JP2642342B2 - 固相拡散試験法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 関連出願とのクロスレファレンス 本出願は1985年８月20日に出願された米国出願第761,
961号の一部継続出願であって、更にその出願は1984年1
2月20日に出願された米国出願第684,059号の一部継続出
願である。
961号の一部継続出願であって、更にその出願は1984年1
2月20日に出願された米国出願第684,059号の一部継続出
願である。
技術分野 本発明は、溶液中における微量物質の定量及び定性試
験法に関し、更に詳しくは、新規な固相拡散試験法によ
溶液中の物質の迅速簡易な定性及び定量に関する。新規
な試験法は、タンパク質、ホルモン、薬物、ポリペプチ
ド、ビタミン、グリコシドその他の濃度を迅速かつ定量
的に分析するために利用することができる。本発明は更
に、このような定量分析を実施するためのキット、並び
に、このようなキットの及び新規な試験法において使用
するための一定の新規成分に関する。
験法に関し、更に詳しくは、新規な固相拡散試験法によ
溶液中の物質の迅速簡易な定性及び定量に関する。新規
な試験法は、タンパク質、ホルモン、薬物、ポリペプチ
ド、ビタミン、グリコシドその他の濃度を迅速かつ定量
的に分析するために利用することができる。本発明は更
に、このような定量分析を実施するためのキット、並び
に、このようなキットの及び新規な試験法において使用
するための一定の新規成分に関する。
発明の背景 １×10-6g以下の濃度で溶液中に存在する物質の検出
方法を安価でかつ簡易なものにするための必要性が存続
している。溶液中のこれら濃度の物質を正確に検出する
ことができる従来技術の方法は、厄介で高価であり、し
かも実施に長時間を要する。更に、高価で複雑な装置が
これら従来技術の方法を実施するために必要とされる。
方法を安価でかつ簡易なものにするための必要性が存続
している。溶液中のこれら濃度の物質を正確に検出する
ことができる従来技術の方法は、厄介で高価であり、し
かも実施に長時間を要する。更に、高価で複雑な装置が
これら従来技術の方法を実施するために必要とされる。
血清及び他の生物学的に重要な媒体中の可溶性物質の
存在を検出するためには、多くの従来技術試験方法があ
る。生物学的活性をもつ物質の場合は、単に生物学的液
体中の活性を測定するだけで、物質の存在を検出するこ
とができる。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェート
のような酸性ホスファターゼ酵素物質を加え、溶液をし
ばらくインキュベートすることにより、血清中の酸性ホ
スファターゼ酵素の存在を分析することができる。酵素
が血清中に存在する場合は、基質が酵素によりホスフェ
ートとｐ−ニトロフェノールに加水分解されるにつれ
て、溶液は黄色に変色する。しかしながら、このタイプ
の分析に関連して多数の問題が存在する。例えば、被検
物質は、測定可能な生物学的活性を有していなければな
らない。多くの場合、生物学的活性の測定は厄介でかつ
時間の浪費に結がる可能性がある。更に、酵素活性は阻
害剤の存在によって阻害されるおそれがある。そのよう
な阻害剤が存在する場合は、誤って低活性として測定し
てしまうことがある。しかも、酵素は液体中に存在して
いたとしても、不活性であるかもしれない。
存在を検出するためには、多くの従来技術試験方法があ
る。生物学的活性をもつ物質の場合は、単に生物学的液
体中の活性を測定するだけで、物質の存在を検出するこ
とができる。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェート
のような酸性ホスファターゼ酵素物質を加え、溶液をし
ばらくインキュベートすることにより、血清中の酸性ホ
スファターゼ酵素の存在を分析することができる。酵素
が血清中に存在する場合は、基質が酵素によりホスフェ
ートとｐ−ニトロフェノールに加水分解されるにつれ
て、溶液は黄色に変色する。しかしながら、このタイプ
の分析に関連して多数の問題が存在する。例えば、被検
物質は、測定可能な生物学的活性を有していなければな
らない。多くの場合、生物学的活性の測定は厄介でかつ
時間の浪費に結がる可能性がある。更に、酵素活性は阻
害剤の存在によって阻害されるおそれがある。そのよう
な阻害剤が存在する場合は、誤って低活性として測定し
てしまうことがある。しかも、酵素は液体中に存在して
いたとしても、不活性であるかもしれない。
生物学的液体中の微量物質の存在を測定するためのも
う１つの方法は、クロマトグラフィーとして知られる方
法である。多数の様々なタイプのクロマトグラフィーが
ある。薄層クロマトグラフィーは、質量分光分析又は気
相クロマトグラフィーと組合わされ、生物学的液体中の
特定物質を単離しかつ定量するために利用されてきた。
しかしながら、薄層クロマトグラフィーは、時間がかか
り、広汎な妨害物質の影響をうけ、しかも信頼性の面で
著しい変動をうける等のいくつかの欠点を有する。
う１つの方法は、クロマトグラフィーとして知られる方
法である。多数の様々なタイプのクロマトグラフィーが
ある。薄層クロマトグラフィーは、質量分光分析又は気
相クロマトグラフィーと組合わされ、生物学的液体中の
特定物質を単離しかつ定量するために利用されてきた。
しかしながら、薄層クロマトグラフィーは、時間がかか
り、広汎な妨害物質の影響をうけ、しかも信頼性の面で
著しい変動をうける等のいくつかの欠点を有する。
液体クロマトグラフィーは、生物学的液体から物質を
単離するためのもう１つの方法である。この方法におい
ては、大きさ又は電荷のような特定分子の特性を利用し
ている。しかしながら、特定物質が単離された後、それ
を分析するための方法を更に利用しなければならない。
これは、生物学的活性、吸光特性、質量分光性を測定す
るか、又は更に分離分析によって実施することができ
る。
単離するためのもう１つの方法である。この方法におい
ては、大きさ又は電荷のような特定分子の特性を利用し
ている。しかしながら、特定物質が単離された後、それ
を分析するための方法を更に利用しなければならない。
これは、生物学的活性、吸光特性、質量分光性を測定す
るか、又は更に分離分析によって実施することができ
る。
分子電荷及び大きさを利用するもう１つの方法はゲル
電気泳動である。この方法では、生物学的試料は多孔質
ゲル上に置かれる。試料及びゲルには次いで、試料をゲ
ル内で移動させるために、電場がかけられる。移動速度
は分子の電荷及び大きさに依存する。このようにして様
々な分子を分離し、単離することができる。
電気泳動である。この方法では、生物学的試料は多孔質
ゲル上に置かれる。試料及びゲルには次いで、試料をゲ
ル内で移動させるために、電場がかけられる。移動速度
は分子の電荷及び大きさに依存する。このようにして様
々な分子を分離し、単離することができる。
物質同定に関し、クロマトグラフィー法及び電気泳動
法には多数の問題がある。問題の１つは、物質の単離
後、それを同定しなければならないことである。単離物
質を同定するためには、更に、生物学的活性の測定のよ
うな操作、質量分光分析又は免疫学的方法のような他の
方法による同定を実施しなければならない。電気泳動又
はクロマトグラフィー操作は時間がかかり、数時間〜数
日を要する。更に、これらの操作に使用される装置は高
価であって、分析を実施するためには熟練した技術者を
必要とする。
法には多数の問題がある。問題の１つは、物質の単離
後、それを同定しなければならないことである。単離物
質を同定するためには、更に、生物学的活性の測定のよ
うな操作、質量分光分析又は免疫学的方法のような他の
方法による同定を実施しなければならない。電気泳動又
はクロマトグラフィー操作は時間がかかり、数時間〜数
日を要する。更に、これらの操作に使用される装置は高
価であって、分析を実施するためには熟練した技術者を
必要とする。
溶液中の微量の特定物質を同定するためのもう１つの
方法は、免疫学的技術を利用したものである。すべての
免疫学的操作では、抗原、及び抗原に対し特異的な抗体
を使用する。従来技術の免疫学的方法としては免疫沈降
法があるが、そこでは特異的抗体は抗原と結合する。生
成する複合体は、溶液中で沈降して可視的沈降を形成す
る。
方法は、免疫学的技術を利用したものである。すべての
免疫学的操作では、抗原、及び抗原に対し特異的な抗体
を使用する。従来技術の免疫学的方法としては免疫沈降
法があるが、そこでは特異的抗体は抗原と結合する。生
成する複合体は、溶液中で沈降して可視的沈降を形成す
る。
凝集反応は、低濃度の特定物質を検出するためのもう
１つの従来技術方法である。凝集反応においては、赤血
球又は細菌のような物質は、物質表面上の抗原に対し特
異的な抗体と反応する。抗体が表面抗原と反応するた
め、細胞は凝集して可視的高密度凝集物を形成する。
１つの従来技術方法である。凝集反応においては、赤血
球又は細菌のような物質は、物質表面上の抗原に対し特
異的な抗体と反応する。抗体が表面抗原と反応するた
め、細胞は凝集して可視的高密度凝集物を形成する。
免疫沈降法及び免疫凝集法は一般的に低感度である。
更に、それらの方法では、抗体が抗原と架橋結合して沈
降又は凝集を起こすように、多数の抗体結合部位をもつ
抗原を必要とする。免疫沈降プロセスでは操作終了まで
に数時間〜数日を要するため、特定物質の同定又は定量
は迅速に行なわれなければならないという多くの状況か
ら判断すると、操作を非実用的なものにしてしまう。
更に、それらの方法では、抗体が抗原と架橋結合して沈
降又は凝集を起こすように、多数の抗体結合部位をもつ
抗原を必要とする。免疫沈降プロセスでは操作終了まで
に数時間〜数日を要するため、特定物質の同定又は定量
は迅速に行なわれなければならないという多くの状況か
ら判断すると、操作を非実用的なものにしてしまう。
上記方法における精度不足という問題は放射線免疫検
定法として知られる方法によって克服された。この方法
では、被検抗原は放射性元素で“標識”され、放射性類
似体を形成する。放射線免疫検定法において通常使用さ
れる放射性同位元素は表Ｉに示されている。
定法として知られる方法によって克服された。この方法
では、被検抗原は放射性元素で“標識”され、放射性類
似体を形成する。放射線免疫検定法において通常使用さ
れる放射性同位元素は表Ｉに示されている。
抗体を被検ハプテン又は抗原の溶液及び放射性抗原類
似体と混合させると、放射性類似体は、溶液中のハプテ
ン又は抗原の濃度にある程度直接的に比例して、抗体と
の結合が妨げられる。次いで、抗体結合放射性類似体か
ら放射性類似体を分離しかつ分析することによって、原
溶液中のハプテン又は抗原の量を間接的に調べることが
できる。
似体と混合させると、放射性類似体は、溶液中のハプテ
ン又は抗原の濃度にある程度直接的に比例して、抗体と
の結合が妨げられる。次いで、抗体結合放射性類似体か
ら放射性類似体を分離しかつ分析することによって、原
溶液中のハプテン又は抗原の量を間接的に調べることが
できる。
しかしながら、このような分析における放射性同位体
の使用には健康に対する危険性が潜在しており、更には
放射線免疫検定法に必要な装置は比較的複雑でかつ高価
である。放射線免疫検定法に伴うもう１つの問題は抗原
または抗体の標識である。最も一般的に使用される同位
体は短い半減期を有したものである。これらにはヨウ素
−131及びヨウ素−125がある。これらの同位体は半減期
が非常に短いため（それぞれ、8.1日及び60日）、分析
標識成分は周期的に新しい生成物で交換されていなけれ
ばならない。更に、標準曲線は、同位体の比活性が絶え
ず減少していくことから、各々の未知試料毎に準備され
ていなければならない。特定の標識成分に係わるもう１
つの問題は自然分解である。成分を標識するために通常
使用される同位体は比較的強い放射線放出物であって、
それらが結合した化合物を分解させることがある。最後
に、放射性廃棄物処理に関する政府取締り規制が次第に
強化されていくのに伴い、放射線免疫検定法に使用され
た放射性同位体の処理は次第に困難かつ高価な問題とな
ってきた。
の使用には健康に対する危険性が潜在しており、更には
放射線免疫検定法に必要な装置は比較的複雑でかつ高価
である。放射線免疫検定法に伴うもう１つの問題は抗原
または抗体の標識である。最も一般的に使用される同位
体は短い半減期を有したものである。これらにはヨウ素
−131及びヨウ素−125がある。これらの同位体は半減期
が非常に短いため（それぞれ、8.1日及び60日）、分析
標識成分は周期的に新しい生成物で交換されていなけれ
ばならない。更に、標準曲線は、同位体の比活性が絶え
ず減少していくことから、各々の未知試料毎に準備され
ていなければならない。特定の標識成分に係わるもう１
つの問題は自然分解である。成分を標識するために通常
使用される同位体は比較的強い放射線放出物であって、
それらが結合した化合物を分解させることがある。最後
に、放射性廃棄物処理に関する政府取締り規制が次第に
強化されていくのに伴い、放射線免疫検定法に使用され
た放射性同位体の処理は次第に困難かつ高価な問題とな
ってきた。
酵素免疫測定法は上記問題を克服し、更に測定活性を
潜在的に増幅させるという独特な利点を有している。
〔酵素免疫測定法の分野は、デベロップメンツ・イン・
イムノロジー，第18巻、免疫酵素学的技術，エルシビア
ー・サイエンス・パブリッシャーズ,1983年（Developme
nts in Immunology,Vol 18,Immunoenzymatic Technique
s,Elsevier Science Publishers,1983）において一般的
に概説されている。〕この方法では、放射性生物学的物
質類似体の代わりに酵素標識生物学的物質（ハプテン又
は抗原）を使用する。酵素免疫測定法において標識とし
て使用可能な典型的酵素は、表IIに掲載されている。
潜在的に増幅させるという独特な利点を有している。
〔酵素免疫測定法の分野は、デベロップメンツ・イン・
イムノロジー，第18巻、免疫酵素学的技術，エルシビア
ー・サイエンス・パブリッシャーズ,1983年（Developme
nts in Immunology,Vol 18,Immunoenzymatic Technique
s,Elsevier Science Publishers,1983）において一般的
に概説されている。〕この方法では、放射性生物学的物
質類似体の代わりに酵素標識生物学的物質（ハプテン又
は抗原）を使用する。酵素免疫測定法において標識とし
て使用可能な典型的酵素は、表IIに掲載されている。
表 II酵素免疫測定法において通常使用される酵素 アルカリホスファターゼ類 グルコースオキシダーゼ類 ウエアーゼ類 ペルオキシダーゼ類 β−ガラクトシダーゼ類 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ類 リゾチーム類 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ類 このような修正酵素分子は自らの酵素活性を保持して
おり、酵素標識生物学的物質は、抗体複合体の形成の面
で、系中の未知量の遊離生物学的物質と競合する。複合
体は特定物質の不溶性を利用して分離されてもよい。分
離された複合体の活性又は溶液中に残存する一部の活性
は、最初に存在した抗原量の測定のために利用される。
同様の原理は、生物学的液体中に存在する同一の抗体の
未修正変換体が測定されなければならないいずれの場合
においても、酵素標識抗体を用いる逆の系で応用するこ
とができる。
おり、酵素標識生物学的物質は、抗体複合体の形成の面
で、系中の未知量の遊離生物学的物質と競合する。複合
体は特定物質の不溶性を利用して分離されてもよい。分
離された複合体の活性又は溶液中に残存する一部の活性
は、最初に存在した抗原量の測定のために利用される。
同様の原理は、生物学的液体中に存在する同一の抗体の
未修正変換体が測定されなければならないいずれの場合
においても、酵素標識抗体を用いる逆の系で応用するこ
とができる。
酵素免疫測定法にはいくつかの変形例がある。１つの
変形例においては、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）
として知られているが、標識及び未標識の抗原は一定量
の固相抗体に体する結合の点で競合する。置換された酵
素標識が測定されるが、しかる後の計算は実質的に放射
線免疫検査法操作の場合と同様である。
変形例においては、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）
として知られているが、標識及び未標識の抗原は一定量
の固相抗体に体する結合の点で競合する。置換された酵
素標識が測定されるが、しかる後の計算は実質的に放射
線免疫検査法操作の場合と同様である。
サンドイッチ法は酵素免疫測定法のもう１つの変形例
であって、多価抗原、及び抗体２分子との同時的結合能
を必要とする。第１抗体分子は固相反応剤である。その
抗体は、未知試料中のすべての抗原分子との結合を確実
化するため、過剰に使用される。かかる反応の終了後、
酵素標識抗体が加えられ、第１相で形成された複合体と
一緒にインキュベートされる。標識抗体はしかる後抗原
上の利用可能な決定基と結合する。過剰の抗体は洗浄に
より除去され、酵素活性はしかる後測定される。多の系
の場合では、複合体結合酵素量は試料中の抗原量から間
接的に測定される。この方法の変形例としては第２抗体
法がある。その方法において、抗原は最初に固相抗体
と、次いで遊離抗体を反応せしめられるが、いずれの抗
体も標識されていない。次いで、遊離抗体に対し特異的
な酵素標識抗体が最後の試薬として使用される。
であって、多価抗原、及び抗体２分子との同時的結合能
を必要とする。第１抗体分子は固相反応剤である。その
抗体は、未知試料中のすべての抗原分子との結合を確実
化するため、過剰に使用される。かかる反応の終了後、
酵素標識抗体が加えられ、第１相で形成された複合体と
一緒にインキュベートされる。標識抗体はしかる後抗原
上の利用可能な決定基と結合する。過剰の抗体は洗浄に
より除去され、酵素活性はしかる後測定される。多の系
の場合では、複合体結合酵素量は試料中の抗原量から間
接的に測定される。この方法の変形例としては第２抗体
法がある。その方法において、抗原は最初に固相抗体
と、次いで遊離抗体を反応せしめられるが、いずれの抗
体も標識されていない。次いで、遊離抗体に対し特異的
な酵素標識抗体が最後の試薬として使用される。
大半の酵素免疫測定法は不均一試験として分類され
る。このことは、液体中の未知物質量を分析するのに必
要な計算を実施するためには、結合標識分子が分析操作
のある時点において遊離標識分子から分離されなければ
ならないことを意味する。そのことから、分析中に分離
工程を要し、しかも分析操作の時間及び費用を増大させ
てしまう。結合標識物質及び未結合標識物質の分離が行
なわれない、均一的試験の酵素免疫測定法操作がある。
このような系では固相反応剤を必要としないが、代わっ
て、抗体を酵素標識抗原又はハプテンと結合させて酵素
活性を阻害することが必要になる。このタイプの試験法
では、すべての抗原−抗体結合により予測どおりに酵素
活性を低下させるとは限らないため、使用に限界があ
る。
る。このことは、液体中の未知物質量を分析するのに必
要な計算を実施するためには、結合標識分子が分析操作
のある時点において遊離標識分子から分離されなければ
ならないことを意味する。そのことから、分析中に分離
工程を要し、しかも分析操作の時間及び費用を増大させ
てしまう。結合標識物質及び未結合標識物質の分離が行
なわれない、均一的試験の酵素免疫測定法操作がある。
このような系では固相反応剤を必要としないが、代わっ
て、抗体を酵素標識抗原又はハプテンと結合させて酵素
活性を阻害することが必要になる。このタイプの試験法
では、すべての抗原−抗体結合により予測どおりに酵素
活性を低下させるとは限らないため、使用に限界があ
る。
酵素免疫測定法は一般的に放射線免疫検定法と同等の
感度を有し、放射性同位体が使用されないことからより
安全である。更に、酵素免疫測定法では一般に放射線免
疫検定法ほど複雑な装置を必要としない。酵素免疫測定
法は、放射線免疫検定法により行なわれる同様の分析よ
りも一般的に非常に安価である。
感度を有し、放射性同位体が使用されないことからより
安全である。更に、酵素免疫測定法では一般に放射線免
疫検定法ほど複雑な装置を必要としない。酵素免疫測定
法は、放射線免疫検定法により行なわれる同様の分析よ
りも一般的に非常に安価である。
しかしながら、典型的な酵素免疫測定法に付随してな
おも重要な問題が残されている。酵素免疫測定法を行な
うのに要する時間は、何度も実施する場合には非常に長
くなる。大半の場合、少なくとも数時間のインキュベー
ト時間が分析を実施するためには必要である。更に、典
型的な酵素免疫測定法では、測定可能に発色するよう
に、酵素基質について数回の洗浄工程と更にインキュベ
ート工程とを必要とする。酵素反応による発色は次いで
分光光度計で測定されなければならない。
おも重要な問題が残されている。酵素免疫測定法を行な
うのに要する時間は、何度も実施する場合には非常に長
くなる。大半の場合、少なくとも数時間のインキュベー
ト時間が分析を実施するためには必要である。更に、典
型的な酵素免疫測定法では、測定可能に発色するよう
に、酵素基質について数回の洗浄工程と更にインキュベ
ート工程とを必要とする。酵素反応による発色は次いで
分光光度計で測定されなければならない。
発明の概要 本発明の固相拡散試験法は不均一試験ではなく、した
がって結合標識化合物を未結合標識化合物から分離する
ための分離工程を必要としない。一方、結合分子及び標
識間に立体的相互作用がないため、本発明の固相拡散試
験法を従来の如き均一試験と呼ぶことは正確ではない。
〔この試験においては、すべての標識化合物が固相中の
吸着剤分子に結合している。〕本発明にあっては、生物
学的液体中に微小濃度で存在する物質を検出するのに際
し、上記方法に付随した問題を生じない。本発明は、比
較的短時間で実施することができ、しかも感度の面で放
射線免疫検定法に匹敵する、固相拡散試験法を提供する
ものである。更に、本発明の固相拡散試験法ではいかな
る複雑な測定装置をも必要としない。本発明の固相拡散
試験法は試験所で実施されることを要せず、患者のベッ
ドのかたわらで実施することができる。
がって結合標識化合物を未結合標識化合物から分離する
ための分離工程を必要としない。一方、結合分子及び標
識間に立体的相互作用がないため、本発明の固相拡散試
験法を従来の如き均一試験と呼ぶことは正確ではない。
〔この試験においては、すべての標識化合物が固相中の
吸着剤分子に結合している。〕本発明にあっては、生物
学的液体中に微小濃度で存在する物質を検出するのに際
し、上記方法に付随した問題を生じない。本発明は、比
較的短時間で実施することができ、しかも感度の面で放
射線免疫検定法に匹敵する、固相拡散試験法を提供する
ものである。更に、本発明の固相拡散試験法ではいかな
る複雑な測定装置をも必要としない。本発明の固相拡散
試験法は試験所で実施されることを要せず、患者のベッ
ドのかたわらで実施することができる。
本発明によれば、様々な物質が正確かつ簡易に測定さ
れ得ることが明らかにされた。これらの物質には、他の
物質と特異的に相互作用することが可能なあらゆる物質
が含まれる。このような物質としては、例えば、タンパ
ク質、糖タンパク質、核タンパク質及び高分子量ペプチ
ドホルモン、例えばインシュリン及び成長ホルモン、の
ような免疫原がある。これらの物質には、薬物、ビタミ
ン、グリコシド及びポリペプチドのようなハプテン類を
含む。互いに特異的に相互反応する他の化合物の例とし
ては、レクチン及び糖、酵素及び基質、ビオチン及びア
ビジン、DNA及び相補的DNA、RNA及び相補的RNA、DNA及
びRNA、並びに、リガンド及びリガンドに対するレセプ
ターがある。
れ得ることが明らかにされた。これらの物質には、他の
物質と特異的に相互作用することが可能なあらゆる物質
が含まれる。このような物質としては、例えば、タンパ
ク質、糖タンパク質、核タンパク質及び高分子量ペプチ
ドホルモン、例えばインシュリン及び成長ホルモン、の
ような免疫原がある。これらの物質には、薬物、ビタミ
ン、グリコシド及びポリペプチドのようなハプテン類を
含む。互いに特異的に相互反応する他の化合物の例とし
ては、レクチン及び糖、酵素及び基質、ビオチン及びア
ビジン、DNA及び相補的DNA、RNA及び相補的RNA、DNA及
びRNA、並びに、リガンド及びリガンドに対するレセプ
ターがある。
固相拡散試験法の原理は、例として競合的試験法を用
いた下記記載において概説されている。特定の試験物質
に対し特異性のある吸着剤は、ニトロセルロース紙のよ
うな不溶性支持体に結合されている。吸着剤がそれに対
して特異的な試験物質の未知濃度溶液は、既知濃度の酵
素標識試験物質と混合される。既知量の要絵は不溶性支
持体の１箇所に塗布される。溶液は数分間で不溶性支持
体中に拡散せしめられる。拡散終了後、拡散量は酵素標
識用の基質を加えることにより視覚化される。固体支持
体上における拡散パターンの直径は、溶液中の未標識試
験物質の濃度に比例する。本発明の全体的な固相拡散試
験法では実施に数分間しかかからず、必要とされる測定
器具は定規のみである。
いた下記記載において概説されている。特定の試験物質
に対し特異性のある吸着剤は、ニトロセルロース紙のよ
うな不溶性支持体に結合されている。吸着剤がそれに対
して特異的な試験物質の未知濃度溶液は、既知濃度の酵
素標識試験物質と混合される。既知量の要絵は不溶性支
持体の１箇所に塗布される。溶液は数分間で不溶性支持
体中に拡散せしめられる。拡散終了後、拡散量は酵素標
識用の基質を加えることにより視覚化される。固体支持
体上における拡散パターンの直径は、溶液中の未標識試
験物質の濃度に比例する。本発明の全体的な固相拡散試
験法では実施に数分間しかかからず、必要とされる測定
器具は定規のみである。
上記基本原理を用いたこの試験の様々な変形例が実施
されてもよい。試験はサンドイッチ法として行なわれて
もよい。この場合には、可溶性試験試料のみが吸着剤担
持固体相上に塗布される。固相は次いで標識吸着剤含有
溶液中でインキュベートされ、標識吸着剤の結合物が洗
浄工程後に視覚化される。
されてもよい。試験はサンドイッチ法として行なわれて
もよい。この場合には、可溶性試験試料のみが吸着剤担
持固体相上に塗布される。固相は次いで標識吸着剤含有
溶液中でインキュベートされ、標識吸着剤の結合物が洗
浄工程後に視覚化される。
試験物質を直姓標識するための予備インキュベート工
程が行なわれてもよい。この場合には、試験物質及び標
識吸着剤が一緒にインキュベートされ、混合物が吸着剤
担持固体に塗布される。
程が行なわれてもよい。この場合には、試験物質及び標
識吸着剤が一緒にインキュベートされ、混合物が吸着剤
担持固体に塗布される。
本発明の固相拡散試験法は、他の試験における生成物
をモニターするために利用されてもよい。この応用例の
場合は、本発明の固相拡散試験法は各種物質の測定試験
のために視覚化工程として利用される。例えば、酵素含
有リポソームに関する免疫試験は液相中で行なうことが
できる。上澄は次いで吸着剤含有固相に塗布される。リ
ポソームからの酵素放出量は、界面活性剤（detergen
t）含有酵素基質溶液の添加後に測定される。界面活性
剤はリポソームを溶解させるために加えられる。
をモニターするために利用されてもよい。この応用例の
場合は、本発明の固相拡散試験法は各種物質の測定試験
のために視覚化工程として利用される。例えば、酵素含
有リポソームに関する免疫試験は液相中で行なうことが
できる。上澄は次いで吸着剤含有固相に塗布される。リ
ポソームからの酵素放出量は、界面活性剤（detergen
t）含有酵素基質溶液の添加後に測定される。界面活性
剤はリポソームを溶解させるために加えられる。
各種物質の測定試験のための視覚化工程として本発明
を利用するもう１つの例は、アビジン／酵素複合体で標
識された抗体を使用する方法である。抗体／アジビン／
酵素複合体は、その抗体が特異的な未知量の抗原と一緒
にインキュベートされる。結合反応終了後、溶液はビオ
チンが結合した不溶性支持体に塗布される。抗原の存在
は、複合体を架橋結合せしめ、遊離抗体／アビジン／酵
素複合体数を減少させ、その結果、これに比例して拡散
パターン面積を縮小させる。
を利用するもう１つの例は、アビジン／酵素複合体で標
識された抗体を使用する方法である。抗体／アジビン／
酵素複合体は、その抗体が特異的な未知量の抗原と一緒
にインキュベートされる。結合反応終了後、溶液はビオ
チンが結合した不溶性支持体に塗布される。抗原の存在
は、複合体を架橋結合せしめ、遊離抗体／アビジン／酵
素複合体数を減少させ、その結果、これに比例して拡散
パターン面積を縮小させる。
本発明の固相拡散試験法において使用される標識は、
酵素、放射性同位体、蛍光化合物、色素、紫外線で視覚
できる基質、又は上記標識の１種が充填されたリポソー
ムのような担体であってもよい。更に、本発明の固相拡
散試験法において使用される標識は、潜在的に標識可能
なものであってもよい。例えば、タンパク質はクマシー
ブルー（Coomassie Blue）色素溶液を加えて視覚化する
ことができる。
酵素、放射性同位体、蛍光化合物、色素、紫外線で視覚
できる基質、又は上記標識の１種が充填されたリポソー
ムのような担体であってもよい。更に、本発明の固相拡
散試験法において使用される標識は、潜在的に標識可能
なものであってもよい。例えば、タンパク質はクマシー
ブルー（Coomassie Blue）色素溶液を加えて視覚化する
ことができる。
本発明の固相拡散試験法において、溶液中の特定の試
験物質の濃度を測定するために必要な最大溶液量は約１
〜50μである。このように、例えば、結中抗生物質量
の測定が必要とされる場合は、指の１回の穿刺によって
試験実施に十分な血液が得られる。血中抗生物質量の従
来の測定方法では、数cm3の血液が血管穿刺により採取
されることを必要とする。
験物質の濃度を測定するために必要な最大溶液量は約１
〜50μである。このように、例えば、結中抗生物質量
の測定が必要とされる場合は、指の１回の穿刺によって
試験実施に十分な血液が得られる。血中抗生物質量の従
来の測定方法では、数cm3の血液が血管穿刺により採取
されることを必要とする。
したがって、新規な拡散試験法を提供することが本発
明の目的である。
明の目的である。
本発明の他の目的は、非技術者によって実施すること
ができる試験法を提供することである。
ができる試験法を提供することである。
本発明の他の目的は、微量物質測定のための安価な試
験法を提供することである。
験法を提供することである。
本発明の他の目的は、微量物質測定のための迅速なワ
ンステップ試験法を提供することである。
ンステップ試験法を提供することである。
本発明の他の目的は、キットの形で市販することが可
能な迅速かつ安価な免疫学的試験法を提供することであ
る。
能な迅速かつ安価な免疫学的試験法を提供することであ
る。
本発明の他の目的は、測定器具として定規のみを必要
とする定性定量試験法を提供することである。
とする定性定量試験法を提供することである。
本発明の他の目的は、各種物質の濃度測定のために使
用することができる多用途向試験法を提供することであ
る。
用することができる多用途向試験法を提供することであ
る。
本発明の他の目的は、他のタイプの試験のための視覚
的工程を提供することである。
的工程を提供することである。
更に、本発明の他の目的は、事前に血漿を全血から分
離する必要のない血漿中物質濃度の試験法を提供するこ
とである。
離する必要のない血漿中物質濃度の試験法を提供するこ
とである。
本発明のもう１つの目的は、微量溶液中の低濃度物質
の試験法を提供することである。
の試験法を提供することである。
本発明のこれらのそして他の目的、特徴、利点は、下
記に開示された態様の詳細な説明、添付図面及び請求の
範囲を参照することにより明らかとなるであろう。
記に開示された態様の詳細な説明、添付図面及び請求の
範囲を参照することにより明らかとなるであろう。
図面の簡単な説明 図１（ａ）〜１（ｃ）は、標識試験分子のみを用いた
本発明の固相拡散試験法の概略図である。
本発明の固相拡散試験法の概略図である。
図２（ａ）〜２（ｃ）は、標識試験分子及び未標識試
験分子を用いた固相拡散試験法の概略図である。
験分子を用いた固相拡散試験法の概略図である。
図３は、本発明の固相拡散試験法により不活性ペルオ
キシダーゼを測定した際の標準曲線である。
キシダーゼを測定した際の標準曲線である。
図４は、本発明の固相拡散試験法によりゲンタマイシ
ンを測定した際の標準曲線である。
ンを測定した際の標準曲線である。
図５は、本発明の固相拡散試験法によりテオフィリン
を測定した際の標準曲線である。
を測定した際の標準曲線である。
図６は、本発明の固相拡散試験法により免疫グロブリ
ンＧを測定した際の標準曲線である。
ンＧを測定した際の標準曲線である。
好ましい態様の詳細な説明 本発明の固相拡散試験法は、微小濃度の各種可溶性物
質に関する定量的及び／又は定性的測定及び検出のため
の試験である。本発明の固相拡散試験法においては、特
定の試験物質に対し特異的な吸着剤は、試験溶媒に不溶
性の支持体に共有結合的又は非共有結合的に結合せしめ
られる。下記記載は競合試験の変形法にも妥当する。未
知濃度の試験物質溶液が調製される。その溶液に既知量
の標識試験物質が加えられる。試験物質及び標識試験物
質含有の少量溶液は、不溶性吸着剤処理支持体上の１箇
所に塗布される。試験物質及び標識試験化合物が支持体
中に拡散するにつれて、それらは吸着剤処理不溶性支持
体上で結合部位に対し競合する。標識化合物で覆われた
円形領域は、試験試料で置き代えられていくにしたがい
増加していく。
質に関する定量的及び／又は定性的測定及び検出のため
の試験である。本発明の固相拡散試験法においては、特
定の試験物質に対し特異的な吸着剤は、試験溶媒に不溶
性の支持体に共有結合的又は非共有結合的に結合せしめ
られる。下記記載は競合試験の変形法にも妥当する。未
知濃度の試験物質溶液が調製される。その溶液に既知量
の標識試験物質が加えられる。試験物質及び標識試験物
質含有の少量溶液は、不溶性吸着剤処理支持体上の１箇
所に塗布される。試験物質及び標識試験化合物が支持体
中に拡散するにつれて、それらは吸着剤処理不溶性支持
体上で結合部位に対し競合する。標識化合物で覆われた
円形領域は、試験試料で置き代えられていくにしたがい
増加していく。
本明細書において用いられる“リガンド”という語
は、それに対するレセプターが自然界に存在し又は製造
可能である、あわゆる化合物を表わす。“レセプター”
という語は、分子、即ち抗原決定基部位の特定の空間的
又は極性構造を認識することができる、あらゆる化合物
又は組成物に関して使用される。レセプターの例として
は、天然レセプター、例えば、チロキシンと特異的に結
合するチロキシン結合グロブリン：免疫グロブリンと特
異的に結合するブドウ球菌（Staphylococcal）タクパク
質A;抗体；基質と特異的に結合する酵素;Fab断片；レク
チンその他が挙げられるが、それらに限定されない。
は、それに対するレセプターが自然界に存在し又は製造
可能である、あわゆる化合物を表わす。“レセプター”
という語は、分子、即ち抗原決定基部位の特定の空間的
又は極性構造を認識することができる、あらゆる化合物
又は組成物に関して使用される。レセプターの例として
は、天然レセプター、例えば、チロキシンと特異的に結
合するチロキシン結合グロブリン：免疫グロブリンと特
異的に結合するブドウ球菌（Staphylococcal）タクパク
質A;抗体；基質と特異的に結合する酵素;Fab断片；レク
チンその他が挙げられるが、それらに限定されない。
同一の数字がいくつかの図全体において同一の要素を
示している図面を参照することにより、本発明の固相拡
散試験法が図１（ａ）〜１（ｃ）及び図２（ａ）〜２
（ｃ）に開示されていることが理解されるであろう。図
１（ａ）〜１（ｃ）は未知濃度の標識試験物質分子の結
合について示すものである。この図は、従来の試験にお
ける測定工程として、本発明の固相拡散試験法を適用し
たことを示している。陰影を帯びた球は、溶液中の標識
試験物質分子12を表わす。これらの分子は免疫原又はハ
プテンのようなリガンドであっもよく、あるいは、それ
らはリガンドに対し特異的なレセプターであってもよ
い。レセプターの例としては抗体がある。吸着剤分子14
も同様に抗原でもレセプターであってもよい。試験物質
分子12に対し特異的な吸着剤分子は、特定の試験で使用
される溶媒に不溶性の支持体16と結合している。不溶性
支持体の１例はニトロセルロース紙である。不溶性支持
体16は吸着剤分子14で処理される。例えば、本発明にお
いて使用可能な典型的吸着剤分子は、特定の抗原又はハ
プテンに対し特異的な抗体である。抗体分子は全体的に
正電荷を有している。ニトロセルロース紙は全体的に負
電荷を有している。抗体分子がニトロセルロース紙に溶
液として塗布された場合は、正荷電抗体はニトロセルロ
ース紙上の負荷電硝酸イオン基とイオン結合する。別の
固体支持体が使用されてもよく、しかも吸着剤分子は固
体支持体とイオン結合又は共有結合していてもよい、と
いうように理解すべきである。吸着剤分子14は、したが
って、試験物質分子12が結合可能な支持体16上の特異的
結合部位を提供することになる。吸着剤分子14で処理さ
れた不溶性支持体16は、試験に際して固相18を提供す
る。
示している図面を参照することにより、本発明の固相拡
散試験法が図１（ａ）〜１（ｃ）及び図２（ａ）〜２
（ｃ）に開示されていることが理解されるであろう。図
１（ａ）〜１（ｃ）は未知濃度の標識試験物質分子の結
合について示すものである。この図は、従来の試験にお
ける測定工程として、本発明の固相拡散試験法を適用し
たことを示している。陰影を帯びた球は、溶液中の標識
試験物質分子12を表わす。これらの分子は免疫原又はハ
プテンのようなリガンドであっもよく、あるいは、それ
らはリガンドに対し特異的なレセプターであってもよ
い。レセプターの例としては抗体がある。吸着剤分子14
も同様に抗原でもレセプターであってもよい。試験物質
分子12に対し特異的な吸着剤分子は、特定の試験で使用
される溶媒に不溶性の支持体16と結合している。不溶性
支持体の１例はニトロセルロース紙である。不溶性支持
体16は吸着剤分子14で処理される。例えば、本発明にお
いて使用可能な典型的吸着剤分子は、特定の抗原又はハ
プテンに対し特異的な抗体である。抗体分子は全体的に
正電荷を有している。ニトロセルロース紙は全体的に負
電荷を有している。抗体分子がニトロセルロース紙に溶
液として塗布された場合は、正荷電抗体はニトロセルロ
ース紙上の負荷電硝酸イオン基とイオン結合する。別の
固体支持体が使用されてもよく、しかも吸着剤分子は固
体支持体とイオン結合又は共有結合していてもよい、と
いうように理解すべきである。吸着剤分子14は、したが
って、試験物質分子12が結合可能な支持体16上の特異的
結合部位を提供することになる。吸着剤分子14で処理さ
れた不溶性支持体16は、試験に際して固相18を提供す
る。
既知量の試験物質分子12は、キャピラリー管20により
又はマイクロピペットもしくは微生物用ループのような
他の周知器具により、固相18に塗布される。図１（ｂ）
に示されているように、試験物質分子12が固相18に塗布
されると、それらは塗布部位から外方に向け急速に固相
中に拡散していく。試験物質分子12が固相18を拡散する
にしたがい、試験物質分子は遊離吸着剤分子14部位に結
合していく。
又はマイクロピペットもしくは微生物用ループのような
他の周知器具により、固相18に塗布される。図１（ｂ）
に示されているように、試験物質分子12が固相18に塗布
されると、それらは塗布部位から外方に向け急速に固相
中に拡散していく。試験物質分子12が固相18を拡散する
にしたがい、試験物質分子は遊離吸着剤分子14部位に結
合していく。
図１（ｃ）に示されているように、すべての標識試験
物質分子12が吸着剤分子14と結合するようになると、固
相18における試験物質分子の拡散は停止する。結合試験
物質分子12は固相上で円形拡散パターンを展開する。円
形拡散パターンは22のような直径を有しており、この直
径は使用される標識物質のタイプにより変更される周知
の技術によって測定することができる。拡散パターンの
直径は溶液中の標識試験物質量に比例する。
物質分子12が吸着剤分子14と結合するようになると、固
相18における試験物質分子の拡散は停止する。結合試験
物質分子12は固相上で円形拡散パターンを展開する。円
形拡散パターンは22のような直径を有しており、この直
径は使用される標識物質のタイプにより変更される周知
の技術によって測定することができる。拡散パターンの
直径は溶液中の標識試験物質量に比例する。
次いで図２（ａ）〜２（ｃ）では、未知量の未標識試
験物質が既知標識試験物質溶液に加えられた場合におけ
る本発明の固相拡散試験法25が示されている。この固相
拡散試験変形例では、固相上の結合部位に対する標識試
験物質及び未標識試験物質間の競合原理を利用してい
る。抗原又はハプテンのような未知濃度の未標識試験物
質分子24は、試験溶液を調製するために、既知濃度の標
識試験物質分子12と混合される。固相18は上記のように
して調製される；しかしながら、吸着剤分子14は、それ
らが標識試験物質分子12及び未標識試験物質分子24の双
方に対する結合部位を与えるように選択される。
験物質が既知標識試験物質溶液に加えられた場合におけ
る本発明の固相拡散試験法25が示されている。この固相
拡散試験変形例では、固相上の結合部位に対する標識試
験物質及び未標識試験物質間の競合原理を利用してい
る。抗原又はハプテンのような未知濃度の未標識試験物
質分子24は、試験溶液を調製するために、既知濃度の標
識試験物質分子12と混合される。固相18は上記のように
して調製される；しかしながら、吸着剤分子14は、それ
らが標識試験物質分子12及び未標識試験物質分子24の双
方に対する結合部位を与えるように選択される。
試験溶液は上記方法により固相18に塗布される。試験
溶液は塗布部位から外方に向け急速に固相18中に拡散し
ていく。標識試験物質分子12及び未標識試験物質分子24
の双方は、遊離吸着剤14結合部位との結合に関し競合す
る。固相18における試験溶液の拡散は、すべての標識試
験物質分子12及びすべての未標識試験物質分子24が吸着
剤分子14と結合するまで続く。
溶液は塗布部位から外方に向け急速に固相18中に拡散し
ていく。標識試験物質分子12及び未標識試験物質分子24
の双方は、遊離吸着剤14結合部位との結合に関し競合す
る。固相18における試験溶液の拡散は、すべての標識試
験物質分子12及びすべての未標識試験物質分子24が吸着
剤分子14と結合するまで続く。
ある程度の結合部位が未標識試験物質分子24によって
占められているため、標識試験物質分子12は、未標識試
験物質分子が存在していない場合よりも塗布部位から更
に外方に拡散する。その結果、試験溶液の拡散パターン
は、標識試験物質分子12のみの拡散パターンである図１
（ｃ）の直径22よりも大きい図２（ｃ）の直径26を有し
ている。
占められているため、標識試験物質分子12は、未標識試
験物質分子が存在していない場合よりも塗布部位から更
に外方に拡散する。その結果、試験溶液の拡散パターン
は、標識試験物質分子12のみの拡散パターンである図１
（ｃ）の直径22よりも大きい図２（ｃ）の直径26を有し
ている。
標識試験物質が移動する距離は図１（ｃ）の場合より
も図２（ｃ）の場合の方が長いが、その理由は、図２
（ｃ）において、ある程度の割合の吸着剤結合部位が未
標識試験物質によって占められていて、標識試験物質が
遊離吸着剤結合部位と出会うまでに更に拡散されてしま
うからである。このように、標識試験物質によって形成
される拡散パターンの直径は、溶液中の未標識試験物質
の濃度に比例しているのである。
も図２（ｃ）の場合の方が長いが、その理由は、図２
（ｃ）において、ある程度の割合の吸着剤結合部位が未
標識試験物質によって占められていて、標識試験物質が
遊離吸着剤結合部位と出会うまでに更に拡散されてしま
うからである。このように、標識試験物質によって形成
される拡散パターンの直径は、溶液中の未標識試験物質
の濃度に比例しているのである。
本発明の固相拡散試験法には多種のものがある。例え
ば、（ａ）試験物質が標識することができない、又は
（ｂ）試験物質及びレセプター間の親和性が低いため、
本発明の固相拡散試験法において使用することができな
い、又は（ｃ）極めて高い感度が要求される、又は
（ｄ）各種物質の濃度測定のために、同一の固相拡散試
薬を使用したい、という状況がある。
ば、（ａ）試験物質が標識することができない、又は
（ｂ）試験物質及びレセプター間の親和性が低いため、
本発明の固相拡散試験法において使用することができな
い、又は（ｃ）極めて高い感度が要求される、又は
（ｄ）各種物質の濃度測定のために、同一の固相拡散試
薬を使用したい、という状況がある。
上記状況において上記試験物質を測定するためには予
備工程が必要とされる。試験物質が標識することができ
ないという状況（ａ）では、試験物質に対するレセプタ
ーを標識することができ、このレセプターは次いで本発
明の固相拡散試験法の最終工程において分析される。
備工程が必要とされる。試験物質が標識することができ
ないという状況（ａ）では、試験物質に対するレセプタ
ーを標識することができ、このレセプターは次いで本発
明の固相拡散試験法の最終工程において分析される。
試験物質及びレセプター間の親和性が低い場合には、
試験物質又はレセプターはビオチン（リガンド）−アビ
ジン（レセプター）系のような高親和性リガンド又はレ
セプターと結合させることができる。本発明の固相拡散
試験法はしかる後高親和性リガンド及びレセプターを用
いて実施されてもよい。（例は以下に記載されてい
る。） 本発明の固相拡散試験の感度は、増幅工程を取り入れ
ることによって非常に大きく増大させることができる。
この工程の例としては、補体系を利用するもの、あるい
は、酵素又は他の標識が充填された単層リポソーム膜中
に試験物質に対する抗体を組込ませるものがある。
試験物質又はレセプターはビオチン（リガンド）−アビ
ジン（レセプター）系のような高親和性リガンド又はレ
セプターと結合させることができる。本発明の固相拡散
試験法はしかる後高親和性リガンド及びレセプターを用
いて実施されてもよい。（例は以下に記載されてい
る。） 本発明の固相拡散試験の感度は、増幅工程を取り入れ
ることによって非常に大きく増大させることができる。
この工程の例としては、補体系を利用するもの、あるい
は、酵素又は他の標識が充填された単層リポソーム膜中
に試験物質に対する抗体を組込ませるものがある。
各種試験試料について同一の本発明の固相拡散試験法
を適用する場合は、各種試験物質を測定するために、ビ
オチンを不溶性支持体に結合させかつアビジンをリガン
ドとして用いることにより行なわれてもよい。この場合
において、酵素標識アビジンは各種試験試料に対する抗
体に結合せしめられる。試験試料はしかる後その相補的
標識抗体と一緒にインキュベートされ、ビオチン／アビ
ジン固相拡散試験法により抗体が分析される。抗原が存
在すると、不溶性支持体上の拡散パターン面積を減少さ
せることにつながる架橋結合によって、標識抗体量を減
少させる。
を適用する場合は、各種試験物質を測定するために、ビ
オチンを不溶性支持体に結合させかつアビジンをリガン
ドとして用いることにより行なわれてもよい。この場合
において、酵素標識アビジンは各種試験試料に対する抗
体に結合せしめられる。試験試料はしかる後その相補的
標識抗体と一緒にインキュベートされ、ビオチン／アビ
ジン固相拡散試験法により抗体が分析される。抗原が存
在すると、不溶性支持体上の拡散パターン面積を減少さ
せることにつながる架橋結合によって、標識抗体量を減
少させる。
本発明の固相拡散試験法において、試験溶液はいくつ
かの方法によって塗布することができる。試験溶液は、
処理された不溶性支持体上に直接、キャピラリー管、マ
イクロピペット又は微生物用ループによって１箇所に塗
布することができる。更に、小孔を有するプラスチック
製シート又はテープが不溶性支持体上に載置されていて
もよい。試験溶液はしかる後直接孔全体にわたりプラス
チック製シート又はテープ上に直接塗布される。試験溶
液は次いで孔を通過して不溶性支持体中に拡散する。試
験溶液は、処理された不溶性支持体ストリップの一端を
既知量の試験溶液と接触せしめることにより塗布するこ
ともできる。溶液はしかる後不溶性支持体中に拡散す
る。標識試験物質の拡散距離は溶液中の未標識試験物質
量に比例する。
かの方法によって塗布することができる。試験溶液は、
処理された不溶性支持体上に直接、キャピラリー管、マ
イクロピペット又は微生物用ループによって１箇所に塗
布することができる。更に、小孔を有するプラスチック
製シート又はテープが不溶性支持体上に載置されていて
もよい。試験溶液はしかる後直接孔全体にわたりプラス
チック製シート又はテープ上に直接塗布される。試験溶
液は次いで孔を通過して不溶性支持体中に拡散する。試
験溶液は、処理された不溶性支持体ストリップの一端を
既知量の試験溶液と接触せしめることにより塗布するこ
ともできる。溶液はしかる後不溶性支持体中に拡散す
る。標識試験物質の拡散距離は溶液中の未標識試験物質
量に比例する。
試験物質に結合せしめられる標識は酵素であってもよ
いと理解されたい。酵素標識試験物質は、酵素基質を加
え、拡散パターンの測定が可能になるほど発色が生じる
まで固体支持体を短時間インキュベートすることにより
視覚化される。試験方法は、酵素基質溶液の１成分を試
験試料混合物に加え、第２成分を固相中に組み込んでお
くことによっても簡易化することができる。試料混合物
を塗布することにより、酵素基質は自動的に再調製され
る。
いと理解されたい。酵素標識試験物質は、酵素基質を加
え、拡散パターンの測定が可能になるほど発色が生じる
まで固体支持体を短時間インキュベートすることにより
視覚化される。試験方法は、酵素基質溶液の１成分を試
験試料混合物に加え、第２成分を固相中に組み込んでお
くことによっても簡易化することができる。試料混合物
を塗布することにより、酵素基質は自動的に再調製され
る。
試験物質に結合せしめられる標識は放射性同位体であ
ってもよい。標識が放射性同位体である場合は、試験物
質溶液の拡散パターンは、不溶性支持体をＸ線フィルム
に接触させ、拡散パターンをフィルム上に写すために必
要な時間の間フィルムを暴露することによって視覚化さ
れる。この時間は、使用される同位体及び同位体の比活
性に依存する。フィルムを支持体に対し暴露した後、フ
ィルムは現像され、拡散パターンの直径が測定される。
ってもよい。標識が放射性同位体である場合は、試験物
質溶液の拡散パターンは、不溶性支持体をＸ線フィルム
に接触させ、拡散パターンをフィルム上に写すために必
要な時間の間フィルムを暴露することによって視覚化さ
れる。この時間は、使用される同位体及び同位体の比活
性に依存する。フィルムを支持体に対し暴露した後、フ
ィルムは現像され、拡散パターンの直径が測定される。
試験物質に結合せしめられる標識は蛍光化合物であっ
てもよい。標識が蛍光化合物である場合は、不溶性支持
体上の試験物質溶液の拡散パターンは支持体を紫外光下
におくことによって視覚化される。紫外光は試験物質に
結合した化合物に蛍光を発生させ、拡散パターンの直径
は定規で測定することができる。
てもよい。標識が蛍光化合物である場合は、不溶性支持
体上の試験物質溶液の拡散パターンは支持体を紫外光下
におくことによって視覚化される。紫外光は試験物質に
結合した化合物に蛍光を発生させ、拡散パターンの直径
は定規で測定することができる。
試験物質に結合せしめられる標識は、金コロイド、銀
コロイド、〔ヤンセン・ファーマシューティカル社（Ja
nssen Pharmaceutical），ビールス，ベルギー〕コンゴ
ーレッド22120、４′,6′−ジアミジノ−２−フェニル
インドール、エオシン10B及びヘマトキシリン75290〔シ
グマ・ケミカル・カンパニー社（Sigma Chemical Compa
ny），セントルイス，ミズーリ州〕のような色素であっ
てもよい。
コロイド、〔ヤンセン・ファーマシューティカル社（Ja
nssen Pharmaceutical），ビールス，ベルギー〕コンゴ
ーレッド22120、４′,6′−ジアミジノ−２−フェニル
インドール、エオシン10B及びヘマトキシリン75290〔シ
グマ・ケミカル・カンパニー社（Sigma Chemical Compa
ny），セントルイス，ミズーリ州〕のような色素であっ
てもよい。
試験物質に結合せしめられる標識は、従来の薄層クロ
マトグラフィーで広く使用された検出方法の１つにより
検出されてもよい。これには、特定の化学物質に対し親
和性をもつ色素が含まれる〔薄層クロマトグラフィーの
実施における視覚化操作、ジェイ・シー・タッチストー
ン及びエム・エフ・ドビンズ，第161−219頁,1970年（V
isualization Procedures in the Practice of Thin La
yer chromatography,J.C.Touchstone and M.F.Dobbins,
pqs.161−219,1970）参照〕。
マトグラフィーで広く使用された検出方法の１つにより
検出されてもよい。これには、特定の化学物質に対し親
和性をもつ色素が含まれる〔薄層クロマトグラフィーの
実施における視覚化操作、ジェイ・シー・タッチストー
ン及びエム・エフ・ドビンズ，第161−219頁,1970年（V
isualization Procedures in the Practice of Thin La
yer chromatography,J.C.Touchstone and M.F.Dobbins,
pqs.161−219,1970）参照〕。
試験物質に結合せしめられる標識は、間接的に試験物
質に結合されてもよい。例えば、試験物質がハプテンで
ある場合は、タンパク質をハプテンに結合させ、次いで
標識をこのタンパク質に結合させることができる。ある
いは、抗原に対する抗体が標識され、試験に際し標識抗
体−抗原複合体として使用されてもよい。
質に結合されてもよい。例えば、試験物質がハプテンで
ある場合は、タンパク質をハプテンに結合させ、次いで
標識をこのタンパク質に結合させることができる。ある
いは、抗原に対する抗体が標識され、試験に際し標識抗
体−抗原複合体として使用されてもよい。
抗原に結合せしめられる標識はリポソームのような担
体中に組み込まれてもよい〔ジョーナル・オブ・イムノ
ロジカル・メソッズ，第62巻，第155−162頁,1983年（J
ournal of Immunological Methods,62:155−162,1983）
参照〕。この方法では、抗原は単層リポソーム膜中に加
えられる。酵素はリポソーム内部に存在する。リポソー
ム表紙をもつ試験物質が固体支持体中に拡散した後、界
面活性剤が酵素基質と一緒に固体支持体に加えられる。
界面活性剤はリポソーム膜を破壊し、酵素を放出させ、
酵素基質と反応させる。リポソーム内部に保持された酵
素又は色素に対する抗体は、標識の非特異的拡散を防止
するため、固相中に組み込まれてもよい。
体中に組み込まれてもよい〔ジョーナル・オブ・イムノ
ロジカル・メソッズ，第62巻，第155−162頁,1983年（J
ournal of Immunological Methods,62:155−162,1983）
参照〕。この方法では、抗原は単層リポソーム膜中に加
えられる。酵素はリポソーム内部に存在する。リポソー
ム表紙をもつ試験物質が固体支持体中に拡散した後、界
面活性剤が酵素基質と一緒に固体支持体に加えられる。
界面活性剤はリポソーム膜を破壊し、酵素を放出させ、
酵素基質と反応させる。リポソーム内部に保持された酵
素又は色素に対する抗体は、標識の非特異的拡散を防止
するため、固相中に組み込まれてもよい。
固体支持対の様々な特徴は試験の実施に強い影響を与
える。したがって、本発明の固相拡散試験法に対する具
体的ニーズに特に適した固体支持体を開発することがで
きる。一般に、固体支持体の厚さは、所定の表面を覆う
のに要する試料の量及び試験の感度差に間接的に比例す
る。親水性及び疎水性成分の濃度も試料の拡散挙動に影
響を与える。レセプターに対する固体支持体の結合力
は、本発明の固相拡散試験法の感度にとって重要であ
る。各種固体支持体の製造方法は当業者に周知である。
える。したがって、本発明の固相拡散試験法に対する具
体的ニーズに特に適した固体支持体を開発することがで
きる。一般に、固体支持体の厚さは、所定の表面を覆う
のに要する試料の量及び試験の感度差に間接的に比例す
る。親水性及び疎水性成分の濃度も試料の拡散挙動に影
響を与える。レセプターに対する固体支持体の結合力
は、本発明の固相拡散試験法の感度にとって重要であ
る。各種固体支持体の製造方法は当業者に周知である。
本発明で使用される固相不溶性支持体は、全体的に正
電荷を帯びた吸着剤分子（レセプター又はリガンド）が
不溶性支持体に非共有結合し得るように、全体的に負電
荷を帯びたものであれば、いかなる支持体であってもよ
い。これらのタイプの支持体の例としては、ニトロセル
ロース紙、吸取膜、ジエチルアミノエチルイオン交換紙
及び吸取吸着紙がある。更に、固相不溶性支持体は、
吸着剤分子（レセプター又はリガンド）が共有結合する
ことが可能な支持体結合性官能基を有するものであれ
ば、いかなる支持体であってもよい。これらのタイプの
支持体の例としては、アミノベンジルオキシメチル（AB
M）紙、２−アミノフェニルチオエーテル（APT）紙、臭
化シアン活性化紙（CBA）〔CBA紙について記載されてい
るメソッズ・イン・エンザイモロジー，アール・ウー
（編集）,1979年，アカデミック・プレス・ニューヨー
ク，第68巻，第436−442巻（Methods in Enzymology,R.
Wu（ed.）1979,Academic Press New York,68:436−44
2）参照〕、ジアゾベンジルオキシメチルセルロース紙
（DBM）、ジアゾフェニルチオエーテルセルロース紙（D
PT）及びニトロベンジルオキシメチルセルロース紙（NB
M）がある。
電荷を帯びた吸着剤分子（レセプター又はリガンド）が
不溶性支持体に非共有結合し得るように、全体的に負電
荷を帯びたものであれば、いかなる支持体であってもよ
い。これらのタイプの支持体の例としては、ニトロセル
ロース紙、吸取膜、ジエチルアミノエチルイオン交換紙
及び吸取吸着紙がある。更に、固相不溶性支持体は、
吸着剤分子（レセプター又はリガンド）が共有結合する
ことが可能な支持体結合性官能基を有するものであれ
ば、いかなる支持体であってもよい。これらのタイプの
支持体の例としては、アミノベンジルオキシメチル（AB
M）紙、２−アミノフェニルチオエーテル（APT）紙、臭
化シアン活性化紙（CBA）〔CBA紙について記載されてい
るメソッズ・イン・エンザイモロジー，アール・ウー
（編集）,1979年，アカデミック・プレス・ニューヨー
ク，第68巻，第436−442巻（Methods in Enzymology,R.
Wu（ed.）1979,Academic Press New York,68:436−44
2）参照〕、ジアゾベンジルオキシメチルセルロース紙
（DBM）、ジアゾフェニルチオエーテルセルロース紙（D
PT）及びニトロベンジルオキシメチルセルロース紙（NB
M）がある。
化学物質を固相支持体に結合するために使用可能な方
法は、支持体の化学構造及び支持体に結合せしめられる
化学物質の化学構造に一部依存する。化学物質は、臭化
シアンカップリング、シランカップリング（silatio
n）、ジアゾカップリング、カルボジイミドカップリン
グ、グルタルアルデヒドカップリングの利用により、及
びヘテロ２官能試薬の使用により、支持体に結合するこ
とができる。多くの場合、立体障害があるため、スペー
サー基が、１つの化学物質をもう１つの化学物質に結合
させるために必要とされる。通常のスペーサー基として
は、ジアミノアルキルもしくはアリール基、アリールカ
ルボン散もしくはγ−アミノアルキル基、チオール、ヒ
ドロキシ及び水銀系塩基があるが、これらに限定されな
い。
法は、支持体の化学構造及び支持体に結合せしめられる
化学物質の化学構造に一部依存する。化学物質は、臭化
シアンカップリング、シランカップリング（silatio
n）、ジアゾカップリング、カルボジイミドカップリン
グ、グルタルアルデヒドカップリングの利用により、及
びヘテロ２官能試薬の使用により、支持体に結合するこ
とができる。多くの場合、立体障害があるため、スペー
サー基が、１つの化学物質をもう１つの化学物質に結合
させるために必要とされる。通常のスペーサー基として
は、ジアミノアルキルもしくはアリール基、アリールカ
ルボン散もしくはγ−アミノアルキル基、チオール、ヒ
ドロキシ及び水銀系塩基があるが、これらに限定されな
い。
不溶性支持体の孔径により定められる非除限界は、固
相中で拡散し得る粒子の径を決定することになる。固相
の孔径は、試験に際し分離工程を省略するために利用す
ることができる。例えば、ヘパリン処理血液が分析され
る場合は、血液の細胞成分は、いずれかの試験が行なわ
れる前に血液中の液体又は血漿部分から通常分離されな
ければならない。これは通常遠心分離により行なわれ
る。本発明の固相拡散試験ではこの遠心分離工程は省略
することができるが、その理由は、不溶性支持体の孔径
は血液中の細胞成分の拡散を阻止するように選択するこ
とができるからである。
相中で拡散し得る粒子の径を決定することになる。固相
の孔径は、試験に際し分離工程を省略するために利用す
ることができる。例えば、ヘパリン処理血液が分析され
る場合は、血液の細胞成分は、いずれかの試験が行なわ
れる前に血液中の液体又は血漿部分から通常分離されな
ければならない。これは通常遠心分離により行なわれ
る。本発明の固相拡散試験ではこの遠心分離工程は省略
することができるが、その理由は、不溶性支持体の孔径
は血液中の細胞成分の拡散を阻止するように選択するこ
とができるからである。
本発明の固相拡散試験法におけるこの態様のもう１つ
の変形例においては、試験溶液はフィルターを介して不
溶性支持体に塗布されてもよい。試験溶液はフィルター
の頂部に塗布され、試験溶液はフィルターを介して不溶
性支持体中に拡散する。典型的フィルターの例として
は、吸取紙及びジエチルアミノエチルイオン交換紙があ
るが、これらに限定されない。この方法の利用例として
は、不溶性支持体がヘパリン処理全血中の赤血球を溶解
させてしまう場合に血球を血漿から分離させる例があ
る。溶解細胞から放出されるヘモグロビンは不溶性支持
体において濃い背景色を呈し、拡散パターンの視覚化を
困難ならしめる。
の変形例においては、試験溶液はフィルターを介して不
溶性支持体に塗布されてもよい。試験溶液はフィルター
の頂部に塗布され、試験溶液はフィルターを介して不溶
性支持体中に拡散する。典型的フィルターの例として
は、吸取紙及びジエチルアミノエチルイオン交換紙があ
るが、これらに限定されない。この方法の利用例として
は、不溶性支持体がヘパリン処理全血中の赤血球を溶解
させてしまう場合に血球を血漿から分離させる例があ
る。溶解細胞から放出されるヘモグロビンは不溶性支持
体において濃い背景色を呈し、拡散パターンの視覚化を
困難ならしめる。
不溶性支持体への試験試料の塗布は、下記の方法のよ
うに修正されてもよい。薄いプラスチック製シート又は
プラスチック製テープは、シート又はテープの中心に孔
を穿設して製造することができる。孔径は約１〜5mmと
することができる。プラスチック製シート又はテープは
次いで不溶性支持体上におかれる。試験試料はしかる後
シート又はテープの孔全体にわたり不溶性支持体に迅速
に塗布されてもよい。試験試料は次いで孔を通過し不溶
性支持体中に拡散していく。
うに修正されてもよい。薄いプラスチック製シート又は
プラスチック製テープは、シート又はテープの中心に孔
を穿設して製造することができる。孔径は約１〜5mmと
することができる。プラスチック製シート又はテープは
次いで不溶性支持体上におかれる。試験試料はしかる後
シート又はテープの孔全体にわたり不溶性支持体に迅速
に塗布されてもよい。試験試料は次いで孔を通過し不溶
性支持体中に拡散していく。
本発明の固相拡散試験によって分析され得る未標識試
験物質としては、抗原として公知の物質群があるが、そ
れらに限定されない。抗原は２群：即ち、免疫原及びハ
プテンに分類することができる。
験物質としては、抗原として公知の物質群があるが、そ
れらに限定されない。抗原は２群：即ち、免疫原及びハ
プテンに分類することができる。
免疫原とは、脊索動物に導入された場合に、抗体を生
成する化合物である。免疫原の代表例は、タンパク質、
糖タンパク質及び核タンパク質、例えば、ペプチドホル
モン、血清タンパク質、補体タンパク質、凝固因子及び
ウィルスもしくは最近の産生物である。すべての動物種
に遍在する一定のの体内化合物は、これらの化合物が免
疫された動物で異物として認識されないため、抗体の産
生用としては使用することができない。これらの化合物
は化学的誘導によって“異物”に変換することができ
る。試験における試験物質は、変換後の化合物に対する
抗体が使用される場合、同一の誘導方法が実施されなけ
ればならない。
成する化合物である。免疫原の代表例は、タンパク質、
糖タンパク質及び核タンパク質、例えば、ペプチドホル
モン、血清タンパク質、補体タンパク質、凝固因子及び
ウィルスもしくは最近の産生物である。すべての動物種
に遍在する一定のの体内化合物は、これらの化合物が免
疫された動物で異物として認識されないため、抗体の産
生用としては使用することができない。これらの化合物
は化学的誘導によって“異物”に変換することができ
る。試験における試験物質は、変換後の化合物に対する
抗体が使用される場合、同一の誘導方法が実施されなけ
ればならない。
表IIIは、本発明の固相拡散試験法による定量が可能
ないくつかのタイプの免疫原に関する部分的リストであ
る。
ないくつかのタイプの免疫原に関する部分的リストであ
る。
ハプテンは、免疫原担体と結合し脊索動物に導入され
た場合に、ハプテンに対し特異的な抗体を生成せしめる
化合物である。ハプテンの代表例は、エストロゲン及び
コルチゾンのようなステロイド類、低分子量ペプチド、
他の低分子量生物学的化合物、抗生物質及び化学療法剤
のような薬物、工業汚染物質、香味剤、食品添加剤、食
品汚染物質及び／又はそれらの代謝産物もしくは誘導体
である。
た場合に、ハプテンに対し特異的な抗体を生成せしめる
化合物である。ハプテンの代表例は、エストロゲン及び
コルチゾンのようなステロイド類、低分子量ペプチド、
他の低分子量生物学的化合物、抗生物質及び化学療法剤
のような薬物、工業汚染物質、香味剤、食品添加剤、食
品汚染物質及び／又はそれらの代謝産物もしくは誘導体
である。
上記分類では、抗体を形成し得るいずれかの分子につ
いて分析するために本発明の固相拡散試験法が利用可能
である場合において、明らかに不十分である。更に、本
発明の固相拡散試験法は抗体分子を定性定量するために
使用することもできる。
いて分析するために本発明の固相拡散試験法が利用可能
である場合において、明らかに不十分である。更に、本
発明の固相拡散試験法は抗体分子を定性定量するために
使用することもできる。
本発明の固相拡散試験法において使用可能な抗体は、
分析すべき抗原を、それが免疫原である場合には、生き
た脊索動物に導入することによって産生することができ
る。免疫原の導入に応答して産生される抗体は、免疫原
を覆ってそれを解毒し、それを溶液から沈降させ、又は
単にそれに結合するタンパク質である。抗体タンパク質
は、免疫原がタンパク質の空間配置と一致するように幾
何学的に配列されたレセプターを形成する。ハプテンの
場合では、余分の工程が抗体の産生のために必要とされ
る。ハプテンは、生きた脊索動物に導入される前に免疫
原担体に結合されなければならない。ハプテンからの抗
体産生方法は当業者において周知である。
分析すべき抗原を、それが免疫原である場合には、生き
た脊索動物に導入することによって産生することができ
る。免疫原の導入に応答して産生される抗体は、免疫原
を覆ってそれを解毒し、それを溶液から沈降させ、又は
単にそれに結合するタンパク質である。抗体タンパク質
は、免疫原がタンパク質の空間配置と一致するように幾
何学的に配列されたレセプターを形成する。ハプテンの
場合では、余分の工程が抗体の産生のために必要とされ
る。ハプテンは、生きた脊索動物に導入される前に免疫
原担体に結合されなければならない。ハプテンからの抗
体産生方法は当業者において周知である。
本発明の固相拡散試験法において使用可能な抗体のも
う１つの供給源はモノクローナル抗体である。モノクロ
ーナル抗体を産生する技術では、脾臓リンパ球と骨髄初
代腫瘍の悪性細胞とを融合させなければならない。この
方法では、リンパ球及び骨髄腫細胞系双方の特徴を有す
る単一の融合細胞ハイブリッド又はクローンから発生し
たハイブリッド細胞系を産生する。（特定の抗原で処理
された動物から採取される）リンパ球と同様に、ハイブ
リドーマと称される融合ハイブリッドは抗原に対し特異
的な単一種の免疫グロブリンを分泌し；しかも、骨髄細
胞系と同様に、ハイブリッド細胞系は不死である。これ
ら２つの特徴の組合せは、従来の抗血清が使用されてい
る研究及び医学の分野に大きなインパクトを与えた。接
種動物から得られる抗血清は、同一に再度産生すること
のできない様々な抗体の混合物であるが、モノクローナ
ル抗体は単一種でかつ特異性の高い免疫グロブリンであ
る。ハイブリドーマから分泌される単一種の免疫グロブ
リンは、多数の抗原決定基をもつ複合分子たる抗原上の
１つ、しかもたった１つの抗原決定基のみに対して特異
的である〔シー・ミルシュタイン，サイエンティフィッ
ク・アメリカン，第243巻，第４号，第66−74頁,1980年
（C.Milstein,Scientific American,243（４）:66−74,
1980）参照〕。
う１つの供給源はモノクローナル抗体である。モノクロ
ーナル抗体を産生する技術では、脾臓リンパ球と骨髄初
代腫瘍の悪性細胞とを融合させなければならない。この
方法では、リンパ球及び骨髄腫細胞系双方の特徴を有す
る単一の融合細胞ハイブリッド又はクローンから発生し
たハイブリッド細胞系を産生する。（特定の抗原で処理
された動物から採取される）リンパ球と同様に、ハイブ
リドーマと称される融合ハイブリッドは抗原に対し特異
的な単一種の免疫グロブリンを分泌し；しかも、骨髄細
胞系と同様に、ハイブリッド細胞系は不死である。これ
ら２つの特徴の組合せは、従来の抗血清が使用されてい
る研究及び医学の分野に大きなインパクトを与えた。接
種動物から得られる抗血清は、同一に再度産生すること
のできない様々な抗体の混合物であるが、モノクローナ
ル抗体は単一種でかつ特異性の高い免疫グロブリンであ
る。ハイブリドーマから分泌される単一種の免疫グロブ
リンは、多数の抗原決定基をもつ複合分子たる抗原上の
１つ、しかもたった１つの抗原決定基のみに対して特異
的である〔シー・ミルシュタイン，サイエンティフィッ
ク・アメリカン，第243巻，第４号，第66−74頁,1980年
（C.Milstein,Scientific American,243（４）:66−74,
1980）参照〕。
抗原−酵素免疫複合体（又は、抗体−酵素複合体）は
標識剤として作用する。可溶性抗原又は抗体−酵素複合
体の産生及び用途は、シュターンバーガーら、ジャーナ
ル・オブ・ヒストケミストリー及びサイトケミストリ
ー，第18巻，第315頁,1970年（Sternberger et al.,in
Journal of Histochemistry and Cytochemistry,18:315
（1970）〕に記載されている。望ましい酵素は、高い交
代率を有し、様々なリガンドと容易に結合することがで
き、非特異的相互反応に対し比較的感受性が低く、高分
子試薬により調節される交代率を有し、特に電磁放射線
の吸収又は放出によって可視的になる生成物を生じるよ
うな酵素である。本発明の固相拡散試験法における使用
に適した酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼ（シグマ・
ケミカル・カンパニー社，セントルイス，ミズーリー
州）である。好ましい酵素は様々な化合物と容易に複合
化することができる。標識として使用可能な他の酵素
は、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレア
ーゼ、グルコース−６−リン産デヒドロゲナーゼ、リゾ
チーム及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼである。
標識剤として作用する。可溶性抗原又は抗体−酵素複合
体の産生及び用途は、シュターンバーガーら、ジャーナ
ル・オブ・ヒストケミストリー及びサイトケミストリ
ー，第18巻，第315頁,1970年（Sternberger et al.,in
Journal of Histochemistry and Cytochemistry,18:315
（1970）〕に記載されている。望ましい酵素は、高い交
代率を有し、様々なリガンドと容易に結合することがで
き、非特異的相互反応に対し比較的感受性が低く、高分
子試薬により調節される交代率を有し、特に電磁放射線
の吸収又は放出によって可視的になる生成物を生じるよ
うな酵素である。本発明の固相拡散試験法における使用
に適した酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼ（シグマ・
ケミカル・カンパニー社，セントルイス，ミズーリー
州）である。好ましい酵素は様々な化合物と容易に複合
化することができる。標識として使用可能な他の酵素
は、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレア
ーゼ、グルコース−６−リン産デヒドロゲナーゼ、リゾ
チーム及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼである。
物質間で特異的相互反応が生じるいずれの系も本発明
の固相拡散試験法において使用することができる。本発
明で使用される抗体／抗原系以外の系の例としては、レ
クチン／糖系、酵素／基質、DNA及びRNA分子のハイブリ
ッド形成、ビオチン／アジビン系及びブドウ球菌タンパ
ク質A/免疫グロブリン系がある。
の固相拡散試験法において使用することができる。本発
明で使用される抗体／抗原系以外の系の例としては、レ
クチン／糖系、酵素／基質、DNA及びRNA分子のハイブリ
ッド形成、ビオチン／アジビン系及びブドウ球菌タンパ
ク質A/免疫グロブリン系がある。
便宜上、固相拡散試験用の試薬は、所用の範囲内で分
析感度を実質的に最適にするため、試薬が規定比率で収
納されたキットとして提供することができる。乾燥試薬
を規定容積に再調製すると、試薬濃度は適切なレベルに
達する。
析感度を実質的に最適にするため、試薬が規定比率で収
納されたキットとして提供することができる。乾燥試薬
を規定容積に再調製すると、試薬濃度は適切なレベルに
達する。
本発明は下記例によって説明されるが、下記例は本発
明をそこに記載された具体的な方法のみに限定するとい
うように解釈されるべきものではない。
明をそこに記載された具体的な方法のみに限定するとい
うように解釈されるべきものではない。
例１ 下記例は、少量の不活性西洋ワサビペルオキシダーゼ
を検出するために利用された本発明の固相拡散試験法に
ついて説明するものである。これは抗体／抗原相互反応
に基づく競合試験の例であって、そこでは競合的化合物
自体が標識として使用されている。抗ペルオキシダーゼ
抗体は固相に結合せしめられるが、この例における固相
はニトロセルロース紙である。不活性西洋ワサビペルオ
キシダーゼは抗原であり、活性ペルオキシダーゼはこの
試験において標識抗原に相当する。
を検出するために利用された本発明の固相拡散試験法に
ついて説明するものである。これは抗体／抗原相互反応
に基づく競合試験の例であって、そこでは競合的化合物
自体が標識として使用されている。抗ペルオキシダーゼ
抗体は固相に結合せしめられるが、この例における固相
はニトロセルロース紙である。不活性西洋ワサビペルオ
キシダーゼは抗原であり、活性ペルオキシダーゼはこの
試験において標識抗原に相当する。
不活性西洋ワサビペルオキシダーゼの高濃度溶液を調
製することにより標準曲線を作成する。活性ペルオキシ
ダーゼ（この場合は標識）の濃度を以下の如く測定し
た。ペルオキシダーゼ1mg/mlの数種の希釈溶液を10％ウ
サギ血清及びリン酸緩衝液と混合し（試験溶液ではな
い）、処理されたニトロセルロースに塗布した。測定可
能な拡散パターンを与えた最大の希釈液をこの例におい
て標識として使用した。不活性西洋ワザビペルオキシダ
ーゼ溶液（50μg/ml）を10％ウサギ血清含有リン酸緩衝
液で連続的に希釈する。不活性西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ溶液各2.5μを活性ペルオキシダーゼ（この例に
おける標識抗原）0.3μｇ含有溶液2.5μと混合する。
溶液５μを次いでキャピラリー管から結合抗ペルオキ
シダーゼ抗体含有ニトロセルロース紙に慎重に塗布す
る。溶液はキャピラリー管からニトロセルロース紙中に
拡散し、円形の拡散パターンを形成する。ニトロセルロ
ース紙を次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（４−
クロロ−１−ナフトール及び過酸化水素）溶液中に浸漬
し、青色円が展開するまでインキュベートする。図３に
示されているように、円形拡散パターン面積は溶液中の
未標識抗原量に比例する。本発明によれば、単一の標準
曲線のみが所定の抗体及び標識抗原試薬の組合せについ
て作成されなければならないことが判明した。本発明の
固相拡散試験法の詳細な態様は以下のとおりである： ニトロセルロース紙〔バイオ−ラッド社（Bio−Ra
d），ロックビルセンター，ニューヨーク州,No.162−01
15,0.45ミクロン〕を約１平方インチ（約6.5cm2）の大
きさに裁断する。これら各片を次いでリン酸緩衝液（pH
7.2）で10分間洗浄する。洗浄された紙を次いでウサギ
抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンＧ〔バッチ（Batc
h）Cl,アファニティークロマトグラフィー精製〕10mg/m
l含有溶液中４℃で12時間インキュベートする。12時間
のインキュベート後、紙を再びリン酸緩衝液中で10分間
洗浄する。紙を次いで５％血清アルブミン溶液中で２時
間インキュベートする。この工程はすべての非特異的結
合部位を飽和させるために行われる。紙を再びリン酸緩
衝液中で洗浄する。蒸留水で短時間洗浄した後、膜片を
風乾し、給湿室中室温で保存する。
製することにより標準曲線を作成する。活性ペルオキシ
ダーゼ（この場合は標識）の濃度を以下の如く測定し
た。ペルオキシダーゼ1mg/mlの数種の希釈溶液を10％ウ
サギ血清及びリン酸緩衝液と混合し（試験溶液ではな
い）、処理されたニトロセルロースに塗布した。測定可
能な拡散パターンを与えた最大の希釈液をこの例におい
て標識として使用した。不活性西洋ワザビペルオキシダ
ーゼ溶液（50μg/ml）を10％ウサギ血清含有リン酸緩衝
液で連続的に希釈する。不活性西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ溶液各2.5μを活性ペルオキシダーゼ（この例に
おける標識抗原）0.3μｇ含有溶液2.5μと混合する。
溶液５μを次いでキャピラリー管から結合抗ペルオキ
シダーゼ抗体含有ニトロセルロース紙に慎重に塗布す
る。溶液はキャピラリー管からニトロセルロース紙中に
拡散し、円形の拡散パターンを形成する。ニトロセルロ
ース紙を次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（４−
クロロ−１−ナフトール及び過酸化水素）溶液中に浸漬
し、青色円が展開するまでインキュベートする。図３に
示されているように、円形拡散パターン面積は溶液中の
未標識抗原量に比例する。本発明によれば、単一の標準
曲線のみが所定の抗体及び標識抗原試薬の組合せについ
て作成されなければならないことが判明した。本発明の
固相拡散試験法の詳細な態様は以下のとおりである： ニトロセルロース紙〔バイオ−ラッド社（Bio−Ra
d），ロックビルセンター，ニューヨーク州,No.162−01
15,0.45ミクロン〕を約１平方インチ（約6.5cm2）の大
きさに裁断する。これら各片を次いでリン酸緩衝液（pH
7.2）で10分間洗浄する。洗浄された紙を次いでウサギ
抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンＧ〔バッチ（Batc
h）Cl,アファニティークロマトグラフィー精製〕10mg/m
l含有溶液中４℃で12時間インキュベートする。12時間
のインキュベート後、紙を再びリン酸緩衝液中で10分間
洗浄する。紙を次いで５％血清アルブミン溶液中で２時
間インキュベートする。この工程はすべての非特異的結
合部位を飽和させるために行われる。紙を再びリン酸緩
衝液中で洗浄する。蒸留水で短時間洗浄した後、膜片を
風乾し、給湿室中室温で保存する。
この例において使用された抗原は不活性西洋ワサビペ
ルオキシダーゼであった。この抗原を、西洋ワサビペル
オキシダーゼ（VI型，シグマ・ケミカル・カンパニー
社，セントルイス，ミズーリー州,No.P−8375,ロット43
F−9589）1.5mgをリン酸緩衝液に溶解することにより調
製する。酵素を、最終濃度1.0％となるまで過酸化水素
を加えることにより不活性化し、次いでリン酸緩衝液に
対して一夜透析する。
ルオキシダーゼであった。この抗原を、西洋ワサビペル
オキシダーゼ（VI型，シグマ・ケミカル・カンパニー
社，セントルイス，ミズーリー州,No.P−8375,ロット43
F−9589）1.5mgをリン酸緩衝液に溶解することにより調
製する。酵素を、最終濃度1.0％となるまで過酸化水素
を加えることにより不活性化し、次いでリン酸緩衝液に
対して一夜透析する。
未知西洋ワサビペルオキシダーゼ抗原含有試料2.5μ
を活性ペルオキシダーゼ0.3μｇ含有溶液2.5μと混
合する。溶液５μをキャピラリーピペットから拡散さ
せることにより、抗体処理ニトロセルロース紙に慎重に
塗布した。基室溶液は次のようにして調製される:4−ク
ロロ−１−ナフトール（バイオ−ラッド社，ロックビル
センター，ニューヨーク州,No.170−6534）15mgをメタ
ノール5mlに溶解する。この溶液に蒸留水25ml及びメタ
ノール15μを加える。この溶液に蒸留水25ml及び30％
過酸化水素15μを加える。青色円形パターンは数分後
に展開する。
を活性ペルオキシダーゼ0.3μｇ含有溶液2.5μと混
合する。溶液５μをキャピラリーピペットから拡散さ
せることにより、抗体処理ニトロセルロース紙に慎重に
塗布した。基室溶液は次のようにして調製される:4−ク
ロロ−１−ナフトール（バイオ−ラッド社，ロックビル
センター，ニューヨーク州,No.170−6534）15mgをメタ
ノール5mlに溶解する。この溶液に蒸留水25ml及びメタ
ノール15μを加える。この溶液に蒸留水25ml及び30％
過酸化水素15μを加える。青色円形パターンは数分後
に展開する。
試験溶液中の抗原濃度を調べるためには、円形パター
ン面積を測定する。標準曲線を利用することにより、溶
液中の正確な抗原濃度値を求めることができる。
ン面積を測定する。標準曲線を利用することにより、溶
液中の正確な抗原濃度値を求めることができる。
図３は拡散パターン面積と試験試料中の未標識不活性
ペルオキシダーゼ濃度との相関々係を示している。
ペルオキシダーゼ濃度との相関々係を示している。
例２ この例は溶液中低濃度の抗生物質ゲンタマイシンを検
出されるために利用される本発明の固相拡散試験法につ
いて説明するものである。これ抗原／抗体相互反応に基
づく競合試験の例であり、ここでは試験物質はハプテン
で、標識化合物は標識が結合した担体に結合せしめられ
たハプテンからなる。
出されるために利用される本発明の固相拡散試験法につ
いて説明するものである。これ抗原／抗体相互反応に基
づく競合試験の例であり、ここでは試験物質はハプテン
で、標識化合物は標識が結合した担体に結合せしめられ
たハプテンからなる。
ニトロセルロース紙（バイオ−ラッド社，ロックビル
センター，ニューヨーク州,No.162−0115,0.45ミクロ
ン）を約１平方インチ（約6.5cm2）の大きさに裁断す
る。これら各片を次いでリン酸緩衝液（pH7.2）で10分
間洗浄する。洗浄された紙を次いで、リン酸緩衝液で1:
3に希釈されたヤギ抗ゲンタマイシン抗体含有ヤギ全血
清中４℃で12時間インキュベートする。飽和工程は、希
釈ヤギ血清が高タンパク質濃度であることから、この例
においては不必要である。紙を次いでリン酸緩衝液で洗
浄する。蒸留水で短時間洗浄した後、膜片を風乾する。
センター，ニューヨーク州,No.162−0115,0.45ミクロ
ン）を約１平方インチ（約6.5cm2）の大きさに裁断す
る。これら各片を次いでリン酸緩衝液（pH7.2）で10分
間洗浄する。洗浄された紙を次いで、リン酸緩衝液で1:
3に希釈されたヤギ抗ゲンタマイシン抗体含有ヤギ全血
清中４℃で12時間インキュベートする。飽和工程は、希
釈ヤギ血清が高タンパク質濃度であることから、この例
においては不必要である。紙を次いでリン酸緩衝液で洗
浄する。蒸留水で短時間洗浄した後、膜片を風乾する。
ゲンタマイシンをカルボジイミドカップリング処理に
よってウシオロソムコイドに化学的に結合させるが、そ
の処理法は当業者に周知である。ゲンタマイシンをオロ
ソムコイドに結合させた後、西洋ワサビペルオキシダー
ゼを次いでグルタルアルデヒド法によりオロソムコイド
タンパク質と結合させる〔エス・アブラミーズ，イムノ
ケミストリー，第16巻，第43頁,1969年（S.Arrameas,Im
munochemistry,Vol.16:43,1969）参照〕。この操作によ
り、オロソムコイド−ゲンタマイシン−西洋ワサビペル
オキシダーゼ複合体からなる複合体を生ずる。
よってウシオロソムコイドに化学的に結合させるが、そ
の処理法は当業者に周知である。ゲンタマイシンをオロ
ソムコイドに結合させた後、西洋ワサビペルオキシダー
ゼを次いでグルタルアルデヒド法によりオロソムコイド
タンパク質と結合させる〔エス・アブラミーズ，イムノ
ケミストリー，第16巻，第43頁,1969年（S.Arrameas,Im
munochemistry,Vol.16:43,1969）参照〕。この操作によ
り、オロソムコイド−ゲンタマイシン−西洋ワサビペル
オキシダーゼ複合体からなる複合体を生ずる。
オロソムコイド−ゲンタマイシン−西洋ワサビペルオ
キシダーゼ複合体をアフィニティークロマトグラフィー
処理により精製する。臭化シアン活性化セファロース4B
〔ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社（Pharmacia
Fine Chmeicals,アップシュラ，スウェーデン〕1gを1mM
HClで洗浄する。ゲンタマイシン−オロソムコイド−
西洋ワサビペルオキシダーゼ10mg/mlを次いで製造者用
標準プロトコールによりセファロース4Bに共有結合させ
る。得られたゲルしかる後小さなクロマトグラフィー用
カラム〔エコノモ・カラム（Economo column），バイオ
−ラッド社〕に注入する。ヤギ抗ゲンタマイシン抗体を
次いで、リン酸緩衝液中1:10希釈ヤギ抗ゲンタマイシン
血清5mlをカラムに通過させることによってカラムに吸
着させる。抗体をしかる後、0.02Mグルタルアルデヒド
溶液と一緒に室温で２時間インキュベートすることによ
り、固相に共有結合させる。グルタルアルデヒドの遊離
結合部位をグリシン緩衝剤で飽和し、カラムをしかる後
大量のリン酸緩衝液で洗浄する。
キシダーゼ複合体をアフィニティークロマトグラフィー
処理により精製する。臭化シアン活性化セファロース4B
〔ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社（Pharmacia
Fine Chmeicals,アップシュラ，スウェーデン〕1gを1mM
HClで洗浄する。ゲンタマイシン−オロソムコイド−
西洋ワサビペルオキシダーゼ10mg/mlを次いで製造者用
標準プロトコールによりセファロース4Bに共有結合させ
る。得られたゲルしかる後小さなクロマトグラフィー用
カラム〔エコノモ・カラム（Economo column），バイオ
−ラッド社〕に注入する。ヤギ抗ゲンタマイシン抗体を
次いで、リン酸緩衝液中1:10希釈ヤギ抗ゲンタマイシン
血清5mlをカラムに通過させることによってカラムに吸
着させる。抗体をしかる後、0.02Mグルタルアルデヒド
溶液と一緒に室温で２時間インキュベートすることによ
り、固相に共有結合させる。グルタルアルデヒドの遊離
結合部位をグリシン緩衝剤で飽和し、カラムをしかる後
大量のリン酸緩衝液で洗浄する。
アフィニティーカラムは次いでゲンタマイシン−オロ
ソムコイド−ペルオキシダーゼ複合体の精製のために使
用される。pH2.5の0.1M HCl及び0.2Mグリシンを標識複
合体の溶出用に使用する。溶出液のpHは固体トリス（ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，シグマ・ケミ
カル・カンパニー社，セントルイス）を加えることによ
り直ちに修正される。得られた精製ゲンタマイシン−オ
ロソムコイド−ペルオキシダーゼ複合体溶液を次いで保
存前にリン酸緩衝液に対して透析する。
ソムコイド−ペルオキシダーゼ複合体の精製のために使
用される。pH2.5の0.1M HCl及び0.2Mグリシンを標識複
合体の溶出用に使用する。溶出液のpHは固体トリス（ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，シグマ・ケミ
カル・カンパニー社，セントルイス）を加えることによ
り直ちに修正される。得られた精製ゲンタマイシン−オ
ロソムコイド−ペルオキシダーゼ複合体溶液を次いで保
存前にリン酸緩衝液に対して透析する。
標準曲線作成用の溶液は、リン酸緩衝液及び10％正常
ウサギ血清に６種の異なるゲンタマイシン希釈液を加え
て調製される。標準曲線におけるゲンタマイシン濃度は
0.4μg/ml〜12.4μg/mlの範囲である。標識ゲンタマシ
イン−オロソムコイド−ペルオキシダーゼ複合体のタン
パク質濃度は約0.3mgであって、280nmにおける溶液の吸
光度から調べられる。核希釈液５μキャピラリー管に
よりニトロセルロース紙上に塗布する。試験液がニトロ
セルロース紙中に拡散した後、基質溶液に浸漬させる。
基質溶液は次のようにして調製される:4−クロロ−１−
ナフトール（バイオ−ラッド社，ロックビルセントレ，
ニューヨーク州,No.170−6534）15μをメタノール5ml
に溶解する。この溶液に蒸留水25ml及び30％過酸化水素
15μを加えた。青色円形パターンが数分後に展開す
る。
ウサギ血清に６種の異なるゲンタマイシン希釈液を加え
て調製される。標準曲線におけるゲンタマイシン濃度は
0.4μg/ml〜12.4μg/mlの範囲である。標識ゲンタマシ
イン−オロソムコイド−ペルオキシダーゼ複合体のタン
パク質濃度は約0.3mgであって、280nmにおける溶液の吸
光度から調べられる。核希釈液５μキャピラリー管に
よりニトロセルロース紙上に塗布する。試験液がニトロ
セルロース紙中に拡散した後、基質溶液に浸漬させる。
基質溶液は次のようにして調製される:4−クロロ−１−
ナフトール（バイオ−ラッド社，ロックビルセントレ，
ニューヨーク州,No.170−6534）15μをメタノール5ml
に溶解する。この溶液に蒸留水25ml及び30％過酸化水素
15μを加えた。青色円形パターンが数分後に展開す
る。
図４は、拡散パターン面積と試験試料中の未標識ゲン
タマイシン濃度との相関々係を示している。
タマイシン濃度との相関々係を示している。
例３ 下記例は、低濃度の薬物テオフィリンを検出するため
に利用される本発明の固相拡散試験法について説明する
ものである。これは抗原−抗体相互反応のもう１つの例
であって、ここでは試験物質は低分子量ハプテンで、標
識化合物は西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したハプ
テンからなる。この試験では更に、不均一抗体とは異な
るモノクローナル抗体を使用する。
に利用される本発明の固相拡散試験法について説明する
ものである。これは抗原−抗体相互反応のもう１つの例
であって、ここでは試験物質は低分子量ハプテンで、標
識化合物は西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したハプ
テンからなる。この試験では更に、不均一抗体とは異な
るモノクローナル抗体を使用する。
ニトロセルロース未（バイオ−ラッド社，ロックビル
セントレ，ニューヨーク州,No.162−0115,0.45ミクロ
ン）は、例１および２で記載されたようにして調製され
る。洗浄された紙を次いでテオフィリンに対するマウス
モノクローナル抗体10μg/ml及びウシ血清アルブミン
（シグマ・ケミカル・カンパニー社，セントルイス）2m
gの混合物含有リン酸緩衝液中４℃で一夜インキュベー
トする。紙をしかる後リン酸緩衝液で洗浄し、風乾し、
給湿室中で保存する。
セントレ，ニューヨーク州,No.162−0115,0.45ミクロ
ン）は、例１および２で記載されたようにして調製され
る。洗浄された紙を次いでテオフィリンに対するマウス
モノクローナル抗体10μg/ml及びウシ血清アルブミン
（シグマ・ケミカル・カンパニー社，セントルイス）2m
gの混合物含有リン酸緩衝液中４℃で一夜インキュベー
トする。紙をしかる後リン酸緩衝液で洗浄し、風乾し、
給湿室中で保存する。
テオフィリンを西洋ワサビペルオキシダーゼに結合す
る〔テオフィリン放射線免疫検定法：抗原の合成と抗血
清の特徴，シー・イー・クールら、リサーチ・コミュニ
ケーションズ・イン・ケミカル・パソロジー・アンド・
ファーマコロジー，第13巻，第３号,1976年（theophyll
ine radioimmnoassay:Synthesis of Antigen and Chara
cteriztion Of Antiserum,C.E.Coole,et,al.,Research
Communications in Chemical Pathology and Pharmacol
ogy,Vol 13.No.3,1976）参照〕。テオフィリン−西洋ワ
サビペルオキシダーゼ複合体を、モノクローナル抗テオ
フィリン抗体を用い、例２で記載されたものと同様の方
法により、アファニティークロマトグラフィーによって
精製する。
る〔テオフィリン放射線免疫検定法：抗原の合成と抗血
清の特徴，シー・イー・クールら、リサーチ・コミュニ
ケーションズ・イン・ケミカル・パソロジー・アンド・
ファーマコロジー，第13巻，第３号,1976年（theophyll
ine radioimmnoassay:Synthesis of Antigen and Chara
cteriztion Of Antiserum,C.E.Coole,et,al.,Research
Communications in Chemical Pathology and Pharmacol
ogy,Vol 13.No.3,1976）参照〕。テオフィリン−西洋ワ
サビペルオキシダーゼ複合体を、モノクローナル抗テオ
フィリン抗体を用い、例２で記載されたものと同様の方
法により、アファニティークロマトグラフィーによって
精製する。
標準曲線作成用の溶液は、リン酸緩衝液及び10％ウサ
ギ血清中に６種の異なるテオフィリン希釈液を含有させ
て調製される。テオフィリン濃度は1.6〜25.6μg/mlの
範囲である。10％ウサギ血清中標識抗原の1:2希釈液2.5
μ及び各希釈液2.5μを含有した混合物を、キャピ
ラリー管でニトロセルロース紙上に塗布する。ニトロセ
ルロース紙中に液体が拡散した後、紙を上記基質溶液中
に浸漬し、発色反応を進行させる。拡散パターンの直径
を次いで測定し、拡散パターン面積を計算する。
ギ血清中に６種の異なるテオフィリン希釈液を含有させ
て調製される。テオフィリン濃度は1.6〜25.6μg/mlの
範囲である。10％ウサギ血清中標識抗原の1:2希釈液2.5
μ及び各希釈液2.5μを含有した混合物を、キャピ
ラリー管でニトロセルロース紙上に塗布する。ニトロセ
ルロース紙中に液体が拡散した後、紙を上記基質溶液中
に浸漬し、発色反応を進行させる。拡散パターンの直径
を次いで測定し、拡散パターン面積を計算する。
図５は、拡散パターン面積と試験試料中の未標識テオ
フィリン濃度との相関々係を示している。
フィリン濃度との相関々係を示している。
例４ 下記例は、ブドウ球菌タンパク質Ａと反応する低濃度
のヒト免疫グロブリンを検出するために利用される本発
明の固相拡散試験法について説明するものである。これ
はリガンド（免疫グロブリン）及びレセプター（タンパ
ク質Ａ）の相互反応に基づく“サンドイッチ法”の例で
ある。ヒト免疫グロブリンに対するペルオキシダーゼ標
識ウサギ抗体は遊離抗体として使用される。
のヒト免疫グロブリンを検出するために利用される本発
明の固相拡散試験法について説明するものである。これ
はリガンド（免疫グロブリン）及びレセプター（タンパ
ク質Ａ）の相互反応に基づく“サンドイッチ法”の例で
ある。ヒト免疫グロブリンに対するペルオキシダーゼ標
識ウサギ抗体は遊離抗体として使用される。
ニトロセルロース紙（バイオ−ラッド社，ロックビル
センター，ニューヨークン州,No.162−0115,0.45ミクロ
ン）を約１平方インチ（約6.5cm2）の大きさに裁断す
る。これら各片を次いでリン酸緩衝液（pH7.2）で10分
間洗浄する。洗浄された紙を次いでブドウ球菌タンパク
質Ａ（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社，アップ
シュラ，スウェーデン）0.01mg/ml及びウシ血清アルブ
ミン（シグマ・ケミカル・カンパニー社，セントルイ
ス，ミズーリー州）1mg/ml含有リン酸緩衝液中４℃で12
時間インキュベートする。12時間のインキュベート後、
紙を再びリン酸緩衝液中で10分間洗浄する。紙を次いで
５％ウシ血清アルブミン溶液中で２時間インキュベート
する。このインキュベートは非特異的結合部位を飽和す
るために行なわれる。グリシンインキュベートはすべて
の非特異的結合部位を飽和するために行なわれる。紙を
再びリン酸緩衝液で洗浄する。蒸留水で短時間洗浄した
語、膜片を風乾する。
センター，ニューヨークン州,No.162−0115,0.45ミクロ
ン）を約１平方インチ（約6.5cm2）の大きさに裁断す
る。これら各片を次いでリン酸緩衝液（pH7.2）で10分
間洗浄する。洗浄された紙を次いでブドウ球菌タンパク
質Ａ（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社，アップ
シュラ，スウェーデン）0.01mg/ml及びウシ血清アルブ
ミン（シグマ・ケミカル・カンパニー社，セントルイ
ス，ミズーリー州）1mg/ml含有リン酸緩衝液中４℃で12
時間インキュベートする。12時間のインキュベート後、
紙を再びリン酸緩衝液中で10分間洗浄する。紙を次いで
５％ウシ血清アルブミン溶液中で２時間インキュベート
する。このインキュベートは非特異的結合部位を飽和す
るために行なわれる。グリシンインキュベートはすべて
の非特異的結合部位を飽和するために行なわれる。紙を
再びリン酸緩衝液で洗浄する。蒸留水で短時間洗浄した
語、膜片を風乾する。
標準曲線は５％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液
に６種のヒト免疫グロブリンＧ希釈液を混合して調製さ
れる。標準曲線におれる免疫グロブリンＧ〔ベーリンガ
ー社（Boehringer）、マンハイム，西ドイツ〕濃度は32
μg/ml〜1mg/mlの範囲である。各希釈液10μ含有溶液
をキャピラリー管によりニトロセルロース紙上に塗布し
た。試験液がニトロセルロース紙中に拡散した後、紙を
次いで0.5％ツイーン（Tween）20（モノラウリン酸ポリ
オキシエチレンソルビタン，シグマ・ケミカル・カンパ
ニー社，セントルイス，ミズーリー州）含有リン酸緩衝
液で３分間洗浄する。しかる後、ヒトIgG Ｈ及びＬ鎖
（ダコ・アキュレート・ケミカルズ社（Dako Accurate
Chemicals）〕に特異的なベルオキシダーゼ標識抗体を
サンドイッチの第２層として塗布する。これらの標識抗
体を１％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液1:1000に
希釈する。
に６種のヒト免疫グロブリンＧ希釈液を混合して調製さ
れる。標準曲線におれる免疫グロブリンＧ〔ベーリンガ
ー社（Boehringer）、マンハイム，西ドイツ〕濃度は32
μg/ml〜1mg/mlの範囲である。各希釈液10μ含有溶液
をキャピラリー管によりニトロセルロース紙上に塗布し
た。試験液がニトロセルロース紙中に拡散した後、紙を
次いで0.5％ツイーン（Tween）20（モノラウリン酸ポリ
オキシエチレンソルビタン，シグマ・ケミカル・カンパ
ニー社，セントルイス，ミズーリー州）含有リン酸緩衝
液で３分間洗浄する。しかる後、ヒトIgG Ｈ及びＬ鎖
（ダコ・アキュレート・ケミカルズ社（Dako Accurate
Chemicals）〕に特異的なベルオキシダーゼ標識抗体を
サンドイッチの第２層として塗布する。これらの標識抗
体を１％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液1:1000に
希釈する。
リン酸緩衝液及び0.5％ツイーン20を用いる第二洗浄
工程後、紙を次いで基質溶液中に浸漬する。基質溶液は
次のようにして調製される:4−クロロ−１−ナフトール
（バイオ−ラッド社，ロックビルセンター，ニューヨー
ク州,No.170−6534）15μｇをメタノール5mlに溶解し
た。この溶液に蒸留水25ml及び30％過酸化水素15μを
加える。青色円形パターンは数分後に展開する。
工程後、紙を次いで基質溶液中に浸漬する。基質溶液は
次のようにして調製される:4−クロロ−１−ナフトール
（バイオ−ラッド社，ロックビルセンター，ニューヨー
ク州,No.170−6534）15μｇをメタノール5mlに溶解し
た。この溶液に蒸留水25ml及び30％過酸化水素15μを
加える。青色円形パターンは数分後に展開する。
図６で示されているように、円形拡散パターンの面積
は試験溶液中の遊離免疫グロブリン量に比例する。本発
明によれば、単一の標準曲線のみが所定の調製ニトロセ
ルロース試験物質及び標識抗体の組合せについて作成さ
れなければならないことが判明した。
は試験溶液中の遊離免疫グロブリン量に比例する。本発
明によれば、単一の標準曲線のみが所定の調製ニトロセ
ルロース試験物質及び標識抗体の組合せについて作成さ
れなければならないことが判明した。
例５ 薄層クロマトグラフィー用の市販固相支持体が本発明
の固相拡散試験法に使用することができる。市販薄層ク
ロマトグラフィー用支持体は極めて薄く、通常約250ミ
クロン厚であり、本発明の固相拡散試験法に容易に適用
することができる。
の固相拡散試験法に使用することができる。市販薄層ク
ロマトグラフィー用支持体は極めて薄く、通常約250ミ
クロン厚であり、本発明の固相拡散試験法に容易に適用
することができる。
抗ゲンタマイシン抗体は下記の方法で固体支持体に共
有結合せしめられる。アビセル（Avicel）Ｆクロマトグ
ラフィー用プレート〔アナルテック社（Analtech,In
c.），ニューアークDE（Newark DE）〕及びセルロース
基質薄層クロマトグラフィー用プレートを、リン酸緩衝
液で1:4に希釈されたヤギ抗ゲンタマイシン血清及び溶
液100mlにつき50μのグルタルアルデヒドと一緒に４
℃で一夜インクベートする。プレートを次いで１％ウシ
血清アルブミン（シグマ・ケミカル・カンパニー社，セ
ントルイス，ミズーリー州）含有リン酸緩衝液、最後に
リン酸緩衝液単独で大規模に洗浄する。プレーチを次い
で風乾する。
有結合せしめられる。アビセル（Avicel）Ｆクロマトグ
ラフィー用プレート〔アナルテック社（Analtech,In
c.），ニューアークDE（Newark DE）〕及びセルロース
基質薄層クロマトグラフィー用プレートを、リン酸緩衝
液で1:4に希釈されたヤギ抗ゲンタマイシン血清及び溶
液100mlにつき50μのグルタルアルデヒドと一緒に４
℃で一夜インクベートする。プレートを次いで１％ウシ
血清アルブミン（シグマ・ケミカル・カンパニー社，セ
ントルイス，ミズーリー州）含有リン酸緩衝液、最後に
リン酸緩衝液単独で大規模に洗浄する。プレーチを次い
で風乾する。
試験は、例２で記載されたゲンタマイシン−西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ−オロソムコイド複合体の４種の希
釈液20μを薄層クロマトグラフィー用プレート上の１
箇所に加えることによって行なわれる。溶液が拡散した
後、酵素基質を前記例で記載されているように加える。
ビペルオキシダーゼ−オロソムコイド複合体の４種の希
釈液20μを薄層クロマトグラフィー用プレート上の１
箇所に加えることによって行なわれる。溶液が拡散した
後、酵素基質を前記例で記載されているように加える。
例６ 下記例は、多工程試験の最終工程としての本発明の固
相拡散試験法の利用例を示すものである。この試験はヒ
ト免疫グロブリンＧの濃度を測定するためのものであ
る。ヒト免疫グロブリンＧ（ダコ・アキュレート・ケミ
カルズ社，ウエストベリー，ニューヨーク州）に対し特
異的なアフィニティー精製ペルオキシダーゼ標識抗体１
μｇを、10％ウサギ血清含有リン酸緩衝液100μ中、
リン酸緩衝液で希釈された1:1000試験血清希釈液10μ
と一緒に室温で15分間インキュベートする。試験物質５
μを次いでウサギ抗ペルオキシダーゼ抗体で被覆され
たニトロセルロース紙に塗布する。このニトロセルロー
ス紙は以下の差異以外例１で記載されたように調製され
た。即ち、ウサギ免疫グロブリンを、上記ペルオキシダ
ーゼ標識抗体１μｇ含有溶液４μが拡散溶液の端部
（約8mm）近くまで拡散するように、正常ウサギ血清で
希釈したのである。このように本発明の固相拡散試験法
のこの変形例の場合において、試験溶液が加えられてい
ない試薬の拡散パターンは最大の面積を有するようにな
る。試験溶液がいずれかのヒト免疫グロブリンＧを含有
する場合は、免疫グロブリンＧ分子は溶液中のペルオキ
シダーゼ標識抗体と反応してしまう。抗体に対し特異的
な１個の免疫グロブリンＧは２以上の免疫グロブリン分
子と反応するため、結合反応処理の結果、免疫グロブリ
ン分子間で不要な架橋結合が生じる。したがって免疫グ
ロブリン特異性抗体の大きな複合体が形成される。この
架橋結合は溶液中の遊離ペルオキシダーゼ標識抗体数を
減少させ、しかも拡散複合体の大きさを増大させてしま
う。その結果、拡散パターンの大きさは、試験溶液中の
ヒト免疫グロブリンＧ濃度が増加するにしたがい、著し
く減少せしめられる。標準曲線は、試験溶液中のヒト免
疫グロブリンＧ濃度を徐々に高めていくことにより作成
される。
相拡散試験法の利用例を示すものである。この試験はヒ
ト免疫グロブリンＧの濃度を測定するためのものであ
る。ヒト免疫グロブリンＧ（ダコ・アキュレート・ケミ
カルズ社，ウエストベリー，ニューヨーク州）に対し特
異的なアフィニティー精製ペルオキシダーゼ標識抗体１
μｇを、10％ウサギ血清含有リン酸緩衝液100μ中、
リン酸緩衝液で希釈された1:1000試験血清希釈液10μ
と一緒に室温で15分間インキュベートする。試験物質５
μを次いでウサギ抗ペルオキシダーゼ抗体で被覆され
たニトロセルロース紙に塗布する。このニトロセルロー
ス紙は以下の差異以外例１で記載されたように調製され
た。即ち、ウサギ免疫グロブリンを、上記ペルオキシダ
ーゼ標識抗体１μｇ含有溶液４μが拡散溶液の端部
（約8mm）近くまで拡散するように、正常ウサギ血清で
希釈したのである。このように本発明の固相拡散試験法
のこの変形例の場合において、試験溶液が加えられてい
ない試薬の拡散パターンは最大の面積を有するようにな
る。試験溶液がいずれかのヒト免疫グロブリンＧを含有
する場合は、免疫グロブリンＧ分子は溶液中のペルオキ
シダーゼ標識抗体と反応してしまう。抗体に対し特異的
な１個の免疫グロブリンＧは２以上の免疫グロブリン分
子と反応するため、結合反応処理の結果、免疫グロブリ
ン分子間で不要な架橋結合が生じる。したがって免疫グ
ロブリン特異性抗体の大きな複合体が形成される。この
架橋結合は溶液中の遊離ペルオキシダーゼ標識抗体数を
減少させ、しかも拡散複合体の大きさを増大させてしま
う。その結果、拡散パターンの大きさは、試験溶液中の
ヒト免疫グロブリンＧ濃度が増加するにしたがい、著し
く減少せしめられる。標準曲線は、試験溶液中のヒト免
疫グロブリンＧ濃度を徐々に高めていくことにより作成
される。
例７ 下記例は、最終生成物を定性定量分析する試験の最終
工程として試験するために適用される本発明の固相拡散
試験法の利用例について説明するものである。このアプ
ローチは、高アフィニティレセプターが思い出されず、
極めて特殊な標識しか使用することができず、又は非常
に高い感度が要求されるような場合の物質のために選択
することができる。
工程として試験するために適用される本発明の固相拡散
試験法の利用例について説明するものである。このアプ
ローチは、高アフィニティレセプターが思い出されず、
極めて特殊な標識しか使用することができず、又は非常
に高い感度が要求されるような場合の物質のために選択
することができる。
例えば、ウェルシュ金（Clostridium perfringens）
毒素に対し十分に高い親和性をもつ抗体を産生すること
は困難であることが判明した。したがって、毒素に対す
る抗体は低親和性であるため、例１〜４で記載されてい
る固相拡散試験法を実施することは困難であろう。固相
拡散試験法のこの変形例として、低親和性抗体を用いて
固相拡散試験法を実施しなければならない。
毒素に対し十分に高い親和性をもつ抗体を産生すること
は困難であることが判明した。したがって、毒素に対す
る抗体は低親和性であるため、例１〜４で記載されてい
る固相拡散試験法を実施することは困難であろう。固相
拡散試験法のこの変形例として、低親和性抗体を用いて
固相拡散試験法を実施しなければならない。
毒素に対するウサギ抗体をペルオキシダーゼで標識
し、しかる後当業者に周知のフアィニティー精製を行な
う。ニトロセルロース紙を西洋ワサビペルオキシダーゼ
に対し特異的な抗体で処理する。一定量のペルオキシダ
ーゼ標識抗体を次いで未知量のウェルシュ菌毒素と一緒
にインキュベートする。標識ウェルシュ菌毒素抗体及び
未知ウェルシュ菌毒素の混合物を次いで不溶性支持体上
の１箇所に塗布し、拡散させる。このように、例６と同
様に、本発明の固相拡散試験法におけるこの変形例で
は、試験溶液が加えられていない試薬の拡散パターンが
最大面積を有するようになる。
し、しかる後当業者に周知のフアィニティー精製を行な
う。ニトロセルロース紙を西洋ワサビペルオキシダーゼ
に対し特異的な抗体で処理する。一定量のペルオキシダ
ーゼ標識抗体を次いで未知量のウェルシュ菌毒素と一緒
にインキュベートする。標識ウェルシュ菌毒素抗体及び
未知ウェルシュ菌毒素の混合物を次いで不溶性支持体上
の１箇所に塗布し、拡散させる。このように、例６と同
様に、本発明の固相拡散試験法におけるこの変形例で
は、試験溶液が加えられていない試薬の拡散パターンが
最大面積を有するようになる。
１個の毒素特異性抗体は２以上の毒素化合物と反応す
るため、抗体−毒素分子として毒素分子及びペルオキシ
ダーゼ標識毒素特異性抗体間で不要な架橋結合を生じ
る。この架橋結合はしたがって溶液中の遊離毒素抗体数
を減少させ、しかも拡散複合体の大きさを増大させる。
このように、毒素−抗体−ペルオキシダーゼ複合体をペ
ルオキシダーゼ特異性抗体処理ニトロセルロース紙に塗
布する場合は、拡散パターンの大きさは、試験溶液中の
毒素分子濃度が増加するにしたがい、著しく縮少せしめ
られる。標準曲線は、試験溶液中のウェルシュ菌毒素濃
度を徐々に高めていみことにより作成される。
るため、抗体−毒素分子として毒素分子及びペルオキシ
ダーゼ標識毒素特異性抗体間で不要な架橋結合を生じ
る。この架橋結合はしたがって溶液中の遊離毒素抗体数
を減少させ、しかも拡散複合体の大きさを増大させる。
このように、毒素−抗体−ペルオキシダーゼ複合体をペ
ルオキシダーゼ特異性抗体処理ニトロセルロース紙に塗
布する場合は、拡散パターンの大きさは、試験溶液中の
毒素分子濃度が増加するにしたがい、著しく縮少せしめ
られる。標準曲線は、試験溶液中のウェルシュ菌毒素濃
度を徐々に高めていみことにより作成される。
例８ 本発明の固相拡散試験法における試験試料は、いくつ
かの方法で不溶性支持体に塗布することができる。試薬
及び不溶性支持体を例４と同様にして調製する。薄いプ
ラスチック製シートは、シートの中心に穿孔を設けて製
造される。孔径は2mmである。プラスチック製シートを
次いで、孔がニトロセルロース紙のほぼ中央に位置する
ように、ニトロセルロース紙上に載置する。試験溶液10
μをプラスチックの孔上にのせる。試験溶液はプラス
チックの孔を通過してニトロセルロース紙中に拡散して
いく。拡散終了後、基質を加え、前記例で記載されてい
るように拡散パターンを測定する。
かの方法で不溶性支持体に塗布することができる。試薬
及び不溶性支持体を例４と同様にして調製する。薄いプ
ラスチック製シートは、シートの中心に穿孔を設けて製
造される。孔径は2mmである。プラスチック製シートを
次いで、孔がニトロセルロース紙のほぼ中央に位置する
ように、ニトロセルロース紙上に載置する。試験溶液10
μをプラスチックの孔上にのせる。試験溶液はプラス
チックの孔を通過してニトロセルロース紙中に拡散して
いく。拡散終了後、基質を加え、前記例で記載されてい
るように拡散パターンを測定する。
例９ この例では、金コロイドが色素型標識として使用され
る。本発明の固相免疫試験法において標識として色素を
用いた場合は、標識を視覚化させるための余分な工程が
必要になるという利点を生ずる。この例は、酵素標識の
代わりに金コロイドが使用されたこと以外、例１で記載
された方法と類似している。
る。本発明の固相免疫試験法において標識として色素を
用いた場合は、標識を視覚化させるための余分な工程が
必要になるという利点を生ずる。この例は、酵素標識の
代わりに金コロイドが使用されたこと以外、例１で記載
された方法と類似している。
西洋ワサビペルオキシダーゼを、ジェイ・デメイ，免
疫細胞化学における金コロイドプローブ、免疫細胞化
学：アプリケーションズ・イン・パソロジー・アンド・
バイオロジー，編集：ジェイ・ポラーク、エス・ファン
・ヌールデン、ジェイ・ライト・アンド・サンズ社、ロ
ンドン，第82−112頁,1983年（J.DeMay,Colloidal Gold
Probes in Immunocytochemistry,Immunocytochemistr
y:Applications in Pathology and Biology,Ed:J.Pola
k,S.Van Noorden,J.Wright ＆ Sons Ltd.,London,pgs 8
2−112,1983）で記載された方法により金コロイドで標
識する。
疫細胞化学における金コロイドプローブ、免疫細胞化
学：アプリケーションズ・イン・パソロジー・アンド・
バイオロジー，編集：ジェイ・ポラーク、エス・ファン
・ヌールデン、ジェイ・ライト・アンド・サンズ社、ロ
ンドン，第82−112頁,1983年（J.DeMay,Colloidal Gold
Probes in Immunocytochemistry,Immunocytochemistr
y:Applications in Pathology and Biology,Ed:J.Pola
k,S.Van Noorden,J.Wright ＆ Sons Ltd.,London,pgs 8
2−112,1983）で記載された方法により金コロイドで標
識する。
ニトロセルロース紙を例１で記載されたように調製す
る。未標識ペルオキシダーゼ測定用の標準曲線を次いで
例１のように作成する。濃度２、４、６、８及び10μg/
mlの未標識ペルオキシダーゼ2.5μを同量の１μg/ml
金コロイド標識ペルオキシダーゼに加え、例１で記載さ
れたようにして標準曲線を作成する。試料の拡散を示す
円は直ちに目で見ることができる。拡散パターンを視覚
化するためには、インクベートを要しない。
る。未標識ペルオキシダーゼ測定用の標準曲線を次いで
例１のように作成する。濃度２、４、６、８及び10μg/
mlの未標識ペルオキシダーゼ2.5μを同量の１μg/ml
金コロイド標識ペルオキシダーゼに加え、例１で記載さ
れたようにして標準曲線を作成する。試料の拡散を示す
円は直ちに目で見ることができる。拡散パターンを視覚
化するためには、インクベートを要しない。
例10 金コロイドを用いる固相免疫試験法の変形例は、定性
結果のみが要求される分析のために実施することができ
る。未標識ペルオキシダーゼ含有試料を、例９と同様に
調製されたペルオキシダーゼに対する金コロイド標識抗
体と一緒にインキュベートする。試料を次いで例１及び
例９のようにニトロセルロース紙に塗布する。その結
果、ニトロセルロース紙上のスポットとして直ちに目で
見ることができ、その方法は１μg/ml未満のペルオキシ
ダーゼに感受性がある。
結果のみが要求される分析のために実施することができ
る。未標識ペルオキシダーゼ含有試料を、例９と同様に
調製されたペルオキシダーゼに対する金コロイド標識抗
体と一緒にインキュベートする。試料を次いで例１及び
例９のようにニトロセルロース紙に塗布する。その結
果、ニトロセルロース紙上のスポットとして直ちに目で
見ることができ、その方法は１μg/ml未満のペルオキシ
ダーゼに感受性がある。
このような定性試験の実用例としては下記の妊娠試験
がある。ヒトコリオゴナドトロピン（HCG）のαサブユ
ニットに対する３種のモノクローナル抗体の混合物を例
９の方法により金コロイドで標識する。ニトロセルロー
ス膜をHCGに対するポリクローナル抗体で飽和させる
が、その抗体はウサギから産生され、しかも当業者に公
知のブドウ球菌タンパク質Ａのカラムでアフィニティー
精製されたものである。膜を次いで約2mm2の孔をもつカ
バーで被覆する。凍結乾燥された金標識抗HCG抗体を含
有する綿棒をHCG含有尿試料で湿潤させる。綿棒をしか
る後直ちに膜カバーと接触させる。尿は膜カバーの孔を
通過して綿棒からニトロセルロース膜中に拡散する。綿
棒を約30秒間同じ箇所に保持し、しかる後取り去る。50
mIU/ml以上のHCG濃度は通常妊娠を示すが、これは赤色
スポットの存在により診断することができる。50mIU/ml
以下のHCG濃度では可視的スポットを発現しない。
がある。ヒトコリオゴナドトロピン（HCG）のαサブユ
ニットに対する３種のモノクローナル抗体の混合物を例
９の方法により金コロイドで標識する。ニトロセルロー
ス膜をHCGに対するポリクローナル抗体で飽和させる
が、その抗体はウサギから産生され、しかも当業者に公
知のブドウ球菌タンパク質Ａのカラムでアフィニティー
精製されたものである。膜を次いで約2mm2の孔をもつカ
バーで被覆する。凍結乾燥された金標識抗HCG抗体を含
有する綿棒をHCG含有尿試料で湿潤させる。綿棒をしか
る後直ちに膜カバーと接触させる。尿は膜カバーの孔を
通過して綿棒からニトロセルロース膜中に拡散する。綿
棒を約30秒間同じ箇所に保持し、しかる後取り去る。50
mIU/ml以上のHCG濃度は通常妊娠を示すが、これは赤色
スポットの存在により診断することができる。50mIU/ml
以下のHCG濃度では可視的スポットを発現しない。
例11 ニトロセルロース紙の下面に負の圧力（例えば、減
圧）を加え、例10の方法を繰り返した。負の圧力はニト
ロセルロース紙中での試験溶液（例えば、尿）の拡散を
高めるために加えられる。ニトロセルロース紙の両面を
粘着テープで覆い、即ち、それを試料及び膜間の接触面
積を制限するカバーとして用いた。テープは、微少表面
上に分析対象物−標識抗体複合体を集中させるために、
膜の両面の対応位置に2mm2の孔を有していた。分析対象
物の存在は、塗布箇所における赤色スポットとして確認
することができた。
圧）を加え、例10の方法を繰り返した。負の圧力はニト
ロセルロース紙中での試験溶液（例えば、尿）の拡散を
高めるために加えられる。ニトロセルロース紙の両面を
粘着テープで覆い、即ち、それを試料及び膜間の接触面
積を制限するカバーとして用いた。テープは、微少表面
上に分析対象物−標識抗体複合体を集中させるために、
膜の両面の対応位置に2mm2の孔を有していた。分析対象
物の存在は、塗布箇所における赤色スポットとして確認
することができた。
例12 拡散を早めるため負の圧力の代わりに正の圧力を加
え、例11の方法を繰り返した。正の圧力は、分析対象物
／金標識抗体混合物0.5ml含有1mlシリンジを用いて加え
られた。被覆された膜は、膜の各面のカバー上におい
て、対応した2mm2の孔を有していた。膜及びその両面の
コバーを標準的無菌フィルター容器に収納したが、フィ
ルター容器の膜は上記膜及びカバーで置き換えられた。
シリンジをフィルター容器に接続し、分析対象物／金標
識抗体混合物を対応した孔に向けて露出した膜部分に注
入した。分析対象物の存在は、塗布箇所における赤色ス
ポットとして確認することができた。
え、例11の方法を繰り返した。正の圧力は、分析対象物
／金標識抗体混合物0.5ml含有1mlシリンジを用いて加え
られた。被覆された膜は、膜の各面のカバー上におい
て、対応した2mm2の孔を有していた。膜及びその両面の
コバーを標準的無菌フィルター容器に収納したが、フィ
ルター容器の膜は上記膜及びカバーで置き換えられた。
シリンジをフィルター容器に接続し、分析対象物／金標
識抗体混合物を対応した孔に向けて露出した膜部分に注
入した。分析対象物の存在は、塗布箇所における赤色ス
ポットとして確認することができた。
例13 拡散を高めるため負の圧力の代わりに親水性物質を用
い、例11の方法を繰り返した。親水性物質を脱カバーの
片面に隣接させた。分析対象物／菌標識抗体混合物を親
水性膜とは反対面上の孔部分にピペットで注入し、孔、
紙から親水性膜中に連続的に拡散させた。分析対象物の
存在は赤色スポットにより視覚化された。
い、例11の方法を繰り返した。親水性物質を脱カバーの
片面に隣接させた。分析対象物／菌標識抗体混合物を親
水性膜とは反対面上の孔部分にピペットで注入し、孔、
紙から親水性膜中に連続的に拡散させた。分析対象物の
存在は赤色スポットにより視覚化された。
例11、12及び13の操作は、試料が塗布される側のみ被
覆された膜を用いて行なわれてもよいと理解すべきであ
る。しかしながら、片面のみが被覆された場合は、分析
対象物／金標識抗体混合物がおそらくより広く拡散する
ようになるであろう。
覆された膜を用いて行なわれてもよいと理解すべきであ
る。しかしながら、片面のみが被覆された場合は、分析
対象物／金標識抗体混合物がおそらくより広く拡散する
ようになるであろう。
カバーの効果は他の手段でも達成可能である、という
ようにも理解すべきである。例えば、ニトロセルロース
紙の表面に直接接触する漏斗を使用することができ、こ
の漏斗は試験溶液を紙上に塗布するための小孔を有して
いる。
ようにも理解すべきである。例えば、ニトロセルロース
紙の表面に直接接触する漏斗を使用することができ、こ
の漏斗は試験溶液を紙上に塗布するための小孔を有して
いる。
例14 例14は、デオキシリボ核酸（DNA）又はリボ核酸（RN
A）の定性定量分析のための固相拡散試験法の利用例に
ついて説明するものである。この例では、試料中のクラ
ミジア・トラコマティス金（Chlamydia trachomatis）D
NAを迅速に定量することができる。
A）の定性定量分析のための固相拡散試験法の利用例に
ついて説明するものである。この例では、試料中のクラ
ミジア・トラコマティス金（Chlamydia trachomatis）D
NAを迅速に定量することができる。
A.ニトロセルロースフィルターの製造:0.1M NaOH、1M
NaCl、150mMクエン酸ナトリウム中の0.1キロ塩基対クラ
ミジア・トラコマティスDNプローブの10μg/ml溶液を３
分間沸騰して加熱変性させ、2cm2のニトロセルロース紙
（バイオ−ラッド社，上記と同一）に塗布する。紙を次
いでpH7の1Mリン酸緩衝液中に10秒間浸漬し、NaOHを中
和する。未反応部位を、“分子クローニング，研究所マ
ニュアル",編集，テー・マニアティス，イー・エフ・フ
リッチュ及びジェイ・サムブルック，コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボレートリー,1982年，第326頁
（“Molecular Cloning,a laboltory,Manual",eds.T.Ma
niatis,E.F.Fritsch and J.Sambroock,Cold Spring Har
bor Labortory,1982,page 326）に記載されているよう
に、DNAブロッキング緩衝液中で一夜インキュベートす
ることによりブロックする。
NaCl、150mMクエン酸ナトリウム中の0.1キロ塩基対クラ
ミジア・トラコマティスDNプローブの10μg/ml溶液を３
分間沸騰して加熱変性させ、2cm2のニトロセルロース紙
（バイオ−ラッド社，上記と同一）に塗布する。紙を次
いでpH7の1Mリン酸緩衝液中に10秒間浸漬し、NaOHを中
和する。未反応部位を、“分子クローニング，研究所マ
ニュアル",編集，テー・マニアティス，イー・エフ・フ
リッチュ及びジェイ・サムブルック，コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボレートリー,1982年，第326頁
（“Molecular Cloning,a laboltory,Manual",eds.T.Ma
niatis,E.F.Fritsch and J.Sambroock,Cold Spring Har
bor Labortory,1982,page 326）に記載されているよう
に、DNAブロッキング緩衝液中で一夜インキュベートす
ることによりブロックする。
B.核酸試料の検出：核酸試料10μをDNAブロッキング
緩衝液中の第２クラミジア・トラコマティスDNAプロー
ブ0.2μg/mg溶液10μと混合する。この第2DNAプロー
ブを当業者が公知のようにビオチンで標識する。ビオチ
ン標識DNAプローブ配列は固相プローブ配列に対し相補
的ではない。核酸試料及び標識プローブの混合物を次い
で３分間沸騰することにより加熱変性する。混合物５μ
をキャピラリー管でニトロセルロースに塗布し、放射
状に拡散させる。ビオチン標識DNAプローブを次いで、
キャピラリーマイクロピペットで正確に同一部位上に、
pH7.4のリン酸緩衝液中15nmのアビジン−金コロイド粒
子（EYラボラトリーズ，サンマテオ，カリフォルニア
州，カタログNo.GA−01）0.001mg/ml溶液５μを塗布
することにより、視覚化させる。赤色スポットの生成は
試料中におけるクラミジア・トラコマティスDNAの存在
を示す。
緩衝液中の第２クラミジア・トラコマティスDNAプロー
ブ0.2μg/mg溶液10μと混合する。この第2DNAプロー
ブを当業者が公知のようにビオチンで標識する。ビオチ
ン標識DNAプローブ配列は固相プローブ配列に対し相補
的ではない。核酸試料及び標識プローブの混合物を次い
で３分間沸騰することにより加熱変性する。混合物５μ
をキャピラリー管でニトロセルロースに塗布し、放射
状に拡散させる。ビオチン標識DNAプローブを次いで、
キャピラリーマイクロピペットで正確に同一部位上に、
pH7.4のリン酸緩衝液中15nmのアビジン−金コロイド粒
子（EYラボラトリーズ，サンマテオ，カリフォルニア
州，カタログNo.GA−01）0.001mg/ml溶液５μを塗布
することにより、視覚化させる。赤色スポットの生成は
試料中におけるクラミジア・トラコマティスDNAの存在
を示す。
本発明はその好ましい態様に関し詳細に記載されてい
るが、変更及び修正は前述されかつ添付された請求の範
囲で規定されるように本発明の精神及び反息を逸脱しな
い限り行なうことができる。
るが、変更及び修正は前述されかつ添付された請求の範
囲で規定されるように本発明の精神及び反息を逸脱しな
い限り行なうことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭57−200862（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−99319（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−28662（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−166866（ＪＰ，Ａ) 米国特許4587102（ＵＳ，Ａ)
Claims (14)
- 【請求項１】液体試験試料中の分析物の定量定性分析方
法であって、 （ａ） 第１物質を不溶性の多孔質シート支持体に結合
させ；但し、該第１物質はリガンド−レセプターの関係
にある上記分析物に結合するリガンド、及びレセプター
−リガンドの関係にある上記分析物に結合するレセプタ
ーからなる群より選択され、該支持体は穴を有する水不
浸透性の物質の層によってカバーされており、更にその
隣接真下に、液体を吸収し、その結果上記支持体を通し
て液体の横断拡散を高めるように作用する親水性物質の
シートを有する； （ｂ） 上記試験試料を上記カバー層が存在する上記不
溶性支持体に上記穴を通して塗布し； （ｃ） 上記試験試料を上記第１物質を担持する上記不
溶性支持体中に拡散せしめ； （ｄ） 上記分析物の塗布前に、或いは同時に、又は後
に標識した第２物質を上記不溶性支持体に塗布し；但
し、該第２物質はリガンド−レセプターの関係にある上
記第１物質又は上記分析物のいずれかに結合しうるリガ
ンド、及びレセプター−リガンドの関係にある上記第１
物質または上記分析物のいずれかに結合しうるレセプタ
ーからなる群より選択され、また、該第２物質は金コロ
イド又は銀コロイドで標識されており、上記（ａ）の多
孔質シート支持体の多孔度は、未反応の第２物質に付着
した金コロイド又は銀コロイド粒子が上記多孔質シート
支持体を横断して通過し、上記親水性物質のシートに至
るのに充分である；及び （ｅ） 固定化された上記標識第２物質の存在及び／又
は量を評価する； 工程からなることを特徴とする方法。 - 【請求項２】定性分析のために、標識が、第２物質が既
決検出限界以上の量で存在する場合には肉眼で見ること
ができ、第２物質が既決検出限界以下の量で存在する場
合には肉眼で見ることができない明瞭なシグナルを発す
るのに十分な量で存在する、請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項３】不溶性支持体の横断方向に通じての該試験
試料の拡散を、負又は正の圧力を用いることにより増大
させる、請求の範囲第１項或いは第２項記載の方法。 - 【請求項４】試験試料が未知濃度の分析物及び既知濃度
の標識第２物質を含み、上記第２物質が固定化された第
１物質に結合し得、それにより競合的結合測定が行なえ
る、請求の範囲第１〜３項のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項５】標識第２物質が分析物に結合し得、該分析
物の後で上記支持体に塗布される、請求の範囲第１〜３
項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】上記第２物質が他の標識化合物によって標
識され、該化合物が第２物質に結合しているリガンド及
びレセプターの群に属している、請求の範囲第１〜５項
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】穴の直径が約5mm以下である、請求の範囲
第１〜５項のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項８】第１物質が直接的又は間接的に不溶性支持
体に共有結合又は非共有結合されている、請求の範囲第
１〜６項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項９】リガンド及びレセプターが、特異的に相互
作用する抗原及び抗体又はその断片、糖及びレクチン、
核酸、酵素及び基質、酵素及び阻害剤、ビオチン及びア
ビジン、ビオチンを含む複合体及びアビジン、アビジン
を含む複合体及びビオチン、免疫グロブリン及びブドウ
球菌タンパク質Ａ、免疫グロブリンを含む複合体及びブ
ドウ球菌タンパク質Ａ、ブドウ球菌タンパク質Ａを含む
複合体及び免疫グロブリン、又は免疫グロブリンを含む
複合体及びブドウ球菌タンパク質Ａを含む複合体、の群
から選ばれる、請求の範囲第１〜７項のいずれか一項に
記載の方法。 - 【請求項１０】不溶性支持体が蛋白質、炭水化物又は核
酸に結合しうる官能基を有する高分子物質である、請求
の範囲第１〜８項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１１】試験試料中の分析物を定量定性分析する
ためのキットであって、該キットが： （ａ） リガンド−レセプターの関係にある上記分析物
に特異的なリガンド、及びレセプター−リガンドの関係
にある上記分析物に特異的なレセプターからなる群より
選択された第１物質に結合している不溶性の多孔質シー
ト支持体；但し、該支持体は穴を有する水不浸透性の物
質の層によってカバーされており、更にその隣接真下
に、液体を吸収し、その結果上記支持体を通して液体の
横断拡散を高めるように作用する光不透過性の親水性物
質のシートを有する；及び （ｂ） 第２物質の溶液；但し該第２物質はリガンド−
レセプターの関係にある上記第１物質又は上記分析物の
いずれかに結合しうるリガンド、及びレセプター−リガ
ンドの関係にある上記第１物質又は上記分析物のいずれ
かに結合しうるレセプターからなる群より選択され、該
第２物質の溶液は金コロイド又は銀コロイドを含む標識
に結合した既知濃度の上記第２物質を含み、上記（ａ）
の多孔質シート支持体の多孔度は、未反応の第２物質に
付着した金コロイド又は銀コロイド粒子が上記多孔質シ
ート支持体を横断して通過し、上記親水性物質のシート
に至るのに充分である； を含んでなることを特徴とするキット。 - 【請求項１２】穴の直径が約5mm以下である、請求の範
囲第11項記載のキット。 - 【請求項１３】第１物質が直接的又は間接的に不溶性支
持体に共有結合又は非共有結合されている、請求の範囲
第11項又は第12項記載のキット。 - 【請求項１４】リガンド及びレセプターが、特異的に相
互作用する抗原及び抗体又はその断片、糖及びレクチ
ン、核酸、酵素及び基質、酵素及び阻害剤、ビオチン及
びアビジン、ビオチンを含む複合体及びアビジン、アビ
ジンを含む複合体及びビオチン、免疫グロブリン及びブ
ドウ球菌タンパク質Ａ、免疫グロブリンを含む複合体及
びブドウ球菌タンパク質Ａ、ブドウ球菌タンパク質Ａを
含む複合体及び免疫グロブリン、又は免疫グロブリンを
含む複合体及びブドウ球菌タンパク質Ａを含む複合体、
の群から選ばれる、請求の範囲第11〜13項のいずれか一
項に記載のキット。
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