JP2807831B2 - 免疫学的測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は免疫学的測定法に関する。より詳細には、臨
床検査等の分野で使用され、生体成分などの微量成分を
測定する免疫学的測定法に関する。

＜従来の技術及び発明が解決しようとする課題＞ 免疫学的測定法は、抗原抗体反応の特異性を利用し
て、生体成分（例えば、抗原、抗体、ハプテン、ホルモ
ン等）、薬剤等の微量成分を測定する方法であり、信頼
性及び測定精度が高いうえ、種々の抗原に対する抗体が
容易に取得し得ること等から、微量生体成分等の測定
（定量）法として広く用いられている。このような免疫
学的測定法としては、使用される標識物質の差異によ
り、放射免疫測定法（RIA法）、酵素免疫測定法（EIA
法）、螢光免疫測定法（FIA法）等が知られている。

免疫学測定法には、その測定様式の相違により、抗原
抗体反応物と非反応物との分離操作（いわゆるB/F分
離）を必要とする方法と、B/F分離を必要としない方法
がある。B/F分離を必要としない方法は測定操作が簡便
ではあるが、検体中の測定対象物質が極微量の場合には
測定精度が劣り、適切な方法とはいえない。かかる問題
から、B/F分離を行う方法が汎用されるが、この方法の
一種として、抗原又は抗体を固体化した固相を用いてB/
F分離を行う固相法が知られている。固相法は、抗原抗
体反応を固相上で行い、標識物質を含む抗原抗体反応物
を固相上に結合させる方法、抗原抗体反応を液相で行
い、標識物質を含む抗原抗体反応物を生成させ、次いで
該反応生成物を固相上に結合させる方法等により行われ
る。標識物質を含む抗原抗体反応物は固相上に固定化さ
れているので、反応終了後、担体を水洗する方法、遠心
分離法等により、容易にB/F分離を行うことができ、操
作が簡便であると共に測定精度の向上が図れる。

しかし、免疫学的測定法においては、抗原抗体反応が
緩慢に進行するため、長時間の反応時間（通常、数時間
〜１日程度）を要するという問題があり、特に不均一反
応である固相法の場合にはこの傾向は著しい。従来、か
かる問題を解消するため、標識化抗体等の反応試薬を高
濃度で使用し、抗原抗体反応速度を高める方法が用いら
れているが、標識化抗体等の反応試薬を高濃度で使用す
ると、固相上への非特異的結合が生じ、ブランクの測定
値の上昇、いわゆるバックグランドの上昇が認められ、
その結果、S/N比が低くなり、測定感度が低下するとい
う問題がある。

本発明は上記の従来技術の欠点を解決するために創案
されたもので、本発明者らが種々の検討を重ねた結果、
二種類の固相を組み合わせることにより、反応時間を短
縮し得ると共にバックグランドが低下し、測定感度を向
上させ得ることを見出して完成した。すなわち、本発明
の目的は測定精度及び感度に優れると共に迅速測定を可
能にする免疫学的測定法を提供することにある。

＜課題を解決するための手段＞ 上記の課題を解決すべくなされた本発明の免疫学的測
定法は、二種類の固相を用いた免疫学的測定法で、第一
の固相は溶解可能な材料からなり、少なくとも、 標識物質を含む抗原抗体反応物（以下、標識化抗原抗
体反応物という）が固定化された第一の固相を調製する
工程、 上記で得られた第一の固相を溶解する工程、 上記で得られた溶解物中の標識化抗原抗体反応物を
第二の固相に固定化する工程、及び 上記の工程により、第二の固相に固定化された標識
化抗原抗体反応物の標識活性を測定する工程、 を含むことを特徴とするものである。

上記構成からなる本発明の免疫学的測定法には、例え
ば、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法
等の種々の測定法が包含される。また、上記各測定法に
おいて、測定様式として、例えば、競合法、サンドイッ
チ法、固定化第二抗体を用いる方法などの様々な方法が
知られているが、これらのいずれの方法も包含される。
これらの免疫学的測定法及びその実施方法については、
石川ら編「酵素免疫測定法」（1978年医学書院刊行）、
入江編「ラジオイムノアッセイ」（1974年講談社刊行）
等に詳細に記載されている。

本発明は前記〜の工程を少なくとも包含する免疫
学的測定法であり、その方法を以下に詳述する。

本発明の第一の工程は、標識化抗原抗体反応物が固定
化された第一の固相を調製するものである。ここで使用
される第一の固相は、温度変化、pH変化等の雰囲気変化
又は酵素、キレート剤等の試薬の作用により、溶解（ゾ
ル状態を含む）可能な材料からなり、例えば、温度変化
により溶解可能な材料としては、例えば、アガロース、
ゼラチン、ポリアクリルアミド等が挙げられ、pH変化に
より溶解可能な材料としては、例えば、ヒドロキシアパ
タイト等が挙げられ、酵素の作用により溶解可能な材料
としては、例えば、デキストラン、キトサン、キチン等
が挙げられ、キレート剤の作用により溶解可能な材料と
しては、例えば、アルギン酸カルシウム等が挙げられ
る。これらの材料は置換基を有していてもよく、置換基
としては、例えば、アミノ基、カルボキシ基、チオール
基、スルホ基等が挙げられ、これらの置換基の導入は慣
用の方法にて行うことができる。

かかる材料からなる第一の固相の形状は特に限定され
ないが、操作性の点から粒状とするのが好ましく、また
溶解性の点から微粒子状とするのが好ましい。

上記第一の固相上には、検体中の測定対象物質（例え
ば、抗原、抗体、ハプテン、薬剤等）と抗原抗体反応可
能な物質（以下、免疫反応性物質という）が固定化され
ている。すなわち、検体中の測定対象物質が抗原、ハプ
テン、薬剤等の場合にはその抗体が、また測定対象物質
が抗体の場合にはその抗原が固定化される。第一の固相
上への免疫反応性物質の固定化は、従来から慣用の方法
で行うことができ、物理化学的結合法（例えば、吸着
法、イオン結合法等）、化学結合法等が挙げられる。

物理化学的方法による固定化は、0.01〜1M程度の適当
な緩衝液に免疫反応性物質を溶解し、ここに第一の固相
を、室温又は冷却下、１〜10時間程度浸漬し、次いで水
又は緩衝液で洗浄することにより行われる。

一方、化学結合法としては、結合剤を用いる方法、反
応性官能基を有する固相を用いる方法等が挙げられる。
結合剤を用いる方法における結合剤としては、例えば、
グルタルアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンジ
アルデヒド等のジアルデヒド類；ヘキサメチレンジイソ
シアネート等のジイソシアネート類;N,N′−ｏ−フェニ
レンジマレイミド、N,N′−ｍ−フェニレンジマレイミ
ド等のジマレイミド類;N,N′−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド等のカルボジイミド類などが挙
げられる。これらの結合剤を用いることにより、免疫反
応性物質と第一の固相上の官能基とを反応させて結合さ
せることができる。また、反応性官能基を有する固相を
用いる方法で使用される反応性官能基を有する固相とし
ては、例えば、ブロムシアン活性化アガロース等のブロ
ムシアン活性化多糖類、ジアルデヒド化アガロース等の
ジアルデヒド化多糖類などが例示される。これらの化学
結合法の反応は慣用の方法にて行うことができ、例え
ば、千畑編「固定化酵素」（1975年講談社刊行）等に記
載されている。

免疫反応性物質が固定化された第一の固相は、標識化
抗体等の反応試薬の非特異的結合を防止するため、ブロ
ッキング剤（例えば、脱脂粉乳、牛血清アルブミン、ゼ
ラチン及びその加水分解物、カゼイン及びその加水分解
物、デキストラン、ポリエチレングリコール等）で処理
してもよいが、本発明においては、かかるブロッキング
剤処理をしなくとも、非特異的結合に起因するS/N比の
低下を防止できるという特長を有する。

本発明の第一工程は、標識化抗原抗体反応物が固定化
された第一の固相を調製することにより行われる。この
工程は、免疫学的方法の種類により種々の方法にて行う
ことができる。例えば、免疫学的測定法がサンドイッチ
法の場合、測定対象物質を含む検体と、該測定対象物質
に対応する免疫反応性物質を固定化した第一の固相とを
混合し、第一の固相上に免疫反応性物質を介して測定対
象物質を結合させ、次いで、標識物質（例えば、酵素、
放射性物質、螢光物質、発光物質、発色物質等）が結合
した免疫反応性物質を加え、第一の固相上の測定対象物
質をサンドイッチ状に挾むことにより、第一の固相上に
標識化抗原抗体反応物を固定化し、必要に応じて洗浄す
ることにより行われる。

また、免疫学的測定法が競合法による固相化第二抗体
法の場合には、測定対象物質に対応する免疫反応性物質
に対して、検体中の測定対象物質と標識化測定対象物質
とを競合反応させ、次いで、上記免疫反応性物質に対す
る抗体（第二抗体）が固定化された第一の固相を加え、
標識化測定対象物質を含む抗原抗体反応物を第一の固相
上に固定化し、必要に応じて洗浄することにより行われ
る。

かくして標識化抗原抗体反応物が固定化された第一の
固相は、次いで、第一の固相を溶解する工程に付される
（第二工程）。この工程は、第一の固相を形成する材料
に応じて、適宜の方法が用いられ、例えば、第一の固相
が、アガロース、ゼラチン、ポリアクリルアミド等の場
合には、膨潤状態又は適当な溶媒中で加熱することによ
りゲル状態からゾル状態へ変化させて溶解することがで
き、ヒドロキシアパタイトの場合には、適当な溶媒中で
pH調整剤（例えば、塩酸、クエン酸、リンゴ酸等の酸
類）を用いてpHを低下させること（例えば、pH6〜８をp
H3程度にする）により溶解することができ、デキストラ
ン、キトサン及びキチンの場合には、適当な溶媒中でそ
れぞれを基質とする酵素、すなわちデキストラナーゼ、
キトサナーゼ及びキチナーゼを作用させることにより溶
解でき、アルギン酸カルシウムの場合には、適当な溶媒
中でEDTA等のキレート剤を作用させることにより溶解す
ることができる。

この第二工程により第一の固相は溶解され、標識化抗
原抗体反応物を含有する溶液が得られる。この溶液に第
二の固相を加え、第二の固相上に標識化抗原抗体反応物
を固定化する（第三工程）。

ここで使用される第二の固相の材料は特に限定され
ず、従来から免疫学的測定法の固相として使用されてい
るものが使用でき、例えば、アガロース、セルロース、
デキストラン等の多糖類、ポリスチレン、ナイロン、エ
チレン−無水マレイン酸共重合体、ポリヒドロキシエチ
ルメタアクリレート等のプラスチック類、ガラス等が例
示される。また、第二の固相の形状も特に限定されず、
例えば、ビーズ状、プレート状、チューブ状等の適宜な
形状とすることができる。

第二の固相上に標識化抗原抗体反応物を固定化する方
法としては、例えば、第二の固相上に、該抗原抗体反応
物を構成する成分のいずれかと結合し得る抗体を固定化
しておき、該抗体を介して第二の固相上に固定化する方
法等、種々の方法が採用できる。より好ましくは、結合
性を有する物質の対（以下、結合性物質対という）の一
方物質を第一の固相上に固定化されるいずれかの成分
（例えば、第一の固相上に固定化されている免疫反応性
物質若しくは第二抗体、標識化された免疫反応性物質又
は標識化された測定対象物質）に結合させ、また結合性
物質対の他方の物質を第二の固相に固定化し、該結合性
物質対を介して第二の固相上に標識化抗原抗体反応物を
固定化する方法が用いられる。かかる結合性物質対の例
としては、例えば、アビジン（又はストレプトアビジ
ン）−ビオチン（又はデスチオビオチン）対、コンカナ
バリンＡ−糖類対、抗原−抗体対等が挙げられる。より
詳細には、例えば、第一の固相上の免疫反応性物質に導
入されている物質がビオチンの場合には、第二の固相上
には対応する結合性物質であるアビジン又はストレプト
アビジンが固定化される。同様に、第一の固相上の免疫
反応性物質に導入されている物質が、例えば、コンカナ
バリンＡ、FITC（フルオレセイン イソチオシアネー
ト）又はDNP（2,4−ジニトロフェノール）の場合には、
第二の固相上にはそれぞれ対応する結合性物質である糖
類、抗FITC抗体又は抗DNP抗体が固定化される。

結合性物質対の一方の物質を第一の固相上の免疫反応
性物質又は第二抗体に結合させる方法としては、該物質
を予め導入した免疫反応性物質又は第二抗体を第一の固
相に固定化する方法、第一の固相に固定化された免疫反
応性物質又は第二抗体に該物質を導入する方法等により
行うことができる。免疫反応性物質又は第二抗体への該
物質の導入及び第一の固相に固定化された免疫反応性物
質又は第二抗体への該物質の導入は、いずれも前記の結
合剤を用いる化学結合法で行うことができる。また、結
合性物質対の一方の物質を、標識化された免疫反応性物
質又は標識化された測定対象物質に結合させる方法とし
ては、前記の結合剤を用いる化学結合法で行うことがで
きる。

第二の固相に、結合性物質対の他方の物質を固定化す
るする方法としては、前記の物理化学的方法又は化学結
合法を用いることができる。また、かくして得られた第
二の固相は、非特異的結合を防止するため、前記のブロ
ッキング剤で処理されていてもよい。

このように、第一の固相上の免疫反応性物質若しくは
第二抗体、標識化された免疫反応性物質又は標識化され
た測定対象物質には結合性物質対の一方の物質が導入さ
れているので、第一工程により形成された第一の固相上
には、結合性物質の一方の物質が、直接又は間接的に結
合している標識化抗原抗体反応物が固定化される。ま
た、第二の固相上には結合性物質対の他方の物質が固定
化されているので、第二工程で溶解された第一の固相と
第二の固相を反応させると、結合性物質によって形成さ
れる結合対を介して、標識化抗原抗体反応物を第二の固
相上に固定化することができる。この反応は、前記第二
工程により得られた標識化抗原抗体反応物溶液と第二の
固相とを、必要に応じて適当な緩衝液を用い、室温〜冷
却下で反応させることにより行われ、反応終了後、必要
に応じて第二の固相を洗浄し、未反応物を除去する。か
くして、標識化抗原抗体反応物は第二の固相上に固定化
される。

次いで、第二の固相上に固定化されている標識化抗原
抗体反応物の標識活性を測定する（第四工程）。標識活
性の測定は、標識物質の種類に応じて適宜の方法を用い
ることができる。例えば、標識物質が放射性物質の場合
にはその放射能をカウントすることにより行われ、また
標識物質が酵素の場合には該酵素の基質を作用させ、常
法に従って該基質の減少量若しくは酵素反応生成物の増
加量又はそれらの変化速度を、吸光度測定等の方法で求
めることにより行われる。かかる標識酵素と基質の組み
合わせの例としては、例えば、ペルオキシダーゼと過酸
化水素及びｏ−フェニレンジアミンとの組み合わせ、β
−ガラクトシダーゼとｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトシドとの組み合わせ、アルカリホスファターゼと
ｐ−ニトロフェニルホスフェートとの組み合わせ等が挙
げられる。標識物質が螢光物質及び発色物質の場合に
は、それぞれ螢光強度測定及び発色強度測定等により行
われる。このようにして求められた標識活性の測定値を
常法に従って処理することにより、検体中の測定対象物
質の量を求めることができる。

次に、本発明の免疫学的測定法を、より詳細に説明す
る。

その一例として、サンドイッチ法により、測定対象物
質としての抗原を測定（定量）する例をもって説明す
る。この方法においては、結合性物質対の一方が結合し
ている抗体が固定化された第一の固相を、測定対象物質
である抗原を含有する検体に加え、検体中の抗原を第一
の固相上の抗体で捕捉した後、洗浄することによりB/F
分離を行う。次いで、得られた固相に標識化抗体を加
え、固相上に捕捉された抗原をサンドイッチ状に挟み、
過剰の標識化抗体を洗浄により除去し、B/F分離を行
う。かくして、標識化抗体を含む抗原抗体反応物は第一
の固相上に固定化される。次いで、得られた固相を、必
要に応じて適当な溶媒中に加え、第一の固相を形成する
材料に応じて適宜の方法（例えば、前記の温度変化、pH
変化、酵素やキレート剤の作用等）で第一の固相を溶解
する。この溶液に、結合性物質対の他方が固定化された
第二の固相を加え、結合性物質対を介して、標識化抗体
を含む抗原抗体反応物を第二の固相上に固定化し、固定
化された標識化抗体の標識活性を測定する。一方、上記
の抗原含有検体の代りに、濃度既知の抗原標準試料を用
いて、同様な方法により標識活性を測定し、抗原濃度に
対する標識活性の検量線（標準曲線）を作成する。この
検量線と抗原含有検体の標識活性とを対比することによ
り、抗原含有検体中の抗原量を定量することができる
（以下、便宜上、測定法Ｉという）。

また、他の例として、第二抗体固定化固相を用いた競
合法に基いて、抗原（測定対象物質）の測定（定量）法
を説明する。この方法においては、測定対象物質である
抗原を含有する検体と一定量の標識化抗原とを第一抗体
（測定対象物質である抗原に対する抗体）に対して競合
反応させる。次いで、結合性物質対の一方が結合してい
る第二抗体（第一抗体に対する抗体）が固定化された第
一の固相を加え、標識化抗原を含む抗原抗体反応物を固
相上に固定化し、水洗することにより、B/F分離を行
う。かくして、標識化抗原を含む抗原抗体反応物は第一
の固相上に固定化される。次いで、得られた固相を、必
要に応じて適当な溶媒に加え、第一の固相を形成する材
料に応じて適宜の方法（例えば、前記の温度変化、pH変
化、酵素やキレート剤の作用等）で第一の固相を溶解す
る。この溶液に、結合性物質対の他方が固定化された第
二の固相を加え、結合性物質対を介して、標識化抗原を
含む抗原抗体反応物を第二の固相上に固定化し、固定化
された標識化抗原の標識活性を測定する。一方、上記の
抗原含有検体の代りに、濃度既知の抗原標準試料を用い
て、同様な方法により標識活性を測定し、抗原濃度に対
する標識活性の検量線を作成する。この検量線と抗原含
有検体の標識活性とを対比することにより、抗原含有検
体中の抗原量を定量することができる（以下、便宜上、
測定法IIという）。

上記の測定法Ｉ及びIIにおいて、第一の固相上に固定
化される抗体、標識化される抗体及び第二抗体は、ポリ
クローナル抗体（抗血清）及びモノクローナル抗体のい
ずれであってもよく、またそのＦ（ab′）_２画分も使用
することができる。これらの抗体は従来から慣用の方法
にて得ることができる。なお、測定対象物質がハプテン
等の免疫原性のない物質の場合には、アルブミン、グロ
ブリン、ヘモグロビン等の慣用のキャリヤーと結合させ
て免疫抗原を調製した後、常法の抗体産生法により抗体
を得ることができる。

また、標識化抗体及び標識化抗原は公知の方法にて調
製することができ、例えば、標識が酵素の場合には、前
述の結合剤を用いて酵素と抗体（又は抗原）とを反応さ
せることにより得られる。標識が放射性物質、例えば、
¹²⁵Iの場合には、常法のクロラミンＴ法、ラクトペルオ
キシダーゼと過酸化水素を用いる酵素法等により、抗体
（又は抗原）を標識化することができる。更に、標識が
螢光物質の場合には、上記の酵素標識と同様な方法にて
も行うことができるが、螢光物質をマイクロカプセル中
に封入し、このマイクロカプセルと抗体（又は抗原）と
を吸着法、化学結合法等により結合させて標識化する方
法が好ましい。

標識活性の測定は前述の方法にて行われる。

なお、上記の測定法Ｉ及びIIは、本発明の測定法のあ
る種の態様を示したものであり、これらの方法に限定さ
れるものではなく、測定対象物質等に応じて適宜変更す
ることができる。例えば、測定法Ｉにおいて、測定対象
物質が抗体の場合には、抗原が固定化された第一の固相
及び標識化抗原を用いればよく、また同様に、測定法II
においては、第一抗体の代りに抗原を用いると共に標識
化抗体を用いればよい。

次に、本発明の免疫学的測定法の一例を、第一の固相
としてアガロース、また結合性物質対としてビオチン−
アビジン対を用いて、サンドイッチ法を用いた酵素免疫
測定法により、測定対象物質としての抗原を測定する例
に基き、より具体的に説明する。

まず、結合性物質対の一方（例えば、ビオチン）が結
合している抗体が固定化されたアガロース固相及び結合
性物質対の他方（すなわち、アビジン）が固定化された
第二の固相を調製する。上記のアガロース固相は種々の
方法により調製することができるが、例えば、アガロー
スゲル微粒子を適当な緩衝液（例えば、0.1Mリン酸緩衝
液、pH7.0）中で膨潤・懸濁させた後、常法に準じて過
ヨウ素酸類（例えば、過ヨウ素酸、メタ過ヨウ素酸カリ
ウム、メタ過ヨウ素酸ナトリウム等）で酸化し、ジアル
デヒド化アガロースゲル微粒子を調製する。得られたジ
アルデヒド化アガロースゲル微粒子に、測定対象抗原に
対応する抗体［又はそのＦ（ab′）_２画分］を水又は適
当な緩衝液（例えば、0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0）中で
反応させ、抗体が結合したアガロースゲル微粒子が得ら
れる。次いでビオチン化剤（例えば、ビオチンスクシン
イミド等）を反応させてビオチン化抗体固定化アガロー
スゲル微粒子が得られる。

一方、アビジンが固定化された第二の固相も種々の方
法で調製することができるが、例えば、ブロムシアン活
性化多糖類担体を、常法に準じて、適当な緩衝液で膨潤
・懸濁させた後、アビジンを反応させることにより得ら
れる。

次いで、かくして得られたアガロースゲル微粒子及び
第二の固相を用いて抗原を測定する。この測定操作とし
ては、まず、測定対象物質である抗原を含有する検体
を、そのまま又は水若しくは適当な緩衝液で濃度調整を
した後、上記で得られたアガロースゲル微粒子に加え、
検体中の抗原を該固相上の抗体で捕捉する。この反応
は、冷却下〜加温下、通常、室温程度で行われ、１〜10
分間程度、通常、２〜５分間程度で終了する。次いで、
該固相を適当な緩衝液で洗浄してB/F分離を行った後、
適当な濃度の酵素標識化抗体溶液を添加し、固相上に固
定化された抗原と反応させることにより、抗原を介して
酵素標識化抗体を固相上に固定化する。この反応は、冷
却下〜加温下、通常、室温程度で行われ、１〜10分間程
度、通常、２〜５分間程度で終了する。かくして、酵素
標識抗体を含む抗原抗体反応物が固定化された固相は、
緩衝液で洗浄することによりB/F分離を行う。B/F分離さ
れた固相を、膨潤状態で又は必要に応じて適当な緩衝液
（例えば、0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0）中に分散させ、5
0℃程度に加熱してアガロースゲルをゾル化させて溶解
する。得られた溶液に、アビジンが固定化された第二の
固相を加え、ビオチン−アビジン結合対を介して、酵素
標識抗体を含む抗原抗体反応物を第二の固相に固定化
し、適当な緩衝液で洗浄し、B/F分離を行う。この固定
化は冷却下〜室温程度で行われ、１〜10分間程度、通
常、１〜３分間程度で終了する。次いで、酵素標識抗体
を含む抗原抗体反応物が固定化された第二の固相に酵素
の基質溶液を添加し、所定時間（通常、１〜10分間程
度）反応させた後、基質の減少量、酵素反応生成物の増
加量等を吸光度測定等の方法で測定し、担体上の標識酵
素の酵素活性を測定する。得られた測定値に基き、予め
作成した検量線から、検体中の抗原量を求めることがで
きる。なお、検量線の作成は、上記の測定方法におい
て、検体の代りに濃度既知の抗原標準試料を用い、同様
な操作により酵素活性を求め、抗原濃度に対して酵素活
性をプロットすることにより得られる。

本発明の免疫学的測定法は種々の微量成分の測定（定
量）に用いることができ、測定対象物質としては、例え
ば、α−フェトプロテイン、Ｃ反応性蛋白（CRP）、ガ
ン胎児性抗原、ハプトグロビン、免疫グロブリン類等の
血清蛋白質、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、成長ホ
ルモン等のホルモン、ステロイドホルモン、HBs抗原等
のウイルス抗原、カナマイシン、テオフィリン等の薬剤
などが挙げられ、これらの物質を含む検体としては、例
えば、血清、血漿、尿、髄液、リンパ液等が挙げられ
る。

＜発明の作用・効果＞ 以上のように、本発明の免疫的測定法によれば、標識
化抗原抗体反応物が固定化された第一の固相を調製した
後、第一の固相を溶解して標識化抗原抗体反応物を第二
の固相に固定化しているので、第一の固相に非特異的に
結合した標識化抗体等の反応試薬が第二の固相に非特異
的に結合する割合は大きく減少し、第二の固相には標識
化抗原抗体反応物を選択的に固定化することができる。
そのため、抗原抗体反応の反応速度を上げるために標識
化抗体等の反応試薬の濃度を高めても、非特異的な結合
に起因するバックグランドの上昇を抑制でき、S/N比が
高まり、測定感度を上昇させることができる。

従って、本発明の免疫学的測定法によれば、短時間に
測定が終了し、測定精度及び測定感度を著しく向上させ
ることができるという効果を奏し、反応の迅速性、B/F
分離の容易性等から、自動分析化にも適した測定法であ
る。

＜実施例＞ 以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより詳細
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

実施例 （１）アガロースゲル微粒子の調製 アガロース（シグマ社製タイプ1X）3gを精製水100ml
に分散させ、液温を60℃に保ちながらゾルを調製する。
調製したゾル5mlをオリーブ油10mlと界面活性剤MYS−２
（日光ケミカルズ社製）1gの混合液に加えて激しく混合
し、アガロースゲル微粒子を調製した。調製したゲル微
粒子は遠心分離洗浄し、ゲル微粒子固相として用いた。

（２）ビオチン化抗CRP抗体固定化アガロースゲル微粒
子の調製 上記（１）で調製したアガロースゲル微粒子10mlを0.
1Mリン酸緩衝液（pH7.0）10mlに懸濁させ、メタ過ヨウ
素酸ナトリウム0.1gを加え、氷冷下で30分間反応させて
ジアルデヒド化アガロースゲル微粒子を作製した。この
ジアルデヒド化アガロースゲル微粒子に抗CRP抗体のＦ
（ab′）_２画分1mgを加え、室温で２時間反応させて抗
体固定化アガロースゲル微粒子を得た。このとき未反応
の抗体はゲルを、上記緩衝液で洗浄することにより除去
した。次いで、抗体固定化アガロースゲル微粒子を0.1M
リン酸緩衝液（pH7.0）10mlに懸濁させ、ビオチンスク
シンイミド10mgを加え、室温で２時間反応させて、ビオ
チン化抗CRP抗体固定化アガロースゲル微粒子を調製し
た。

（３）アビジン固定化合セファロース固相の調製 ブロムシアン活性化セファロース（ファルマシア社
製）3mlを0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）3mlに懸濁させた
後、アビジン10mgを加え、室温で２時間反応させて、ア
ビジン固定化セファロース固相を調製した。

（４）CRPの測定 ビオチン化抗CRP抗体固定化アガロースゲル微粒子0.1
mlに、検体として各種濃度のCRP抗原水溶液（０、31、6
3、125、250、500ng/ml）50μを加え３分間室温で反
応させてから洗浄し、さらに西洋ワサビペルオキシダー
ゼ（POD）標識抗体液（1U/ml）50μを加えて室温で３
分間反応させた。次いで、これを洗浄後、固相を50℃で
加温して融解した。

次に、融解した固相を、アビジン固定化セファロース
固相0.1mlを0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）0.1mlに懸濁さ
せた液に加え、反応させた後洗浄した。この洗浄したア
ビジン固定化セファロース固相に結合したPODの活性
を、ｏ−フェニレンジアミン（18.5mM）と過酸化水素水
（6mM）を含む基質液0.1mlを加えて室温で３分間反応さ
せ、更に2N−硫酸1mlを添加し反応を停止させ、呈色液
の吸光度を波長492nmで測定した。検体のCRP抗原濃度と
吸光度の関係を第１図に示す。第１図から明らかなよう
に、吸光度はCRP抗原の濃度に比例して増加し、CRP抗原
の濃度を定量する検量線が得られた。比較例 実施例と同様にして、ビオチン化抗CRP抗体固定化ア
ガロースゲル微粒子と検体（CRP抗原濃度０及び125ng/m
l水溶液）とを反応させて洗浄した後、固相を50℃で加
温して溶解した。次いで、アビジン固定化セファロース
固相を用いないで基質液を加える方法（直接法という）
と、実施例と同様にアビジン固定化セファロース固相に
固定化した後に基質液を加える方法（本発明法という）
により吸光度を測定した。

その結果を第１表に示す。第１表に示されるように、
本発明法であるアビジン固定化セファロース固相を用い
た方法は、直接法に比べ、感度の指標であるS/N比が約
2.5倍となり、測定対象物質を高感度で分析する方法と
して有利であることが判った。

【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明の測定法によりCRPを測定したときの
検量線を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−254868（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−28558（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/543

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】二種類の固相を用いた免疫学的測定法で、
   第一の固相は溶解可能な材料からなり、少なくとも、 標識物質を含む抗原抗体反応物が固定化された第一の
   固相を調製する工程、 上記で得られた第一の固相を溶解する工程、 上記で得られた溶解物中の標識物質を含む抗原抗体
   反応物を第二の固相に固定化する工程、及び 上記の工程により、第二の固相に固定化された標識
   物質を含む抗原抗体反応物の標識活性を測定する工程、 を含むことを特徴とする免疫学的測定法。
2. 【請求項２】第一の固相上には、検体中の測定対象物質
   に対して抗原抗体反応可能な物質が固定化され、更に該
   物質には結合性を有する物質対の一方の物質が結合して
   おり、また第二の固相上には上記結合性を有する物質対
   の他方の物質が固定化されており、 （１）上記第一の固相と測定対象物質を含む検体とを反
   応させて第一の固相上に抗原抗体反応物を結合させ、次
   いで、測定対象物質に対して抗原抗体反応可能であり且
   つ標識物質が結合した物質を反応させた後、第一の固相
   を溶解し、得られた溶液を上記第二の固相と反応させ
   て、結合性を有する物質対を介して、第二の固相上に標
   識物質を含む抗原抗体反応物を固定化し、次いで、第二
   の固相上に固定化された標識物質を含む抗原抗体反応物
   の標識活性を測定するか、 又は （２）上記第一の固相に対して、測定対象物質を含む検
   体及び標識物質が結合した測定対象物質を競合反応させ
   て、第一の固相上に標識物質を含む抗原抗体反応物を結
   合させ、次いで、第一の固相を溶解し、得られた溶液を
   上記第二の固相と反応させて、結合性を有する物質対を
   介して、第二の固相上に標識物質を含む抗原抗体反応物
   を固定化し、次いで、第二の固相上に固定化された標識
   物質を含む抗原抗体反応物の標識活性を測定する、 請求項１記載の免疫学的測定法。
3. 【請求項３】第一の固相が、置換基を有することのある
   アガロース又はヒドロキシアパタイトからなる請求項１
   又は２記載の免疫学的測定法。
4. 【請求項４】結合性を有する物質対がアビジン−ビオチ
   ン対である請求項２記載の免疫学的測定法。