DE3877032T2 - Diagnostischer immunoassay fuer digoxin mit festphasetrennung. - Google Patents
Diagnostischer immunoassay fuer digoxin mit festphasetrennung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und Reagentien zur Durchführung eines Immuntests für Digoxin in biologischen Flüssigkeiten durch Festphasentrennung. In diesem Test wird ein Festphasen-Material eingesetzt, auf welchem eine Ouabaintriacetat- Verbindung fixiert ist. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere für den Einsatz in automatisierten Systemen.
- Es sind eine Vielzahl von Immuntests bekannt, bei denen im allgemeinen die spezifischen Bindungscharakteristika, die zwischen einem Analyten oder einem Protein mit einem spezifischen Antikörper, der mit einem detektierbaren Substituenten markiert worden ist, eingesetzt werden. Ein seit langem mit diesem Verfahren verbundenes Problem ist die Frage, wie ein Überschuß an Antikörper aus der auf einen Analyten zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit auf eine Weise entfernt werden kann, wobei die Analyt-Konzentration genau gemessen werden kann.
- Die verschiedenen Versuche, einen Überschuß an Antikörper zu entfernen, schließen die US-Patentschrift 4.298.687 ein, die die Absorption nicht umgesetzter Antikörper an eine Festphase, die aus einem Polyacrylamid-Gel besteht, das gegen den spezifischen Antiköper sensibilisiert worden ist, beschreibt.
- Die US-Patentschrift 4.551.426 von Freytag et al. beschreibt ein weiteres Verfahren zur Entfernung überschüssiger Antikörper bei einem Immuntest für Digoxin. In diesem Fall wird ein Überschuß an markiertem Antikörper dadurch entfernt, daß man ihn über eine Affinitätssäule, die Ouabain, ein Analogon von Digoxin, das auf der Festphasenchromatographie-Matrix fixiert worden ist, enthält, leitet. Der überschüssige Antikörper wird durch das Ouabain absorbiert. Das Eluat der Chromatographie wird anschließend auf den Komplex aus markiertem Antikörper und dem Analyten geprüft.
- Die EP-A-0 253 270, die unter die Bedingungen des Artikels 54(3) EPC fällt, beschreibt ein Verfahren zur Durchführung eines diagnostischen Immuntests durch Festphasentrennung. Zu einem Reaktionsgemisch aus einer Testprobe und markiertem Antikörper, der mit jedem in der Testprobe vorliegenden Analyten einen Komplex bildet, wird ein Festphasen-Material hinzugefügt, welches eine Verbindung enthält, die überschüssigen markierten Antikörper binden kann. Es wird ein Festphasen-Material gewählt, das sich schnell absetzt und dabei eine feste und einen flüssige Phase bildet. Die flüssige Phase kann dann extrahiert werden, um darin vorliegende Mengen an Analytmarkiertem Antikörper zu bestimmen.
- Obwohl die obigen Verfahren wirkungsvoll sein können, sind sie alle einer Verbesserung unterworfen. Im Falle der oben beschriebenen Techniken der Festphasentrennung muß die auf der Festphase fixierte Verbindung eine ausreichende Affinität für den zu entfernenden markierten Antikörper aufweisen. Im Idealfall ist die immobilisierte Verbindung irreversibel an die Festphase gebunden. Allerdings ist eine Abdissoziation der immobilisierten Verbindung von der Festphase durch Auswaschung nicht vermeidbar. Temperaturveränderungen und Verunreinigungen durch Mikroorganismen sind unvermeidbar und können diesen Prozeß beschleunigen. Dieses freigesetzte Material wird aufgrund seiner Affinität für den Antikörper den markierten Antikörper erkennen und mit ihm einen Komplex bilden, wodurch eine unerwünschte Hintergrundstörung und eine verringerte Testempfindlichkeit erfolgt. Die Dissoziation der fixierten Verbindung von dem Festphasen-Material ist ein Hauptverursacher für die verminderte Lebensdauer des Komplexes aus Festphase/immobilisierter Verbindung.
- Bekannte Verbindungen, die sich in einem Immuntest für Digoxin für die Fixierung auf Festphasen-Material eignen, schließen Digoxin und Ouabain ein. Diese Verbindungen weisen eine relativ hohe Affinität für den markierten Anti- Digoxin-Antikörper auf. Treten dieselben Verbindungen jedoch festphasenfrei auf, so werden sie von den Anti-Digoxin-Antikörpern erkannt, bilden mit den Antikörpern einen Komplex und verursachen die unerwünschte Hintergrundstörung. Der Verlust relativ geringer Mengen dieser Verbindungen wirkt sich nachteilig auf die Durchführung des Tests aus. Während der Synthese oder Lagerung von Digoxin- oder Ouabain-Festphasen reduziert die Abdissoziation von dem Festphasenkomplex die nutzbare Lebensdauer des Digoxin- oder Ouabain-Festphasenkomplexes.
- Entsprechend besteht ein Bedarf für einen verbesserten diagnostischen Immuntest durch Festphasentrennung für Digoxin, der eine Verbindung, die ausreichende Antikörper- Bindungseigenschaften aufweist, wenn sie auf der Festphase immobilisiert worden ist und die außerdem nur in geringem Maße Digoxin erkennt, wenn sie in an das Material der Festphase ungebundener Form vorliegt, vorsieht.
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen diagnostischen Immuntest für Digoxin mittels Festphasentrennung. Das Verfahren umfaßt folgende Schritte:
- (a) Bilden eines Reaktionsgemisches einer Testprobe mit einem molaren Überschuß an markiertem Anti-Digoxin-Antikörper, wobei der genannte markierte Antikörper mit dem in der genannten Testprobe vorliegenden Digoxin einen Komplex bilden kann; (b) Kontaktieren des genannten Reaktionsgemisches mit einem Festphasen-Material mit einer darauf immobilisierten Verbindung der Strukturformel:
- worin R&sub1;=R&sub2;=R&sub3;=Ac, X=0, Y&sub1;=Y&sub2;=OH,
- Z&sub1;=Z&sub2;=H oder R&sub1;=R&sub2;=R&sub3;=Ac, X=0, Y&sub1;=OH, Z&sub1;=H,
- Y&sub2; und Z&sub2;= eine Bindung, die die zwei Kohlenstoff-Atome, an die sie gebunden sind, miteinander verbindet; oder R&sub1;=R&sub2;=R&sub3;=Ac, X=0,
- Y&sub1;, Z&sub1; und Y&sub2;, Z&sub2;=eine Bindung, die die zwei Kohlenstoff-Atome, an die sie gebunden sind, miteinander verbindet; oder
- R&sub1;=R&sub2;=R&sub3;=H, X=N, Y&sub1;=Y&sub2;=OH, Z&sub1;=Z&sub2;=H, wobei die genannte Verbindung eine bevorzugte Bindungsaffinitiät für die markierten Anti-Digoxin- Antikörper besitzt, wobei die genannte Verbindung in einer Menge vorliegt, so daß jeder der genannten markierten Überschuß-Antikörper unter Bildung eines Festphasen-Komplexes komplexiert werden kann, (c) Absetzen lassen des genannten Festphasen-Materials und jedes Komplexes damit, wobei sich ein Feststoff und eine flüssige Phase bilden; und (d) Messen der Menge an Komplex, der in der genannten flüssigen Phase vorliegt.
- Das Festphasen-Material besitzt im allgemeinen eine ausreichende Dichte, um auf Grund der Schwerkraft zu sedimentieren. Vorzugsweise besitzt das Festphasen-Material in Wasser eine Sedimentationsgeschwindigkeit von 5 Sekunden bis 2 Minuten pro Zentimeter und hat einen Durchmesser von 5 bis 300 um. Das Festphasen-Material kann aus einer Vielzahl von Materialien, vorzugsweise Agarose, Polystyrol, Polyacrylamid, deren Derivate oder Mischungen daraus, gebildet werden. Am meisten bevorzugt ist das Festphasen-Material Trisacryl (Réactifs IBF, F92390 Villeneuve - La-Garenne, France) .
- Der Test kann auch auf einen kompetitive Weise durchgeführt werden, wobei Probe, Antikörper-Enzym und Festphase gleichzeitig gemischt werden. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer wird der Test, wie bei Schritt (c) oben beschrieben, fortgesetzt.
- Das Festphasen-Material weist darauf immobilisiert eine Verbindung der Strukturformel I auf, die fähig ist, den überschüssigen, markierten Antikörper zu binden, wie z.B. ein entsprechendes Antigen oder chemisches Analogon. Typischerweise ist der markierte Antikörper ein Enzym-markierter Antikörper.
- Am häufigsten wird 1,11,19-Tris-(acetyloxy)-3-[(6-desoxy-α-L-mannopyranosyl)-oxy]- 5,14-dihydroxycard-20(22)-enolid, (1β,3β,5β,11α) der folgenden Strukturformel verwendet:
- Weiterhin wird das Antikörper-Enzym-Konjugat gemäß der bevorzugten Ausführungsform für eine stärkere Bindung an Ouabaintriacetat als an Digoxin oder Ouabain vorselektioniert.
- Das vorliegende Verfahren ist speziell an die Verwendung in automatisierten diagnostischen Systemen, bei denen die Zentrifugalfiltration oder Säulenfiltration nur schwer durchführbar sind, angepaßt.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren, wodurch jeglicher Überschuß an markierter Anti-Digoxin-Verbindung, die zur Identifizierung von Digoxin verwendet wird, leicht entfernt werden kann, um die genaue Bestimmung des verbleibenden markierten Anti-Digoxins, das proportional zu dem Digoxin in der Probe ist, zu ermöglichen, bereit. Das Verfahren, wie unten beschrieben, ist besonders an die Verwendung in automatisierten Systemen, in welchen die traditionellen Mittel der Reinigung und Entfernung, z.B. Filtration, Zentrifugation oder Filtrationssäulen, ungeeignet sind, angepaßt. Mehr bevorzugt wird das hier beschriebene Verfahren mit dem diagnostischen Immun-Testgerät TDx, einem Markengerät der Firma Abbott Laboratories, als automatisiertes System zur Quantifizierung therapeutischer Arzneimittelkonzentrationen im Serum oder Plasma auf der Basis eines Fluoreszenz- Polarisierungsimmuntests, eingesetzt.
- Im allgemeinen umfaßt das nicht-kompetitive Verfahren die Herstellung eines Reaktionsgemisches aus einer biologischen Flüssigkeit, von der vermutet wird, daß sie Digoxin enthält, mit einer markierten Substanz, einem Antikörper, die sich an Digoxin anlagern kann. Die markierte Substanz wird zu dem Reaktionsgemisch in einem molaren Überschuß hinzugegeben, bezogen aud die vermutete Menge zu quantifizierendes Digoxin, um dessen vollständige Komplexierung sicherzustellen.
- Nach einer geeigneten Inkubationszeit, d.h. einem Zeitraum, der ausreicht, die Komplexbildung der Markierungssubstanz mit dem für die Quantifizierung zu suchenden Material zu ermöglichen, wird der Komplex gemessen. Da die Markierungssubstanz jedoch in einem molarem Überschuß verwendet wird, ist es notwendig, diesen Überschuß zu entfernen, bevor die Menge des gebildeten Komplexes gemessen wird.
- Das betreffende Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß der Überschuß an markierter Substanz durch Hinzufügen eines Festphasen-Materials, mit einer darauf immobilisierten Verbindung der Strukturformel I, die eine bevorzugte Bindungsaffinität gegenüber dem markierten Anti-Digoxin-Antikörper besitzt, die darum mit der markierten Substanz einen Komplex bilden kann, entfernt wird. Das Festphasen-Material besitzt physikalische Eigenschaften der Art, daß es in dem Reaktionsgemisch leicht dispergiert und durch Sedimentation entfernt werden kann. Aus diesem Grund ist die Dichte und Gesamtgröße des Festphasen-Materials der Art, daß eine schnelle Verteilung durch Schütteln und Sedimentation durch die Schwerkraft erleichtert wird.
- Das Festphasen-Material liegt als Teilchen oder Matrix, die eine höhere Dichte als Wasser aufweisen, vor. Das Festphasen-Material besitzt in Wasser eine Sedimentationsgeschwindigkeit von 5 Sek. bis 2 Min. pro cm, mehr bevorzugt 20 Sek. pro cm bis 1,5 Min., pro cm. Die Größe des Teilchens, das das Festphasen-Material bildet, kann von 5um-300 um, mehr bevorzugt 40-160 um, im Durchmesser betragen. Die Sedimentationsgeschwindigkeit und Größe ist wichtig, um sicherzustellen, daß das Festphasen-Material sowohl schnell dispergiert werden kann, als auch sich schnell ohne eine wesentliche Energie- oder Bewegungszufuhr in das Reaktionsgefäß, in dem sich das betreffende Reaktionsgemisch befindet, absetzt. Dies ist besonders wichtig, wenn ein automatisiertes diagnostisches Gerät eingesetzt wird.
- Das Festphasen-Material kann aus einer beliebigen Anzahl synthetischer Materialien hergestellt werden. Vorzugsweise wird das Festphasen-Material aus polymeren Materialien, wie Agarose, Polystyrol, Polyacrylamid, deren Derivaten oder Gemischen davon, hergestellt. Im allgemeinen liegt die Festphase in perlenförmigen Strukturen vor. Am meisten bevorzugt werden Trisacryl -Perlen verwendet. Das Festphasen-Material kann als trockenes Pulver, nasse Aufschlämmung, Tablette oder Kapsel in das Reaktionsgefäß gegeben werden, Zur Vereinfachung der Handhabung, Beschleunigung des Lösungsprozesses und Maximierung der größtmöglichen Stabilität, wird die Tablettenform bevorzugt.
- Gemäß einem bevorzugten Nachweisverfahrens wird der markierte Anti-Digoxin- Antikörper mittels einer Affinitätssäule, die 1,11,19-Tris-(acetyloxy)-3-[(6-desoxy-α-L- mannopyranosyl)-oxy]-5,14-dihydroxycard-20(22)-enolid,(1β,3β,5β,11α) enthält, unter Anwendung an sich bekannter Verfahrensweisen nach Dean et al. "Affinity Chromatography" (IRL Press Limited: 1985) gereinigt.
- Immobilisiert auf dem Festphasen-Material befindet sich eine Verbindung, die eine erhöhte Bindungsaffinität für den markierten Anti-Digoxin-Antikörper aufweist. Diese Verbindung ist komplementär zu der zu identifizierenden Substanz, in diesem Fall Digoxin, und in der Lage, die markierte Substanz zu komplexieren. Der gebildete Komplex wird an das Festphasen-Material gebunden, und auf Grund seiner physikalischen Eigenschaften wird er durch Absetzen abgetrennt oder sedimentiert durch die Schwerkraft. Die Verbindung kann entweder direkt oder kovalent durch eine Gruppe zur Verknüpfung, wie ein Protein oder einen organischen Spacer-Arm, an die Festphase gebunden sein. Auf diese Weise trennt sich das gesamte Reaktionsgemisch in eine Festphase, die das Festphasen-Material als Komplex mit irgendeiner überschüssigen Substanz enthält und einer flüssigen Phase, die das gesuchte, quantitativ zu bestimmende Material, das mit der markierten Substanz einen Komplex bildet, enthält.
- Ein wichtiger Aspekt dieser Erfindung ist die Tatsache, daß die immobilisierte Verbindung eine ausreichende Bindungsaffinität gegenüber der markierten Substanz aufweisen muß, wenn sie an das Festphasen-Material gebunden wird und sie muß außerdem eine geringe Erkennungsfähigkeit der markierten Substanz, wenn sie vom Festphasen-Material abdissoziiert ist, aufweisen. Überraschenderweise tritt diese Kombination aus adäquater Bindungsaffinität und geringer Erkennungungsfähigkeit der Anti-Digoxin-Antikörpern bei Verbindungen, die der hier gezeigten Strukturformel I entsprechen, auf.
- Gemäß der Erfindung dienen die Ouabaintriacetate der Formel I als immobilisierte Verbindung. Gemäß der am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Ouabaintriacetat-Verbindung 1,11,19-Tris-(acetyloxy)-3-[(6-desoxy-α-L-annopyranosyl)- oxy]-5,14-dihydroxycard-20(22)-enolid,(1β, 3β, 5β,11α) (Formel II der Beschreibung), und wird durch einen Protein-Verknüpfungsarm an das Festphasen-Material gebunden. Auf Grund ihrer geringen Affinität (s. Beispiel 3) wird diese Verbindung am meisten bevorzugt. Es ist klar, daß während das oben genannte Ouabaintriacetat-Derivat, welches gemäß der Verfahrensweise des hier aufgeführten Beispiels I synthetisiert worden ist, die bevorzugte Verbindung für die Immobilisierung auf dem Festphasen-Material darstellt, die in Beispiel 1 dargelegten Verfahrensweisen durch Fachleute auf an sich bekannten Wegen geändert werden können, um weitere verwendbare Ouabaintriacetat- Verbindungen, die durch die Strukturformel I dargestellt werden, herzustellen.
- Nachdem der Überschuß an markierter Substanz in einem Komplex aus Festphasen-Material/immobilisierter Substanz entfernt worden ist, wird die Flüssigphase dann auf die Menge des gesuchten, quantitativ zu bestimmenden Materials, z.B. Digoxin, geprüft. Im allgemeinen wird dies durch Herausnehmen der Flüssigphase mittels einer Spritze, durch Absaugen oder andere Mittel erreicht. Anschließend wird ein Immuntest im geeigneten Format zur Messung der Menge an markierter Substanz verwendet.
- Typische Mittel, die für die Markierung Verwendung finden, sind Enzyme, Radioisotope, Chromophore, Fluorophore oder jede Substanz, die entweder allein oder in Kombination mit anderen Reagentien, ein nachweisbares Signal erzeugen kann. Verfahren und Methoden zur Markierung und Identifizierung der markierten Komplexe sind in der Technik des diagnostischen Immuntests, wie er in L. Miles und C. Hales, Labeled Antibodies and Immunological Assay Systems, Nature 219, 187-189 (1968) und in der US-Patentschrift 3.654.090 beschrieben wird, gut bekannt. Gemäß des bevorzugten Tests auf Digoxin ist die Markierungssubstanz β-Galactosidase.
- Das betreffende Verfahren eignet sich wegen seiner relativ automatischen Reinigung des zu messenden Komplexes besonders zum Einsatz in automatisierten diagnostischen Immun-Testgeräten.
- Insbesondere kann das Immun-Testverfahren ausgeführt werden, indem die biologische Flüssigkeit, die auf Digoxin analysiert werden soll, mit genügend markierter Substanz gemischt wird und dann dieses Reaktionsgemisch entweder in ein Reaktionsgefäß, welches das betreffende Festphasen-Material enthält, gegeben wird oder das betreffende Festphasen-Material zu dem ursprünglichen Reaktionsgemisch gegeben wird, wodurch das betreffende Festphasen-Material das Reaktionsgemisch vom Überschuß an markierter Substanz reinigt, ohne daß zusätzliche physikalische oder chemische Behandlungsschritte erforderlich sind. Somit wird bei dem betreffenden Verfahren die Notwendigkeit der Zentrifugation, die Herstellung eines Säuleneluats oder der Einsatz noch zeitaufwendigerer Schritte zur Gewinnung der markierten Substanz für die endgültige Messung umgangen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft vorzugsweise nicht-kompetitive Testverfahren, wie sie in Beispiel 4 beschrieben sind. Jedoch betrachtet die vorliegende Erfindung auch kompetitive Test-Techniken. Bei dem kompetitiven Testaufbau betrifft die Messung zum Nachweis von Digoxin in einer Probe-Flüssigkeit die gleichzeitige Inkubation von β- Glaktosidase-markierten F(ab')&sub2;-Antikörperfragmenten mit der Probe und einer Ouabaintriacetat-Albumin-Trisacryl-Festphase. Das Festphasen-Material und die β-Galaktosidase verhalten sich gegenüber dem Analyten kompetitiv. Im Anschluß an die kompetitive Reaktionszeit sedimentiert die Festphase, und ein Aliquot, das den mit β-Galaktosidase markierten Analyten F(ab)&sub2; enthält, wird zur quantitativen Bestimmung unter Verwendung eines fluorogenen Substrates in eine Küvette gegeben.
- Ein Gemisch aus 4,7 g (6,45 mmol) Ouabainoctahydrat und 400 mg (3,28 mmol) 4-Dimethylaminopyridin wurde in 95 ml 1:4 Essigsäureanhydrid in Pyridin gelöst und über Nacht gerührt. Die klare gelbe Lösung wurde mit 200 mlMethylenchlorid verdünnt, danach mit eiskalter 25%iger wäßriger Schwefelsäure extrahiert, bis die wäßrige Phase einen sauren pH-Wert aufwies. Die organische Phase wurde dann mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Entfernung des Lösungsmittels ergaben 5,3 g (98 %) eines Produktes in Form eines gelben Feststoffes, der ohne weitere Reinigung weiterverwendet wurde. Die Dünnschicht-Chromatographie auf Silicagel mit 20 % Methanol in Methylenchlorid als Laufmittel ergab folgende Rf- Werte: Ouabain = 0,11 und Ouabainhexaacetat = 0,87.
- Ein Gemisch aus Ouabainhexaacetat (1,02 g, 1,22 mmol) und Kaliumcyanid (75 mg, 1,15 mmol) in 15 ml Methanol wurde bei Raumtemperatur gerührt. Das feste Hexaacetat war in Methanol nur leicht löslich. Jedoch war nach etwa 1,5 h Rühren das gesamte Material gelöst. Nach 6 h wurden dem Reaktionsgemisch etwa 5 g Silicagel zugefügt und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt. Es ist wichtig, daß die Temperatur während dieser Stufe unter 45º C gehalten wird. Dieses Silicagel wurde auf eine Säulen für die Flash-Chromatographie aufgetragen und mit 10% Methanol in Methylenchlorid eluiert. Fraktionen, die dem Hauptprodukt entsprachen, wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, wodurch 841 mg (97%) Produkt als glasiger Feststoff erhalten wurden, der nach Abkratzen von den Wänden des Kolbens ein weißes Pulver ergab. Die Bestimmung dieses Produktes mit Hilfe von NMR- und Massenspektroskopie ergab, daß es sich um 1,11,19-Tris-(acetyloxy)-3-[(6-desoxy-α-L- mannopyranosyl)-oxy]-5,14-Dihdroxycard-20(22)-enolid,(1β,3β,5β,11α) handelte. Die Dünnschicht-Chromatographie auf Silicagel (20% Methanol/Methylenchlorid) ergab für das Ouabaintriacetat einen Rf-Wert von 0,49.
- Ein Gemisch aus Ouabainhexaacetat (10,0 g, 12,0 mmol) und Kaliumcarbonat (0,75 g, 5,4 mmol) in 250 ml Methanol wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 0,5 h wurde das Gemisch filtriert, und dem Filtrat wurde sodann verdünnte wäßrige Essigsäure zugesetzt, bis ein in 2 ml gelöstes 0,25 ml Aliquot einen neutralen pH-Wert aufwies. Danach wurden dem Reaktionsgemisch 50 g Silicagel zugesetzt, und das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt. Das getrocknete Silicagel wurde dann auf eine Säulen für die Flash-Chromatographie aufgetragen und mit 15% Methanol in Methylenchlorid eluiert. Die dem Hauptprodukt entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, wobei 8.5 g (89%) eines Produktes als farbloser Feststoff anfielen. Die Bestimmung des Produkts durch NMR- und Massenspektroskopie ergab, daß es sich um 1,11,19-Tris(acetyloxy)-3-[(6-desoxy-α-L- mannopyranosyl)-oxy]-5,14-dihydroxycard-20-(22)-enolid,(1β,3β,5β,11α) handelt. Die Dünnschicht-Chromato-graphle auf Silicagel ergab einen Rf-Wert von 0,49 für das Ouabaintriacetat.
- Kaninchen-Antiserum gegen Digoxin wurde durch (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Fällung fraktioniert und mit Pepsin umgesetzt, um F(ab')&sub2;-Fragmente herzustellen. Die F(ab')&sub2;-Fragmente wurden durch Affinitätschromatographie auf Trisacryl-Rinderserum-Albumin-Ouabaintriacetat unter Verwendung der in Dean et al. "Affinity Chromatography" (IRL Press Limited 1985) angegebenen Verfahrensweisen gereinigt.
- Durch Affinitätschromatographie gereinigte F(ab')&sub2;-Fragmente wurden mit β- Galaktosidase gekuppelt, wobei im wesentlichen die in Kang et al., Clin. Chem. 32:1682 (1986) beschriebene Methode zur Bindung von IgG-Molekülen an β-Galaktosidase verwendet wurde. F(ab')&sub2;-β-Galaktosidase-Konjugate wurden durch Größen- Ausschlußchromatographie unter Verwendung einer Superose IM-Säule isoliert.
- Ouabain, Ouabaintriacetat-1,11,19-Tris(acetyloxy)-3-[(6-desoxy-α-L-mannopyranosyl)-oxy]-5,14-dihydroxycard-20(22)-enolid,(1β,3β,5β,11α) und Digoxin-Festphasen wurden in ähnlicher Weise gewonnen. Ouabaintriacetat, Ouabain und Digoxin wurden an Rinderserum-Albumin gebunden, indem das in Biochemistry 9:331 (1970) beschriebenen allgemeinen Schema befolgt wurde. Anschließend wurden die Albumin- Konjugate mit Trisacryl, das vorher in ähnlicher Weise, wie von Bethell, J. Biol. Chem., 254:2572 (1979) beschrieben, mit Carbonyldiimidazol aktiviert worden war, gekuppelt.
- Die Antigenität der Herzglycosid-Analoga wurde zunächst unter Verwendung des TDx-Analysators und des Abbott Digoxin II-Tests, der durch die Firma Abbott Laboratories, Abbott Park, Il 60064 käuflich erhältlich ist, bestimmt. Die Analoga werden als wäßrige Lösungen in TDx-Verdünnungspuffer bewertet. Mehrere Analoga wurden außerdem anschließend unter Verwendung des hier beschriebenen (s. allgemein Beispiel IV) neuen Digoxin-Tests unter Verwendung einer Ouabaintriacetat-Festphase, die gemäß Beispiel IIB hergestellt worden war, getestet. Bei den getesteten Analoga handelte es sich um:
- wobei R&sub1; = R&sub2; = R&sub3; = Ac, X = 0, Y&sub1;, Z&sub1; und Y&sub2;,
- Z&sub2; = eine Bindung, die die zwei Kohlenstoff-Atome verbindet, an die sie gebunden sind (A); R&sub1; = R&sub2; = R&sub3; = Ac, X = 0, Y1 = OH,
- Z&sub1; = H, Y&sub2; und Z&sub2; = eine Bindung, die die zwei Kohlenstoff-Atome verbindet, an die sie gebunden sind (B); R&sub1; = R&sub2; = R&sub3; = Ac,
- X = 0, Y&sub1; = Y&sub2;= OH, Z&sub1; = Z&sub2; = H (C); und
- R&sub1; = R&sub2; = R&sub3; = H, X = N, Y&sub1; = Y&sub2;= OH, Z&sub1; = Z&sub2; = H (D).
- Die Kreuzreaktivität wurde als die ermittelte Testkonzentration, dividiert durch die tatsächliche Konzentration des Analogons mal 100, definiert. Kreuzreaktivität (%) Anlalogon DIGOXIN II TEST (NEU) Digoxin Digoxinlactam Ouabain Ouabaintriacetat Ouabainlactam
- Der allgemeine Test-Aufbau besteht aus der Vorinkubation des Überschusses an β- Galaktosidase-markiertem F(ab')&sub2; (Beispiel II A) mit Probe, so daß die Probe quantitativ und schnell gebunden wird, um das F(ab')&sub2;-Konjugat zu bilden. Ein Aliquot dieses Gemisches wird in ein Reaktionsgefäß übergeführt, welches Ouabaintriacetat-Albumin- Trisacryl-Festphase enthält, die gemäß des Verfahrens aus Beispiel II B hergestellt worden war und deren charakteristische Dichte eine leichte Suspendierung in Lösungen erlaubt und doch ausreichend dicht ist, um durch die Schwerkraft schnell zu sedimentieren. Das Festphasen-Material fängt schnell überschüssiges nichtkonjugiertes β- Galaktosidase-markiertes F(ab')&sub2; ab und sedimentiert. Im Anschluß an die Fang- Reaktion und die Sedimentation wurde ein Aliquot, das das mit Analyt-β-Galaktosidase markierte F(ab')&sub2; enthielt, zur quantitativen Bestimmung unter Verwendung eines fluorogenen Substrats in eine Küvette übergeführt.
- Serumlösungen, die 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; und 5,0 ng/ml Digoxin enthielten, wurden jeweils gemäß desselben unten beschriebenen Testprotokolls geprüft. Eine Kontrolle wurde ohne Digoxin bzw. ohne Festphasen-Material durchgeführt. 50 Mikroliter Serumprobe wurden mit 25 ul von β-Galaktosidase-markiertem F(ab')&sub2; (Beispiel II A) und 325 ul TDx-Verdünnungspuffer vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde für 6 Minuten bei 34-35º C inkubiert und danach ein 60 ml Aliquot sowie 55 Mikroliter TDx Verdünnungspuffer zu 10 mg Festphasen-Material (Beispiel II B) hinzugegeben. Dieses Gemisch wurde unter weiterem Mischen für 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurden dem Gemisch 400 ul Verdünnungspuffer beigegeben.
- Das Gemisch wurde kurz ruhen gelassen, wobei sich das Gemisch in eine flüssige und eine feste Phase trennte. Die β-Galaktosidase-Aktivität des Überstands wurde durch quantitative Bestimmung der Fluorescein-Produktion gemessen. Die Messung wurde unter Verwendung von 10 umolarem Di-(β-D-galaktosyl)-fluorescein als Substrat in TDx-Verdünnungspuffer, welcher 1 mM MgCl&sub2; enthielt, durchgeführt.
- Die Messungen ergaben: Test Nr. Konzentration Digoxin (ng/ml) Fluorescenz Meßwert Kontrolle (kein Festphasenmaterial)
- Die erhaltene Messung zeigt, daß durch Verwendung des betreffenden Verfahrens eine Standardkurve ermittelt werden kann, um verdünnte Seren, die unbekannte Digoxin- Konzentrationen enthalten, zu analysieren. Weiterhin zeigt die Nullwert-Messung im Vergleich mit der Kontrolle, daß der Überschuß an Antikörper-Konjugat durch das betreffende Verfahren wirksam entfernt worden ist.
- F(ab')&sub2;-Fragmente werden unter Verwendung entweder von Ouabaintriazetet- oder Ouabain-Festphasenmatrix unter Verwendung des in Beispiel I B beschriebenen Verfahrens durch Affinitätschromatographie gereinigt. Mit β-Galaktosidase markierte Konjugate wurden hergestellt, wobei jeweils diese Typen der gereinigten F(ab')&sub2;- Fragmente, wie in Beispiel II A beschrieben, verwendet wurden. Jeder Konjugat-Typ wurde auf seine Fähigkeit, eine Ouabaintriacetat Festphase zu binden, untersucht. Die Ergebnisse lauten wie folgt: Ouabain-F(ab')&sub2; Ouabaintriacetat-F(ab')&sub2; Kontrolle (Wert) + Festphase (Wert) % Bindung
- Wie die oben stehende Tabelle zeigt, liefert die Affinitätsselektionierung von F(ab')&sub2;- Fragmenten mit einer Ouabaintriacetat-Matrix ein Konjugat, das eine höhere Bindungsrate und somit eine überlegene Testleistung ergibt.
- Die verbesserte Stabilität, die sich aus der Verwendung eines Analyten mit geringerer Affinität als Festphasen-Ligand ergab, wurde auf verschiedenen Wegen analysiert. Im ersten Fall wurden zwei unterschiedliche Typen der Festphase, wobei eine Festphase mit Digoxin, die andere mit Ouabaintriacetat-1,11,19-Tris(acetyloxy)-3-[(6- desoxy-α-L-mannopyranosyl)-oxy]-5,14-dihydroxycard-20(22)-enolid,(1β,3β,5β,11α) hergestellt worden war, hinsichtlich ihrer Stabilität während der Lyophilisation getestet. Die zwei lyophilisierten Festphasen wurden dann hinsichtlich ihrer Langzeitstabilität untersucht. Die Daten sind unten aufgeführt. Digoxin-Festphase Ouabaintriacetat-Festphase vor Lyophilisation (Bindung, %) nach Lyophilisation (Bindung, %) Rückgang
- Jede der obigen verwendeten Festphasen wurde bei Raumtemperatur aufbewahrt und hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Antikörper-Enzym in Abhängigkeit von der Zeit zu binden, geprüft. Die beobachteten Ergebnisse waren wie folgt: Bindung (%) Tage Digoxin Ouabaintriacetat
- Wie die Ergebnisse zeigen, verliert die Digoxin-Festphase ihre Bindungskapazität schnell, wenn sie bei Raumtemperatur gelagert wird. Das Ouabaintriacetat blieb während des gleichen Zeitraums stabil.
- Ouabain und Ouabaintriacetat 1,11,19-Tris-(acetyloxy)-3-[(6-desoxy-α-L-mannopyranosyl)-oxy]-5,14-dihydroxycard-20(22)-enolid,(1β,3β,5β,11α) wurden an Albumin und anschließend an Trisacryl unter Verwendung der ähnlichen Chemie gebunden, so daß eine Auswaschung aufgrund der Bindungsspaltung bei beiden Festphasen in ähnlicher Weise auftreten sollte. Trypsin wurde zur Spaltung des Albumin-Verknüpfungsarms verwendet, wobei diese Auswaschungsgeschwindigkeit beschleunigt wurde. Trypsin hat den wichtigen Vorteil, daß es die Struktur keines Analyten verändert, was bei vielen nicht-enzymatischen Verfahren auftreten könnte. Die experimentellen Daten lauten wie folgt:
- % Bindung von Antikörper-Enzym-Konjugat an die Festphase Ouabaintriacetat Ouabain ohne Trypsin Trypsin (0,2 mg/ml) (10 Min.) Trypsin (0,2 mg/ml) (30 Min.)
- Das Auswaschen des Ouabains wirkt sich für die Antikörper-Enzym Bindung und darum auf die Leistungsfähigkeit nachteiliger aus als die Auswaschung des Ouabaintriacetats. Dies wird auf Grund der sehr unterschiedlichen Kreuzreaktivitäten äquimolarer Mengen von Ouabain und Ouabaintriacetat vorausgesagt.
Claims (7)
1. Verfahren zur Durchführung eines diagnostischen Immuntests umfassend
den Schritten:
(a) Bilden eines Reaktionsgemisches einer Testprobe mit einem molaren
Überschuß an markiertem Anti-Digoxin Antikörper, wobei der genannte
markierte Antikörper mit dem in der genannten Test-Probe vorliegenden
Digoxin einen Komplex bilden kann;
(b) Kontaktieren des genannten Reaktionsgemisches mit einem Festphasen-
Material mit einer darauf immobilisierten Verbindung der Strukturformel:
worin R&sub1;=R&sub2;=R&sub3;=Ac, X=0, Y&sub1;=Y&sub2;=OH,
Z&sub1;=Z&sub2;=H oder R&sub1;=R&sub2;=R&sub3;=Ac, X=0, Y&sub1;=OH, Z&sub1;=H,
Y&sub2; und Z&sub2;= eine Bindung, die die zwei Kohlenstoffatome, an die sie
gebunden sind, miteinander verbindet; oder R&sub1;=R&sub2;=R&sub3;=Ac, X=0,
Y&sub1;, Z&sub1; und Y&sub2;, Z&sub2;=eine Bindung, die die zwei Kohlenstoffatome, an die
sie gebunden sind, miteinander verbindet; oder
R&sub1;=R&sub2;=R&sub3;=H, X=N, Y&sub1;=Y&sub2;=OH, Z&sub1;=Z&sub2;=H, wobei die genannte
Verbindung eine bevorzugte Bindungsaffinitiät für die markierten Anti-
Digoxin Antikörper besitzt, wobei die genannte Verbindung in einer
Menge vorliegt,so daß jeder der genannten markierten Überschuß-
Antikörper unter Bildung eines Festphasen-Komplexes komplexiert werden
kann.
(c) Absetzen lassen des genannten Festphasen-Materials und jedes
Komplexes damit, wobei sich ein Feststoff und eine flüssige Phase bilden;
und
(d) Messen der Menge an Komplex, der in der genannten flüssigen Phase
vorliegt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die genannte immobilisierte
Verbindung 1,11,19-Tris-(acetyloxy)-3-[(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-oxy]-5,14-
dihydroxycard-20-(22)-enolid-(1β,3β,5β,11α) ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der genannte Antikörper durch
Affinitätschromatographie unter Verwendung von 1,11,19-Tris-(acetyloxy)-3-[(6-
deoxy-α-L-mannopyranosyl)-oxy]-5,14-dihydroxycard-20-(22)-enolid-(1β,3β,5β,11α)
gereinigt wird.
4.Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Stufen (a) und (b) gleichzeitig
durchgeführt werden.
5. Verfahren zur Durchführung eines diagnostischen Immuntestes für
Digoxin umfassend die Stufen:
(a) Bilden eines Reaktionsgemisches einer Test-Probe mit einem molaren
Überschuß des markierten Anti-Digoxin Antikörpers, wobei der genannte
Anti-Digoxin Antikörper vor der Bildung des genannten
Reaktionsgemisches durch Affinitätschromatographie unter Verwendung
von 1,11,19-Tris-(acetyloxy)-3-[(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-oxy]-
5,14-dihydroxycard-20-(22)-enolid-(1β,3β,5β,11α) gereinigt worden ist,
wobei der genannte markierte Anti-Digoxin Antikörper mit in der
genannten Testprobe vorliegenden Digoxin einen Komplex bilden kann;
(b) Kontaktieren des genannten Reaktionsgemisches mit einem Festphasen-
Material mit darauf immoblisierten 1,11,19-Tris-(acetyloxy)-3-[(6-deoxy-
α-L-mannopyranosyl)-oxy]-5,14-dihydroxycard-20-(22)-enolid-(1β,3β,5β,11α), wobei dieVerbindung eine bevorzugte Bindungsaffinität für
markierte Anti-Digoxin-Antikörper besitzt und in einer Menge vorliegt,
daß jeder der genannten markierten Überschuß-Antikörper unter Bildung
eines Festphasen-Komplexes komplexiert werden kann,
(c) Absetzen lassen des genannten Festphasen-Materials und jedes
Komplexes damit, wobei sich ein Feststoff und eine flüssige Phase bilden;
und
(d) Messen der Menge an Komplex, der in der genannten flüssigen Phase
vorliegt.
6. Eine Verbindung der Formel:
worin R&sub1;=R&sub2;=R&sub3;=Ac, X=0, Y&sub1;=Y&sub2;=OH,
Z&sub1;=Z&sub2;=H oder R&sub1;=R&sub2;=R&sub3;=Ac, X=0, Y&sub1;=OH, Z&sub1;=H,
Y&sub2; und Z&sub2;= eine Bindung, die die zwei Kohlenstoffatome, an die sie
gebunden sind, miteinander verbindet; oder R&sub1;=R&sub2;=R&sub3;=Ac, X=0,
Y&sub1;, Z&sub1; und Y&sub2;, Z&sub2;=eine Bindung, die die zwei Kohlenstoffatome, an die
sie gebunden sind, miteinander verbindet; oder
R&sub1;=R&sub2;=R&sub3;=H, X=N, Y&sub1;=Y&sub2;=OH, Z&sub1;=Z&sub2;=H.
7. Verbindung nach Anspruch 6, bei der R&sub1;=R&sub2;=R&sub3;=Ac,
X=0Y&sub1;=Y&sub2;=OH, Z&sub1;=Z&sub2;=H.
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