JPS601564A - 分離に用いられる磁性粒子 - Google Patents

分離に用いられる磁性粒子

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JPS601564A
JPS601564A JP59095470A JP9547084A JPS601564A JP S601564 A JPS601564 A JP S601564A JP 59095470 A JP59095470 A JP 59095470A JP 9547084 A JP9547084 A JP 9547084A JP S601564 A JPS601564 A JP S601564A
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silane
magnetic
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■９発明の分野 本発明は、磁気応答粒子Ｊ３Ｊ：び周）Ｕ媒体よりのあ
る分子の分離が必要であるまたは望ましい系にお【プる
その粒子の使用に関するものである。１す１に、本発明
は、数多くの種類の有機分子およびまたは生物分子が結
合し得る安定なシラン被覆により囲繞された金属酸化物
核よりなる磁気応答粒子の調製方法に関するものである
。（結合したＪ、たは非結合の）粒子は、迅速な重力沈
降を起こずことなく水性媒体中で分散し得また、都合の
よいことに該水性媒体中から磁場を用いて再生利用され
得る。
り了ましくは、ここにおいて１足供される製ン入＃Ｊ５
、超常磁性づなわち磁場におかれた後においても永久磁
化されない粒子を産するものである。この特すＩｔは磁
気凝集形成なしに再分散することを該粒子にｒ１容する
ものである。従って、該粒子は再使用または再循環され
１ｑるものである。シラン被覆の安定度おＪ：びそれへ
の分子の共有結合性１１着もまた粒子の使用おＪ：び再
使用の一囚子である。
本発明の磁気応答粒子は、生物分子または有機分子と親
和力、吸収する能力またはある他の生物分子もしくは有
機分子と相互作用する能力により結合し得るものである
。このように結合した粒子は、これに限定されるわＩＪ
ではないが、免疫学的検定、他の生物学的検定、生化学
的もしくは酵素的反応、親和クロマ１ヘゲラフイー精製
、細胞分類ならびに診断学的および治療学的使用を含む
、分離段階または結合分子の特定位置への右向移動を伴
う種々の試験室内または生体内系に使用され得る。■１
発明の費用 ■−１゜ 生物学系にａ３Ｌ’Ｊる磁気分離ニ一般的考察重力分離
または遠心分離にかわるものとしての生物学系にお（プ
る磁気分離は詳しく調べられている〔ビー　エル　ヒル
シュへイン［Ｂ、Ｌ。
Ｈ１ｒｓｃ１１ｂｅｉｎ　］ら、ケムテツク［ＣＩ＋ｅ
ｎ＋ｔｃｃｂ　］、１９８２年３月、１７２〜１７９（
１９８２）、工Ｌ　ホウフ７　ルリ”ネフ［Ｍ、　Ｐｏ
ｕｒｆａｒｚａｎｅｌ＋　］、１ア　リ刀ンド　りＡ−
タリイ［Ｔ　ｈｅ　Ｌ　ｉｇａｎｄＱｕａｒｔＯ１川ｙ
ｌ　５　（１）　：４１　〜４７　（１９８２）ａ３よ
Ｕビー　ジエイ　ポーリング［Ｐ、Ｊ。
１−１−１ａｌｌｉｎとピー　タンニル［ｐ、　１）ｕ
ｎｎｉｌｌ’ｌ、エンザイム　ミクロバイオロジカル　
テクノロジー　［「　ｎｚｉｍｃ　、Ｍ　１ｃｒｏｂ　
、　Ｔｅｃ　旧］０１　コ　−２：２　〜１０（’１９
８０））。酵素、抗体Ｊ３よび他の生親和力吸収性物の
ような生物分子の支持体としての磁気分離可能な粒子の
使用のいくつかの利点は、一般的に認識されている。例
えば、磁性粒子は固定酵素系の固形相支持体として使用
され〔例えばピーシエイロビンソン［Ｐ、　Ｊ　、　Ｒ
ｏｂｉｎｓｏｎ　ｌら、バイオチック　バイオチック［
Ｂ　１ｏｔｅｃｈ。
１３　ｉｏｃｎｇ、］　、Ｘ　Ｖ　：　６０３〜６０６
　（１９７３）参照〕、酵素は、懸濁された固体を含む
媒体を含み酵素反応体の再循環を許容しながら媒体Ｊ：
り選択的に回収され１７る。固体支持体として免疫学的
検定または他の競合的結合検定において使用された時、
遠心分離と比へて磁性ｔｊｒ子は均質的な反応状態（最
適な結合活動を助長し、分析−吸収平衡を最小限変える
しのである。）を与え、結合した分析物の非結合の分析
物ｊ；りの分離を促進する。
遠心分離は時間消費であり、高価で−Ｌネルギーを消費
する設備を要し、放０１線学的、生物学的Ｊ５よび物理
学的危険をかかえている。一方、磁気分離は、比較的迅
速で、容易であり、簡単な設備を要りるのみである。最
後に親和り１コマ１〜グラフイー系における非極性吸着
剤を結合した磁性粒子の使用は、周知の親和クロマトグ
ラフィー系にお【ノるよりもより良好な質量移動を与え
、より失敗の少ない結果に終わる。
磁性粒子に結合づることによる分子の磁気分離の一般的
概念は、づでに論議されそしてこのにうな粒子の生物学
的目的への使用の潜在する利点は認識されているが、磁
気分離の実践的発達は、磁性粒子のいくつかの批打的特
性ににってさまたげられ、これによってほとんど光達し
なかった。
大きな磁性粒子（溶液中の直径が１０ミクロン以上を意
味する。、）は、弱磁場および弱磁場変化に対し応答し
得るが、これらは、迅速に沈吟する傾向にあり、均質的
な状Ｃ，を要求覆る反応に対してのそれらの有用性は限
られている。大きな粒子はさらに小さな粒子よりも小月
当りの表面積が限られているので、これに対してはにり
少量の物質が結合し得るのみである。人込な粒子の例と
しては、５０〜１２５μの自行を右するロビンソン［Ｒ
０１１ｒ　ｎ５ｏｎコら（上記の文献）の〜しの、６０
〜１４０μの直径を有するモスバック［ｌｙｌ　ｏｓｂ
ａｃｈ　］とアンダーリン［Ａ　ｎｄｅｒｓｏ＋１］　
（ネーチャー［Ｎａｔｕｒｅ　］、２７０：２５９〜２
６１　（１９７７）〕のものおよび５０〜１６０μの直
径を有するゲストン［Ｑ　ｕｅｓｄｏｎ　］ら（ジエイ
　アレルギークリン　イムツル［Ｊ　、　Ａ　ｌｌｅｒ
ｇｙ　Ｃｌｉｎ。
Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、］　６二Ｉ　（１）　：２３〜２７
　（１９７Ｂ＞）のものがある。ハルシュ［１−１ｅｒ
ｓｂ］とヤベルバン［Ｙ　ａｖｅｒｂｕｍ　］により調
製された複合粒子（米国特許第３，９３３，９９７号〕
は、強磁性酸化鉄（Ｆｅ：＋０＋）担体粒子を含んでい
る。酸化鉄担体粒子は直径１．５〜１０μを有している
と報告されている。しかしながら、報告された５分間の
沈降速度および複合粒子の１グラム当りわずか１２ｍｇ
の結合容■に基づくと〔エル　ニス　バーシュ［Ｌ、Ｓ
、ト１　ｅｒｓｈ　］とヤベルバン、クリンヂム　アク
タ［ＣＩｉｎ、ｃ　ｌｉｍ、Ａ　ｃｔａ　］　、６３　
：　６９〜７２　（１９７５））、溶液中の複合粒子の
実際的大きさは、実質的に１０μより大きいものと思わ
れる。
米国特許第３．’９３３．９７７号のハルシュとヤベル
バンの強磁性担体粒子は、抗ジゴキシン抗体を担体粒子
に化学的に結合するために、抗ジゴキシン抗体と反応し
得るシランでシラン化されでいる。１重々のシランカッ
プリング剤が、このために参照により組み入れられる米
国特許第３，６５２．７６１号に論議されている。複合
粒子の直径が１０μよりたぶん大きいものは、少なくと
もその一部は、バルジ；Ｌど１７ベルバンの特Ｖ［にお
いて用いられたシラン化の方法によって説明され行る。
当業者間に公知のシラン化の手法はシランの重合に選ば
れる媒体と反応性表面へのそれの析出においてたがいに
一般的に異なるものである。ｊ〜ル１ン〔エッヂ　ダブ
リュー　ライ−１−−ル［ｌｉ、Ｗ。
Ｗｅｅｔａｌｌ’］　；メソツズ　オブ　エン１アイモ
ロシイ［Ｍｃｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　］　、クイ　モスハック（編集）　［Ｋ、　Ｍｏ５
ｂａｃｌ＋（ｅｄ、　）　］　、　／ｌ　／Ｉ　：　１
３４〜１４８．１／１０　（１９７６）中）、メタノー
ル〔米国特許第３．９３３，９７７号〕およびクロロホ
ルム〔米国特許第３，６５２，７６１号〕のにうな心機
溶媒が用いられている。水性アルコールならびに酸含有
水溶液からのシラン析出（エッチ　ダブリュー　ライ−
トール、メソツズＡブエンザイモロジイ、上記、Ｐ、１
３６　（１９７６））もすでに用いられている。これら
のシラン化の手法のどちらも空気およびまたはＡ−ブン
乾燥を脱水段階に用いる。磁気担体粒子のシラン化の用
いられた時、このような脱水方法は、１１体粒子のシラ
ン化された表面が互いに接触覆ることをもｌこらし、例
えばシロキサン形成による粒子間の架橋、隣接粒子間の
ファンデルワールス相互作用もしくは物ｍ凝着等を含む
粒子間結合と潜在的に終わる。この粒子間結合は単一の
担体粒子よりもかなり大きな直径のシラン化された担体
粒子の其イ１結合したもしくは物理結合した凝集体を生
じる。
このような凝集体は、単位ｍｆｆ１当り低い表面積を有
し、そしてこれ故に、抗体、抗原または酵素のような分
子との結合に関し低い能力を右する。このにうな凝集体
はまた多くの適用に対して短かすぎる重力法ｌ１４時間
を有している。
溶液中における平均直径が約０．０３μ以下である小さ
な磁性粒子は、熱攪拌により溶液中に保たれることがで
き、それゆえ自然沈降しない。しかしながら、このＪ：
うな粒子を溶液から除去するために要求される磁場およ
び磁場変化度は、ベンチトップワークにお（）る使用に
不便な重く嵩のある磁石をそれらの発生に要求するよう
に大きいものである。、５０００工ルステツド以上の磁
場を発生し得る磁石は代表的に直径０．０３μ以下の磁
性粒子を分離するために要求される。粒子に作用する正
味の力（Ｆ）と磁場との間の概粋定但関係は、以下の等
式により与えられる〔ヒルシュベインら、上記文献〕。
Ｆ−（Ｘｖ　−Ｘｖ　）　ＶＨ（ｄ　Ｆｌ／ｄ　ｘ　）
（式中Ｘｖとｘ％はそれぞれ粒子と媒体の容積磁化率、
■は粒子の容積、１−口ま適用された磁場であり、また
ｄ　Ｈ／　ｄ　ｘは磁場変化度である。）この表現は、
粒子形状や粒子相互作用を無視したものであるからあく
まで単に概算的なものである。しかしながらこれは、磁
１９粒子にお（プる力が粒子の容積に直接比例している
ことを示しているものである。
０．０３μＪメ下の磁性粒子は、例えば米国特許第３，
５３１，４１３号中に述べられるような、いわゆる）１
０フルイド［ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ］中に用いられる。
フェロフルイドは数多くの適用を有するが、分離をもた
らすために要求される大きな磁場および大きな磁場変化
度のために、磁性粒子の周辺媒体からの分離を要求づる
適用には非実践的である。
強磁性材料は通常ｖＡ場に応答して永久磁化される。「
超常磁性」と定義される材料は磁場変化度に力を受ける
が、永久磁化はされない。磁性酸化鉄の結晶は結晶の大
きさにより、強磁性とも超常磁性ともなり得る。鉄の超
常磁性酸化物は、結晶が直径約３００八（０，０３μ）
以下のときもたらされ、それより大きな結晶は一般的に
強磁性を有する。磁場に最初にさらされた後に、強磁性
粒子は、ロビンソンら〔上記文献〕によりａ３よびハル
シュとヤベルバン〔上記文献〕ににり記されているよう
に永久磁化された粒子間の磁力のために凝集づる傾向に
ある。
報告されるところによると直径３００八Ｊ３よび表面に
アミン基を有づるものである分散可能な磁性酸化鉄粒子
は、レンバウム［Ｒｅ’ｍｂａｕｍ］の米国特許第４，
２６７．２３４丹の記載に従って、ポリエチレンイミン
の存在下、塩化第−畝と塩化第二鉄の塩基性沈澱（Ｆｅ
　”／　Ｆｅ　３”＝　１　）より調製される。報告さ
れたところでは、これらの粒子は、調製中３度磁場にさ
らされ、再分散可能であると述べられている。この磁性
粒子は、０．１μの報告された直径の磁性ポリグルタル
アルデヒド微小球体を形成するために、グルタルアルデ
ヒド懸濁重合系と混合される。ポリグルクルアルデヒド
微小球体は、タンパク質のようなアミノ含有分子への結
合を形成し得る表面上に共役アルデヒド基を右する。し
かしながら、一般的にアルデヒド基と反応し得る化合物
のみが直接ポリグルタルアルデヒド微小球体の表面に結
合され冑る。さらに、［■性ポリグルタルアルデヒド微
小球体はある適用に関して十分に安定なものではない。
ＩＩ　−２。
放射標識免疫検定法にお番プる分離 数０；Ｊ　標識免疫検定法［ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ］　（ＲＩＡ＞は、抗体に結合する放射性に標
識された物質を含んでいる物質の濃度の分析のため方法
を述べるのに用いられる用語である。放射性結合のｍは
同じ抗原に結合し得る標識されていない試験物１ｊの存
在によって変えられる。標識されていない物質は、もし
存在すると、結合位置に関して標識された物質と競合し
、これにより抗体への放射性結合のｍを減少する。結合
放射能にお（〕る減少は、標準曲線によって標識されて
いない試験物質の濃度に相関され得る。ＲＩＡの本質的
段階は、結合力を定量するために達成すべきである結合
標識と遊離標識との分離である。
被覆管、微粒子系および二抗体分離法を含む種々の一般
的分離策が放射標識免疫検定法（ＲＩＡ＞に適用された
。米国特許第３，６４６，３４６＠に記載されるｊ；う
な被覆管は、遠心分離することなく結合標識と遊離標識
との分離をなすが、２つの主たる欠点をかかえている。
第１に、管の表面は反応において用いられ得る抗体のｍ
を限定する。
第２に、抗体と抗原との反応を緩慢としながら、抗体は
いくつかの抗体／）ｒ　Ｉらはるかに（０，５０＋ｎは
ど）隔てられる〔シー　ダブリュー　バーソンズ［Ｇ、
　Ｗ、　Ｐａｒｓｏｎｓ］　、メソッズ　イン　エンザ
イモロジイ、ジエイ　ランボーン（ｍ集）　［Ｊ。
Ｌａｎａｏｎｅ（ｅｄ、　）］　７３：２２５　（１９
８１）中おＪ：びビー　エヌ　ナヤク［Ｐ、　Ｎ、　Ｎ
ａｙａｋ］、ザ　リガンド　クオータリイ４　（４）　
：３４　（１９８１））。
抗体は分離を促進づるため微粒子系に付着している。〔
例えば米国特許第３．６５．２，７６１号おＪ：び第３
，５５５．１４３号参照。〕。このような系（よ使用さ
れる抗体のほぼ無制限に近いｍをＶ［容する広い表面積
を右しているが、検定の間に該微粒子ｔよしばしば沈降
する。該管は部分的な均質化を達成するためにさえもし
ばしば攪拌されなければならない〔ピー　エム　ジャコ
ブス［Ｐ。
Ｍ　、　Ｊ　ａｃｏｌ＋ｓ　］　、　チ　リガンド　り
Ａ−タリイ４（／Ｉ）：２３〜３３（１９８１））。結
合標識と遊離標識との完全な分離をもたらづためには遠
心分離がまだ要求される。
第１抗体に対して＾められた第２抗体を用いる分離に伴
なわれて、抗体は標識された分子および標識されていな
い分子と反応し得る（同一文献）。
二抗体法と定義されるこの方法は、標識との反応中にお
【プる抗体の均質性を達成づるが、抗原をべレット化す
るための遠心分離を伴なった第１抗体と第２抗体の反応
のための培養期間を要求する。
抗体は、ノルトリブチリン、メトトレキセート、ジゴキ
シン、ヂロキシンおよびヒト胎盤性ラフ１〜ゲンに関す
る放射標識免疫検定法において遠心分離段階を消去する
ための努力において、磁性支持体に付着されたＣアール
　ニス　カメル［Ｒ，Ｓ。
Ｋ　ａｍｅ！　］ら、りｌ）　ン　ケム［Ｃｌｉｎ、ｃ
　ｌ＋ｅｍ、コ、旦（１２）：１９９７〜２００２　（
１９７］：アール　ニス　カメルとジエイ　ガードナー
［Ｊ。
Ｇａｒｄｎｅｒ］　、クリン　チム　アクタ［Ｃｌ１ｎ
。
Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ　］　、８９　：　３６３〜３７０
　（１９７８〉：米国特〃［第３，９３３．９９７号ニ
ジ−ダウニス［Ｃ，Ｄａｗｅｓ］とジエイ　ガードナー
、クリン　チム　アクタ、８６　：　３５３〜３５６（
１９７Ｂ）；ディー　ニス　イザキシＡス［Ｄ。
Ｓ、Ｉ　ｔｈａｋｉｓｓｉｏｓｌら、クリン　チム　ア
クタ、１工：６９〜８４　（１９７８）：ディー　エス
イサキシＡスとディー　オー　クビアトウィクス［Ｄ、
　Ｏ，Ｋｕｂｉａｔｏｗｔｃｚ］　、クリン　ケム２３
（１１）：　２０７２〜２０７９　（１９７７）および
エル　ナイエ［Ｌ、Ｎｙｅ］ら、クリン　チムアクタ、
６９：３８７〜３９６　（１９７６）　、このため参照
ににって組み入れられた。〕。このような方法は大ぎな
粒径（直径１０〜１００μ〉に悩まされ、検定の間拡散
した抗体をイ？つための攪拌を必要とする。実質的分離
は磁場のない状態での自然沈降により起こるので、これ
らの従前の方法は、実際は単に磁気的に補助されたΦ力
分離である。沈降の問題は、米国特許第４，１７７．２
５３号中で、空洞ガラスやポリプロピレンのような低密
反核（直径４〜１０μ）の粒子表面の一部を被膜（厚さ
４ｍμ〜１０μ）してなる磁化粒子を用いるものである
試みによりディビス［Ｄ　ａｖｉｓ］とジエンタＣＪａ
口ｊａ］により提唱されている。抗エストラジオール抗
体は、このような粒子に結合し、そしてこれらのエスト
ラジオールＲＩＡにお１プる潜在的有用性が示された。
この試みは沈降の問題を克服したかもしれなが、その粒
径と磁性被膜はそれでもなお表面積にｄ３　ＬＪる限定
を有しそれにより抗体との結合位賄の有効性において限
定を有している。
■−３゜ 他の生物学的系にお１ノる磁気分離の適用磁気分離は、
ＲＩＡ以外の他の生物学的系においても適用されている
。螢光免疫検定法［Ｎｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
　］　（Ｆ　Ｉ△）や酵素免疫検定法［ｅｎｚｙｍｅ−
ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙコ　（ＥＩＡ）のようないくつ
かの・非同位性元素的免疫検定法は、抗体の結合した（
または抗原の結合した）磁性粒子を用いるものを光；ヱ
させた。競合的結合の主要点は螢光支持体および酵素が
それぞれ標識として放射性同位元素のかかる他はＲＩＡ
におりるものとＦｒＡ　８３よびＥＩＡにおいて同一で
ある。説明のために、エム　ボーファルザネフ［Ｍ　、
　ｐ　ｏｕｆａｒｚａｎｅｈｌらおよびアール　ニス　
カメル［Ｒ，Ｓ、　Ｋａｍｅｌ］らは、抗体がブロモシ
アン活性化により結合する強磁性のセルロース／酸化鉄
粒子を用いて、それぞれコルチゾールａ３　Ｊ：びフェ
ニトインに関する磁化可能固形相［ｍａｇｎａｔｉｚａ
ｂｌｅ　５ｏｌｉｄ−ｐｈａｓｃ＋］　Ｆ　１Ａを発展
させた［エム　ボーファルザネフら、クリン　ケム　、
２６　（６）：　７３０〜７３３　（１９８０）：アー
ル　ニス　カメルら、クリン　ケム、２６　（９）：　
１２Ｂ’１〜１２８４．（，１９８０）］。
１（ＩＥの測定に関する非競合的固形相ナンドイッチ技
法［ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　５ｏｌｉｄ　ｐ
ｌｅａｓｅｓａｎｄｗｉｃｂ　ｔｅｃｂｎｉｑｕｅ　］
　Ｅ　Ｉ△はジエイ　エルグストン［Ｊ　、Ｌ、　Ｇ　
ｕｅｓｄｏｎコらにより）ホぺられでいる〔ジエイ　ア
レルギー　クリン　イムツル［Ｊ、Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃ
ｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎａｌ、、６１　＜　１　）　：２３
〜２７（１９７８））。この方法によると、グルタルア
ルデヒド活性化にＪ：り磁性ポリアクリルアミド−アガ
ロース　ピーズに結合した抗１ａＥ抗体は、結合をさせ
るためにＩｇＥを含有試験試料で培養される。結合した
Ｉ（ＩＥは、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラク
トシダーがのいずれかで標識された第２抗１（ＩＥ抗体
を添加することで定■される。酵素で標識された第２抗
体は、サンドインチ状を形成しながら第１抗体と結合し
たＩｏＥと複合し、そして粒子は磁気的に分離される。
結合したＩ（ＩＩＥに比例したものである粒子に関連し
た酵素活性度は、次にＩ（ＩＥ定量をなしながら計測さ
れる。
ビタミンＢ　にＰＡターる磁化可Ｏ［固形相非免疫放Ｑ
・ｊ線検定法［ｍａｇｎｅｔｉｚａｂｌｅ　５ｏｌｉｄ
　ｐｌｅａｓｃ　＋＋ｏｎ　−ｉｍｍｕａ　ｒａｄｉｏ
ａｓｓａｙ］は、ディー　■ス　イザキシオスとディー
　Ａ−クビア］〜ウイクスにより報告されている〔クリ
ン　ケムλ３（１１）：２０７２へ−２０７９（１９７
７））。非免疫敢用線検定法における競合的結合の主要
点は、散開性同位元素標識を用いる双方の検定法でＲＩ
Ａにお【プるものと同様である。しかしながら、ＲＩＡ
が抗体−抗原結合に基づくものである一方、非免疫放射
線検定法はビタミンＢ１２のようなある生物分子の特定
または非特定の結合、担体もしくは受容体タンパクとの
結合または相互作用に基づくものである。イザキシオス
とクビアトウイクスの磁性粒子は、水不溶性タンパク基
質中に包埋［ｅｍｂｅｄ　コされたバリウムフェライト
粒子から成るものであつた。
今述べた固形組生物学的検定法にお（プるこれらの使用
の池に、磁性粒子はその他の生物学的検定法の種々のも
のにおいても使用されている。磁性粒子は、混合母集団
より選定ウィルス、選定ハクデリアおＪ：び他の選定細
胞を分１ｉ１１　するために細胞分類系に用いられてい
る（米国特許第３，９７０゜５１８号、第４，２３０，
６８５号、ｉｙよび第４゜２６７．２３４号、このため
参照により紺み入れられる。〕。これらは溶液から分子
を選択的に分離および精製するために親和クロマトグラ
フィー系に用いられており、そして特にコロイド懸ン向
液からの精製に有用である〔ケイ　モスバック［Ｋ　、
　ＭＯ３Ｉ）ａｃｌｌ］とエル　アンダーソン［Ｌ。
Ａ　ｌ１ｄｅｒｓＯｎ　］　、ネイチｔ　−［Ｎａｊｕ
ｒｅ　］　１７０　：２５９〜２６１　（１９７７）、
このため参照により組み入れられる。）。磁性粒子はま
た、固定化酵素系における固形相支持体として使用され
ている。磁性粒子に結合した酵素は生化学的反応に触媒
作用を及ばずのに十分な時間基質と接触さぜられる。そ
の後酵素は、生成物および非反応基質から磁気的に分離
し１ｑ、そして潜在的に再使用可能である。磁性粒子は
、α−キモトリプシンおよびβ−カラクトシダーゼ〔米
国特許第４，１５２゜２１０号、このため参照により組
み入れられる。〕ならびにグルコース　イソメラーＬ〔
米国性Ｖ［第４．３４３，９０１号、このため参照によ
り組み入れられる。〕に対づる支持体どして固定化酵素
系において使用されている。
■、術語 「磁気応答粒子［ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｒｅｓｐ
ｏｎｓｉｖｅｐａｒ口ｃｌｅｌ　Ｊないし「磁性粒子［
ｍａｇｎｅｔｉｃｐａｒｔｉｃｌｅ］　Ｊなる用語は、
顕著な車ツノ沈降を起こすことなく水性媒体中に分散可
能もしくは懸濁可能でありそして懸濁液から磁場をかり
ることにより分離可能である粒子であり、かつ該粒子は
生親和性吸着剤が共有結合し得る、吸収的もしくは共心
的に結合した、有機感応性を生ずる外装ないしは被膜に
よって通常囲繞された磁性金属酸化物核よりなる粒子で
あることと定義される。
［磁性群ｊｍａｇｎｃｒｏｃｌｕｓｔｅｒｌ　Ｊなる用
ｔＯは、［磁気応答粒子Ｊ　ｄ３よび「磁性粒子」の類
？３．語である。
［金属酸化物核［ｍｅｔａｌ　ｏｘｉｄｅ　ｃｏｒｅ］
　Ｊはフココロスピネル［ｆｅｒｒｏｓｐｉｎｅｌ　コ
構造を有し、Ｉｉ′ｉ１しあるいは異なる遷移金属の三
価または二価のカヂＡンからなる遷移金属酸化物の結晶
もしくは結晶群と定義される。詳説すると、金属酸化物
核は酸化鉄の超常磁性結晶群もしくは酸化鉄の強磁性結
晶群より構成され１りるまたは酸化鉄の強磁性単結晶に
にりなり得る。
Ｆ生親和性吸着剤［ｂｉｏａｆｆｉｎｉｔｙ　ａｂｓｏ
ｒｂｅｎｔ　］　Ｊなる用語は、他の生物学的分子との
特定もしく（よ非特定の結合もしくは相互作用し）する
生物学的あるいは他のイ１機的分子と定義され、ここに
Ｊ３いて結合もしくは相互作用は、［リガンド／リゲー
ト［１ｉｇａｎｄ／　ｌｉｇａｔｅｌ　Ｊ結合もしくは
相互作用に関連し得、また何ら限定されるものではない
が、抗体／抗原、抗体／ハブテン、酵素／基質、酵素／
阻止因子、酵素／補助因子、結合タンパク／基質、担体
タンパク／基層、ラクヂン／炭水化物、受容体／ホルモ
ン、受容体／作用因子もしくは抑制因子／誘光因子の結
合もしくはａ　Ｈ１’ｒ＝用などで例示される。
「結合磁気応答粒子［ｃｏｐｌｅｄ　ｍａｇｎｅｔｉｃ
ａｌｌｙｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　］
　Ｊないし［結合磁性粒子［ｃｏｐｌｅｄ　ｍａｇｎｅ
ｔｉｃ　ｐａｒｔｉｃｌｅ］　Ｊなる用語ハ、コないし
それ以上の種類の生親和性吸着剤が共有結合によって結
合される磁性粒子と定義され、ここにおいて共有結合は
、磁性粒子の被膜と生親和性吸着剤の双方におりる結合
に有効な官能性に依存づるアミド、エステル、エーテル
、スルホンアミド、ジスルフィド、アゾまたは他の安定
な右礪的の結合であり得る。
［シラン［５ｉｌａｎｅ］　Ｊなる用語は、二官０ヒ性
のオルガノシランに関するものであり、米国１！ｒ許第
３．６５２，７６１号中に分子のケイ素部分が無機物に
親和性を右する一方、分子中の有機部分が有機物と結合
するように（７４成されたことを特徴とするケイ素−官
能性ケイ素化合物と定義されている。シランはそのケイ
素−官能性の利点により金属酸化物核の適当な？１１７
覆材料であり、そしてその有機官ｎと性によって生親和
性吸着剤に結合し得るものである。
［超常磁性［：　ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｓ
ｍ］　Ｊなる用５台は、約３００八以下の結晶粒径を有
する酸化鉄により表わされる磁気的挙動と定義され、こ
こにおいて該挙動は、永久磁化されることなく磁場に応
答１１ることにより特徴づけられる。
１強磁性［ｒｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｓｍ］　Ｊなる用
語は、約５００Å以上の結晶粒径を有する酸化鉄により
表わされる磁気的挙動と定義され、ここにおいて該挙動
は、永久磁化を伴なって磁場に応答Ｊ−ることにより特
徴づりられる。
「フェロフルイド［ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄコ］なる用語
は、良好に分離された通常５０〜５００への副変域粒径
の磁性粒子の、担体液体おにび界面活性剤中におけるコ
ロイド状分散体よりなる液体と定義され、ここにおいて
該粒子は、最高約５０００エルスデツドの磁場の存在に
おいてさえも、液体担体中に実質的に均一に分散された
状態をどどめるものである。
「免疫検定法［１ｎｕｎ旧１０８ｓｓａｙ］　Ｊなる用
語は、多クーロン性もしくは単クーロン性抗体と抗原と
の免疫学的結合もしくは免疫学的相Ｈ作用に基づく溶液
中にお（プる分析物のｉ農度もしくは量の計測に関する
方法と定義され、ここに４３いて該方法は、（ａ）結合
していない分析物から結合した分析物を分離覆ることを
要求し、（ｂ）結合した分析物およびまたは結合してい
ない分析物の計測の手段として成用性同位元素標識、螢
光測定標識、酵素標識、化学ルミネッセンス標識または
他の標識を用い、そして（Ｃ）結合した計測可能な１７
識のｍが、元来溶液中にある分析物の量に一般的に逆比
例でる場合「競合的」とあるいは結合した目測可能な標
識の慣が、元来溶液中にある分析物の吊と一般的に直接
比例づ−る場合は「非競合的」と述べられ得る。標識は
、抗原中、抗体中あるいは二抗体法においては第２抗体
中にあり得る。免疫検定法は、何ら限定されるわけでは
ないが例えば放１１’１標識免疫検定法（Ｒ１へ）、免
疫放ｑ・１線測定検定法　［ｉｍｍｕｌＩＯｌ”ａｄｌ
ＯｍｅｔｒｉＣａｓｓａｙコ　（ＩＲＭ　△　）　、螢
光免疫検定法（ＦＩＡ＞、酵素免疫検定法（ＦＩＡ）お
よびサン１−インチ法免疫検定法などが例示されうる。
「結合検定法［ｌ＋ｉ＋＋ｄｉ＋＋ｇ　ａｓｓａｙ　］
　Ｊないし［非免疫学的検定法［ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｅ
　ａｓｓａｙ］　Ｊなる用語は、生親和性吸着剤と他の
生物学的もしくは右）成約分子との抗体／抗原の結合も
しくは相互作用以外の１４定もしくは非特定の結合もし
くは相り作用に基づく溶液中の分析物のＷｉ度もしくは
用の４測に関する方法と定義され、ここにＪ３いて該方
法は（ａ）結合していない分析物から結合した分析物を
分ｔｉｔ−ｙることを要求し、（ｂ　）　ｒ、’ｉ合し
た分析物　。
およびまたは結合していない分析物を４測する手段とし
て、成用性同位元素標識、螢光；１測標識、酵素標識、
化学ルミネッセンス標識またはその他の標識を用い、そ
して（Ｃ）結合した計測可能な標識の旦が、元来溶液中
にある分析物の位に一般的に逆比例する場合「競合的」
とあるいは結合したｉｌ…り可能な標識の吊が、元来溶
液中にある分析物の量に一般的に直接比例する場合は［
非競合的と）ホベられ得る。
「固定化酵素反応［ｉｍｍｏｌ＋何１ｚｅｄ　ｅｎｚｙ
ｍｅｒｅａｃｔｉｏｎ　］なる用釦は、酵素的に触媒作
用された生化学的な転化、合成または劣化と定義され、
ここにおいて酵素分子またはその活性１ヴ置は、自由に
溶解しないだ【プでなく、周辺媒体中に懸濁されるまた
は周辺媒体に接触されかつ該媒体Ｊ、り再生され得るま
たは分離され得る固形用支持体に吸収的結合または共有
結合しているものである。
［親和クロマ１〜グラフ−（−［ａｆｆｉｎｉｔｙｃｌ
＋ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　］　Ｊなる用語は、選定
分子をその周辺媒体より、周辺媒イ小中に懸濁されるＪ
：たは周辺媒体中に接触され、かつ該媒体より再生され
１りるまたは分段１され得る固形用支持体に吸収的結合
または共イ１結合している生親和性吸着剤との選定分子
の結合または相互作用に基づいて、分離、隔離およびま
たは精製することと定義される。
ＩＶ　、発明の概要 本発明は周）Ｕ媒体からの分子の分離または周辺媒体中
の分子の直接的な移動を伴なう生物学的適用にイｊ用な
新規な磁性粒子をｌｉＺ供づることを目的どづる。本発
明はま１＝該磁性粒子の調製および使用に関づる方法と
組成物を提供する。
該磁性粒子は、選定された結合化学作用により広範な種
類の生親和性吸着剤が共有結合し得るものである吸着結
合もしくは其イｉ結合シラン被膜ににり一般的に囲繞さ
れた磁１１金ＦＵＳ酸化物核ｊ：りなるものである。こ
の磁性金属酸化物核は好ましくは超富滋慴酸化鉄結晶Ｂ
Ｙを含有し、この被膜は好ましくは、シラン重合体であ
り、そしてこの結合化学作用は、何ら限定されるわ【ブ
ではないが、ジアゾ化カップリング、カルボジイミドカ
ップリングおにびグルタルアルデヒドカップリングを含
・むものである。
本明りＩｌ書中に述べる方法ににり調製される該磁１１
粒子は、該磁性粒子を数多くの検定方法にＪ５１ｊる使
用に十分許容し得る時間水性媒体中に分１１にされた状
態を保持し得るものである。該磁性粒子は好ましくは粒
径約０．１〜１．５μのものである。
注目すべきことに、この範囲の平均粒径を有Ｊる本発明
の好ましい磁性粒子は、生親和性吸着剤との結合に高い
能力を与えるものである約１００〜１５０ｍ２１０はど
の高い表面積を有して調製され得るものである。この粒
径範囲の磁性粒子は、より大きな粒子のもつ迅速な沈降
の問題を克服しそしてより小さな粒子を分離１するため
に要求された磁場および磁場変化を発生するための大き
な磁石の必要性を除去するものである。本発明の磁性粒
子の分離をなすのに使用される磁石は、約１゜Ｏ〜約１
０００Ｉルスデツドのｍ場を発生するものしか要求され
ない。このような磁場は、磁性粒子の分散を保つ容器よ
りも好ましく小ざいものである永久磁石で得られること
ができ、これゆえ、ベンチトップ使用にも適している。
強磁性粒子も本発明のいくつかの適用には使用され得る
が、超常磁性の挙動を有する粒子が、強磁性粒子に関連
する磁気凝集を示すことがなくかつ再分散および再使用
が可能であることｌ）＋　ｌろｂｒよれる。
該磁性粒子の調製方法ｌＪ１、微細な金属酸化物結晶を
形成されるためにアルカリ土類金属塩を沈澱させ、角力
散さけそして結晶を水中でおＪ：ひ電解液中で洗浄する
ことでなる。磁気分離は、結晶か超常磁性である場合に
洗浄液中の結晶を収集づ゛るのに用いられ１ｑる。結晶
（ま次にこの金１ｔｌｉ酸化物に吸着結合または共有結
合し得かつ生親和性吸着剤との結合に関する有機官能性
を供〜し得る物質で被覆される。
本発明の一実施態様において金属酸化物核を囲繞する被
膜はシランの重合体である。シラン化は、金ＪＩＮＫ酸
化物結晶を酸性有機液中に再分散さけ、号ルガノシラン
を添加し、水および４１機溶液のいずれにも況和し１ｑ
る湿潤剤のひ在−■・に加熱により面木し、そしてｔり
られた磁性シラン化金属酸化物を洗浄することよりなさ
れ得る。
本発明の磁性粒子は、周知の結合化学作用により、例え
ばしかしながら何ら限定されることはないが、抗体、抗
原および特定の結合タンパクなどのような生親和性吸着
剤と共有結合することができ、そしてこの結合磁性粒子
は、ｔＥＦ　ｉｔり中の分析物の計測に用いられる免疫
検定法もしくは他の結合検定法に使用づることかできる
。このような検定法は好ましくは、生親和性吸着剤に結
合しておりかつ非標識分析物および標識分析物の双方に
結合または相互作用し得る磁性粒子の存在十に、標識分
析物の既知■と共に非（７識分析物の未知■を含む試料
をｔｌＰ合し、生ずる結合または相互作用をなさけ、磁
性粒子を磁気分則し、磁ＩＩ１粒子に関連する標識のｍ
およびまたは溶液中に遊離している標識の爪を計測し、
そして試料中の分析物のａ隼を決定するために標識の吊
を、相似して作成された標準曲線に相関させることにに
りなる。
本発明の磁性粒子は、固定化酵素系、特に酵素の再循環
が望Ｊれる固定化酵素系にＪハノる使用に適したもので
ある。酵素反応はりＴましくは、基質を含有づる反応混
合物中に酵素結合磁性ち°Ｌ子を分散させ、生じる酵素
反応を４イさせ、酵素結合磁性粒子を生成物および未反
応基質を含有覆る反応混合物から磁気分離し、そして望
まｒｌる場合には♀）ましい基質中に該磁性粒子を再分
散する（これにより酵不は再使用される。）ことで行な
われる。
親和クロマトグラフィー分離および細胞選別（よ本発明
の磁性粒子を用いて達成されることができ、りＹましく
け、隔離されるまたは精製されるべき分子または細胞を
２む溶液Ｊ、たは懸澗Ｈｋ中に生親和性吸着剤結合磁性
粒子を分散させ、生親和性吸着剤と望まれる分子または
望まれる細胞に相互作用をなさせ、溶液または懸濁液よ
り該粒子を磁気分ｌｌ＋ｌｉ　Ｌ、、そして磁１／１粒
子から隔ｌｌｌ１された分子または細胞を回収すること
によりなされる。
さらに、本発明の磁性粒子は、該粒子にｖ４合した特別
の生親和性吸着剤により認識された細胞または組織の診
断学的位置測定に、さらにまた該粒子に結合した治療剤
の病理学的部位への磁気的に指向された配給にＪ３いて
生体内系に使用され１ワる。
本発明の磁性粒子は、既存の磁性粒子の粒径、表面積、
重力沈降速度および磁気的特性に関連づる問題点を克服
したものである。約１．５詩間を超える重力沈降Ｕう間
は、本発明の磁性粒子で達成りることかでさる、ここに
おいてｍ力沈降時間は、磁場の存在下におりる５０％ま
で低下づる本発明の磁ｆ１粒子の分散体の１局り度に要
する時間であると定義される。約１０分間未満の磁気分
離時間は、磁（Ｊ粒子の分散体を含んでいる容器をこの
容器より容積的に大きくない永久磁石の磁４６スカと接
触させることによって本発明のｍ性粒子で達成づること
ができる、ここにおいて磁気分離Ｒ間は、９５９６まで
低下づる分散体の濁り度に要Ｊる時間であると定義され
る。さらに、水門１０書中に述べられた磁性ち°ｌ子の
金屈酸化物核を囲繞゛りる被膜どじてのシランの使…は
、より限定された結合官能性をもつ公知の磁性粒子被膜
と比べて同様に広範囲の結合条件下にお（プる広範な種
類の分子との結合を可能とでる。
本発明の好ましい磁気応答粒子は、超７ｊｒ　！ｊ性の
特性を維持しながら低磁場（１００〜１０００１ルステ
ツド）において該粒子の十分な分離を生じるものである
超常磁性結晶群よりなる金属酸化物核を有するものであ
る。粒子の凝集は、意図された生物学的検定法またはそ
の他の適用において使用されるために該磁気粒子の分ｔ
ｉｋ　’ｊ十分訂容し１ｑる時間実質的な重力沈降がな
きにうに好Ｊ、しくは十分小さなものである粒子を生成
するように、粒子合成の量制御される。磁気応答粒子中
に超常磁性核を有することの利点は、このにうな粒子が
くり返し磁場にさらされ３りるということである。この
ような粒子は、永久磁化されず、それゆえ磁気凝集を起
こさないために、このＪ：つな粒子は再分ｎｋおよび再
使用できる。シラン化の後においてさえも、結晶群によ
りつくられた核を右Ｊる本発明の好ましい粒子は、この
ような粒子が開放または多孔質構造を有することを示η
ものである単位用量当りの非常に高い表面積および一般
的に相応する高い結合能力を承りものである。
第■節で述べた生物学的系において使用された既存の磁
性粒子のいずれも、本発明の磁性粒子と同様な、粒径、
表面積、結合融通性、沈降特性および磁気的挙動をイｊ
していない。本発明の磁性粒子は、文献に、１３いて報
告される多くの検定法、酵素固定化法、細胞選別法およ
び親和クロマトグラフィー法に適しており、そして実際
このような手法において過去に経験された粒子沈降およ
び再使用に関１−る問題を克服しているものである。
■８本発明の詳細な説明 ■−１゜ 磁性粒子調製 本発明の好ましい磁性粒子は、２つの段階により調製さ
れ得る。第一に、超常磁性酸化鉄が、例えばＦｅＣｌ２
およびＦｅｃｌ、３のような二価（Ｆｅ２″゛〉および
三価（Ｆｃ３＋）の鉄塩のアルカリ中の沈澱により調製
される。第二にオルガノシラン被膜が、この酸化鉄に適
用される。
Ｆｅ２十とＦｅ３＋との比は、最終製品中におりる実質
的変更をＵずに、畝の一定モルｍを維持しながらＦｅ２
＋の最を増加することで変えられ得る。
ｔＪ７ましいＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比は２／１であるが４
／１のＦｅ２”／Ｆｅ３＋比もまた、第Ｖｌ−１節の製
法において適当に作用１−る（第Ｖｌ−７節をさらに参
照のこと。）。１／２のＦｅ２す／Ｆｅ３＋比は、それ
より高いＦｅ２セ／Ｆｅ３＋比Ｊ、す１ｑられたものＪ
：りわずかに品Ｓ＋ｊｆの劣った磁性粒子を生ずる。こ
のｂｉｔ性酸化物は「フリート」を起づ傾向にあるまた
は第Ｖｌ　−１節の洗（１１方法において川沿となり、
そして粒径は２／１ないし４／１のＦｅ２モ、／　Ｆ　
Ｃ１比から１９られたものよりより不均一である。それ
にもかかわらず、これは、第Ｖｌ−７節で例示されるよ
うな有用な磁性粒子を生じるにうにシラン化され得るも
のである。
酸化ｉスの水性溶液は、超常磁性酸化鉄の結晶性沈澱物
を形成することをもたらり例えば水酸化す１−リウムの
ようなアルカリ中に混合される。この沈澱物は、磁気分
離を用いて水でくり返し洗浄され、そし−Ｃ中性ｐ　ｌ
−１値に）±するまで再分散される。
この沈澱物は次に一度例えば塩化ナトリウム溶油のよう
な電解液中で洗浄される。電解液洗ひ段階は、酸化鉄結
晶の純度を保証するために重要である。最後に沈澱物は
、メタノールで１．０％（Ｖ／Ｖ）水の残留物を残すと
ころまで洗浄される。
洗浄段階における懸ｗ４液から酸化鉄を分離するための
磁場のくり返しの使用は、超常磁性により容易である。
いかに多くの回数核粒子が磁場におかれたとしてｂｌこ
れらは決して永久磁化づ゛ることなく、従ってゆるやか
な１景打をすれば再分散される。永久磁化される（強磁
性）金属酸化物は、磁場にさらした後に磁気凝集する傾
向にありそして均一に再分散できないので、このＪ、う
な洗浄手段によっては調製され得ない。
マグネシウム塩、マンガン塩、コバルト塩、ニックル塩
、亜鉛塩および銅Ｊｍのような他の２価の遷移金属塩は
、磁性金ｆｉｌ酸化物を得るのにこの沈澱手法において
１（ｎ）塩に変えることができる。
例えば第Ｖ１１節の手法にお（プるＦｅＣｊ！２の２価
のコバルト塩化物（Ｃｏ　Ｃｌ２）での置き換えは、強
磁性金属酸化物粒子を生成した。Ｃ０Ｃ（１２でこのに
うに調製される強磁性金Ｒ１１Ｉ！化物粒子は、該粒子
を磁化しないため、洗浄と洗浄の間に遠心分離または濾
過などの周知手段を用いて磁場の不存在下に洗浄され得
る。得られた強磁性金属酸化物が水性媒体中で分散体を
とどめるのに十分小さな粒径である限り、これらはまた
シラン化され得、そして例えばある放躬標識免疫検定杼
、のような１回の磁気分離を要求する系におりる使用の
ために生親和性吸着剤に結合され１！′する。強磁性は
、再分散または再使用を要求づ−る適用にお（プる粒子
の有用性を限定する。
アルカリ沈澱により調製された磁性全屈酸化物は（Φ々
の適当なシラン類のいずれか１つにより被覆され１ｑる
。シランカップリング材わ１は、２つの特徴を有してお
り、それはこれらが金属酸化物に吸６結合または共有結
合し得ることと、これらが有機官能性により生親和性吸
着剤と共有結合を形成し得ることである。
本発明の磁性粒子の金属酸化物核を被覆づ′るのにシラ
ン化が用いられる場合、一般式Ｒ−ｓ　ｒ＜０Ｘ）３　
（ただし式中、（ＯＸ）３は代表的にはトリメトキシも
しくはトリメトキシのようなｌ〜リアルコシキ基であり
、またＲは末端にアミノフェル、アミノ、ヒドロキシル
、スルフィドリル、脂肪性、親水性もしくは混成官能性
（両親媒性）を有するアリル、アルキルもしくはアラル
キル基または生親和性吸着剤に共有結合するのに適した
他の右Ｉ１ｍである。〕を有するオルカッシランが用い
られ得る。このようなオルカッシランは、何ら限定され
るわけではないが例えばＰ−アミノフェニルトリメ１−
キシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、
Ｎ−２−アミノエチル−３−アミノプロピルトリメトキ
シシラン、トリアミノ官能性シラン（１−１２Ｎ　Ｃｌ
−１２０日２−Ｎ１−１−ＣＨ２Ｃｌ−１２−ＮＨ−Ｃ
Ｈ２Ｃｌ−１２−ＣＩ−１２−３ｉ　−（ＯＣＩ−１３
＞３　）　、ｎ−ドテシルトリ１トキシシランおにびｒ
）−へキシルトリメ１−キシシランを含むものである。
〔他の可ロヒなシランカップリング剤に関しては、米国
特許第３，６５２，７６１号を参照のこと、参照にＪこ
り組み入れられた、上記あり。〕。一般的に、クロロシ
ランは放出される塩化水素酸を中和する準備がなされて
いないと用いられ得ない。
本発明の一実施態様において、シランは酸性有機溶媒中
から金属酸化物核上に析出される。このシラン化反応は
２段階的に起こる。第一に、トリメトキシシランは、メ
タノールのような有機溶媒、水および例えばリン酸もし
くは氷酢酸からなるものの中に入れられる。これはシラ
ン重合体を形成するように縮合される。
Ｒ−Ｓ　ｉ　（ＯＣＨ３）→ ＲＲ １ ト１Ｏ−８ｉ　−０−Ｓｔ　−０− 「 と１４　叶 第二に、これらの重合体は、金属酸化物と結合する、ｄ
３ぞらくこれは、表面Ｏ＋−＋　Ｗとのｌ１ｔｆ水によ
る共有結合を形成することによるしのと思われる。
金属酸化物へのシラン重合体の吸着もまた可能である。
本発明に係る酸性有機シラン化方法の重要な点は、シラ
ン重合体の金属酸化物への吸着結合または共有結合をも
たらりために用いられたＤＩ２Ｉ２法である。この結合
は、有機溶媒と水のどちらにも混和しくｑる湿潤剤の存
在下にシラン重合体と金属酸化物とを加熱することで達
成される。約２９０℃の沸点を右Ｊるグリヒロールが適
当な湿潤剤である。クリセロールの存在下に約１６０〜
１７０℃に加熱することは、２つの目的を与える。これ
は水、有機溶媒（これは例えば、メタノール、エタノー
ル、ジＡキυン、アレトンまたはその他の適当な極性溶
媒であり行る。）および過剰なシランＬｌｉｆｆｉ体の
蒸発を保Ｋｌｌりる。さらに、グリ上ロールの存在は、
脱水が乾燥の！こめに加熱により行なわれる公知の他の
シラン化方法の生来の問題である粒子の凝集ないしは塊
状化および粒子の潜在的架橋を防ぐものである。
本発明の他の実施態様において、酸性水性シラン化方法
が、シラン重合体を金属酸化物核上に析出するために用
いられる。ここにおいて金属酸化物は、１０９６シラン
単里体の酸性（Ｐ　Ｉ−１約４．５〉水溶液中に懸濁さ
れる。シラン化は、約２峙間９０’〜９５℃で加熱する
ことににり達成される。
クリセロール脱水がまた使用される。
酸化鉄粒子上のシランの存在は、以下の観察により確証
された。第一に、６Ｎ−塩酸での処理の後、該酸化鉄は
溶解し、シラン化されていない酸化鉄が同様に消化され
ても存在しない白色の熱定形の残留物が残った。この酸
不溶性残留物がシランてあった。第二に、第Ｖｌ　−４
節のジアゾ化法は、該粒子への抗体の（＝Ｊ着を許容し
た。ジアゾ化ばシラン化されていない粒子の付着は促進
しない。最後に、抗体の１４着は撞めて安定であり、金
属酸化物への抗体の吸着によるものよりもかなりすぐれ
て安定している。
■−２゜ シランカップリング化学作用 シラン被膜の選択および磁性粒子への生親和性吸着剤の
結合に対する特定の化学作用に関する最初の考察は、生
親和性吸１′３剤それ自体の状態、たとえば温度やｐ　
Ｈなどのにうな因子に対する感受性ならびに結合に関づ
−る分子上の反応基の有用性である。
例えば、抗体が磁性粒子に結合づべきである場合には、
結合化学作用は免疫グロブリンタンパクに非破壊的であ
るべきであり、共有結合は、抗イホ／抗原相互作用がａ
ｌｔｉないし妨害されないようにタンパク分子上の部位
に形成されるへきであり、そして得られる結合は選択さ
れた結合条件下で安定であるべきである。同様に、酵素
が磁性粒子に結合すべぎである場合には、結合化学作用
は酵素タンパクを変性づべさではなく、そして共有結合
は活性もしくは触媒作用性部位並びに酵素／基質もしく
は酵素／補助因子相ｎ作用にＪ：り干渉され冑るその他
の部位以外の分子上の部位で形成されるべきである。
種々のカップリング化学作用が当業者に公知であり、ま
た上述した参照により組み入れられた米国特許第３，６
５２，７６１号においてｊホベられている。詳述Ｊると
、ジアゾ化は、１つ−アミノフェニル末端化シランを免
疫グロブリンに結合りることに用いらね得る。免疫グロ
ブリンおよび他のクンバクの３−アミノプロピル末端化
シランおＪ、びＮ−２−アミンエチル−３−アミノフコ
ニル末端化シランへの結合はグルタルアルデヒドの使用
にＪ：り達成されでいる。この手法は２つの１４本的段
階ずなわら、１）未反応のグルタルアルデヒドの除去を
後に行なうものであるグルタルアルデヒドとの反応によ
る粒子の活性化と、２〉未反応のタンパクの除去を後に
行なうものであるタンパクの活性化粒子との反応をより
なるものである。この手法はタンパクおよび細胞の固定
化に広範に使用される〔エイ　エム　クリバッフ［Ａ、
Ｍ。
Ｋ　１ｉｂａｎｏｖ　］　、ザイエンス［３ｃｉｅｎｃ
ｃｌ　、２１０　ニア２２　（１９８３）、このため参
照により組み入れられた。〕磁気粒子がカルボキシ末端
化シランによって被覆された場合には、タンパクおよび
免疫グロブリンのような生親和性吸着剤は、最初に該粒
子を３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイ
ミドで処］！Ｉ！　することによってこれらの結合され
冑る。
一般的にある有機官能性を供与するシランで被覆された
磁性粒子は、表面上にすでに存在する官能性をより望ま
しい官能性に置き換えるＪ：うに変更されをる。例えば
、ジアゾ誘導体は、ｐ−ニトロ−安息香酸との反応、二
１−ロ塁のアミンへの還元、そして次に亜硝酸でのジア
ゾ化により３−アミノプロピルトリエトキシシランがら
調製され得る。同じシランが、アミノ官能基のチオホス
ゲンとの反応によりイソチオシアノアルキルシラン誘導
体へ転化され得る。
磁性粒子への結合をもたらまために、生親和性吸着剤の
水性溶液がシラン被膜粒子ど室温もしくはそれ以下の温
度で接触され１！７る。タンパク（ないしは免疫グロブ
リン）が結合されるべき場合゛、一般的に１＝１０〜１
：３０のタンパク（ｍｇ）：粒子（ｍｇ）の比が用いら
れる。約３〜２４時間の接触時間が通常、結合に十分で
ある。この時間の問ｐ１−１は、生親和性吸着剤を変性
さμない値に維持されそしてその最良の１直は、例えば
アゾ結合の場合ｐ　ｌ−ｌ　８〜９であるような、形成
される結合の種類に合わせたものである。
ざらに詳細に第ＶＩ−５節、第１ｎ　−８節ｄ３よび第
Ｖｌ−１０ｆｉｔ）でそれぞれ述べられるジアゾ化法、
カルボジイミド法またはグルタルアルデヒド法のいずれ
かによる抗体のシラン被覆磁性粒子へ結合の後に、抗体
は以下の苛酷な処理を行なった後でさえも磁気性をとど
めたニリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に５０℃で２４時
間、ＰＢＳ中に３７℃で２１日間、１Ｍ−塩化ナトリウ
ム中に２３℃で３０分間および室温でエタノールまたは
メタノール中での反復的洗浄。酸に鉄に吸着された抗体
は、実質的にこれらのいかなる処Ｊ５！によっても解離
されない。これらの結果は、シランが非常に堅固に金属
酸化物と結合していることＪ３　Ｊ：び抗体の該粒子へ
の結合は本質的に不可逆的共有結合よりなされたもので
あるということを示すしのである。シランの金属酸化物
への生親和性吸着剤（例えば抗休）の共有結合を伴なっ
た堅固な結合（Ｊ、商品的に重要な特質である、結合磁
性粒子上へ安定性を与える特徴点である。
■−３゜ 生物学的検定法にお（プる磁性粒子の使用本発明の磁性
粒子は、第３節で定義されたような免疫検定法および他
の結合検定法に使用され（ｑる。診断学的または研究的
目的に使用される検定法の最も普及した種類は、競合的
結合の主１４−にｙＪづいた放射５識免疫検定法、螢光
免疫検定法、ｒＩシ索免疫検定法Ｊ３よび非免疫放射線
検定法である。
基本的に、抗原のようなりゲート［ｌｉｇａｔｅ］に指
向した例えば抗体もしくは特異性結合タンパクのような
リガンド［ｌｉｇａｎｔ］は、過剰な標識リケード（“
リケード〉Ｃ飽和される〔あるいは、競合的検定法は標
識リガンドと非標識リゲー１−とで行なわれ得る。サン
ドイッヂ検定法とげばれる非競合的検定法もまた広範に
用いられ１うる。〕本発明の方法によると、リガンドは
磁性粒子に結合され４ る。標識の例としては、１へリチウム、　Ｃ１５７ＣＯ
Ｊ−３よび好ましくは　ＩのＪζうな敢１．ｌ’ｌ性同
位元木、ロークミンイソチＡシアネー１〜おＪ、ひフル
オレセインイソチオシアネートのＪ、うな螢光測定標識
、またアルカリボスファターゼｄ５よびβ−１〕−カラ
ク［−シダーゼのような酵素（一般的に酵素反応が計測
され得る容易さで選ばれる。）などかある。非標識リグ
−１〜がりガントに　リグ　Ｉ〜を伴なって加えられる
と、非標識リグ−１〜の標識リケード（”リグ−１−）
に対する比が増加り゛るので、にり少ないスリゲートが
リガンド−リグ−１〜？！２合体中に見い出されるであ
ろう。リガンド−リケード複合体が“リケードから物理
的に分断され得ると、試験物質中の非標識リケードの■
が決定され得る。
非標識リケードを計測覆るために、４ｆｆｌ　Ｑ’＝曲
線が作成されな【プればならない。これはりガントとス
リゲートのある固定した量を混合し、そしてそれぞれに
非標識リケードの既知量をＪ＋口えることにより行なわ
れる。反応が完了した際、リガンド−”リケード複合体
は“リケードから分離される。そして収集されたりガン
ト−大すグート複合体中の標識を添加した非標識リケー
ドに関係ざゼたグラフが作成される。実験試料中の非標
識リゲー１〜のｍを決定Ｊるために、試料の部分標本（
アリクウＡツｌ−［ａｌｉｑｕｏｔ　］　）が標準曲線
を行るのに用いられたのど同しりガント−“リグ−１〜
ｉ！２合物中に添加される。リガント−リケード複合体
は収集され、標識が測定され、そしＣ非標識リガン１〜
の炎が標準曲線から読み取られる。これは、ノことえと
のような複合体でもリガント−”リグ−１〜相互作用を
伺も妨害しない限り、いずれの試お１でも可能である。
本発明の方法により、リガン１〜−−２リグート複合体
は遊離７リグー１〜から磁気的に分離される。
この一般的方法論は、ホルモン、医薬剤、ビタミンおよ
び補助因子、血液学的物質、ウィルス抗原、核酸、ヌジ
レオチド、グリコシドならびに糖を含む広範な種類の化
合物の計測に関する検定法において適用されｉ！７るも
のである。詳細のために、第１表にあげた化合物はすべ
て磁性粒子免疫検定法および磁性粒子結合検定法により
測定可能である〔ディー　フレイフィルダー ［Ｄ、　Ｆｒｅｉｒｉｌｄｅｒ　］　、７　イシｈルｔ
＜イオ’ｙミスドリー［Ｐ　ｌ＋ｙｓｉｃａｌ　Ｂ　１
ｏｃｌ＋ｅｍｉｓｔｒｙ　］　、　Ｉ）　２５９、ダブ
リュー　エッチ　フリーマン　アンド＝１ンパニー［Ｗ
、　ｌ−１，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａ＋＋〔Ｉ　Ｃｏｍｐａ
ｎｙ］、サンフランシスコ（１９７６）を参照のこと。
〕。
（以下余白） 第　１　表 磁気粒子検定法で測定可能な物質 ホルモン類 甲状腺ホルモン類　１　プロラクチン 〈サイロキシン、　１　ザイロ力ルシトニントリアイオ
ドチロニン、１　上皮小体ホルモン甲状腺結合グロブリ
ン、１　ヒト絨毛性ゴナドトロ甲状腺刺激ホルモン、　
１　ピン サイログロブリン）　１　ヒト胎盤性ラクトゲン１　下
垂体後菓製ベプヂド 胃賜ホルモン類　１　類（オキシ１〜シン、〈グルカゴ
ン、ガスｉ−１パップレシン、ニューリン、エンテログ
ル力　１　ロフィジン）ボン、セクレチン、パ　ブラジ
キニン ンクレオザイミン、　コルチゾール ＄ 血管作動性膜ペプチド、　コルチコトロピン（第１表続
き） 工１−ストリオール　１　ニストラジオール医　薬　剤
　（ ジゴキシン　１　テトラヒドロカンナヒ′ゾロフィリン
　１　ノール モルヒネおよびアヘン　１　パルピッレート類のアルカ
ロイドｙＥ４１　ニコチンおよび代謝心臓グリコシド類
　１　生産物類 プロスタグランジン類　１　フェノチアジン類りぜルギ
ン酸および　アンフェタミン類そ′）誘導体類　１ ビタミン類および補助因子類 ビタミンＤ　１　ビタミンＢ１２ 菓酸　１　サイクリックΔＭＰ 血液学的物質　１ フィブリノーゲン、１　プロトロンビンフィブリンおよ
び　１　［−ランスフェリンフィブリノペプチド　１　
およびフエリチンプラスミノダンおよび　１１°ノス０
′１′イエチンプラスミン　１　抗血液向性因子 く第１表続き） ’７　（／Ｌ／　７４ＪＬ　Ｕｊ’＝　１肝炎抗原　ｉ
　ポリオウィルス 単純ヘルペス　狂犬病ウィルス ワタシニア　°　Ｑ熱つィルス ■ 種々のΔ群アルボ　Ａラム病つィルス ウィルス類 ■ 核酸類およびヌクレオチド類 ［”ＮΔ　ｌ　ＲＮＡ シトシン誘導体□類　１ （払下＆ｅ１） ｖ＝４゜ 固定化酸素系にＪハブる磁性粒子の使用酵素は、第Ｖ−
２節で述べたような方法に」、って、本発明の磁性粒子
に結合し得る。これらは、反応が起った後の生成物から
の酵素の分離を容易とするためならびに酵素の再使用お
よび再循環を許容するために、固定化酸素系において、
特にバッチ反応器もしくは連続流動１話拌タンク反応器
［ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｆｌｏｗ　５ｔｉｒｒｅｄ−
ｔａｎｋ　ｒｃａｃｔｏｒｌ　１（Ｃ８ＴＲ）において
使用され得る。生化学反応にお（）る酵素結合磁性粒子
の使用に関する１つの方法が、上記した参照により組み
入れられＩこ米国特許第４，１５２，２１０号でダンニ
ル［Ｄｕｎｎｉｌｌ］とリリー［１−ｉ１１ｙ］により
述べられている。本発明の磁性粒子は、沈降の問題を解
消しそして酵素の再循環を許容覆るものであるため、タ
ンニルとリリーの磁性粒子と有利に置き換えられ得る。
簡単に古うと、基質は、反応が最も促進されるｐｌ−１
、温度および基質濃度の条件下で、酵素結合磁性粒子と
接触される。反応が完了したのち、該粒子は、生成物が
酵素から離れて回収され得るところとなる塊状液体（溶
液もしくは懸ｖＡ液であり得る。）から磁気分離される
。酵素結合ｌ１ｉｌ性粒子は次に、再使用され得る。固
定化酵素（非磁性支持体に結合したもの）は、いくらか
の工業的に重要な酵素反応にＪ３いて使用されており、
そのいくつかは第２表にあげられる。本発明の磁↑１粒
子は、カラス、セラミックス、ポリアクリルアミド、Ｄ
ＥＡＥ−贅ルロース、キヂン、多孔質シリカ、セルロー
スビーズおよびアルミノケイ！ｉ！塩などがある従前に
用いられた非磁性固定相に置き換えられ得るものである
。
（以下余白） 第２表 工業的に重要な固定化酵崇反１心 酵　素　反応物／生成物 アミログルコシダーゼ　マルトース／グルコースグルコ
ースオキシダービ　グルコース／グルコン酸グルコアミ
ラーゼ　デンプン／グルコース、デキストリン／グリコ
ース β−アミラーゼ　デンプン／フル１〜−ス、インベルタ
ーゼ　スクロース／′グルーＩ−スグルコース　イソメ
ラーゼ　グルコース／フルクトースラフターぜ　ラクト
ース／クルコース トリブシン　タンパク類、′アミノ酸類アミノアクリラ
ーＩｆｆ　Ｎ−アセチル−Ｄ「〜メチオニン／メチＡニ
ンリゾヂーム　リゾディックティカス球菌〔ミクロコ・
ノカスリゾディツクデカス［Ｍ、　ｈｙｓｏｄｃＨζｔ
ｉｃｕｓ　］　）ｖ−５゜ 親和クロマトグラフィーにおりる 磁性粒子の使用 親和クロア１〜グラフイーのプロ廿スは、分子に固有な
特徴、すなわち酵素もしくは抗体のような生親和性吸着
剤によって高い選択性を有して認識するらしくは認識さ
れる能力およびこれらの生親和性吸着剤への結合もしく
は吸着する能力の使用をはかることにより、分子の有効
的な隔離を可能とする。親和クロマトグラフィーのプロ
廿ス１．Ｌ！１ｊに、選択的生親和性吸着材もしくは選
択性リガンドを望まれる種族が含ｌ、れているものであ
る。数種の物質を含有する溶液、すなわちリグートと接
触Ｊ−るように設【プることを包含Ｊるものである。
リグートは不溶性の支持体ないし母体に結合されている
ものである。りガントに選択的に結合さ。
る。非結合の種族は洗浄により除去される。リグートは
次に、例えば緩衝剤のにうな特定の脱離剤で吸着リゲー
１〜の脱離を引き起こすようなｌ）Ｈもしくはイオン強
度にＪ３いて溶出させることで回収される。
本発明の方法においては、磁性粒子はりガントが結合さ
れる不溶性の支持体として使用され得る。
該粒子は隔離されるべきリグ−１〜を含有り−るバッチ
反応器中に懸濁され１１する。結合リゲートを有する該
粒子は洗かと洗浄の間に磁気弁１ｆｔ１１を行なって塊
状流体から磁気的に分離されそして洗浄され行る。最後
に、リゲートは該粒子から脱１１ｉ１［−Ｊることによ
り回収され１ｑる。本発明の磁性粒子は第３表にあげた
例示されるような種々の親和系に使用され１９る。
（以下余白） 第　３　表 親　和　系 りガンド、不動物体　リグ−１へ、可溶性物体１ｔｌｌ
　、＋ト剤、補助因子、　酵素：アポ酵索配合団、小合
性塁買 酵　素　重合性閉止剤 核酸、単鎖　核酸、補体類 ハプテン；抗原　抗体 抗体（ＩｇＧ）　タンパク類；多糖類 ｔ１ｉ糖類：多糖類　レクヂン類；受容体類レクチン　
糖タンパク類：受容体類 微小標的化合物類　結合タンパク類 結合タンパク　微小標的化合物類 （ノソ、下　フイ〒に　１→） Ｖｌ　、実施例 ＶＴ　−１。
金属酸化物の調製 金属酸化物粒子は以下のこと１ｊｒ（ＩＩ）（Ｆｅ２＋
）のＪｇと谷ス（Ｉ［１）（Ｆｅ”す）のｆｌ蕩のン容
液をアルカリと？昆合することにより調製される。すな
１）　チ、０．５Ｍ塩化第一１２（ＦｅＣ１２）と０．
２５ＭＩＭ化第二鉄（Ｆｅ　Ｃ１，ｓ　＞の溶液（２ｏ
ｏｍ　ｉ　＞が５Ｍ水酸化す１〜リウム（Ｎａ○１」）
（２００ｍ　ｌ　）と６０°Ｃで、１００ｍｆｆ１の蒸
溜水を入れた５００ｍ１ビーカーに双方の溶液を江くこ
とにより混合された。特に注釈しない限りづぺての段階
は室温にて行なわれた。この混合物は、約２分間撹拌さ
れ、この時間の間に黒色の磁気法′１２が形成された。
沈降した後にＪ３いて、沈降沈澱物の容積は約１７５ｍ
、ｇであった。この沈澱物中の鉄酸化物の濃度は約６Ｑ
ｍｇ／ｍ、ｅであつＩこく下記に測定した鉄１１．２ｍ
Ｏの収率に基づく。）。
これは、例えはレコーディングデーブ用の標準的磁性酸
化物であるビフイザー　＃２２２８γＦＱ２　０３　［
Ｐ［１ｚｃｒ　＃２２２８　７”Ｆｅ　２０３］　〔ピ
フィザー　ミネラルズ［Ｐ　ｆｉｚｃｒＭ　１ｎｅｒａ
ｌｓ　］　、ピグメンツ　アンド　メタルズディビジョ
ン［Ｐ　ｉｕｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｍ　ｃｔａｌｓＤ　
１ｖｉｓｉｏｎ　］　、ニュー　３−り、ニューヨーク
州〕のＪ：うな、水性スラリー中に約７００Ｉｌ１ｇ／
ｍ、２のａ度で得られる市販の磁性酸化鉄とは箸しく異
なるものである。この比較は、本方法にＪ：り調製され
た粒子の微細性を強調することも含んでいる。
非常に微細な粒子はら密な充填ができないおにび最も多
くの水を吸い入れる。一方、より大さくそしてＪ：りち
密な粒子は、ち密に充填され水を除去する。
沈澱物は次に、ｐｌ−１ペーパーで測定してｐｌ−１６
〜８に達するまで水で洗浄された。以下の洗浄方法が用
いられた。りなわら、該粒子は２℃ビーカーに入れた１
、８℃の水の中に懸濁されそして磁気的抽出により収集
された。このビーカーは高さ１／２インチ直径６インチ
の環状磁石の上端におかれ、そして磁性粒子がこれによ
り沈降した。水は、水を移す間磁石をビーカーの底部に
保持Ｊることで、該粒子の損失なく取り除かれた。同様
の洗浄り法が、容積が必要により調整されることを除い
て、すべての洗浄を通して用いられた。代表的に、中性
ｐ１−１に達するのに３回の洗浄で充分であった。該磁
性粒子は次に一度、同じビーカー中で０．０２Ｍ塩化ナ
トリウム（Ｎａ　Ｃ１，）　１．０℃で洗浄された。
水は次に、メ１−二１；ジシランの加水分解に触媒作用
を及ぼすだめの水の痕跡を残しながら、メタノールで置
き換えられた（第ｖＩ−２節参照）。これは、０．２ｆ
ｖｌ　Ｎａ　Ｃ（ｔ　８００ｍ　ｆｌで吸出し、総容ｆ
ｆ１１１をエタノールで運ぶことによりなされる。
この物質は再懸濁され、そして磁気的抽出され、懸濁液
ａｏｏｍｘが除去されそして他の８００ｍ℃のメタノー
ルが加えられた。メタノールの３回添加の後、該酸化物
は約１％（Ｖ／Ｖ）水である溶液中においてシラン化の
用乃をした。沈澱物の一部が７０℃で２４時間乾燥され
Ｃ１−ｆｆｉされた結果、１１．２ａの酸化鉄が形成さ
れていた。
この方法を通して、磁性酸化１ス粒子は、その超常磁性
の特性ゆえ、磁場にさらりことをくり返しＣも永久磁化
沈澱となることは決してないということに注１」づへさ
ｒある。従って、水洗ン争およびメタノールでの置換え
処理の間粒子を再懸濁さけるためには単にゆるやかな撹
拌が要求されるにづ−ぎなかった。
Ｖｌ　−２。
シラン化 約１％（Ｖ／Ｖ）の水を含むメタノール２５０ｍ１中に
懸濁された磁性酸化鉄粒子（第Ｖｌ−１節参照）はウイ
ルテス　２３　ボモグナイザ−［Ｖｉｒｌｉｓ　２３　
１＋ｏｍｏｇｅ＋＋１ｚｅｒ　］　（ヴイルテスコンパ
ニー　インコーボレーテツｌ”　［Ｖ　＋ｒｔｉ３Ｃｏ
ｍｐａｎｙ、ｌ　ｎｃ、コ、ガーディナー、ニュー　Ｊ
　−り州）中へ入れられた。Ａル１〜亜リン酸（フィッ
シャー　ザイエンディフインク　コーポレーション［Ｆ
ｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、コ、ビッツ
ハーグ、ペンシルバニア州）２（ＩとＰ−アミノフェニ
ルトリメ１〜キシシラン（Ａ−７０２５、ベトラーチ　
システムス　インコーホレーア・ｙド［Ｐｅｔｒａｒｃ
ｌ＋　Ｓｙｓｔｅｍ　、Ｉ　１１ｃ、］　、ブリスト−
ル、ペンシルバニア州）ＩＱｌｌｌ（ｌが加えられた。
別のｆ）様において、氷ｆｌｉ１酸５５ｎ１℃がＡル１
−亜リン酸２ｇと置き換えられた。混合物は、２３，０
００１”　ｌ］　Ｉｌ＋で１０分間およＵ９．ＯＯＯｒ
ｐｍで１２０分間均質化された。内容物はクリピロール
２００１＋２を入れたガラス製の５００ｍ１ビーカー中
ｌ＼江き移され、そして１６０°〜１７０°Ｃの温度に
ｊヱタるｊ：でホットプレート上で加熱された。混合物
は寮副へ冷Ｎ］させられた。加熱およｄ′３び冷却の両
段階ども窒素条（’ｌ下で撹拌しながら行なわれた。
グリセロール粒子スラリー（容積的２００ｍｆｆ１）が
２２ビーカーに入れられた水１．５℃中に）１ぎ入れら
れ、該Ｍ子は第Ｖｌ　−１節で述べた方法に従い水で徹
底的に（通常４回）洗浄された。
このシラン化方法は、３−アミノプロピルトリメキシシ
ラン、Ｎ−２−アミノ１チル−３−アミノプロピルトリ
メトキシシラン、Ｎ−ドデシルトリエトキシシランＪ３
よひＮ−ヘキシルトリメ１ヘキシシラン〔それぞれ△−
０８００．Ａ−０７００゜Ｄ−６２２４およびＨ−７３
３４、ペトラーヂシステムス　インツーボレーデッド、
ブリストール、ペンシルバニア州〕を含むその他のシラ
ンを用いても行なわれた。
上記のシラン化方法に代わる方法どじで、シランはまた
酸性水溶液から超常磁性酸化鉄（第Ｖｌ　−１節におい
て調製された。）上に析出された。
ＦＣ２″−／Ｆｅ３土比が２である超常（１に性酸化畝
が第Ｖｌ−１節に述へたｊ；うにして水で洗浄された。
メタノールへの移行は省かれた。粒子１ｇ　（沈降粒子
的２０ｍ、９）が３−アミノプロピルトリメ１〜キシシ
ラン１０％水溶液１００ｍｆｆ１と混合された。
ｐｌ−１は、氷耐酸で４．５に調節された。混合物は、
電気モーターに取付けられた金属撹拌板で混合しながら
９０〜９５℃で２時間加熱された。冷却の後、粒子は水
（１００ｍＡ）で３回、メタノール（１００ｍ℃）で３
回、そし【さらに水（１００Ｉｌｌ　Ａ　）で３回洗浄
された。粒子上のシランの存在がｍ認された。
Ｖｌ　−３。
シラン化磁性粒子の物理的特性 Ｐ−アミノフェニルシラン化粒子、３−アミノプロピル
シラン化粒子およびＮ−２−アミン土ブルー３−アミノ
プロピルシラン化粒子に関する光散乱により測定された
平均粒径および窒素カス吸着により測定された１グラム
当りの表面積が第４表に示される。粒子表面積は、タン
パクをＭ合づ゛る粒子の能力に密接に関係するものであ
り、３００　ｍｇ／　（Ｉはどの多聞のタンパクかＮ−
２−アミノエチル−３−アミノプロピルシラン化粒子に
結合され得、これは従前に報告された粒子の１２ｍｇ（
タンパク）７ｇの１直よりも極めて高い１直である（ハ
ルシュとヤベルバン、シラン　ケム　アクタ６３：６９
（１９７５））。比較のために、シラン化磁気鉱の２つ
の仮定球状粒子に関する１グラム当りの表面積が第４表
中にあけられている。該仮定粒子の密度は、シラン化磁
気鉱粒子の密度の概算である２、５ｇ／ｃｃであると解
釈された。それぞれの仮定粒子の粒径は、仮定粒子に関
づる事項が記載された隣の本発明の粒子の平均粒径であ
ると解釈された。窒素ガス吸むによって測定された本発
明の粒子の１グラム当りの表面積が同じ粒径のシラン化
磁気鉱の完全な球体に関づるム１算された１グラム当り
の表面積よりもはるかに大きいことが観察できる。本発
明の粒子のこのより大きな１グラム当りの表面積は、本
発明の粒子が多孔性（１４漬あるいはさもな【）れは開
放６４造を有していることを示すものである。粒径０．
０１μを有するシラン化磁気鉱の仮定真球体は約１２０
ｍ２／ｑのｉ＋−Ｒされた１グラム当りの表面積を有し
ている。
（以下余白） 第Ｖｌ−１節および第Ｖｌ−２節の方法により調製され
たシラン化磁化粒子の平均粒径は、文献中に述べられた
他の磁化粒子の粒径よりもかなり小さいので、従前に報
告されたこれらの他の磁気粒子の重力沈降時間よりも、
該シラン化磁気粒子はより遅延された重力沈降時間を示
寸。例えば、ここに）ホベられる該粒子の沈降時間は約
１５０分であり、これはａ）１０μより大きい粒径と概
棹されＩこハルシュとヤベルバンの粒子に関する約５分
〔シラン　ラム　アクタ　６３：６９（１９７５））お
よび粒径５０・〜１６０μである日ビンソンらの粒子に
関する約１分〔バイオチック　バイオチック　ＸＶ　：
　６０３　（１９７３））とははなはだ異なるものであ
る。
本発明のシラン化磁化粒子は、これらが弱い磁場に対し
て迅速に応答するものであるにもかかわらず、それらの
粒径および組成の結果としての重力沈降の非常に遅い速
度を右することにより特徴ずけられる。これは、磁場の
不在化に自然的粒子沈腎によりもたらされるシラン化磁
気粒子のＷ１濁の時間を通しての濁り度における変化が
サマリウム−コバルト磁石の存在下にお（プる濁り度と
比較される第１図に描かれる。３０分経過後において、
懸濁液の濁り度は、１！場の不在下においてわずかに１
０％より大きいものとしか変化しなかったことが観察さ
れ得る。しかしながら、弱い磁場の存在下においては、
粒子懸濁液の濁り度は、６分以内にその最初の値の９５
％以上近くも降下した。
他の実験において、３０分間でわずか約４％の濁り麿の
減少が観察された。
３−アミノトリメトキシシランでシラン化され）；超常
磁性粉子ＭＳＩＮＪ粒子）の顕微鏡写真図が第２図にお
いて示されている。粒子は形状および粒径において異な
つ−Ｃいること、そしてこれらは、形状において粗い球
状を現わすものである個々の超常磁性結晶（３００Ａ以
下ンの群から形成されていることを観察することができ
る。
■−４ ４）−イロキシンに対する抗体への アミノフェニルシラン化磁性粒子の結合第一に、サイロ
キシン（Ｔ４）抗血清が以下のように調製された。
Ｔ４で免疫されたヒツジの血清〔ラジオアッセイ　シス
テムズ　ラボラ１〜リース　インコーホレーテッド［Ｒ
ａｄｉｏａｓｓａｙ　Ｓ　ｙＳｔｅｍＳＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ　、Ｉ　ｎｃ、］、カーソン、カリフォルニ
ア州）５．０ｍｌが５０ｍｆｆ１３ｉ心分１１１ｔＦｌ
デユープへ入れられた。リン酸緩衝食塩水の５．Ｏｎ＋
　、９アリクＡツ１−の２つが８０％飽和硫化アンモニ
ウム１５１１＋１．を伴なって、１）Ｈ７，４，，４℃
で該デユープに加えられた。混合の後に、該チューブは
４℃で９０分間保存された。混合物は次に、４℃、３０
００ｒｐｍで３０分間；仝心分離された。
上澄み成分は取り移され、そしてペレットはＰＢＳ５゜
Ｏｍ、２中に再懸濁され清澄となるまで溶解された。こ
のＴ４抗血）６調製品（ＰＢＳ中１：２）は、ＰＢＳで
透析され、ＰＢＳ４０ｍｌが入れられた５０ｎ＋１遠心
分離（幾チューブへ透析管から移されて総容（ｆｉ５０
ｍｆｆｉとされた。このＴ４抗血清調製物（ＰＢＳ中１
：１０）は、結合に用いられるまで冷蔵された。
１Ｎ−塩Ｗ　（Ｈ（１）１００ｍ　Ｉｌ中のｐ−アミノ
フェニルシラン化粒子１７４０ｍｇへ、０．６Ｍ−亜硝
酸ナトリウム（Ｎａ　ＮＯ２）２５ｍ　Ｅが加えられた
。このＮａ　ＮＯ２は、凍結しないように注意してＯ°
〜５℃の温度を維持しながら、粒子／ト１（ｌ混合物の
表面下にゆっくりと加えられた。
１０分経過した後、混合物は、０°〜５℃の湿度に保っ
たまま、１．２Ｍ−Ｎａ　ＯＨ６５ｍ　ｆｔおよび１Ｍ
−炭酸水素ナトリウム（Ｎａ　ＨＣＯ３）１８１１＋ｕ
を加えることにより１）ｌ−１７，５〜８．５とされた
。次にサイロキシンに対づる抗体を含むヒツジの血清の
γ−グロブリン成分１００ｍｇを含むＰＢＳ５０ｍｌ　
（上記に述べたＴ４抗血清調製物）が加えられた。ｐＨ
は、混合物がＯ°〜５℃で１８時間培養される間、７．
５〜８．５の間に保たれた。得られた抗体結合粒子は、
ｐｔ−１７，２の０゜１Ｍ−リン酸ナトリウム緩別剤で
３回、ＩＭ−Ｎａ　Ｃ１，で、メタノールで、１Ｍ−Ｎ
ａＣ（ｌで、そしてさらに０．１Ｍ−リン酸ナトリウム
緩衝剤で洗浄し、完全に洗浄された。この洗浄段階は２
度ないしそれ以上くり返された。すべての洗浄は、第Ｖ
ｌ　−１節で述べたように粒子を分散さＵそしてこれを
磁気分離することによりなされた。洗浄の後、粒子はＰ
ＢＳ中に再懸濁されそして一晩５０℃で培養されＩこ。
この粒子は前に）小べたようにしてメタノール、１Ｍ−
Ｎａ　ＣＡおよび０．１Ｍ−リン酸ナトリウム緩衝剤中
で洗浄し、そして２度フリーＴ４　ｔ−レーリー−バッ
ファしｌ’：ｒｅｅＴ４Ｔｒａｃｅｒ　Ｂｕｆｆｅｒ　
］中で洗浄し、放８４　ｍ　減免ｍ　検定法に用いるま
で４℃にて保存された。
Ｖｌ　−５。
サイ１］キシンに対する磁性粒子成用 標識免疫検定法 サイロキシンの放ＱＪ　標識免疫検定法（ＲＩＡ）に用
いられる抗体結合磁性粒子の量は、以下のＲＩＡ法を用
いて経験的に決定された。
標準の２マイクロリツトル（μ℃）が、１〜レーサー（
追跡子）５００μｍ１５よび磁気ＫＭ了１００μ℃を伴
なって１２Ｘ７５＋＋＋ｍポリプロピレン製チューブ中
ヘピペツ１〜を用いて入れられＩＣ０渦動の後、混合物
は３７℃で１５分間培養され、その後該チューブは１０
分間マグネチックラック上に齢かれた。このマグネチッ
クラックは、それぞれのチューブの底部がくる位置に円
筒状の［バ１−ン［ｂｕｔｔｏｎコ　Ｊ　磁石　〔イ　
ンノＪ　−１８［１ｎｃｏｒｌ　８　コ　、インディア
ナ　ジェネラル　マグネチック　プロダクツ　コーポレ
ーション［Ｉ　ｎｄｉａｎａ　Ｇ　ｅｎｅｒａｌＭａｇ
ｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｒｐ、］　、パル
パライソ、インディアナ化〕を有する試験管ホルダーか
ら成るものであった。抗体および結合トレーサーを右す
る磁性粒子は、マグネチックラックを転倒し上ｔＵみ液
を捨てることで除去されるものである非結合１〜レーザ
ーを残したまま、チューブの底部へ引きつけられた。こ
のベレット中の放射０ヒは、トラカー　１２９０　ガン
マ　カウンター［Ｔ　ｒａｃｏｒ１２９０　Ｇａｍｍａ
Ｃｏｕｎｔｅｒ］　（トラカー　アナリテック　インコ
ーボレーテツ１〜［Ｔ　ｒａｃｏｒＡ　１１ａｌｙＬｔ
ｏ　、　、１　ｎＣ，コ、エルク　クローブビレツジ、
イリノイ州〕により測定された。
またこの検定法に用いられた試薬は次の通りである。標
準は、Ｔ４をＴ４のないヒト血清にｆａｌｌえることに
より調製された。、Ｔ４は、ノコ−ター［Ｃａｒｔｅｒ
　］の方法（シラン　クム２４，３６２（１９７８））
に従い、活性木炭を除去するために濾過を伴なう活性木
炭での血清の培養にｊ：り血清より除去された。トレー
サーは、ケンブリッジシブカル　ダイアグノステイクス
［ＣａｍｂｒｉｄｇｃＭ　ｅｄｔｃａｌ　Ｄ　ｔａｇｎ
ｏｓｔｉｃｓｌ　Ｊ：り購入された　Ｉ−サイロキシン
（＃１５’５）であり、ウシ血清アルブミン１００μ（
１／ｍ　１．　、サリチル酸塩１０μ９／ｍ℃おにび８
−アミジノナフタレン−８−スルホン！１１１５０μａ
／ｍ（ｔを含む０．０１Ｍ　ｌ−リスバッフｙｙ　［Ｔ
　ｒｉｓ　ｂｕｆ丁ｅｒ’：ｌ　（２−アミノ−２−と
１：ｒ］キシメチル−１，３−プロパンジオール）中へ
希釈された。０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸
緩衝良塩水（ＰＢＳ）中における種々の濃度での磁性粒
子が、Ｔ４測定に適した粒子濃度を決定するためＲＩＡ
中に使用された。チューブ当りの約５０μｇの磁気粒子
の量がＲＩＡのために選択された。このｍは、Ｔ４の望
まれる′ａ度範囲（０〜３２μｇ／ｄ、１４＞に関して
抗体／３＼らのトレーサーの良好な置き換えを許容した
。
このように最適範囲を測定したことで、上記に述べたＲ
ＩＡ法が、Ｔ４に関する放射標識免疫検定標準曲線を作
成するためにチューブ当り約５０μ９の磁性粒子を用い
て行なわれた。このＲＩＡにより得られた結果を第５表
に示す。
第　５　表 ０μＱ／ｄｆｔ　３６７６３ ２ｔｔａ　／ｄ　ｎ　２４８８０ ４μｏ／ｄ、９　１８９１６ ８μｕ／ｄＡ　１３７３７ １６μ（１／ｄｌ　１０１５９ ３２μｑ／ｄＱ　７６３２ 総　ｍ　６９２１９ Ｖｌ　−６。
ゾロフィリンに関する磁性粒子 成用標識免疫検定法 ウリーギ抗テロフィン抗体は第Ｖｌ−４節に述べたたち
のと同様の方法により調製されＰ−アミノフェニルシラ
ン化粒子に結合された。この抗７１．ＴＩフィリン抗体
結合磁性粒子は、以下の態様で収用標識免疫検定法に用
いられた。テオフィリン４＝　Ｑ”（テオフィリンを有
しないヒト面漬に、テオフィリンを加えることで得られ
た。＞２０μＡ　、／２ゝ■−テオフィリントレーサー
（クリ二カルアツセイス［Ｃｌ１ｎｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ　Ｅ　（クンブリッジ、マサチコーセツツ
州）製）１００μ℃および抗体結合磁性粒子が渦動１１
ｆｆｉ拌された。室温での１５分間の培養の後に、１０
分間の磁気分離が行なわれた。イ票準曲線が作成された
。１０られだデータを第６表に示Ｊ−０（Ｌゾ下　金９
） 第　Ｇ　表 ０μｇ　／ｄｌ　３５０６１ ２μ（１／ｄ　１　２８２１　７ ８μｕｌｄｆｌ　１９７９７ ２０μ（１／ｄ　ｆｌ　１　３３５２ ６０μｇ　／ｄ１　８１４Ｂ 総　酊　５２４．６１ Ｖｌ　−７。
Ｔ４敢用標識免疫検定法にお【プる磁性粒子のＦｅ２”
／Ｆｅ３＋比の変化の影響 第Ｖ１１節の結晶化方法に従い、６９、の一定モル■は
ＭＥ　）ＷするがＦｅ２“／「Ｃ３十比を４から０．５
の間で変えて、磁性酸化鉄が調製された。これらの粒子
はそれぞれ第Ｖ１〜２ｍ、第Ｖｌ　−４節およびｍ　Ｖ
ｌ　−５ｍに述べられるようにしてシラン化され、抗Ｔ
４抗体と結合されそしてＴ４ＲＩＡに用いられた。
［０２”／Ｆｅ３↑比の変化は第７表に示すにうにＴ４
ＲＩΔにおいてこれらの磁性粒子の＋ａ−能に実質的に
影響をもたらさなかった。
（Ｊ−ヅ下金、口） 第７表 ０μ０／ｄｎ　３５６３３　３５６／１２１μｇ／ｄｆ
ｆｉ　３１６８１　３３１３９２μ！］／ｄｆｆｉ　３
０５７２　３０１５９４μｇ／ｄ　ｌ、　２４７０２　
２５５４３８μｑ／ｄλ　１８６８０　１９７２０１６
μ（１、−’ｄ℃　１２８０３　１１６２５３２μｑ／
ｉ　１００１２　８００５ 総　量　７７８６６　７５６３６ （以下余白） Ｖｌ−８，ノＪルボン酸末端化磁性粒子の１３．結合タ
ンパクへの結も Ｖｌ　−８−１。
カルボン酸末端化磁性粒子の調製 超常磁性酸化鉄が第Ｖｌ−１節に述べた方法によって調
製され、そして、アミノフェニルシランの代わりに３−
アミツブＤピルトリメトキシシランを用いて第Ｖｌ−２
節に述べるようにしてシラン化された。シランのアミノ
基は次に、末端化をアミンからカルボン酸に転化するた
めに無水グルタル酸と反応さけられた。末端化の転化は
次のようにして行なわれた。水中のアミノプロピルシラ
ン化粒子の５ｇが、第■−１節の洗浄方法を用いて０、
１　Ｍ−Ｎａ　＋−１ｃｏ３１　、５℃で４回洗浄され
た。容積が１００ｍｊ＆に調整され、無水グルタル酸２
．８５ｏが添加された。粒子は２度洗浄されそして無水
グルタル酸での反応がくり返された。
タンパクとの反応に用いられるものを調製するため、カ
ルボン酸末端化磁性粒子は水で５回洗浄された。
Ｖｌ　−８−２。
ＢＩ２結合タンパクおよびヒト血清アルブミンのカルボ
ン酸末端化磁性粒子への カルボジイミドカップリンク 水１ｍ、ｆｇ中のカルボン酸末端化磁性粒子５０ｍ９へ
、３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミ
ド４ｍｇが添加された。２分間の振動による混合の後、
ＢＬ２結合タンパク〔ドクター７−ル　エッチ　アレン
［Ｄｒ　、　Ｒ，ｌ−１，Ａ１１ｅｎｌ（デンバー、コ
ロラド州〉より得られた豚の腸の内因性因子（ＩＦ））
０．０５ｍｇおよびヒト血清アルブミン（＋−Ｉ　Ｓ　
Ａ　、シグマクミカル　コーボレーシーｒン［Ｓｉｏｍ
ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ　、コ、Ａ−８７６３）０
．７５ｎ＋ｇが水中の０．３０ｍｆｆ１へ加えられた。
３時間の間Ｐ　ｌ−１は、０．ｌＮ−１−ＩＣ２または
０．Ｉ　Ｎ−Ｎａ　０＋−１を添加ＪることによりｐＨ
５，、ｃ＋に調整され維持された。粒子は次に、０．５
Ｍ−Ｎａ　Ｃｆｆ１を有するＰＨ８，３の０．１Ｍ−ホ
ウ酸塩１０ｍｆｔ、０．１％１−ＩＳＡを有するリン酸
緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０ｍ　Ｅ　、そして蒸留水１０
ｍ、９で、第Ｖｌ−１節に述べたような磁気分離法を用
いながら洗浄された。粒子はＰＢＳで３度洗ひされ、使
用までＰＢＳ中に保存された。
Ｖｌ　−９。
ビタミンＢＩ２に関する磁性粒子競合検定法第Ｖｌ−７
節の方法により調製されたＩＦ−およびＨＳ八−結合磁
性粒子について、粒子の滴定が、ビタミンＢ／２　（Ｂ
　ｔ２　）に関する競合結合検定法において必要どされ
る粒子の量を確かめるために行なわれた。次の検定法態
様が用いられた。椋皐の緩衝液１００μ℃とトレーサー
の緩衝液１０００μ℃が１２Ｘ７５ｍｍポリプロピレン
製チューブに入れられた。混合物は、ヒ１〜面消試料中
の結合タンパクの変性をなすために１５分間υ１；騰し
た湯浴中へ入れられた。次にリン５１８１１ｔ！ｉ液中
の種々の濃度の磁性粒子１００μ℃が、０〜２０００ピ
コグラム／ミリリツトル（ＤＯ／ｍ　１　）　（ＤＢ１
２　ｍ１Ｘ（ＤＩ’Ａ定に最適な粒子濃度を決定するた
めに加えられた。
室温で１時間の培養の後、結合Ｂ７つと遊１１ｉ１ｔＢ
、２の磁気分離が第Ｖｌ　−５節で述べた方法およびマ
グネチックラックを用いて行なわれた。次に、ベレット
中の放射能が、１−ラカー　１２９０　ガンマカウンタ
ー〔トラカー　アナリテック　インコーホレーテッド、
エルク　グ］」−ブビレッジ、イリノイ州〕を用いて測
定された。
この検定に用いられた試薬は次の通りである。
Ｂ７２（開渠は、コーニング　メゾ、ｒ）Ｊ）し　アン
ドサイエンティフィック［Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃ
ａｌａｎｄ　３　ｃｉｅｎｔｉｆｉｃコ　（ディビジョ
ン　オブ　］−ニング　クラス　ワークス［［）　１ｖ
ｉｓｉｏｎ　ｏｆＣＯｒｌｌｌｎ（］　Ｇｌａｓｓ　Ｗ
ｏｒｋｓ］　、メトフィールド。
マサヂューセッッ州〕より得られた（＃４７４２６７）
。これらは、ＰＢＳ中のＢｚｕを６たないヒト血清アル
ブミンＪ３よび防腐剤どして加えられたアジ化ナトリウ
ムと共に調製される。、１−レーサーは、コーニングメ
ディカル　アンド　サイエンティフィック〔ディビジョ
ン　オブ　コーニンググラス　ワークス、メトフィール
ド　マリーブユーセッツ州〕より得られた”ＣｏＢ＋）
　（放射性コバルトで標識されたビタミンＢ／２　＞　
（＃４７４２８７）であった。トレー９−は０．００１
％シアン化カリウムおよびアシ化す１−リウムを含むｐ
ｌ−１９，２のホウｌ！Ｉ２塩緩衝液中にある。磁性粒
子はＯ〜２０００＋１（１／ｍ℃のＢｚ２ｉ１１度を測
定するのに必要どされる粒子のｍを決定Ｊるために種々
の！ｆｌ　ＩＩＪ−（でＰＢＳ中に希釈された。
約５０μｇ／ヂコーブの磁性粒子のｍ＞　′／Ｊ＜　’
Ｍ択され、ぞして標準曲線を作成するために上記のＢ／
２競合結合検定法において使用された。データは第８表
に示される。
第８表 ｏＤＯ／ｃｌｘ　５５２３ １００１１（１／ｄｆｆｉ　５２２０ ２５０＋１０／ｄ、Ｑ　４１６９ ５００ｐ　ａ　／ｄ　（ｔ　３２９５ １ｏｏｏｐｇ７’ｃｌｉ　２７７Ｂ ２０００ｐ　ｇ／ｄ　ｉ　１７４．５ 総　量　１６５１５ Ｖ■−１０゜ アミノエチル−３−アミノプロピルシランで被覆された
磁性粒子のタンパクへの結合Ｖｌ−１０−１゜ Ｎ　−２−アミノエチル−３アミノプロピルシラン化磁
性粒子のタンパクへの結合第ＶＩ−２節のようにして調
製されたＮ−２−アミノエチル−３−アミノプロピルシ
ラン化磁性粒子（粒子がＮ／Ｓｉ比２を有Ｊ゛るという
意味の「二窒素」のためｒＤＩＮｊと略される。）６／
１０（＋が、水中に再懸濁された。粉子は、洗浄と洗浄
の間に磁気分離を行なって、水中で１度Ｊ３よびその後 ｐｌ−１７，４の０．１Ｍ−リンｒＵ９．緩ｉ液３０ｍ
℃で２度洗浄された。洗浄粒子の０．１Ｍ−リン酸塩１
５ｍ　ｉ中への懸濁の後に、０．１’Ｍ−リン酸塩で２
５％グルタルアルデヒド（Ｇ−５８８２、シグマ　ケミ
カル　コーポレーション、セントルイス、ミズーリー州
〕を希釈することで調製されたグルタルアルデヒドの５
％溶液１５ｍ１が加えられた。グルタルアルデヒド活性
化粒子は、次に０．１Ｍ−リン酸塩１５１１＋１中へ再
懸濁された。
１〜リアイオドチロニン（Ｔ３）抗血清（１，６１１℃
１丁３−ＢＳＡ共役物でウサギを免疫することにより得
られた。）が活性化粒子へ加えられ、室温で１６〜２４
時間ホイールミキサーで撹拌した。Ｔ３抗体結合粒子は
０．１Ｍ−リンｌ１４ＦＡ３０ｍ℃で１度洗浄され、そ
して、未反応のアルデヒド基を反応Ｊるにうに０．２Ｍ
−グリシン溶液１５１１１λ中に懸濁された。＃ｉ濁液
は、２５分間振動により混合されＩこ。抗体結合粒子は
０．１Ｍ−リン酸塩３０ｍ１．およびエタノール３０ｍ
１で洗浄され、そして０．１％ウシ而面アルブミン（Ｂ
ＳＡ）を含むＰＢＳｌ　５０ｍ　ｌで２回洗浄された。
これは、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に再懸濁され、Ｔ３
に関するＲＩＡに使用されるまで４℃で保存された。
ＶＩ−１０−２゜ Ｎ−２−アミンエチル−３−アミノプロピルシラン化磁
性粒子の甲状腺刺激 ホルモンに対する抗体への結合 第Ｖｌ　−１０−１節の結合方法が最小限変更された。
ＤＩＮ粒子２０ｏが、グルタルアルデヒド活性化の前に
メタノール１．５℃で３度洗浄された。
グルタルアルデヒド活性化は、規横を調整して第Ｖｌ　
−１０−１節に述べられたようにして行なわれた。
ヒト甲状腺刺激ホルモン（Ｔ　Ｓ　＋−１＞に対する抗
体を含んでいるヤギβ−クロプリン成分は、全ての抗血
清よりも幾分多くＤＩＮ粒子に結合した。
分画は、ＰＢＳでの透析を伴なって、４０％硫酸アンモ
ニウムを用いてβ−グロブリンを）′Ａ：澱さ已ること
により行なわれた。約４９のタンパク（２０ｎｏ＋／ｍ
ｘで２００ｍ１＞が結合しティた。
タンパクの完全な付着は、結合の後の上ｔＨ？Ｉ（（中
に２８　Ｏｎ＋ｎでの光学濃度が不在であることにより
確認された。これは、粒子１グラム当り約タンパク２０
１＋１１のイｑ看を示した。粒子は次に、１Ｍ−ＮａＣ
ｌ２．５１．で３度およびＰＢＳで３ａ洗浄され、そし
て５０℃で一晩Ｊ８ｆｆｉされた。次に、粒子はＰＢＳ
／ＢＳＡ中で３度以上洗ン争され、Ｔ　Ｓ　Ｈ検定法に
お【プる使用に関して滴定された。
ＶＩ−１１゜ トリアイドヂロニン）こ関Ｊる 磁性粒子敢劃標識免疫検定法 Ｔ、ＲＩＡに用いられる粒子のｍが次の検定法により決
定された。標準は、Ｔ３を有しないヒ］〜血清にＴ３を
Ｔ４の場合のようにして加えることにより調製された（
第７．５節参照）、、１〜レー４ノー（よコーニング　
メゾカル　アンド　サイエンテイフ（ツク〔デ′イビシ
ョン　オフ　コーニングワークス、メトフィールド、マ
ザチコーセツツ州〕より得られに′偽−Ｔ：＋　（＃４
７１０６）であった。磁性粒子は、必要とされる粒子の
ｍを決定づ−るためにＰＢＳ−ＢＳＡ中へ種々の１１２
度に希釈された。この検定法態様は次の通りであつｌζ
ｏ４７；準０ μ込、１−レーサー１００ＩｉｅおよびＤＩＮ磁性オ☆
子８００μｅが１２Ｘ７５ｍｍポリプロピレン製チュー
ブ中ヘビベットを用いて入れられた。渦動の後、チュー
ブ（Ｊ室温で２竹間培養された。この検定法はｔｉ気分
離にＪ−り終了された。Ｑｎｇ／ｍ！標準を用いて検定
法にＪ５１プる粒子のｍを滴定づることによって、３０
μＱ、／チューブの吊が、この検定法１感様に４３いて
最適であると思われた。第９表（よ、この爪の粒子を用
いて冑られたＴ３１−？ｌＡ標準曲線データを承りもの
である。
第　９　表 Ｑ、　Ｏｎｇ７ｔｎ　ｎ　１７２７８ ０．２５ｎｇ／ｎｌ　（１１５０３４ ０、５Ｏｎｇ／ｍ　ｌ　１３／＋　５６１、０Ｏｎｇ／
ｍ　Ｑ　１２１２７ ２．０Ｏｎｇ／ｍ℃　８７５８ ４、　０Ｏｎｑ／ｍ　Ｑ　５　７　７　６８、０Ｏｎ（
］／ｍ　１　’　３８９７総　量　２ＧＯ／１６ Ｖ［−１２゜ 甲状腺刺部ボルモンに関づる 磁性粒子放射標識免疫検定法 ＴＳＨＲＩＡに用いられる粒子量が以下の検定法により
決定された。標準は、正常ヒト面清中のもの〔コーニン
グ　メゾカル　アンド　サイエンティフィック製＃４．
７１８６（メトフィールド、マサチューセッツ州）〕で
あった。［・レレーサはＰＢＳ中の　１−ウサギ抗ＴＳ
＋〜１（コーニングアンド　ザイエンテイフイツクｔｍ
＃４７４１８５（メトフィールド、マザヂューセッツ州
））であった。磁性粒子は、必要とされる粒子の量を決
定づ゛るためにＰＢＳ−ＢＳＡ中へ種々のＩＮ度で希釈
された。
この検定法態様は次の通りである。標準１００μ℃おに
ひトレーサー１００μ℃が１２ｘ７５ｍｍポリプロピレ
ン製デユープ中ヘビペットにより入れられ、渦動され、
そして室温で３時間Ｊ８養された。磁性粒子（５００μ
℃〉が加えられ、混合物は渦動されそして室温で１時間
培養された。水５００μ℃が加えられ、そして結合トレ
ーサーを非結合トレーサー力日ろ分離するために通常の
磁気分離が用いられた。ＴＳＩ〜１の存在に４３いて、
磁、性１八（４ｉ　（ｔ　キ１７ｉ　Ｔ　Ｓ　ｌ−ｌ　
抗イホ、Ｖｌ　−１０−１参照＞　１−３Ｉ」とトレー
４ノー−ｌ抗体くウサギ抗Ｔ　Ｓ　ｌ−１１ｉ’Ｌｆホ
ンどの間で４ノンドウイツチが形成される。これゆえ、
分析物（Ｔ　Ｓ　ｌ−１＞の増加する濃度は、結合数口
・１酷の爪を増加する。第１０表は、この手法により青
られた王ＳＨＲＩＡ４Ｗｔｌ’＋曲線データを示すもの
である。
第　１０　表 ０μＩＵ／ｍＡ　１６１５ １．５μｌＵ／ｍ　ｌ　２３０９ ３．０ｃｚｌＵ／ｍ　Ｑ　３０１４ ６、Ｏｌｌ　ＩｔＪ／ｌｌＩｎ　４．４４８１５．０μ
ｌＬＪ／ｍ　ｌ　７７９ご３３０．０μＩＵ／ｍｌ　１
１０６３ ６０、ＯμＩＵ／ｍ　ｎ　１５０３０ 総　ｍ　４５１６８ 久　μＩＵ−マイクロ国際単位 ＶＩ−１３゜ グルタルアルデヒ１〜の使用によるＮ−２−アミノエチ
ル−３−アミノプロピルシランで被覆された磁性粒子の
酵素への結合 磁性粒子（１ｇ〉が、第Ｖｌ　−１０−、１節に）ボベ
るＪ、うにしてグルタルアルデヒドで活性化された。
洗浄の後、粒子は、ＰＢＳｌ　５ｍ　ｌ中に再懸濁され
た。次に３ｍｌの粒子（２ｇ）が、ＰＢＳ２、Ｏｍｆｉ
に溶解されたアルカリ　小スファターピ（シグマ　ケミ
カル　コンパニー、Ｐ−９７０１）５ｍｇもしくはＰＢ
Ｓ２．Ｏｍｇに溶解されたβ−ガラク１〜シダーげ〔シ
グマ　ケミカル　コンパニー、５６３５）５ｍｇと混合
された。結合粒子はグリシンで洗浄され、次にＰ［３Ｓ
で５回洗浄され、そして０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中
に再慝ン蜀された。
磁性アルノＪりホスファターゼ活性度に関する酵素検定
法は次のようにして行なわれた。
３ｎ１℃容器にｐＨ８，Ｏｒ、０．０５Ｍ　−Ｔ’ｒｉ
ｓ−１−１０！１３ｍ１が３＋ｎＭＰ−ニトロフェニル
ーホスフェートと共に入れられた。次に結合したアルカ
リホスファターゼを右りる磁性粒子希釈液１００μｌが
加えられた。４１０ｎｍでの光学＋ｌＰ１度にｄ３ける
増加か記録された。
磁性β−カラクトシダービ活性度に関する酵素検定法は
次のＪ：うにして行なわれた。
３ｍｌ容器にｐＨ７，４で、Ｏ，ＩＭリン酸ｊｎ３ｍｆ
ｌが０．０１Ｍメルカプトエタノールお」、ひ０．００
５ｆｖｌＯ−ニトロフェニル−β−〇−ガラクトピラニ
ノシドと共に入れられた。
次に、β−カラクトシダーゼに結合した磁性粒子希釈液
１００μｇが加えられた。／１１０ｎｍでの光学ｉ１！
度における増加が記録された。
以上述べたにうに、本発明は、その発明の範囲内におい
て、多くの変更および買換が可１ｉ旨である。
なｄ３、述べられた特定の実施態様は、例示のためのみ
与えられたものであり、何ら本発明を限定づるものでな
く、本発明は特許請求の範囲の記載によってのみ限定さ
れるものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の磁性粒子の一実施例に係る磁気粒子
懸濁液の濁り度（％ｍｍフン磁場の存在Ｊ、たけ不存在
に６３４プる経時的変化を示すグラフであり、また第２
図は、本発明の一実施例である３−アミノプロピル１〜
リメ１〜キシシランでシラン化された超常磁性粒子の顕
微鏡写真図を示ずものである。 特許出願人　アドバンスト、マグネティックス、インコ
ーボレーテット ド アメリカ合衆国マサチューセラ ツ州ヒンガム・メイン・ストリ −）６２６ 手続ン市正書 １、事件の表示 昭和５９年　特許願　第９５．４７０号２、発明の名称 分離に用いられる磁性粒子 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　アメリカ合衆国、マサヂューセッツ州、ケンブ
リッジ、ビー　コンコード　アベニュー７６７ 名　称　アドバンスト、マグネティックス、インコーホ
レーテッド 代表者　ジエローハ　ゴールドスティン４、代理人 住　所　東京都千代田区二番町１１Ｍ地９ダイアパレス
二番町６、補正の対象 （１）願書の［特許出願人の代表者」の欄および願書に
記載した〈３）別紙浄書図面の通り。（内容に変更なし
。）４０７

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）　磁気応答粒子にＪ３いて、その磁気応答粒子は
    分子が共有結合し得るシラン被膜により通常囲繞された
    磁性金属酸化物核にりなり、また■磁場の存在しない状
    態において、その水性分散体の５０９６濁り度減少沈降
    時間が約１．５時間以−Ｌでかつ■水性分散体の＠積を
    入れた容器を容器中の水性分散体の容積よりも小さな容
    （ｉを有する永久磁石の極力と接触させることにより水
    性分散体にかりられるもの（・ある磁場の存在する状態
    において、その水性分散体の９５％濁り度減少分離時間
    か約１０分以下である水性分散体を形成するように水性
    媒体中に分散可能である粒子質量を有することを特徴ど
    するものである磁気応答粒子。 （２）　金属酸化物核が超常磁性結晶群を含むものであ
    る特許請求の範囲第１項に記載の磁気応答粒子。 （３）　超常磁性結晶が２価および３価の陽イオンを含
    む酸化鉱よりなるものである特許請求の範囲第２項に記
    載の磁気応答粒子。 （４）　核を囲繞丈るシラン被膜が、金属酸化物核に吸
    着結合もしくは共有結合し得る官能性の第１対と生物分
    子に共有結合しＩＵる第２対とを有づる二官能性シラン
    重合性物質よりなるしのである特許請求の範囲第１項に
    記載の磁気応答粒子。 （５）　シラン手合性物質が、アミノフェニル、アミノ
    、カルボン酸、ヒドロキシル、スルノイドリル、脂肪性
    、親水性および両親媒性部分からなる群から選ばれた有
    機官能性を右Ｊるものである特許請求の範囲第４項に記
    載の磁気応答粒子。 （６）　シラン手合性物質が、ｐ−７２ミノフＪ−二ル
    トリメトキシシラン、３−アミノプロピル１〜リメトキ
    シシラン、Ｎ−２−アミノエチル−３−アミノプロピル
    １〜リメ１−キシシラン、ｎ　−ドデシルトリエトキシ
    シランおよびｎ−ヘキシルトリメトキシシランからなる
    群から選ばれたシラン単量イ４）から形成されるもので
    ある特δ′［請求の範囲第４項に記載の磁気応答粒子。 （７）　光分散により測定された平均粒径が約０．１〜
    約１．５μである特許請求の範囲第４項に記載の磁気応
    答粒子。 （８）　窒素ガス吸着により測定された表面積が約１０
    ０ｍ２／ｇ以上である特許請求の範囲第７項に記載の磁
    気応答粒子。 （９）　磁性金属酸化物核が超常磁性酸化鉄核であり、
    シラン被膜が重合性シラン被膜であり、該酸化鉄核が酸
    化鉄結晶群を含み、かつ光分散により測定された平均粒
    径が約０．１〜約１．５μｍ００ｍ２／ｕ以上である特
    許請求の範囲第１項に記載の磁気応答粒子。 （１０）　ｌ性金属酸化物核が、強磁性金属酸化物核で
    あり、シラン被膜が重合性シラン被膜であり、該金属酸
    化物核が金属酸化物結晶群を含み、かつ光分散により測
    定された平均粒径が約０．１〜約１．５μおよび窒素ガ
    ス吸着により測定された表面積が約１００ｍ２１０以上
    である特許請求の範囲第１項に記載の磁気応答粒子。 （１１）　シラン被１１Ｓ！が少なくとも１種類の生親
    和性吸着剤に共有結合されるものである特許請求の範囲
    第１項、第９項または第１０項に記載の磁気応答粒子。 （１２ン　生親和性吸着剤が、抗体、抗原、ヘプテン、
    酵素、アポ酵素、酵素基質、酵素阻止剤、補助因子、結
    合タンパク、担体タンパク、結合タンパクにより結合さ
    れた化合物、ｌｉ体タンパクにより結合された化合物、
    レクチン、単糖類、多糖類、ホルモン、受容体、抑制因
    子および誘発因子からなる群から選ばれたものである特
    許請求の範囲第１１項に記載の磁気応答粒子。 （１３）　被膜が、抗サイロキシン抗体、抗１〜リアイ
    オドチロニン抗体、抗甲状腺刺激ホルモン抗体、抗甲状
    腺結合グロブリン抗体、抗す−イログロブリン抗体、抗
    ジゴキシン抗体、抗コルチゾール抗体、抗インスリン抗
    体、抗テロフィリン抗体、抗ビタミンＢ５，２．抗体、
    抗菓酸塩抗体、抗フェリチン抗体、抗ヒ１〜絨毛性ゴナ
    ドトロピン抗体、抗卵胞刺激ホルモン抗体、抗黄体化ホ
    ルモン抗体、抗プロプステロン抗体、抗デストステロン
    抗体、抗エストリオール抗体、抗エストラジオール抗体
    、抗プロラクチン抗体、抗ヒト胎盤性ラクトゲン抗体、
    抗ガストリン抗体および抗ヒト成長ホルモン抗体からな
    る群から選ばれる抗体に共有結合されるものである特許
    請求の範囲第９項または第１０項に記載の磁気応答粒子
    。 （１４）　シラン被膜が、ジアゾ化により抗ナイロキシ
    ン抗体に共有結合されるものであるｐ−アミノフェニル
    トリメトキシシラン重合体である特許請求の範囲第９項
    に記載の磁気応答粒子。 （１５）　被膜が、ジアゾ化により抗テロフィリン抗体
    に共有結合されるものであるｐ−アミノフェニルトリメ
    トキシシラン重合体である特許請求の範囲第９項に記載
    の磁気応答粒子。 （１６）　被膜が、カルボジイミド結合によりビタミン
    ［３−ｔ２結合タンパクへ共有結合されるものであるカ
    ルボン酸末端化無水グルタル酸処理３−アミノプロピル
    トリメトキシシラン重合体である特許請求の範囲第９項
    に記載の磁気応答粒子。 （１７）　被膜が、グルタルアルデヒド結合により抗ト
    リアリオドチロニン抗体へ結合されるものであるＮ−２
    −アミノエチル−３−アミノプロピルシラン重合体であ
    る特許請求の範囲第９項に記載の磁気応答粒子。 （１８）　被膜が、グルタルアルデヒド結合により抗甲
    状腺刺激ホルモン抗体へ結合されるものであるＮ−２−
    アミノエチル−３−アミノプロピルシラン重合体である
    特許請求の範囲第９項に記載の磁気応答粒子。 り１９）　被膜が、グルタルアルデヒド結合によりアル
    カリボスフ７ターゼまたはβ−ガラクトシダーゼに結合
    されるものであるＮ−２−アミンエチル−３−アミノプ
    ロピルシラン爪合体である特許請求の範囲第９項に記載
    の磁気応６粒子。 （２０） ａ）　アルカリ中に２価および３価の遭移金属塩を沈澱
    させ、 ｂ〉　沈澱物をほぼ中性に達づるまで洗浄し、Ｃ）　沈
    澱物を電解液中で洗浄し、 ｄ）　沈澱物を、沈澱物へ吸着結合また【ま共有結合さ
    れた分子が共有結合され得る重合性被膜を形成し得るシ
    ラン単量体中へ再懸濁し、そしてｅ）　沈澱物に吸着結
    合または共有結合する手合性シラン被膜を発生さｌるこ
    とでなる、光分散で測定された平均粒径が約０．１〜約
    １．５μである磁気応答粒子の製造方法。 （２１） ａ）　アルカリ中に２価および３価の鉄塩の２価および
    ３価の鉄陽イオンを沈澱させ、［）〉　沈澱物を水中で
    ほぼ中性に達するまで洗浄し、 Ｃ）　沈澱物を電解液中で洗浄し、 ｄ）　洗浄された沈澱物を吸着結合または共有結合した
    シラン重合体で被膜させることでなる、光分散で測定さ
    れた平均粒径が約０．１〜約１．５であり超常磁性を右
    する特許請求の範囲第２０項に記載の製造方法。 （２２）　２価および３価の鉄塩がＦｅＣｊ！２おＪ：
    びＦｅＣｆｆ１ｓである特許請求の範囲第２１項に記載
    の製造方法。 （２３）　２価および３価の鉄陽イオンは、約４／１〜
    約１／２のＦＣ２十／Ｆｅ３＋比において使用されるも
    のである待ｉ′１請求の範囲第２１項に記載の製造方法
    。 （２４）　洗浄は、沈澱物を水および電解液中に再懸濁
    させ、そして洗浄と洗浄の間に沈澱物を磁気的に収集す
    ることでなる特γ［８＾求の範囲第２１頂に記載の製造
    方法。 （２５）　沈澱物は、酸性水溶液からのシラン重合体の
    析出により該シラン重合体で被覆されるものである特許
    請求の範囲第２１項に記載の製造方法。 （２Ｇ）　沈澱物は、酸性有１１溶液からのシラン重含
    体の析出により該シラン重合体で被覆されるものである
    特許請求の範囲第２１項に記載の製造方法。 （２７）　酸性有機溶液からのシラン重合体の析出が、 ａ）　約１％（Ｖ／Ｖ）の水を含んでいる有機溶媒中へ
    洗浄された沈澱物を懸濁さび、ｂ〉　シランψ椿体の酸
    性溶液を添加し、Ｃ）　高速で沈澱物を均質化し、 ｄ）　沈澱物を、有機溶媒および水のいずれにも混和し
    得る湿潤剤と混合し、 ｅ〉　水および有機溶媒を蒸発せるのに十分な温瓜に加
    熱し、そして ｆ）　沈澱物から湿潤剤を洗浄する ことでなる特許請求の範１１１１第２６項に記載の製造
    方法。 （２８）　有機溶媒がメタノールでありかっｔ！ｉａ潤
    剤がグリセロールである特許請求の範囲第２７項に記載
    の製造方法。 （２９）　シラン単量体の溶液がＡル１〜亜リン酸また
    は氷酢酸で酸性化されたものである特許請求の範囲第２
    ７項に記載の製造方法− （３０）　シラン重合体が、ｐ−アミノフェニル１〜リ
    メトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラ
    ン、Ｎ−２−アミノエチル−３−アミノプロピルメトキ
    シシラン、ｎ−ドテシルトリエトキシシラン、ｎ−ヘキ
    シルトリメ１−キシシランからなる群から選ばれたシラ
    ン単量体から形成されるものである特許請求の範囲第２
    １項に記載の製造方法。 （３１） ａ）　約２／１のＦｅ２＋　／Ｆｅ３＋　比テ１ｌＣｆ
    ｔ２およびＦｅＣｌ２を水酸化ナトリウムで沈澱させ、 ｂ）　沈澱物を再懸濁および磁気分離づることに」；す
    、沈澱物を水中でほぼ中性となるまで洗浄し、 Ｃ）　沈澱物を再懸濁および磁気弁＋１ｉＩｔ−！Ｉる
    ことにより、沈澱物を塩化ナトリウム溶液中で洗浄し、
    ｄ）　洗浄された沈澱物を約１％（Ｖ／Ｖ　）の水を含
    むメタノール中に懸濁し、 ｅ）　シラン単量体の酸性溶液を沈澱物の懸濁液に添加
    し、 ｆ）　高速で沈澱物を均質化し、 ｇ）　沈澱物をグリセロールと混合し、ｈ）　沈澱物と
    ２リセロールを約１６０°〜約１７０℃の湿度に加熱し
    、そして ｉ）　沈澱物からグリセロールを洗浄することでなり、 磁気応答粒子は、分子が共有結合し得る重合性シラン被
    膜により通常囲繞された超常磁性酸化鉄核Ｊこりなり、
    該粒子は光分散ににり測定された平棒の５０％濁り度減
    少沈降時間が約１．５時間以上でかつ■水性分散体の容
    積を入れた容器を容器中の水性分散体の容積にりも小さ
    な容積をイｊする永久磁石の極力と接触させることによ
    り水性分散体にかりられるものである磁場の存在する状
    態においで、その水性分散体の９５％濁り度減少分離時
    間が約１０分以下である水性分散体を形成するＪ、うに
    水性媒体中に分散可能である粒子質ｍを有づるものであ
    る特許請求の範囲第２１項に記載の製造方法。 （３２）　シラン単ｍ体は、ｐ−アミノフェニルトリメ
    ｌルキシシラン、３−アミノプロビルト１ノメトキシシ
    ラン、Ｎ　−２−７ミノエチル−３−アミツブＬＪピル
    トリメｌ〜キシシラン、ｎ−ドデシル１〜すＪ１〜キシ
    シランおよびｎ−ヘニＩ：シル１〜１ツメ１〜キシシラ
    ンからなる群から選ばれたものである特６′１請求の範
    囲第３１項に記載の製造方法。 〈３３） ８）　溶液、既知量の標識リグ−１〜および溶液中のり
    ゲートに特異性のりガントかバ右結合さ４ｔている磁気
    応答訂１子を、り刀ンド／リゲート複合体を形成するた
    めに反応させ、ここにお（八で該磁気応答粒子は、分子
    が共有結合しｊｑる、小会４１４−シラン被躾により通
    常囲繞された超常磁性３イヒ鉄４亥Ｊ、りなり、該酸化
    畝核は酸化鉄結晶ｌ！Ｙを含み、該粒子は光分散ににり
    測定された平均ネ（Ｉ径ｈ＜　ｆＪＯ，１μ〜約１．５
    μまた窒素刀ス１段着により８ｍ性分１１（体の５０％
    濁り度減少沈降時間が約１．５時間以上でかつ■水１１
    １分散体の容積を六ｆした容器を容器中の水性分散体の
    容積よりも小さな容積を有する永久磁石の極力と接触さ
    せることにより水性分散体にか（ノられるものである磁
    場の存在づる状態にＪ３いて、その水性分散体の９５％
    濁り度減少分離時間が約１０分以下である水性分散体を
    形成するように水性媒体中に分散可能である粒子質量を
    有づるものであるか、または分子が共有結合し１１する
    、重合性シラン被膜により通常囲繞された強磁性金属酸
    化物核よりなり、該金属酸化物は金属耐化物結晶群を含
    み、該粒子は光分散により測定された平均粒径が約０．
    １μ〜約１．５しない状態において、その水性分散体の
    ５０％濁り度減少沈降時間が約１．５時間以上ｒかつ■
    水性分散体の容積を入れた容器を容器中の水性分散体の
    容積よりも小さな容積を有する永久磁石の極力と接触さ
    せることにより水性分数体にかりられるものである磁場
    の存在覆る状態において、その水性分散体の９５％濁り
    度減少分離時間が約１０分以下である水性分散体を形成
    するように水性媒体中に分散可能である粒子質量をイｊ
    りるものである、 ｂ）　Ｉ１１！気応答粒子を反応溶液から磁気公印（シ
    、Ｃ）　磁気応答粒子に結合した標識または溶液中の遊
    離標識を測定し、そして ｄ）　ｃ）段階で測定された標識の昂を、リグ−トル５
    度を測定づるために標準曲線に相関さけることでなる溶
    液中のりグー１〜の０庶の測定方法。 （３４）　リガンドが抗体である特５′１請求の範囲第
    ３３項に記載の測定方法。 （３５）　抗体が、抗ナイロキシン抗体、抗トリアイ詞
    ドチロニン抗体、抗甲状腺刺激ホルモン抗体、抗甲状腺
    結合グロブリン抗体、抗ナイログロブリン抗体、抗ジゴ
    キシン抗体、抗コルチゾール抗体、抗インスリン抗体、
    抗テロフィリン抗体、抗ビタミンＢ１２抗体、抗菓酸塩
    抗体、抗フェリチン抗体、抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン
    抗体、抗卵胞刺激ホルモン抗体、抗黄体化ホルモン抗体
    、抗プロプステＩコン抗体、抗テストスデロン抗体、抗
    土ストリＡ−ル抗イイー、抗ニストラジオール抗体、抗
    プロラクチン抗体、抗ヒト胎盤性ラダ１ヘゲン抗抗体１
    ｙ　＋うなる群から選ばれる抗体である特許請求の範囲
    第３４項に記載の測定方法。 （３６） ａ〉　酵素反応をもたら１　１＝めの反応混合物を反応
    容器中に形成づるために、磁気応答粒子と共有結合した
    酵素を反応媒体と接触させ、ここにおいて該磁気応答粒
    子（ま、分子が共有結合し１９る、重合性シラン被［３
    により通常＋１１１繞された超１ｉ磁性醒化畝核よりな
    り，該酸化鉄核は酸化鉄結晶群を含み、該粒子は光分散
    により測定された平均粒径が約０．１μ〜約１．５μま
    た窒素ガス吸着によの水性分散体の５０％濁り度減少沈
    降時間が約１。 ５時間以上でかつ■水性分散体の容積を入れた容器を容
    器中の水性分散体の容積よりも小さな容積を有する永久
    磁石の極力と接触させることにより水性分散体にかけら
    れるものである磁場の存在する状態において、その水性
    分散体の９５％濁り度減少分離詩間が約１０分以下であ
    る水性分ｔｉｋ体を形成覆るように水性媒体中に分１１
    夕可能である粒子質問を右するものである、 ｂ〉　発生覆る酵素反応をなさせ、そしてＣ）　酵素を
    、磁気分離を用いて反応混合物より除去覆ることでなる
    酵素反応実施方法。 （３７）　酵素がアルカリホスファターげまたはβ−ガ
    ラクトシダーゼである特許請求の範囲第３６項に記載の
    方法。 （３８）　酵素結合磁気応答粒子を新しい反応媒体中に
    再懸濁することにより酵素を再循環ツることをさらにな
    すものである特許請求の範囲第３６項に記載の方法。 （３９） ａ）　容器中で、磁気応答粒子に共イ１結合したりカン
    トをリゲー１〜および他の物質を含む溶液または懸濁液
    に接触させ、ここにｄ５いて、該磁気応答粒子は、分子
    が共有結合し得る、重合性シラン被膜により通常囲繞さ
    れ！こ超常磁性酸化畝核よりなり、該酸化鉄核は酸化鉄
    結晶群を含み、該粒子は光分散により測定されＩこ平均
    粒径が約０．１μ磁場の存在しない状態において、その
    水性分散体の５０％濁り度減少沈降時間が約１．５時間
    以上でかつ■水性分散体の容積を入れた容器を容器中の
    水性分散体の容積よりも小さな容積を有する永久磁石の
    極力と接触させることにより水性分散体にかけられるも
    のである磁場の存在する状態において、その水性分散体
    の９５％濁り度減少分離時間が約１０分以下である水性
    分散体を形成するように水性媒体中に分散可能である粒
    子質ｍを有するものである、 ｂ）　リガンドとりゲーｊ・に結合ないし相互作用をな
    させ、 Ｃ）　磁気応答粒子をそれに結合しているりゲー１〜と
    共に溶液または懸ｉｎ液から磁気分離し、そして ｄ）　リゲートを磁気応答粒子から脱離することで、リ
    ゲートをリガンドから回収することでなる 溶液からのりゲートの隔離に関づる親和り［１マドグラ
    フイー法。
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