NO303155B1 - Lysstabile, fysikalske fremkallere, kit for fremstilling derav samt anvendelse av fremkallerne - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår lysstabile, fysikalske fremkallere.

Oppfinnelsen angår også en todelt kit for fremstilling av slike fremkallere samt anvendelsen av fremkallerne for kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse av en eller flere komponenter i et aggregat.

I løpet av de senere år er det innført metoder der aggregater som dannes mellom spesifikke bindemidler og bindbare stoffer detekteres ved å merke aggregatene direkte eller indirekte med metallpartikler med liten størrelse, spesielt gullpartikler. Avhenging av omstendighetene kan disse partikler detekteres, for eksempel ved direkte visuell undersøkelse, ved mikroskopiske eller spektrofotometriske teknikker. En beskrivelse av "immunogullflekkings(IGS)teknikken" , "sol-partikkelimmunoanalyse(SPIA)teknikken" eller spesifikke forbedringer derav kan finnes i US-A-4 313 743, US-A-4 446 238, US-A-4 420 558, EP-A-0 165 633, EP-A-0 165 643, EP-A-0 158 746, EP-A-0 293 947 samt i IBRO håndbokserien, Wiley, New York, 1983, side 347 til 372.

Fra en relativt ukjent metode for merking av celleoverflate-antigener har metallpartikler i dag fått en vid anvendelse i et antall detekterings- og/eller kvantitative bestemmelses-oppgaver. Muligheten for direkte visuell undersøkelse av metallpartikler og den fordel at signalet som dannes er permanent og ikke offer for hurtig forringelse, gjør det til en interesant markør for enkle og hurtige analyser. I tillegg synes metallmarkører og fortrinnsvis gullmarkører å være å foretrekke i forhold til radioisotopmarkører på grunn av de veldig lave helserisiki som forbindes med arbeidet med de førstnevnte.

Derefter ble det funnet at signalet til en metallmarkør som kolloid gull kan økes betydelig ved å underkaste de kolloide gullmarkører en såkalt fysikalsk forbedringsprosedyre. Virkningen av en slik fysikalsk forbedringsprosedyre er at de typiske rødaktige optiske gullsignaler omdannes til et dypbrunt til sort sølvsignal med en meget høyere intensitet. Ved denne prosedyre katalyserer metallmarkørene som benyttes som merkelapp, reduksjonen av sølvioner som er tilstede i fremkallingsoppløsningen. De sistnevnte resulterer i en spesifikk avsetning av et metallisk sølvsjikt på det metalliske partikkelsete. De således dannede metalliske sølvpartikler katalyserer i sin tur reduksjonen av flere sølvioner fra den fysikalske fremkalleroppløsningen og danner en autokatalytisk prosess.

Artskjente fysikalske fremkalleroppløsninger består generelt av en oppløsning inneholdene et oppløselig metallsalt som sølvnitrat, et reduksjonsmiddel som hydrokinon, en egnet buffer og eventuelt et kompieksdannende middel for å binde opp metallionene og gjøre den mindre ømfintlige overfor reduksjon.

Selv om bruken av disse kjente fysikalse fremkallere resulterer i et forbedret signal er det et antall mangler forbundet med metoden. Således er det velkjent at sølvioner kan danne lysfølsomme sølvsalter som sølvbromid og sølvklorid som lett reduseres til metallisk sølv under innvirkning av lys og derved starte en autokatalytisk prosess. Denne ikke-spesifikke prosess for selvkjernedannelse bidrar til opptredenen av bakgrunn i ganske betydelig grad. Den kan være forstyrrende sterk under betingelser med intenst lys, for eksempel ved overvåking av testprøver under et lysmikroskop, eller også når den fysikalske fremkallingsprosess er langsom og testprøven eksponeres til lys i lengre tid.

Som et resulat er målet for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en sensitiv og anvendelig fysikalsk fremkaller for bruk i et antall metallbaserte analyser, som er lysstabile og ikke gir grunn til uønsket, ikke-spesifikk avsetning av metallpartikler.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en fysikalsk fremkaller som karakteriseres ved at den omfatter en vandig oppløsning av sølvioner, 6-etoksy-l-metyl-2-(3-nitrostyril )quinolinium-metylsulfonat som desensetiseringsmiddel, et molart overskudd av et kompieksdannede middel med henblikk på sølvionene, et reduksjonsmiddel og eventuelt et buffersystem og et eller flere tilsetningsstoffer.

Oppfinnelsen angår som nevnt også en todelt kit for fremstilling av en fysikalsk fremkaller som beskrevet ovenfor og denne kit karakteriseres ved at den er oppnådd ved blanding av: a) en vandig oppløsning omfattende et reduksjonsmiddel og eventuelt et buffersystem og et eller flere tilsetningsstoffer; og b) en vandig oppløsning omfattende sølvioner, desensitiseringsmidlet, et molart overskudd av et kompleksdannende

middel med henblikk på sølvioner og eventuelt et buffersystem og et eller flere tilsetningsstoffer.

Til slutt angår oppfinnelsen anvendelsen av en fysikalsk fremkaller som beskrevet ovenfor for kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse av en eller flere komponenter i et aggregat dannet mellom minst et spesifikt bindingsmiddel og dettes tilsvarende bindbare stoff, omfattende merking av minst en komponent av aggregatet med en markør og å bringe aggregatet i kontakt med en fysikalsk fremkaller hvorved det under innflytelse av markøren dannes en metallpartikkel som kvalitativt eller kvantitativt kan bestemmes.

Ifølge oppfinnelsen blir lyssensitiviteten for de tradisjo-nelle fysikalske fremkallere basert på sølvioner, motvirket ved tilsetning av et desensitiseringsmiddel til fremkalleren. Foretrukne desensitiseringsmidler for bruk ifølge oppfinnelsen er elektronakseptorer som 6-etoksy-l-metyl-2-(3- nitrostyryl)kuinoliniummetylsulfonat, kjent som Pinakryptol Yellow® og lignende desensitiseringsmidler.

Reduksjonsmidlene for bruk i den foreliggende fysikalske fremkaller inkluderer ethvert middel som reduserer sølvioner fra en fysikalsk fremkaller i nærheten av et aktivt sete. Fortrinnsvis danner reduksjonsmidlene stabile oppløsninger med bestanddelene i den forbedrede fysikalske fremkaller. Som reduksjonsmiddel kan spesielt nevnes 1,2-dihydroksybenzen, 1,4-dihydroksybenzen (Hydroquinone), 4-metylaminofenolsulfat (Metol®), 4-aminofenol, 1,4-diaminobenzen, 1,2-diaminobenzen, N-(4-hydroksyfenyl )glysin, 2,4-diaminofenol, l-fenyl-3-hydroksypyrasol (Phenidone®) eller blandinger derav. Som andre hjelpemidler i de forbedrede fysikalske fremkallere kan nevnes buffere, preserveringsmidler som antioksydanter eller organiske stabilisatorer, hastighetsregulatorer, baktericider og lignende, for eksempel natriumsulfitt, natriumbisulfitt, natriumcitrat og lignende.

Egnede pH-justeringsmidler er for eksempel eddiksyre, sitronsyre, natriumhydroksyd eller et salt av et hvilket som helst av disse eller et buffersystem basert på tris(hydroksy-metyl)aminometan. pH-verdien i den fysikalske fremkaller ligger fortrinnsvis innen området 5 til 9, spesielt fra 6 til 8. Generelt er pH-verdien i den fysikalske fremkaller begrenset til det området hvori det spesifikke bindemiddel og det tilsvarende bindbare stoff er stabilt.

Bortsett fra sølvionene, reduksjonsmidlet og desensitiseringsmidlet, omfatter den foretrukne fysikalske fremkaller-oppløsning også et overskudd av et kompieksdannende middel for å binde opp metallionene og gjøre dem mindre ømfintlige mot reduksjon. Gunstige kompleksdannende midler for bruk ifølge oppfinnelsen er beskrevet i EP-A-0 293 947 og omfatter pyridin, aminopyridin, nikotinamid, kinolin, imidasol, histidin, benzimidasol, pyrasol, purin og lignende aro-matiske, heterocykliske ringsystemer.

Et eksempel på en metode for fremstilling av oppfinnelsens fysikalske fremkaller omfatter oppløsning eller suspendering av desensitiseringsmidlet i en vandig oppløsning omfattend sølvioner, reduksjonsmidler, buffer og hjelpestoffer. I den endelige oppløsning er forholdet desensitiseringsmiddel:sølv-ioner fra 50 til 0,5 g/mol sølvioner, spesielt fra 50 til 5 g/mol sølvioner og helst fra 35 til 15 g/mol sølvioner. Konsentrasjonen av sølvioner ligger i området 0,001 til 0,1 mol/l, fortrinnsvis 0,005 til 0,5 mol/l og helst 0,07 til 0,3 mol/l.

I en foretrukket utførelsesform fremstilles den fysikalske fremkaller ved blanding av to stabile og flytende opp-løsninger. En oppløsning, herefter kalt forbedrer, omfatter sølvioner, et desensitiseringsmiddel, et molart overskudd av kompleksdannende middel med henblikk på sølvionene og eventuelt et buffersystem. Spesielt ligger det molare overskudd av kompleksdannende middel i forhold til sølvionene fra et ca 2 ganger til et 200 ganger molart overskudd, fortrinnsvis fra et 20 til et 100 ganger molart overskudd. Den andre oppløsning, herefter kalt initiator, omfatter et reduksjonsmiddel og eventuelt et buffersystem og en anti-oksydant og/eller en organisk stabilisator, for eksempel natriumsulfitt, natriumbisulfitt og lignende. Fortrinnsvis er fortynningen av både forbedreren og initatoren slik at blanding av et likt volum av hver oppløsning gir en lysstabil fysikalsk fremkaller som beskrevet ovenfor. I enkelte tilfeller kan forbedreren og initatoren fremstilles fra de tilsvarende tørre bestanddeler ved tilsetning av en egnet mengde vann. For å lette fremstillingen av forbedreren og/eller den fysikalske fremkaller kan det være hensiktsmessig å oppløse det desensitiserende middel først i en liten mengde av et organisk oppløsningmiddel som N,N-dimetylform-amid, N,N-dimetylacetamid og lignenden og å blande den således oppnådde organiske oppløsning med den vandige oppløsning inneholdene sølvionene. pH-verdien i forbedreren bør ligge innen området 5 til 9 og fortrinnsvis 6,5 til 8,5. pH-verdien i initiatoren bør ligge innen området 2 til 7 og fortrinnsivs 3,5 til 5,5.

Selv om bruken av desensitiseringsmidler lik Pinakryptol Yellow® i sølvhalogenidemulsjoner er kjente, er det over-raskende at Pinakryptol Yellow® selektivt kan forhindre ikke-spesifikk selvnukleering i en fysikalsk fremkalleroppløsning og danne en lysstabil vandig oppløsning uten ugunstig å påvirke graden av metallavsetning på markøren. Således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en flere gangers økning i forholdet mellom markørspesifikk reduksjonshastighet og hastigheten for selvnukleering. En bemerkelsesverdig konsekvens av dette er at den herværende fysikalske fremkaller kan reagere til maksimum, det vil si inntil utarming av alle sølvioner, hvorefter både markørspesifikk fremkalling og selvnukleering, hvis til stede, skarpt reduseres og stanser. Dette gjør den fysikalske fremkallingsprosedyre mindre avhengig av eksterne og fremgangsmåtebetingede parametre. Mere spesielt betyr dette at man ikke lenger behøver å tidsavstemme fremkallerprosessen for å stanse den når bakgrunnsstøyen på grunn av ikke-spesifikk metallavsetning, starter. Med blandingene ifølge oppfinnelsen kan fremkallingsprosessen føres til fullføring og derfor efterlates uten overvåking.

Det økede forhold mellom markørspesifikk reduksjonshastighet og hastigheten for ikke-spesifikk selvnukleering kan eksploateres på flere måter. Sensitiviteten kan økes ved å holde markørene lengre i kontakt med den fysikalske fremkaller, eller hastigheten for den markørspesifikke fremkalling kan økes og dette uten å miste den fleksibilitet som tilbys ved en sikkerhetsperiode mellom øyeblikket for optimal markørfremkalling og øyeblikket der selvnukleeringen begynner å gi en øket bakgrunn. I enkelte tilfelle kan en kombinasjon av både øket total hastighet og sensitivitet implementeres. Hastigheten og sensitiviteten kan moduleres ved å endre konsentrasjonen og arten av sølvionene, spesielt deres ligander, desensitiseringsmidlet, reduksjonsmidlet og/eller pH-verdien i fremkalleroppløsningen. For eksempel vil en økning av konsetrasjonen av sølvioner og/eller økning av pH-verdien og/eller bruken av et sterkere reduksjonsmiddel resultere i en hurtigere fremkallingsprosedyre. Omvendt kan fremkallingsprosedyren sinkes ved å redusere konsentrasjonen av sølvioner og/eller å redusere pH-verdien og/eller ved å benytte et svakere reduksjonsmiddel. Hastigheten, spesielt med markører mindre enn 5 nm, kan perfekt moduleres fra meget hurtig (10 - 20 sek) til langsomme (30 min eller mer). Fortrinnsvis blir fremkallingstiden modulert fra ca 10 sek til 2 min, spesielt fra 10 sek til 1 min.

De ovenfor beskrevne fysikalske fremkallere er perfekte å benytte ved fremgangsmåten for kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse av en eller flere komponenter av et aggregat dannet mellom minst et spesifikt bindemiddel og dets tilsvarende bindbare stoff hvorved minst en komponent i aggregatet er merket med en metallmarkør som direkte eller indirekte katalyserer reduksjonen sølvioner fra en fysikalsk fremkaller.

Markøren for bruk ved denne fremgangsmåten definerer enhver partikkel som kan katalysere reduksjonen av metallioner med resulterende avsetning av de tilsvarende metallpartikler på setet for markøren.

Slike markører omfatter metaller, metallforbindelser eller polymerer, eventuelt belagt eller impregnert med metaller eller metallforbindelser som direkte eller indirekte katalysere reduksjonen av metallioner på deres overflate. Som eksempler på slike metaller skal nevnes gull, sølv, thallium, platina, palladium såvel som kobber, nikkel og lignende mens gull er foretrukket. Som eksempler på forbindelser skal nevnes deres tilsvarende komplekser eller gelater og sulfider. Polymerer som er belagt eller impregnert med metaller eller metallforbindelser har egenskaper tilsvarende metallet eller metallforbindelsen men størrelse, densitet og metall innhold kan kombineres optimalt. For bruk ved den foretrukne fremgangsmåte bør markøren velges slik at spesifikke bindemidler eller deres tilsvarende bindbare stoffer kan festes til markøren uten tap av affiniteten for motparten.

Spesielt foretrukne markører er enten (i) kolloide metallpartikler, eventuelt en sol inneholdene metaller eller metallsulfider, eller (ii) metallgelater; spesielt de som inneholder etylendiaminotetraeddiksyre (EDTA) eller dietylen-triaminpentaeddiksyre (DTPA) grupper; eller (ili) polymerer som eventuelt er impregnert med metaller eller metall-sulf ider, for eksempel polymeriseringsprodukter av benzidin-derivater, for eksempel diaminobenzidinpolymerer.

Fordi foretrukne metoder hensiktsmessig kan gjennomføres ved å immobilisere det spesifikke bindemiddel eller det tilsvarende bindbare stoff, direkte eller indirekte, på en fast bærer, å bringe bæreren i kontakt med en motpart merket med en markør som katalyserer reduksjonen av metallionene i den fysikalske fremkaller og å tilsette den fysikalske fremkaller før eller efter separeringen av de bundne og frie merkede komponenter hvorved, under reaksjonen eller efter en passende reaksjonstid, de dannede metallpartikler kvantitativt og/eller kvalitativt bestemmes i en testprøve og/eller de avledede fraksjoner for å gi en kvalitativ og/eller kvantitativ indikasjon på komponenten eller komponentene som skal bestemmes. I enkelte tilfelle kan det være foretrukket å bringe bæreren inneholdene det immobiliserte bindbare stoff i kontakt med et første bindemiddel som er spesifikt mot det bindbare stoff for å danne et aggregat med dette og derefter å bringe bæreren med det således dannede aggregat i kontakt med et andre bindende protein som er spesifikt til det første bindene protein, merket med markør. Den således beskrevne metode er spesielt egnet for bestemmelse av immunokjemiske komponenter som haptener, antigener og antistoffer.

Videre kan oppfinnelsen benyttes for kvantitativ og/eller kvalitativ bestemmelse av en akseptorsubstans som protein eller en nukleinsyre som indirekte immobiliseres på en fast bærer og bindes med den ovenfor nevnte markør.

Bestemmelsen kan gjennomføres homogent eller heterogent. Homogene bestemmelser er spesielt enkle å gjennomføre men krever en målbar endring av signalet fra enten de markører som er tilstede i den merkede reagent eller i det merkede aggregat som dannes mellom den merkede reagens og partiklene som skal bestemmes. I de tilfeller der en slik distinksjon ikke er mulig, vil heterogene bestemmelser måtte gjennom-føres .

Homogene bestemmelser er fordelaktige på grunn av det faktum at det ikke er nødvendig fysikalsk å separere bundne og ikke-bundne merkede specier, noe som reduserer antallet trinn som er nødvendig for å gjennomføre en analyse. Reaksjonen mellom den merkede komponent og den tilsvarende bindemiddelmotpart forårsaker den målbare endring i merkelappens deltagelse i eller modulering av den signaldannende del som er nødvendig for å gi homogen bestemmelse. Fordelingen av markører mellom bundne og ikke-bundne specier kan være differensiert ved den manglende evne eller den endrede evne for markøren til å påvirke signalet derfra efter fremkalling ved tilstedeværelse i de bundne specier.

En homogen bestemmelse kan hensiktsmessig gjennomføres ifølge kjente prosedyrer, for eksempel ved kompetitiv bindings-teknikk. Prøven inneholdene analytten kombineres med en bindene motpart av analytten, en merket reagens omfattende en markør koblet til analytten eller en spesifikk bindingsanalog derav, og den fysikalske fremkaller som er nødvendig for å omdanne markøren til den signaldannende del selv. Alternativt kan en sekvensiell bestemmelse gjennomføres hvorved, prøven og analyttbindingsmotparten først kombineres og detekterings-reagensen derefter tilsettes.

I mange tilfeller er det ikke mulig å gjennomføre homogene bestemmelser. I disse tilfeller kan en heterogen bestemmelse være et spesielt attraktivt alternativ. Generelt omfatter heterogen bestemmelse minst to basisbestanddeler og den fysikalske fremkaller som kombineres samtidig eller i følge, det vil si analytten som skal detekteres, en bindingsmotpart merket med en markør samt den fysikalske fremkaller som er nødvendig for å omdanne markøren til selve den signaldannende enhet. Hvis nødvendig blir, efter en egnet inkuberingsperiode eller -perioder den merkede reagens bundet til det tilsvarende bindbare stoff som skal detekteres hvorved forholdet bundne specier:ikke-bundne specier er en funksjon av mengden tilstedeværende analytt. Mengden ikke-bundne specier er fysikalsk adskilt og mengden merkelapp som er tilstede i en av dem, bestemmes.

Forskjellige måter for gjennomføring av separeringstrinnene og gjennomføring bindingsreaksjonene er i og for seg kjente. Separeringen kan omfatte enhver konvensjonell teknikk som anvendelse av et fastfaseantistoff eller antigen, et andre antistoff, eller et fastfase andre antistoff; eller ved anvendelse av immunokompleksprecipiteringsmidler, adsor-beringsmidler og lignende. Bindingsreaksjonene kan for eksempel inkludere såkalte kompetitive bindingsteknikker, sekvensiell metningsteknikk, sandwichteknikken og lignende.

De foretrukne bestemmelser er homogene bestemmelser som generelt er basert på det prinsipp at det merkede aggregat som dannes mellom det spesifikke bindingsprotein og de bindbare stoffer på et visst tidspunkt immobiliseres på en slik måte at eventuelle ikke-omsatte partikler kan vaskes av, hvorefter de immobiliserte partikler detekteres "in situ" eller, hvis ønskelig, efter frigjøring i enhver annen fase avledet derfra.

I en spesielt foretrukket utførelsesform blir bindings-substansen som skal detekteres, og som kan være inneholdt i en råprøve eller en renset eller delvis renset fraksjon avledet derfra, immobilisert på en egnet immobil iserende bærer før dennes kompleksdannelse med det merkede bindingsmiddel som er spesifikt for det bindbare stoff.

Immobiliseringen av det bindbare stoff kan gjennomføres ved å følge de vanlige teknikker, for eksempel ved å bringe en aliquot av prøvegjenstanden på den immobiliserte bærer eller ved å senke den sistnevnte i testprøven og derefter tørke og eventuelt vaske av ikke-immoblilsert materiale. Dette er den såkalte direkte teknikk. Som immobil iserende bærere for denne teknikk skal nevnes forskjellige stoffer, generelt polymer-stoffer som nitrocellulose, diazobenzyloksymetyl (DBH)- og diazofenyltioeter (DPT) modifisert cellulosepapir, papir, papir- eller celluloseacetat aktivert med cyanogenbromid, agarose, nylon plast og lignende, som kan ha en hvilken som helst form som er hensiktsmessig for bestemmelsesprosessen, for eksempel ark, kuler, bølgeplater, dyppepinner og lignende.

Bæreren bringes så i kontakt med et merket bindemiddel under betingelser som tillater aggregatdannelse mellom bindemidlet og det tilsvarende bindbare stoff. På de seter der bindbare stoff er immobilisert vil som en konsekvens markørene i sin tur være immobilisert i mengder proposjonale med konsentrasjonen av det immobiliserte bindbare stoff.

I en variant av denne metode blir den immobiliserte bindbare substans først tillatt å reagere med et første bindemiddel som er spesifikt for det og derefter blir den således immobiliserte fase bragt i kontakt med markørene festet til et andre bindende middel som er spesifikt for det første bindemiddel.

På grunn av mangelen på selektivitet og spesifisitet ved immobiliseringsprosessen som beskrevet ovenfor, blir den direkte metode vanligvis benyttet med relativt rene eller rensede testprøver eller fraksjoner. For mere komplekse prøver vil den direkte metode ofte være mindre egnet da den ikke-spesifikke immobilisering av et stort overskudd av ikke-ønsket materiale vil interferere med sensitiviteten og spesifisiteten for bestemmelsen.

For å unngå dette problem som er viktig med henblikk på rutineanalyser, kan det benyttes en indirekte eller en såkalt sandwichteknikk. Ved denne teknikk blir et renset eller anriket primærspesifikt bindemiddel immobilisert på en fast bærer. Den sistnevnte bringes i kontakt med testprøven under betingelser som tillater kompleksdannelse av de tilsvarende bindbare stoffer som som et resultat selv blir immobilisert. Efter fjerning av testprøven og vasking av bæreren blir den sistnevnte bragt i kontakt med en suspensjon av markører belagt med sekundære spesifikke bindemidler som er istand til å binde til ikke-kompleksdannede seter av den immobiliserte bindbare substans.

Det mest direkte tilfellet der oppfinnelsen kan anvendes er en gjennomstrømningsomgivelse bestående av en bindbar substans som er immobilisert, direkte eller indirekte, til en fast fase, og en flytende fase som er mobil i forhold til den faste fase. Avhengig av retningen av væskefasestrømmen i forhold til den faste fase kan denne faste fase være væskepermeabel eller -ikke-permeabel. For eksempel kan et permeabelt membran benyttes som fast fase og tillate en perpendikulær strøm av væskefasen gjennom membranet. På den annen side kan en ikke-permeabel fast fase benyttes i kombinasjon med en latteralvæskestrøm.

I det første trinn av utførelsesformen blir den flytende fase inneholdene det merkede spesifikke bindemiddel bragt i kontakt med den bindbare substans som er immobilisert på den faste fase. Bevegelsen av denne væskefase i forhold til den faste fase kan være kontinuerlig eller diskontinuerlig og må være slik at kontakttiden mellom de to faser tillater binding mellom den immobiliserte bindbare substans og det merkede spesifikke bindemiddel. Imidlertid behøver denne bindings-prosess ikke nødvendigvis å nå sitt metningspunkt. Trykk-fallet mellom kilde og destinasjon for væskefasen, noe som skaper strømmen, kan bygges opp på forskjellige måter. Når det gjelder en permeabel membran som fast fase kan en perpendikulærstrøm dannes ved å bringe en side av membranen i kontakt med et fluidabsorberende materiale og ved å legge væskef åsene på den andre siden. Når det gjelder en ikke-permeabel fast fase kan en lateralstrøm av væskefasen dannes ved hjelp av en pumpe.

I det andre trinn blir en forbedret fysikalsk fremkaller ifølge oppfinnelsen lagt på som flytende fase. For å maksimalisere forholdet mellom markør-spesifikk reduksjonshastighet og hastigheten for selvnukleeringen, kan det være hensiktsmessig å holde begge komponenter av den fysikalske fremkaller, initiator og forbedrer, adskilt inntil umiddel-bart før bruk. Imidlertid skal det påpekes at sammenlignet med den kjente teknikk, kan stabile oppløsninger av den fysikalske fremkaller oppnås ved å blande initiator og forbedrer. I enkelte tilfeller kan det være foretrekke å legge på forbedrer og initiator senere og derved å danne den forbedrede fysikalske fremkaller "in situ". I lys av disse betrakninger kan den fysikalske fremkaller ifølge oppfinnelsen lett optimaliseres mot den benyttede markør, den krevede sensitivitet og kontakttiden mellom den faste fase og den flytende fysikalske fremkaller.

I den foretrukne gjennomstrømningsutførelse bør blandingen av de to stabile væskekomponenter og pålegningen av den resulterende forbedrede fremkaller kombineres til et enkelt trinn. Pålegningen av den strømmende beskyttede fysikalske fremkaller har en dualvirkning. Til å begynne med vil væsken vaske bort fra den faste fase alle gjenværende merkede spesifikke bindemidler som ikke er eller som kun er løst bundet i det første trinn. Fordi den fysikalske fremkaller av markøren er en gradvis progressiv prosess vil dette materi-alet vaskes fra den faste fase før noe signal blir åpenbart. Gjennværende, bundet markert spesifikt bindemiddel, vil danne et synlig signal iløpet av den videre kontakt med den beskyttede fysikalske fremkaller. Strømmen og volumet av fremkalleren som legges på den faste fase kan velges for å sikre at kontakttiden er lang nok for en optimal detektering av de immobiliserte merkede forbindelser og kort nok til å unngå en ikke-spesifikk reduksjon ved den faste fase, forårsaket av selvnukleering. Karakteristisk kan disse tider moduleres fra noen sekunder til flere minutter.

Detekteringen av de dannede metallpartikler i en viss fase av reaksjonsblandingen kan skje ved bruk av tallrike teknikker som i og for seg er kjent. Teknikkene er basert på mengden og/eller de fysikalske egenskaper for metallpartiklene som dannes, spesielt på spredningen og adsorbsjonen av metallpartiklene. Som eksempler på disse teknikker skal nevnes spektrofotometriske teknikker som densitometri, som vil bli foretrukket når de.t er ønskelig med kvantitative bestemmelser. I lys av den høye sensitivitet som oppnås kan imidlertid partiklene lett observeres visuelt, eventuelt gjennom et mikroskop.

De spesifikke bindemidler som kan benyttes ved den foretrukne metode kan være av forskjellig art men vil i mange tilfeller være antistoffer til spesifiserte antigener eller haptener. Som et eksempel på spesifikke bindingssubstanser andre enn antistoffer kan nevnes phager som er eventuelt kjemiske eller genetisk tilpasset til å binde cellulære eller molekylære stoffer, lechtiner som spesifikt binder glykoproteiner, Staphylococcus aureus protein Å som spesifikk binder immunoglobeliner fra forskjellige dyrespecier og DNA- og RNA prober for geneidentifisering. Generelt kan envher molekylær interaksjon med tilstrekkelig spesifisitet og affininitet, benyttes. Antistoffene kan være polyklonale eller mono-klonale .

I lys av den generelle art har fremgangsmåtene som beskrevet et ekstremt bredt anvendelsesfelt. I prinsippet kan de anvendes på den kvalitative og/eller den kvantitative bestemmelse av et hvilket som helst stoff som kan merkes med den ovenfor nevnte markør. For eksempel omfatter slike stoffer blant annet celleoverflate- og vevantigener, biologiske stoffer som er skilt ut av eller avledet fra levende organismer, spesielt biologiske stoffer som opptrer i biologiske væsker som spytt, lymfevæske, blod og fraksjoner oppnådd derfra som plasma og serum, videre urin, cerebro-spinalfluid, amnionfluid og lignende. Stoffer som kan detekteres omfatter proteiner, polypeptider, peptider, lignende enzymer, hormoner, strukturelle proteiner, nukleinsyrer, vitaminer, polysakkarider, toksiner, alkaloider, glykoproteiner, haptener, metabolitter, farmakologiske midler, pesticider, forurensende materialer, steroider og et hvilket som helst annet molekyl for hvilket det foreligger en bindene motpart i biologiske systemer, eller en bindende motpart kan syntetiseres.

Representative proteinanalytter omfatter klassene av protaminer, mucoproteiner, glykoproteiner, globuliner, albuminer, scelroproteiner, fosfoproteiner, histoner, lipoproteiner, chromproteiner og nukleoproteiner. Eksempler på spesifikke proteiner er prealbumin, a^-lipoprotein, human serum albumin, a-syreglykoprotein, a^-antistrypsin, a^-glykoprotein, transcortin, thyroksinbindende globulin, haptoglobin, hemoglobin, myoglobin, ceruloplasmin, a£-lipoprotein, a-macroglobulin, p<->lipoprotein, erythropoietin, transferin, hemopeksin, fibrinogen, immunoglobelinene som IgG, IgM, IgA, IgD, og IgE, idet IgG er foretrukket, og deres fragmenter, for eksempel Fc, Fal3 og F(ab)<2>komplement faktorer, prolactin, blodkoaguleringsfaktorer som fibrinogen, thrombin og så videre, insulin, melanotropin, somatotropin, thyrotropin, follicelstimulerende hormon, luteiniserende hormon, gonadotropin, thyroidstimulerende hormon, placental lactogen, iboendefaktor, serumenzymer som alkalisk fosfatase, melkedehydrogenase, amylase, lipase, fosfataser, cholin-esterase, glutaminoksomelkesyretransaminase, glutamin-pyruvintransaminase og uropepsin, endorfiner, enkefaliner, protamin, vevantigener, bakterielle antigener og virusanti-gener som som hepatittassosierte antigener (for eksempel HBsAg, HBcAg og EBeAg).

Representative haptenanalytter er den genrelle klasse av medikamenter, metabolitter, homoner, pesticider, foru-rensninger, vitaminer og lignende organiske forbindelser. Haptenhormoner omfatter tyroksin og trijodtyronin. Vitaminer omfatter vitaminene A, B, for eksempel Bj^»C, D, E og K, folsyre og tiamin. Medikamenter omfatter antibiotika som aminoglykosider, for eksempel gentamicin, tobramycin, amidacin, sisomicin, kanamycin og netilmicin, penicillin, tetracyklin, terramycin, kloromycetin og actinomycetin; nukleosider og nukleotider som adenosindifosfat (ADP), adenosintrifosfat (ATP), flavinmononukleotid (FMN), nikotin-amidadenindinukleotid (NAD) og dettes fosfatderivat (NADP), thymidin, guanosin og adenosin; prostaglandin; steroider som østrogener, for eksempel østriol og østradiol, steroider; og andre som fenobarbital, fenytoin, pirimidon, ethosuksimid, carbamazepin, valproat, theofyllin, koffein, propanolol, procainamid, kuinidin, amitryptilin, kortizol, desipramin, disopyramid, doksepin, duksorubicin, nortryptilin, methotre-akse, imipramin, lidocain, N-acetyl-procainamid, amfetaminer, katekolaminer og antihistaminer. Videre kardialglukosid og derivater av benzodiasepin, benzimidazol, piperidin, piperasin, imidazol, triazol, pyridasin, 1,2,4-triasindion, eller 2,3,5,6-tetrahydrolmldaso[2,l-b]tlazol eller amider, hydratropinsyrederivater eller trialkylaminer.

Benzimidazolhaptener omfatter tiabendazol, fuberidazol, ciclobendazol, oksibendazol, parbendazol, cambendazol, mebendazol, fenbendazol, flubendazol, albendazol, oks-fendazol, nocodazol og astemizol.

Piperidinhaptender omfatter difenoksylat, fenoperidin, haloperidol, haloperidoldekanoat, bromperidoldekanoat, bromperidol, moperon, trifluperidol, pipampreon, piritramid, fentanyl, benperidol, droperidol, benzitramid, benzetimid, domperidon, sufentanil, carfentanil, alfentanil, deksetimid, milenperon, difenoksin, fluspirilen, penfluridol, pimozid, lorcainid, loperamid, astemizol, ketanserin, levocabastin, cisaprid, altaserin, ritaserin, 3-[2-[4-fluorbenzoyl)1-piper idinyl]etyl]-2,7-dimetyl-4H-pyrido-[l,2-a]-pyrimidin-4-on-, 3-[2-[4-[bis(4-fluorfenyl)metylen]-1-piperidinyl]etyl]-2-metyl-4Epyrido[l,2-a]pyrimidin-4-on og 3-[2-[4-[[3-(2-furanylmetyl ) -3Himidaso [4 , 5-b] pyr idin-2-yl] amino] -1-piper-idinyl]etyl]-2-metyl-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-on.

Piperidinhaptener omfatter azaperon, fluanison, lidoflasin, fluanarisin, mianserin, oksatomid, mioflasin, clocinisin og cannarisin.

Eksempler på imidazolhaptener er metronidazol, ornidazol, ipronidazol, tinidazol, isoconazol, nimorazol, miconazol, burimamid, metiamid, metomidat, eniconazol eller imazalil, etomidat, econazol, clotrimazol, carnidazol, cimetidin, doconazol, sulcanazol, parconazol, orconazol, butoconazol, triadiminol, tioconazol, valconazol, fluotrimazol, keto-conazol, oksykonazol, lombazol, bifonazol, oksmetidin, fenticonazol, fluconazol, tubulazol og (Z )-l-[kloro-2-(2,4-diklorofenyl)etenyl]-lH-imidazol.

Triazolhaptender omfatter virazol, azaconazol, etaconazol, propiconazol, penconazol, itraconazol og terconazol.

Pyridazinhaptener omfatter for eksempel 3-kloro-6-[3,6-dihydro-4-(3metylfenyl)-l(2H)-pyridinyl]pyridazin, 3-metoksy-6-[4-(3-metylfenyl)-l-piperazinyl]pyridazin og forbindelsene ifølge EP Publ. 0 156 433.

1,2,4-triazindioner omfatter for eksempel 2-kloro-a-(4-klorofenyl )-4-(4,5-dihydro-3,5-diokso-l,2,4-triazin-2(3H)-yl) benzenacetonitril, 2 >6-dikloro-a-(4-klorofenyl )4-(4,5-dihydro-3 , 5-diokso-l ,2 ,4-triazin-2(3H)-yl )benzenacetonitril og forbindelsene ifølge EP Publ. 0 170 316.

Trialkylaminer er for eksempel diisopromin, prozapin.

2,3,5,6-tetrahydro-imidazo[2,1-b]tiazoler omfatter for eksempel tetramisol eller levamisol.

Amider omfatter for eksempel closeantel, ambucetamid, isopropamid, buzepid, metiodid, dekstromoramid.

Et hydratropinsyrehapten er for eksempel sufopren.

Formålet for bestemmelsene kan være flere. Ved visse anvendelser ville den fysikalske fremkaller ifølge oppfinnelsen benyttes kun som vitenskapelig verktøy i lys- og elektronmikroskopiske anvendelser for bedre å visualisere spesielle stoffer, for eksempel på histologiske snitt, kromatogrammer, elektroforetogrammer, blot og så videre. Det er funnet at den her beskrevne fysikalske fremkaller er spesielt brukbar for immunologisk detektering av antigener både i celle- og vevsnitt og i hele prøver (intakte celler). De oppnådde sensitiviteter er meget høye og de resulterende merkemønster er mere homogent enn med de kjente fysikalse fremkallere, spesielt når ultrasmå markører anvendes som for eksempel gullpartikler på 1 til 3 nm. Bortsett fra den vitenskapelige brukbarhet vil den fysikalske fremkaller ifølge oppfinnelsen finne anvendelse innen en vidt spektrum diagnostiske prøver som for eksempel de følgende: detektering og karakterisering av subpopulasjoner av T-lymfocytter; graviditesprøver basert på nærvær av visse hormoner (cori-oniske gonadotropin) i urinen, diagnostiske prøver på forskjeller infektsiøse sykdommer av sopp- eller bakteriell opprinnelse som gonoré og spesielt for sykdommer av viral opprinnelse som hepatitt B, rubella, poliomyelitt og lignende, autoimmunsykdommer som Lupus erytheamatosus og immundefektsykdommer som AIDS; diagnose på metabolske, endokrinologiske og forskjellige endogene sykdommer inkludert diagnose for detektering av kongenitale misfunksjoner av embryo basert på nærværet av spesifikke proteiner i amnion-fluidet.

Således kan oppfinnelsen finne anvendelse under så og si alle omstendigheter for hvilke immunologiske teknikker benyttes i dag. I tillegg kan den fysikalske fremkaller ifølge oppfinnelsen også benyttes ved bestemmelse og/eller detektering av akseptorstoffer som proteiner eller nukleinsyrer som direkte immobiliseres i eller på en fast bærer og bindes med en kolloid markør ved å følge prosedyrer som beskrevet i EP 0 165 633 samt "Analytical Biochemistry" 145, 315-321

(1985). Denne metode omfatter de efterfølgende trinn av kontakt mellom protein eller nukleinsyrebærer i et gitt tidsrom og med en tilstrekkelig konsentrasjon av kolloide markører suspendert i et medium, fortrinnsvis inneholdene en detergens som ikke innvirker på protein- eller nukleinsyre-bindingen, for eksempel 0,1 # av den ikke-ioniske detergens Tween 20, og egnet pE-justert, og å tilsette en fysikalsk fremkaller hvorved, under reaksjonen eller efter en tilstrekkelig reaksjonstid, de dannede metallpartikler kvantitativt og/eller kvalitativt bestemmes. Den fysikalske fremkaller ifølge oppfinnelsen forbedrer sensitiviteten for denne metode uten de mangler som forbindes med de tradisjo-nelle fremkallere. Fremgangsmåten som beskrevet tilbyr en prinsippramme som kan benyttes for et vidt spektrum rutine- og forsøksanvendelser. På grunn av deres art og lette gjennomføring kan fremgangsmåtene være anvendelig spesielt for enkle og hurtige kvalitative eller semikvantitative analyser. Disse kan være orienterte mot bruk av erfarne laboratorieteknikkere såvel som av ikke-teknisk trenet medisinsk personell eller legmenn. Fremgangsmåtene kan også lett automatiseres, noe som er en viktig faktor når store mengder identiske bestemmelser skal gjennomføres, for eksempel i blodbanker og spesialiserte kliniske laboratorier.

I et ytterligere trekk ved oppfinnelsen tilveiebringes det som nevnt innledningsvis produkter for å avsette sølv-partikler på en markør som katalyserer reduksjonen av sølvioner fra en fysikalsk fremkaller. Slike produkter omfatter noen av eller alle de bestanddeler som er nødvendige for å gjennomføre analysemetodene som beskrevet ovenfor. Produktene kan presenteres i kommersielt pakket form, for eksempel som en blanding eller et preparat når bestanddelene er forenelige, i en prøveinnretning, eller et prøvesett, det vil si en pakket kombinasjon av to eller flere beholdere som inneholder de nødvendige bestanddeler. I sin enkleste form består produktet av en fysikalsk fremkalleroppløsning som beskrevet ovenfor. Fortrinnsvis presenteres produktene som prøvesett eller kit omfattende en forbedreroppløsning og initiatoroppløsning som ved blanding av to like volumer av hver oppløsning gir en lysstabil fysikalsk fremkaller som beskrevet ovenfor. Prøvesettene kan videre omfatte bestanddeler egnet for spesifikke analysemetoder som spesifikke bindemidler merket med metallmarkører som katalyserer reduksjonen av sølvioner fra den fysikalske fremkaller, ikke-merkede bindemidler spesifikk for analytter sammen med merkede bindemidler spesifikke for de ikke-merkede bindings-midler. Selvfølgelig kan de herværende produkter også omfatte andre brukbare reagenser som buffere, fortynningsmidler, standarder og lignende.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1

Materialer og metoder

1.1. Fremstilling av en beskyttet fysikalsk fremkaller I

To flytende komponenter av denne fremkaller ble fremstilt separat. Oppløsning A ble fremstilt ved å oppløse 17,85 g sitronsyre, 7,05 g natriumsitrat, 40 g imidazol og 1,86 g sølvnitrat i 500 ml vann. Oppløsning B består av 32,9 g natriumsitrat, 10 g natriumsulfitt, 0,6 g N-(p-hydroksy-fenyl)glysin og 15,32 g sitronsyre i 1000 ml vann.

1.2. Fremstilling av en beskyttet fysikalsk fremkaller II

To flytende komponenter av denne fremkaller ble fremstilt separat. Oppløsning A ble fremstilt ved å oppløse 17,85 g sitronsyre, 7,05 g natriumsitrat, 40 g imidazol, 1,86 g sølvnitrat og 0,25 g Pinakryptol Yellow®, oppløst i ca 5 ml N,N-dimetylformamid. Oppløsningen ble fortynnet med vann til 500 ml. Oppløsning B besto av 32,9 g natriumsitrat, 10 g natriumsulfitt, 0,6 g N-(p-hydroksyfenyl)glysin og 15,32 g sitronsyre i 1000 ml vann.

1.3. Fremgangsmåte for måling av autonukleeringen

Reagensene ble bragt til 20 "C ved å anbringe dem i et termostatert vannbad som hold 20°C. 1 ml av oppløsning A og 1 ml av oppløsning B blandes i en plastkuvette og bringes i et spektrofotometer som er termostatert til 20°C. Økningen i den optiske densitet ved 500 nm overvåkes og registeres kontinuerlig.

1.4. Visuell undersøkelse av autonukleeringen

En visuell kontrollprøve for sølvnukleering gjennomføres ved å blande 1 ml oppløsning A og 1 ml oppløsning B i et transparent polystyrentestrør. Tiden registreres når den første turbiditet observeres. Denne prøve kan skje under mørke og lyse betingelser.

Resultater

1. Måling av autonukleeringen

Prøven for måling av autonukleering ble gjennomført ved bruk av prøven som beskrevet under 1.3. ved bruk av de beskyttede fysikalske fremkallere I og II som beskrevet under 1.1. og 1.2. Denne prøve viser autonukleeringstiden i fravær av lys. Resultatene er vist i tabell 1 og 2. Som vist er det ingen differanse når det gjelder autonukleeringen i mørket, ved bruk av de beskyttede fyskikalske fremkallere I og II.

2. Visuell undersøkelse av autonukleering

Prøven på visuell kontroll av autonukleeringen ble gjennom-ført ved bruk av prøven som beskrevet under 1.4. ved bruk av de beskyttede fysikalske fremkallere I og II beskrevet under 1.1. og 1.2. Resultatene av prøven er oppsummert i tabell 3.

Claims (7)

1. Fysikalsk fremkaller,karakterisert vedat den omfatter en vandig oppløsning av sølvioner, 6-etoksy-l-metyl-2-(3-nitrostyril )quinolinium-metylsulfonat som desensetiseringsmiddel, et molart overskudd av et kompleksdannede middel med henblikk på sølvionene, et reduksjonsmiddel og eventuelt et buffersystem og et eller flere tilsetningsstoffer.

2. Fremkaller ifølge krav 1,karakterisertved at det kompleksdannende middel er histidin, imidazol, benzimidazol, pyrazol, pyridin, aminopyridin, nikotinamid, quinolin eller purin.

3. Fysikalsk fremkaller ifølge krav 1,karakterisert vedat reduksjonsmiddelet er 1,2-dihydroksybenzen, 1,4-dihydroksybenzen, 4-metylaminofenolsulfat, 4-aminofenol, 1,4-diaminobenzen, 1,2-diaminobenzen, N-(4-hydroksyfenyl)glycin, 2,4-diaminofenol, 1-fenyl-3-hydroksy-pyrazol eller en blanding derav.

4. Todelt kit for fremstilling av en fysikalsk fremkaller ifølge krav 1,karakterisert vedat den er oppnådd ved blanding av: a) en vandig oppløsning omfattende et reduksjonsmiddel og eventuelt et buffersystem og et eller flere tilsetningsstoffer; og b) en vandig oppløsning omfattende sølvioner, desensitiseringsmidlet, et molart overskudd av et kompleksdannende middel med henblikk på sølvioner og eventuelt et buffersystem og et eller flere tilsetningsstoffer.

5. Anvendelse av en fysikalsk fremkaller omfattende en vandig oppløsning av sølvioner, 6-etoksy-l-metyl-2-(3-nitrostyril)-quinolinium-metylsulfonat som desensetiseringsmiddel, et molart overskudd av et kompleksdannede middel med henblikk på sølvionene, et reduksjonsmiddel og eventuelt et buffersystem og et eller flere tilsetningsstoffer for kvalitativ og/eller bestemmelse av en eller flere komponenter i et aggregat dannet mellom minst et spesifikt bindingsmiddel og dettes tilsvarende bindbare stoff, omfattende merking av minst en komponent av aggregatet med en markør og å bringe aggregatet i kontakt med en fysikalsk fremkaller hvorved det under innflytelse av markøren dannes en metallpartikkel som kvalitativt eller kvantitativt kan bestemmes.

6. Anvendelse ifølge krav 5 av et metall, en metallforbindelse eller en polymer, belagt eller impregnert med metaller eller metallforbindeler, som markør.

7. Anvendelse ifølge krav 6 av markører i form av enten kolloide gull-, sølv-, tallium-, platina- eller palladiumpartikler; chelaterte gull-, sølv-, tallium-, platina- eller palladium-ioner eller polymeriseringsprodukter av benzidin-derivater, impregnert med metaller eller metallforbindelser.