JPH06506058A - 分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分離方法 本発明は、（例えば、イムノアッセイ及び免疫センサーにおける）種の検出に用 途が見出される分離方法、検出に用いるのに適した方法、センサー及び試験キッ トに関する。

本発明の１つの態様によれば、分析対象種の検出のためのイムノアッセイ法に用 いるのに適した分離方法が提供されるが、この分離方法には支持物質上に提供さ れる補助種の使用、並びに補助種と結合し得る結合種の使用が含まれ、上記の結 合種は結合種との非特異的結合型の結合を包含するリンケージによって一次槽と 結合し得る非特異的結合型の結合の例は、共有結合である。従って、例えば非特 異的結合型の別の例は、吸着を包含する結合である。従って、例えば結合種及び −次槽は好適な物質（例えばラテックス粒子のような担体物質）上にともに吸着 されることにより結合し得る。

結合種は一次槽と直接又は間接的に（例えば、他の種を介して）結合し得る。

従って、例えば結合種が一次槽と直接結合されるよう配列した場合、リンケージ は結合種と一次槽との間の非特異的結合型の結合（例えば、共有結合）である。

さらに別の例によれば、結合種が一次槽と間接的に結合されるように配列した場 合、リンケージは１つ又はそれ以上の他の種を、そして必要な場合は１つ又はそ れ以上の結合を含み得るが、その結合の少な（とも１つは非特異的結合型の結合 種との結合である。

１つ又はそれ以上の結合がリンケージに包含され、結合の１つが非特異的結合型 の結合であり、さらにリンケージ中のあらゆる単数又は複数の結合があらゆる好 適な型（例えば非特異的結合型又は特異的結合型）であり得る；従って、例えば 、リンケージが非特異的結合型のさらに別の単数又は複数の結合を含み得るか或 いは特異的結合型のさらなる単数又は複数の結合（例えば、リガンド−バインダ ー型）、或いは種々の混合型の結合（例えば、非特異的結合型と特異的結合型） を含み得ると理解されるべきである。

結合種が他の種、例えば二次抗体又はリガンド又はバインダーを介して一次槽と 結合する場合は、例えば結合種は共有的に上記の他の種と結合し得る。

本発明による分離は補助種と結合種が一緒に結合するよう配列することにより有 効にし得ると理解されるべきである。

本発明の別の態様によれば、イムノアッセイによる分析対象種の検出に用いるの に好適な方法が提供されるが、この方法は支持物質上に提供される補助種の使用 、及び補助種と結合可能で且つ結合種との非特異的結合型の結合を含むリンケー ジにより一次槽と結合し得る結合種の使用を包含する。

さらに本発明の別の態様によれば、支持物質上に提供される補助種を包含し、分 析対象種の検出に使用するのに適したセンサーが提供される。

本発明のある態様によれば、支持物質上に提供される補助種を包含し、分析対象 種の検出に使用するのに適したセンサー、及び補助種と結合可能で且つ結合種と の非特異的結合型の結合を含むリンケージにより一次槽と結合し得る結合種の使 用が提供される。

例として、本発明によれば、分析対象種はこのように検出され得るし、或いは分 析対象種は検出される実体の一部であり得る（例えば、分析対象種は、分析対象 挿合有体である実体の一部であり得る）。さらに例として、本発明は分析対象種 に対する抗体又は検出される実体に対する抗体を利用し得る。

本発明によれば、さらに分析対象種の検出のためのイムノアッセイ法に用いるの に適した分離方法が提供されるが、この方法は支持物質上に提供される補助種の 使用、補助種と結合し得る結合種であって、結合種との非特異的結合型の結合を 含むリンケージにより一次槽と結合し得る結合種の使用及び分析対象種に対する 抗体の使用又は検出される実体に対する抗体の使用を包含する。

分析対象種に対する抗体又は検出される実体に対する抗体は、あらゆる好適な方 法、例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体の産主に関して知られている 方法により調製し得る。従って、抗体は、例えば動物を免疫化することにより産 生し得る。

本発明のある態様によれば、分析対象種の検出のためのイムノアッセイ法に用い るのに適した分離方法が提供されるが、この方法は支持物質上に提供される補助 種の使用、補助種と結合し得る結合種であって、検出される実体を有する結合種 の使用及び検出される実体に対する抗体の使用を包含する。

本発明はさらに、イムノアッセイによる分析対象種の検出に用いるのに適した方 法を提供するが、この方法は支持物質上に提供される補助種の使用、補助種と結 合し得る結合種であって、結合種との非特異的結合型の結合を含むリンケージに より一次槽と結合し得る結合槽の使用及び分析対象種に対する抗体の使用又は検 出される実体に対する抗体の使用を包含する。

本発明のある態様によれば、イムノアッセイによる分析対象種の検出に用いるの に適した方法が提供されるが、この方法は支持物質上に提供される補助槽の使用 、補助槽と結合し得る結合槽であって、検出される実体を有する結合槽の使用及 び検出される実体に対する抗体の使用を包含する。

本発明はさらに、分析対象種の検出のためのセンサーを提供するが、このセンサ ーは支持物質上に提供される補助槽であって、検出される実体を有する結合槽と の結合のために存在する補助槽を包含する。

例として、本発明のセンサーは補助槽のための支持物質として作用するのに適し た表面を包含し得る。

本発明のある態様によれば、センサーは、補助槽を固定化する表面を有する支持 物質を包含し得る。

表面は、例えば、ガラス、石英又は電極物質である。

本発明のさらに別の態様によれば、分析対象種の検出に用いるためのセンサーの 製造方法が提供されるが、この方法は、支持物質の表面に固定化補助槽を提供す る工程を含む。

結合槽は、好適な方法で且一つ好適な時機に、検出される実体を有するよう配列 し得る。従って、結合槽は、例えば補助槽と結合槽との間の結合が生じる前又は 生じた後に実体を有するよう配列し得る本発明による一次槽は、−次免疫結合反 応に参加し得る種である。例として、本発明の一次免疫結合反応は、分析対象種 が、又は検出される実体（分析対象種を含有する）が特異的結合反応を経るか、 或いは真正分析対象種（後述）が、又は検出される真正実体（後述）が特異的結 合反応を経るか、或いは分析対象種及び真正分析対象種が特異的結合反応を経る か、或いは検出される実体及び検出される真正実体が特異的結合反応を経るもの である（分析対象種及び真正分析対象種は他の種との特異的結合反応を経るが互 いに反応はせず、検出される実体及び検出される真正実体は他の種との特異的反 応は経るが互いには反応しないと考えられる）。

例として、−次種は一次抗体又はリガンド（例えば抗原）であり得る。例えば、 −次種は分析対象種に対する抗体、真正分析対象種に対する抗体、検出される実 体に対する抗体又は検出される真正実体に対する抗体であると理解されるべきで あって、所定のイムノアッセイに関しては、分析対象種に対する抗体及び真正分 析対象種に対する抗体は同一抗体であると考えられる。同様に、所定のイムノア ッセイに関して、検出される実体に対する抗体及び検出される真正実体に対する 抗体は同一抗体であると考えられる。さらに−次種は、例えば分析対象種、真正 分析対象種、検出される実体又は検出される真正実体であると理解されるべきで ある。

”抗体”という用語は、本明細書中で用いる場合（例えば−次抗体又は二次抗体 に関連して）は、全抗体又は抗体断片、例えばＦａｂ及び（Ｆａｂ）＊を包含し 、従って”抗体（複数）”という用語は、本明細書中で用いる場合は全抗体（複 数）及び抗体断片を包含する。

さらに、”真正分析対象種”は、実質的に同様の条件下で検出される分析対象種 と実質的に同様の方法で反応し得る種である、と理解されるべきである。同様に 、”真正実体”は実質的に同様の条件下で検出される実体と実質的に同様の方法 で反応し得る実体である、と理解されるべきである。

真正分析対象種は、特にカリブレーク−又は基準として用い得ると考えられる。

同様に、検出される真正実体は、特にカリブレーター又は基準として用い得ると 考えられる。

補助槽は、それ自体が分析対象種（又は真正分析対象種）或いは検出される実体 （又は検出される真正実体）との−次特異的結合免疫反応に参加しない種である 。

補助槽は、例えばあらゆる好適な方法で支持物質上に提供されるが１本明細書中 では”支持物質上に提供する”そして”支持物質上に提供される”という表現は 、例えば支持物質それ自体又は支持物質の一部が補助槽を提供する場合、及び支 持物質が補助槽を保有する場合を包含すると理解されるべきである。

従って、例えば、補助槽は支持物質の化学的基又は単位により提供され得るし、 補助物質は、例えば支持物質に結合し得る（例えば共有結合又は吸着により）。

支持物質が、例えばポリマーである場合、ポリマーの単位は補助槽として作用す る。さらに例として、支持物質上に存在する表面基、例えばポリスチレン又は修 飾シリカは補助槽として作用し得る。

例として、支持物質を配列させて単−補助槽を提供する代わりに、支持物質は所 望により補助槽のオリゴマー又はポリマーを提供する。

補助槽が支持物質と結合する場合、補助槽は支持物質と直接結合するか又は他の 種（例えば担体タンパク質）を介して間接的に支持物質と結合する。

ある態様において、本発明は、さらに直接又は間接的に補助槽を支持物質と結合 する工程を含む方法を提供する。

別の例として、支持体の表面はそれにより活性化されてリガンドを結合させる。

例えば、好適な支持物質表面は化学的処理により活性化されてリガンドと結合し 得る遊離アミノ基を提供する。

さらに例として、単−補助槽を遊離アミノ基と結合する代わりに（すぐ上に記載 したように生成される）補助槽のオリゴマー又は補助槽のポリマーを遊離アミノ 基と結合し得る。

さらに例として、補助槽は別の種（例えば担体タンパク質又はポリマー）と結合 （例えば共有的に又は他の方法で）し得るし、さらに別の種は補助槽が支持物質 上に間接的に提供されるようになるように支持物質と会合し得る。

さらに別の例として、単−補助槽を支持物質に間接的に結合させる代わりに、補 助槽のオリゴマー又はポリマーをさらに別の種（例えば担体タンパク質又はポリ マー）と結合させる（例えば共有的に又は他の方法で）ことができるし、さらに 別の種を補助槽のオリゴマー又は補助槽のポリマーが支持物質上に間接的に提供 されるようになるように支持物質と会合させ得る。

補助槽が支持物質と結合する場合、補助槽の結合はあらゆる所望の時に実施し得 る。従って、例えば補助種が支持物質と結合する前又は結合後に補助種を結合挿 と結合させ得る。しかし、概して、補助種及び結合種を結び合わせる前に補助種 を支持物質と結合させるのがより便利である。

補助種のオリゴマー又はポリマーの使用はある環境においては有益であると理解 されるべきである。従って、例えば補助種のオリゴマー又はポリマーの使用によ り単−補助種のみを用いる場合に提供され得るより多（の補助種が提供され得る 。従って、例えばより多くの補助種の提供は、より多くの補助種はそのための有 益な結合種との反応を経るのに用いられるため、より迅速な反応の可能性をもた らす。

結合種はあらゆる好適な方法で且つあらゆる好適な時機に補助種と結合するよう 配列し得る。従って、例えば、結合種は、補助種と結合する前又は結合後に一次 槽と（直接又は間接的に）結合するよう配列し得る。

補助種は、抗原リガンド（例えばハブテン）及び非抗原リガンドである好適なリ ガンド例である。

抗原リガンドの例としては、２．４−ジニトロフェノール、フルオレセイン、ジ ギトキシン、クマリン及びシバクロンブルーが挙げられる。

非抗原リガンドの例は、特異的リガンド−バインダ一対のリガンド（例えばリガ ンド−バインダ一対ビオチン−アビジンの場合のりガントビオチン）である。

支持物質と結合し得る（例えば共有結合により）又は非共有結合（吸着）である 補助種の別の例は、可溶性物質、例えばポリペプチド、タンパク質、多糖類及び 導電ポリマーのような可溶性分子（例えばポリマー）である。ハブテン機能はこ のような可溶性物質（例えばポリマー）と共有的に結合し得る。例として、補助 種は支持物質上のポリマーのコーティングとして提供される。

結合種は、補助種と結合し得るあらゆる好適な種であり得る。従って結合種は、 補助種と結合し得る”補助”結合種であると考えられる。

例として、結合種は結合タンパク質（例えば抗体又はリガンドのための結合パー トナ−）であり得る。

従って、例えば、補助種が抗原リガンドである場合、結合種はリガンドに対する 抗体である。補助種に対する抗体は抗補助種抗体であると考えられる。

従って、例えば、補助種がフルオレセイン、クマリン、２，４−ジニトロフェノ ール又はシバクロンブルーである場合、結合種はそれぞれ抗フルオレセイン抗体 、抗クマリン抗体、抗２，４−ジニトロフェノール抗体又は抗シバクロンブルー 抗体である。

すぐ上に記載したような抗体はあらゆる好適な方法、例えばポリクローナル又は モノクローナル抗体を産生ずるための公知の方法により調製し得る。従って、抗 体は、例えばリガンドの好適な誘導体と免疫原性担体タンパク質、例えばウシ血 清アルブミン又は鍵穴カサガイヘモシアニンとの抱合体で動物を免疫化すること により産生じ得る。動物を免疫化することにより得られた物質は所望の場合は（ 例えばアフィニティークロマトグラフィーを用いて）精製して必要な抗体を得る ことができる。

例えば、補助種が非抗原リガンドである場合は、リガンドは例えば結合種が非イ ムノグロブリン（例えば天然タンパク質）である結合パートナ−であるようなも のである。結合パートナ−はリガンドのバインダーであると考えられる。このよ うな結合パートナ−の例は、ビオチン−アビジン複合体を含む特異的リガンド− バインダ一対におけるアビジンである。

従って、本発明の分離方法は１例えばフルオレセイン／抗フルオレセイン抗体、 クマリン／抗クマリン抗体、２．４−ジニトロフェノール／抗２，４−ジニトロ フェノール抗体、シバクロンブルー／抗シバクロンブルー抗体又はビオチン−ア ビジン複合体を含有する分離系を利用し得る。

本発明は、あらゆる好適なサンプル中の例えば分析対象種の検出に、又は検出さ れる実体の検出に用途を見出し得る。従って、例えば水、土壌、生体種（例えば 植物（例えば野菜）又は動物）又は空気の試料は、本発明による検出のための分 析対象種又は検出される実体を提供し得る。分析対象種又は検出される実体が本 発明により検出され得る生物学的サンプルの例としては、血液、血漿、血清、尿 、唾液又は乳汁が挙げられる０分析対象種又は検出される実体は、例えば水、水 性標本又は液体抽出物中に存在し得る０分析対象種は、例えばハブテンである。

本発明により検出される分析対象種の例を以下に挙げる＝（ａ）ステロイドホル モン、例えばプロゲステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン又はエストラ ジオール（例えば血液、血清、唾液、尿又は乳汁の試料中）； （ｂ）ホルモン、例えば甲状腺ホルモン（例えばチロキシン又はトリョードチロ ニン）； （ｃ）薬剤、例えば乱用薬（例えばフェノバルビタール）及び治療薬（例えばジ ゴキシン）（例えば血液、血清、唾液又は尿の試料中）； （ｄ）ポリペプチドホルモン（例えば血液又は尿の試料中）；（ｅ）腫瘍マーカ ー、例えばマーカータンパク質（例えば血液又は血清の試料中）； （ｆ）ヒト血清アルブミン； （ｇ）ヒト塩素イオンゴナドトロピン（ｈＣＧ）ｉ（ｈ）ヒトＩｇＧ。

（ｉ）タンパク質抗原； （ｊ）血中タンパク質（例えばイムノグロブリン、酵素マーカー又は受容体）： （ｋ）尿疾患試験により生じるマーカータンパク質；（１）殺虫剤、農薬又は除 草剤（例えば水又は土壌中）；（ｍ）毒素（例えば飼料及び食料品から抽出され るもの）；（ｎ）微生物（例えばウィルス及び細菌）。

本発明により検出される分析対象種の別の例としては、金属の錯体が挙げられる 。

従って、本発明は、例えば金属の錯体、例えば有毒とみなされる強金属錯体（例 えば環境中に存在する生物学的存在中）の検出に用途を見出し得る。

本発明により検出され得る金属錯体の例としては、メチル水銀が挙げられる。

さらに別の例として、金属イオンは錯生成剤（例えばキレート化剤）の使用によ り金属の錯体中に生じ、このように生成された錯体は本発明による分析対象種と して作用し得る。

さらに別の例として、金属は後にさらに開示されるように本発明に従って検出し 得る。

本発明により用途が見出される支持物質の例としては、固相物質、例えば反応容 器壁、不溶性多糖類、微小粒子（例えば粒状ミクロセルロース）、ポリスチレン （例えばウェル、ビーズ、顕微滴定プレート、円板、スティック又は管の形態で ）、架橋デキストリン（例えばセファデックス）、不溶性ポリマー構造、ガラス 表面、誘導化シリカ表面（例えば、結合された化学的機能を伴うシリル基を有す る）、好適な表面（例えばガラス表面）に付着した可溶性ポリマー、酸化第一鉄 を閉じ込めた微粒子物質（磁化粒子）、ナイロン及びポリアミドが挙げられる。

い（つかの種類の支持物質はいくつかの分析対象種及び検出されるい（つかの実 体と一緒に用いるには不適当であると考えられる。

従って１例えば分析対象種が金属イオンである場合、又は検出される実体が金属 を含有する場合は、いくつかの種類の支持物質を用いるのは不適切である（例え ば、酸化鉄を封じ込めた支持物質が許容不可能な妨害を生じる恐れがある）。

本発明は、例えば無標識又は検出可能な種依存性（例えばトレーサ一種依存性） 検定法、例えば酵素イムノアッセイ、フルオロイムノアッセイ及びラジオイムノ アッセイに用途を見出し得る６例として、本発明は抗体標識化又は抗原標識化検 定に用途を見出し得る。

例として、分析対象種又は検出される実体の検出において本発明に従って、あら ゆる好適な検出可能種を用い得る。検出可能種は例えば検出可能構造であると理 解されるべきである。

検出可能種の例としては、酵素、フルオロフォア（又は高分子フルオロフォア） 、放射性同位元素、リガンド（又はリガンドのポリマー）及びバインダーが挙げ られる。

例として、酵素は、対応する基質により検出し得るし、フルオロフォア及び放射 性同位元素は好適な検出器で直接検出し得るし、リガンドはそのためのバインダ ーを用いて検出し得るが、そのバインダーはトレーサ一種と捨合し、そのための リガンドを用いて検出し得る。そのリガンドはトレーサ一種と摺合する。

トレーサ一種は、例えばタンパク質結合検定（例えば、イムノアッセイ）に関す る当業界で公知のもののようなあらゆる好適なトレーサ一種であり得る（トレー サ一種は信号積又は標識種であるとも考えられると理解されるべきである）。

トレーサ一種の例としては、酵素（例えば、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガ ラクトシダーゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ）、フルオロフォア（例え ば、フルオレセイン、クマリン又はローダミン）、化学発光化合物、生物発光化 合物、放射性同位元素及び染料が挙げられる。

検出可能種からの信号の検出又は測定は、免疫化学分野で公知のもののようなあ らゆる好適な方法で実施し得る。

例えば、（前述のように）検出可能種としてリガンド又はバインダーを用いる場 合、あらゆる好適なリガンド又はバインダーを利用し得る。

検出可能挿として利用し得るリガンドの例としては、ハブテンであると考えられ る抗原（例えば、２．４−ジニトロフェノール、フルオレセイン、ジギトキシン 、クマリン及びシバクロンブルー）、及び非抗原リガンド、例えば特異的リガン ド−バインダ一対のリガンド（例えば、ビオチン）が挙げられる。

検出可能種として利用し得るバインダーの例としては、抗体（例えば、抗２，４ −ジニトロフェノール抗体、抗フルオレセイン抗体、抗ジギトキシン抗体、抗ク マリン抗体及び抗シバクロンブルー抗体）、及び特異的リガンド−バインダ一対 のバインダー（例えば、アビジン）が挙げられる。すぐ上に開示したもののよう な抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体の産主に関して公知のものの ようなあらゆる好適な方法により調製してもよく、従って、抗体は、例えば動物 を免疫化することにより産生じ得ると考えられる。

本発明は、免疫学的検出又はイムノアッセイのあらゆる好適な形式に用途を見出 し得るが、それらの例としては競合的イムノアッセイ法、非競合的イムノアッセ イ法及びサンドイッチイムノアッセイ法が挙げられる。

本発明に従って検出可能種を用いる場合、検出可能種は、例えばあらゆる好適な 方法及びあらゆる好適な時機にあらゆる選ばれた種又は実体と会合するよう配列 し得る。従って、例えば、検出可能種は結合種と又は真正分析対象種と、又は真 正実体積（検出される真正実体である）と、又は−次抗体と、又は二次抗体と（ イムノアッセイを用いるのが適切である場合）会合し得る。

ここで本発明を、競合的イムノアッセイ法及び非競合的イムノアッセイ法を参照 して、実施例のみによりさらに説明する。

すぐ下で説明する２つのイムノアッセイ法においては、抗補助種抗体を用いる。

（ここで、例えば補助種が、抗原であるハブテンである場合、抗補助種抗体は抗 補助ハブテン抗体であると考えられる）。前記の開示された抗補助種抗体は好適 な方法、例えばポリクローナル及びモノクローナル抗体を産生ずるための公知で ある方法により調製し得る。

例として、本発明の分離方法を包含する競合的イムノアッセイ法においては、以 下のことが起こり得る：（ａ）補助種を高濃度で支持物質に導入する（例えば共 有結合により）か、又は支持物質それ自体をアレンジして補助種を提供する（ｂ ）補助種に対する予調製抗体を共有結合により問題の真正分析対象種と結合させ る； （ｃ）抗分析対象抗体（これは、例えば、−次抗体と呼ばれる）をトレーサ一種 （信号を発生し得る）（例えば、蛍光物質又は酵素）で標識する； （ｄ）−次免疫反応と呼ばれるものにおいては、分析対象種（存在すれば）、適 量の標識化−次抗体、及び補助種に対する抗体に結合した真正分析対象種を溶液 中で混合させる。

−次免疫反応は、短時間で平衡を得るか又は平衡に近づき（例えば、３７℃〜４ ２℃の温度で）、それにより一次免疫反応混合物を生じると予測し得る。−次反 応混合物は特に結合及び未結合画分を含有すると考えられる。

次に、支持物質上に提供される中等度に”過剰０の補助槽（例えば、支持物質に より担持されるか、支持物質それ自体により提供されるか、又は支持物質それ自 体の一部である）を−次免疫反応混合物に加えるか、或いは一次免疫反応混合物 を支持物質上に提供される（例えば支持物質又はその一部により提供されるか、 或いはそこに付着する）”過剰”の補助槽と接触させる。

（すぐ上の段落で用いた”過剰”という用語は、補助槽に対応する結合種に関し て補助槽部位に換算して”過剰”であることを意味すると考えられる）。

補助槽が、補助槽に対する抗体に関して非常に大過剰に存在するため、結合反応 は迅速に起こり、補助槽に対する抗体が有効に高比率で生じ、支持物質と結合す るようになると予測し得る０例として、すべてではないがいくつかの状況では、 ９９％もの抗体が支持物質と結合するようになる。

従って、結合種と補助槽との結合により、トレーサ一種な担持するある抗体が真 正分析対象種と結合されることにより、順次結合種と結合する支持物質上に保持 される。トレーサ一種を担持する保持抗体の割合は、所定のサンプル中の”競合 ”分析対象種（もしあれば）の濃度に依る。競合分析対象種は基準又は未知量で ある。

支持物質を適切な緩衝液で洗浄して、未結合物質を除去し、支持物質と会合する トレーサ一種活性を当業界で公知の方法のようなあらゆる好適な方法で測定する 。

任意に、適切な緩衝液を用いてトレーサ一種活性を溶液中に溶離し、トレーサ一 種の測定を容易にし得る。

本発明のいくつかの態様（例えば、表面プラスモン共鳴原理に基づいた、又は無 限小波蛍光に基づいた光学的免疫センサーの使用を包含する態様）では、洗浄工 程は必要ない、従って、支持物質（例えば、センサー表面）と組合わせるトレー サー活性は未結合物質の存在下で測定し得る。

標準量の真正分析対象種の使用により、次に、未知量の分析対象種を測定し得る ように較正を実施し得ると理解されるべきである。

競合イムノアッセイでは、分析対象種の量が増加すると支持物質上に保持される トレーサ一種の量は減少し、逆に分析対象種の量が減少すると支持物質上に保持 されるトレーサ一種の量は増加して分析対象種が存在しない場合は最大量に達す ると考えられる。

例として、本発明による分離方法を包含する非競合イムノアッセイ法では、以下 のものを用い得る： （ａ）分析対象種に対する抗体じ信号”抗体）、これを信号を発し得るトレーサ 一種（例えば、蛍光物質又は酵素）と複合させる（ｂ）”固定化”抗体を含有す るハイブリッド複合体、これを補助槽に対する抗体と複合させる； （ｃ）分析対象種（例えば、高分子の抗原物質）；（ｄ）補助槽をそれ自体提供 するか又はそれに付着させる支持物り さらに例として、本発明の分離方法を包含する非競合的イムノアッセイ法におい ては、以下のことが起きる：（ｉ）問題の分析対象種及びトレーサ一種と複合す る”信号”抗体を溶液中で混合すると、分析対象種が信号抗体と結合する；（ｉ 　ｉ）溶液中の（ｉ）で生成された反応混合物に中等度”過剰”の固定化抗体ハ イブリッド複合体（即ち補助槽に対する抗体と複合した固定化抗体）を加えると 、分析対象種を”間にはさむ（ｓａｎｄｗｉｃｈｉｎｇ）”する免疫複合体が生 成される；（ｉ　ｉ　ｉ）過剰の支持物質（例えば、それ自体補助槽を提供する か又はそれに補助槽を付着させた）を（ｉｆ）で生成した反応混合物に加えるか 、又は（ｉｉ）で生成した反応混合物を過剰の支持物質（例えば、それ自体補助 槽を提供するか又はそれに補助槽を付着させた）と接触させて、補助槽に対する 抗体（固定化抗体と複合する）が補助槽（供給された又は支持物質上の）と結合 するようにする。この結合により分析対象物に結合している”信号”抗体のみが 支持物質に付着するようになる。

支持物質を適切な緩衝液で洗浄して未付着”信号”抗体を除去する。

支持物質上に残留し分析対象種の濃度に直接比例するトレーサ一種の量は、当業 界で公知の方法のようなあらゆる好適な方法により測定し得る。

本発明のい（つかの態様（例えば、表面プラスモン共鳴原理に基づいた又は無限 小波蛍光に基づいた光学的免疫センサーの使用を包含する態様）においては、洗 浄工程は必要ない。従って、支持物質（例えば、センサー表面）と組合わせるト レーサー活性は、未結合物質の存在下で測定し得る。

基準量の真正分析対象種を用いることにより、次に未知量の分析対象種を測定し 得るように較正を実施し得ると理解されるべきである。

異種免疫化学分析（イムノアッセイ）においては、結合及び未結合状態間の検出 可能種（例えばトレーサ一種）の分布を評価するために、検出可能種（例えばト レーサ一種）の結合及び未結合画分の分離のための要件が存在すると考えられる 。イムノアッセイ法におけるこの分離工程はこのような方法の最も重要な特徴を 有するものであると考えられる。

分離工程の実際的重要性は、その工程の効率、その簡易性（又は別の方法）及び その速度が検定法の一般的特性に影響を及ぼし得るし、検定法の性能に作用し得 るという事実を基礎にしている。

検出可能種（例えばトレーサ一種）の結合及び未結合画分の分離は、固相固定化 抗体法を用いて実施し得るが、この場合、抗体を反応容器（ポリスチレン管）の 表面に吸着させるか又は微小粒状物質、例えばミクロセルロース、セファデック ス、又は酸化第一鉄を閉じ込めた微小粒状物質（磁化粒子）と共有結合させる。

イムノアッセイにおける分離に固定化抗体を用いると、いくつかの不利益を蒙る 恐れがある０例えば、抗体と分析対象種（又は真正分析対象種）との間の相互作 用は、溶液に溶解した同−抗体及び分析対象種（又は真正分析対象種）を用いて 生じるよりもかなり遅い（即ち、平衡に達するのに長時間を要する）。

さらに、固相上の抗体の固定化は、問題がない操作というわけではない、従って 、例えば制御又は再現するのが難しく、重大なタンパク質漏出が起こり得る。

本発明は、迅速固相分離法の便利性を有する溶液中での反応の利点を提供し得る 。

検出される実体に対しては前述を参照されたい。例えば検出される実体は、例え ば分析対象種と好適な作用物質との相互作用により生成される分析対象種含有種 （即ち分析対象種を含有又は担持する種）である。

従って、本発明のある態様において、分析対象種と又は真正分析対象種と相互作 用して検出される実体を生成し得る作用物質の使用、作用物質との組合わせのた めの結合種の使用、補助槽の使用、支持物質の使用及び検出される実体に対する 抗体の使用を包含し、上記結合種及び上記補助槽が一緒に結合し得るものである 方法が提供される。

分析対象種又は真正分析対象種１作用物質、結合種、補助槽、支持物質及び抗体 は任意の好適な方法で及び任意の好適な時機に結合させ得ると理解されるべきで ある。

従って例として、本発明は、分析対象種と、分析対象種と相互作用し得る作用物 質を担持する結合種とを結び合わせてそれにより検出される実体を生成するよう に分析対象種と作用物質との相互作用を実行させ、このようにして生成される検 出すべき実体を担持する結合種を支持物質上に提供される補助槽と結合させて結 合種と補助槽との間に結合を生じ、検出される実体に対する抗体がその実体と結 合するように抗体を適用する工程を包含する方法を提供する。

さらに別の例として、すぐ上に開示した例の代わりとして、分析対象種が作用物 質と相互作用して検出される実体を生成する前に補助槽及び分析対象種と相互作 用し得る作用物質を担持する結合種を配列して一緒に結合させてもよい。

検出される実体に対する抗体は検出される実体に対する特異的抗体である抗体で あると考えられる。

本発明によれば、検出される実体に対する抗体は、任意に検出可能種（前記した ように）を担持し得る。従って、例えば、検出可能種はトレーサ一種（例えば酵 素トレーサー、蛍光トレーサー又は放射性トレーサー）でありうる。

従って、本発明のある態様によれば、結合種と補助槽との間に結合が生じるよう に結合種と支持物質上に提供される補助槽を結び合わせ、結合種が検出される実 体を有するように配列し、検出される実体に対する抗体であって且つトレーサ一 種を担持する抗体をそれが検出される実体と結合するように適用し、トレーサ一 種により抗体と実体との結合を検出する工程からなる方法が提供される。

結合種は、あらゆる好適な方法で及び任意の好適な時機に（例えば結合種と補助 槽の結合の前又は後に）、検出される実体を担持するように配列し得る。

検出される実体を生成し得るあらゆる好適な作用物質は１本発明の結合種が担持 し得る０分析対象種との複合体を生成し得る作用物質は、本発明によって検出さ れる実体の生成に用途を見出し得る作用物質の一例である。

分析対象種が金属（例えば金属イオンの形態）である場合、結合種が担持する作 用物質は、例えば金属含有種（例えば金属の錯体）を生成し得る作用物質である 。

金属との錯体を生成するための作用物質の例としてはキレート化剤が挙げられる 。

従って、本発明のある態様においては、キレート化剤の１つ又はそれ以上の分子 を有する結合種と金属イオンを含有する分析対象種とを結び合わせて検出される 実体として金属−キレート錯体を担持する結合種を生成し、金属−キレート錯体 を担持する結合種と支持物質上に提供される補助槽とを結び合わせて結合種と補 助槽との間に結合を生じさせ、検出される実体に対する抗体であって検出可能種 を担持する抗体をそれが金属−キレート錯体と結合するように適用し、そして抗 体と金属−キレート錯体との結合を検出する工程からなる方法が提供される。

例として、抗体は酵素トレーサーを含有し且つ抗体と金属−キレート錯体との結 合をおそらく酵素誘発性変化により検出する検出可能種を担持し得る。

酵素誘発性変化は、例えば、色変化又は蛍光変化又はルミネセンス変化又は電気 化学的変化である。

抗体は金属−キレート複合体を認識するが、金属イオンと錯体を作らないキレー ト北側分子を認識しないようなものであると考えられる。

従って、抗体は金属−キレート錯体に関して特異的である。さらに、抗体は特定 の金属イオンとキレート化剤との錯体に対して特異的であるようなものであり、 従って同一キレート化剤と錯体な作る他の金属イオンを含有する錯体と有意に結 合しない。

金属キレートを生成するためのキレート化剤の例を以下に挙げるエチレンジアミ ンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタアセテート（Ｄ ＴＰＡ）、シクロヘキシレンジニトリロ四酢Ｍ　（ＣＤＴＡ）、１−ベンジル− ＥＤＴＡ、ｌ−ベンジル−ＥＤＴＡの誘導体、８−ヒドロキシキノリン、８−ヒ ドロキシキノリンの誘導体及びデフェロキサミン。

作用物質は任意の好適な方法で（例えば、作用物質と結合種との間の共有結合に より）、結合種に担持される０例として、１単位の作用物質が結合種と結合し得 るか、或いは１単位を超える作用物質が結合種と結合し得る。従って、例えば１ 分子の作用物質が結合種と結合し得るか、或いは、例えば１分子を超える作用物 質が結合種と結合し得る。

前述の開示から、本発明のある態様においては、方法は、分析対象種の複合体を 生成し、このように生成された複合体が検出される実体を提供する工程を包含す ると考えられる。

さらに前述の開示から、本発明のある態様において、方法は作用物質を結合種と 直接又は間接的に結合する工程を包含すると考えられる。

本発明は、例えば環境的又は臨床的又は工業的サンプル中の（例えば、遊離水和 金属イオンの形態）金属の検出に用途を見出し得る本発明は、例えば環境に有毒 であると考えられる金属の検出及び測定に用途を見出し得ると理解されるべきで ある。従って、本発明は環境モニタリングに適用し得る。

従って、例えば、一般的にｐＩ）ｂ範囲である金属イオンの濃度（例えば、重金 属イオンの濃度）のレベルは、あらゆる好適な方法で検出及び測定し得る。従っ て、例えば水、土壌、生体物質（例えば、植物（例えば野菜）又は動物）又は空 気の試料は本発明による検出のための分析対象種又は検出される実体を提供し得 る。

好ましくは、試料の採集操作及びあらゆる濃縮操作は、外部供給源からの夾雑物 を最小にするようにすべきである。

例として、本発明の検出を施される試料は水性試料が便利である検出し得る金属 の例を以下に示す： カルシウム（Ｃａ”）、鉄（Ｆ　ｅ　”、Ｆｅｌ１１）、コバルト（Ｃ０１１、 Ｃｏ”’）、アルミニウム（Ａｌｌ１１）、亜鉛（Ｚ　ｎ＋１）、鉛（Ｐｂ”） 、銅（ＣｕＩＩ、Ｃｕ’　）、カドミウム（Ｃｄ”）、バナジウム（Ｖｌｌ、Ｖ ■）、銀（Ａ　ｇＩ　、　Ａ　ｇｌｌ）、水銀（Ｈｇ’）（ｇｌｌ）、インジウ ム（ＩｎＩＩ＋）、マンガン（Ｍｎ”）及びニッケル（Ｎｉｎ＋）。

検出される実体及び実体に対する抗体はあらゆる好適な方法で結合し得ると考え られる。従って、例えば、本発明による検出される実体と抗体との結合は、水性 媒質中で実施し得る。

上記開示したように、検出される実体に対する抗体は、好適な方法、例えばポリ クローナル又はモノクローナル抗体の産主に関してあらゆる公知の方法により調 製し得る。従って、抗体は、例えば動物を免疫化することにより産生じ得る。

例えば、分析対象種を、実体（例えば分析対象種の複合体）を生成するように作 用物質と反応させ、実体に対する抗体を調製するために用いる前に実体を担体タ ンパク質と複合させる。

抗体を調製するために用いる場合、実体はハブテンとみなされると理解されるべ きである。

さらに別の例として、作用物質な担体タンパク質と複合させ、次に作用物質と反 応するように分析対象種を導入して、実体を有する担体タンパク質が実体に対す る抗体を調製するのに用いられるよう実体（例えば、分析対象種の複合体）を生 成する。

従って、例えばｐ−アミノベンジル−ＥＤＴＡのようなキレート化剤をｐ−アミ ノ官能基のチオシアネート誘導体又はジアゾ誘導体を介してウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）又は鍵穴カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）と複合させ、この複合から 生じた物質を過剰量の金属の塩（例えば、硝酸鉛又は硝酸コバルト）と反応させ ると、金属イオン−ＥＤＴＡ−ＢＳＡ種又は金属イオン−ＥＤＴＡ−ＫＬＨ種が 生じる。

過剰量の金属塩を除去（例えばゲル濾過又は透析により）後、例えば４〜６か月 間動物を免疫化することにより、このような種を用いて金属イオン−ＥＤＴｌｉ 体に対する抗体を産生じ得る。

結合種と支持物質上に提供される補助種との結合後、結合種はさらに、実際上、 支持物質に付加されると考えられる。従って、例えば結合種が分析対象種に又は 検出される実体に付加され、分析対象種に対する又は検出される実体に対する抗 体が適用された場合、結合抗体は、実際上、支持物質に付加される（順次、分析 対象種又は検出される実体、結合種及び補助種を介して）。

従って、あらゆる必要な洗浄工程（例えば、適切な緩衝液を使用）を用いて未結 合物質を除去し得る。

支持物質上に残留するトレーサ一種の量は、分析対象種又は検出される実体の濃 度に直接比例し、あらゆる好適な方法１例えば当業界で公知の方法により測定し 得る。

検出される実体（例えば、金属錯体）に対する抗体の使用により、このようにし てなされる検出が実体に対して、従って実体の一部であるあらゆる分析対象種に 対して特異的且つ感受性であるように抗体及び実体の結合は特異的であり得ると 理解されるべきである。

例として、ナノモルないしピコモル（即ち１０１〜１０−”　Ｍ）範囲での分析 対象種濃度が、本発明により検出し得る（例えば酵素標識化イムノアッセイ法の ようなイムノアッセイ法を用いて）。

本発明による検出の感度は、”検出限界”として表す（”定量化限界”としても 当業界に公知である）、この限界は、反応の変化と反応の変化を引き起こす分析 対象種の濃度との間の関係に関連する”検出限界“は、分析法により検出され得 る分析対象種の最低濃度又は量（通常濃度単位で表す）である。

”検出限界”は、概して、有意であるためには少なくとも９５％信頼限界を有す る必要がある。

標識化イムノアッセイ法の使用を含む本発明の検出のための方法の一例において 、検出の感度に影響を及ぼす因子を以下に挙げる：（ａ）分析対象種又は検出さ れる実体に関する抗体の親和性；（ｂ）用いるあらゆる検定トレーサーの特異的 活性；（ｃ）信号種の性質（即ち、使用する信号種の種類（例えば、放射性トレ ーサー、酵素トレーサー又は蛍光トレーサー））；（ｄ）検定バックグラウンド （即ち、バックグラウンド”ノイズ”）：及び （ｅ）検定信号を測定するために用いる計測。

例えば検出される実体が本発明により検出されるものである場合、検出される実 体は満足のいく検出が実施されるよう十分に安定である必要があると考えられる 。さらに実体は、実体に対する抗体に関して”ハプテン”として作用するもので あるとみなされると考えられる。

本発明により検出される実体及び実体に対する抗体を用いる場合、検出される実 体の一部を構成する本発明の分析対象種の検出に関連した特異性は、検出される サンプルが種の混合物を含有する場合は、検出が分析対象種（例えば金属イオン ）と他の種（例えば他の金属イオン）との間を区別する程度として明示し得る。

従って、検出の特異性は、他の種（例えば妨害反応を生じ得る単数又は複数の錯 体）の存在下での検出される実体に対する抗体の特異性に依っている。

例えば、分析対象種と錯体を生成し得る作用物質は、分析対象種以外の他の種と も錯体を生成し得る。

このような状況では、抗体（即ち、分析対象の錯体に対する抗体）と、作用物質 と分析対象種以外の種との錯体とがある種の”交叉反応”を起こし得る。

例として、抗体の交叉反応を測定するためのある方法は、競合イムノアッセイ法 における固定化−次抗体及び分析対象種の標識化錯体を用いる。従って、分析対 象種濃度範囲及び”限定”量の固定化抗体を用いて較正曲線（即ち、標準曲線） を作成し得る０分析対象種の限定量の標識化錯体の結合は、分析対象種の競合標 準錯体の不在下で、且つこのような基準のレベル増大下でモニターする。

較正曲線じ用量反応曲線”）は、基準の濃度に対する結合トレーサーのレベル（ ％結合として）をプロットすることにより作成する。トレーサーの結合は１００ ％（基準の０％が結合される場合）としてされ、トレーサーの総量は１００％と されると理解されるべきである。

分析対象種以外の種と錯化された同一作用物質を含有する錯体（分析対象種を錯 化するのに用いるのと同様に）の公知の濃度範囲を基準値と置き換えて、上記の 工程を反復する。他のパラメーターはすべて実質的にそのままとする。

従って、基準及び可能な”交叉反応”が考えられる錯体の一連の用量反応曲線を 、グラフ上に一緒にブロッティングする。

交叉反応値（ＣＲ）を１００ｘ基準及び可能な交叉反応が考えられる錯体のモル 濃度比として算出し、５０％までのある程度のトレーサー結合を得る（競合実体 の不在下での結合値を１００％とする）。

前述の開示から、例として本発明の分析対象種の検出は免疫化学的検出方法、例 えばイムノアッセイ法を用いて実施し得ると理解されるべきである。

例えば、分析対象種と相互作用し得る作用物質を用いて検出される実体を生成す る場合、分析対象種（例えば、金属イオン）は、結合種と組合せ得る作用物質と の相互作用により試料から抽出し、それにより検出される実体を生成し得る。

次いで、結合種を支持物質上に提供される補助種と結合し、次に標識化抗体を適 用する。存在する実体の量（それゆえサンプル中に存在する分析対象種の量）は イムノアッセイに関して公知の方法に依り測定し得る。

本発明はさらに、センサー、例えば光学的免疫センサー及び電気化学的免疫セン サーのような免疫センサーに対して、補助種を担持するセンサー表面が種々の又 はすべての分析対象種に対して同一であり、それにより一般的センサー横簗を提 供するという可能性を提供する。

補助種を担持するセンサー表面からなる結合も、例えば何回も再利用するため再 生できるようなものである。例えば、このような補助種を担持するセンサー表面 の結合は、好適な緩衝液配合物（例えばＯ，ＬＭ　グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２， ５）で洗浄することにより結合物質を除去して再生し得る。

さらに例として、低又は高ｐＨの有接溶媒で、及び／又はカオトロピック試薬で 何回も処理し、それにより何回も再利用のため再生できるよう安定であるように 補助種を選択する。

従って、本発明は免疫センサー又は免疫電極のような非専用センサーを構築する 可能性を提供する。

従って、例として、電極表面が補助種として作用するよう配列される導電ポリマ ー（例えば、ポリピロールポリマー）で被覆された電気化学的免疫センサーが提 供される。このようなセンサーで用いるために、当業界で公知の方法のような好 適な方法により導電ポリマー（例えば、ポリピロールポリマー）又はそのセグメ ントに対する抗体を産生じ得る。電極表面及び導電ポリマーコーティングからな る結合は、例えば何回も再利用するために再生できるようなものである。

例として、前述した競合及び非競合性イムノアッセイの方法は、すぐ上に記載し たように、電気化学的免疫センサーに用い得る。このような電気化学的免疫セン サーに用いるためのトレーサ一種は、電気活性種を提供するよう配列する。

当業界で公知の従来の電気化学的免疫センサーにおいては、特異的抗体を電極表 面に固定し、それにより専用免疫センサーを提供し得る。このような免疫センサ ーは、同一特性を有する多数電極が必要な場合には、固有の拘束を有する。従っ て、センサーの再生が難しいか又は再生すると抗体活性の劣化をもたらすため、 欠点が明らかになってくる。

本発明は、このような欠点を除く可能性を提供し得るが、その場合、本発明のセ ンサーが専用センサーである必要がない。

例として、本発明の分析対象種の検出は免疫センサー法を用い得ると前述から考 えられる。

例えば、補助種をセンサー装置の表面（例えばガラス表面、石英表面又は電極表 面）に固定し得る。

例えば、直接光学免疫センサーを用いる場合は、標識は用いず、分析対象種又は 検出される実体と抗体との結合により信号が発生して検出がなされる（例えば、 表面プラスモン共鳴による）。

さらに別の例として、標識化抗体免疫センサーを用いる場合、信号発生は標識に より発生される信号の性質に適した方法により検出し得る（例えば標識が蛍光発 生実体である場合には蛍光発光を測定するための手段を用いる）。

本発明のさらに別の態様によれば、本発明の方法の使用を包含する試験キットが 提供される。このような試験キットは、例えば支持物質上に提供される補助種、 及び結合種を包含し得る。ある態様では、結合種は、分析対象種と接触した場合 に検出される実体を生成し得る作用物質を保有し得るし、実体に対する抗体を用 い得る。免疫学的方法により測定するための手段、生成される実体の量、それゆ え所定の試料（例えば水性試料）中に存在する分析対象種の量を用いてもよい。

本発明の検出は、例えば定性的又は定量的であると考えられる。

定量検定は濃度レベルを測定するために用い得るとも考えられる。

さらに、本発明は分析対象種又は検出される実体を含有する試料に、そして実質 的に分析対象種又は検出される実体を含有しない試料（例えば”ブランク”基準 サンプル又は本発明により検出した場合に実際に分析対象又は検出される実体を 含有しないことが判明した”未知”サンプル）に用い得ると考えられる。

さらに例として基準量の真正分析対象種又は検出される真正実体を用いることに より、続いて未知量の分析対象種又は未知量の検出される実体を測定し得ると考 えられる。

本発明はさらに１本発明の方法の使用を包含するセンサーを提供する。

以下の実施例により本発明をさらに説明する。

夾施侃 実施例１ 抗−１７β−エストラジオール−抗血清の調製例として、本発明の分離における 補助種−結合種対系の使用、ＥＬＩＳＡ（酵素標識化免疫溶媒検定）における結 合及び未結合画分の使用を説明するための分析対象種として１７β−エストラジ オールを選択した。従って、１７β−エストラジオールに対する抗体を調製する 必要があった。

１７β−エストラジオール−３−（０−カルボキシメチルエーテル）　（即ち、 Ｅ、３ＣＭＥ）を調製し、鍵穴カサガイヘモシアニン（ＫＬ）ｌ）と結合して免 疫原を合成した。従って、１７β−エストラジオール−３−（〇−カルボキシメ チルエーテル）をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに誘導した。エス テル（ジオキサン中に１０ｍｇ／ｍｌ）をＫＬＨ（０，１Ｍ　ＮａＨＣＯｓ　１ ０ｍ１に溶解、ｐ　Ｈ８、６）　５０　ｍ　ｇに加えた。その結果生じた複合体 免疫原を３％　Ｎ　ａ　ＨＣＯｓに対する透析により精製した。１か列間隔で９ か月間、複合体免疫原　０．５ｍｇ定量を注射して、１７β−エストラジオール に対するウサギ抗血清を産生じた。エストラジオール誘導体を前記のように卵ア ルブミン（オボアルブミン）と結合させて、ポリスチレンミクロ滴定プレート上 に吸着され得る真正分析対象種−タンパク質複合体を調製した。

結晶卵アルブミン（０，１Ｍ　ＮａＨＣＯｓ　６ｍｌ中に３０ｍｇ、ｐＨｓ、６ ）をＥｔ　３ＣＭＥ活性エステル　０．３ｍｇ　（ジメチルホルムアミド　１ｍ ｌに溶解）と反応させた。このようにして生成した複合体を３％　ＮａＨＣＯ， に対して大規模に透析して精製し、次いで活性炭（１％）で処理して未結合エス トラジオールを除去した。

抗１７β−エストラジオール抗体の結合活性の滴定９６ウエルのポリスチレンミ クロ滴定ＥＬＩＳＡプレートを、前述のようにして調製した真正分析対象種−タ ンパク質複合体（即ちＥ、３ＣＭＥ−オボアルブミン）で覆った。そうして複合 体（０゜１　Ｍ　Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ　ｌ　ＯＯμｌ中にｏ、ｌμｇ）を２４時間 吸着させた。ウマヘモグロビン（０，１Ｍ　ＮａＨＣＯ−中に１５０μｌ）の０ ．５ｇ−１−’溶液で過剰の部位を遮断した。抗１７β−エストラジオール抗血 清中の抗体結合活性を抗体希釈反応グラフにより評価した。抗血清を検定緩衝液 （５０ｍＭ　）リス−ＨＣ１，ｐＨ７，４（０，１Ｍ　ＮａＣ１，０，１％　ゼ ラチン、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０及び０．００１％チメロサール含有）） で連続希釈し、このようにして得た各希釈液１００μｌ容積を前記のように調製 した被覆プレートの被覆ウェルに添加しく２通り）、３７℃で２時間反応させた 。プレートを洗浄後、二次抗体−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体　１０ ０μｍを加えて、３７℃でさらに１時間反応を継続させた（二次抗体−セイヨウ ワサビペルオキシダーゼ複合体は、ロバ抗ウサギイムノグロブリン抗体とセイヨ ウワサビペルオキシダーゼの複合体を含む市販の複合体であった）。２０分間反 応させて、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質　２，２°−アジノ ービス（３−エチルベンゾ−チアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）により 検定信号を発生させた。標準ＥＬＩＳＡプレート読取器で４１５ｎｍでの光学濃 度を読み取った。

結果を表Ｉに示す。

友−上 実施例２ 補助種に対する抗血清の調製 本実施例では、リガンドである、補助種に対する抗体（結合種）を調製した。従 って、７−アミノ　４−メチルクマリン−３−プロピオン酸（７ＡＭＣＰＡ）を 合成し、活性エステル誘導体を用いてウシ血清と結合させて免疫原複合体を生成 した。１か列間隔で１２か月間、免疫原複合体　１．５ｍｇ定量を注射して、７ −アミノ４−メチルクマリンに対するヒツジ抗体を産生させた。前述のように７ −アミノ　４−メチルクマリンエステル誘導体を卵アルブミン（オボアルブミン ）と結合させて、ポリスチレンミクロ滴定プレートのコーティングに用いるため のりガント−タンパク質複合体を提供した。産生された抗血清中の抗体結合活性 を、実施例１に記載のＥＬＩＳＡを含む希釈反応曲線法を用いて（但し、リガン ド−タンパク質複合体　２μｇを用いてプレートを被覆し、抗ヒツジ抗体−ＨＲ Ｐ複合体は二次抗体として用いた）評価した。結果を表ＩＩに示す。

補助槽に対する抗体は補助槽のための結合種であると考えられる実施例３ 分析対象物誘導体と結合種の結合 ＤＥＡＥ−セファデックス　Ａ５０上でのイオン交換クロマトグラフィーにより 、ヒツジ抗７−ＡＭＣＰＡ抗体のＩｇＧ画分を調製した。標準複合法により、１ ７β−エストラジオール−３−（０−カルボキシメチルエーテル）をＩｇＧ画分 と結合させた。このようにしてＥ□３ＣＭＥ活性エステル（ジオキサン　２００ ｕｌに溶解）　２．０ｍｇを、Ｏ，ＬＭ　ＮａＨＣＯ＊　（ｐＨ８，６）　１５ ｍ１中のＩｇＧ画分　１００ｍｇに加えて、結合種−真正分析対象種複合体を生 成した。透析し、１％活性炭で処理後、この複合体の抗体結合活性を実施例２に 記載の方法と同様のＥＬＩＳＡ法で評価した。

結果を表ＩＩＩに示す。

夾施丞Ａ 結合種−真正分析対象種複合体の精製 実施例３に記載されているようにＥ、３ＣＭＥ活性エステルをヒツジ抗７ＡＭＣ ＰＡ抗体のＩｇＧ画分と結合させて調製した結合種−真正分析対象種複合体は、 夾雑物として非抗体ＩｇＧ複合体を含有した。これらの夾雑物は、親和性マトリ ックスとして５ｅｐｈａｒｏｓｅ−６Ｂに結合させた実施例２に記載の補助槽を 用いてアフィニティークロマトグラフィー精製により除去した。従って、７ＡＭ ＣＰＡ−卵アルブミン（オボアルブミン）複合体（２０ｍｇ）をシアノゲンブロ ミド活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅ−６Ｂ　（５ｍｌ）と結合させて親和性マトリッ クスを調製した。

親和性マトリックスの処理、その洗浄及びアフィニティークロマトグラフィー法 の全工程は冷却（５℃）状態で実施し、ずっと冷却クロマトグラフィーキャビネ ットを用いた。

アフィニティークロマトグラフィーの標準操作に従って、親和性マトリックスを 先ず大規模に洗浄した。ゆる（結合したリガンドをマトリックスから除去するた めに、マトリックスを抗７ＡＭＣＰＡ抗血清（検定緩衝液で２０ｍ１に希釈）　 ５ｍｌと混合し、次にマトリックスを溶離試薬（蒸留水に溶解した２０％　アセ トニトリル及び１％　プロピオン酸）　１００ｍ１で洗浄した。親和性マトリッ クスを検定緩衝液で完全に洗浄して溶離試薬の痕跡を除去した。

検定緩衝液は実施例１に記載の組成を有した。

このようにして調製した親和性マトリックスは７ＡＭＣＰＡ−オボアルブミン− ３ｅｐｈａｒｏｓｅ−６Ｂ　ゲルと呼ばれるものと考えられる。

抗７ＡＭＣＰＡ抗体−Ｅ、３ＣＭＥ？１合体（緩衝液　２０ｍ１中に８０ｍｇ、 ０．１Ｍ　リン酸塩緩衝液、ｐＨ７，１（０，１ＭＮａ１１．０．１％　アジ化 ナトリウム及び０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０含有）を、約０．１ｍｌ／分の流 量でカラム中の親和性マトリックス　２ｍｌに通した。すべての複合体がカラム 内のマトリックスに曝露された後、カラム内に溶液を入れてカラムを洗浄緩衝液 （０，１Ｍ　リン酸塩緩衝液、ｐＨ７，５（０，５Ｍ　ＮａＣ１，０，０５％　 Ｔｗｅｅｎ　２０及び０．１％　アジ化ナトリウム含有）で洗浄して、未結合物 質を除去した。カラムからの溶離物の光学濃度（２８０ｎｍでの）が０．０５に 下がった時に、カラムを水冷蒸留水　２０ｍ１で洗浄し、洗浄工程中はこの流量 を０゜５ｍ１／分に１大した。水洗後、溶離試薬の勾配液をカラムに適用した（ 溶離試薬は蒸留水に溶解した２０％　アセトニトリルと１％プロピオン酸の混合 物であった）、溶離試薬を水中に保持して低温を保った。溶離画分（２ｍｌ／画 分）を０．２Ｍ　リン酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）　０．５ｍｌ中に受け入れて、 酸を中和した。溶離後、２８０ｎｍでＯ，Ｄ、を測定した（タンパク質吸収）。

結果を表■Ｖに示す。

（カラムから画分１１を採集した時間あたりに溶離試薬を先ず適用したため、画 分１ないし１５に関するＯ、Ｄ、の数値は本質的に蒸留水の値である。溶離剤含 量の増加がタンパク質の溶離を起こすことに留意すべきである）。

タンパク質を含有する画分（画分１７ないし２４）をプールし、冷却した（５℃ ）０．１Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７゜４）＋０．１Ｍ　ＮａＣ１に対 して大規模に透析して溶離試薬の濃度を低減し、そして抗体を再生させた。

Ｋ厘斑上 透析後の親和性精製複合体（実施例４に従って調製）の抗体結合活性を、実施例 ２に記載されているものと同様の希釈反応曲線法により評価した。結果を表■に 示す。

夾施丞互 実施例４により調製した複合体のエストラジオール含量を、先ず複合体をミクロ 滴定プレート上に吸着されたリガンドと結合させ、緩衝液で洗浄し、ウサギ抗エ ストラジオール抗体（１／１０，０００に希釈）を適用し、そして３７℃で１時 間反応させた。洗浄後、実施例１に記載されたものと同様の手順を用いて、抗つ サギ抗体−ＨＲＰ複合体により信号を発生させた。結果を表ＶＩに示す。

艮−ヱ工 夾施■ユ 本発明の分離を用いてＥＬＩＳＡにより分析対象種エストラジオールに関する較 正グラフを作成した。過剰の補助リガンド（７ＡＭＣＰＡ−卵アルブミン）を実 施例２に記載されているようにＥＬＩＳＡミクロ滴定プレートに吸着した。

エストラジオール基準を検定緩衝液中に調製した。検定緩衝液は実施例１に示し た組成を有した。２通りの５０μｌの用量のこの基準をガラス試験管に入れ、こ れに以下の物質を加えた：アフィニティークロマトグラフィー精製抗７ＡＭＣＰ Ａ抗体−Ｅ＊　３ＣＭＥ複合体（実施例４に記載されているように調製）　５０ μｍ　（１／７０００に希釈）、及びウサギ抗Ｅ、３ＣＭＥ抗体（１／１０，０ ００に希釈）。３７℃で３０分インキュベーション後、各検定試験管の内容物か らの１００μｍ容量を、本実施例の場合はりガント７−アミノ−４−メチル−ク マリン−３−プロピオン酸である補助種を担持するミクロ滴定プレートの個々の ウェルに移した。本実施例では、リガンドはオボアルブミンと複合させ、従って オボアルブミンを介して支持物質（ミクロ滴定プレート）と間接的に結合させた 。

３７℃で３０分インキュベーション後、ミクロ滴定プレートを洗浄し、抗つサギ 抗体−ＨＲＰ複合体を加えた。検定は実施例１に記載されているように完了させ た。

結果を表ＶＩＩに示す。

夾急豊溢 エストラジオールの代わりにエストロンを用いて、実施例７に記載の手順により 、エストロン（エストラジオールに関する主要交叉反応体）に関する交叉反応グ ラフを作成した。

結果を表ＶＩＩＩに示す。

犬施皿ユ エストラジオールの代わりにエストリオールを用いて、実施例７に記載の手順に より、エストリオール（エストラジオールに関する主要交叉反応体）に関する交 叉反応グラフを作成した。

表−１入 実施例７．８及び９で得られた結果を比較すると、分析対象種（エストラジオー ル）に対する反応は２つの主要交叉反応体エストロン及びエストリオールとは有 意に異なることが判る。

Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. １．分折対象種の検出のためのイムノアッセイ法に用いるのに適した分離方法で あって、支持物質上に提供される補助種の使用、並びに補助種と結合し得る結合 種の使用を含み、上記の結合種が結合種との非特異的結合型の結合を包含するリ ンケージによって一次種と結合し得ることを特徴とする方法。
2. ２．非特異的結合型の結合が共有結合又は吸着を包含する結合であることをさら に特徴とする請求項１記載の方法。
3. ３．リンケージがさらに非特異的結合型の別の結合又は特異的結合型の別の結合 を包含することをさらに特徴とする請求項１又は２記載の方法。
4. ４．イムノアッセイによる分折対象種の検出に用いるのに適した方法であって、 支持物賃上に提供される補助種の使用、及び補助種と結合し得る結合種の使用を 含み、上記結合種が結合種との非特異的結合型の結合を包含するリンケージによ って一次種と結合し得ることを特徴とする方法。
5. ５．分析対象種の検出に用いるのに適したセンサーであって、支持物質上に提供 される補助種を包含することを特徴とするセンサー。
6. ６．センサーが支持物質上に提供される補助種、及び補助種と結合し得る結合種 の使用を含み、上記結合種が結合種との非特異的結合型の結合を包含するリンケ ージによって一次種と結合し得ることをさらに特徴とする請求項５記載のセンサ ー。
7. ７．支持物質上に提供される補助種の使用、補助種と結合可能な結合種の使用（ 該結合種は、非特異的結合型の結合を包含するリンケージによって一次種と結合 し得る）、及び分析対象種に対する抗体の使用又は検出される実体に対する抗体 の使用を包含することをさらに特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の 方法。
8. ８．支持物質上に提供される補助種の使用、補助種と結合可能な結合種の使用（ 該結合種は、検出される実体を担持する）、及び検出される実体に対する抗体の 使用を包含することをさらに特徴とする請求項７記載の方法。
9. ９．支持物質上に提供される補助種の使用、補助種と結合可能な結合種の使用（ 該結合種は、非特異的結合型の結合を包含するリンケージによって一次種と結合 し得る）、及び分析対象種に対する抗体の使用又は検出される実体に対する抗体 の使用を包含することをさらに特徴とする請求項４記載の方法。
10. １０．支持物質上に提供される補助種の使用、補助種と結合可能な結合種の使用 （該結合種は、検出される実体を担持する）、及び検出される実体に対する抗体 の使用を包含することをさらに特徴とする請求項９記載の方法。
11. １１．支持物質上に提供される補助種を包含し、上記補助種が検出される実体を 担持する結合種との結合のためのものであることをさらに特徴とする請求項５記 載のセンサー。
12. １２．補助種を固定化する表面を有する支持物質を包含することをさらに特徴と する請求項５又は１１記載のセンサー。
13. １３．表面がガラス、石英又は電極物質であることをさらに特徴とする請求項１ ２記載のセンサー。
14. １４．支持物質又はその一部が補助種を提供することをさらに特徴とする前記請 求項のいずれかに記載の方法又はセンサー。
15. １５．補助種が支持体と直接又は間接的に結合することをさらに特徴とする請求 項１４記載の方法又はセンサー。
16. １６．補助種のオリゴマー又は補助種のポリマーが支持物質上に提供されること をさらに特徴とする請求項１４又は１５記載の方法又はセンサー。
17. １７．補助種が抗原リガンド又は非抗原リガンドであることをさらに特徴とする 前記請求項のいずれかに記載の方法又はセンサー。
18. １８．リガンドが２，４−ジニトロフェノール、フルオレセインジギトキシン、 クマリン又はシバクロンブルーであることをさらに特徴とする請求項１７記載の 方法又はセンサー。
19. １９．リガンドがビオチンであることをさらに特徴とする請求項１７記載の方法 又はセンサー。
20. ２０．補助種が支持物質上にポリマーのコーティングとして提供されることをさ らに特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
21. ２１．結合種が抗体又は特異的リガンド−バインダ−対のバインダーであること をさらに特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法又はセンサー。
22. ２２．抗体が抗フルオレセイン抗体、抗クマリン抗体、抗２，４−ジニトロフェ ノール抗体又は抗シバクロンブルー抗体であることをさらに特徴とする請求項２ １記載の方法又はセンサー。
23. ２３．結合種がアビジンであることをさらに特徴とする請求項２１記載の方法又 はセンサー。
24. ２４．一次種が一次抗体又はリガンドであることをさらに特徴とする前記請求項 のいずれかに記載の方法又はセンサー。
25. ２５．分析対象種がこのようなものとして検出可能であるか又は分析対象種が検 出される実体の一部であることをさらに特徴とする前記請求項のいずれかに記載 の方法又はセンサー。
26. ２６．分析対象種がホルモン、薬剤、ステロイド、腫瘍マーカーヒト血清アルブ ミン、ヒト塩素イオンゴナドトロピン、ヒトＩｇＧ、タンパク質抗原、血中タン パク質、マーカータンパク質、毒素、微生物、金属錯体又は金属イオンであるこ とをさらに特徴とする請求項２５記載の方法又はセンサー。
27. ２７．金属錯体がメチル水銀であることをさらに特徴とする請求項２６記載の方 法又はセンサー。
28. ２８．金属イオンがカルシウムイオン、鉄イオン、コバルトイオン、アルミニウ ムイオン、亜鉛イオン、鉛イオン、銅イオン、カドミウムイオン、バナジウムイ オン、銀イオン、水銀イオン、インジウムイオン、マンガンイオン又はニッケル イオンであることをさらに特徴とする請求項２６記載の方法又はセンサー。
29. ２９．検出される実体が分析対象種と作用物質との相互作用により生成されるこ とをさらに特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法又はセンサー。
30. ３０．作用物質が錯体を生成し得る作用物質であることをさらに特徴とする請求 項２９記載の方法又はセンサー。
31. ３１．検出される実体を提供する分析対象種の錯体を生成する工程を含むことを さらに特徴とする請求項２９又は３０記載の方法又はセンサー。
32. ３２．検出される実体を生成するために分析対象種と又は真正分析対象種と相互 作用し得る作用物質の使用、作用物質との組合せのための結合種の使用、補助種 の使用、支持物質の使用、及び検出される実体に対する抗体の使用を包含し、上 記結合種及び上記補助種が一緒に結合し得るようなものであることをさらに特徴 とする請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法又はセンサー。
33. ３３．分析対象種と、分析対象種と相互作用し得る作用物質を担持する結合種と を結び合わせてそれにより検出される実体を生成するように分析対象種と作用物 質との相互作用を実行させ、このようにして生成される検出すべき実体を有する 結合種を支持物質上に提供される補助種と結合させて結合種と補助種との間に結 合を生じ、検出される実体に対する抗体がその実体と結合するように抗体を適用 する工程を包含することをさらに特徴とする請求項２９〜３２のいずれかに記載 の方法。
34. ３４．分析対象種が作用物質と相互作用して検出される実体を生成する前に補助 種及び分折対象種と相互作用し得る作用物質を担持する結合種を一緒に配列する ことをさらに特徴とする請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法又はセンサー 。
35. ３５．結合種と補助種との間に結合が生じるように結合種と支持物質上に提供さ れる補助種を結び合わせ、結合種が検出される実体を担持するように配列し、検 出される実体に対する抗体であって且つトレーサー種を担持する抗体をそれが検 出される実体と結合するように適用し、トレーサー種により抗体と実体との結合 を検出する工程からなることをさらに特徴とする請求項２９〜３４のいずれかに 記載の方法。
36. ３６．キレート化剤を用いて、検出される実体として錯体を生成することをさら に特徴とする請求項２９〜３５のいずれかに記載の方法又はセンサー。
37. ３７．キレート化剤の１つ又はそれ以上の分子を担持する結合種と金属イオンを 含有する分析対象種とを結び合わせて検出される実体として金属−キレート錯体 を担持する結合種を生成し、金属−キレート錯体を担持する結合種と支持物質上 に提供される補助種とを結び合わせて結合種と補助種との間に結合を生じさせ、 検出される実体に対する抗体であって検出可能種を担持する抗体をそれが金属− キレート錯体と結合するように適用し、及び抗体と金属−キレート錯体との結合 を検出する工程からなることをさらに特徴とする請求項２９〜３６のいずれかに 記載の方法。
38. ３８．抗体が、酵素トレーサーを含有する検出可能種を有し、抗体と金属−キレ ート錯体との結合が酵素誘発性変化により検出されることをさらに特徴とする請 求項３７記載の方法。
39. ３９．酵素誘発性変化が色変化、蛍光変化、ルミネセンス変化又は電気化学的変 化であることをさらに特徴とする請求項３８記載の方法。
40. ４０．キレート化剤がエチレンジアミンテトラアセテート、ジエチレントリアミ ンペンタアセテート、シクロヘキシレンジニトリロ四酢酸、１−ベンジル−ＥＤ ＴＡ、１−ベンジル−ＥＤＴＡの誘導体、β−ヒドロキシキノリン、β−ヒドロ キシキノリンの誘導体又はデフェロキサミンであることをさらに特徴とする請求 項３６又は３７記載の方法又はセンサー。
41. ４１．支持物質が固相物質であることをさらに特徴とする前記請求項のいずれか に記載の方法又はセンサー。
42. ４２．固相物質が反応容器壁、不溶性多糖類、微小粒子、ポリスチレン、架橋デ キストラン、不溶性ポリマー構造、ガラス表面、誘導化シリカ表面、表面付着ポ リマー、酸化第一鉄を閉じ込めた微小粒状物質、ナイロン又はポリアミドである ことをさらに特徴とする請求項４１記載の方法又はセンサー。
43. ４３．検出可能種を用いることをさらに特徴とする請求項１〜３６又は４０〜４ ２のいずれかに記載の方法又はセンサー。
44. ４４．検出可能種が酸素、フルオロフォア、高分子フルオロフォア、放射性同位 元素、リガンド、リガンドのポリマー又はバインダーを包含することをさらに特 徴とする請求項４３記載の方法又はセンサー。
45. ４５．検出可能種がリガンドであり、リガンドがそのためのバインダーの使用に より検出されるか又は検出可能種がバインダーであり、バインダーがそのための リガンドの使用により検出されることをさらに特徴とする請求項４４記載の方法 又はセンサー。
46. ４６．トレーサー種を用いることをさらに特徴とする前記請求項のいずれかに記 載の方法又はセンサー。
47. ４７．トレーサー種が、酵素、フルオロフォア、化学発光化合物生物発光化合物 、放射性同位元素又は染料であることをさらに特徴とする請求項４６記載の方法 又はセンサー。
48. ４８．トレーサー種が、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西 洋ワサビペルオキシダーゼ、フルオレセイン、クマリン又はローダミンであるこ とをさらに特徴とする請求項４７記載の方法又はセンサー。
49. ４９．補助種を支持物質に付着させることを含むことをさらに特徴とする請求項 １〜４、又は７〜１０、又は１４〜４８のいずれかに記載の方法又はセンサー。
50. ５０．作用物質を結合種と直接又は間接的に結合する工程を含むことをさらに特 徴とする請求項１〜４、又は７〜１０、又は１４〜４９のいずれかに記載の方法 又はセンサー。
51. ５１．水、土壌、生体種又は空気の試料が検出のための分析対象種又は検出され る実体を提供することをさらに特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法又 はセンサー。
52. ５２．生物学的試料に検出を施すことをさらに特徴とする前記請求項のいずれか に記載の方法又はセンサー。
53. ５３．生物学的試料が血液、血漿、血清、尿、唾液又は乳汁であることをさらに 特徴とする請求項５２記載の方法又はセンサー。
54. ５４．分析対象種又は検出される実体が水、水性標本又は液体抽出物中に存在す ることをさらに特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法又はセンサー。
55. ５５．分析対象種の検出に用いるためのセンサーの製造方法であって、支持物質 の表面に固定化補助種を提供する工程を含むことを特徴とする方法。