JP2672151B2 - 磁性体を利用した酵素免疫測定法 - Google Patents
磁性体を利用した酵素免疫測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は主に臨床検査の分野で利用される他、食品検
査、医学や生命科学の基礎分野等において利用される抗
原−抗体反応を利用した分析法である酵素免疫測定法に
関するものである。
査、医学や生命科学の基礎分野等において利用される抗
原−抗体反応を利用した分析法である酵素免疫測定法に
関するものである。
［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］ 従来、未反応の試薬や反応物を反応液から分離する
（BF分離）操作を伴うヘテロジニアスな酵素免疫測定法
（EIA）においては、該分離をいかに正確に効率よく行
なうかが重要であり、分離を容易にするための固相とし
て種々の抗体や抗原を固定化したものが使用されてき
た。プラスチックチューブ、ポリスチレンビーズ、ガラ
スビーズ等はその代表的なものである。これらの担体は
BF分離には比較的好都合であるものの、反応の迅速性と
いう点では固相−液相間の反応であり結合等の反応が液
相同士の場合に比べ遅く不利である。反応速度を上げる
為には担体の微粒子化が好ましい。しかし微粒子担体を
用いた場合、通液時の圧力損失や該粒子からのBF分離操
作にろ過のような複雑な操作が必要となる。
（BF分離）操作を伴うヘテロジニアスな酵素免疫測定法
（EIA）においては、該分離をいかに正確に効率よく行
なうかが重要であり、分離を容易にするための固相とし
て種々の抗体や抗原を固定化したものが使用されてき
た。プラスチックチューブ、ポリスチレンビーズ、ガラ
スビーズ等はその代表的なものである。これらの担体は
BF分離には比較的好都合であるものの、反応の迅速性と
いう点では固相−液相間の反応であり結合等の反応が液
相同士の場合に比べ遅く不利である。反応速度を上げる
為には担体の微粒子化が好ましい。しかし微粒子担体を
用いた場合、通液時の圧力損失や該粒子からのBF分離操
作にろ過のような複雑な操作が必要となる。
一方、反応の迅速化をはかる試みとして担体に磁性体
を使用し磁力で担体を集めBF分離を行なう方法が従来か
ら行なわれてきたが、今日まで一般的に広く用いられる
には至っていない。この原因は従来から使われている担
体への酵素標識試薬の非特異的吸着が大きい為、一般的
に測定のブランクが高く十分な感度が得られなかったか
らである。
を使用し磁力で担体を集めBF分離を行なう方法が従来か
ら行なわれてきたが、今日まで一般的に広く用いられる
には至っていない。この原因は従来から使われている担
体への酵素標識試薬の非特異的吸着が大きい為、一般的
に測定のブランクが高く十分な感度が得られなかったか
らである。
本発明は上記従来技術の問題に鑑みなされたものであ
り、高感度で迅速簡便に行なうことのできる新規なEIA
を提供するものである。
り、高感度で迅速簡便に行なうことのできる新規なEIA
を提供するものである。
［課題を解決するための手段］ 本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行なっ
た結果、抗原や抗体を担体に固定化する固相法を改良す
ることにより簡単な操作でEIAの感度を高め、かつ迅速
化が可能であることを見い出し本発明に至った。
た結果、抗原や抗体を担体に固定化する固相法を改良す
ることにより簡単な操作でEIAの感度を高め、かつ迅速
化が可能であることを見い出し本発明に至った。
すなわち、本発明は、表面がアミノ基と化学的に結合
できる反応性官能基を有するポリマーで被覆された磁性
体粒子を固相担体として用いることを特徴とする酵素免
疫測定法であり、この方法によれば、ブランクが低く、
高感度の測定を迅速に行なうことが可能となる。これは
磁性体粒子を前記ポリマーが被覆しているため、特定の
抗原、抗体又はハプテンを高い濃度で固定化することに
より低アフィニティーのものも吸着することが可能とな
り、更に、担体材料が磁性体であり、磁力による担体の
分別等ができるため、複雑な操作をすることなく担体の
粒径を小さくし反応速度を増大させることが可能となる
ためである。
できる反応性官能基を有するポリマーで被覆された磁性
体粒子を固相担体として用いることを特徴とする酵素免
疫測定法であり、この方法によれば、ブランクが低く、
高感度の測定を迅速に行なうことが可能となる。これは
磁性体粒子を前記ポリマーが被覆しているため、特定の
抗原、抗体又はハプテンを高い濃度で固定化することに
より低アフィニティーのものも吸着することが可能とな
り、更に、担体材料が磁性体であり、磁力による担体の
分別等ができるため、複雑な操作をすることなく担体の
粒径を小さくし反応速度を増大させることが可能となる
ためである。
本発明においてポリマーとは磁性体粒子を被覆するこ
とのできる高分子化合物でありアミノ基と化学的に結合
できる反応性官能基、例えば、トシル基、カルボキシル
基、アミノ基、チオール基等を有するものであればよ
く、ポリマー材料中に上記官能基を有しうるもの、及び
ポリマー形成後に上記官能基をもつスペーサーを導入し
たものであってもよい。好ましい官能基としてはトシル
基を挙げることができ、該基は抗原や抗体又はハプテン
のアミノ基との反応性が良好で、又非特異的吸着も少な
い。又上記官能基は被覆後のポリマー表面に配置されて
いればよく、、ポリマー分子中少なくとも１個含有され
ていればよい。尚、磁性体粒子にポリマーを被覆させる
手段としては、例えばin−situ重合法等により行なうこ
とができる。
とのできる高分子化合物でありアミノ基と化学的に結合
できる反応性官能基、例えば、トシル基、カルボキシル
基、アミノ基、チオール基等を有するものであればよ
く、ポリマー材料中に上記官能基を有しうるもの、及び
ポリマー形成後に上記官能基をもつスペーサーを導入し
たものであってもよい。好ましい官能基としてはトシル
基を挙げることができ、該基は抗原や抗体又はハプテン
のアミノ基との反応性が良好で、又非特異的吸着も少な
い。又上記官能基は被覆後のポリマー表面に配置されて
いればよく、、ポリマー分子中少なくとも１個含有され
ていればよい。尚、磁性体粒子にポリマーを被覆させる
手段としては、例えばin−situ重合法等により行なうこ
とができる。
本発明において用いることのできる磁性体粒子として
は、四三酸化鉄、二酸化クロム等、一般に強磁性体とい
われるものであればいずれも用いることができる。
は、四三酸化鉄、二酸化クロム等、一般に強磁性体とい
われるものであればいずれも用いることができる。
又、磁性体粒子にポリマーが被覆されて成る担体の粘
度は粒径１〜10μｍの範囲になるようにするのが好まし
い。担体の粒径は大き過ぎれば反応中、即座に沈降し反
応時間の短縮上不都合であり、また小さ過ぎれば反応液
中に分散し、反応速度の上昇には貢献するもののBF分離
をする為に磁石で集める時に時間を要することになる。
度は粒径１〜10μｍの範囲になるようにするのが好まし
い。担体の粒径は大き過ぎれば反応中、即座に沈降し反
応時間の短縮上不都合であり、また小さ過ぎれば反応液
中に分散し、反応速度の上昇には貢献するもののBF分離
をする為に磁石で集める時に時間を要することになる。
又、担体に所望の抗原、抗体又はハプテンをポリマー
上に固定化させるには、１〜100μg/ml程度の濃度で調
製したそれぞれの溶液を用いて常法により反応させ吸着
させ後、反応容器外側に磁石を接触させ担体を集め反応
液上清を吸引等により除去し、PBS等で洗浄後定着させ
ることにより行なうことができる。
上に固定化させるには、１〜100μg/ml程度の濃度で調
製したそれぞれの溶液を用いて常法により反応させ吸着
させ後、反応容器外側に磁石を接触させ担体を集め反応
液上清を吸引等により除去し、PBS等で洗浄後定着させ
ることにより行なうことができる。
担体に固定化する抗原、抗体等は、検出を目的とする
抗体、抗原又はハプテン及び用いる測定原理により適宜
選定すればよい。
抗体、抗原又はハプテン及び用いる測定原理により適宜
選定すればよい。
次に、本発明において用いることのできる標識酵素と
しては、抗原、抗体、又はハプテンの活性が少量でも検
出することのできる高感度な酵素であればよく、例えば
西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ウシ粘膜アルカリホスファターゼ等いずれも用いる
ことができるが、呈色性の基質や発行性の基質を用いる
場合は西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ、又蛍光性基質
を用いる場合はβ−ガラクトシダーゼが好ましい。
しては、抗原、抗体、又はハプテンの活性が少量でも検
出することのできる高感度な酵素であればよく、例えば
西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ウシ粘膜アルカリホスファターゼ等いずれも用いる
ことができるが、呈色性の基質や発行性の基質を用いる
場合は西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ、又蛍光性基質
を用いる場合はβ−ガラクトシダーゼが好ましい。
標識すべき抗原、抗体又はハプテンは、固定化固相担
体の種類、測定原理、及び検出を目的とする抗原、抗体
又はハプテンとの特異性等により適宜選定すればよい。
酵素標識抗体や標識抗原又はハプテンの調製は公知の技
術、例えば石川らのヒンジ法（E.Ishikawa et al,J.Imm
unoassay,４,209−327,1983），加藤らの方法（K.Kato
et al FEBS Lett.,56,370−372,1975）等で実施するこ
とが出来、種々のタンパク質架橋剤を用いて行ないえる
が、それらのなかでもヘテロバイファンクショナルな二
価性結合試薬を用いたチオール基とアミノ基との選択的
な結合を利用した標識法が好ましい。
体の種類、測定原理、及び検出を目的とする抗原、抗体
又はハプテンとの特異性等により適宜選定すればよい。
酵素標識抗体や標識抗原又はハプテンの調製は公知の技
術、例えば石川らのヒンジ法（E.Ishikawa et al,J.Imm
unoassay,４,209−327,1983），加藤らの方法（K.Kato
et al FEBS Lett.,56,370−372,1975）等で実施するこ
とが出来、種々のタンパク質架橋剤を用いて行ないえる
が、それらのなかでもヘテロバイファンクショナルな二
価性結合試薬を用いたチオール基とアミノ基との選択的
な結合を利用した標識法が好ましい。
本発明の酵素免疫測定法は、測定原理として公知の方
式、例えばサンドイッチ法、競合法等に基づき行なうこ
とができるが、本発明に係る固相担体による効果をより
発揮させるために好ましい測定原理としてはサッドイッ
チ法、及び競合法である。
式、例えばサンドイッチ法、競合法等に基づき行なうこ
とができるが、本発明に係る固相担体による効果をより
発揮させるために好ましい測定原理としてはサッドイッ
チ法、及び競合法である。
サンドイッチ法で行なう場合は、定量する目的の抗
原、ハプテンに特異的な抗体に酵素標識するが、抗体と
してはモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のど
ちらでもよい。ただしポリクローナル抗体を用いる場合
には固相にはモノクローナル抗体を固定化しておくとよ
い。又モノクローナル抗体を標識した場合はポリクロー
ナル抗体を固定化した固相を用いることもできるが、BF
分離の効率から、又非特異的吸着を低減させるために
も、固相固定化モノクローナル抗体と酵素標識モノクロ
ーナル抗体又は酵素標識ポリクローナル抗体を組み合わ
せが好ましい。又好ましい標識抗体としては、ペプシン
分解によって得られるFab′フラクションの還元型のも
のを挙げることができる。
原、ハプテンに特異的な抗体に酵素標識するが、抗体と
してはモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のど
ちらでもよい。ただしポリクローナル抗体を用いる場合
には固相にはモノクローナル抗体を固定化しておくとよ
い。又モノクローナル抗体を標識した場合はポリクロー
ナル抗体を固定化した固相を用いることもできるが、BF
分離の効率から、又非特異的吸着を低減させるために
も、固相固定化モノクローナル抗体と酵素標識モノクロ
ーナル抗体又は酵素標識ポリクローナル抗体を組み合わ
せが好ましい。又好ましい標識抗体としては、ペプシン
分解によって得られるFab′フラクションの還元型のも
のを挙げることができる。
競合法で行なう場合は、定量する目的の抗原、ハプテ
ンに特異的な抗体とアフィニティーを示す抗原に酵素標
識するが、抗原の抗原性が低下しないように反応基を有
するスペーサーを導入した抗原を用いるとよい。
ンに特異的な抗体とアフィニティーを示す抗原に酵素標
識するが、抗原の抗原性が低下しないように反応基を有
するスペーサーを導入した抗原を用いるとよい。
抗原又は抗体を固定化した固相担体はガラスチューブ
等に収容し定量をしようとする目的の抗原、抗体又はハ
プテンを含有する標準溶液及び酵素標識した抗原、抗体
又はハプテンを加え一定時間経過後、磁力を作用させ固
相担体を１ヶ所に集め、反応液を吸引除去後、PBS等で
洗浄し、次に基質を加えさらに一定時間経過後停止液を
加え、反応を停止させる。停止後再び固相担体を集め溶
液を分別し得られた溶液を又は、ガラスチューブのまま
自動分光光度計等により吸光度を測定すれば、目的物質
の定量をすることができる。基質は公知のものでよく、
測定波長は用いる基質により選定すればよく、蛍光強度
により測定してもよい。加える標準溶液は測定対象物に
より要求される測定濃度が異なるが、一般的には0.1〜1
000ng/ml程度のものでよい。又酵素標識された物質を含
有する溶液の濃度は適当な吸光度や感度が得られる様に
希釈調整して用いれば良い。ガラスチューブ等に収容す
る固相担体の量としては10〜500μｇ程度でよい。
等に収容し定量をしようとする目的の抗原、抗体又はハ
プテンを含有する標準溶液及び酵素標識した抗原、抗体
又はハプテンを加え一定時間経過後、磁力を作用させ固
相担体を１ヶ所に集め、反応液を吸引除去後、PBS等で
洗浄し、次に基質を加えさらに一定時間経過後停止液を
加え、反応を停止させる。停止後再び固相担体を集め溶
液を分別し得られた溶液を又は、ガラスチューブのまま
自動分光光度計等により吸光度を測定すれば、目的物質
の定量をすることができる。基質は公知のものでよく、
測定波長は用いる基質により選定すればよく、蛍光強度
により測定してもよい。加える標準溶液は測定対象物に
より要求される測定濃度が異なるが、一般的には0.1〜1
000ng/ml程度のものでよい。又酵素標識された物質を含
有する溶液の濃度は適当な吸光度や感度が得られる様に
希釈調整して用いれば良い。ガラスチューブ等に収容す
る固相担体の量としては10〜500μｇ程度でよい。
上記の構成によれば固相担体の粒度を小さく効率よく
反応を行なうことができ、さらにろ過等の操作は不要
で、又ポリマーが磁性粒子に被覆されているために感度
を良好とすることができ、このため、標準溶液と固相担
体との反応時間、及び基質と酵素との反応時間を著しく
減少させることができるのである。
反応を行なうことができ、さらにろ過等の操作は不要
で、又ポリマーが磁性粒子に被覆されているために感度
を良好とすることができ、このため、標準溶液と固相担
体との反応時間、及び基質と酵素との反応時間を著しく
減少させることができるのである。
［実施例］ 以下実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれらの実施例によってなんら制限されるもの
ではない。
本発明はこれらの実施例によってなんら制限されるもの
ではない。
実施例1.癌胎児性抗原（CEA）のEIA （１）抗GEA抗体固定化磁性担体の調製 四三酸化鉄をポリマーコーティングした。表面にアミ
ノ基と反応性をもつトシル基を有する磁性担体（平均粒
径2.65μｍ）1gを、抗CEAモノクローナル抗体（マウ
ス）1mgを溶解した0.2Mほう酸緩衝液50mlに加え、室温
で24時間反応容器中で撹拌しながら反応させた。この後
反応容器外側にフェライト磁石を接触させ、担体を１ヶ
所に集め反応液上清を吸引除去した。除去後0.1MPBS（p
H7.2）50mlで同様な操作により担体を洗浄した後、50ml
の1Mエタノールアミンを加え室温で２時間撹拌し反応さ
せた。前回同様反応液を除き、PBSを用い洗浄した後、
１％牛血清アルブミンを含む0.1MPBSpH7.2に浸し使用時
まで保存した。
ノ基と反応性をもつトシル基を有する磁性担体（平均粒
径2.65μｍ）1gを、抗CEAモノクローナル抗体（マウ
ス）1mgを溶解した0.2Mほう酸緩衝液50mlに加え、室温
で24時間反応容器中で撹拌しながら反応させた。この後
反応容器外側にフェライト磁石を接触させ、担体を１ヶ
所に集め反応液上清を吸引除去した。除去後0.1MPBS（p
H7.2）50mlで同様な操作により担体を洗浄した後、50ml
の1Mエタノールアミンを加え室温で２時間撹拌し反応さ
せた。前回同様反応液を除き、PBSを用い洗浄した後、
１％牛血清アルブミンを含む0.1MPBSpH7.2に浸し使用時
まで保存した。
（２）ペルオキシダーゼ標識抗CEA抗体の調製 西洋ワサビペルオキシダーゼによる抗CEA家兎抗体標
識は石川らのヒンジ法（E.Ishikawa et al,J.Immunoass
ay,４,209−327,1983）に従って行なった。すなわち抗
体IgGフラクションをペプシン消化し、続いて還元して
チオール基の遊離したFab′フラクションを得た。このF
ab′フラクションと、Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ートを用いてマレイミド基を導入した西洋ワサビペルオ
キシダーゼとを反応させて酵素標識抗体を得た。
識は石川らのヒンジ法（E.Ishikawa et al,J.Immunoass
ay,４,209−327,1983）に従って行なった。すなわち抗
体IgGフラクションをペプシン消化し、続いて還元して
チオール基の遊離したFab′フラクションを得た。このF
ab′フラクションと、Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ートを用いてマレイミド基を導入した西洋ワサビペルオ
キシダーゼとを反応させて酵素標識抗体を得た。
（３）CEAのEIA（サンドイッチ法） 上記で得られている抗体固定化磁性担体（1mg/50μ
ｌ）を内径10mmのガラスチューブに加え、更に表１に示
す濃度の標準CEA（50μｌ）及び上記で得られている酵
素標識抗体を適当に希釈したもの50μｌをそれぞれ加え
て、37℃,10分間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、フェライト磁石をチューブの外側に接触させ担
体を１ヵ所に集め、反応液を吸引除去した。更に1mlの
上記と同様のPBSを用い同様な操作で担体を３回洗浄し
た後、基質として10mMH2O2及び0.1％オルトフェニレン
ジアミンを含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.5）0.25mlを
加え、37℃,5分間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、1mlの0.1MH2SO4を加え反応を停止させた後、49
2nmにおける吸光度を測定し、検量線を作成した。結果
を表１に示す。
ｌ）を内径10mmのガラスチューブに加え、更に表１に示
す濃度の標準CEA（50μｌ）及び上記で得られている酵
素標識抗体を適当に希釈したもの50μｌをそれぞれ加え
て、37℃,10分間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、フェライト磁石をチューブの外側に接触させ担
体を１ヵ所に集め、反応液を吸引除去した。更に1mlの
上記と同様のPBSを用い同様な操作で担体を３回洗浄し
た後、基質として10mMH2O2及び0.1％オルトフェニレン
ジアミンを含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.5）0.25mlを
加え、37℃,5分間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、1mlの0.1MH2SO4を加え反応を停止させた後、49
2nmにおける吸光度を測定し、検量線を作成した。結果
を表１に示す。
表１の結果に示すように迅速簡便な操作にもかかわら
ず、CEAが1ng/mlまで精度良く測定可能であった。これ
は従来報告されてきたCEAの高感度RIAやEIAに優るとも
劣らないものである。
ず、CEAが1ng/mlまで精度良く測定可能であった。これ
は従来報告されてきたCEAの高感度RIAやEIAに優るとも
劣らないものである。
実施例2.α−フェトプロティン（AFP）のEIA （１）抗AFP抗体固定化磁性担体の調製 抗AFPマウスモノクローナル抗体の磁性担体への固定
化は、実施例１に記載の方法と同様に行なった。
化は、実施例１に記載の方法と同様に行なった。
（２）β−ガラクトシダーゼ標識抗AFP抗体の調製 抗AFP抗体とβ−ガラクトシダーゼとの結合は加藤ら
の方法（K.Kato et al,FEBS Lett.,56,370−372,1975）
に従った。すなわち抗体の還元型Fab′フラクションを
調製し、二価性結合試薬N,N′−ｏ−オルトフェニレン
ジマレイミドを用いて大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ
と結合させ酵素標識抗体を得た。
の方法（K.Kato et al,FEBS Lett.,56,370−372,1975）
に従った。すなわち抗体の還元型Fab′フラクションを
調製し、二価性結合試薬N,N′−ｏ−オルトフェニレン
ジマレイミドを用いて大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ
と結合させ酵素標識抗体を得た。
（３）AFPのEIA（サンドイッチ法） 上記抗体固定化担体（1mg/ml）50μl,表２に示す濃度
の標準AFP溶液50μｌ及び適当に希釈調整した酵素標識
抗体液50μｌを実施例１と同様チューブに加え、37℃,1
0分間インキュベーションした。インキュベーション終
了後、フェライト磁石を用い実施例１と同様に反応液の
吸引除去及び洗浄を行なった。基質として0.2mMの４−
メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを含む
0.05Mリン酸緩衝液,pH7.8を0.3ml加え、37℃,1分間イン
キュベートした。インキュベーション後、1mlのグリシ
ン−NaOH緩衝液,pH10.3を加え反応を停止させ、蛍光光
度計にて蛍光強度を測定した。結果を表２に示す。
の標準AFP溶液50μｌ及び適当に希釈調整した酵素標識
抗体液50μｌを実施例１と同様チューブに加え、37℃,1
0分間インキュベーションした。インキュベーション終
了後、フェライト磁石を用い実施例１と同様に反応液の
吸引除去及び洗浄を行なった。基質として0.2mMの４−
メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを含む
0.05Mリン酸緩衝液,pH7.8を0.3ml加え、37℃,1分間イン
キュベートした。インキュベーション後、1mlのグリシ
ン−NaOH緩衝液,pH10.3を加え反応を停止させ、蛍光光
度計にて蛍光強度を測定した。結果を表２に示す。
表２の結果に示す様に、本発明による方法でAFPの短
時間、簡便、高感度測定が可能となった。
時間、簡便、高感度測定が可能となった。
実施例3.3,3′,5−Ｌ−トリヨウドサイロニン（T3）のE
IA （１）抗T3抗体固定化担体の調製 磁性担体150mgを、抗T3抗体0.6mgを溶解した0.2Mホウ
酸緩衝液（pH9.0）10mlに加え、室温で24時間反応させ
た。この後、実施例１と同様に洗浄、エタノールアミン
処理などを行ない抗体固定化担体を調製した。
IA （１）抗T3抗体固定化担体の調製 磁性担体150mgを、抗T3抗体0.6mgを溶解した0.2Mホウ
酸緩衝液（pH9.0）10mlに加え、室温で24時間反応させ
た。この後、実施例１と同様に洗浄、エタノールアミン
処理などを行ない抗体固定化担体を調製した。
（２）ペルオキシダーゼ標識T3の調製 ペルオキシダーゼ（1mg）を2mlの0.1MPBS（pH7.2）に
溶解し、これにジメチルホルムアミドに溶解した0.3mg
のT3を加え、さらに0.5％グルタルアルデヒド溶液、0.0
5mlを加え室温で2.5時間反応させた。反応後、反応液を
セファデックスＧ−25カラムに通し、0.1M燐酸緩衝液
（pH6.5）を用いて溶出し、ペルオキシダーゼ標識T3の
原液を得た。この原液を、0.08％２−アニリノナフタレ
ン−６−スルホン酸、１％牛血清アルブミンを含む0.1M
バルビタール緩衝液（pH8.6）を用いて好ましい検量線
が得られる濃度に希釈し、測定にした。
溶解し、これにジメチルホルムアミドに溶解した0.3mg
のT3を加え、さらに0.5％グルタルアルデヒド溶液、0.0
5mlを加え室温で2.5時間反応させた。反応後、反応液を
セファデックスＧ−25カラムに通し、0.1M燐酸緩衝液
（pH6.5）を用いて溶出し、ペルオキシダーゼ標識T3の
原液を得た。この原液を、0.08％２−アニリノナフタレ
ン−６−スルホン酸、１％牛血清アルブミンを含む0.1M
バルビタール緩衝液（pH8.6）を用いて好ましい検量線
が得られる濃度に希釈し、測定にした。
（３）T3のEIA（競合法） 上記で得られた抗体固定化磁性担体（0.5mg/ml）100
μｌ、１％牛血清アルブミンを含有する0.1MPBSに溶解
した標準T3溶液100μｌおよびペルオキシダーゼ標識T3,
500μｌをチューブに加え、37℃,10分間インキュベート
した。インキュベーション後、実施例１と同様に反応液
の吸引除去及び洗浄を行った。さらに実施例１と同様酵
素反応を行い、検量検を得た。結果を表３に示す。
μｌ、１％牛血清アルブミンを含有する0.1MPBSに溶解
した標準T3溶液100μｌおよびペルオキシダーゼ標識T3,
500μｌをチューブに加え、37℃,10分間インキュベート
した。インキュベーション後、実施例１と同様に反応液
の吸引除去及び洗浄を行った。さらに実施例１と同様酵
素反応を行い、検量検を得た。結果を表３に示す。
表３の結果に示す様に、短時間、簡便に高い感度及び
精度でT3の測定ができた。
精度でT3の測定ができた。
［発明の効果］ 以上説明したように、酵素免疫測定法において表面が
ポリマー被覆された磁性体粒子、特に表面に活性トシル
基を有するポリマーで被覆された磁性担体を使用し、抗
体や抗原又はハプテンのアミノ基を介して結合させて得
たものを固相担体として用いることにより、ブランクを
低くし、高感度な測定を簡便迅速に行なうことが可能と
なる。
ポリマー被覆された磁性体粒子、特に表面に活性トシル
基を有するポリマーで被覆された磁性担体を使用し、抗
体や抗原又はハプテンのアミノ基を介して結合させて得
たものを固相担体として用いることにより、ブランクを
低くし、高感度な測定を簡便迅速に行なうことが可能と
なる。
Claims (2)
- 【請求項１】表面がトシル基を有するポリマーで被覆さ
れた磁性体粒子を固相担体として使用することを特徴と
する酵素免疫測定法。 - 【請求項２】トシル基を介して抗体、抗原又はハプテン
が固定化されている請求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1180390A JP2672151B2 (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | 磁性体を利用した酵素免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1180390A JP2672151B2 (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | 磁性体を利用した酵素免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0346565A JPH0346565A (ja) | 1991-02-27 |
| JP2672151B2 true JP2672151B2 (ja) | 1997-11-05 |
Family
ID=16082399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1180390A Expired - Fee Related JP2672151B2 (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | 磁性体を利用した酵素免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2672151B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19621133A1 (de) * | 1996-05-24 | 1997-11-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Bestimmungsverfahren mit oligomerisierten Rezeptoren |
| JP2007003411A (ja) * | 2005-06-24 | 2007-01-11 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法及びヘモグロビンＡ１ｃ測定用キット |
| JP2011003386A (ja) | 2009-06-18 | 2011-01-06 | Makita Corp | 電気コードのコネクタ |
| JP6289705B1 (ja) | 2017-03-31 | 2018-03-07 | Jsr株式会社 | プローブ結合担体の製造方法、プローブ結合担体および標的物質を検出または分離する方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU527144B2 (en) * | 1978-02-13 | 1983-02-17 | Technicon Instruments Corportion | Magnetically attractable material |
| US4554088A (en) * | 1983-05-12 | 1985-11-19 | Advanced Magnetics Inc. | Magnetic particles for use in separations |
-
1989
- 1989-07-14 JP JP1180390A patent/JP2672151B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0346565A (ja) | 1991-02-27 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |