JPH076986B2 - リゲートの濃度測定方法 - Google Patents

リゲートの濃度測定方法

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JPH076986B2
JPH076986B2 JP59095470A JP9547084A JPH076986B2 JP H076986 B2 JPH076986 B2 JP H076986B2 JP 59095470 A JP59095470 A JP 59095470A JP 9547084 A JP9547084 A JP 9547084A JP H076986 B2 JPH076986 B2 JP H076986B2
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チバ コーニング ダイアグノスティクス コーポレーション
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Description

【発明の詳細な説明】 I.発明の分野 本発明は、磁気応答粒子を開いた溶液中のリゲートの濃
度測定方法に関するものである。特に、本発明は、数多
くの種類の有機分子およびまたは生物分子が結合し得る
安定なシラン被覆により囲繞された金属酸化物核よりな
る磁気応答粒子を開いた溶液中のリゲートの濃度測定方
法に関するものである。（結合したまたは非結合の）粒
子は、迅速な重力沈降を起こすことなく水性媒体中で分
散し得また、都合のよいことに該水性媒体中から磁場を
用いて再生利用され得る。ここにおいて提供される測定
方法は、超常磁性すなわち磁場におかれた後においても
永久磁化されない粒子を用いるものである。この特性は
磁気凝集形成なしに再分散することを該粒子に許容する
ものである。従って、該粒子は再使用または再循環され
得るものである。シラン被覆の安定度およびそれへの分
子の共有結合付着もまた粒子の使用および再使用の一因
子である。
本発明に用いられる磁気応答粒子は、生物分子または有
機分子と親和力、吸収する能力またはある他の生物分子
もしくは有機分子と相互作用する能力により結合し得る
ものである。このように結合した粒子は、これに限定さ
れるわけではないが、免疫学的検定、他の生物学的検
定、生化学的もしくは酵素的反応、親和クロマトグラフ
ィー精製、細胞分類ならびに診断学的および治療学的使
用を含む、分離段階または結合分子の特定位置への有向
移動を伴う種々の試験管内または生体内系に使用され得
る。
II.発明の背景 II−1. 生物学系における磁気分離：一般的考察 重力分離または遠心分離にかわるものとしての生物学系
における磁気分離は詳しく調べられている〔ビー エル
ヒルシュベイン［B.L.Hirschbein］ら、ケムテック
［Chemtech〕、1982年３月、172〜179（1982）、エム
ポゥファルザネフ［M.Pourfarzaneh］、ザ リガンド
クオータリィ［The Ligand Quarterly］５（１）:41〜4
7（1982）およびピー ジェイ ホーリング［P.J.Halli
ng］とピー ダンニル［P.Dunnill］、エンザイム ミ
クロバイオロジカル テクノロジー［Enzyme.Microb.Te
chnol］２:2〜10（1980）〕。酵素、抗体および他の生
親和力吸収性物のような生物分子の支持体としての磁気
分離可能な粒子の使用のいくつかの利点は、一般的に認
識されている。例えば、磁性粒子は固定酵素系の固形相
支持体として使用され〔例えばピージェイ ロビンソン
［P.J.Robinson］ら、バイオテック バイオエング［Bi
otech.Bioeng.］、XV−603〜606（1973）参照〕、酵素
は、懸濁された固体を含む媒体を含み酵素反応体の再循
環を許容しながら媒体より選択的に回収され得る。固体
支持体として免疫学的検定または他の競合的結合検定に
おいて使用された時、遠心分離と比べて磁性粒子は均質
的な反応状態（最適な結合活動を助長し、分析−吸収平
衡を最小限変えるものである。）を与え、結合した分析
物の非結合の分析物よりの分離を促進する。遠心分離は
時間消費であり、高価でエネルギーを消費する設備を要
し、放射線学的、生物学的および物理学的危険をかかえ
ている。一方、磁気分離は、比較的迅速で、容易であ
り、簡単な設備を要するのみである。最後に親和クロマ
トグラフィー系における非極性吸着剤を結合した磁性粒
子の使用は、周知の親和クロマトグラフィー系における
よりもより良好な質量移動を与え、より失敗の少ない結
果に終わる。
磁性粒子に結合することによる分子の磁気分離の一般的
概念は、すでに論議されそしてこのような粒子の生物学
的目的への使用の潜在する利点は認識されているが、磁
気分離の実践的発達は、磁性粒子のいくつかの批判的特
性によってさまたげられ、これによってほとんど発達し
なかった。
大きな磁性粒子（溶液中の直径が10ミクロン以上を意味
する。）は、弱磁場および弱磁場変化に対し応答し得る
が、これらは、迅速に沈降する傾向にあり、均質的な状
態を要求する反応に対してそれらの有用性は限られてい
る。大きな粒子はさらに小さな粒子よりも重量当りの表
面積が限られているので、これに対してはより少量の物
質が結合し得るのみである。大きな粒子の例としては、
50〜125μの直径を有するロビンソン［Robinson］ら
（上記の文献）のもの、60〜140μの直径を有するモス
バック［Mosbach］とアンダーソン［Anderson］〔ネー
チャー［Nature］、270:259〜261（1977）〕のものおよ
び50〜160μの直径を有するゲスドン［Guesdon］ら〔ジ
ェイ アレルギークリン イムノル［J.Allergy Clin.I
mmunol.］61（１）:23〜27（1978）〕のものがある。ハ
ルシュ［Hresh］とヤバルバン［Yaverbum］により調製
された複合粒子〔米国特許第3,933,997号〕は、強磁性
酸化鉄（Fe3O4）担体粒子を含んでいる。酸化鉄担体粒
子は直径1.5〜10μを有していると報告されている。し
かしながら、報告された５分間の沈降速度および複合粒
子の１グラム当りわずか12gの結合容量に基づくと〔エ
ル エス ハーシュ［L.S.Hersh］とヤベルバン、クリ
ンチム アクタ［Clin.Clim.Acta］、63:69〜72（197
5）〕、溶液中の複合粒子の実際的大きさは、実質的に1
0μより大きいものと思われる。
米国特許第3,933,977号のハルシュとヤベルバンの強磁
性担体粒子は、抗ジゴキシン抗体を担体粒子に化学的に
結合するために、抗ジゴキシン抗体と反応し得るシラン
でシラン化されている。種々のシランカップリング剤
が、このために参照により組み入れられる米国特許第3,
652,761号に論議されている。複合粒子の直径が10μよ
りたぶん大きいものは、少なくともその一部は、ハルシ
ュとヤベルバンの特許において用いられたシラン化の方
法によって説明され得る。当業者間に公知のシラン化の
手法はシランの重合に選ばれる媒体と反応性表面へのそ
れの析出においてたがいに一般的に異なるものである。
トルエン〔エッチ ダブリュー ウィートール［H.W.We
etall］；メソッズ オブ エンザイモロジイ［Methods
in Enzymology］、ケイ モスバック（編集）［K.Mosb
ach（ed. ）］、44:134〜148,140（1976）中〕、メタノ
ール（米国特許第3,933,977号〕およびクロロホルム
（米国特許第3,652,761号〕のような有機溶媒が用いら
れている。水性アルコールならびに酸含有水溶液からの
シラン析出（エッチ ダブリュー ウィートール、メソ
ッズオブ エンザイモロジイ、上記、P.136（1976）〕
もすでに用いられている。これらのシラン化の手法のど
ちらも空気およびまたはオーブン乾燥を脱水段階に用い
る。磁気担体粒子のシラン化の用いられた時、このよう
な脱水方法は、担体粒子のシラン化された表面が互いに
接触することをもたらし、例えばシロキサン形成による
粒子間の架橋、隣接粒子間のファンデルワールス相互作
用もしくは物理凝着等を含む粒子間結合と潜在的に終わ
る。この粒子間結合は単一の担体粒子よりもかなり大き
な直径のシラン化された担体粒子の共有結合したもしく
は物理結合した凝集体を生じる。このような凝集体は、
単位重量当り低い表面積を有し、そしてこれ故に、抗
体、抗原または酵素のような分子との結合に関し低い能
力を有する。このような凝集体はまた多くの適用に対し
て短かすぎる重力沈降時間を有している。
溶液中における平均直径が約0.03μ以下である小さな磁
性粒子は、熱攪拌により溶液中に保たれることができ、
それゆえ自然沈降しない。しかしながら、このような粒
子を溶液から除去するために要求される磁場および磁場
変化度は、ベンチトップワークにおける使用に不便な重
く嵩のある磁石をそれらの発生に要求するように大きい
ものである。5000エルステッド以上の磁場を発生し得る
磁石は代表的に直径0.03μ以下の磁性粒子を分離するた
めに要求される。粒子に作用する正味の力（Ｆ）と磁場
との間の概算定量関係は、以下の等式により与えられる
〔ヒルシュベインら、上記文献〕。
（式中Xvと はそれぞれ粒子と媒体の容積磁化率、Ｖは粒子の容積、
Ｈは適用された磁場であり、またdH/dxは磁場変化度で
ある。） この表現は、粒子形状や粒子相互作用を無視したもので
あるからあくまで単に概算的なものである。しかしなが
らこれは、磁性粒子における力が粒子の容積に直接比例
していることを示しているものである。
0.03μ以下の磁性粒子は、例えば米国特許第3,531,413
号中に述べられるような、いわゆるフェロフルイド［fe
rrofluid］中に用いられる。フェロフルイドは数多くの
適用を有するが、分離をもたらすために要求される大き
な磁場および大きな磁場変化度のために、磁性粒子の周
辺媒体からの分離を要求する適用には非実践的である。
強磁性材料は通常磁場に応答して永久磁化される。「超
常磁性」と定義される材料は磁場変化度に力を受ける
が、永久磁化はされない。磁性酸化鉄の結晶は結晶の大
きさにより、強磁性とも超常磁性ともなり得る。鉄の超
常磁性酸化物は、結晶が直径約300Å（0.03μ）以下の
ときもたらされ、それより大きな結晶は一般的に強磁性
を有する。磁場に最初にさらされた後に、強磁性粒子
は、ロビンソンら〔上記文献〕によりおよびハルシュと
ヤベルバン〔上記文献〕により記されているように永久
磁化された粒子間の磁力のために凝集する傾向にある。
報告されるところによると直径300Åおよび表面にアミ
ン基を有するものである分散可能な磁性酸化鉄粒子は、
レンバウム［Rembaum］の米国特許第4,267,234号の記載
に従って、ポリエチレンイミンの存在下、塩化第一鉄と
塩化第二鉄の塩基性沈澱（Fe2+／Fe3+＝１）より調製さ
れる。報告されたところでは、これらの粒子は、調製中
３度磁場にさらされ、再分散可能であると述べられてい
る。この磁性粒子は、0.1μの報告された直径の磁性ポ
リグルタルアルデヒド微小球体を形成するために、グル
タルアルデヒド懸濁重合系と混合される。ポリグルタル
アルデヒド微小球体は、タンパク質のようなアミノ含有
分子への結合を形成し得る表面上に共役アルデヒド基を
有する。しかしながら、一般的にアルデヒド基と反応し
得る化合物のみが直接ポリグルタルアルデヒド微小球体
の表面に結合され得る。さらに、磁性ポリグルタルアル
デヒド微小球体はある適用に関して十分に安定なもので
はない。
II−2. 放射標識免疫検定法における分離 放射標識免疫検定法［radioimmunoassay］（RIA）は、
抗体に結合する放射性に標識された物質を含んでいる物
質の濃度の分析のため方法を述べるのに用いられる用語
である。放射性結合の量は同じ抗原に結合し得る標識さ
れていない試験物質の存在によって変えられる。標識さ
れていない物質は、もし存在すると、結合位置に関して
標識された物質と競合し、これにより抗体への放射性結
合の量を減少する。結合放射能における減少は、標識曲
線によって標識されていない試験物質の濃度に相関され
得る。RIAの本質的段階は、結合分を定量するために達
成すべきである結合標識と遊離標識との分離である。
被覆管、微粒子系および二抗体分離法を含む種々の一般
的分離策が放射標識免疫検定法（RIA）に適用された。
米国特許第3,646,346号に記載されるような被覆管は、
遠心分離することなく結合標識と遊離標識との分離をな
すが、２つの主たる欠点をかかえている。第１に、管の
表面は反応において用いられ得る抗体の量を限定する。
第２に、抗体と抗原との反応を緩慢としながら、抗体は
いくつかの抗体からはるかに（0.5cmほど）隔てられる
（ジー ダブリュー パーソンズ［G.W.Parsons］、メ
ソッズ イン エンザイモロジイ、ジェイ ランゴーン
（編集）［J.Langone（ed. ）］73:225（1981）中およ
びピー エヌ ナヤク［P.N.Nayak］、ザ リガンド
クオータリィ４（４）:34（1981）〕。
抗体は分離を促進するため微粒子系に付着している。
〔例えば米国特許第3,652,761号および第3,555,143号参
照。〕、このような系は使用される抗体のほぼ無制限に
近い量を許容する広い表面積を有しているが、検定の間
に該微粒子はしばしば沈降する。該管は部分的な均質化
を達成するためにさえもしばしば攪拌されなければなら
ない〔ピー エム ジャコブス［P.M.Jacobs］、ザ リ
ガンド クオータリィ４（４）:23〜33（1981）〕。結
合標識と遊離標識との完全な分離をもたらすためには遠
心分離がまだ要求される。
第１抗体に対して高められた第２抗体を用いる分離に伴
なわれて、抗体は標識された分子および標識されていな
い分子と反応し得る〔同一文献〕。二抗体法と定義され
るこの方法は、標識との反応中における抗体の均質性を
達成するが、抗原をペレット化するための遠心分離を伴
なった第１抗体と第２抗体の反応のために培養期間を要
求する。
抗体は、ノルトリプチリン、メトトレキセート、ジゴキ
シン、チロキシンおよびヒト胎盤性ラクトゲンに関する
放射標識免疫検定法において遠心分離段階を消去するた
めの努力において、磁性支持体に付着された〔アール
エス カメル［R.S.Kamel］ら、クリン ケム［Clin,Ch
em.］、25（12）:1997〜2002（1979）；アール エス
カメルとジェイ ガードナー［J.Gardner］、クリン
チム アクタ［Clin.Chim.Acta］、89:363〜370（197
8）；米国特許第3,933,997号；シー ダウェス［C.Dawe
s］とジェイ ガードナー、クリン チム アクタ、86:
353〜356（1978）；ディー エス イサキシオス［D.S.
Ithakissios］ら、クリン チム アクタ、84:69〜84
（1978）；ディー エス イサキシオスとディー オー
クビアトウィクス［D.O.Kubiatowicz］、クリン ケ
ム23（11）:2072〜2079（1977）およびエル ナイエ
［L.Nye］ら、クリン チム アクタ、69:387〜396（19
76）、このため参照によって組み入れられた。〕。この
ような方法は大きな粒径（直径10〜100μ）に悩まさ
れ、検定の間拡散した抗体を保つための攪拌を必要とす
る。実質的分離は磁場のない状態での自然沈降により起
こるので、これらの従前の方法は、実際は単に磁気的に
補助された重力分離である。沈降の問題は、米国特許第
4,177,253号中で、空洞ガラスやポリプロピレンのよう
な低密度核（直径４〜10μ）の粒子表面の一部を被覆
（厚さ4mμ〜10μ）してなる磁化粒子を用いるものであ
る試みによりデイビス［Davis］とジェンタ［Janta］に
より提唱されている。抗エストラジオール抗体は、この
ような粒子に結合し、そしてこれらのエストラジオール
RIAにおける潜在的有用性が示された。この試みは沈降
の問題を克服したかもしれないが、その粒径と磁性被膜
はそれでもなお表面積における限定を有しそれにより抗
体との結合位置の有効性において限定を有している。
II−3. 他の生物学的系における磁気分離の適用 磁気分離は、RIA以外の他の生物学的系においても適用
されている。螢光免疫検定法［fluoroimmunoassay］（F
IA）や酵素免疫検定法［enzyme−immunoassay］（EIA）
のようないくつかの非同位性元素的免疫検定法は、抗体
の結合した（または抗原の結合した）磁性粒子を用いる
ものを発達させた。競合的結合の主要点は螢光支持体お
よび酵素がそれぞれ標識として放射性同位元素のかかる
他はRIAにおけるものとFIAおよびEIAにおいて同一であ
る。説明のために、エム ポーファルザネフ［M.Poufar
zaneh］らおよびアール エス カメル［R.S.Kamel］ら
は、抗体がブロモシアン活性化により結合する強磁性の
セルロース／酸化鉄粒子を用いて、それぞれコルチゾー
ルおよびフェニトインに関する磁化可能固形相［magnet
izable solid−phase］FIAを発展させた［エム ポーフ
ァルザネフら、クリン ケム 、26（６）:730〜733（1
980）；アール エス カメルら、クリン ケム、26
（９）:1281〜1284（1980）］。
IgEの測定に関する非競合的固形サンドイッチ技法［non
−competitive solid phase sandwith technique］EIA
はジェイ エル ゲスドン［J.L.Guesdon］らにより述
べられている〔ジェイ アレルギー クリン イムノル
［J.Allergy Clin.Immunal.,61（１）:23〜27（197
8）〕。この方法によると、グルタルアルデヒド活性化
により磁性ポリアクリルアミド−アガロース ビーズに
結合した抗IgE抗体は、結合をさせるためにIgEを含有試
験試料で培養される。結合したIgEは、アルカリホスフ
ァターゼまたはβ−ガラクトシダーゼのいずれかで標識
された第２抗IgE抗体を添加することで定量される。酵
素で標識された第２抗体は、サンドイッチ状を形成しな
がら第１抗体と結合したIgEと複合し、そして粒子は磁
気的に分離される。結合したIgEに比例したものである
粒子に関連した酵素活性度は、次にIgE定量をなしなが
ら計測される。
ビタミンＢに関する磁化可能固形相非免疫放射線検定法
［magnetizable solid phase non−immue radioassay］
は、ディー エス イサキシオスとディー オー クビ
アトウィクスにより報告されている〔クリン ケム23
（11）:2072〜2079（1977）〕。非免疫放射線検定法に
おける競合的結合の主要点は、放射性同位元素標識を用
いる双方の検定法でRIAにおけるものと同様である。し
かしながら、RIAが抗体−抗原結合に基づくものである
一方、非免疫放射線検定法はビタミンB12のようなある
生物分子の特定または非特定の結合、担体もしくは受容
体タンパクとの結合または相互作用に基づくものであ
る。イサキシオスとクビアトウィクスの磁性粒子は、水
不溶性タンパク基質中に包埋［embed］されたバリウム
フェライト粒子から成るものであった。
今述べた固形相生物学的検定法におけるこれらの使用の
他に、磁性粒子はその他の生物学的検定法の種々のもの
においても使用されている。磁性粒子は、混合母集団よ
り選定ウイルス、選定バクテリアおよび他の選定細胞を
分離するために細胞分類系に用いられている〔米国特許
第3,970,518号、第4,230,685号および第4,267,234号、
このため参照により組み入れられる。〕。これらは溶液
から分子を選択的に分離および精製するために親和クロ
マトグラフィー系に用いられており、そして特にコロイ
ド懸濁液からの精製に有用である〔ケイ モスバック
［K.Mosbach］とエル アンダーソン［L.Anderson］ネ
イチャー［Nature］170:259〜261（1977）、このため参
照により組み入れられる。〕。磁性粒子はまた、固定化
酵素系における固形相支持体として使用されている。磁
性粒子に結合した酵素は生化学的反応に触媒作用を及ぼ
すのに十分な時間基質と接触させられる。その後酵素
は、生成物および非反応基質から磁気的に分離し得、そ
して潜在的に再使用可能である。磁性粒子は、α−キモ
トリプシンおよびβ−ガラクトシダーゼ（米国特許第4,
152,210号、このため参照により組み入れられる。〕な
らびにグルコース イソメラーゼ〔米国特許第4,343,90
1号、このため参照により組み入れられる。〕に対する
支持体として固定化酵素系において使用されている。
III.術語 「磁気応答粒子［magnetically responsive particl
e］」ないし「磁性粒子［magnetic particle］」なる用
語は、顕著な重力沈降を起こすことなく水性媒体中に分
散可能もしくは懸濁可能でありそして懸濁液から磁場を
かけることにより分離可能である粒子であり、かつ該粒
子は生親和性吸着剤が共有結合し得る、吸収的もしくは
共有的に結合した、有機感応性を生ずる外装ないしは被
膜によって通常囲繞された磁性金属酸化物核よりなる粒
子であることと定義される。
「磁性群［magnerocluster］」なる用語は、「磁気応答
粒子」および「磁性粒子」の類義語である。
「金属酸化物核［metal oxide core］」はフェロスピネ
ル［ferrospinel ］構造を有し、同じあるいは異なる遷
移金属の三価または二価のカチオンからなる遷移金属酸
化物の結晶もしくは結晶群と定義される。詳説すると、
金属酸化物核は酸化鉄の超常磁性結晶群もしくは酸化鉄
の強磁性結晶群より構成され得るまたは酸化鉄の強磁性
単結晶によりなり得る。
「生親和性吸着剤［bioaffinity absorbent ］」なる用
語は、他の生物学的分子との特定もしくは非特定の結合
もしくは相互作用し得る生物学的あるいは他の有機的分
子と定義され、ここにおいて結合もしくは相互作用は、
「リガンド／リゲート［ligand/ligate］」結合もしく
は相互作用に関連し得、また何ら限定されるものではな
いが、抗体／抗原、抗体／ハプテン、酵素／基質、酵素
／阻止因子、酵素／補助因子、結合タンパク／基質、担
体タンパク／基質、ラクチン／炭水化物、受容体／ホル
モン、受容体／作用因子もしくは抑制因子／誘発因子の
結合もしくは相互作用などで例示される。
「結合磁気応答粒子［copled magnetically responsive
particle］」ないし「結合磁性粒子［copled magnetic
particle］」なる用語は、１ないしそれ以上の種類の
生親和性吸着剤が共有結合によって結合される磁性粒子
と定義され、ここにおいて共有結合は、磁性粒子の被膜
と生親和性吸着剤の双方における結合に有効な官能性に
依存するアミド、エステル、エーテル、スルホンアミ
ド、ジスルフィド、アゾまたは他の安定な有機的の結合
であり得る。
「シラン［silane］」なる用語は、二官能性のオルガノ
シランに関するものであり、米国特許第3,652,761号中
に分子のケイ素部分が無機物に親和性を有する一方、分
子中の有機部分が有機物と結合するように構成されたこ
とを特徴とするケイ素−官能性ケイ素化合物と定義され
ている。シランはそのケイ素−官能性の利点により金属
酸化物核の適当な被覆材料であり、そしてその有機官能
性によって生親和性吸着剤に結合し得るものである。
「超常磁性［superparamagnetism］」なる用語は、約30
0Å以下の結晶粒径を有する酸化鉄により表わされる磁
気的挙動と定義され、ここにおいて該挙動は、永久磁化
されることなく磁場に応答することにより特徴づけられ
る。
「強磁性［ferromagnetism］」なる用語は、約500Å以
上の結晶粒径を有する酸化鉄により表わされる磁気的挙
動と定義され、ここにおいて該挙動は、永久磁化を伴な
って磁場に応答することにより特徴づけられる。
「フェロフルイド［ferrofluid］」なる用語は、良好に
分離された通常50〜500Åの副変域粒径の磁性粒子の、
担体液体および界面活性剤中におけるコロイド状分散体
よりなる液体と定義され、ここにおいて該粒子は、最高
約5000エルステッドの磁場の存在においてさえも、液体
担体中に実質的に均一に分散された状態をとどめるもの
である。
「免疫検定法［immunoassay］」なる用語は、多クロー
ン性もしくは単クローン性抗体と抗原との免疫学的結合
もしくは免疫学的相互作用に基づく溶液中における分析
物の濃度もしくは量の計測に関する方法と定義され、こ
こにおいて該方法は、（ａ）結合していない分析物から
結合した分析物を分離することを要求し、（ｂ）結合し
た分析物およびまたは結合していない分析物の計測の手
段として放射性同位元素標識、螢光測定標識、酵素標
識、化学ルミネッセンス標識または他の標識を用い、そ
して（ｃ）結合した計測可能な標識の量が、元来溶液中
にある分析物の量に一般的に逆比例する場合「競合的」
とあるいは結合した計測可能な標識の量が、元来溶液中
にある分析物の量と一般的に直接比例する場合は「非競
合的」と述べられ得る。標識は、抗原中、抗体中あるい
は二抗体法においては第２抗体中にあり得る。免疫検定
法は、何ら限定されるわけではないが例えば放射標識免
疫検定法（RIA）、免疫放射線測定検定法［immunoradio
metric assay］（IRMA）、螢光免疫検定法（FIA）、酵
素免疫検定法（EIA）およびサンドイッチ法免疫検定法
などが例示されうる。
「結合検定法［binding assay］ないし「非免疫学的検
定法［non−immune assay］」なる用語は、生親和性吸
着剤と他の生物学的もしくは有機的分子との抗体／抗原
の結合もしくは相互作用以外の特定もしくは非特定の結
合もしくは相互作用に基づく溶液中の分析物の濃度もし
くは量の計測に関する方法と定義され、ここにおいて該
方法は（ａ）結合していない分析物から結合した分析物
を分離することを要求し、（ｂ）結合した分析物および
または結合していない分析物を計測する手段として、放
射性同位元素標識、螢光計測標識、酵素標識、化学ルミ
ネッセンス標識またはその他の標識を用い、そして
（ｃ）結合した計測可能な標識の量が、元来溶液中にあ
る分析物の量に一般的に逆比例する場合「競合的」とあ
るいは結合した計測可能な標識の量が、元来溶液中にあ
る分析物の量に一般的に直接比例する場合は、「非競合
的と延べられ得る。
「固定化酵素反応［immobilized anzyme reaction］な
る用語は、酵素的に触媒作用された生化学的な転化、合
成または劣化と定義され、ここにおいて酵素分子または
その活性位置は、自由に溶融しないだけでなく、周辺媒
体中に懸濁されるまたは周辺媒体に接触されかつ該媒体
より再生され得るまたは分離され得る固形相支持体に吸
収的結合または共有結合しているものである。
「親和クロマトグラフィー［affinity chromatograph
y］」なる用語は、選定分子をその周辺媒体より、周辺
媒体中に懸濁されるまたは周辺媒体中に接触され、かつ
該媒体より再生され得るまたは分離され得る固形相支持
体に吸収的結合または共有結合している生親和性吸着剤
との選定分子の結合または相互作用に基づいて、分離、
隔離およびまたは精製することと定義される。
IV.発明の概要 本発明は周辺媒体からの分子の分離または周辺媒体中の
分子の直接的な移動を伴なう生物学的適用に有用な新規
な磁性粒子を用いた効率的な溶液中のリゲートの濃度測
定方法を提供することを目的とする。
該磁性粒子は、選定された結合化学作用により広範な種
類の生親和性吸着剤が共有結合し得るものである吸着結
合もしくは共有結合シラン被膜により一般的に囲繞され
た磁性金属酸化物核よりなるものである。この磁性金属
酸化物核は好ましくは超常磁性酸化鉄結晶群を含有し、
この被膜は好ましくは、シラン重合体であり、そしてこ
の結合化学作用は、何ら限定されるわけではないが、ジ
アゾ化カップリング、カルボジイミドカップリングおよ
びグルタルアルデヒドカップリングを含むものである。
本明細書中に述べる方法により調製される該磁性粒子
は、該磁性粒子を数多くの検定方法における使用に十分
許容し得る時間水性媒体中に分散された状態を保持し得
るものである。該磁性粒子は粒径約0.1〜1.5μのもので
ある。注目すべきことに、この範囲の平均粒径を有する
本発明に用いられる磁性粒子は、生親和性吸着剤との結
合に高い能力を与えるものである約100〜159m2/gほどの
高い表面積を有して調製されるものである。この粒径範
囲の磁性粒子は、より大きな粒子のもつ迅速な沈降の問
題を克服しそしてより小さな粒子を分離するために要求
された磁場および磁場変化を発生するための大きな磁石
の必要性を除去するものである。本発明に用いられる磁
性粒子の分離をなすのに使用される磁石は、約100〜約1
000エルステッドの磁場を発生するものしか要求されな
い。このような磁場は、磁性粒子の分散を保つ容器より
も好ましく小さいものである永久磁石で得られることが
でき、これゆえ、ベンチトップ使用にも適している。本
発明においては、超常磁性の挙動を有する粒子が、強磁
性粒子に関連する磁気凝集を示すことがなくかつ再分散
および再使用が可能であることから用いられる。
該磁性粒子の調製方法は、微細な金属酸化物結晶を形成
されるためにアルイカリ中に金属塩を沈殿させ、再分散
させそして結晶を水中でおよび電解液中で洗浄すること
でなる。磁気分離は、結晶が超常磁性である場合に洗浄
液中の結晶を収集するのに用いられ得る。結晶は次にこ
の金属酸化物に吸着結合または共有結合し得かつ生親和
性吸着剤との結合に関する有機官能性を供与し得る物質
で被覆される。
本発明のにおいて金属酸化物該を囲繞する被膜はシラン
の重合体である。シラン化は、金属酸化物結晶を酸性有
機液中に再分散させ、オルガノシランを添加し、水およ
び有機溶液のいずれにも混和し得る湿潤剤の存在下に加
熱により脱水し、そして得られた磁性シラン化金属酸化
物を洗浄することによりなされ得る。
本発明に用いられる磁性粒子は、周知の結合化学作用に
より、例えばしかしながら何ら限定されることはない
が、抗体、抗原および特定の結合タンパクなどのような
生親和性吸着剤と共有結合することができ、そしてこの
結合磁性粒子は、溶液中の分析物の計測に用いられる免
疫検定法もしくは他の結合検定法に使用することができ
る。このような検定法は好ましくは、生親和性吸着剤に
結合しておりかつ非標識分析物および標識分析物の双方
に結合または相互作用し得る磁性粒子の存在下に、標識
分析物の既知量と共に非標識分析物の未知量を含む試料
を混合し、生ずる結合または相互作用をなさせ、磁性粒
子を磁気分離し、磁性粒子に関連する標識の量およびま
たは溶液中に遊離している標識の量を計測し、そして試
料中の分析物の濃度を決定するために標識の量を、相似
して作製された標準曲線に相関させることによりなる。
本発明に用いられる磁性粒子は、既存の磁性粒子の粒
径、表面積、重力沈降速度および磁気的特性に関連する
問題点を克服したものである。第1.5時間を超える重力
沈降時間は、本発明に用いられる磁性粒子で達成するこ
とができる、ここにおいて重力沈降時間は、磁場の存在
下における50％まで低下する本発明に用いられる磁性粒
子の分散体の濁り度に用する時間であると定義される。
約10分間未満の磁気分離時間は、磁性粒子の分散体を含
んでいる容器をこの容器より容積的に大きくない永久磁
石の磁極面と接触させることによって本発明に用いられ
る磁性粒子で達成することができる、ここにおいて磁気
分離時間は、95％まで低下する分散体の濁り度に要する
時間であると定義される。さらに、本明細書中に述べら
れた磁性粒子の金属酸化物核を囲繞する被膜としてのシ
ランの使用は、より限定された結合官能性をもつ公知の
磁性粒子被膜と比べて同様に広範囲の結合条件下におけ
る広範な種類の分子との結合を可能とする。
本発明に用いられる磁気応答粒子は、超常磁性の特性を
維持しながら低磁場（100〜1000エルステット）におい
て該粒子の十分な分離を生じるものである超常磁性結晶
群よりなる金属酸化物核を有するものである。粒子の凝
集は、意図された生物学的検定法またはその他の適用に
おいて使用されるために該磁性粒子の分散を十分許容し
得る時間実質的な重力沈降がなきように好ましくは十分
小さなものである粒子を生成するように、粒子合成の間
制御される。磁性応答粒子中に超常磁性核を有すること
の利点は、このような粒子がくり返し磁場にさらされ得
るということである。このような粒子は、永久磁化され
ず、それゆえ磁気凝集を起こさないために、このような
粒子は再分散および再使用できる。シラン化の後におい
てさえも、結晶群によりつくられた核を有する本発明の
好ましい粒子は、このような粒子が開放または多孔質構
造を有することを示すものである単位重量当りの非常に
高い表面積および一般的に相応する高い結合能力を示す
ものである。
第II節で述べた生物学的系において使用された既存の磁
性粒子のいずれも、本発明に用いられる磁性粒子と同様
な、粒径、表面積、結合融通性、沈降特性および磁性的
挙動を有していない。本発明の磁性粒子は、文献におい
て報告される多くの検定法、酵素固定化法、細胞選別法
および親和クロマトグラフィー法に適しており、そして
実際このような手法において過去に経験された粒子沈降
および再使用に関する問題を克服しているものである。
V.本発明の具体的説明 Ｖ−1. 磁性粒子調製 本発明に用いられる磁性粒子は、２つの段階により調製
され得る。第一に、超常磁性酸化鉄が、例えばFeCl2お
よびFeCl3のような二価（Fe2+）および三価（Fe3+）の
鉄塩のアルカリ中の沈澱により調製される。第二にオル
ガノシラン被膜が、この酸化鉄に適用される。
Fe2+とFe3+との比は、最終製品中における実質的変更を
せずに、鉄の一定モル量を維持しながらFe2+の量を増加
することで変えられ得る。好ましいFe2+／Fe3+は2/1で
あるが4/1のFe2+／Fe3+比もまた、第VI−１節の製法に
おいて適当に作用する（第VI−７節をさらに参照のこ
と。）。1/2のFe2+／Fe3+比は、それにより高いFe2+／F
e3+比より得られものよりわずかに品質の劣った磁性粒
子を生ずる。この磁性酸化物は「ブリード」を起す傾向
すなわち第VI−１節の洗浄方法において可溶となる傾向
にあり、そして粒径は2/1ないし4/1のFe2+／Fe3+比から
得られたものより不均一である。それにもかかわらず、
これは、第VI−７節で例示されるような有用な磁性粒子
を生じるようにシラン化され得るものである。
酸化鉄の水性溶液は、超常磁性酸化鉄の結晶性沈殿物を
形成することをもたらす例えば水酸化ナトリウムのよう
なアルカリ中に混合される。この沈殿物は、磁気分離を
用いて水でくり返し洗浄され、そして中性pH値に達する
まで再分散される。この沈殿物は次に一度例えば塩化ナ
トリウム溶液のような電解液中で洗浄される。電解液洗
浄段階は、酸化鉄結晶の純度を保障するために重要であ
る。最後に沈殿物は、メタノールで1.0％（v/v）水の残
留物を残すところまで洗浄される。
洗浄段階における懸濁液から酸化鉄を分離するための磁
場のくり返しの使用は、超常磁性により容易である。い
かに多くの回転該粒子が磁場におかれたとしても、これ
らは決して永久磁化することなく、従ってゆるやかな攪
拌をすれば再分散される。永久磁化される（強磁性）金
属酸化物は、磁場にさらした後に磁気凝集する傾向にあ
りそして均一に再分散できないので、このような洗浄手
段によっては調製され得ない。
マグネシウム塩、マンガン塩、コバルト塩、ニッケル
塩、亜鉛塩および銅塩のような他の２価の遷移金属塩
は、磁性金属酸化物を得るのにこの沈殿手法において鉄
（II）塩に変えることができる。例えば第VI−１節の手
法におけるFeCl2の２価のコバルト塩化物（CoCl2）での
置き換えは、強磁性金属酸化物粒子を生成した。CoCl2
でこのように調製される強磁性金属酸化物粒子は、該粒
子を磁化しないため、洗浄と洗浄の間に遠心分離または
濾過などの周知手段を用いて磁場の不存在下に洗浄され
得る。得られた強磁性金属酸化物が水性媒体中で分散体
をとどめるのに十分小さな粒径である限り、これらはま
たシラン化され得、そして例えばある放射標識免疫検定
法のような１回の磁気分離を要求する系における使用の
ために生親和性吸着剤に結合され得る。強磁性は、再分
散または再使用を要求する適用における粒子の有用性を
限定する。
アルカリ沈殿により調製された磁性金属酸化物は種々の
適当なシラン類のいずれか１つにより被覆され得る。シ
ランカップリング材料は、２つの特徴を有しており、そ
れはこれらが金属酸化物に吸着結合または共有結合し得
ることと、これら有機官能性により生親和性吸着剤と共
有結合を形成し得ることである。
本発明に用いられる磁性粒子の金属酸化物核を被覆する
のにシラン化が用いられる場合、一般式Ｒ−Si(OX)
3〔ただし式中、(OX)3は代表的にはトリメトキシもしく
はトリエトキシのようなトリアルコシキ基であり、また
Ｒは末端にアミノフェル、アミノ、ヒドロキシル、スル
フィドリル、脂肪性、親水性もしくは混成官能性（両親
媒性）を有するアリル、アルキルもしくはアラルキル基
または生親和性吸着剤に共有結合するのに適した他の有
機基である。〕を有するオルガノシランが用いられ得
る。このようなオルガノイランは、Ｐ−アミノフェニル
トリメトキシシラン、ｎ−ドデシルトリエトキシシラン
およびｎ−ヘキシルトリメトキシシランからなる群より
選ばれる。
本発明の一実施例態様において、シランは酸性有機溶媒
中から金属酸化物核上に析出される。このシラン化反応
は２段階的に起こる。第一に、トリメトキシシランは、
メタノールのような有機溶媒、水および例えばリン酸も
しくは氷酢酸からなるものの中に入れられる。これはシ
ラン重合体を形成するように縮合される。
第二に、これらの重合体は、金属酸化物と結合する、お
そらくこれは、表面OH基との脱水による共有結合を形成
することによるものと思われる。
金属酸化物へのシラン重合体の吸着もまた可能である。
本発明に係る酸性有機シラン化方法の重要な点は、シラ
ン重合体の金属酸化物への吸着結合または共有結合をも
たらすために用いられた脱水方法である。この結合は、
有機溶媒と水のとちらにも混和し得る湿潤剤の存在下に
シラン重合体と金属酸化物とを加熱することで達成され
る。約290℃の沸点を有するグリセロールが適当な湿潤
剤である。グリセロールの存在下に約160〜170℃に加熱
することは、２つの目的を与える。これは水、有機溶媒
（これは例えば、メタノール、エタノール、ジオキサ
ン、アセトンまたはその他の適当な極性溶媒である得
る。）および過剰なシラン単量体の蒸発を保証する。さ
らに、グリセロールの存在は、脱水が乾燥のために加熱
により行なわれる公知の他のシラン化方法の生来の問題
である粒子の凝集ないしは塊状化および粒子の潜在的架
橋を防ぐものである。
本発明の他の実施態様において、酸性水性シラン化方法
が、シラン重合体を金属酸化物核上に析出するために用
いられる。ここにおいて金属酸化物は、10％シラン単量
体の酸性（pH約4.5）水溶液中に懸濁される。シラン化
は、約２時間90°〜95℃で加熱することにより達成され
る。
グリセロール脱水がまた使用される。
酸化鉄粒子上のシランの存在は、以下の観察により確証
された。第一に、6N−塩酸での処理の後、該酸化鉄は溶
解し、シラン化されていない酸化鉄が同様に消化されて
も存在しない白色の無定形の残留物が残った。この酸不
溶性残留物がシランであった。第二に、第VI−４節のジ
アゾ化法は、該粒子への抗体の付着を許容した。ジアゾ
化はシラン化されていない粒子の付着は促進しない。最
後に、抗体の付着は極めて安定であり、金属酸化物への
抗体の吸着によるものよりもかなりすぐれて安定してい
る。
Ｖ−2. シランカップリング化学作用 シラン被膜の選択および磁性粒子への生親和性吸着剤の
結合に対する特定の化学作用に関する最初の考察は、生
親和性吸着剤それ自体の状態、たとえば温度やpHなどの
ような因子に対する感受性ならびに結合に関する分子上
の反応基の有用性である。
例えば、抗体が磁性粒子に結合すべきである場合には、
結合化学作用は免疫グロブリンタンパクに非破壊的であ
るべきであり、共有結合は、抗体／抗原相互作用が遮断
ないし妨害されないようにタンパク分子上の部位に形成
されるべきであり、そして得られる結合は選択された結
合条件下で安定であるべきである。同様に、酵素が磁性
粒子に結合すべきである場合には、結合化学作用は酵素
タンパクを変性すべきではなく、そして、共有結合は活
性もしくは触媒作用性部位並びに酵素／基質もしくは酵
素／補助因子相互作用により干渉され得るその他の部位
以外の分子上の部位で形成されるべきである。
種々のカップリング化学作用が当業者に公知であり、ま
た、上述した参照により組み入れられた米国特許第3,65
2,761号において述べられている。詳述すると、ジアゾ
化は、ｐ−アミノフェニル末端化シランを免疫グロブリ
ンに結合することに用いられ得る。免疫グロブリンおよ
び他のタンパクの３−アミノプロピル末端化シランおよ
びＮ−２−アミノエチル−３−アミノフェニル末端化シ
ランへの結合はグルタルアルデヒドの使用により達成さ
れている。この手法は２つの基本的段階すなわち、１）
未反応のグルタルアルデヒドの除去を後に行なうもので
あるグルタルアルデヒドとの反応による粒子の活性化
と、２）未反応のタンパクの除去を行なうものであるタ
ンパクの活性化粒子との反応をよりなるものである。こ
の手法はタンパクおよび細胞の固定化に広範に使用され
る〔エイ エム クリバノフ［A.M.Klibanov］、サイエ
ンス［Science］、219:722（1983）、このため参照によ
り組み入れられた。〕磁性粒子がカルボキシ末端化シラ
ンによって被覆された場合には、タンパクおよび免疫グ
ロブリンのような生親和性吸着剤は、最初に該粒子を３
−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミドで
処理することによってこれらの結合され得る。
一般的にある有機官能性を供与するシランで被覆された
磁性粒子は、表面上にすでに存在する官能性をより望ま
しい官能性に置き換えるように変更され得る。例えば、
ジアゾ誘導体は、ｐ−ニトロ−安息香酸との反応、ニト
ロ基のアミンへの還元、そして次に亜硝酸でのジアゾ化
により３−アミノプロピルトリエトキシシランから調製
され得る。同じシランが、アミノ官能基のチオホスゲン
との反応によりイソチオシアノアルキルシラン誘導体へ
転化され得る。
磁性粒子への結合をもたらすために、生親和性吸着剤の
水性溶液がシラン被膜粒子と室温もしくはそれ以下の温
度で接触され得る。タンパク（ないしは免疫グロブリ
ン）が結合されるべき場合、一般的に1:10〜1:30のタン
パク（mg）：粒子（mg）の比が用いられる。約３〜24時
間の接触時間が通常、結合に十分である。この時間の間
pHは、生親和性吸着剤を変性させない値に維持されそし
てその最良の値は、例えばアゾ結合の場合pH8〜９であ
るような、形成される結合の種類に合わせたものであ
る。
さらに詳細に第VI−５節、第VI−８節および第VI−10節
でそれぞれ述べられるジアゾ化法、カルボジイミド法ま
たはグルタルアルデヒド法のいずれかによる抗体のシラ
ン被覆磁性粒子へ結合の後に、抗体は以下の苛酷な処理
を行なった後でさえも磁気性をとどめた：リン酸緩衝食
塩水（PBS）中に50℃で24時間、PBS中に37℃で21日間、
1M−塩化ナトリウム中に23℃で30分間および室温でエタ
ノールまたはメタノール中での反復的洗浄。酸に鉄に吸
着された抗体は、実質的にこれらのいかなる処理によっ
ても解離されない。これらの結果は、シランが非常に堅
固に金属酸化物と結合していることおよび抗体の該粒子
への結合は本質的に不可逆的共有結合よりなされたもの
であるということを示すものである。シランの金属酸化
物への生親和性吸着剤（例えば抗体）の共有結合を伴な
った堅固な結合は、商品的に重要な特質である、結合磁
性粒子上へ安定性を与える特徴点である。
ｖ−3. 生物学的検定法における磁性粒子の使用診断学的または
研究的目的に使用される検定法の最も普及した種類は、
競合的結合の主体に基づいた放射標識免疫検定法、螢光
免疫検定法、酵素免疫検定法および非免疫放射線検定法
である。基本的に、抗原のようなリゲート［ligate］に
指向した例えば抗体もしくは特異性結合タンパクのよう
なリガンド［ligant］は、過剰な標識リゲート（*リゲ
ート）で飽和される〔あるいは、競合的検定法は標識リ
ガンドと非標識リゲートとで行なわれ得る。サンドイッ
チ検定法と呼ばれる非競合的検定法もまた広範に用いら
れ得る。〕本発明の方法によると、リガンドは磁性粒子
に結合される。標識の例としては、トリリウム、14C，
57Coおよび好ましくは125Iのような放射性同位元素、ロ
ーダミンイソチオシアネートおよびフルオレセインイソ
チオシアネートのような螢光測定標識、またアルカリホ
スファターゼおよびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼのような
酵素（一般的に酵素反応が計測され得る容易さで選ばれ
る。などがある。非標識リゲートがリガンドに*リゲー
トを伴なって加えられると、非標識リゲートの標識リゲ
ート（*リゲート）に対する比が増加するので、より少
ない*リゲートがリガンド−リゲート複合体中に見い出
されるであろう。リガンド−*リゲート複合体が*リゲー
トから物理的に分離され得ると、試験物質中の非標識リ
ゲートの量が決定され得る。
非標識リゲートを計測するために、標準曲線が作成され
なければならない。これはリガンドと*リゲートのある
固定した量を混合し、そしてそれぞれに非標識リゲート
の既知量を加えることにより行なわれる。反応が完了し
た際、リガンド−*リゲート複合体は*リゲートから分離
される。そして収集されたリガンド−*リゲート複合体
中の標識を添加した非標識リゲートに関係させたグラフ
が作成される。実験試料中の非標識リゲートの量を決定
するために、試料の標本（アリクウォット［aliquo
t］）が標準曲線を得るのに用いられたのと同じリガン
ト−*リゲート混合物中に添加される。リガント−*リゲ
ート複合体は収集され、標識が測定され、そして非標識
リガントの量が標準曲線から読み取られる。これは、た
とえどのような複合体でもリガント−*リゲート相互作
用を何も妨害しない限り、いずれの試料でも可能であ
る。本発明の方法により、リガント−*リゲート複合体
は遊離*リゲートから磁気的に分離される。
この一般的方法論は、ホルモン、医薬剤、ビタミンおよ
び補助因子、血液学的物質、ウィルス抗原、核酸、ヌク
レオチド、グリコシドならびに糖を含む広範な種類の化
合物の計測に関する検定法において適用され得るもので
ある。詳細のために、第１表にあげた化合物はすべて磁
性粒子免疫検定法および磁性粒子結合検定法により測定
可能である〔ディー フレイフィルダー ［D.Freifilder］、フィジカル バイオケミストリー
［Physical Biochemistry］,p259、ダブリュー エッチ
フリーマン アンド コンパニー［W.H.Freeman and
Company］、サンフランシスコ（1976）を参照のこ
と。〕。
VI.実施例 VI−1. 金属酸化物の調製 金属酸化物粒子は以下のごとく鉄（II）（Fe2+）の塩と
鉄（III）（Fe3+）の塩の溶液をアルカリと混合するこ
とにより調製される。すなわち、0.5M塩化第一鉄（FeCl
2）と0.25M塩化第二鉄（FeCl3）の溶液（200ml）が5M水
酸化ナトリウム（NaOH）（200ml）と60℃で、100mlの蒸
溜水を入れた500mlビーカーに双方の溶液を注ぐことに
より混合された。特に注釈しない限りすべての段階は室
温にて行なわれた。この混合物は、約２分間攪拌され、
この時間の間に黒色の磁気沈澱が形成された。沈降した
後において、沈降沈澱物の容積は約175mlであった。こ
の沈澱物中の鉄酸化物の濃度は約60mg/mlであった。
（下記に測定した鉄11.2mgの収率に基づく。）。これ
は、例えばレコーディングテープ用の標準的磁性酸化物
であるピフィザー ♯2228 γFe2O3［Pfizer ♯2228
γFe2O3］〔ピフィザー ミネラルズ［Pfizer Mineral
s］、ピグメンツ アンド メタルズ ディビジョン［P
igments and Metals Division］、ニューヨーク州、ニ
ューヨーク州〕のような、水性スラリー中に約700mg/ml
の濃度で得られる市販の磁性酸化鉄とは著しく異なるも
のである。この比較は、本方法により調製された粒子の
微細性を強調することも含んでいる。非常に微細な粒子
はち密な充填ができないおよび最も多くの水を吸い入れ
る。一方、より大きくそしてよりち密な粒子は、ち密に
充填され水を除去する。
沈澱物は次に、pHペーパーで測定してpH6〜８に達する
まで水で洗浄された。以下の洗浄方法が用いられた。す
なわち、該粒子は2lビーカーに入れた1.8lの水の中に懸
濁されそして磁気的抽出により収集された。このビーカ
ーは高さ1/2インチ（約1.27cm）直径６インチ（約15.24
cm）の環状磁石の上端におかれ、そして磁性粒子がこれ
により沈降した。水は、水を移す間磁石をビーカーの底
部に保持することで、該粒子の損失なく取り除かれた。
同様の洗浄方法が、容積が必要により調整されることを
除いて、すべての洗浄を通して用いられた。代表的に、
中性pHに達するのに３回の洗浄で充分であった。該磁性
粒子は次に一度、同じビーカー中で0.02M塩化ナトリウ
ム（NaCl）1.0lで洗浄された。
水は次に、メトキシシランの加水分解に触媒作用を及ぼ
すための水の痕跡を残しながら、メタノールで置き換え
られた（第VI−２節参照）。これは、0.2M NaCl800ml
で吸出し、総容量１をエタノールで運ぶことによりな
される。この物質は再懸濁され、そして、磁気的抽出さ
れ、懸濁液800mlが除去されそして他の800mlのメタノー
ルが加えられた。メタノールの３回添加の後、該酸化物
は約１％（V/V）水である溶液中においてシラン化の用
意をした。沈澱物の一部が70℃で24時間乾燥され計量さ
れた結果、11.2gの酸化鉄が形成されていた。
この方法を通して、磁性酸化鉄粒子は、その超常磁性の
特性ゆえ、磁場にさらすことをくり返しても永久磁化沈
澱となることは決してないということに注目すべきであ
る。従って、水洗浄およびメタノールでの置換え処理の
間粒子を再懸濁させるためには単にゆるやかな攪拌が要
求されるにすぎなかった。
VI−２ シラン化 約１％（v/v）の水を含むメタノール250ml中に懸濁され
た磁性酸化鉄粒子（第VI−１節参照）はヴィルテス 23
ホモゲナイザー ［Virtis 23 homogenizer］〔ヴィ
ルテス コンパニー インコーポレーテッド［Virtis C
ompany, Inc.］、ガーディナー、ニューヨーク州〕中へ
入れられた。オルト亜リン酸〔フィッシャー サイエン
ティック コーポレーション［Fisher Scientific C
o.］、ピッツバーグ、ペンシルバニア州〕2gとＰ−アミ
ノフェニルトリメトキシシラン〔Ａ−7025、ペトラーチ
システムス インコーポレーテッド ［Petrarch Sys
tem,Inc.］、ブリストール、ペンシルバニア州〕10mgが
加えられた。別の態様において、氷酢酸5mlがオルト亜
リン酸2gと置き換えられた。混合物は、23,000rpmで10
分間および9,000rpmで120分間均質化された。内容物は
グリセロール200mlを入れたガラス製の500mlビーカー中
へ注ぎ移され、そして160°〜170℃の温度に達するまで
ホットプレート上で加熱された。混合物は室温へ冷却さ
せられた。加熱および冷却の両段階とも窒素条件下で攪
拌しながら行なわれた。グリセロール粒子スラリー（容
積約200ml）が2lビーカーに入れられた水1.5l中に注ぎ
入れられ、該粒子は第VI−１節で述べた方法に従い水で
徹底的に（通常４回）洗浄された。
このシラン化方法は、３−アミノプロピルトリメキシシ
ラン、Ｎ−２−アミノエチル−３−アミノプロピルトリ
メトキシシラン、Ｎ−ドデシルトリエトキシシランおよ
びＮ−ヘキシルトリメトキシシラン〔それぞれＡ−080
0,A−0700,D−6224およびＨ−7334、ペトラーチシステ
ムス インコーポレーテッド、ブリストール、ペンシル
バニア州〕を含むその他のシランを用いても行なわれ
た。
上記のシラン化方法に代わる方法として、シランはまた
酸性水溶液から超常磁性酸化鉄（第VI−１節において調
製された。）上に折出された。
Fe2+／Fe3+比が２である超常磁性酸化鉄が第VI−１節に
述べたようにして水で洗浄された。メタノールへの移行
は省かれた。粒子1g（沈降粒子約20ml）が３−アミノプ
ロピルトリメトキシシラン10％水溶液100mlと混合され
た。pHは、氷酢酸で4.5に調節された。混合物は、電気
モーターに取付けられた金属攪拌板で混合しながら90〜
95℃で２時間加熱された。冷却の後、粒子は水（100m
l）で３回、メタノール（100ml）で３回、そしてさらに
水（100ml）で３回洗浄された。粒子上のシランの存在
が確認された。
VI−3. シラン化磁性粒子の物理的特性 ｐ−アミノフェニルシラン化粒子、３−アミノプロピル
シラン化粒子およびＮ−２−アミノエチル−３−アミノ
プロピルシラン化粒子に関する光散乱により測定された
平均粒径および窒素ガス吸着により測定された１グラム
当りの表面積が第４表に示される。粒子表面積は、タン
パクを結合する粒子の能力に密接に関係するものであ
り、300mg/gほどの多量のタンパクがＮ−２−アミノエ
チル−３−アミノプロピルシラン化粒子に結合され得、
これは従前に報告された粒子の12mg（タンパク）/gの値
よりも極めて高い値である〔ハルシュとヤベルバン、ク
リン ケム アクタ63:69（1975）〕。比較のために、
シラン化磁気鉱の２つの仮定球状粒子に関する１グラム
当りの表面積が第２表中にあげられている。該仮定粒子
の密度は、シラン化磁気鉱粒子の密度の概算である2.5g
/ccであると解釈された。それぞれの仮定粒子の粒径
は、仮定粒子に関する事項が記載された隣の本発明に用
いられる粒子の平均粒径であると解釈された。窒素ガス
吸着によって測定された本発明に用いられる粒子の１グ
ラム当りの表面積が同じ粒径のシラン化磁気鉱の完全な
球体に関する計算された１グラム当りの表面積よりもは
るかに大きいことが観察できる。本発明に用いられる粒
子のこのより大きな１グラム当りの表面積は、本発明に
用いられる粒子が多孔性構造あるいはさもなければ開放
構造を有していることを示すものである。粒径0.01μを
有するシラン化磁気鉱の仮定真球体は約120m2/gの計算
された１グラム当りの表面積を有している。
第VI−１節および第VI−７節の方法により調製されたシ
ラン化磁化粒子の平均粒径は、文献中に述べられた他の
磁化粒子の粒径よりもかなり小さいので、従前に報告さ
れたこれらの他の磁気粒子の重力沈降時間よりも、該シ
ラン化磁気粒子はより遅延された重力沈降時間を示す。
例えば、ここに述べられる該粒子の沈降時間は約150分
であり、これはａ）10μより大きい粒径と概算されたハ
ルシュとヤベルバンの粒子に関する約５分〔クリン ケ
ム アクタ 63:69（1975）〕および粒径50〜160μであ
るロビンソンらの粒子に関する約１分〔バイオテック
バイオエング XV:603（1973）〕とははなはだ異なるも
のである。
本発明に用いられるシラン化磁化粒子は、これらが弱い
磁場に対して迅速に応答するものであるにもかかわら
ず、それらの粒径および組成の結果としての重力沈降の
非常に遅い速度を有することにより特徴ずけられる。こ
れは、磁場の不在化に自然的粒子沈降によりもたらされ
るシラン化磁化粒子の懸濁の時間を通しての濁り度にお
ける変化がサマリウム−コバルト磁石の存在下における
濁り度と比較される第１図に描かれる。30分経過後にお
いて、懸濁液の濁り度は、磁場の不在下においてわずか
に10％より大きいものとしか変化しなかったことが観察
され得る。しかしながら、弱い磁場の存在下において
は、粒子懸濁液の濁り度は、６分以内にその最初の値の
95％以上近くも降下した。他の実験において、30分間で
わずか約４％の濁り度の減少が観察された。
３−アミノトリメトキシシランでシラン化された超常磁
性粒子（「SIN」粒子）の顕微鏡写真図が第２図におい
て示されている。粒子は形状および粒径において異なっ
ていること、そしてこれらは、形状において粗い球状を
現わすものである個々の超常磁性結晶（300Å以下）の
群から形成されていることを観察することができる。
VI−４ サイロキシンに対する抗体へのアミノフェニルシラン化
磁性粒子の結合 第一に、サイロキシン（T4）抗血清が以下のように調製
された。
T4で免疫されたヒツジの血清〔ラジオアッセイ システ
ムズ ラボラトリーズ インコーポレーテッド［Radioa
ssay Systems Laboratories,Inc.］、カーソン、カリフ
ォルニア州〕5.0mlが50ml遠心分離機チューブへ入れら
れた。リン酸緩衝食塩水の5.0mlアリクォットの２つが8
0％飽和硫化アンモニウム15mlを伴なって、pH7.4,4℃で
該チューブに加えられた。混合の後に、該チューブは４
℃で90分間保存された。混合物は次に、４℃,3000rpmで
30分間遠心分離された。上澄み成分は取り移され、そし
てペレットはPBS5.0ml中に再懸濁され清澄となるまで溶
解された。このT4抗血清調製品（PBS中1:2）は、PBSで
透析され、PBS40mlが入れられた50ml遠心分離機チュー
ブへ透析管から移されて総容積50mlとされた。このT4抗
血清調製物（PBS中1:10）は、結合に用いられるまで冷
蔵された。
1N−塩酸（HCl）100ml中のｐ−アミノフェニルシラン化
粒子1740mgへ、0.6M−亜硝酸ナトリウム（NaNO2）25ml
が加えられた。このNaNO2は、凍結しないように注意し
て０℃〜５℃の温度を維持しながら、粒子/HCl混合物の
表面下にゆっくりと加えられた。10分経過した後、混合
物は、０°〜５℃の温度に保ったまま、1.2M−NaOH65ml
および1M−炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）18mlを加える
ことによりpH7.5〜8.5とされた。次にサイロキシンに対
する抗体を含むヒツジの血清のγ−グロブリン成分100m
gを含むPBS50ml（上記に述べたT4抗血清調製物）が加え
られた。pHは、混合物が０℃〜５℃で18時間培養される
間、7.5〜8.5の間に保たれた。得られた抗体結合粒子
は、pH7.2の0.1M−リン酸ナトリウム緩衝剤で３回、1M
−NaClで、メタノールで、1M−NaClで、そしてさらに0.
1M−リン酸ナトリウム緩衝剤で洗浄し、完全に洗浄され
た。この洗浄段階は２度ないしそれ以上くり返された。
すべての洗浄は、第VI−１節で述べたように粒子を分散
させそしてこれを磁気分離することによりなされた。洗
浄の後、粒子はPBS中に再懸濁されそして一晩50℃で培
養された。この粒子は前に述べたようにしてメタノー
ル、1M−NaClおよび0.1M−リン酸ナトリウム緩衝剤中で
洗浄し、そして２度フリーT4 トレーサー バッファ
［Free T4 Tracer Buffer］中で洗浄し、放射標識免疫
検定法に用いるまで４℃にて保存された。
VI−5. サイロキシンに対する磁性粒子放射標識免疫検定法 サイロキシンの放射標識免疫検定法（RIA）に用いられ
る抗体結合磁性粒子の量は、以下のRIA法を用いて経験
的に決定された。
標準の２マイクロリットル（μｌ）が、トレーサー（追
跡子）500μｌおよび磁性粒子100μｌを伴なって12×75
mmポリプロピレン製チューブ中へピペットを用いて入れ
られた。渦動の後、混合物は37℃で15分間培養され、そ
の後該チューブは10分間マグネチックラック上に置かれ
た。このマグネチックラックは、それぞれのチューブの
底部がくる位置に円筒状の「バトン［button］」磁石
〔インカー18［Incor18］、インディアナ ジェネラル
マグネチック プロダクツ コーポレーション［Indi
ana General Magnetic Products Corp.］バルパライ
ソ、インディアナ州〕を有する試験管ホルダーから成る
ものであった。抗体および結合トレーサーを有する磁性
粒子は、マグネチックラックを転倒し上澄み液を捨てる
ことで除去されるものである非結合トレーサーを残した
まま、チューブの底部へ引きつけられた。このペレット
中の放射能は、トラカー 1290 ガンマ カウンター
［Tracor 1290 Gamma Counter］〔トラカー アナリテ
ック インコーポレーテッド［Tracor Analytic,In
c.］、エルク グローブビレッジ、イリノイ州〕により
測定された。
またこの検定法に用いられた試薬は次の通りである。標
準は、T4をT4のないヒト血清に加えることにより調製さ
れた。T4は、カーター［Carter］の方法〔クリン ケム
24,362（1978）〕に従い、活性木炭を除去するために濾
過を伴なう活性木炭での血清の培養により血清より除去
された。トレーサーは、ケンブリッジメデカル ダイア
グノスティクス［Cambridge Medical Diagnostics］よ
り購入された125I−サイロキシン（♯155）であり、ウ
シ血清アルブミン100μg/ml、サリチル酸塩10μg/mlお
よび８−アミリノナフタレン−８−スルホン酸50μg/ml
を含む0.01M トリスバッファ［Tris buffer］（２−ア
ミノ−２−ヒドロキシメチル−1.3−プロパンジオー
ル）中へ希釈された。0.1％ウシ血清アルブミンを含む
リン酸緩衝食塩水（PBS）中における種々の濃度での磁
性粒子が、T4測定に適した粒子濃度を決定するためRIA
中に使用された。チューブ当りの約50μｇの磁気粒子の
量がRIAのために選択された。この量は、T4の望まれる
濃度範囲（０〜32μg/dl）に関して抗体からのトレーサ
ーの良好な置き換えを許容した。
このように最適範囲を測定したことで、上記に述べたRI
A法が、T4に関する放射標識免疫検定標準曲線を作成す
るためにチューブ当り約50μｇの磁性粒子を用いて行な
われた。このRIAにより得られた結果を第３表に示す。
第 ３ 表 T4に関するRIA標準曲線 T4濃度 cpm（２つのチューブの平均） 0μg/dl 36763 2μg/dl 24880 4μg/dl 18916 8μg/dl 13737 16μg/dl 10159 32μg/dl 7632 総 量 69219 VI−6. テロフィリンに関する磁性粒子 放射標識免疫検定法 ウサギ抗テロフィン抗体は第VI−４節に述べたものと同
様の方法により調製されＰ−アミノフェニルシラン化粒
子に結合された。この抗テロフィリン抗体結合磁性粒子
は、以下の態様で放射標識免疫検定法に用いられた。テ
オフィリン標準（テオフィリンを有しないヒト血清に、
テオフィリンを加えることで得られた。）20μl,125I−
テオフィリントレーサー〔クリニカルアッセイズ［Clin
ical Assays］（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）製〕10
0μｌおよび抗体結合磁性粒子が渦動攪拌された。室温
での15分間の培養の後に、10分間の磁気分離が行なわれ
た。標準曲線が作成された。得られたデータを第４表に
示す。
第 ４ 表 テロフィリンに関するRIA標準曲線 テロフィリン濃度 cpm（２つのチューブの平均） 0μg/dl 35061 2μg/dl 28217 8μg/dl 19797 20g/dl 13352 60μg/dl 8148 総 量 52461 VI−7. T4放射標識免疫検定法における磁性粒子のFe2+／Fe3+比
の変化の影響 第VI−１節の結晶化方法に従い、鉄の一定モル量は維持
するがFe2+／Fe3+比を４から0.5の間で変えて、磁性酸
化鉄が調製された。これらの粒子はそれぞれ第VI−２
節、第VI−４節および第VI−５節に述べられるようにし
てシラン化され、抗T4抗体と結合されそしてT4RIAに用
いられた。
Fe2+／Fe3+比の変化は第５表に示すようにT4RIAにおい
てこれらの磁性粒子の性能に実質的に影響をもたらさな
かった。
VI−8. カルボン酸末端化磁性粒子のB12結合タンパク
への結合 VI−８−1. カルボン酸末端化磁性粒子の調製 超常磁性酸化鉄が第VI−１節に述べた方法によって調製
され、そして、アミノフェニルシランの代わりに３−ア
ミノプロピルトリメトキシシランを用いて第VI−２節に
述べるようにしてシラン化された。シランのアミノ基は
次に、末端化をアミンからカルボン酸に転化するために
無水グルタル酸と反応させられた。末端化の転化は次の
ようにして行なわれた。水中のアミノプロピルシラン化
粒子の5gが、第VI−１節の洗浄方法を用いて0.1M−NaHC
O31.5lで４回洗浄された。容積が100mlに調整され、無
水グルタル酸2.85gが添加された。粒子は２度洗浄され
そして無水グルタル酸での反応がくり返された。タンパ
クとの反応に用いられるものを調製するため、カルボン
酸末端化磁性粒子は水で５回洗浄された。
VI−８−2. B12結合タンパクおよびヒト血清アルブミンのカルボン
酸末端化磁性粒子へのカルボジイミドカップリング 水1ml中のカルボキシ末端化磁性粒子50mgへ、３−（３
−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド4mgが添
加された。２分間の振動による混合の後、B12結合タン
パク〔ドクターアール エッチ アレン［Dr.R.H.Alle
n］（デンバー、コロラド州）より得られた豚の腸の内
因性因子（IF）〕0.05mgおよびヒト血清アルブミン〔HS
A、シグマケミカル コーポレーション［Sigma Chemica
l Co.］,A−8763〕0.75mgが水中の0.30mlへ加えられ
た。３時間の間PHは、0.1N−HClまたは0.1N−NaOHを添
加することによりPH5.6に調整され維持された。粒子は
次に、0.5M−MaClを有するPH8.3の0.1M−ホウ酸塩10ml,
0.1％HSAを有するリン酸緩衝食塩水（PBS）10ml、そし
て蒸留水10mlで、第VI−１節に述べたような磁気分離法
を用いながら洗浄された。粒子はPBSで３度洗浄され、
使用までPBS中に保存された。
VI−9. ビタミンB12に関する磁性粒子競合検定法 第VI−７節の方法により調製されたIF−およびHSA−結
合磁性粒子について、粒子の滴定が、ビタミンB
12（B12）に関する競合結合検定法において必要とされ
る粒子の量を確かめるために行なわれた。次の検定法態
様が用いられた。標準の緩衝液100μｌとトレーサーの
緩衝液1000μｌが12×75mmポリプロピレン製チューブに
入れられた。混合物は、ヒト血清試料中の結合タンパク
の変性をなすために15分間沸騰した湯浴中へ入れられ
た。次にリン酸緩衝液中の種々の濃度の磁性粒子100μ
ｌが、０〜2000ピコグラム／ミリリットル（pg/ml）のB
12濃度の検定に最適な粒子濃度を決定するために加えら
れた。室温で１時間の培養の後、結合B12と遊離B12の磁
気分離が第VI−５節で述べた方法およびマグネチックラ
ックを用いて行なわれた。次に、ペレット中の放射能
が、トラカー 1290 ガンマ カウンター〔トラカ−
アナリテック インコーポレーテッド、エルク グロー
ブビレッチ、イリノイ州〕を用いて測定された。
この検定に用いられた試薬は次の通りである。B12標準
は、コーニング メディカル アンド サイエンティフ
ィック［Corning Medical and Scientific］〔ディビジ
ョン オブ コーニング グラス ワークス［Division
of Corning Glass Works］、メドフィールド，マサチ
ューセッツ州〕より得られた（♯474267）。これらは、
PBS中のB12をもたないヒト血清アルブミンおよび防腐剤
として加えられたアジ化ナトリウムと共に調製される。
トレーサーは、コーニングメディカル アンド サイエ
ンティフィック〔デイビジョン オブ コーニング グ
ラス ワークス、メドフィールド マサチューセッツ
州〕より得られた57Co−B12（放射性コバルトで標識さ
れたビタミンB12）（♯474287）であった。トレーサー
は0.001％シアン化カリウムおよびアジ化ナトリウムを
含むpH9.2のホウ酸塩緩衝液中にある。磁性粒子は０〜2
000pg/mlのB12濃度を測定するのに必要とされる粒子の
量を決定するために種々の濃度でPBS中に希釈された。
約50μg/チューブの磁性粒子の量が選択され、そして標
準曲線を作成するために上記のB12競合結合検定法にお
いて使用された。データは第６表に示される。
第 ６ 表 B12競合結合検定法標準曲線 B12濃度 cpm（２つのチューブの平均） 0pg/dl 5523 100pg/dl 5220 250pg/dl 4169 500pg/dl 3295 1000pg/dl 2778 2000pg/dl 1745 総 量 16515 VI−10. アミノエチル−３−アミノプロピルシランで被覆された
磁性粒子のタンパクへの結合 VI−10−1. Ｎ−２−アミノエチル−３アミノプロピルシラン化磁性
粒子のタンバクへの結合 第VI−２節のようにして調製されたＮ−２−アミノエチ
ル−３−アミノプロピルシラン化磁性粒子（粒子がN/Si
比２を有するという意味の「二窒素」のため「DIN」と
略される。）6/10gが、水中に再懸濁された。粒子は、
洗浄と洗浄の間に磁気分離を行なって、水中で１度およ
びその後 pH7.4の0.1M−リン酸緩衝液30mlで２度洗浄された。洗
浄粒子の0.1M−リン酸塩15ml中への懸濁の後に、0.1M−
リン酸塩で25％グルタルアルデヒド〔Ｇ−5882、シグマ
ケミカル コーポレーション、セントルイス，ミズー
リー州〕を希釈することで調製されたグルタルアルデヒ
ドの５％溶液15mlが加えられた。グルタルアルデヒド活
性化粒子は、次に0.1M−リン酸塩15ml中へ再懸濁され
た。
トリアイオドチロニン（T3）抗血清（1.6ml,T3−BSA共
役物でウサギを免疫することにより得られた。）が活性
化粒子へ加えられ、室温で16〜24時間ホイールミキサー
で攪拌した。T3抗体結合粒子は0.1M−リン酸塩30mlで１
度洗浄され、そして、未反応のアルデヒド基を反応する
ように0.2M−グリシン溶液15ml中に懸濁された。懸濁液
は、25分間振動により混合された。抗体結合粒子は0.1M
−リン酸塩30mlおよびエタノール30mlで洗浄され、そし
て0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS150mlで２
回洗浄された。これは、１％BSAを含むPBS中に再懸濁さ
れ、T3に関するRIAに使用されるまで４℃で保存され
た。
VI−10−2. Ｎ−２−アミノエチル−３−アミノプロピルシラン化磁
性粒子の甲状腺刺激ホルモンに対する抗体への結合 第VI−10−１節の結合方法が最小限変更された。DIN粒
子20gが、グルタルアルデヒド活性化の前にメタノール
1.5lで３度洗浄された。グルタルアルデヒド活性化は、
規模を調整して第VI−10−１節に述べられたようにして
行なわれた。
ヒト甲状腺刺激ホルモン（TSH）に対する抗体を含んで
いるヤギβ−クロブリン成分は、全ての抗血清よりも幾
分多くDIN粒子に結合した。分画は、PBSでの透析を伴な
って、40％硫酸アンモニウムを用いてβ−グロブリンを
沈澱させることにより行なわれた。約4gのタンパク（20
mg/mlで200ml）が結合していた。タンパクの完全な付着
は、結合の後の上澄液中に280nmでの光学濃度が不在で
あることにより確認された。これは、粒子１グラム当り
約タンパク20mgの付着を示した。粒子は次に、1M−NaCl
1.5lで２度およびPBSで３度洗浄され、そして50℃で一
晩培養された。次に、粒子はPBS/BSA中で３度以上洗浄
され、TSH検定法における使用に関して滴定された。
VI−11. トリアイドチロニンに関する磁性粒子放射標識免疫検定
法 T3PIAに用いられる粒子の量が次の検定法により決定さ
れた。標準は、T3を有しないヒト血清にT3をT4の場合の
ようにして加えることにより調製された（第7.5節参
照）。トレーサーはコーニング メデカル アンド サ
イエンティフィック〔ディビジョン オブ コーニング
ワークス，メドフィールド，マサチューセッツ州〕よ
り得られた125I−T3（♯47106）であった。磁性粒子
は、必要とされる粒子の量を決定するためにPBS−BSA中
へ種々の濃度に希釈された。この検定法態様は次の通り
であった。標準50 μｌ、トレーサー100μｌおよびDIN磁性粒子800μｌが1
2×75mmポリプロピレン製チューブ中へピペットを用い
て入れられた。渦動の後、チューブは室温で２時間培養
された。この検定法は磁気分離により終了された。Ong/
ml標準を用いて検定法における粒子の量を滴定すること
によって、30μl/チューブの量が、この検定法態様にお
いて最適であると思われた。第７表は、この量の粒子を
用いて得られたT3RIA標準曲線データを示すものであ
る。
第 ７ 表 T3に関するRIA標準曲線 T3濃度 cpm（２つのチューブの平均） 0.0ng/ml 17278 0.25ng/ml 15034 0.50ng/ml 13456 1.00ng/ml 12127 2.00ng/ml 8758 4.00ng/ml 5776 8.00ng/ml 3897 総 量 26946 VI−12. 甲状腺刺激ホルモンに関する磁性粒子放射標識免疫検定
法 TSH RIAに用いられる粒子量が以下の検定法により検定
された。標準は、正常ヒト血清中のもの〔コーニング
メデカル アンド サイエンティフィック製♯47186
（メドフィールド、マサチューセッツ州）〕であった。
トレーサーはPBS中の125I−ウサギ抗TSH〔コーニング
アンド サイエンティフィック製♯474185（メドフィー
ルド、マサチューセッツ州）〕であった。磁性粒子は、
必要とされる粒子の量を決定するためにPBS−BSA中へ種
々の濃度で希釈された。
この検定法態様は次の通りである。標準100μｌおよび
トレーサー100μｌが12×75mmポリプロピレン製チュー
ブ中へピペットにより入れられ、渦動され、そして室温
で３時間培養された。磁性粒子（500μｌ）が加えら
れ、混合物は渦動されそして室温で１時間培養された。
水500μｌが加えられ、そして結合トレーサーを非結合
トレーサーから分離するために通常の磁気分離が用いら
れた。TSHの存在において、磁性抗体（ヤギ抗TSH抗体、
VI−10−１参照）TSHとトレーサー125I抗体（ウサギ抗T
SH抗体）との間でサンドウィッチが形成される。これゆ
え、分析物（TSH）の増加する濃度は、結合放射能の量
を増加する。第８表は、この手法により得られたTSH RI
A標準曲線データを示すものである。
第 ８ 表 TSHに関するRIA標準曲線 TSH濃度 cpm 0μIU*/ml 1615 1.5μIU*/ml 2309 3.0μIU*/ml 3014 6.0μIU*/ml 4448 15.0μIU*/ml 7793 30.0μIU*/ml 11063 60.0μIU*/ml 15030 総 量 45168 * μIU＝マイクロ国際単位 以上述べたように、本発明は、その発明の範囲内におい
て、多くの変更および置換が可能である。なお、述べら
れた特定の実施態様は、例示のためのみ与えられたもの
であり、何ら本発明を限定するものでなく、本発明は特
許請求の範囲の記載によってのみ限定されるものであ
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明に用いられる磁性粒子の一実施例に係
る磁気粒子懸濁液の濁り度（％濃度）の磁場の存在また
は不存在における経時的変化を示すグラフであり、また
第２図は、３−アミノプロピルトリメトキシシランでシ
ラン化された超常磁性粒子の顕微鏡写真図を示すもので
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ア−ネスト・ビクタ−・グロマン アメリカ合衆国マサチユ−セツツ州ブルツ クリン・コロンビア・ストリ−ト80 (72)発明者 リ−・ジヨセフソン アメリカ合衆国マサチユ−セツツ州ア−リ ントン・マ−チン・ストリ−ト11 (72)発明者 ロイ・ア−サ−・ホワイトヘツド アメリカ合衆国マサチユ−セツツ州ヒンガ ム・メイン・ストリ−ト626 (56)参考文献 特開 昭58−61829（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）生親和性分子が共有結合し得る重合性
    シラン被膜によりほぼ覆われた超常磁性酸化鉄核を有す
    る生化学用磁気応答粒子であって、該酸化鉄核は２価お
    よび３価の酸化鉄結晶群を含んでおり、光分散により測
    定される該粒子の平均直径は0.1〜1.5μの範囲にあり、
    窒素ガス吸着により測定される該粒子の表面積は100〜1
    50m2/gの範囲にあり、また磁場の存在しない状態にお
    いて、その水性分散体の50％濁り度減少沈降時間が約1.
    5時間以上でかつ水性分散体の容積を入れた容器を容
    器中の水性分散体の容積よりも小さな容積を有する永久
    磁石の磁極面と接触させることにより水性分散体にかけ
    られるものである100〜1000エルステッドの磁場の存在
    する状態において、その水性分散体の95％濁り度減少分
    離時間が約10分以下である水性分散体を形成するように
    水性媒体中に分散可能である粒子質量を有しており、前
    記重合性シランはｐ−アミノフェニルトリメトキシシラ
    ン、ｎ−ドデシルトリエトキシシランおよびｎ−ヘキシ
    ルトリメトキシシランからなる群より選ばれたシラン単
    量体から形成されたものである磁気応答粒子を用意し、
    溶液、既知量の標識リゲートおよび溶液中のリゲートに
    特異性のリガンドが共有結合されている前記磁気応答粒
    子を、リガンド／リゲート複合体を形成するために反応
    させ、 ｂ）前記磁気応答粒子を反応溶液から磁気分離し、 ｃ）前記磁気応答粒子に結合した標識または溶液中の遊
    離標識を測定し、そして ｄ）ｃ）段階で測定された標識の量を、リゲート濃度を
    測定するために標準曲線に相関させる ことからなる溶液中のリゲートの濃度の測定方法。
  2. 【請求項２】リガンドが抗体である特許請求の範囲第１
    項に記載の測定方法。
  3. 【請求項３】抗体が、抗サイロキシン抗体、抗トリアイ
    オドチロニン抗体、抗甲状腺刺激ホルモン抗体、抗甲状
    腺結合グロブリン抗体、抗サイログロブリン抗体、抗ジ
    ゴキシン抗体、抗コルチゾール抗体、抗インスリン抗
    体、抗テロフィリン抗体、抗ビタミンB12抗体、抗葉酸
    塩抗体、抗体フェリチン抗体、抗ヒト絨毛性ゴナドトロ
    ピン抗体、抗卵胞刺激ホルモン抗体、抗黄体化ホルモン
    抗体、抗プロデステロン抗体、抗テストステロン抗体、
    抗エストリオール抗体、抗エストラジオール抗体、抗プ
    ロラクチン抗体、抗ヒト胎盤性ラクトゲン抗体、抗ガス
    トリン抗体および抗ヒト成長ホルモン抗体からなる群か
    ら選ばれる抗体である特許請求の範囲第２項に記載の測
    定方法。
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