JPH03503566A - 天然結合タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたイムノアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 名　　　　　　　称 天然結合タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイ 及ｒｈｏとｉ！ｊすＬ 本発明は非免疫天然結合タンパク質に対するモノクローナル抗体または免疫反応 性モノクローナル抗体断片を用いたイムノアッセイおよび結合タンパク質の新し い標識方法に関する。

発明の背景 抗原のイムノアッセイは、通常、特異抗体を検体中に存在するかもしれない抗原 に結合させ次いでその抗ｇ−抗体複合体を規定された検出系により同定すること に基づいている。これらの系の性能特性はアッセイに用いた反応成分の結合特性 に大きく左右される。非免疫天然結合タンパク質など他の反応成分はその結合特 性の故にモノクローナル抗体よりもアッセイフォーマット（ａｓｓａｙｆｏｒ＋ ａａｔ）への使用に望ましいとされている。天然のリガンド選択的結合タンパク 質、例えば７オレート（ｆｏｌａｔｅ）結合タンパク質および内因子（ｉｎｔｒ ｉｎｓｉｃ　ｆａｃｔｏｒ）などは多くの生物系に存在しそして低分子量生体分 子に選択的にかつ抗体のそれに匹敵する親和定数をもって結合することによりそ れらを輸送または受容する役目を果たしている。

７オレートについては市販のラジオイムノアッセイ（以下ＲＩＡと記す）キット が利用可能であるが、これは反応成分の一つとしてフオレート結合タンパク質を 用いている。何故ならば、それはｐＨ９，３において同じ親和性をもって葉酸お よび血清中に認められる一次葉酸代謝物である５−メチルテトラヒドロ葉酸（５ ＭＴＨＦ）の両方に結合するからである。臨床的に重要な被分析物質（ａｎａｌ ｙｔｅ）はこの−次葉酸代謝物の５　ＭＴＨＦであるのでこの二重の結合は重要 である。残念なことに、５ＭＴＨＦ酸は不安定なためにアッセイ７オーマツトの 検定物質（キャリブレータ−）として用いるには難がある。葉酸の方は安定であ ることからしばしくキャリブレータ−として用いられており、それによって製造 元がｐＨ９，３において同化合物に対し結合するという７オレ一ト結合タンパク 買の能力を利タンパク質は市販されているため二つ以上の構造的に異なる化合物 に対し十分に高い結合親和性をもった抗体を生産するという困難な仕事を製造元 がとらなくて済む。

同様に、　Ｂ−１２ＲＩＡは内因子を用いているが、これはそれが血清中に認め られる四つのすべての主要Ｂ−１２代謝物に結合するからである。四つのすべて の主要Ｂ−１２代謝物に対し高い親和性を有する内因子は入手しやすいためＢ− １２の市販用ＲＩＡキットの作成が容易である。寅際、多くの天然結合タンパク 質が抗体のもつ親和性よりも高い親和性を有している。結合タンパク質を用いて 作業することのもう一つの長所は、酵素イムノアッセイに一般的に用いられるハ プテン接合物の架橋基を結合タンパク質が認識しない点である。市販のＲＩＡは いずれも単一のアッセイフォーマットにモノクローナル抗体および結合タンパク 質を用いておらず、これらのアッセイは結合タンパク質と放射性標識リガンドを 用いているにすぎない。

更に今日に到るも、非免疫天然結合タンパク質を用いた市販用酵素イムノアッセ イは利用可能となっていない。

酵素結合拮抗式イムノアッセイが７オレートについて記載されているが、これは 未標識の７オレ一ト結合タンパク質（ＦＢＰ）およびフオレート置換グルコース −６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを二つの異なるアッセイフォーマットに用 いている。一方のフォーマットはり、Ｇ。

Ｂａｃｈａｓ　ａｔ　ａｌ、、　Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉ ｎｋｅｄ　Ｃｏｏ＋ｐｅｔｉ−ｔｉｖｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ａｓ５ａｙ　ｆｏｒ 　ｔｈｅ　Ｒａｐｉｄ　Ｄｅｔｅｒａ＋１ｎａｔｉｏｎ　ｏｆＦｏｌａｔｅ　ｉ ｎ　Ｖｉｔａ＋ｎｉｎ　Ｔａｂｌｅｔｓ、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ。

Ｖｏｌ、５８．　Ｎｏ、４．　ｐｐ、９５６〜９６１（１９８６）に報告されて いるような可溶化されたＦＢＰを用いている。他方のフォーマットはり、Ｇ、Ｂ ａｃｈａｓ　　ａｔ　　ａｔ、ｉｎ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　　Ｉｎｔａｒａ ｃｔｉｏｎｏｆ　１ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｆｏｌａｔｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐ ｒｏｔｅｉｎ　ｖｉｔ、ｈ　Ｅｎｚｙ＋ａｅ−Ｆｏｌａｔａ　Ｃｏｎｊｕｇａｔ ｅｓ：　Ａｎ　Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　Ａｓ５ａｙ　ｆｏｒＦｏｌａｔｅ 、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、５６．　Ｎｏ、９ ＋　ｐｐ。

１７２３〜１７２６　（１９８４）に報告されているような固定されたＦＢＰを 用いている。これらのアッセイは範囲が限られており、また固定ＦＢＰを用いる アッセイは、どちらかといえば独特な二相（鉤状曲部のある）用量応答曲線を示 すためそのアッセイ範囲では被分析物質濃度の測定が困難となる。

米国特許第４．２７１．１４０号（以下′１４０と記す）およびＰＣＴ／ＧＢ８ ５１００１２０は単一のアッセイフォーマットに結合タンパク質と抗体を用いる ことを開示している。′１４０文献はＡｎＬ（ＢＬ）ｎＡｌ（式中ＢＬはＡｏに 共有結合的に結合した結合リガンドである）なる構造の複合体を用いたイムノア ッセイに化学修飾された結合タンパク質を用いることを記載している。

１９８５年ｌθ月１０日に公開されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ８５１０ ０１２０は小分子とその小分子に対する結合タンパク質の複合体を認識し得るモ ノクローナル抗体の使用を記載しているが、その場合のモノクローナル抗体は小 分子および結合タンパク質に対する抗体ではない。従ってこれらの抗体は結合タ ンパク質をリガンドが結合されていない限り認識することはない。

以上の文献あるいは市販のラジオイムノアッセイキットはいずれも、単一のアッ セイフォーマットに天然結合タンパク質に特異なモノクローナル抗体または免疫 反応性モノクローナル抗体断片を用いる本発明を教示するものではない。結合タ ンパク質はその結合タンパク質に特異な標識モノクローナル抗体の付着を介して 間接的に標識される。これによって、結合タンパク質のリガンド結合能を変えて しまうことのある結合タンパク質の直接化学修飾を行う必要はなくなる。すなわ ち、モノクローナル抗体−結合タンパク質複合体は、イムノアッセイへの使用に 適した特異標識結合タンパク質の調製に化学修飾に依拠する従来の結合タンパク 質標識技術にとってかわるものである。更にこれは、結合タンパク質の結合能を 保存することにより従来のイムノアッセイの改良を提供する。

＾−吸ニュ」ｉ」」 天然結合タンパク質に特異なモノクローナル抗体または免疫反応性モノクローナ ル抗体断片を用いて、様々なイムノアッセイフォーマットにおけるリガンド検出 のためのモノクローナル抗体−結合タンパク質複合体が形成される。これらの抗 体または断片は標識または未標識のいずれでもよく、まＩ；未標識の場合にはそ の未標識抗体または断片を該未標識抗体または断片に特異な標識抗体と反応させ る。このアプローチは結合タンパク質のリガンドに対する固有の親和性を維持す る。

本発明の詳細な説明 本発明のモノクローナル抗体の製法はよく知られており、広範な刊行物に引用さ れているが、以下のものを引用により本明細書の記載として含める：Ｋｏｈｌｅ ｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　　“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　 ｏｆＦｕｓｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　 ＰｒｅｄｅｆｉｎｅｄＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”、　Ｎａｔｕｒｅ、　２５６　 ：　４９５”４９７（１９７５）、　Ｐｅｒｅｉｒａａｔ　　ａｌ、、　Ｉｎｆ ｅｃｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｖｏｌ、２９．Ｎｏ、２ｒ　　 ｐｐ−７２４〜７３２　　（Ａｕｇ−１９８０）、Ｏｉ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｉ ｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　　ｃｅｌｌ　　１ｉｎｅｓ、 ｐｐ、３５１〜３７１．Ｂ−Ｍｉｓｈｅｌｌ　　ａｎｄＳ、Ｓｃｈｉｉｇｉ　　 （ｅｄ、）、５ｅｌｅｃｔｅｄ　　ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　ｃｅｌｌｕｌａ ｒｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ、、Ｓａｎ　　Ｆｒａ ｎｃｉｓｃｏ　　（１９８０）およびＧａ１ｆｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｐｒｅ ｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　　Ｓ ｔｒａｔｅｇｉｅｓ　　ａｎｄ　　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　 ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　７３：　　ｌ　〜４６　　（１９８１）。

全体にわたって使用するモノクローナル抗体という用語はインタクト（完全）な モノクローナル抗体のほか免疫反応性モノクローナル抗体断片をも包含する。

天然結合タンパク質、例えば下記の第１表に例示されるような結合タンパク質、 その他と結合するモノクローナル抗体はモノクローナル抗体の前記製法のいずれ を用いても製造し単離することができる。これらの抗体は周知の精製およびタン パク質接合技術を用いて精製し標識することができる。

第　　１　　表 ビタミン　　　７オレ一ト結合タンパク質　　　　フオレート、　５ＭＴＨＦ内 因子　　　　　　　　　　　　Ｂ１２および代謝物リボフラビン結合タンパク質 　　　リボフラビン穴タンパクｊｔ　　　　　　　　　　　Ｂ１２およびた代謝 物ホルモン　　　フルチゾール結合グロブリン　　　コルチゾール（Ｔ、） アンドロジエン結合タンパク質　　アンドロジエン類薬　　剤　　　シクロフィ リン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉ　Ｉ　ｉｎ）　　　シクロスポリンペニシリン結合タン パク質　　　　βラクタム類アミノ酸　　　細胞周辺結合タンパク質（細菌）　 　大抵のアミノ類細胞受容体　　表皮成長因子（ＥＧＦ）受容体　　　　ＥＧＦ インターロイキン（ル）、受容体　　ＩＬ−２ベンゾピレン結合タンパク質　　 　ペンゾビレンアロステリッ　タンパク質キナーゼ　　　　　　　ｃＡＭＰクタ ンパク質 ジヒドロ７オレートリダク ターゼ　　　　　　　　　　　　　　メトトレキセート炭水化物　　　細胞周辺 結合タンパク質（細菌）　　多くの糖類前記モノクローナル抗体は、以下におい て規定されるようなリポータ−系の成分で、またはリポータ−系の成分が結合し た特異結合対の構成員（ｍｅｍｂｅｒ）で標識することができる。

特異結合対は免疫タイプまたは非免疫タイプのいずれであってもよい。免疫特異 結合対は例えば抗原−抗体系またはハブテン−抗ハプテン系である。フルオレセ イン／抗フルオレセイン、ジニトロフェニル／抗ジニトロフェニル、ビオチン／ 抗ビオチン、ペグチド／抗ペプチドなどを挙げることもできる。特異結合対の抗 体構成員は、当業者によく知られた常法により製造することができる。かかる方 法は動物を特異結合対の抗原構成員で免疫することより成る。特異結合対の抗原 構成員が免疫原性でないとき、すなわちハプテンである場合には、それを担体タ ンパク質に共有結合的に結合してそれを免疫原性にしてもよい。

非免疫結合対には、二成分が相互に対する自然親和性を共有するが抗体ではない 系、例えばビオチン−アビジン、プロティンＡ−１ｇＧおよびプロティンＧ−１ ＫＧなどが包含される。

モノクローナル抗体を特異結合対の構成員で共有結合的に標識するには様々な方 法を利用することができる。

方法の選択は、特異結合対の構成員の性質、所望される結合のタイプおよび様々 な接合ケミストリーに対する抗体の寛容度に基づいて行われる。ビオチンは、商 業的に入手可能な活性誘導体を用いることによりモノクローナル抗体に共有結合 的にカップリングすることができる。

これらの一部は、タンパク質のアミン基に結合するビオチン−Ｎ−ヒドロキシー スク、シンイミド；炭水化物部分、アルデヒドおよびカルボキシル基にカルボジ イミド結合を介して結合するビオチンヒドラジド；およびいずれもスルフヒドリ ル基に結合するビオチンマレイミドおよびヨードアセチルビオチンである。フル オレセインはフルオレセインインチオシアネートを用いてタンパク質アミン基に カップリングすることができる。モノクローナル抗体を特異結合対の構成員にカ ップリングするには、ジアルデヒド、カルボジイミドカップリング、ホモニ官能 性架橋およびヘテロニ官能性架橋を含む他の標準的接合方法を用いることができ る。カルボジイミドカップリングはある物質のカルボキシル基を他の物質のアミ ン基にカップリングする効果的な方法である。カルボジイミド結合は、商業的に 入手し得る試剤であるｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カル ボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いることにより容易になる。

二官能性イミドエステルおよび二官能性Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステ ルを含むホモニ官能性架橋剤は商業的に入手でき、そしである物質のアミン基を 他の物質のアミン基にカップリングするのに用いられる。ヘテロニ官能性架橋剤 は異なる官能基を有する試剤である。

最も一般的な商業的に入手し得るヘテロニ官能性架橋剤は一つの官能基としてア ミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、そして第二の官能基とし てスルフヒドリル反応性基を有する。最も一般的なスルフヒドリル反応性基はマ レイミド類、ピリジルジスルフィドおよび活性ハロゲンである。それら官能基の 一つは照射時に様々な基と反応する光活性アリールナイトレンであってもよい。

信号検出を容易にするために、モノクローナル抗体または特異結合対の構成員の いずれかをリポータ−系の成分で標識する。リポータ−系という用語は、選択さ れたリポータ−と、そのリポータ−をモノクローナル抗体に、あるいは後でモノ クローナル抗体に付着する特異結合対の構成員に結合させる任意の手段のことで ある。すなわち、リポータ−は、直接または間接に、共有結合的または非共有結 合的に、モノクローナル抗体または特異結合対の構成部分に結合することができ る。それらに限定はされないが、リポータ−には放射性同位元素、酵素、金属酸 化物、金属水酸化物および金属塩などの金属化合物、または金属または金属化合 物で被覆されたポリマー核または金属の金属ゾル、表面のバーミティビティー（ ｐｅｒｍｉｔｔｉｖｉｔｙ）、導電率または透磁率を変える粒子、蛍光原性、化 学発光性または電気化学的物質が包含される。汎用される二つの放射性同位元素 は１２Ｊおよび３Ｈである、標準的な放射性同位元素標識方法には１２″！につ いてはクロラミンＴ、ラクトペルオキシダーゼおよびＢｏｌ　ｔｏｎ−Ｈｕｎｔ ｅｒ法および３Ｈについては還元メチル化が包含される。

やはりイムノアッセイ用リポータ−として用いられる酵素には西洋わさびペルオ キシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ＢＥＴＡ−ガラクトシダーゼ、グルコ ースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢＥＴＡ−ラクタマーゼ、ウレアーゼおよ びリソチームが包含されるがこれらに限定されるものではない。酵素による標識 は、上記においてモノクローナル抗体の特異結合対構成員による標識について記 載したようなジアルデヒド、カルボジイミドカップリング、ホモニ官能性架橋剤 およびヘテロニ官能性架橋剤を用いることによって容易となる。選択される標識 方法は、酵素上の利用可能な官能基、標識されるべき物質および両者の接合条件 に対する寛容度に依存する。本発明に用いられる標識方法は、Ｅｎｇｖａｌｌお よびＰｅａｒｌｍａｎｎ。

Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８．８７１　（１９７１）、　Ａｖｒａａ＋ ｅａｓおよびＴｅｒｎｙｎｃｋ、　　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　Ｌ　 　１１７５　　（１９７１）＋　　Ｉｓｈｉｋａｗａａｔ　ａｌ、、　　Ｊ、　 　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　４（３）＝２０９〜３２７　（１９８３）およびＪ ａｂｌｏｎｓｋｉ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈａｍ、　１４８：　１９９　（１ ９８５）に記載されているものを含め現在用いられている任意の常法であってよ いが、それらに限定されるものではない。標識はスペーサーや特異結合対の他の 構成員を用いるような間接方法によって行うこともできる。この−例は、未標識 ストレプトアビジンおよびビオチニル化酵素を用い、その未標識ストレプトアビ ジンおよびビオチニル化酵素を順次にまたは同時に添加することによりビオチニ ル化抗体を検出する例である。酵素活性の検出は色素厚、磁気、蛍光原および化 学発光の変化、または電気化学的な変化を測定することにより、あるいは当該技 術分野において一般的に知られた他の任意の方法によって容易なものとすること ができる。

更に本発明に包含されるものとして、モノクローナル抗体に特異な抗−抗体を挙 げることができるが、その場合それら抗−抗体は信号の発生に用いられまた前述 の標識および接合方法のうちの任意のものを用いて標識することができる。

本発明に包含される天然結合タンパク質に対するモノクローナル抗体は次の機能 を包含するがそれらに限定されるものではない： １）結合タンパク質を認識するがその結合タンパク質によるリガンドの結合を妨 害しない抗体：および２）リガンドが結合されていない場合にのみ結合タンパク 質を認識する抗体。

前述機能２を有する抗体についていえば、これらの抗体は活性部位を認識でき、 あるいはリガンドの結合に伴って変化する区別可能な部位（ｄｉｓｔｉｎｃｔ　 ５ｉｔｅ）を認識できる。

本発明の実施にとって重要なのは後述する如く、前述の機能を有する結合タンパ ク質に対するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマクローンの弁別を可 能にする分別スクリーニング実験である。Ｅ、　　Ａ、　　Ｐｉｅｒｃｅ　ｅｔ ａｌ、、　　Ａ　　Ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ　　ＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎＬ　 　Ａｓ５ａｙ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ａｎｔｉ− Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　ＡｎＬｉｂｏ−ｄｉｅ ｓ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５３：　　６７− ７４　　（１９８６）およびり、　Ｏ，Ｍｏｒｇａｎ、　Ｐｌａｔｅ　Ｂｉｎｄ ｉｎｇ　Ａｓ５ａｙ　ｆｏｒ　Ｍｏｎｏ−ｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉ−ｒｅｃｅ ｐｔｏｒ　　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ。

１１６（３）　：　１２２４〜１２２６（１９８５）を参照されたい（それら文 献を引用により本明細書の記載として含める）。好ましい−態様においては、本 発明は結合タンパク質を認識するが結合タンパク質によるリガンドの結合は妨害 しない機能を有するモノクローナル抗体を用いて実施することができる。このタ イプのモノクローナルは適当な動物、例えばマウスまたはラットなどを精製また は一部精製結合タンパク質で免疫することにより調製することができる。

精製結合タンパク質が要求されることはなく、また実際に、後述するモノクロー ナル抗体スクリーニング法の性質上、結合タンパク質が何であるかを知る必要さ えもない。

動物は慣用の免疫方法を用いて免疫される。これは通常、７０インドの完全アジ ュバント（ＣＦＡ）中の結合タンパク質による初回免疫、および７０インドの不 完全アジュバント中の結合タンパク質またはホスフェート緩衝食塩水中の結合タ ンパク質を用いた一回以上の追加免疫を含む。融合の１〜４日前に行われる追加 免疫゛の後、リンパ節または牌臓からのリンパ球を、前述のＫｏｈｌｅｎおよび ＭｉｌｓＬｅｉｎの文献に記載されているような十分確立された方法に従って適 当な非免疫グロブリン分泌ミエローマと融合させる。ヒボキサンチン、アミノプ テリンおよびチミジンの混合物を含む培地（ＨＡＴ）中でｌＯ日間以上インキュ ベーションの後、モノクローナル抗体を分泌する個々のハイブリッドクローンよ りの上澄を固体状態ラジオイムノソルベントアッセイ（ＲＩＳＡ、下記チャート １参照）で検索する。このアッセイはウサギまたはヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を８ 個または１２個の十分に離間されたウェル帯より成るウェルにコーティングする ことより成る。検索されるべきハイブリッドクローンよりの抗体を含有する上澄 を個々にそれらウェルに入れそして３７℃で１時間インキュベートする。次いで これらのウェルを洗浄しそして精製または一部精製結合タンパク質（ＢＰ）例え ばフオレート結合タンパク質（ＦＢＰ）を各ウェルに添加する。３７℃でもう１ 時間インキュベージコン後、ウェルを十分に洗浄する。この時点で、結合タンパ ク質に対し十分高い親和性を有する抗体を含有する上澄は結合タンパク質をウェ ルに間接的に結合してしまっているであろう。放射性標識結合リガンド、例えば ７オレート、を添加しそしてインキュベートすることにより、結合タンパク質の ７オレ一ト結合能を妨げない結合タンパク質に対する抗体を含んだウェルが検出 される。

ｌ）表面−抗１ｇＧ ↓　　ハイブリドーマ上澄 ２）表面−抗１ｇＧ　Ｏハイブリドーマ上澄↓　　ＢＰ ３）表面−抗１ｇＧ　Ｏハイブリドーマ上澄ＯＢＰ↓　　放射性標識リガンド（ ＲＬ） ４）表面−抗１ｇＧ　Ｏハイブリドーマ上澄　ＯＢＰ　ＯＲＬチャートｌ 前記ＲＩＳＡのほか、直接法ＥＬＩＳＡ、酵素結合イムノソルベントアッセイ、 （チャート２）を行うこともでき、その場合には精製結合タンパク質をポリスチ レンプレートに結合させる。これは標準的なＥＬＩＳＡハイプリドーマスクリー ニングアッセイである。この直接法アッセイでは、結合タンパク質に対する抗体 を含んでいると推定されるハイブリドーマ上澄をウェルに添加し、インキュベー トし、次いで洗浄の後、（酵素または放射性標識を化学的に結合させた）マウス 抗体に対する第二抗体を加える。

インキュベーションおよび洗浄後に基質を添加しそしてウェルに結合した抗体を 測定する。

ｌ）表面−ＢＰ ↓　　ハイブリドーマ上澄 ２）表面−ＢＰ　Ｏハイブリドーマ上澄↓　　酵素標識抗１ｇＧ ３）表面−ＢＰ　Ｏハイブリドーマ上澄０酵素標識抗１ｇＧチャート２ 間接法ＥＬＩＳＡ（チャート３）を行うこともでき、その場合にはりガント（ハ プテン）をＢＳＡなどの担体タンパク質に化学的に結合させ、そしてこのバズテ ン−担体をポリスチレンプレートに結合させる。この間接法スクリーニングアッ セイでは、結合タンパク質は、該結合タンパク質がりガントへの結合によって結 合することのできる担体タンパク質に接合されたリガンドを含むウェルに添加さ れる。インキュベーシヨンおよび洗浄の後、ハイブリドーマ上澄を添加すると、 結合タンパク質に対する特異性を有する適当なタイプの抗体が存在すればそのモ ノクローナル抗体が結合することとなり、また直接法アッセイについて記載した 如くに検出することができる。

ｌ）表面−被分析物質担体 ↓　ＢＰ ２）表面−被分析物質担体ＯＢＰ ↓　ハイブリドーマ上澄 ３）表面−被分析物質担体ｏ　Ｂｐ　ｏ　ハイブリドーマ上澄↓　酵素標識抗１ ｇＧ ４）表面−被分析物質担体ｏ　１３ｐ　ｏ　ハイブリドーマ上澄０酵素標識抗１ ｇＧ チャート３ リガンドが結合するかどうかにかかわらず結合タンパク質に結合しそして以後の りガント抗体の結合を妨害しない好ましい抗体群はＲＩＳＡにおいても、また直 接法および間接法ＥＬＩＳＡアッセイにおいても陽性の結果を与えるものと期待 される。リガンドが結合しない場合にのみ結合タンパク質を結合すると推定され る抗体は直接法ＥＬＩＳＡおよびＲＩＳＡでは陽性を示し、そして間接法ＥＬＩ ＳＡでは陰性を示すものと期待される。これらの−次スクリーニング結果に基づ いて、様々な被分析物質結合条件下における結合タンパク質との反応能に関して 抗体を更に特徴付けることができる。

所要の機能を有するモノクローナル抗体が得られれば、次いでそれらを適当な結 合タンパク質と共に問題とするリガンドの測定に用いることができる。様々なア ッセイ７オーマツトを本発明の実施に用いることができる。いくつかのフォーマ ット例としてはサンドイッチアッセイおよびアフィニティ力ラム介在イムノアッ セイ（ＡＣＭＩＡ）例えば米国特許第４，５５１，４２６号に記載されているよ うな結合タンパク質へのリガンドの結合を妨害しないモノクローナル抗体を用い ることができるアッセイが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

ＡＣＩＪＩＡ型アッセイへの応用は、モノクローナル抗体−結合タンパク質複合 体の溶液をその結合タンパク質により認識されるリガンドを含む溶液と混合した 後短時間インキュベーションしてそのリガンドを予め定められた量まで結合させ ることより成る。リガンドまたはりガントアナログを結合した固体表面を加えそ して再びその混合物をインキュベートする。被分析物質を捕獲しなかった複合体 は固定されたリガンドまたはりガントアナログ、すなわちリガンドではないがリ ガンドに似たふるまいをするもの、に結合することになる。固定相と水相を分離 した後、上澄または固定相の標識活性を測定する。

結合タンパク質を認識するが結合タンパク質によるリガンドの結合を妨害しない モノクローナル抗体を用いたサンドイッチアッセイの一例を下記チャート４に示 す。

Ｙ、−ＢＰを認識するがリガンドの結合を妨害しない抗−ＦＢＰモノクローナル 抗体； Ｙ、−リガンドが結合していない場合にＢＰを認識する抗−ＦＢＰモノクローナ ル抗体； ■）表面−Ｙ、　＊　ＦＢＰ　ｋ　ＦＡ十表面−Ｙ、　＊　ＦＢＰ↓　Ｙ２−標 識 ２）表面−Ｙ、　＊　ＦＢＰ　＊　ＦＡ十表面−Ｙ＋　＊　ＦＢＰ　＊　Ｙｔ− 標識チャード４ 本発明は結合タンパク質を標識するための化学修飾手段に対し重要な代替手段を 提供するものである。何故なにば化学修飾は結合タンパク買のリガンドを認識・ 結合する能力を低下させてしまうことがあるからである。実施例１および２に例 示されているように、標識抗体：結合タンパク質比を注意深く調節することによ りアッセイの動態範囲（ｄｙｎａｍｉｃ　ｒａｎｇｅ）も増大する。信号発生は この比に比例する。アッセイにおける結合タンパク質濃度は、被分析物質捕獲効 率にとって至適な値に一定に保つことができ、また所要の信号は抗体接合物の力 価測定により至適化される（実施例３の例示参照）。結合タンパク買上の異なる エピトープを認識するモノクローナル抗体接合物を用いることにより信号および 感度も増加する。

更に、結合タンパク買上の同一のまたは相違するエピトープを認識する選択的に 標識されたモノクローナル抗体を用いることにより一つの結合タンパク質に対し 二つ以上の標識を結合させることができる。

モノクローナル抗体を使用するので、免疫手順およびアッセイのいずれにおいて も結合タンパク質の不均質で純粋でない調製物を用いることができる。前述のス クリーニング実験の基準１〜３を満たすクローンが選択される。

以下の実施例は本発明を説明するものであるが、これに限定はされるものではな い。

実施例　ｌ 予め形成されたＦＢＰ抗−ＦＢＰ−アルカリ性ホスファターゼ複合体およびヒト 血清検体を用いた葉酸（ＦＡ）Ａ、抗−ＦＢＰ−アルカリ性ホスファターゼ接合 物：ゼ（ＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＥＩＡ級）に、２ ０μｆｆのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の８．４　Ｅ−４ｇ、４．８　Ｅ −６モルのＳ−アセチルコハク酸無水物（Ｓｉｇｍａ）を添加した。反応系を室 温で１時間磁力撹拌後、４０μａのヒドロキシルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）のｐ Ｈ７，０，１，４５Ｍ水溶液を添加した。その溶液を室温で０．５時間磁力撹拌 し、１．５　Ｘ　３０ｃｒａの５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）充填カラムを用いｌ　００ｎＭ燐酸ナトリウム、１．ＯｍＭ　ＥＤＴＡ１ｐ Ｈ６，５、で溶出されるサイズ排除クロマトグラフィにより精製した。スルフヒ ドリル修飾アルカリ性ホスファターゼを含む両分をプールし、そして１．０ｍＱ ／　Ｃｍｇ　ｃ＋＊）の２８０ｎｍにおける消衰係数を用いた紫外線分光法によ ってその濃度を測定した。化学修飾アルカリ性ホスファターゼの最終濃度はｌ　 、　２ｔｎｇ　／　ｒｒｒ（ｌであった。

２、抗−ＦＢＦモノクローナル抗体のマレイミジル修飾１．９＋ｍ（２のホスフ ェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７，４、中のｌＯｍｙ、６−７　Ｅ−９モル 、の抗−ＦＢＰモノクローナル抗体に、６．７μｆｆ（７）ＤＭＦ中の８　、０ −ｒ−ル当量、１．８　Ｅ−５９のスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメ チル）シクロヘキサン−１−力ルポキシレート（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏ、）を添加した。その反応溶液を室温で１．５時間磁力撹拌しそして５ ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で充填され、１００ｍＭ燐酸 ナトリウム、ｐＨ６、５で溶出される１、５　Ｘ　３０ｃｍカラムを用いたサイ ズ排除クロマトグラフィにより精製した。化学修飾抗−ＦＢＰモノクローナルを 含む画分をプールし、そして１．←１１１２／（Ｉ１１９　ＣＩ）の２８０ｎｍ における吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を用いて タンパク質濃度を測定した。回収された容量は８　、２＋＋＋ｆｆｉであり、化 学修飾抗体の濃度は０゜０９１１９／＋１１１２であった。

３、　１４ｍ１２の化学修飾アルカリ性ホスファターゼ溶液および８．２ｙａＱ の修飾抗−ＦＢＰモノクローナル抗体溶液を合一させそして４℃で１時間放置し た。１００ｍＭ燐酸ナトリウム中の２−メルカプトエチルアミン塩酸塩の１０ｍ Ｍ溶液を１３μａ添加した。その溶液を４℃で１時間保存し、限外濾過しそして １０ｍＭ　Ｔｒｉｓｓ　１．Ｏｎ＋ＭＭｇＣｆｆ、、０．１ｍＭ　ＺｎＣＬに対 して透析した。ソノ接合物をｌＯｍＮ　Ｔｒｉｓ、　１０％マンニトール、５％ フラクシ３ンＶ　ＢＳＡ、　１５０ｍＭ　ＮａＣＱＳｌ、ＯＱＩＭ　ＭｇＣ（１ ２，０，１ｍＭ　ＺｎＣｆｆ、、０．３％２−クロロアセトアミド、０．２％ナ トリウムアジド、０．０５％チメリゾル（ｔｈｉｍｅｒｉｓｏｌ）　、０．０５ ％Ｔｗｅｅｎ　−２０、ｐＨ８−Ｉｓで構成される水性緩衝液でｌ：２希釈し、 そして４℃で保存した。接合物の近似濃度−０，１１９／讐ｎ。

Ｂ−１２０ｍＭ燐酸ナトリウム、３０ｍＭ　Ｎａｃｆｆ中の牛フオレート結合タ ンパク質（ＦＢＰ）（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａＪ　　Ｉｎｃ、）。比活性−ＬｍＱ あたり１８マイクログラムの７オレートを結合する能力あり。

Ｃ，ＦＢＰ抗−ＦＢＰ−ＡＰ複合体は、５０ｍＭナトリウムテトラボレート、１ ５０ＩＩＩＭ　　ＮａＣｆｆ、　　１．ＯｍＭ　　ＭｇＣｆｆ！、０−１ｍＭ　 　ＺｎＣＬ、０．１％ウサギＩｇＧ　（Ｓｉｇｍａ、安定化剤として使用）　、 ｐＨ９，３、でｌ　：　１０００希釈されたＦＢＰと同じ緩衝液でｌ：２００希 釈された抗−ＦＢＰ−ＡＰ接合物とを等容量ずつ合一させることにより調製した 。

Ｄ、　　Ｃｒ０２−１ｇｃ−ＦＡ試薬（ＰＢＳ中、１０ｍ＋９／鵞Ｑ）は、二酸 化クロム粒子を共有結合的に結合された葉酸ウサギＩｇＧ（ＩｇＧ−ＦＡ）接合 物でコーティングすることにより調製した。（Ｌａｕ　ａｔ　ａｈに対し１９８ ７年４月２１日に交付された米国特許第４．６６１．４０８号参照。その記載を 引用により本明細書の一部に含める）。そのＩｇＧ−ＦＡ接合物は、後述の如く 、カルボン酸官能化化合物をアミノ基含有タンパク質に結合させるためのものと して当該技術分野に知られた原単的方法を用いて調製した。ウサギＩｇＧ（Ｓｉ ｇｍａ）をその免疫学的性質の故にでなく、不活性担体タンパク質として用いた 。

Ｅ、　　７オレートの臨床的に測定された値が付されたヒト血清検体をＭａｓｓ ａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌから入手した。

Ｆ、　　１０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓｓ　Ｏ，０５％　Ｔｗｅｅｎ　−２０，１５０ｍ Ｍ　ＮａＣｆｆ、　０．３％２−クロロアセトアミド、ｐＨ７−０、より成る洗 浄緩衝液。

Ｇ、　　２．４Ｍ　ＤＥＡ緩衝液、ｐＨ９−１゜Ｈ，０−Ｉ　Ｎ　　ＮａＯＨ中 の１５ｍＭ　　４−メチルウムベリ７エリルホスフェート（ＭＵＰ）。

１、　０．５Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，９゜Ｊ−５０＋ｎＭナトリウムテトラポ レート、１５０＋ａＭ　ＮａＣＪ２．１．ＯｍＭ　ＭｇＣＱｘ、０．１ｍＭ　Ｚ ｎＣＱｘ、ｐＨ９，３゜アッセイ手順： １、　１００μａの正常ヒト血清検体を１２Ｘ’７５ｍｍポリプロピレン試験管 に入れ、そして５００μａの試薬Ｊを添加した。

その検体を１００℃で１５分間加熱し、次いで室温に冷却した。

２、　１００μαの複合体（試薬Ｃ）を添加後２５μａの試薬りを添加した。そ の反応溶液を渦流動させ（ｖｏｒｔｅｘｅｄ）そして３７℃浴に２１分間入れた 。同相を室温で磁力的に分離しそして上澄を傾瀉した。その固相を５００ｕ！： ｌの試薬Ｆで３回洗浄した。

３．　２５０μａの試薬Ｇを固相に添加し、その溶液を３７℃に加熱し、そして ５０μａの試薬Ｈを添加した。その溶液を渦流動させモして３７°Ｃで４分間イ ンキュベートした。

３００μｇの試薬Ｉを添加し、固相を室温で分離しそしてこの溶液の蛍光強度を 試薬Ｉで１＝５希釈後に測定した。結果は第２表のとおりである。

第　　　２　　　表 予め形成された複合体を用いた葉酸アッセイＢ　　　　　　　　　３．９　　　 　　　１４．９ヒト血清検体中の葉酸検出を目的とするイムノア・７セイにＦＢ Ｐ抗−ＦＢＰ−ＡＰ複合体を用いると、臨床的に測定された値に対し正の相関が 得られる。その複合体は溶液中の葉酸、および固体表面に共有結合的に結合した 葉酸のいずれをも結合する。所定の実験条件の下では、可溶性および固定化葉酸 に対して複合体が拮抗する。アッセイ信号ハ検体５−メチルテトラヒドロ葉酸の 濃度に反比例１、試薬は、一つの示された例外を除いて、実施例１のそれと同一 とした。ヒト血清検体に代えて葉酸標準溶液を用いた。それら標準溶液は葉酸二 水和物をＰＢＳ。

５％ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）、０．３％２−クロロアセトアミド、ｐＨ７ ，４、で２０．１Ｏ１５，１ｎｙ／ｍＱに希釈することにより調製した。希釈液 をＱｎｇ／ｍＱ標準として用１、実施例１に概説したとおり。結果は第３表のと おりである。

第　　　３　　　表 Ａ　　　０　　８．５ Ｂ　　　１　　８．４ Ｃ５６，５ Ｄ　　　１０　　４．８ Ｅ　　　２０　　３．７ 第２表および第３表のデータは葉酸濃度と信号強度の間に逆の関係があることを 示している。蛍光強度の大きさが２つの実施例で異なるのは溶液マトリックスが 異なっているためである。

実施例　３ 抗−ＦＢＰ−ＡＰ接合物力価の関数としての信号変化試　薬： Ａ、抗−ＦＢＰ−ＡＰ接合物：実施例１の試薬Ａ参照。

Ｂ、牛フオレート結合タンパク質：実施例１の試薬Ｂ参照。

Ｃ，ＦＢＰ抗−ＦＢＰ複合体：異なるＦＢＰ抗−ＦＢＰ−ＡＰ接合物化学量論比 を用いて三種類のＦＢＰ抗−ＦＢＰ−ＡＰ溶液を調製した。等容のｌ　：　３２ ２２希釈されｊ：ＦＢＰと１：２００、ｌ：４００およびｌ：８００希釈された 抗−ＦＢＰ　−ＡＰ接合物とを合一して接合物力価が漸減する三種類の複合体溶 液を作った。５０ｍＭ　　ナトリウムテトラポレート、１５０ｍＭＮａＣＱ、　 １．ｏｍＭ　ＭｇＣＱｚ、０．１ｍＭ　ＺｎＣＱｘ、１０％マンニトール、０． ３％　２−　クロロアセトアミド、０．１％ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，５％Ｂ ＳＡ、　ｐＨ９，３を用いて希釈液を作った。

Ｄ、　　Ｃｒｙ、−１ｇＧ−ＦＡ：０．２５ｍｇ／＋ＲＱ、実施例１の試薬り参 照。

Ｅ、　　ＰＢＳ、　２．５％ＢＳＡおよび０．３％２−クロロアセトアミド中で ｌＯおよびＯｎｇ／ｍＱの最終濃度に調製された葉酸標準溶液。

Ｆ、洗浄緩衝液：実施例１の試薬Ｆ参照。

Ｇ、　　２．４Ｍ　　ＤＥＡ、ｐＨ９，０゜Ｈ１２００ｍＭ　パラ−ニトロフェ ニルホスフェート、Ｏ，ｌＮＮ　ａ　ＯＨ。

１．１５０ｍＭホスフェート緩衝液、ｐＨ７，４゜アッセイ手順： １．５０μＱのＯおよびＩｏｎｇ／ｍＱ葉酸溶液をポリプロピレン試験管各３本 ずつに添加した。

２、　１００μａの複合体溶液をそれら葉酸標準溶液に添加し、それら溶液を渦 流動させそして３７℃で５分間インキュベ　−　　ト　　し　Ｉこ　。

３．２５μＱの試薬りを添加し、そしてそれら溶液を３７°Ｃで更に６分４０秒 間インキュベートした。

４、　３２５μｇの試薬Ｆを添加し、同相を室温で磁力的に分離し、そして上澄 を傾瀉した。固相を５００μＱの試薬Ｆで２回洗浄した。

５、　５５９μｇの試薬Ｇを各試験管に添加し、それら溶液を３７°Ｃとしｔ； 後に２１μｇの試薬Ｈを添加した。それら検体を３７℃で１０分間インキュベー トしそして反応を６００μｇの試薬Ｉの添加によりクエンチした。

６、同相を室温で磁力的に分離した。各溶液の４０５ｎｍにおける吸光度を測定 した。結果は第４表のとおりである。

第　　　４　　　表 抗−ＦＢＰ−ＡＰ力価に伴うアッセイ信号変化１　：　２００　　　　１　：　 ３２２２　　　　３．１０　　　　　０．５４１　：　４００　　　　１　：　 ３２２２　　　　２゜００　　　　　０．４２１　：　８００　　　　１　：　 ３２２２　　　　１．０９　　　　　０．２８実施例３は信号発生が結合タンパ ク質／抗体接合物比に比例することを実証している。与えられたアッセイ範囲に わたって所望される信号は抗体接合物の力価測定により至適化することができる 。

国際調査報告 ＋１１＋”＾ａ嘗＝”’ａｓ”””””ｐｃ’ｒ７ａｓ８９１００３４２

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．非免疫天然結合タンパク質を標識されていても、あるいは未標識のものであ ってもよく、そして該結合タンパク質に特異的である少くとも一種頬の第一モノ クローナル抗体と反応させ、次いでその第一抗体が未標識である場合にはその末 標識第一抗体を該第一抗体に対する標識抗体と反応させることにより成る非免疫 天然結合タンパク質の標識方法。
2. ２．結合タンパク質がビタミン、ホルモン、薬剤、アミノ酸、細胞受容体、発癌 物質、アロステリックタンパク質および炭水化物より成る群より選択される被分 析物質に対する結合タンパク質である請求項１記載の方法。
3. ３．モノクローナル抗体が、結合タンパク質を認識ずるが該結合タンパク質によ るリガンドの結合は妨げない抗体およびリガンド結合していない場合に結合タン パク質を優先的に認識する抗体より成る群より選択される請求項１記載の方法。
4. ４．モノクローナル抗体が、放射性同位元素、酵素、安定フリーラジカル、金属 ゾル、磁性、蛍光原性、化学発光性および電気化学的物質より成る群より選択さ れたリポーター系の成分で標識される請求項１記載の方法。
5. ５．標識抗体が免疫結合対または非免疫結合対の第一構成員を結合しており、該 第一構成員はその結合対の第二構成員と反応させ、更に該第二構成員はリポータ ー系の成分で標識される請求項１記載の方法。
6. ６．リポーター系の成分が放射性同位元素、酵素、安定フリーラジカル、金属ゾ ル、磁性、蛍光原性、化学発光性および電気化学的物質より成る群より選択され る請求項５記載の方法。
7. ７．ａ）リガンドを含むことが推測されるかまたは知られている検体を該リガン ドに対する天然結合タンパク質と共にインキュベートし、そして ｂ）リガンドと結合タンパク質の間の反応度を測定する ことより成り、結合タンパク質を標識されていてもあるいは未標識のものであっ てもよくそして該結合タンパク質に特異的である少くとも一種類のモノクローナ ル抗体と反応させ、そして該抗体が末標識である場合には次いでその未標識モノ クローナル抗体を該未標識抗体に対する標識抗体と反応させ、リガンドと結合タ ンパク質の間の反応度を結合したまたは未結合のモノクローナル抗体の量を測定 することにより測定することを特徴とする非免疫天然結合タンパク質に結合する リガンドを検出または定量するためのイムノアッセイ。
8. ８．結合タンパク貧がビタミン、ホルモン、薬剤、アミノ酸、細胞受容体、発癌 物質、アロステリックタンパク質および炭水化物より成る群より選択される被分 析物質に対する結合タンパク質である請求項７記載のイムノアッセイ。
9. ９．一種類または二種頬以上のモノクローナル抗体が、結合タンパク質を認識す るが該結合タンパク質によるリガンドの結合は妨げない抗体およびリガンドが結 合していない場合に結合タンパク質を優先的に認識する抗体より成る群より選択 される請求項７記載のイムノアツセイ。
10. １０．一種頬または二種類以上のモノクローナル抗体が放射性同位元素、酵素、 安定フリーラジカル、金属ゾル、磁性物質、蛍光原性物質、化学発光性物質およ び電気化学的物質より成る群より選択されるリポーター糸の成分で標識されてい てもよい請求項７記載のイムノアツセイ。
11. １１．一種類または二種類以上の標識抗体が免疫結合対または非免疫結合対の第 一構成員を結合しており、該第一構成員は結合対の第二構成員と反応し、そして 更に該第二構成員がリポーター系の成分で標識されている請求項７記載のイムノ アッセイ。
12. １２．リポーター系の成分が放射性同位元素、酵素、安定フリーラジカル、金属 ゾル、磁性物質、蛍光原性物質、化学発光性物質および電気化学的物質より成る 群より選択される請求項１１記載のイムノアッセイ。
13. １３．ａ）第一抗体、リガンドを含むことが推測されまたは知られている検体お よび該リガンドに対する天然結合タンパク質をインキュベートし、そしてｂ）リ ガンドと結合タンパク質の間の反応度を測定する ことより成り、結合タンパク質を標識されていてもあるいは未標識のものであっ てもよくそして該結合タンパク質に特異的である第二モノクローナル抗体と反応 させ、そして該第二抗体が未標識である場合には次いで該末標識第二抗体を該未 標識第二抗体に対する標識抗体と反応させ、リガンドと結合タンパク質の間の反 応度を結合したまたは未結合の第二モノクローナル抗体の量を測定することによ り測定することを特徴とする請求項７記載のイムノアッセイ。
14. １４．アッセイが逐次進行型のアッセイ（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｆｏｒｗａｒｄ 　ａｓｓａｙ）としてまたは同時型のアッセイ（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ａ ｓｓａｙ）として行われる請求項１３記載のイムノアツセイ。
15. １５．第一抗体が固定されている請求項１３記載のイムノアッセイ。
16. １６．結合タンパク質がビタミン、ホルモン、薬剤、アミノ酸、細胞受容体、発 癌物質、アロステリックタンパク質および炭水化物より成る群より選択される被 分析物質に対する結合タンパク質である請求項１３記載のイムノアッセイ。
17. １７．モノクローナル抗体が、結合タンパク質を認識するが該結合タンパク質に よるリガンドの結合は妨げない抗体およびリガンドが結合していない場合に結合 タンパク質を優先的に認識する抗体より成る群より選択される請求項１３記載の イムノアッセイ。
18. １８．モノクローナル抗体が免疫結合対、非免疫結合対、放射性同位元素、酵素 、安定アリーラジカル、金属ゾル、磁性物質、蛍光原性物質、化学発光性物質お よび電気化学的物質より成る群より選択されるリポーター系の成分で標識される 請求項１３記載のイムノアッセイ。
19. １９．一種類または二種類以上の標識抗体が免疫結合対または非免疫結合対の第 一構成員を結合しており、該第一構成員は結合対の第二構成員と反応し、そして 更に該第二構成員がリポーター糸の成分で標識されている請求項１３記載のイム ノアッセイ。
20. ２０．リポーター系の成分が、放射性同位元素、酵素、安定フリーラジカル、金 属ゾル、磁性物質、蛍光原性物質、化学発光性物質および電気化学的物質より成 る群より選択される請求項１９記載のイムノアッセイ。
21. ２１．ａ）固定されたリガンドまたはリガンドアナログ、リガンドを含むことが 推測されまたは知られている検体および該リガンドに対する天然結合タンパク質 をインキュベートする ことより成り、結合タンパク質を標識されていてもあるいは未標識のものであっ てもよくそして該結合タンパク質に特異的である少なくとも一種類のモノクロー ナル抗体と反応させ、そしてモノクローナル抗体が未標識である場合には次いで その末標識モノクローナル抗体を該未標識モノクローナル抗体に対する標識抗体 と反応させ、リガンドと結合タンパク質の間の反応度を結合したまたは未結合の モノクローナル抗体の量を測定することにより測定することを特徴とする請求項 ７記載のイムノアッセイ。
22. ２２．アッセイが逐次進行型のアッセイとしてまたは同時型のアッセイとして行 われる請求項２１記載のイムノアツセイ。
23. ２３．結合タンパク質がビタミン、ホルモン、薬剤、アミノ酸、細胞受容体、発 癌物質、アロステリックタンパク質および炭水化物より成る群より選択される被 分析物質に対する結合タンパク質である請求項２１記載のイムノアッセイ。
24. ２４．モノクローナル抗体が、結合タンパク質を認識するが該結合タンパク質に よるリガンドの結合は妨げない抗体およびリガンドが結合していない場合に結合 タンパク質を優先的に認識する抗体より成る群より選択される請求項２１記載の イムノアッセイ。
25. ２５．モノクローナル抗体が免疫結合対、非免疫結合対、放射性同位元素、酵素 、安定フリーラジカル、金属ゾル、磁性物質、蛍光原性物質、化学発光性物質お よび電気化学的物質より成る群より選択されるリポーター系の成分で標識される 請求項２１記載のイムノアッセイ。
26. ２６．モノクローナル抗体が免疫結合対または非免疫結合対の第一構成員を結合 しており、該第一構成員は結合対の第二構成員と反応し、そして更に該第二構成 員がリポークー糸の成分で標識されている請求項２１記載のイムノアッセイ。
27. ２７．モノクローナル抗体が放射性同位元素、酵素、安定フリーラジカル、金属 ゾル、磁性物質、蛍光原性物質、化学発光性物資および電気化学的物質より成る 群より選択されるリポーター系の成分で標識される請求項２６記載のイムノアッ セイ。