JPH0346565A - 磁性体を利用した酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は主に臨床検査の分野で利用される他、食品検査
、医学や生命科学の基礎分野等において利用される抗原
−抗体反応を利用した分析法である酵素免疫測定法に関
するものである。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］従来、
未反応の試薬や反応物を反応液から分離する（ＢＦ分離
）操作を伴うヘテロジニアスな酵素免疫測定法（ＥＩＡ
）においては、該分離をいかに１を確に効率よく行なう
かが重要であり、分離を容易にするための固相として種
々の抗体や抗原を固定化したものが使用されてきた。プ
ラスチックチューブ、ポリスチレンビーズ、ガラスピー
ズ等はその代表的なものである。これらの担体はＢＦ分
離には比較的好都合であるものの、反応の迅速性という
点では固相一液相間の反応てあり結合等の反応が液相同
士の場合に比べ遅く不利である。

反応速度を」二げるスｂには１（１体の微オ１′／了−
化が何ましい。しかし微粒子担体を用いた場合、通液時
の圧力損失や該粒子からのＢＦ分離操作にろ過のような
複雑な操作が必要となる。

一方、反応の迅速化をはかる試みとして担体に磁性体を
使用し磁力で担体を集めＢＦ分離を行なう方法が従来か
ら行なわれてきたが、今日まで般的に広く用いられるに
は至っていない。この原因は従来から使われている担体
への酵素標識試薬の非特異的吸着が大きい為、一般的に
測定のブランクが高く十分な感度が得られなかったから
である。

本発明は上記従来技術の問題に鑑みなされたものであり
、高感度で迅速簡便に行なうことのてきる新規なＥＩＡ
を提供するものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行なった
結果、抗原や抗体を担体に固定化する固相法を改良する
ことにより簡単な操作でＥＩＡの感度を高め、かつ迅速
化が可能であることを見い出し本発明に至った。

すなわち、本発明は、表面がアミン基と化学的に結合で
きる反応性官能基を有するポリマーで被覆された磁性体
粒子な固相担体として用いることを特徴とする酵素免疫
測定法であり、この方法によれば、ブランクが低く、高
感度の測定を迅速に行なうことが可能となる。これは磁
性体粒子を補記ポリマーが被覆しているため、特定の抗
原、抗体又はハプテンを高い濃度で固定化することによ
り低アフィニティーのものも吸着することが可能となり
、更に、担体材料が磁性体であり、磁力による担体の分
別等ができるため、複雑な操作をすることなく担体の粒
径を小さくし反応速度を増大させることが可能となるた
めである。

本発明においてポリマーとは磁性体粒子を被覆すること
のできる高分子化合物でありアミノ基と化学的に結合で
きる反応性官能基、例えば、トシル基、カルボキシル基
、アミノ基、チオール基等を有するものであればよく、
ポリマー材料中に上記官能基を有しつるもの、及びポリ
マー形成後に上記官能基をもつスペーサーを導入したも
のであってもよい。好ましい官能基としてはトシル基を
挙げることができ、語基は抗原や抗体又はハプテンのア
ミノ基との反応性が良好で、又非特異的吸着も少ない。

又上記官能基は被覆後のポリマー表面に配置されていれ
ばよく１、ポリマー分子牛歩なくとも１個含有されてい
ればよい。尚、磁性体粒子にポリマーを被覆させる手段
としては、例えば１ｎ−ｓｉＬｕ重合法等により行なう
ことができる。

本発明において用いることのできる磁性体粒子としては
、四三酸化鉄、二酸化クロム等、一般に強磁性体といわ
れるものであればいずれも用いることができる。

又、磁性体粒子にポリマーが被覆されて成る担体の粘度
は粒径１〜１０μｍの範囲になるようにするのが好まし
い。担体の粒径は大き過ぎれば反応中、即座に沈降し反
応時間の短縮り不都合であり、また小さ過ぎれば反応液
中に分散し、反応速度の上昇には貢献するもののＢＦ分
離をする為に磁石で集める時に時間を要することになる
。

又、担体に所望の抗原５、抗体又はハプテンをポリマー
上に固定化させるには、１〜１００μｇ／ｍ　１程度の
濃度で調製したそれぞれの溶液を用いて常法により反応
させ吸着させ後、反応容器外側に磁石を接触させ担体を
集め反応液上滑を吸引等により除去し、ＰＢＳ等で洗浄
後定着させることにより行なうことができる。

担体に固定化する抗原、抗体等は、検出を目的とする抗
体、抗原又はハプテン及び用いる測定原理により適宜選
定すればよい。

次に、本発明において用いることのできる標識酵素とし
ては、抗原、抗体、又はハプテンの活性が少量でも検出
することのできる高感度な酵素であればよく、例えば西
洋ワサビ由来ベルオキシターゼ、β−ガラクトシダーゼ
、ウシ粘膜アルカリホスファターゼ等いずれも用いるこ
とができるが、呈色性の基質や発行性の基質を用いる場
合は西洋ワサビ由来ベルオキシターゼ、又蛍光＋’を基
質を用いる場合はβ−ガラクトシダーゼが好ましい。

標識ずべき抗原、抗体又はハブテンは、ｌｓａ走化固相
担体の種類、測定原理、及び検出を目的とする抗原、抗
体叉はハブテンとの特％　＋’１１等により適宜選定す
ればよい。酵素標識抗体や標識抗原又はハブテンの調製
は公知の技術、例えば石Ｊｉらのヒンジ法（Ｅ、Ｉｓｈ
ｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｉｎｖｕｎｏａｓｓａｙ
。

４．２０９−３２７．１９８３）　、加藤らの方法（Ｋ
、Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、５６．
３７０−３７２．１９７５）等で実施することが出来、
種々のタンパク質架橋剤を用いて行ないえるが、それら
のなかでもヘテロバイファンクショナルな二個性結合試
薬を用いたチオール基とアミノ基との選択的な結合を利
用した標識法が好ましい。

本発明の酵素免疫測定法は、測定原理として公知の方式
、例えばサンドイッチ法、競合法等に基づき行なうこと
ができるが、本発明に係る固相担体による効果をより発
揮させるために好ましい測定原理としてはサンドイッチ
法、及び競合法である。

サンドイッチ法で行なう場合は、定量する目的の抗原、
ハブテンに特異的な抗体に酵素標識するが、抗体として
はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のどちら
でもよい。ただしポリクローナル抗体を用いる場合には
固相にはモノクローナル抗体を固定化しておくとよい。

又モノクローナル抗体を標識した場合はポリクローナル
抗体を固定化した固相を用いることもできるが、ＢＦ分
離の効率から、叉非特異的吸着を低減させるためにも、
固相固定化モノクローナル抗体と酵素標識モノクローナ
ル抗体又は酵素標識ポリクローナル抗体を絹み合わせが
好ましい。又好ましい標識抗体としては、ペプシン分解
によって得られるＦａｂ’フラクションの還元型のもの
を挙げることかできる。

競合法で行なう場合は、定量する目的の抗原、ハブテン
に特異的な抗体とアフィニティーを示す抗原に酵素標識
するが、抗原の抗原性が低下しないように反応基を有す
るスペーサーを導入した抗原を用いるとよい。

抗原又は抗体を固定化した固相担体はガラスチューブ等
に収容し定量をしようとする目的の抗原、抗体又はハブ
テンを含有する標準溶液及び酵素標識した抗原、抗体又
はハブテンを加え一定＋１．’ｉ間経過後、磁力を作用
させ固相担体を１ケ所に集め、反応液を吸引除去後、Ｐ
ＢＳ等で洗浄し、次に基質を加えさらに一定時間経過後
停止液を加え、反応を停止させる。停止後再び固相担体
を集め溶液を分別し得られた溶液を又は、ガラスチュー
ブのまま自動分光光度計等により吸光度を測定すれば、
目的物質の定量をすることができる。基質は公知のもの
でよく、測定波長は用いる基質により選定すればよく、
蛍光強度により測定してもよい。加える標準溶液は測定
対象物により要求される測定濃度が異なるが、−数的に
は０．１〜１１０００ｎ／ｍ１程度のものでよい。又酵
素標識された物質を含有する溶液の濃度は適当な吸光度
や感度が得られる様に希釈調整して用いれば良い。ガラ
スチューブ等に収容する固相担体の量としては１０〜５
００μｇ程度でよい。

上記の構成によれば固相担体の粒度を小さく効率よく反
応を行なうことができ、さらにろ過等の操作は不要で、
又ポリマーが磁性粒子に被覆されているために感度を良
好とすることができ、このため、標準溶液と固相担体と
の反応時間、及び基質と酵素との反応時間を著しく減少
させることができるのである。

［実施例］ 以下実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれらの実施例によってなんら制限されるもので
はない。

実施例１．癌胎児性抗原　（ＧＥＡ）のＣＩＡ（１）抗
ＣＥＡ抗体固定化磁性担体の調製四三酸化鉄をポリマー
コーティングした。表面にアミノ基と反応性をもつトシ
ル基を有する磁性担体（平均粒径２．６５μｍ）　１　
ｇを、抗ＣＥへモノクローナル抗体（マウス）Ｉｍｇを
溶解した０、２Ｍはう酸緩衝液５０ｍ１に加え、室温で
２４時間反応容器中で攪拌しながら反応させた。この後
反応容器外側にフェライト磁石を接触させ、担体を１ケ
所に集め反応液Ｅ清を吸引除去した。除去後０．１ＭＰ
ＢＳ（ｐＨ７，２）　　５０　ｍｌで同様な操作により
担体を洗浄した後、５０ｍ１の１Ｍエタノールアミンを
加え室温で２時間攪拌し反応させた。前回同様反応液を
除き、ＰＢＳを用い洗浄した後、１％牛匣清アルブミン
を含む０．１ＭＰＢＳｐＨ７，２に浸し使用時まで保存
した。

（２）ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥへ抗体の調製西洋ワ
サビペルオキシダーゼによる抗ＧＥＡ家兎抗体標識は石
川らのヒンジ法（Ｅ、Ｉｓｈｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、４．２０９−３２７　、
１９８３）に従って行なった。すなわち抗体ＩｇＧフラ
クションをペプシン消化し、続いて還元してチオール基
の遊離したＦａｂ’フラクションを得た。このＦａｂ’
フラクションと、Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
を用いてマレイミド基を導入した西洋ワサビペルオキシ
ダーゼとを反応させて酵素標識抗体を得た。

１ （３）　（：ＥＡのＣＩＡ　（サンドイッチ法）上記で
得られている抗体固定化磁性担体（１ｍｇ１５０μｌ）
を内径１０ｍｍのガラスチューブに加え、更に表１に示
す濃度の標準ＧＥＡ（５０μｍ）及び上記で得られてい
る酵素標識抗体を適当に希釈したもの５０μ】をそれぞ
れ加えて、３７℃、１０分間インキュベートした。イン
キュベーション後、フェライト磁石をチューブの外側に
接触させ担体を１カ所に集め、反１５ｍを吸引除去した
。更に１＋ｎｌの上記と同様のＰＢＳを用い同様な操作
で担体を３回洗浄した後、基質として１０　ｍＭＩＩ２
０２及び０．１％オルトフェニレンジアミンを含む０．
１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，５）０．２５ｍ１を加え
、３７℃、５分間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、ＩＩＩ＋１の０　、１Ｍ１１２５Ｏ４を加え反
応を停屯させた後、４９２ｎｍにおける吸光度を測定し
、検量線を作成した。結果を表１に示す。

表１の結果に示すように迅速簡便な操作にもかかわらず
、ＧＥＡがＩｎｇ／ｍｌまで精度良く測定可能であった
。これは従来報告されてきたＣＥへの高感度　２ ＩＡ や［Ａ に優るとも劣らないものである。

表１標準ＣＥＡ測定結果 実施例２．α−フェトプロティン（ＡＦＰ）のＣＩＡ（
１）抗ＡＦＰ抗体固定化磁性担体の調製抗ＡＦＰマウス
モノクローナル抗体の磁性担体への固定化は、実施例１
に記載の方法と同様に行なった。

（２）β−ガラクトシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体の調製抗
＾ＦＰ抗体とβ−ガラクトシダーゼとの結合は加藤らの
方法（Ｋ、Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌ、ＦＥＢＳ　ＬｅＬｔ
、、５６，３７０−３７２．１９７５）に従った。すな
わち抗体の還元型Ｆａｂ’フラクションを調製し、二価
性結合試薬Ｎ、Ｎ’−ｏ−オルトフェニレンジマレイミ
ドを用いて大腸菌由来β−ガラクトシダーゼと結合させ
酵素標識抗体を得た。

（３）　ＡＦＰのＥＩＡ　　（サンドイッチ法）　３ 」−記抗体固定化担体（１ｍｇ／ｍ１）５０μｍ１表２
に示す濃度の標準へＦＰ溶液５０μｍ及び適当に希釈調
整した酵素標識抗体液５０μｍを実施例１と同様デユー
プに加え、３７℃、１０分間インキュベーションした。

インキュベーション終了後、フェライト磁石を用い実施
例１と同様に反応液の吸引除去及び洗浄を行なった。基
質として０．２ｍＭの４−メチルウンベリフェリル−β
−Ｄ−ガラクトシドを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液、　
ｐｌ（７，８を０．３ｍｌ加え、３７℃、１分間インキ
ュベートした。インキュベーション後、ｔｍｔのグリシ
ン−ＮａＯＨ４ｌ衝液、　ｐＨ１Ｏ，３を加え反応を停
止させ、蛍光光度計にて蛍光強度を測定した。結果を表
２に示す。

表２の結果に示す様に、本発明による方法でＡＦＰの短
時間、簡便、高感度測定が可能となっ３重測定 実施例３．３．３’、５−１．−トリョウドサイロニン
（′１”３）の１ｉｌＡ （１）抗Ｔ３抗体固定化担体の調製 磁性担体１５０　ｍｇを、抗Ｔ３抗体０．６　ｍｇを溶
解した０、２Ｍはう酸緩衝液（ｐｉ（９，０）　ｌ０ｍ
１に加え、室温で２４時間反応させた。この後、実施例
１と同様に洗浄、エタノールアミン処理などを行ない抗
体固定化担体を調製した、。

（２）ペルオキシダーゼ標識゛ｒ３の調製ペルオキシダ
ーゼ（１ｍｇ）を２ｍｌの０　、１Ｍ１１ＢＳ　（ｐｌ
＋７．２）に溶解し、これにジメチルホルムアミドに溶
解した０、３ｍｇのＴ３を加え、さらに０．５％グルタ
ルアルデヒド溶液、０．０５ｍ１を加え室温で２．５時
間反応させた。反応後、反応液をセファデックスＧ２５
カラムに通し、０．１　Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，５）を
用いて溶出し、ペルオキシダーゼ標識Ｔ３の原液を得た
。この原液を、０．０８％２−アニリノナフタレン−６
−スルホン酸、１％牛血？１１「アルブミンを含む０．
１Ｍバルビタール緩衝液（ｐＨ８，６）を用いて好まし
い検量線が得られる濃度にδ釈し、測定に　５ した。

（３）　Ｔ３のＥＩＡ　　（競合法） 上記で得られた抗体固定化磁性担体（０，５ｍｇ／ｍ１
）１００μｍ、１％牛血清アルブミンを含有する０、１
ＭＰＢＳに溶解した標準Ｔ３溶液１００μｍ８よびペル
オキシダーゼ標識Ｔ３．５００μｌをチューブに加え、
３７℃、１０分間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、実施例１と同様に反応液の吸引除去及び洗浄を
行った。さらに実施例１と同様酵素反応を行い、検量線
を得た。結果を表３に示す。

表３の結果に示す様に、短時間、簡便に高い感度及び精
度でＴ３の測定ができた。

表３標準り測定結果 ２重測定 ［発明の効果］ 以上説明したように、酵素免疫測定法において表面がポ
リマー被覆された磁性体粒子、特に表面　６ に活性トシル基を有するポリマーで被覆された磁性担体
を使用し、抗体や抗原叉はハプテンのアミノ基を介して
結合させて得たものを［ｉ’ｉｌ相担体として用いるこ
とにより、ブランクを低くし、高感度な測定を簡便迅速
に行なうことが可能となる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）表面がアミノ基と化学的に結合できる反応性官能基
   を有するポリマーで被覆された磁性体粒子を固相担体と
   して使用することを特徴とした酵素免疫測定法。 ２）前記磁性体粒子の平均粒径が１〜１０μｍである請
   求項１に記載の方法。 ３）前記ポリマがトシル基を有し、該基を介して抗体、
   抗原又はハプテンが固定化されている請求項１に記載の
   方法。 ４）標識酵素として西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを
   使用する請求項１に記載の方法。５）標識酵素としてβ
   −ガラクトシダーゼを使用する請求項１に記載の方法。 ６）測定原理が固相固定化モノクローナル抗体または固
   相固定化ポリクローナル抗体と酵素標識モノクローナル
   抗体又は酵素標識ポリクローナル抗体を組み合わせ、抗
   原を測定するサンドイッチ法酵素免疫測定法である請求
   項１に記載の方法。 ７）測定原理が競合法酵素免疫測定法である請求項１に
   記載の方法。