DE69027077T2 - Herstellung einer Festphase, geeignet für spezifische Bindung chemischer Substanzen - Google Patents
Herstellung einer Festphase, geeignet für spezifische Bindung chemischer SubstanzenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die analytische Chemie und insbesondere auf Geräte und Verfahren, welche für das selektive Binden chemischer Spezies an ein Substrat sorgen. Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, für ein zweckmäßigeres und effektiveres chemisches Binden an ein Substrat zu sorgen, das in Zusammenhang mit einem Massenbiosensor verwendet wird.
- Die Erhaltung der Umwelt erfordert, daß die Mengen verschiedener Schadstoffe auf dem Land und in dem Wasser überwacht werden. In Laboratorien, die diese Schadstoffe überwachen, besteht die Herausforderung, Mikromengen vieler verschiedener Chemikalien zu messen. Massebiosensoren schaffen ein wertvolles Werkzeug bei dieser Anwendung sowie bei medizinischen und weiteren Anwendungen.
- Massebiosensoren werden verwendet, um Mikromengen von biologischen Komponenten zu messen, und um die Möglichkeit zu haben, Spuren biologischer und chemischer Komponenten zu erfassen. Ein Typ eines Massenbiosensors verwendet ein piezoelektrisches Kristall als einen akustischen Wellenleiter. Ein Eingangswandler erzeugt eine periodische akustische Welle aus einem periodischen elektrischen Eingangssignal. Die akustische Welle breitet sich durch das Kristall zu einem Ausgangswandler aus, welcher die empfangene akustische Welle in ein elektrisches Ausgangssignal umwandelt. Die akustische Welle erfährt eine Veränderung der Ausbreitungsgeschwindigkeit, welche der Masse entspricht, die an der Oberfläche des Kristalls gebunden ist. Durch Überwachen der Frequenz oder der relativen Phasen des elektrischen Eingangs- und des Ausgangssignals können die Massenveränderungen an der Oberfläche des Kristalls gemessen werden.
- Um die Menge einer spezifischen chemischen Komponente in einer Probenlösung zu messen, muß die Oberfläche des Kristalls vorbereitet werden, um diese Komponente selektiv zu binden. Bei einem Lösungsansatz erhält ein Wissenschaftler ein unmodifiziertes Kristall und bereitet es kurz vor der Komponentenmessung vor, derart, daß es eine Affinität für die interessierende Komponente erhält. Ein Antikörper kann beispielsweise an eine Kristalloberfläche gebunden werden, um den Massenbiosensor vorzubereiten, um die Menge des entsprechenden Antigens zu messen.
- Bisher wurden piezoelektrische Kristallbiosensoren derart aufgebaut, daß Antikörperproteine, welche Antigene binden, oder Antikörperbindungsproteine, welche Antikörper binden, direkt an der Oberfläche gebunden wurden. Ein Hauptnachteil dieses Verfahrens ist der außerordentliche Betrag an Zeit, der notwendig ist, um diese Proteine an der Oberfläche zu binden, da dieses Verfahren viele Stunden benötigt. In manchen Fällen benötigt dieses Vorbereitungsverfahren 24 Stunden oder länger.
- Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß die Lagerbeständigkeit der Sensoren durch die Stabilität der Proteine, die an ihrer Kristalloberfläche gebunden sind, begrenzt ist. Antikörper und Antikörper-bindende Proteine benötigen eine kalte Lagerung und verlieren nach und nach die Bindungsaktivität. Noch ein weiterer Nachteil besteht darin, daß bestimmte Proteine an der Oberfläche in einer Ausrichtung angebracht werden können, die Bindungsstellen für die interessierende Verbindung verdunkeln. Zusätzlich setzt das Verfahren zum Immobilisieren der Proteine auf der Oberfläche dieselben bestimmte Chemikalien aus, welche durch Beeinträchtigen von Funktionsgruppen an den Bindungsstellen die Bindungsaktivität erniedrigen können. Ferner kann das Verfahren zusätzliche Modifikationen für jedes spezifische Proteinsystem benötigen. Noch ein weiteres Problem ist der hohe Grad an nicht-spezifischer Adsorption auf der Oberfläche. Viele Moleküle in der Lösung werden sich mittels schwacher elektrostatischer und Wasserstoff-Bindungen an der Oberfläche binden. Bei einem Massenbiosensor beeinträchtigt diese nicht- spezifische Bindung die Messung und begrenzt die Empfindlichkeit des Geräts und seine analytische und klinische Verwendbarkeit.
- Es wird ein schnelles und zweckmäßiges Verfahren zum Anpassen eines Sensors benötigt, um interessierende Chemikalien für diverse Anwendungen zu binden. Zusätzlich wird ein Sensor mit einer minimalen nicht-spezifischen Bindung benötigt, derart, daß er verwendet werden kann, um Spuren interessierender Chemikalien zu erfassen.
- Die EP-A-0138297 beschreibt Immunagglutination-Partikelsuspensionen, die Antikörpermoleküle aufweisen, die an einem Carboxylat-abgeleiteten Polymerkern angebracht sind. Der Antikörper ist mit dem Kern durch eine Avidin-Biotin-Brücke verbunden. Avidin ist durch eine Amid-Bindung mit Carboxylgruppen auf dem Kern verbunden, wobei Biotin durch eine Amid-Bindung mit Aminogruppen auf dem Antikörpermolekül verbunden ist. Die Verwendung eines derartigen Brückensystems ermöglicht es, daß gesteuerte Mengen eines Antikörpers an den Partikeln angebracht werden, wodurch die Reproduzierbarkeit verbessert wird und falsche positive Ergebnisse aufgrund übermäßiger Antikörper auf den Partikeln die eine Agglutination und Fällung bewirken, reduziert werden.
- Die EP-A-0139489 beschreibt ein Sandwich-Hybridisierungsverfahren zur Nukleinsäureerfassung. Das Verfahren verwendet eine biotinilierte Nukleinsäuresonde zum Erfassen von interessierenden Basissequenzen in Nukleinsäuren Die biotinilierte Sonde hybridisiert zu einem immobilisierten Abschnitt eines DNA-Strangs (DNA = Desoxiribo Nucleic Acid = Desoxinbonukleinsäure). Ein Avidin-konjugiertes Mikropartikel befestigt sich an dem Biotin auf der hybridisierten Sonde. Das Nukleinsäure-Hybridpaar kann dann mittels Techniken, wie z.B. der Zentrifugierung, getrennt werden.
- Die WO87/04794 beschreibt Immunagglutination-Latexpartikelsuspensionen, die denen der EP-A-0138297 ähnlich sind, wobei jedoch eine nicht-kovalente Bindung des Avidin an der Oberfläche des Partikels vorhanden ist, und wobei eine Verbindergruppe R zwischen dem Biotin und dem Antikörper vorgesehen ist.
- Die EP-A-0215669 beschreibt ein piezoelektrisches, akustisches Massensensorgerät. Die Elektrodenoberfläche der piezoelektrischen Kristalle werden mit einem Organosilan-Kopplungsmittel, gefolgt von Glutaraldehyd und einem Antikörper für das ausgewählte Analyt behandelt.
- H. Muramatsu u.a. beschreiben in Analvtical Chemistry, Bd. 59, Seiten 2760 bis 2763 (1987) piezoelektrische Kristall- Massensensoren, die mit einem Protein A für die Bestimmung von Immunoglobulinen modifiziert sind. Die Oberfläche des Kristallsensors wird zuerst mit (γ-Aminopropyl)Triethoxysilan modifiziert. Das Substrat wird dann luftgetrocknet und mit einer Glutaraldehyd-Lösung behandelt. Das Protein A wird dann auf der Elektrode mittels des Oberflächenaldehyds immobilisiert, wobei das nach der Immobilisation zurückbleibende nicht-reagierte Aldehyd mit Glycin blockiert wird.
- Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren, bei dem eine Substratoberfläche eines Massensensors für die Bindung einer ausgewählten Substanz spezifisch gemacht wird, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
- Anbringen eines Organosilan-Kopplungsmittels an der Substratoberfläche;
- Anbringen einer ersten Bindungsschicht an dem Organosilan- Kopplungsmittel, wobei die erste Bindungsschicht verfügbare Bindungsstellen der ersten Schicht mit hoher Affinität verfügbar hat; und anschließend
- Anbringen einer zweiten Bindungsschicht an den Bindungsstellen der ersten Schicht mit hoher Affinität durch Bindungsstellen mit reziproker hoher Affinität auf der zweiten Bindungsschicht, wobei die zweite Bindungsschicht ebenfalls Zweite-Schicht-Bindungsstellen zum Binden der ausgewählten Substanz verfügbar hat.
- Die vorliegende Erfindung schafft ferner einen Massensensor zum Messen der Masse eines Analyts in einer Lösung, wobei der Sensor folgende Merkmale aufweist:
- ein Substrat mit einer Oberfläche, an der das Analyt angebracht werden soll;
- eine Organosilan-Kopplungsschicht, die an der Oberfläche gebunden ist, wobei die Organosilan-Kopplungsschicht eine Funktionsgruppe aufweist;
- eine Ligand-Bindungsschicht, die an der Oberfläche mittels der Funktionsgruppe angebracht ist, wobei die Ligand-Bindungsschicht Ligand-Bindungsstellen mit hoher Affinität zum Binden eines Ligand aufweist; und
- eine Ligand-Trägerschicht, die durch das Ligand stark an den Ligand-Bindungsstellen der Ligand-Bindungsschicht haftet, wobei die Ligand-Bindungsschicht zweite Bindungsstellen aufweist, die für das Analyt chemisch selektiv sind, wodurch das Analyt an der Oberfläche mittels der Ligand-Trägerschicht, der Ligand-Bindungsschicht und der Organosilan- Kopplungsschicht angebracht wird, derart, daß die Masse durch den Sensor bestimmt werden kann.
- Vorzugsweise ist der Massensensor ein Oberflächen-Transversalwellen-Massensensor (STW-Massensensor; STW = Surface Transverse Wave).
- Als Beispiel kann Avidin an ein Silikasubstrat gekoppelt werden, wobei ein biotinilierter Antikörper an dem Avidin angebracht werden kann, wobei Biotin zugefügt werden kann, um unbesetzte aktive Stellen zu blockieren. Diese zusammengesetzte Oberfläche wird sich bei minimaler nicht-spezifischer Adsorption stark an ein Antigen binden.
- Wie gezeigt ist, ist Avidin das bevorzugte Material für die Ligand-Bindungsschicht, wobei biotinilierte Antikörper für die Ligand-Trägerschicht geeignet sind. Ein biotinilierter Antikörper ist aus einem Antikörper zusammengesetzt, der direkt oder über ein Abstandshalter-Molekül an Biotin gebunden ist. Biotin weist eine Avidin-Bindungsstelle pro Molekül auf, wobei Avidin vier Biotin-Bindungsstellen pro Molekül aufweist. Avidin und Biotin binden sich durch ihre reziproken Bindungsstellen fest aneinander, selbst wenn jedes wiederum zu weiteren Molekülen konjugiert ist, solange die Bindungsstellen hoher Affinitt nicht blockiert sind.
- Die vorliegende Erfindung schafft ein Gerät, welches, wenn es in eine Flüssigkeit eingetaucht wird, ausgewählte Chemikalien bindet. Die Oberfläche des Geräts weist übereinander liegende Schichten aus, die aus einer Ligand-Bindungssubstanz und aus einer Ligand-konjugierten Verbindung zusammengesetzt sind, wobei die letztere eine starke Bindungsaffinität zu den interessierenden Chemikalien aufweist. Die Ligand-Bindungssubstanz kann unter Verwendung eines Kopplungsmittels an dem Substrat gebunden werden. Durch eine Vorbehandlung mit Blockierungsmitteln, Puffern oder dergleichen kann eine nicht-spezifische Bindung gesteuert werden. Blokkierungsmittel sind Chemikalien, die sich an das Gerät binden und sterisch verhindern, daß die nicht-spezifische Bindung eine schwache Bindungsformation bildet. Puffer mit geeignetem pH können durch Neutralisieren geladener Stellen auf der Oberfläche das nicht-spezifische Binden verhindern.
- Ein bevorzugter Massenbiosensor, der durch die vorliegende Erfindung geschaffen wird, umfaßt einen elektrischen Signalgenerator, einen elektroakustischen Eingangswandler, einen piezoelektrischen Kristallwellenleiter, einen elektroakustischen Ausgangswandler und eine Einrichtung zum Messen von Phasenveränderungen zwischen den elektrischen Signalen von dem Generator und dem Ausgangswandler. In diesem Fall wird der Wellenleiter in eine Flüssigkeit eingetaucht, wobei ein Signal angelegt wird und die Phase oder Frequenz des Ausgangssignals von dem Wellenleiter überwacht wird. Massenveränderungen auf der Oberfläche des Wellenleiters beeinträchtigen das Ausgangssignal, wodurch die Masse oder Konzentration des Analyts aus diesen Daten berechnet werden kann.
- Die vorliegende Erfindung liefert eine Vorbereitung der Meßoberfläche in zwei Phasen, um die Probleme der übermäßigen Vorbereitungszeit und der Produktinstabilität zu überwinden. Gemäß dem bevorzugten Ausführungsbeispiel umfaßt die erste Vorbereitungsphase das Anbringen von Avidin auf der Sensoroberfläche. Diese Phase, welche zeitaufwendig ist, kann durch einen Hersteller des Geräts wirksam durchgeführt werden. Avidin hält seine Bindungsaktivität bei Raumtemperatur, derart, daß das Avidin-beschichtete Gerät eine relativ lange Lagerbeständigkeit aufweist und aus Herstellungsgründen ohne kalte Lagerung bei beträchtlichen Kosteneinsparungen gepackt und ausgeliefert werden kann. Ein weiterer Vorteil für den Hersteller besteht darin, daß Avidin, welches aus Eiweißen besteht, in großen Mengen billig geliefert werden kann. Noch ein weiterer Vorteil für Anwendungen, die sterile Bedingungen benötigen, besteht darin, daß der Avidin-modifizierte Sensor sterilisiert werden kann, da Avidin Temperaturen von bis zu 120ºC aushält.
- Die zweite Phase umfaßt das Anbringen einer biotinilierten Verbindung an dem Avidin und das Blockieren schwacher Bindungsstellen auf der Oberfläche. Diese Phase kann durch den Benutzer ohne weiteres in etwa 30 Minuten durchgeführt werden. Obwohl ein biotinilierter Antikörper weniger stabil als Avidin ist, muß diese Komponente bis direkt vor der Verwendung nicht der Oberfläche zugefügt werden. Ein weiterer Vorteil für den Benutzer besteht darin, daß die zweite Vorbereitungsphase weder teure Vorrichtungen noch teure Chemikalien benötigt. Ferner wird diese Phase bei Raumtemperatur unter physiologischen Bedingungen erreicht, derart, daß die Bindungsaktivität der biotinilierten Verbindungen nicht durch scharfe Chemikalien oder hohe Temperaturen beeinträchtigt wird. Für den Benutzer sehr zweckmäßig ist die Tatsache, daß biotinilierte Verbindungen kommerziell verfügbar sind oder entsprechend veröffentlichter Verfahren hergestellt werden können. Somit steigert die vorliegende Erfindung wesentlich die Zweckmäßigkeit, mit der Massenbiosensoren angepaßt werden können, um die Mengen ausgewählter Chemikalien auszuwerten.
- Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie das nicht-spezifische Binden reduzieren kann. Freie, aktive Bindungsregionen auf der Silikaoberfläche werden durch gebundenes Avidin sterisch blockiert. Freie, ungebundene Stellen auf dem Avidin werden in dem abschließenden Waschschritt mit Biotin blockiert. Da Biotin klein ist und ein niedriges Molekulargewicht aufweist, hat es einen Zugang zu ungebundenen Bindungsstellen, auf die andererseits größere Blockierungsmittel aufgrund einer sterischen Behinderung keinen Zugriff haben.
- Noch ein weiteres Merkmal der Erfindung ist die Multiplikation von Bindungsstellen. Da ein einziges Avidin-Molekül vier Biotin-Bindungsstellen aufweist, wenn über einer Silikaoberfläche Avidin aufgebracht wird, ist die Anzahl von potentiellen Bindungsstellen für biotinilierte Derivate viermal so groß als die Anzahl von Bindungsstellen für Avidin. Wenn biotinilierte Antikörper für die nächste Schicht verwendet werden, von denen jeder zwei Antigen-Bindungsstellen aufweist, werden potentielle Bindungsstellen für die Antigenspezies wieder vergrößert. Diese und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung bezugnehmend auf die folgenden Zeichnungen offensichtlich.
- Fig. 1 ist eine schematische Ansicht eines Sensors, der ein Oberflächen-Transversalwellengerät mit einer chemisch modifizierten oberen Oberfläche verwendet.
- Fig. 2 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens zum Immobilisieren von Avidin an einem Substrat.
- Fig. 3 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens zum Anbringen eines biotinilierten Antikörpers an einem Avidin-beschichteten Substrat.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung weist ein Massenbiosensor 100 ein STW-Gerät 110 mit Eingangswandlern 112 und Ausgangswandlern 113 auf seiner oberen Oberfläche 114 auf, wie es in Fig. 1 gezeigt ist. Eine Kopplungsschicht 116, die aus einer Organosilan-Chemikahe gebildet ist, bedeckt die obere Oberfläche 114. Die Kopplungsschicht 116 dient als Stelle des Anbringens für eine Avidin-Schicht 118, welche sich fest an eine biotinilierte Antikörperschicht 120 bindet. Die biotinilierte Antikörperschicht 120 kann durch weitere biotinilierte Verbindungen, wie sie für die spezielle Anwendung des Biosensors geeignet sind, ersetzt werden. Ein periodisches Signal, das von einem Signalgenerator 121 erzeugt wird, läuft durch die Eingangswandler 112, wo es in eine periodische akustische Welle umgewandelt wird und sich entlang des Oberflächen-Transversalwellengeräts 110 zu den Ausgangswandlern 113 ausbreitet.
- Wenn der Sensor in eine Probe 122 eingetaucht wird, bindet sich ein Antigen 124 an die biotinilierte Antikörperschicht 120. Die Bindung des Antigens 124 bewirkt, daß sich die Masse, die an der Oberfläche 114 gebunden ist, verändert. Diese Veränderung wirkt sich in einer Veränderung der Ausbreitungsgeschwindigkeit der akustischen Welle zwischen den Wandlern 112 und 113 aus. An den Ausgangswandlern 113 wird die periodische akustische Welle in ein periodisches elektrisches Signal umgewandelt, welches zu dem Signalprozessor 125 läuft. Das Signal, das die Frequenz oder die relativen Phasen anzeigt, wird dann verwendet, um die Menge des Antigens 124 in der Probe 122 zu berechnen.
- Nach dem Durchführen der Messung kann das Antigen 124 von der biotinilierten Antikörperschicht 120 abgezogen werden, indem dieselbe mit einer hochionischen, starken Salzlösung, wie z.B. 1,5 M NaCl, abgewaschen wird. Verschiedene Abziehverfahren sind zur Verwendung mit anderen biotinilierten Konjugaten geeignet. Nachdem das Antigen von der Antikörperschicht abgezogen ist, kann der Biosensor wieder verwendet werden.
- Eine schematische Darstellung des Verfahrens zum Immobilisieren von Avidin an einem Quarzsubstrat ist in Fig. 2 dargestellt. Das Substrat wird durch Sputter-Ablagerung von SiO&sub2; zu einer Dicke von 50 nm (500 Angström) vorbehandelt, um eine Anzahl von aktiven Hydroxyl (-OH) Gruppen zu schaffen. In dem ersten Schritt 21 wird ein Organosilan-Kopplungsmittel zu dem Substrat hinzugefügt, obwohl ebenfalls weitere geeignete Kopplungsmittel verwendet werden könnten. Das Organosilan-Kopplungsmittel weist eine allgemeine Formel von RnSiX(4-n) auf. X stellt eine hydrolisierbare Gruppe, beispielsweise Alkoxid, Acyl, Amin oder Chlor dar. R stellt ein nicht-hydrolisierbares organisches Radikal dar, das eine Primäralkoholgruppe enthält. Die Ganzzahl n kann 1, 2 oder 3 sein, sie ist jedoch typischerweise 1. Die R- und X-Gruppen werden an dem zentralen Siliziumatom (Si) gebunden. Das Organosilan-Kopplungsmittel ist 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GOPS). Die Chemie für diesen Schritt lautet so, wie sie in "Silane Coupling Agent Chemistry", Barry Arkles, Petrarch Systems Register and Review, R. Anderson, B. Arkles und G.L. Larson, Ausgabe 1987 beschrieben ist. Als Ergebnis beschichtet ein Organodihydroxysiloxan das Substrat. In dem zweiten Schritt 22 wandelt das Hinzufügen eines geeigneten Oxidierungsmittels, wie z.B. Natrium-Periodat, die Primäralkoholgruppen auf den organischen Radikalen in reaktive Aldehyde um. In dem dritten Schritt 23 wird Avidin hinzugefügt und die Aldehyde reagieren mit einem Primäramin auf dem Avidin, um eine labile Schiffsche Base zu bilden. In dem vierten Schritt 24 wird ein geeignetes Reduktionsmittel, wie z.B. Natrium-Cyanborhydrid, hinzugefügt, welches den labilen Komplex in ein stabiles Reduktionsprodukt umwandelt, das in 25 dargestellt ist.
- Streptavidin, ein Bakterienprotein, kann anstatt des Avidin verwendet werden, da es ähnliche Biotin-Bindungseigenschaften aufweist. Avidin ist ein glycosiliertes Protein, was bedeutet, daß es einen Überfluß an angebrachten Zuckerresten aufweist, welche potentielle Stellen für eine nicht-spezifische Bindung schaffen. Streptavidin ist ein nicht-glycosiliertes neutrales Protein, welches bei bestimmten Anwendungen zum Verkleinern von nicht-spezifischen Bindungen nützlich sein kann. Modifizierte Formen von Avidin oder Streptavidin, wie beispielsweise durch Acetylation oder Succinylation, oder genetisch-entworfenes Avidin oder Streptavidin können ebenfalls verwendet werden, solange die Biotin-Bindungsstellen intakt bleiben.
- Fig. 3 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens zum Anbringen eines biotinilierten Antikörpers an dem Avidin-beschichteten Substrat, um ein spezielles Antigen zu binden. Das Avidin-beschichtete Substrat wird in dem Schritt 31 mit dem biotinilierten Antikörper inkubiert. In einem Schritt 32 wird das Substrat dann mit einem Blockierungsmittel, wie z.B. Biotin, gewaschen, welches alle nicht-besetzten Stellen auf der Avidin-Schicht bindet. Weitere Blockierungsmittel, wie z.B. Glycin, können verwendet werden. Wenn das Substrat in einem Schritt 33 in eine Probenlösung eingetaucht wird, bindet sich ein Antigen über das Antikörpermolekül an der Oberfläche, wie es in Schritt 34 gezeigt ist.
- Das Immobilisierungsverfahren gemäß der Erfindung wird nach folgend bezugnehmend auf das folgende Beispiel näher erläutert.
- Bereite eine 10%-Lösung von 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GOPS) (pH 3,0) unter Verwendung von 2,5 ml GOPS (Aldrich Chemical Co.), 20 ml Isopropanol, 2,5 ml H&sub2;O und 1 ml Essigsäure vor. Setze ein Silikasubstrat, das mit SiO&sub2; vorbehandelt ist, der Lösung aus. Lasse zu, daß die Lösung eine Stunde hydrolysiert und füge dann als Katalysator 0,25 ml Triethylamin (Aldrich Chemical Co.) hinzu. Lasse eine Stunde zum Binden zu. Spüle drei- bis fünfmal mit destilliertem Wasser. Erlaube es, daß die Oberfläche im Vakuum oder unter Hehum oder in einem mechanischen Ofen bei 110ºC zehn Minuten lang trocknet.
- Bereite eine 0,1% Periodatlösung mit 1 g H&sub5;IO&sub6;, mit 200 ml H&sub2;O und mit 800 ml Essigsäure vor. Inkubiere mit dem silanisierten Substrat 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur. Wasche mit Wasser.
- Inkubiere das gewaschene Substrat mit einer Lösung aus Avidin in einer Bor-abgepufferten Salzlösung (BBS; BBS = Borate Buffered Saline) (pH 8,5) bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml. Mische durch sanfte Umkehrung bei 4ºC 20 bis 24 Stunden lang.
- Nach der Inkubation füge NaCNBH&sub4; zu drei 15minütigen Intervallen für eine Endkonzentration von 0,01 M NaCNBH&sub4; zu. Spüle mit BBS.
- Inkubiere das Avidin-beschichtete Substrat mit einem Biotin-konjugierten Antikörper in PBS 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur. Wasche mit PBS.
- Eine Oberfläche, die mit Avidin beschichtet ist, kann durch den Benutzer für eine breite Vielzahl verschiedener Anwendungen angepaßt werden. Grundsätzlich verwendet das Verfahren ein gemischtes Konjugat, das ein biologisch aktives Molekül, das chemisch an einem Ligand angebracht ist, aufweist, wodurch das resultierende Produkt sowohl seine biologische Aktivität als auch seine Affinität zu einem Ligand-Bindungsprotein beibehält. Irgendein chemisches Paar, das eine starke Bindungsaffinität zu einem anderen aufweist, ist ein Kandidat. Beispielsweise binden biotinilierte Antikörper Antigene, biotinilierte Polynucleotid-Stränge binden DNA, CDNA oder RNA, biotinilierte DNA-Bindungsproteine binden regelmäßige Sequenzen von Genen, biotinilierte Proteine G und A binden Immunoglobuline, biotinilierte Lectine binden Zucker, biotinilierte Enzyme binden ihre Substrate, Kofaktoren oder Inhibitoren und biotinilierte Zellenrezeptorenproteine binden Hormone, Neurotransmitter oder Viren. Jedes genetisch entworfene oder chemisch modifizierte Biotin kann statt des Biotins in der Konjugation oder als Blockierungsmittel verwendet werden, solange die Avidin-Bindungsstelle verfügbar bleibt.
- Das Verfahren der Erfindung kann auf verschiedenen Substraten gemäß der speziellen Anwendung verwendet werden. Wenn das Ziel eine Reinigung ist, können chromatographische Trägermatrizen oder Silikaperlen verwendet werden. Glasröhren, Petrischalen oder weitere Labordinge, die gemäß dem Verfahren der Erfindung behandelt worden sind, können verwendet werden, um zeitsparende Schritte und Zweckmäßigkeit in Standard laboratorverfahren einzuführen.
- Alternative Verfahren des Anbringens der Avidinschicht können verwendet werden. Beispielsweise kann ein Organosilan- Kopplungsmittel, dessen nicht-hydrolysierbares organisches Radikal eine Amingruppe, wie z.B. (γ-Aminopropyl)Triethoxysilan (γ-APTES), ist, mit Glutaraldehyd und dann mit Avidin reagiert werden. Bestimmte Substrate, wie z.B. Sepharose, können aktiviert und direkt an Avidin angebracht werden.
- Das Gerät der Erfindung nimmt jeden beliebigen Typ eines gewichtsanalytische Sensors auf. Gewichtsanalytische Sensoren, die piezoelektrische Kristalle verwenden, umfassen Rayleigh-Oberflächen-Akustikwellengeräte und Lamb-Akustikwellengeräte sowie das Oberflächen-Transversalwellengerät.
- Während Avidin und biotinilierte Verbindungen als Bindungssubstanzen bei der Verwendung zweckmäßig sind, da sie weit verbreitet verfügbar sind, können weitere reziproke Bindungssubstanzen gemäß dem Verfahren der Erfindung verwendet werden. Ein Lectin, das als eine erste Bindungsschicht verwendet wird, und ein glycosiliertes Rezeptorprotein als seine reziproke Bindungsschicht werden bei der Immobilisierung von Viruspartikeln, Wachstumsfaktoren, Hormonen und weiteren Zellenmodulatoren anwendbar sein. Alternativ können das Protein A und das Protein G in der ersten Bindungsschicht mit einem Antikörper als der zweiten Bindungsschicht enthalten sein, derart, daß die Konzentration eines Antigens gemessen werden kann.
Claims (14)
1. Ein Verfahren, um eine Substratoberfläche (114) eines
Massensensors (100) für das Binden einer ausgewählten
Substanz (124) spezifisch zu machen, mit folgenden
Schritten:
Anbringen eines Organosilan-Kopplungsmittels (116) an
der Substratoberfläche;
Anbringen einer ersten Bindungsschicht (118) an dem
Organosilan-Kopplungsmittel (116), wobei die erste
Bindungsschicht (118) Erste-Schicht-Bindungsstellen mit
hoher Affinität verfügbar hat; und anschließend
Anbringen einer zweiten Bindungsschicht (120) an den
Erste-Schicht-Bindungsstellen mit hoher Affinität durch
reziproke Bindungsstellen mit hoher Affinität auf der
zweiten Bindungsschicht (120), wobei die zweite
Bindungsschicht (120) ebenfalls
Zweite-Schicht-Bindungsstellen für das Binden der ausgewählten Substanz (124)
verfügbar hat.
2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, das ferner den Schritt
des Waschens mit einem Blockierungsmittel aufweist,
nachdem die zweite Bindungsschicht (120) angebracht
worden ist.
3. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem das
Blockierungsmittel Bindungsstellen mit hoher Affinität
aufweist, welche zu den Erste-Schicht- (118)
Bindungsstellen mit hoher Affinität reziprok sind.
4. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem die
erste Bindungsschicht (118) aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Avidin, Streptavidin, genetisch
entworfenem Avidin, genetisch entworfenem Streptavidin,
derivatisiertem Avidin und derivatisiertem Streptavidin
besteht, wobei die zweite Bindungsschicht (120) eine
biotinilierte Verbindung ist.
5. Das Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem das
Blockierungsmittel Biotin ist.
6. Das Verfahren gemäß einem beliebigen der vorhergehenden
Ansprüche, bei dem der Schritt des Anbringens einer
ersten Bindungsschicht (118) in Verbindung mit der
Herstellung des Massensensors (100) ausgeführt wird,
während der Schritt des Anbringens einer zweiten
Bindungsschicht (120) direkt vor der Verwendung des
Massensensors (100) ausgeführt wird.
7. Ein Massensensor (100) zum Messen der Masse eines
Analyts in einer Lösung mit folgenden Merkmalen:
einem Substrat mit einer Oberfläche (114), an der der
Analyt angebracht werden soll;
einer Organosilan-Kopplungsschicht (116), die an der
Oberfläche (114) gebunden ist, wobei die Organosilan-
Kopplungsschicht (116) eine Funktionsgruppe aufweist;
einer Ligand-Bindungsschicht (118), die mittels der
Funktionsgruppe an der Oberfläche angebracht ist, wobei
die Ligand-Bindungsschicht Ligand-Bindungsstellen mit
hoher Affinität zum Binden eines Ligands aufweist; und
einer Ligand-Trägerschicht (120), die durch das Ligand
an den Ligand-Bindungsstellen der
Ligand-Bindungsschicht (118) stark haftet, wobei die
Ligand-Trägerschicht (120) zweite Bindungsstellen aufweist, die für
das Analyt chemisch selektiv sind, wodurch das Analyt
an der Oberfläche (114) mittels der
Ligand-Trägerschicht
(120), der Ligand-Bindungsschicht (118) und der
Organosilan-Kopplungsschicht (116) angebracht wird,
derart, daß die Masse durch den Sensor (100) bestimmt
werden kann.
8. Ein Massensensor gemäß Anspruch 7, welcher ein
Oberflächen-Transversalwellen-Massensensor (STW-Massensensor)
ist, der ferner folgende Merkmale aufweist:
einen Signalgenerator (121) zum Erzeugen eines
periodischen Signals;
einen Eingangswandler (112) zum Umwandeln des Signals
in eine akustische Welle, welche entlang des Substrats
übertragen wird;
einen Ausgangswandler (113) zum Umwandeln der
akustischen Welle in ein empfangenes Signal, wobei das
empfangene Signal auf die Masse des Analyts, der an der
Oberfläche (114) angebracht ist, anspricht; und
eine Signalverarbeitungseinrichtung (125) zum
Analysieren des empfangenen Signals, um die Masse zu bestimmen.
9. Ein Massensensor gemäß Anspruch 7 oder 8, bei dem die
Ligand-Bindungsschicht (118) aus der Gruppe ausgewählt
wird, die aus Avidin, Streptavidin, genetisch
entworfenem Avidin, genetisch entworfenem Streptavidin,
derivatisiertem Avidin und derivatisiertem Streptavidin
besteht, und wobei die Ligand-Trägerschicht (120) eine
biotinilierte Verbindung ist.
10. Ein Massensensor gemäß Anspruch 9, bei dem die
biotinilierte Verbindung ein biotinilierter Antikörper ist,
wodurch das Gerät das zugeordnete Antigen bindet.
11. Ein Massensensor gemäß Anspruch 9, bei dem die
biotinilierte Verbindung ein biotiniliertes Fragment eines
Strangs eines Polynucleotids ist, wodurch das Gerät
Fragmente von Polynucleotidsträngen bindet, die zum dem
biotinilierten Fragment komplementär sind.
12. Ein Massensensor gemäß Anspruch 9, bei dem die
biotinilierte Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die
aus Proteinen, die Immonoglobuline binden, besteht,
wodurch der Massensensor Immonoglobuline bindet.
13. Ein Massensensor gemäß Anspruch 12, bei dem die
biotinilierte Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die
biotiniliertes Protein A und biotiniliertes Protein G
aufweist.
14. Ein Massensensor gemäß Anspruch 7 oder 8, bei dem die
Ligand-Bindungsschicht (118) ein Lectin ist, wobei das
Lectin eine Bindungsaffinität für ausgewählte Zucker
aufweist, und die Ligand-Trägerschicht (120) ein
glycosyliertes Rezeptorprotein ist, an dem die ausgewählten
Zucker angebracht sind.
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