FI101830B - Valonkestävä fysikaalinen kehite - Google Patents

Description

101830

Valonkestävä fysikaalinen kehite

Viime vuosien aikana on tuotu käyttöön menetelmiä joissa spesifisten sitovien aineiden ja sidottavissa ole-5 vien aineiden välille muodostuneita aggregaatteja detek-toidaan leimaamalla mainitut aggregaatit suorasti tai epäsuorasti pienikokoisilla metallihiukkasilla, erityisesti kultahiukkasilla. Nämä hiukkaset voidaan olosuhteiden mukaan detektoida esimerkiksi suoralla visuaalisella tarkas-10 telulla tai mikroskooppisin tai spektrofotometrisin menetelmin. "Immuunikultavärjäys(IGS-)menetelmää", "soolihiuk-kasimmuunimääritys(SPIA-)menetelmää" tai niiden erityisso-vellutuksia ja parannuksia niihin kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 313 734, US-patenttijulkaisussa 4 446 238, US-15 patenttijulkaisussa 4 420 558, EP-hakemusjulkaisussa 0 165 633, EP-hakemusjulkaisussa 0 165 634, EP-hakemusjulkaisussa 0 158 746, EP-hakemusjulkaisussa 0 293 947 ja käsikirjasarjassa IBRO, Wiley, New York 1983, s. 347 -372 .

20 Vaikka lähdettiin suhteellisen tuntemattomasta me netelmästä solujen pinta-antigeenien leimaamiseksi, metallihiukkasista on nykyisin tullut laajasti käytettyjä erilaisissa detektointiongelmissa ja/tai kvantitatiiviseen määrittämiseen liittyvissä ongelmissa. Mahdollisuus tar-25 kastella metallihiukkasia suoraan visuaalisesti ja se etu, että muodostunut signaali on pysyvä eikä altis nopealle hajoamiselle, tekee metallihiukkasista kiinnostavan merkkiaineen yksinkertaisia ja nopeita määrityksiä varten. Lisäksi metallimerkkiaineet, edullisesti kultamerkkiaineet, 30 näyttävät radioisotooppimerkkiaineita edullisemmilta ensin mainittujen käyttöön liittyvän hyvin vähäisen terveysvaaran ansiosta.

Seuraavaksi havaittiin, että metallimerkkiaineen, kuten kolloidisen kullan, antamaa signaalia voidaan voi-35 mistaa merkittävästi tekemällä kolloidisille kultamerkki- .101830 2 aineille niin kutsuttu fysikaalinen voimistusmenettely. Tällainen fysikaalinen voimistusmenettely saa aikaan sen, että kullan tyypillinen punertava optinen signaali muuttuu syvänruskeaksi - mustaksi hopeasignaaliksi, jolla paljon 5 suurempi intensiteetti. Mainitussa menettelyssä merkkiaineena käytetyt metallimerkkiaineet katalysoivat kehiteliu-oksessa olevien hopeaionien pelkistymistä. Viimeksi mainittu tapahtuma johtaa metallisen hopeakerroksen spesifiseen saostumiseen metallihiukkasen kohdalle. Siten muodos-10 tuneet metalliset hopeahiukkaset katalysoivat puolestaan fysikaalisessa kehiteliuoksessa olevien hopeaionien pelkistymistä edelleen, jolloin syntyy autokatalyyttinen prosessi .

Alalla tunnetut fysikaaliset kehiteliuokset koostu-15 vat yleensä liuoksesta, joka sisältää liukoista metalli-suolaa, kuten hopeanitraattia, pelkistintä, kuten hydroki-nonia, sopivaa puskuria ja mahdollisesti kompleksinmuodostajaa metalli-ionien sitomiseksi ja niiden pelkistymis-herkkyyden vähentämiseksi.

20 Vaikka näiden alalla tunnettujen fysikaalisten ke hitteiden käyttö johtaa voimistuneeseen signaaliin, niihin liittyy joukko haittapuolia. On itse asiassa hyvin tunnettua, että hopeaionit voivat muodostaa valolle herkkiä ho-peasuoloja, kuten hopeabromidia ja hopeakloridia, jotka 25 pelkistyvät helposti metalliseksi hopeaksi valon vaikutuksesta ja käynnistävät autokatalyyttisen prosessin. Tämä epäspesifinen kidealkioiden itsemuodostumisprosessi edistää taustan esiintymistä merkittävässä määrin. Se voi olla häiritsevän voimakas olosuhteissa, joissa valo on voima-30 kas, esimerkiksi tarkasteltaessa tutkittavia näytteitä valomikroskoopilla, tai myös fysikaalisen kehitysprosessin ollessa hidas ja tutkittavan näytteen ollessa pitkiä aikoja alttiina valolle.

Niinpä tämän keksinnön päämääränä on tarjota käyt-35 töön herkkä ja käytännöllinen fysikaalinen kehite käytet- 101830 3 tavaksi erilaisissa metalleihin perustuvissa määrityksissä, joka kehite on valonkestävä eikä aiheuta epätoivottua metallihiukkasten epäspesifistä saostumista.

Tämä keksintö koskee fysikaalista kehitettä, joka 5 on hopeaionien, pelkistimen, herkkyyttä vähentävän aineen ja haluttaessa puskurijärjestelmän ja yhden tai useamman apuaineen vesiliuos.

Tarkemmin sanottuna keksintö koskee fysikaalista kehitettä, joka on vesiliuos, joka sisältää hopeaioneja, 10 herkkyyttä vähentävää ainetta eli 6-etoksi-l-metyyli-2-(3-nitrostyryyli)kinoliniummetyylisulfonaattia, mooliylimää-rän kompleksinmuodostajaa hopeaioneihin nähden, pelkis-tintä ja mahdollisesti puskurijärjestelmän ja yhtä tai useampaa apuainetta.

15 Lisäksi keksintö koskee menetelmää vähintään yhden spesifisen sitovan aineen ja sitä vastaavan sidottavissa olevan aineen muodostaman aggregaatin yhden tai useamman komponentin määrittämiseksi kvalitatiivisesti ja/tai kvantitatiivisesti, jolloin menetelmässä leimataan mainitun 20 aggregaatin vähintään yksi komponentti merkkiaineella ja saatetaan mainittu aggregaatti kosketukseen fysikaalisen kehitteen kanssa, jolloin merkkiaineen vaikutuksesta muodostuu hopeahiukkanen, joka voidaan määrittää kvalitatiivisesti. Menetelmälle on tunnusmerkillistä, että fysikaa-* 25 linen kehite on edellä määritelty tämän keksinnön mukainen fysikaalinen kehite, joka on hopeaionien, herkkyyttä vähentävän aineen ja pelkistimen vesiliuos.

Tämän keksinnön kohteena on lisäksi kaksiosainen pakkaus patenttivaatimuksen 1 mukaisen fysikaalisen kehit-30 teen valmistamiseksi sekoittamalla pakkauksen aineosat. Pakkaus sisältää a) vesiliuoksen, joka sisältää pelkistintä ja mahdollisesti puskurijärjestelmää ja yhtä tai useampaa apuainetta; ja 4 101830 b) vesiliuoksen, joka sisältää hopeaioneja, herkkyyttä vähentävää ainetta, 6-etoksi-l-metyyli-2-(3-nitro-styryyli)kinoliniummetyylisulfonaattia, mooliylimäärän kompleksinmuodostajaa hopeaioneihin nähden, pelkistintä ja 5 mahdollisesti puskurijärjestelmän ja yhtä tai useampaa apuainetta. monikäyttöisiä tuotteita, kuten testivä-lineistöjä, jotka soveltuvat edellä mainittujen menetelmien toteuttamiseen.

Tämässä keksinnössä vaikutetaan hopeaioneihin pe-10 rustuvien perinteisten fysikaalisten kehitteiden valon-herkkyyden vastaisesti lisäämällä kehitteeseen herkkyyttä vähentävää ainetta, joka on 6-etoksi-l-metyyli-2-(3-nit-rostyryyli)kinoliniummetyylisulfonaatti, joka tunnetaan nimellä Pinakryptol Yellow1*.

15 Tämän keksinnön mukaisessa fysikaalisessa kehit teessä käytettäviin pelkistimiin kuuluvat kaikki aineet, jotka pelkistävät fysikaalisesta kehitteestä peräisin olevia hopeaioneja aktiivisen kohdan lähellä. Mainitut pel-kistimet muodostavat edullisesti stabiileja liuoksia yh-20 dessä parannetun fysikaalisen kehitteen aineosien kanssa. Pelkistiminä voidaan erityisesti mainita 1,2-dihydroksi-bentseeni, 1,4-dihydroksibentseeni (hydrokinoni), 4-metyy-liaminofenolisulfaatti (MetolR) , 4-aminofenoli, 1,4-diami-nobentseeni, 1,2-diaminobentseeni, N-(4-hydroksifenyyli)-25 glysiini, 2,4-diaminofenoli, l-fenyyli-3-hydroksipyratsoli (PhenidoneR) tai niiden seokset. Parannetun fysikaalisen kehitteen muina apuaineina voidaan mainita puskurit, säilytteet, esimerkiksi antioksidantit tai orgaaniset stabilointiaineet, nopeudensäätelijät, bakterisidit tms., kuten 30 esimerkiksi natriumsulfiitti, natriumvetysulfiitti, nat-·· riumsitraatti tms.

Soveltuvia pH:ta säätäviä aineita ovat esimerkiksi etikkahappo, sitruunahappo, natriumhydroksidi tai minkä tahansa edellä mainitun aineen suolat tai puskurijärjes-35 telmä, joka perustuu tris(hydroksimetyyli)aminometääniin.

5

10183C

Fysikaalisen kehitteen pH on edullisesti noin 5-9, erityisesti noin 6-8. Fysikaalisen kehitteen pH rajoitetaan yleensä alueelle, jolla spesifinen sitova aine ja vastaava sidottavissa oleva aine ovat stabiileja.

5 Hopeaionien, pelkistimen ja herkkyyttä vähentävän aineen lisäksi edullinen fysikaalinen kehiteliuos sisältää myös ylimäärin kompleksinmuodostajaa metalli-ionien sitomiseksi ja niiden tekemiseksi vähemmän alttiiksi pelkistymiselle. Edullisia kompleksinmuodostajia tämän keksinnön 10 yhteydessä käytettäviksi kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 0 293 947, ja niihin kuuluvat pyridiini, aminopyridiini, nikotiiniamidi, kinoliini, imidatsoli, histidiini, bents-imidatsoli, pyratsoli, puriini ja vastaavat aromaattiset heterosykliset rengasjärjestelmät.

15 Eräässä esimerkissä tavasta tämän keksinnön mukai sen fysikaalisen kehitteen valmistamiseksi liuotetaan tai suspendoidaan herkkyyttä vähentävä aine vesiliuokseen, joka sisältää hopeaioneja, pelkistintä, puskuria ja mahdollisia apuaineita. Valmiissa liuoksessa herkkyyttä vä-20 hentävän aineen suhde hopeaioneihin on noin 50 - 0,5, erityisesti noin 50-5 tai 35 - 15 g moolia kohden hopeaioneja. Hopeaionikonsentraatio on alueella 0,001 - 0,1, erityisesti noin 0,005 - 0,5 tai 0,07 - 0,3 mol/1.

Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa fysikaalinen 25 kehite valmistetaan sekoittamalla kaksi stabiilia ja nestemäistä liuosta. Toinen liuos, jota jäljempänä kutsutaan voimistajaksi, käsittää hopeaioneja, herkkyyttä vähentävää ainetta, hopeaioneihin nähden moolisen ylimäärän kompleksinmuodostajaa ja mahdollisesti puskurijärjestelmää. Tar-30 kemmin määriteltynä kompleksinmuodostajan mooliylimäärä ·; hopeaioneihin nähden on 2- - 100-kertainen, edullisesti noin 20- - 100-kertainen moolimäärä. Toinen liuos, jota jäljempänä kutsutaan initiaattoriksi, käsittää pelkistintä ja mahdollisesti puskurijärjestelmää sekä antioksidanttia 35 ja/tai orgaanista stabilointiainetta, kuten esimerkiksi 6 101830 natriumsulfiittia, natriumvetysulfiittia tms. Sekä voimistaja että initiaattori laimennetaan edullisesti siten, että sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet kumpaakin liuosta saadaan edellä kuvatun kaltainen valonkestävä fysikaa-5 linen kehite. Joissakin tapauksissa voimistaja ja initiaattori voidaan valmistaa kuivista aineosistaan lisäämällä asianmukainen määrä vettä. Voimistajan ja/tai initiaatto-rin valmistuksen helpottamiseksi voi olla asianmukaista liuottaa herkkyyttä vähentävä aine ensin pieneen määrään 10 orgaanista liuotinta, kuten N,N-dimetyyliformamidia, N,N-dimetyyliasetamidia tms., ja sekoittaa siten saatuun orgaaniseen liuokseen hopeaioneja sisältävä vesiliuos. Voimistajan pH:n tulisi olla suunnilleen alueella 5 - 9, edullisesti noin 6,5 - 8,5. Initiaattorin pH:n tulisi olla 15 alueella 2-7, edullisesti noin 3,5 - 5,5.

Vaikka herkkyyttä vähentävien aineiden, kuten Pina-kryptol YellowinR, käyttö hopeahalogenidiemulsioissa on tunnettua, on yllättävää, että Pinakryptol Yellow* pystyy selektiivisesti estämään epäspesifisen kideytimien itse-20 muodostuksen fysikaalisessa kehiteliuoksessa ja muodostamaan valonkestävän vesiliuoksen vaikuttamatta haitallisesti nopeuteen, jolla metallia saostuu merkkiaineelle. Niinpä tämä keksintö saa aikaan merkkiainespesifisen pelkistymisen nopeuden ja kiteytymiskeskusten itsemuodostusnopeu-25 den suhteen kasvun monikertaiseksi. Mainitsemisen arvoisena seurauksena siitä on, että tämän keksinnön mukainen fysikaalinen kehite voi reagoida loppuun asti, ts. kaikkien hopeaionien loppumiseen asti, minkä jälkeen sekä merkkiainespesifinen kehittyminen että kideytimien itse-30 muodostus - jos sitä tapahtuu - vähenevät nopeasti ja lop-' puvat. Tämä tekee fysikaalisesta kehitysmenettelystä vä hemmän riippuvaisen ulkoisista ja menettelyyn liittyvistä parametreista. Tarkemmin määriteltynä tämä merkitsee sitä, että enää tarvitse ajastaa kehitysprosessia sen pysäyttä-35 miseksi epäspesifisen metallin saostumisen aiheuttaman 101850 7 taustakohinan alkaessa. Tämän keksinnön mukaisten koostumusten yhteydessä kehitysprosessi voi mennä loppuun ja se voidaan siksi jättää valvomatta.

Merkkiainespesifisen pelkistymisen nopeuden ja epä-5 spesifisen kidekeskusten itsemuodostusnopeuden välistä kasvanutta suhdetta voidaan hyödyntää moni tavoin. Herkkyyttä voidaan suurentaa pitämällä merkkiaine pidempään kosketuksessa fysikaalisen kehitteen kanssa tai merkkiainespesif isen kehittymisen nopeutta voidaan suurentaa melo nettämättä joustavuutta, jonka tarjoaa turva-aika sen hetken, jolloin merkkiaine on kehittynyt optimaalisesti, ja sen hetken, jolloin kideytimien itsekehitys alkaa aiheuttaa voimistunutta taustaa, välillä. Joissakin tapauksissa voidaan toteuttaa kohonneen kokonaisnopeuden ja parantu-15 neen herkkyyden yhdistelmä. Nopeutta ja herkkyyttä voidaan säätää muuttamalla hopeaionipitoisuutta ja hopeaionien, erityisesti niiden ligandien, luonnetta, herkkyyttä vähentävä aine, pelkistin ja/tai kehiteliuoksen pH:ta. Hopeaio-nipitoisuuden suurentaminen ja/tai pH:n nostaminen ja/tai 20 voimakkaamman pelkistimen käyttö johtaa esimerkiksi nopeutuneeseen kehitysmenettelyyn. Kehitysmenettelyä voidaan puolestaan hidastaa alentamalla hopeaionipitoisuutta ja/tai alentamalla pH:ta ja/tai käyttämällä heikompaa pel-kistintä. Nopeutta voidaan säätää, erityisesti hiukkas-25 kooltaan alle 5 nm:n merkkiaineiden ollessa kyseessä, hyvin suuresta (10 - 20 s) hyvin pieneen (vähintään 30 min). Kehitysaika säädetään edullisesti suunnilleen alueelle 10 s - 2 min, erityisesti 10 s - 1 min.

Edellä kuvattuja fysikaalisia kehitteitä käytetään 30 edullisesti menetelmissä vähintään yhden spesifisen sito-van aineen ja sitä vastaavan sidottavissa olevan aineen muodostaman aggregaatin yhden tai useamman komponentin määrittämiseksi kvalitatiivisesti ja/tai kvantitatiivisesti, jossa menetelmässä leimataan mainitun aggregaatin vä-35 hintaan yksi komponentti metallimerkkiaineella, joka kata- 101850 8 lysoi suorasti tai epäsuorasti fysikaalisesta kehitteestä peräisin olevien hopeaionien pelkistymistä.

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäväksi tarkoitettu merkkiaine määrittää minkä tahansa hiuk-5 kasen, joka pystyy katalysoimaan metalli-ionien pelkistymistä, joka johtaa vastaavien metallihiukkasten saostumi-seen mainitun merkkiaineen kohdalle.

Mainittuja merkkiaineita ovat metallit, metalliyh-disteet tai polymeerit, jotka on päällystetty tai kylläs-10 tetty metalleilla tai metalliyhdisteillä, jotka pystyvät suorasti tai epäsuorasti katalysoimaan metalli-ionien pelkistymistä pinnalleen. Esimerkkeinä tällaisista metalleista voidaan mainita kulta, hopea, tallium, platina ja palladium samoin kuin kupari, nikkeli tms., joista kulta on 15 edullinen. Esimerkkeinä metalliyhdisteistä voidaan mainita metallikompleksit tai -kelaatit ja sulfidit. Metalleilla tai metalliyhdisteillä päällystetyillä polymeereillä on samanlaiset ominaisuudet kuin metalleilla tai metalliyhdisteillä, mutta niiden yhteydessä voidaan tehdä koon, 20 tiheyden ja metallipitoisuuden yhdistelmä optimaaliseksi. Tässä edullisessa menetelmässä käytettäväksi tarkoitettu merkkiaine tulisi valita siten, että spesifiset sitovat aineet tai niitä vastaavat sidottavissa olevat aineet voidaan kiinnittää merkkiaineeseen niiden menettämättä af-·; 25 finiteettiaan vastapuolensa suhteen.

Erityisen edullisia merkkiaineita käytettäviksi tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä ovat joko (i) kolloidiset metallihiukkaset, mahdollisesti metalleja tai me-tallisulfideja sisältävä sooli; tai (ii) metallikelaatit, 30 erityisesti etyleenidiaminotetraetikkahappo-(EDTA-) tai dietyleenitriamiinipentaetikkahappo(DTPA-)ryhmiä sisältävät kelaatit; tai metalleilla tai metallisulfideilla mahdollisesti kyllästetyt polymeerit, esimerkiksi bentsidii-nijohdannaisten polymeraatiotuotteet, kuten esimerkiksi 35 diaminobentsidiinipolymeerit.

101830 9

Mainittu edullinen menetelmä voidaan toteuttaa kätevästi immobilisoimalla spesifinen sitova aine tai sitä vastaava sidottavissa oleva aine suorasti tai epäsuorasti kiinteälle kantajalle, saattamalla kantaja kosketukseen 5 vastapuolen kanssa, joka on leimattu merkkiaineella, joka katalysoi fysikaalisen kehitteen metalli-ionien pelkistymistä, ja lisäämällä fysikaalista kehitettä ennen sitoutuneiden ja vapaiden leimattujen komponenttien erottamista tai sen jälkeen, jolloin muodostuneet metallihiukkaset 10 määritetään reaktion aikana tai riittävän reaktioajan kuluttua kvantitatiivisesti ja/tai kvalitatiivisesti tutkittavasta näytteestä ja/tai siitä saaduista fraktioista, jolloin saadaan kvalitatiivinen ja/tai kvantitatiivinen osoitus määritettävistä yhdestä tai useammasta komponen-15 tista. Joissakin tapauksissa voi olla edullista saattaa immobilisoitua sidottavissa olevaa ainetta sisältävä kantaja kosketukseen mainitulle sidottavissa olevalle aineelle spesifisen ensimmäisen sitovan aineen kanssa, jolloin muodostuu aggregaatti, ja saattaa sen jälkeen siten muo-20 dostettua aggregaattia sisältävä kantaja kosketuksen mainitulle ensimmäiselle sitovalle proteiinille spesifisen toisen sitovan proteiinin kanssa, joka on leimattu merkkiaineella. Kuvattu menetelmä soveltuu erityisesti immuuni-kemiallisten komponenttien, kuten hapteenien, antigeenien 25 ja vasta-aineiden, määrittämiseen.

Tätä keksintöä voidaan lisäksi käyttää kiinteälle kantajalle suoraan immobilisoidun ja edellä mainitun merkkiaineen kanssa yhteen liitetyn akseptoriaineen, kuten proteiinin tai nukleiinihapon, kvantitatiiviseen ja/tai 30 kvalitatiiviseen määrittämiseen.

Tämän keksinnön mukaisen edullisen menetelmän mukaisesti määritykset voidaan toteuttaa homogeenisina tai heterogeenisina. Homogeeniset määritykset ovat erityisen yksinkertaisia toteuttaa, mutta ne vaativat mitattavissa 35 olevan muutoksen vastaanotetussa signaalista, joka tulee 101850 10 joko leimatussa reagenssissa tai leimatun reagenssin ja määritettävien hiukkasten välille muodostuneessa leimatussa aggregaatissa olevista merkkiaineista. Tapauksissa, joissa tällaisen eron havaitseminen ei ole mahdollista, 5 joudutaan tekemään heterogeenisia määrityksiä.

Homogeeniset määritykset ovat edullisia siitä syystä, ettei ole välttämätöntä erottaa fysikaalisesti toisistaan sitoutuneita ja sitoutumattomia leimattuja spesieksiä, mikä vähentää määrityksen tekemiseen tarvittavien 10 vaiheiden lukumäärää. Leimatun komponentin ja sitä vastaavan sitoutuvan vastapuolen välinen reaktio aiheuttaa mitattavissa olevan muutoksen merkkiaineen osallistumisessa signaalin synnyttävään ryhmittymään tai muuntaa mainittua ryhmittymää, joka muutos on välttämätön homogeenisen 15 määrityksen tekemiseksi. Merkkiaineiden jakautuminen si toutuneen ja sitoutumattoman spesieksen välillä voidaan osoittaa mainittujen merkkiaineiden kyvyttömyydellä tai muuttuneella kyvyllä vaikuttaa kehityksen jälkeen syntyvään signaaliin, kun ne ovat läsnä sitoutuneessa spesiek-20 sessä.

Homogeeninen määritys voidaan kätevästi tehdä alalla tunnetuin menettelyin, kuten esimerkiksi kompetetiivi-seen sitoutumiseen perustuvalla menetelmällä. Analysoitavaa ainetta sisältävä näyte yhdistetään analysoitavan ai-: 25 neen sitoutuvaan vastapuoleen, leimattuun reagenssiin, joka sisältää analysoitavaan aineeseen tai sen spesifisesti sitoutuvaan analogiin kytkettyä merkkiainetta, ja fysikaalisen kehitteeseen, joka tarvitaan muuttamaan merkkiaine itse signaalin synnyttäväksi ryhmittymäksi. Vaihtoeh-30 toisesti voidaan tehdä peräkkäismääritys, jossa näyte ja analysoitavaa ainetta sitova vastapuoli yhdistetään ensin ja lisätään sen jälkeen detektointiainereagenssi.

Monissa tapauksissa ei ole mahdollista tehdä homogeenisia määrityksiä. Näissä tapauksissa voi heterogeeni-35 nen määritys olla erityisen houkutteleva vaihtoehto. Ylei- 101830 11 sesti esitettynä heterogeeninen määritysjärjestelmä sisältää vähintään kaksi perusrakenneosaa ja fysikaalisen kehitteen, jotka yhdistetään samanaikaisesti tai peräkkäin, ts. analysoitavan aineen, joka on määrä detektoida, merk-5 kiaineella leimatun sitoutuvan vastapuolen ja fysikaalisen kehitteen, joka tarvitaan muutamaan merkkiaine itse signaalin synnyttäväksi ryhmittymäksi. Leimattu reagenssi sitoutuu, tarvittaessa asianmukaisten yhden tai useamman inkubointijakson jälkeen, vastaavaan detektoitavaan sitou-10 tuvaan aineeseen, jolloin sitoutuneen spesieksen suhde sitoutumattomaan spesiekseen on läsnä olevan analysoitavan aineen määrän funktio. Sitoutunut ja sitoutumaton spesies erotetaan fysikaalisesti ja määritetään merkkiainemäärä, joka on läsnä toisessa niistä.

15 Alalla tunnetaan erilaisia keinoja sitoutumisreak- tioiden toteuttamiseksi. Mainittu erotus voidaan tehdä tavanomaisin menetelmin, kuten esimerkiksi käyttämällä kiinteään faasiin sidottua vasta-ainetta tai antigeeniä, toista vasta-ainetta tai kiinteään faasiin sidottua toista 20 vasta-ainetta tai käyttämällä immunokompleksisaostusainet- ta, adsorbointiainetta tms. Mainittuihin sitoutumisreak-tioihin voivat kuulua esimerkiksi niin kutsuttu kompete-tiiviseen sitoutumiseen perustuva menetelmä, peräkkäiskyl-lästysmenetelmä, kerrosmenetelmä tms.

·; 25 Edullisia määrityksiä tämän keksinnön mukaisella menetelmällä tehtäviksi ovat heterogeeniset määritykset, jotka yleensä perustuvat siihen periaatteeseen, että spesifisen sitovan proteiinin ja sidottavissa olevien aineiden välille muodostunut leimattu aggregaatti immobilisoi-30 daan jossakin vaiheessa sillä tavalla, että mahdolliset reagoimattomat hiukkaset voidaan pestä pois, minkä jälkeen • l immobilisoidut hiukkaset detektoidaan "in situ" tai haluttaessa irrotuksen jälkeen missä tahansa muussa faasissa.

Eräässä erityisen edullisessa suoritusmuodossa de-35 tetoitava sidottavissa oleva aine, joka voi olla epäpuh- 101830 12 taassa tutkittavassa näytteessä tai siitä saadussa puhdistetussa tai osittain puhdistetussa fraktiossa, immobili-soidaan sopivalle immobilisointialustalle ennen komplek-sointiaan leimatun sitovan aineen kanssa, joka on spesifi-5 nen mainitulle sidottavissa olevalle aineelle.

Sidottavissa olevan aineen immobilisointi voidaan tehdä käyttämällä tavanomaisia menetelmiä, esimerkiksi laittamalla annos tutkittavaa näytettä täpläksi immobilisointialustalle tai upottamalla viimeksi mainittu tutkit-10 tavaan näytteeseen ja tekemällä sitten kuivaus ja mahdollisesti immobilisoitumattoman materiaalin peseminen pois. Tämä on niin kutsuttu suora menetelmä. Tämän menetelmän yhteydessä voidaan immobilisointialustoina käyttää erilaisia materiaaleja, yleensä polymeerisiä materiaaleja, kuten 15 nitroselluloosaa, diatsobentsyylioksimetyylilla (DBH:11a) ja diatsofenyylitioeetterillä (DPT:llä) muunnettua sellu-loosapaperia, paperia, syanogeenibromidilla aktivoitua paperia tai selluloosa-asetaattia, agaroosia, nailonia, muoveja tms., jotka voivat olla missä tahansa muodossa, 20 joka on kätevä määritysmenetelmän kannalta, esimerkiksi levyinä, helminä, aaltolevyinä, puikkoina tms.

Kantaja saatetaan sitten kosketukseen leimatun sitovan aineen kanssa olosuhteissa, jotka mahdollistavat aggregaatin muodostumisen sitovan aineen ja vastaavien 25 sidottavissa olevien aineiden välille. Tämän seurauksena kohtiin, joihin sidottavissa olevaa ainetta on immobili-soitunut, immobilisoituu vuorostaan merkkiaineita määrinä, jotka ovat verrannollisia immobilisoidun sidottavissa olevan aineen pitoisuuteen.

30 Tämän keksinnön eräässä variantissa immobilisoidun sidottavissa olevan aineen annetaan ensin reagoida ensimmäisen sitovan aineen kanssa, joka on sille spesifinen, ja saatetaan sitten siten immobilisoitu faasi kosketukseen merkkiaineiden kanssa, jotka on liitetty toiseen sitovaan 13 101650 aineeseen, joka on spesifinen mainitulle ensimmäiselle sitovalle aineelle.

Koska edellä kuvatusta immobilisointimenetelmästä puuttuu selektiivisyys ja spesifisyys, käytetään suoraa 5 menetelmää tavallisesti suhteellisen puhtaiden tai puhdistettujen tutkittavien näytteiden tai fraktioiden yhteydessä. Koostumukseltaan monimutkaisempien näytteiden ollessa kyseessä suora menetelmä on usein vähemmän sopiva, koska suurina ylimäärinä läsnä olevan epätoivottavan materiaalin 10 epäspesifinen immobilisoituminen häiritsee määrityksen herkkyyttä ja spesifisyyttä.

Tämän ongelman välttämiseksi, mikä on tärkeää ru-tiinianalyysien yhteydessä, voidaan käyttää epäsuoraa eli niin kutsuttua kerrosmenetelmää. Tässä menetelmässä puh-15 distettu tai rikastettu ensimmäinen spesifinen sitova aine immobilisoidaan kiinteälle kantajalle. Viimeksi mainittu saatetaan kosketukseen tutkittavan näytteen kanssa olosuhteissa, jotka mahdollistavat vastaavien sidottavissa olevien aineiden kompleksoitumisen, jotka aineet tulevat si-20 ten itse immobilisoiduiksi. Tutkittavan näytteen poistamisen ja kantajan pesun jälkeen viimeksi mainittu saatetaan kosketukseen suspension kanssa, jotka sisältävät markke-reita, jotka on päällystetty toisilla spesifisillä sitovilla aineilla, joilla on kyky sitoutua immobilisoidun . 25 sidottavissa olevan aineen kompleksoitumattomiin kohtiin.

Suoraviivaisin esimerkki suoritusmuodosta, johon tätä keksintöä voidaan soveltaa, on läpivirtausympäristö, joka koostuu kiinteään faasiin suorasti tai epäsuorasti immobilisoidusta sidottavissa olevasta aineesta ja neste-30 faasista, joka liikkuu suhteessa kiinteään faasiin. Sen : mukaan, mihin suuntaan nestefaasi virtaa suhteessa kiinte ään faasiin, voi tämä kiinteä faasi olla nestettä läpäisevä tai läpäisemätön. Kiinteänä faasina voidaan käyttää esimerkiksi läpäisevää kalvoa, joka mahdollistaa nestefaa-35 sin kohtisuoran virtauksen mainitun kalvon läpi. Läpäise- 101830 14 mätön kiinteää faasia voidaan puolestaan käyttää pinnan suuntaisen nestevirtauksen yhteydessä.

Tämän suoritusmuodon ensimmäisen vaiheen aikana leimattua spesifistä sitovaa ainetta sisältävä nestefaasi 5 saatetaan kosketukseen kiinteälle faasille immobilisoidun sidottavissa olevan aineen kanssa. Tämä nestefaasin liikkuminen suhteessa kiinteään faasiin voi olla jatkuvaa tai epäjatkuvaa ja sen tulee olla sellaista, että näiden kahden faasin välinen kontaktiaika mahdollistaa immobilisoi-10 dun sidottavissa olevan aineen ja leimatun spesifisen sitovan aineen välisen sitoutumisen tapahtumisen. Tämän si-toutumisprosessin ei kuitenkaan välttämättä tarvitse saavuttaa kyllästyspistettään. Paine-ero nestefaasin lähteen ja sen määränpään välillä voidaan aikaansaada monin ta-15 voin. Kiinteänä faasina toimivan läpäisevän kalvon ollessa kyseessä kohtisuora virtaus voidaan saada aikaan saattamalla kalvon toinen puoli kosketukseen nestettä imevän materiaalin kanssa ja tuomalla nestefaasia toiselle puolelle. Läpäisemättömän kiinteän faasin ollessa kyseessä 20 nestefaasin pinnan suuntainen virtaus voidaan saada aikaan pumpulla.

Toisessa vaiheessa käytetään nestefaasina tämän keksinnön mukaista parannettua fysikaalista kehitettä. Merkkiainespesifisen pelkistymisen nopeuden ja kideytimien , 25 itsemuodostusnopeuden suhteen maksimoimiseksi voi olla asianmukaista pitää fysikaalisen kehitteen kaksi komponenttia, initiaattori ja voimistaja, erillään käyttöä välittömästi edeltävään hetkeen asti. Tulisi kuitenkin korostaa sitä, että tekniikan tasoon verrattuna stabiileja 30 fysikaalisen kehitteen liuoksia voidaan valmistaa sekoittamalla initiaattori ja voimistaja. Joissakin tapauksissa voi olla edullista lisätä edistäjä ja initiaattori peräkkäin ja muodostaa parannettu fysikaalinen kehite "in situ". Edellä esitettyjen näkökohtien valossa tämän kek-35 sinnön mukainen fysikaalinen kehite voidaan helposti opti- 101830 15 moida käytettävän merkkiaineen, vaadittavan herkkyyden ja kiinteän faasin ja nestemäisen fysikaalisen kehitteen kontaktia jän suhteen.

Edullisessa läpivirtaussuoritusmuodossa kyseisten 5 kahden stabiilin nestekomponentin sekoitus ja tuloksena olevan parannetun fysikaalisen kehitteen käyttö tulisi yhdistää yhdeksi toimenpiteeksi. Virtaavan suojatun fysikaalisen kehitteen käytöllä on kaksoisvaikutus. Aluksi neste pesee kiinteältä faasilta pois kaikki jäljellä ole-10 vat leimatut spesifiset sitovat aineet, jotka ovat jääneet sitoutumatta tai sitoutuneet vain löyhästi ensimmäisen vaiheen aikana. Koska merkkiaineen fysikaalinen kehitys on asteittain etenevä prosessi, tämä materiaali tulee pestyksi pois kiinteältä faasilta ennen signaalin tulemista ha-15 väittäväksi. Jäljelle jäävät, sitoutuneet leimatut spesifiset sitovat aineet synnyttävät näkyvän signaalin ollessaan edelleen kosketuksessa suojatun fysikaalisen kehitteen kanssa. Kiinteälle faasille lisättävän kehitteen virtaus ja tilavuus voidaan valita siten, että taataan riit-20 tävän pitkä kontaktiaika immobilisoitujen leimattujen yhdisteiden optimaalisen detektoinnin kannalta ja kyllin lyhyt kontaktiaika kideytimien itsemuodostuksen aiheuttaman epäspesifisen pelkistymisen välttämiseksi kiinteällä faasilla. Nämä ajat voivat olla tyypillisesti muutamasta : 25 sekunnista muutamiin minuutteihin.

Muodostuneiden metallihiukkasten detektointi reak-tioseoksen tietystä faasista voi tapahtua lukuisilla menetelmillä, jotka ovat sinänsä tunnettuja. Mainitut menetelmät perustuvat muodostuneiden metallihiukkasten määrään 30 ja/tai fysikaalisiin ominaisuuksin, edullisesti metallihiukkasten aikaansaamaan sirontaan ja adsorptioon. Esimerkkeinä näistä menetelmistä voidaan mainita spektrofoto-metriset menetelmät, kuten densitometria, joka on edullinen haluttaessa kvantitatiivisia määrityksiä. Aikaansaadun 35 korkean herkkyyden ansiosta hiukkaset voidaan kuitenkin 101830 16 havaita helposti visuaalisesti, mahdollisesti käyttämällä mikroskooppia.

Spesifiset sitovat aineet, joita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa edullisessa menetelmässä, voi-5 vat olla luonteeltaan monenlaisia, mutta ne ovat monissa tapauksissa vasta-aineita määrätyille antigeeneille tai hapteeneille. Eräinä esimerkkeinä muista spesifisistä sitovista aineista kuin vasta-aineista voidaan mainita faa-git, jotka on mahdollisesti tehty kemiallisesti tai ge-10 neettisesti sopiviksi sitomaan molekyyli- tai solumateri-aaleja, lektiinit, jotka sitovat spesifisesti glykoprote-iineja, Staphylococcus aureus -proteiini A, joka sitoo spesifisesti eri eläinlajien immonoglobuliineja, ja geenien identifiointiin tarkoitetut DNA- tai RNA-koettimet.

15 Yleisesti ilmaistuna voidaan hyödyntää mitä tahansa muutakin molekyylien välistä vuorovaikutusta, jolla on riittävä spesifisyys ja affiniteetti. Vasta-aineet voivat olla po-lyklonaalisia tai monoklonaalisia.

Yleisen luonteensa kannalta katsottuna tämän kek-20 sinnön mukaisilla menetelmillä on äärimmäisen laaja käyttöalue. Niitä voidaan periaatteessa käyttää minkä tahansa edellä mainitulla merkkiaineella leimattavissa olevan aineen kvalitatiiviseen ja/tai kvantitatiiviseen määrittämiseen. Tällaisia aineita ovat esimerkiksi, mainittuihin 25 kuitenkaan rajoittumatta, solupinta- ja kudosantigeenit, elävien organismien erittämät tai niistä peräisin olevat biologiset aineet, erityisesti biologisissa nesteissä, kuten syljessä, imunesteessä, veressä ja sen fraktioissa, kuten plasmassa ja seerumissa, virtsassa, selkäydinnes-30 teessä, lapsivedessä tms. esiintyvät biologiset aineet. Detektoitavissa oleviin aineisiin kuuluvat proteiinit, polypeptidit, peptidit, entsyymit, hormonit, rakenneprote-iinit, nukleiinihapot, vitamiinit, polysakkaridit, toksiinit, alkaloidit, glykoproteiinit, hapteenit, metabolia-35 tuotteet, farmakologiset aineet, pestisidit, saasteet, 101850 17 steroidit ja mitkä tahansa muut molekyylit, joille on olemassa spesifinen sitova vastapuoli biologisissa järjestelmissä tai sellainen on syntetisoitavissa.

Edustaviin esimerkkeihin analysoitavista proteiini-5 ryhmistä kuuluvat protamiinit, mukoproteiinit, glykoprote-iinit, globuliinit, albumiinit, skleroproteiinit, fosfo-proteiinit, histonit, lipoproteiinit, kromoproteiinit ja nukleoproteiinit. Esimerkkejä yksittäisistä proteiineista ovat prealbumiini, Oi-lipoproteiini, ihmisen seerumialbu-10 miini, c^-hapan glykoproteiini, Äi-antitrypsiini, cti-glyko-proteiini, transkortiini, tyroksiinia sitova globuliini, haptoglobiini, hemoglobiini, myoglobiini, seruloplasmiini, a2-lipoproteiini, a2-makroglobuliini, β-lipoproteiini, erytropoietiini, transferriini, hemopeksiini, fibrinogee-15 ni, immunoglobuliinit, kuten IgG, IgM, IgA, IgD ja IgE, joista IgG on edullinen, ja niiden fragmentit, esimerkiksi Fc, Fab ja F (ab)2, komplementtitekijät, prolaktiini, veren hyytymistekijät, kuten fibrinogeeni, trombiini jne., insuliini, melanotropiini, somatotropiini, tyrotropiini, fol-20 likkelia stimuloiva hormoni, luteinisoiva hormoni, gona- dotropiini, kilpirauhasta stimuloiva hormoni, istukan lak-togeeni, sisätekijä, transkobalamiini, seerumientsyymit, kuten alkalinen fosfataasi, maitohappodehydrogenaasi, amy-laasi, lipaasi, fosfataasit, kolinesteraasi, glutamiiniok-25 soetikkahappotransaminaasi, glutamiinipalorypälehappotran- saminaasi ja uropepsiini, endorfiinit, enkefaliinit, pro-tamiini, kudosantigeenit, bakteeriantigeenit ja virusanti-geenit, kuten hepatiittiin liittyvät antigeenit (esimerkiksi HBsAg, HBcAg ja HBgAg) .

30 Edustaviin esimerkkeihin analysoitavista haptee- neista kuuluvat seuraavat yleisryhmät: lääkkeet, metabo liatuotteet, hormonit, pestisidit, saasteet, vitamiinit tms. orgaaniset yhdisteet. Hapteenihormoneihin kuuluvat tyroksiini ja trijodityroniini. Vitamiineihin kuuluvat 35 vitamiinit A, B, esimerkiksi B12, C, D, E ja K, foolihappo 101830 18 ja tiamiini. Lääkkeisiin kuuluvat antibiootit, kuten ami-noglykosidit, esimerkiksi gentamysiini, tobramysiini, ami-dasiini, sisämysiini, kanamysiini ja netilmisiini, penisilliini, tetrasykliini, terramysiini, kloorimysetiini ja 5 aktinomysetiini; nukleosidit ja nukleotidit, kuten adeno-siinidifosfaatti (ADP), adenosiinitrifosfaatti (ATP), fla-viinimononukleotidi (FMN), nikotiiniamidiadeniinidinukleo-tidi (NAD) ja sen fosfaattijohdannainen (NADP), tymidiini, guanosiini ja adenosiini; prostaglandiinit; steroidit, ku-10 ten estrogeenit, esimerkiksi estrioli ja estradioli; ja muut, kuten fenobarbitaali, fenytoiini, pirimidoni, eto-suksimidi, karbamatsepiini, valproaatti, teofylliini, kofeiini, propranololi, prokaiiniamidi, kinidiini, amitryp-tiliini, kortisoli, desipramiini, disopyramidi, doksepii-15 ni, doksorubisiini, nortryptiliini, metotreksaatti, imi-pramiini, lidokaiini, N-asetyyliprokaiiniamidi, amfetamiinit, katekoliamiinit ja antihistamiinit. Lääkkeisiin kuuluvat lisäksi sydänglykosidit, ja bentsodiatsepiinin, bentsimidatsolin, piperidiinin, piperatsiinin, imidatso-20 Iin, triatsolin, pyridatsiinin, 1,2,4-triatsiinidionin tai 2,3,5,6-tetrahydroimidatso[2,1-b]tiätsolien johdannaiset tai amidit, 2-fenyylipropaanihappojohdannaiset tai trial-kyyliamiinit. Bentsimidatsolihapteeneja ovat tiabendatso-li, fuberidatsoli, siklobendatsoli, oksibendatsoli, par-25 bendatsoli, kambendatsoli, mebendatsoli, fenbendatsoli, flubendatsoli, albendatsoli, oksbendatsoli, nokodatsoli ja astemitsoli. Piperidiinihapteeneja ovat fifenoksilaatti, fenoperidiini, haloperidoli, haloperidolidekanoaatti, bro-miperidolidekanoaatti, bromiperidoli, moperoni, triflupe-30 ridoli, pipamperoni, piritramidi, fentanyyli, benperidoli, • droperidoli, bentsitramidi, bentsetimidi, domperidoni, sufentaniili, karfentaniili, alfentaniili, deksetimidi, mileperoni, difenoksiini, fluspirileeni, penflurodoli, pimotsidi, lorkainidi, loperamidi, astemitsoli, ketanse-35 riini, levobastiini, cisapridi, altanserini, ritanseriini, 101850 19 3-{2-[4-(4 - fluoribentsoyyli)-1-piperidinyyli]etyyli}-2,7-dimetyyli-4H-pyrido-[1,2-a]-pyrimidin-4-oni, 3-{2-[4- [bis-(4-fluorifenyyli)metyleeni]-1-piperidinyyli]etyyli}-2-me-tyyli-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-oni ja 3-{2-{4-[ [3-(2-5 furanyylimetyyli)-3H-imidatso[4,5-b]pyridin-2-yyli]-ami no] -1-piperidinyyli}etyyli}-2-metyyli-4H-pyrido[1,2-a]py-rimidin-4-oni. Piperatsiinihapteeneihin kuuluvat atsapero-ni, fluanisoni, lidoflatsiini, flunaritsiini, mianseriini, oksatomidi, mioflatsiini, klosinitsiini ja sinnaritsiini.

10 Esimerkkejä imidatsolihapteeneista ovat metronidatsoli, ornidatsoli, ipronidatsoli, tinidatsoli, isokonatsoli, nimoratsoli, mikonatsoli, burimamidi, metiamidi, metomi-daatti, enilkonatsoli eli imatsaliili, etomidaatti, eko-natsoli, klotrimatsoli, karnidatsoli, simetidiini, doko-15 natsoli, sulkonatsoli, parkonatsoli, orkonatsoli, buto- konatsoli, triadiminoli, tiokonatsoli, valkonatsoli, fluo-trimatsoli, ketokonatsoli, oksikonatsoli, lombatsoli, bi-fonatsoli, oksmetidiini, fentikonatsoli, flikonatsoli, tubulatsoli ja (Z)-1-[2-kloori-2-(2,4-dikloorifenyyli)-20 etenyyli]-lH-imidatsoli, Triatsolihapteeneja ovat virat- soli, atsakonatsoli, etakonatsoli, propikonatsoli, penko-natsoli, itrakonatsoli ja terkonatsoli, Pyridatsinihaptee-neja ovat esimerkiksi 3-kloori-6-[3,6-dihydro-4-(3-metyy-lifenyyli)-1(2H)-pyridinyyli]pyridatsiini, 3-metoksi-6- [4-25 (3-metyylifenyyli)-1-piperatsinyyli]pyridatsiini ja EP- hakemusjulkaisun 0 156 433 mukaiset yhdisteet. 1,2,4-tri-atsiinidioneihin kuuluvat esimerkiksi 2-kloori-a-(4-kloo-rifenyyli)-4-(4,5-dihydro-3,5-diokso-l,2,4-triatsin-2(3H)-yyli)bentseeniasetönitriili, 2,6-dikloori-α-(4-kloorife- 30 nyyli)-4-(4,5-dihydro-3,5-diokso-l,2,4-triatsin-2(3H)-yy li) bentseeniasetonitriili ja EP-hakemusjulkaisun 0 170 316 mukaiset yhdisteet, trialkyyliamiineja ovat esimerkiksi di-isopromiini ja protsapiini. 2,3,5,6-tetrahydroimidat-so [2,1-b]tiatsoleja ovat esimerkiksi tetramisoli ja leva-35 misoli. Amideja ovat esimerkiksi klosanteeli, ambusetami- 101830 20 di, isopropamidi, butsepidi, metiodidi ja dekstromoramidi.

Eräs 2-fenyylipropaanihappohapteeni on esimerkiksi supro-feeni.

Määritysten tarkoitukset voivat olla moninaisia.

5 Tietyissä käyttötarkoituksissa tämän keksinnön mukaista fysikaalista kehitettä käytetään yksinomaan tieteellisenä välineenä valo- ja elektronimikroskooppisovellutuksissa esimerkiksi histologisissa näytteissä, kromatogrammeissa, elektroforetogrammeissa, imeytetyissä näytteissä jne. ole-10 vien hiukkasmaisten aineiden visualisoimiseksi paremmin. Havaitaan, että tämän keksinnön mukainen fysikaalinen kehite on erityisen käyttökelpoinen antigeenien immunologiseen detektointiin sekä solu- ja kudosleikkeistä että kokonaisista näytteistä (rikkomattomat solut). Saavutetut 15 herkkyydet ovat hyvin korkeita ja tuloksena oleva leimau-tumismalli on homogeenisempi kuin alalla tunnettujen fysikaalisten kehitteiden yhteydessä, erityisesti käytettäessä hyvin pienikokoisia merkkiaineita, kuten kolloidisia kul-tahiukkasia, joiden koko on noin 1-3 nm. Tieteellisen 20 käyttökelpoisuutensa lisäksi tämän keksinnön mukaiselle fysikaaliselle kehitteelle löytyy käyttöä monissa erilaisissa diagnostisissa testeissä, kuten esimerkiksi seuraa-vissa: T-lymfosyyttialapopulaatioiden detektointi ja ka rakterisointi; raskaustestit, jotka perustuvat tiettyjen 25 hormonien (koriongonadotropiinin) läsnäoloon virtsassa; sienten tai bakteerien aiheuttamien erilaisten tulehdussairauksien, esimerkiksi gonorrean, ja erityisesti virus-sairauksien, kuten hepatiitti B:n, vihurirokon, polion tms., autoimmuunisairauksien, esimerkiksi systeemisen pu-30 nahukan, ja immuunikatosairauksien, esimerkiksi AIDSin, ;; diagnosointitestit; aineenvaihdunta-, endokrinologisten ja erilaisten endogeenisten sairauksien diagnostiikka, mukaan luettuna sikiöiden synnynnäisten häiriöiden detektointi, joka perustuu tiettyjen proteiinien läsnäoloon lap-35 sivedessä.

101850 21

Niinpä sitä voidaan käyttää käytännöllisesti katsoen kaikissa olosuhteissa, joiden yhteydessä immunologisia menetelmiä käytetään nykyisin. Lisäksi tämän keksinnön mukaista fysikaalista kehitettä voidaan käyttää myös ak-5 septoriaineiden, kuten proteiinien tai nukleiinihappojen, määrittämisen ja/tai detektointiin, jolloin nämä aineet immobi li soidaan suoraan kiinteään kantajaan tai kiinteälle kantajalle ja sidotaan kolloidisen merkkiaineen kanssa noudattamalla menettelyjä, joita kuvataan EP-hakemus-10 julkaisussa 0 165 633 ja julkaisussa Analytical Biochemistry 145 (1985) 315 - 321. Mainittu menetelmä käsittää peräkkäiset vaiheet, joissa saatetaan proteiinin tai nukleiinihapon kantaja kosketukseen tietyksi ajaksi riittävän pitoisuuden kanssa kolloidisia merkkiaineita, jotka 15 on suspendoitu väliaineeseen, joka sisältää edullisesti pinta-aktiivista ainetta, joka ei häiritse proteiinin tai nukleiinihaponsitoutumista, kuten esimerkiksi 0,1 % ioni-tonta detergenttiä Tween 20, ja jonka pH on säädetty sopivaksi, ja lisätään fysikaalista kehitettä ja määritetään 20 muodostuneet metallihiukkaset reaktio aikana tai riittävän reaktioajan kuluttua kvantitatiivisesti ja/tai kvalitatiivisesti. Tämän keksinnön mukainen fysikaalinen kehite parantaa tämän menetelmän herkkyyttä ilman perinteisiin kehitteisiin liittyviä haittapuolia.

* 25 Tämän keksinnön mukaiset menetelmät tarjoavat ke hyksen, jota voidaan käyttää moniin erilaisiin rutiini- ja kokeellisiin sovellutuksiin. Luonteensa ja helppokäyttöisyytensä ansiosta nämä menetelmät soveltuvat erityisesti yksinkertaisiin ja nopeisiin kvalitatiivisiin ja kvan-30 titatiivisiin määrityksiin. Ne voidaan suunnitella siten, .* että niitä voivat käyttää kokenut laboratoriohenkilökunta samoin kuin teknistä koulutusta saamaton hoitohenkilökunta tai amatöörit. Nämä menetelmät voidaan myös helposti automatisoida, mikä on tärkeä tekijä, kun täytyy tehdä suuria . 101830 22 määriä samanlaisia määrityksiä, esimerkiksi veripankeissa ja erikoistuneissa kliinisissä laboratorioissa.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään tuotteita hopeahiukkasten saostamiseksi merkkiaineelle, joka 5 katalysoi fysikaalisen kehitteen hopeaionien pelkistymistä. Mainitut tuotteet sisältävät joitakin edellä kuvattujen määritysmenetelmien toteuttamiseen tarvittavista aineosista tai ne kaikki. Mainitut tuotteet voivat olla kaupallisina pakkauksina, esimerkiksi koostumuksena tai seok-10 sena, kun aineosat ovat yhteen sopivia, testausvälinemuo-dossa tai testivälineistönä, ts. tarvittavat aineosat sisältävien kahden tai useamman säiliön yhdistelmäpakkauksena. Yksinkertaisimmassa muodossa mainittu tuote koostuu edellä kuvatusta fysikaalisesta kehiteliuoksesta. Mainitut 15 tuotteet ovat edullisesti testivälineistöinä, jotka sisältävät vahvistajaliuosta ja initiaattoriliuosta, joista saadaan sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet näitä kahta liuosta edellä kuvattu valonkestävä fysikaalinen kehite. Mainitut testivälineistöt voivat lisäksi sisältää määrät-20 tyihin määritysmenetelmiin sopivia aineosia, kuten spesifisiä sitovia aineita, jotka on leimattu metallimerkkiai-neilla, jotka katalysoivat fysikaalisen kehitteen hopeaionien pelkistystä, leimaamattornia, analysoitaville aineille spesifisiä sitovia aineita yhdessä leimattujen sitovien 25 aineiden kanssa, jotka ovat spesifisiä mainituille leimaa-mattomille sitoville aineille. On ilmeistä, että tuotteet voivat sisältää myös muita käyttökelpoisia reagensseja, kuten puskureita, laimennusaineita, standardeja tms.

Esimerkit 30 Esimerkki 1

Materiaalit ja menetelmät 1.1 Suojatun fysikaalisen kehitteen I valmistaminen Tämän kehitteen kaksi nestekomponenttia valmistettiin erikseen. Liuos A valmistettiin liuottamalla 17,85 g 35 sitruunahappoa, 7,05 g natriumsitraattia, 40 g imidatsolia 101830 23 ja 1,86 g hopeanitraattia veteen (500 ml). Liuos B sisältää 32,9 g natriumsitraattia, 10 g natriumsulfiittia, 0,6 g N-(p-hydroksifenyyli)glysiiniä ja 15,32 g sitruuna-happoa vedessä (1000 ml).

5 1.2 Suojatun fysikaalisen kehitteen II valmistami nen Tämän kehitteen kaksi nestekomponenttia valmistettiin erikseen. Liuos A valmistettiin liuottamalla 17,85 g > sitruunahappoa, 7,05 g natriumsitraattia, 40 g imidatso- 10 lia, 1,86 g hopeanitraattia ja 0,25 g N,N-dimetyyliforma-midiin (noin 5 ml) liuotettua Pinakryptol YellowiaR. Liuos laimennettiin vedellä tilavuuteen 500 ml. Liuos B sisältää 32,9 g natriumsitraattia, 10 g natriumsulfiittia, 0,6 g N-(p-hydroksifenyyli)glysiiniä ja 15,32 g sitruunahappoa ve-15 dessä (1000 ml).

1.3 Menetelmä kideytimien itsemuodostuksen mittaamiseksi

Reagenssit saatetaan lämpötilaan 20 °C laittamalla ne termostaattisäädettyyn vesihauteeseen, joka on lämpöti-20 lassa 20 °C. 1 ml liuosta A ja 1 ml liuosta B sekoitetaan muovikyvetissä ja laitetaan spektrofotometriin, jonka lämpötila on säädetty termostaatilla 20 °C. Seurataan ja rekisteröidään jatkuvasti optisen tiheyden kasvua aallonpituudella 500 nm.

25 1.4 Kideytimien itsemuodos tuksen tarkastelu visuaa lisesti

Visuaalinen kontrollitesti hopeakideytimien muodostumisen toteamiseksi tehdään sekoittamalla 1 ml liuosta A ja 1 ml liuosta B läpinäkyvässä polystyreenikoeputkessa.

30 Rekisteröidään ajanhetki, jolloin havaitaan ensimmäisen kerran sameutta. Tämä testi voidaan tehdä pimeissä ja valoisissa olosuhteissa.

101830 24

Tulokset 1. Rideytimien itsemuodostuksen mittaaminen

Testi kideytimien itsemuodostuksen mittaamiseksi toteutettiin käyttämällä kohdassa 1.3 kuvattua testiä ja 5 kohdissa 1.1 ja 1.2 kuvattuja suojattuja fysikaalisia kehitteitä I ja II. Tulokset esitetään taulukoissa 1 ja 2. Kuten havaitaan, kideytimien itsemuodostuksessa ei ole eroja pimeässä käytettäessä suojattuja fysikaalisia kehitteitä I ja II.

10 TAULUKKO 1

Kideytimien itsemuodostus pimeässä fysikaalisen kehitteen kohdalla 15 Aika (min) Optinen tiheys aallonpituudella 500 nm 0 0,000 2 0,000 4 0,001 6 0,001 20 8 0,001 10 0,000 12 0,000 14 0,000 16 0,000 25 18 0,000 20 0,000 101830 25 TAULUKKO 2

Kideytimien itsemuodostus pimeässä fysikaalisen kehitteen II kohdalla 5 Aika (min) Optinen tiheys aallonpituudella 500 nm 0 0,000 2 0,000 4 0,000 6 0,000 10 8 0,000 10 0,000 12 0,000 14 0,000 16 0,000 15 18 0,000 20 0,000 2. Kideytimien itsemuodostuksen tarkastelu visuaalisesti 2 0 Testi kideytimien itsemuodostuksen kontrolloimisek si visuaalisesti tehtiin käyttämällä kohdassa 1.4 kuvattua testiä ja kohdissa 1.1 ja 1.2 kuvattuja suojattuja fysikaalisia kehitteitä I ja II. Tämän testin tulokset on koottu taulukkoon 3.

25 TAULUKKO 3

Fysikaalinen Fysikaalinen

kehite I kehite II

30 Kideytimen itse-·· muodostus täydessä valossa 6 min 27 min

Kideytimen itsemuodostus pimeässä >120 min >120 min

Claims (7)

101830

1. Fysikaalinen kehite, tunnettu siitä, että se on vesiliuos, joka sisältää hopeaioneja, 5 herkkyyttä vähentävää ainetta eli 6-etoksi-l-metyyli-2-(3-nitrostyryyli)kinoliniummetyylisulfonaattia, mooliylimää-rän kompleksinmuodostajaa hopeaioneihin nähden, pelkis-tintä ja mahdollisesti puskurijärjestelmän ja yhtä tai useampaa apuainetta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fysikaalinen ke hite, tunnettu siitä, että kompleksinmuodostaja on histidiini, imidatsoli, bentsimidatsoli, pyratsoli, pyridiini, aminopyridiini, nikotiiniamidi, -kinoliini tai puriini.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fysikaalinen ke hite, tunnettu siitä, että pelkistin on 1,2-di-hydroksibentseeni, 1,4-dihydroksibentseeni, 4-metyyliami-nofenolisulfaatti, 4-aminofenoli, 1,4-diaminobentseeni, 1,2-diaminobentseeni, N-(4-hydroksifenyyli)glysiini, 2,4-20 diaminofenoli, l-fenyyli-3-hydroksipyratsoli tai niiden seos.

4. Kaksiosainen pakkaus patenttivaatimuksen 1 mukaisen fysikaalisen kehitteen valmistamiseksi sekoittamalla pakkauksen aineosat, tunnettu siitä, että 25 se sisältää a) vesiliuoksen, joka sisältää pelkistintä ja mahdollisesti puskurijärjestelmää ja yhtä tai useampaa apuainetta; ja b) vesiliuoksen, joka sisältää hopeaioneja, herk- . 30 kyyttä vähentävää ainetta eli 6-etoksi-l-metyyli-2-(3-nit- • rostyryyli)kinoliniummetyylisulfonaattia, mooliylimäärän kompleksinmuodostajaa hopeaioneihin nähden, pelkistintä ja mahdollisesti puskurijärjestelmän ja yhtä tai useampaa apuainetta. 101830

5. Menetelmä vähintään yhden spesifisen sitovan aineen ja sitä vastaavan sidottavissa olevan aineen muodostaman aggregaatin yhden tai useamman komponentin määrittämiseksi kvalitatiivisesti ja/tai kvantitatiivisesti, 5 jolloin menetelmässä leimataan aggregaatin vähintään yksi komponentti merkkiaineella ja saatetaan aggregaatti kosketukseen fysikaalisen kehitteen kanssa, jolloin merkkiaineen vaikutuksesta muodostuu hopeahiukkanen, joka voidaan määrittää kvalitatiivisesti tai kvantitatiivisesti, 10 tunnettu siitä, että käytettävä fysikaalinen kehite on jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen fysikaalinen kehite.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytettävä merkkiaine on me- 15 talli, metalliyhdiste tai metalleilla tai metalliyhdis-teillä päällystetty tai kyllästetty polymeeri.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytettävät merkkiaineet ovat kolloidisia kulta-, hopea-, tallium-, platina- tai 20 palladiumhiukkasia, kelatoituja kulta-, hopea-, tallium-, platina- tai palladiumioneja tai bentsidiinijohdannaisten polymeraatiotuotteita, jotka on kyllästetty metalleilla tai metalliyhdisteillä. 101830