸素電極の出力電流を経時的に記録した。ま
た、上記処理を行わない緩衝液を滴加したものをベース
ライン（Ｂ）とした。緩衝液中のアルブミンについて得
た結果を図８に示す。電流変化の初速度及び一定時間後
の電流変化量のいずれもアルブミンの濃度存在的に上昇
することを確認した。
識抗体との結合物を含有する溶液を滴上し、その前後に
わたって酸素電極の出力電流を経時的に記録した。ま
た、上記処理を行わない緩衝液を滴加したものをベース
ライン（Ｂ）とした。緩衝液中のアルブミンについて得
た結果を図８に示す。電流変化の初速度及び一定時間後
の電流変化量のいずれもアルブミンの濃度存在的に上昇
することを確認した。
【００５８】アルブミンの溶剤として人尿及び緩衝液を
使用した場合について、溶液添加の１００秒後の電流変
化量（縦軸）とアルブミン濃度（横軸）との関連を図９
のグラフに示す。緩衝液を使用した場合と人尿を使用し
た場合の結果がよく一致しており、本発明の測定方法が
人尿中の挾雑物により影響を受けないことが確認され
た。なお、図９において、溶媒として人尿を使用した場
合と緩衝液を使用した場合との差は、人尿中にもともと
含まれていたアルブミンによるものと推定される。
使用した場合について、溶液添加の１００秒後の電流変
化量（縦軸）とアルブミン濃度（横軸）との関連を図９
のグラフに示す。緩衝液を使用した場合と人尿を使用し
た場合の結果がよく一致しており、本発明の測定方法が
人尿中の挾雑物により影響を受けないことが確認され
た。なお、図９において、溶媒として人尿を使用した場
合と緩衝液を使用した場合との差は、人尿中にもともと
含まれていたアルブミンによるものと推定される。
【図１】図１は、本発明の第１の態様の装置の模式図で
ある。
ある。
【図２】図２は、本発明の第２の態様の装置の模式図で
ある。
ある。
【図３】図３は、本発明の第３態様の装置の模式図であ
る。
る。
【図４】図４は、本発明の第４の態様（その１）の装置
の模式図である。
の模式図である。
【図５】図５は、本発明の第４の態様（その２）の装置
の模式図である。
の模式図である。
【図６】図６は、本発明の装置の部材（イ）、（ロ）及
び（ハ）を別々に構成し、重ねて配置した状態を示す模
式図である。
び（ハ）を別々に構成し、重ねて配置した状態を示す模
式図である。
【図７】図７は、本発明の装置の部材（イ）、（ロ）及
び（ハ）を支持体３０上に載置した状態を示す模式図で
ある。
び（ハ）を支持体３０上に載置した状態を示す模式図で
ある。
【図８】図８は、本発明の方法により、被験抗原である
ヒトアルブミンを測定した場合の酸素電極の出力電流の
経時的変化を示すグラフである。
ヒトアルブミンを測定した場合の酸素電極の出力電流の
経時的変化を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の方法により被験抗原であるヒ
トアルブミンの濃度と酸素電極の出力電流の変化値との
関係を示すグラフである。
トアルブミンの濃度と酸素電極の出力電流の変化値との
関係を示すグラフである。
１，２，３，１１，１２，１３，２１，２２，２３…本
発明の装置を構成する微孔性部材 ４…試料溶液添加部位 ５…酸素電極
発明の装置を構成する微孔性部材 ４…試料溶液添加部位 ５…酸素電極
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｇ０１Ｎ 27/46 ３３６Ｚ
３３６Ｂ
(72)発明者 山田 幸生
愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41
番地の１ 株式会社豊田中央研究所内
(56)参考文献 特開 平３−202764（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−72173（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−72205（ＪＰ，Ａ)
特開 昭64−59058（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/50 - 33/98
G01N 27/30
G01N 27/46
Claims (14)
- 【請求項１】 特異的結合対の一構成員を、特異的結合
反応と酸化還元反応とにより測定する方法において、酸
化還元触媒により標識された特異的結合対の一構成員又
は結合対の構成員と特異的に結合する物質と、該触媒の
基質とを、酸素電極の感知表面に接触した多孔性支持体
で反応せしめ、前記一構成員を検出又は測定する方法。 - 【請求項２】 前記多孔性支持体が反応液を含んでお
り、該反応液と接触する該酸素電極の感知表面積が１mm
2 以下であり、且つ該酸素電極上の反応溶液の厚さが
０．１mm〜５mmであることを特徴とする請求項１に記載
の方法。 - 【請求項３】 前記特異的結合対が抗原／抗体対、又は
受容体／リガンド対である、請求項１又は２に記載の方
法。 - 【請求項４】 前記基質がグルコースである、請求項１
〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 前記触媒が金属触媒である、請求項１〜
３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 （１）被験物質である特異的結合対の一
方の構成員を含有すると予想される試料溶液と、該特異
的結合対の他方の構成員であって酸化還元触媒により標
識されたものとを溶液中で接触させて、該特異的結合対
の両構成員を結合せしめ、 （２）前記工程（１）からの溶液を、前記標識された構
成員と特異的に結合することができる物質を固定化した
部材と接触せしめることにより、工程（１）において反
応しなかった、標識された特異的結合対の構成員を固定
化除去し、そして （３）前記工程（２）からの、特異的結合対の一方の構
成員である被験物質と該特異的結合対の他方の構成員で
あって標識されたものとの結合物を含有する反応溶液
を、酸素電極の感知表面に接触せしめる、 工程を含んで成る、請求項１〜５のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項７】 （１）被験物質である特異的結合対の一
方の構成員と、該特異的結合対の他方の構成員であって
酸化還元触媒により標識されたもの（標識された構成
員）とを溶液中で接触させて、該特異的結合対の両構成
員を結合せしめ、 （２）前記工程（１）からの溶液を、前記被験物質に特
異的に結合する物質（固定化された特異的結合物質）が
固定化された部材であって酸素電極の感知表面に接触し
ているもの、に供給することにより、前記工程（１）に
おいて被験物質と結合した前記標識された構成員とを、
前記固定化された特異的結合物質を介して前記部材に固
定せしめ、 （３）前記工程（１）において被験物質と結合しなかっ
た前記標識された構成員を、前記工程（２）における酸
素電極の感知表面に接する前記部材から除去し、そして （４）前記工程（２）において酸素電極の感知表面に接
する部材に固定された標識された構成員に、前記酸化還
元触媒の基質を接触せしめる、ことを特徴とする、請求
項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 （１）被験物質である特異的結合対の一
方の構成員（被験物質）（ａ）と、該特異的結合対の他
方の構成員と特異的に結合することができる物質であっ
て酸化還元触媒により標識されたもの（標識された特異
的結合物質）（ｂ）とを混合し、 （２）前記工程（１）からの混合物を、前記特異的結合
対の他方の構成員（ｃ）が固定された部材であって酸素
電極の感知表面と接しているものに供給することによ
り、前記被験物質（ａ）と前記標識された特異的結合物
質（ｂ）とを、前記酸素電極の感知表面に接する部材に
固定化された他方の構成員（ｃ）に対して競合せしめ、 （３）前記工程（２）において固定化された他方の構成
員（ｃ）に結合しなかった被験物質（ａ）及び標識され
た特異的結合物質（ｂ）を除去し、そして （４）前記酸素電極の感知表面に接する部材に前記酸化
還元触媒のための基質を接触せしめる、ことを特徴とす
る、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 （１）被験物質である特異的結合対の一
方の構成員（被験物質）（ａ）と同一の物質であるか又
は該特異的結合対の他方の構成員（ｂ）と特異的に結合
する物質（特異的結合物質）であって、酸化還元触媒に
より標識されたもの（標識された競合物質）（ｃ）を、
部材に固定化した前記特異的結合対の他方の構成員
（ｂ）に結合させておき、 （２）前記部材に、被験物質（ａ）を含有する試料を添
加することにより、該被験物質（ａ）と前記標識された
競合物質（ｃ）とを、前記部材に固定化された他方の構
成員（ｂ）に対して競合せしめることにより、前記標識
された競合物質（ｃ）の一部を被験物質（ａ）の量に依
存する量で遊離せしめ、 （３）前記工程（２）において遊離した標識された競合
物質と結合したままの標識された結合物質とを分離し、
そして （４）前記工程（３）において分離された、遊離した標
識された競合物質又は結合したままの標識された結合物
質のいずれかと、前記酸化還元触媒標識の基質とを、酸
素電極の感知表面と接する部材中で反応せしめる、 ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜６に記載のいずれか１項に
記載の方法を実施するための装置であって、 （イ）被験物質である特異的結合対の一方の構成員とは
異る他方の構成員であり酸化還元触媒により標識されて
いるものを収容する部材であって、その一部分に試料添
加部位を有するもの、 （ロ）前記（イ）における標識された構成員と特異的に
結合することができる物質が固定された部材、及び （ハ）前記酸化還元触媒のための基質を収容し、且つ１
mm2 以下の感知表面を有する酸素電極に接している部
材、を有し、前記部材（イ）の試料添加部位と部材
（ハ）の酸素電極接触部とが部材（ロ）を介して毛細管
作用により液体連絡されていることを特徴とする装置。 - 【請求項１１】 請求項１〜５及び７のいずれか１項に
記載の方法の実施のための装置であって、 （イ）被験物質である特異的結合対の一方の構成員では
ない他方の構成員であって酸化還元触媒により標識され
たものを収容しており、その一部分に試料添加部位を有
する部材、 （ロ）前記被験物質に特異的に結合する物質（固定化さ
れた特異的結合物質）が固定化されている部材であって
１mm2 以下の感知面積を有する酸素電極に接しているも
の、及び （ハ）液体吸収部材、を有し、前記部材（イ）の試料添
加部位と前記液体吸収部材（ハ）とが、部材（ロ）を介
して毛細管作用により液体連絡されていることを特徴と
する装置。 - 【請求項１２】 請求項１〜５及び８のいずれか１項に
記載の方法を実施するための装置であって、 （イ）被験物質（ａ）である特異的結合対の一方の構成
員ではない他方の構成員に対して特異的に結合する物質
であって酸化還元触媒により標識されているもの（標識
された特異的結合物質）（ｂ）を収容しており、その一
部に試料添加部位を有する部材、 （ロ）前記特異的結合対の他方の構成員（ｃ）が固定さ
れた部材であって、１mm2 以下の感知表面を有する酸素
電極により接しているもの、及び （ハ）液体吸収部材を有し、前記部材（イ）の試料添加
部位と前記液体吸収部材（ハ）とが前記部材（ロ）を介
して毛細管作用により液体連結されている、ことを特徴
とする装置。 - 【請求項１３】 請求項１〜５及び９のいずれか１項に
記載の方法を実施するための装置であって、 （イ）被験物質である特異的結合対の一方の構成員（被
験物質）（ａ）ではない他方の構成員（ｂ）が固定され
ている部材、ここで該被験物質（ａ）と同一の物質であ
るか又は該他方の構成員（ｂ）と特異的に結合する物質
（特異的結合物質）であって、酸化還元触媒により標識
されたもの（標識された競合物質）（ｃ）が、前記固定
化された他方の構成員（ｂ）に結合しており、該部材の
一部は試料添加部位を構成している；並びに （ロ）前記酸化還元触媒のための基質を収容し、且つ１
mm2 以下の感知表面を有する酸素電極に接している部
材；を有し、前記部材（イ）の試料添加部位と部材
（ロ）の酸素電極接触部が毛管作用により液体連絡され
ていることを特徴とする装置。 - 【請求項１４】 請求項１〜５及び９のいずれか１項に
記載の方法を実施するための装置であって、 （イ）被験物質である特異的結合対の一方の構成員（被
験物質）（ａ）とは異る他方の構成員（ｂ）が固定され
ている部材、ここで該被験物質（ａ）と同一物質である
か又は該他方の構成員（ｂ）と特異的に結合する物質
（特異的結合物質）であって、酸化還元触媒により標識
されたもの（標識された競合物質）（ｃ）が、前記固定
化された他方の構成員（ｂ）に結合しており、該部材の
試料添加部位を構成しており、且つ該部材は１mm2 以下
の感知表面を有する酸素電極に接している；並びに （ロ）液体吸収部材； を有し、前記部材（イ）の試料添加部位と前記部材
（ロ）が毛管作用により液体連絡していることを特徴と
する装置。
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