DE2751588A1

DE2751588A1 - Verfahren zur bestimmung eines liganden oder der liganden-bindungskapazitaet in einem fluessigen medium

Info

Publication number: DE2751588A1
Application number: DE19772751588
Authority: DE
Inventors: Judith Feingers; Anthony Joseph Pick; Daniel Wagner
Original assignee: Ames Yissum Ltd
Current assignee: Biodex Biotechnological and Diagnostic Systems Ltd
Priority date: 1977-01-28
Filing date: 1977-11-18
Publication date: 1978-08-03
Also published as: AU3074277A; DE2751588C3; SE7714931L; CA1091821A; FR2379072A1; AU510391B2; IT1203081B; JPS5395697A; FR2379072B1; IL51354A; GB1564578A; BR7800524A; IL51354A0; US4205058A; DE2751588B2

Description

DR. IWG. F. WITKSTnOKK

»Η.K. r. PKCUMANN »Η. IN«. Π. JIKItRKNK υιρΐ~ in«. κ.<;οκτζ

PATEIITAIIlVALTe

8OOO ΜΟκοπκν βο

KOΠ WIIOiHSTRAS«E S Tl I.I KOM <18·Ι #·=Οβ1

TKLBX SX4O7·

PMOTKOTrATKMT MO

1Α-50 088

Patent an Me !dung Anmelder: Ames-YissumLtd.

Har Hotζvim, Sanbedria Murhevet Jerusalem (Israel)

Titel:

Verfahren zur Bestimmung eines Liganden oder der Liganden-Bindungskapazität in einem flüssigen Medium

809831/057t

DB. ING. V. WITKSTIIO KF I)K-K. ν. 1'KCIIMANN I)U. INC. I). ItKIlIIKNS DIP!.. INC. H. COKT/.

1"ATEKTAN W Λ l.TK

sooo AtϋκCKEr: no

K 2

«ob») oeaosi

TKLRI Π 24 070

TKI.KIIRAH MK ι
PMOTKOTPATKMT

1A-50 088

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein spezifisches Bindungsverfahren und eine Analyseneinheit zur Bestimmung eines Liganden, wie eines Antigens oder Antikörpers, in oder der Liganden-Bindungskapazität von einem flüssigen Medium, besonders einer Körperflüssigkeit, wie Serum, wobei der unbekannte Ligand mit einer markierten Komponente, wie einer radioaktiv markierten Form des Liganden oder eines bindenden Analogen des Liganden, um die Bindung mit einem Bindungspartner in Konkurrenz tritt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Trennung der entstehenden gebundenen Form von der freien Form der markierten Komponente erreicht wird, indem man das flüssige Reaktionsgemisch in eine Säule mit einem Adsorptionsmaterial, das für eine der beiden Formen spezifisch ist, zieht. Die Trennung wird erreicht durch Immobilisierung der jeweiligen Form im Anfangsteil der Adsorbenssäule, während die andere Form mit fortschreitendem Reaktionsgemisch weiter durch die Säule transportiert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist in der Handhabung einfach und vorteilhafter gegenüber bekannten Verfahren. Es findet spezielle Anwendung für radioimmunologische Bestimmungen, besonders zum Nachweis von niedermolekularen Liganden, und es kann leicht automatisiert werden.

Die Erfindung betrifft die quantitative Bestimmung von Substanzen in oder Eigenschaften von flüssigen Medien, einschließlich Körperflüssigkeiten, wie Serum, die auf spezifischen Bindungsverfahren beruht. Besonders bezieht sich die Erfindung auf den Nachweis bzw. die Bestimmung von Antigenen oder Haptenen durch immunologische Verfahren, umfassend

809831/057S

die Anwendung von markierten Reagentien, wie radioaktiv markierten Reagentien. Die Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur Durchführung der Trennung von gebundener und freier markierter Substanz bei heterogenen spezifischen Bindungsverfahren dar.

Ein lebendes System ist imstande, das Vorhandensein von fremden Substanzen (Antigenen), wie Proteinen, Viren, Bakterien usw., innerhalb des System nachzuweisen, zu erkennen und darauf zu reagieren. Diese Reaktion besteht u.a. in der Bildung eines Antikörpers, der zu dem speziellen Antigen spezifisch ist. Daraufhin tritt eine spezifische Reaktion zwischen dem Antikörper und dem Antigen unter Bildung eines Komplexes ein. Ein einmal gebildeter Antikörper ist auch imstande, ein Hapten, d.h. eine verhältnismäßig kleine und einfache Verbindung zu binden, die die determinierende Gruppe eines bestimmten Antigens sein kann, wobei das Hapten imstande ist, sich mit dem spezifischen Antikörper zu verbinden, aber nicht imstande ist, selbst zur Bildung eines Antikörpers zu führen, solange es nicht an einen antigenen Träger gebunden ist.

Die Bindung zwischen einem Antigen oder einem Hapten und dessen Antikörper ist spezifisch und empfindlich. Andere Arten von Substanzen, die ähnliche spezifische und empfindliche Bindungsreaktionen ein/° sind Enzyme und ihre Substrate, Substanzen, wie Hormone, Vitamine, Metaboliten und pharmakologische Mittel und deren Rezeptoren und bindende Substanzen sowie andere bekannte Substanzen. Diese spezifischen und empfindlichen Bindungsreaktionen führten zu einer raschen Entwicklung von analytischen Verfahren, die als spezifische Bindungsverfahren bekannt sind. Bei einem derartigen Bestimmungsverfahren tritt die zu bestimmende Substanz oder Gruppe von Substanzen (im folgenden als "Ligand" bezeichnet) in einer flüssigen Probe in Konkurrenz mit einer markierten Form des Liganden oder eines Bindungsanalogen davon um die

809831/057«

- ff -

Bindung mit einem bindenden Reagens. Wenn eine radioaktiv markierte Substanz angewandt wird und das bindende Reagens ein Antikörper ist, ist das Verfahren als radioimmunologische Bestimmung (Radioimmunoassay) bekannt. In letzter Zeit wurde über verschiedene alternative Markierungssubstanzen zum Ersatz von Radioisotopen berichtet, wie Enzyme, Coenzyme, Enzymsubstrate, Enzymmodulatoren, wie Hemmstoffe und allosterische

Effektoren, Fluoreszenzmoleküle, Lumineszenzmoleküle u.a. Zur

Illustration wird im folgenden eine spezielle Art einer spezifischen BindungsbeStimmung, nämlich eine radioimmunologische Konkurrenzbindung, beschrieben.

Dieses System besteht aus einem Antigen oder Hapten, das mit einer radioaktiven Substanz markiert ist, nicht markiertem nativen Antigen (in der zu untersuchenden Probe) und spezifischem Antikörper, wobei eine Konkurrenz zwischen dem nicht markierten Antigen und dem markierten Antigen um die Bindung mit einer begrenzten Menge Antikörper eintritt. Daher ist, je größer die Konzentration an nicht markiertem Antigen in der zu untersuchenden Probe des Systems ist, die an

/markiertem Antigen den Körper gebundene Menge an/ umso geringer. Das kann schematisch folgendermaßen dargestellt werden:

markiertes Antigen + spezifischer Antikörper + nicht markiertes Antigen *Ag Ak Ag

markierter und nicht markierter Antigen-Antikörper-Komplex

(*Ag-Ak) + (Ag-Ak)

Wenn die Konzentration an markiertem Antigen und Antikörper festliegt und die einzige Variable die Menge an unmarkiertem Antigen ist, wird es möglich, ein Bestimmungssystem aufzustellen zur Messung desbekannten Gehalts an nicht markiertem Antigen durch physikalische Trennung des Antigen-Antikörper— Komplexes von dem restlichen freien Antigen (sowohl markiert

809831/057$ "^/k

als auch nicht markiert). Die Radioaktivität des Produktes wird verglichen mit einer Standardkurve, bei der die Werte für einen gegebenen Bereich bekannter Mengen eines auf die gleiche Weise behandelten Antigens aufgetragen sind.

Es sind viele Verfahren zur Trennung des freien ungebundenen Antigens oder Haptens von dem Komplex aus Antigen und Antikörper bekannt. Ein als Chromatoelektrophorese bekanntes Verfahren kombiniert das Verfahren der Papierchromatographie mit dem der Papierelektrophorese. Papier mit einer hohen Affinität zu dem freien Antigen (wie Whatman 3MM, Whatman 3MC und DEAE-Papier) werden als Träger verwendet. Während dieses Verfahren unterscheidungskräftig ist und zur Bestimmung von Insulin, Wachstumshormon, Glucagon, Parathyroidhormon, ThyroidXetimulierendem Hormon und anderen Peptidhormonen angewandt worden ist, besitzt es eine Anzahl hervorstechender Nachteile, die seine Anwendung begrenzen. Auf das Absorbens kann nur eine begrenzte Menge Material aufgebracht werden, und die Trennung ist sowohl mühsam als auch zeitraubend.

Bei einem anderen bekannten Verfahren, das angegeben ist zur Bestimmung der oben erwähnten Peptidhormone, wird die aufsteigende Papier-(Docht)-Chromatographie angewandt, z.B. mit Hilfe von Whatman 3MC und DE-Cellulosepapier oder von Papier, das mit schwachen Ionenaustauscherharzen versehen ist. (Orskov, Scand. J. Clin. Lab. Invest. Bd. 20, S. 297 (1967)). Dieses Verfahren besitzt ebenfalls den Nachteil, daß die Menge der Probe, die auf das untere Ende des Papierdochtes aufgebracht werden kann, verhältnismäßig klein ist. Es ist bei diesem Verfahren ferner notwendig, das Papier zu trocknen (manchmal sogar zweimal) und zu schneiden, bevor die Zählung durchgeführt wird, was nachteilig ist, wenn das Bestimmungsverfahren für eine große Anzahl von Proben mechanisch durchgeführt werden soll. Es ist auch interessant, daß dieses Verfahren in mehr als einem Jahrzehnt nirgends in der Literatur als bedeutend erwähnt ist und daß es nirgends für radioimmunologische Bestimmungen von verhältnismäßig niedermolekularen Haptenen angewandt worden ist.

809831/057«

../5 ORIGINAL INSPECTED

Bei einem anderen bekannten Verfahren wird der Antigen-Antikörper-Komplex .durch Salze, organische Substanzen oder Lösungsmittel unter Bedingungen ausgefällt, bei denen das freie Antigen nicht angegriffen wird. Zu den Salzen, organischen Substanzen und Lösungsmitteln, die angewandt werden können, gehören u.a. Äthanol, Aceton, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Dioxan, Trichloressigsäure, Polyäthylenglykol usw. Die Anwendung von Salzen, Lösungsmitteln oder organischen Substanzen besitzt den Vorteil, daß die Trennung sofort stattfindet und eine zweite Inkubation nicht notwendig ist. Die chemische Ausfällung kann jedoch zu einer Mitausfällung von anderen Proteinen führen, die häufig eine unvollständige Trennung der beiden Fraktionen verursachen.

Ferner ist das Doppelantikörperverfahren bekannt, das verbreitet zur Trennung von gebundenem und freiem Antigen angewandt wird. Bei diesem Verfahren wird ein zweiter Antikörper, der gegen den ersten Antikörper gebildet worden ist, angewandt, um den primären Antigen-Antikörper-Komplex auszufällen. Wenn z.B. der erste AntikÖrper^im Kaninchen gebildet worden ist, kann der zweite Antikörper ein Antiserum gegen Kaninchen-

Y-GLobulin sein, das von Ziegen gebildet worden ist. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß die Anwendung eines zweiten Antikörpers eine v/eitere Inkubation erforderlich macht. *) (Schilddrüse)

Spezielle Bindungsbestimmungen, bei denen ein Doppelantikörperverfahren zur Trennung angewandt wird, sind in den US-PS 839 153 und 3 872 225 beschrieben.

Ferner sind verschiedene F^stphasen-Verfahren zur Trennung von freiem und gebundenem Antigen bekannt. Bei diesen Verfahren werden Antikörper angewandt, die gebunden oder physikalisch adsorbiert sind an eine unlösliche Matrix (Imrauno-

809831/057S ../6

275Ί588

sorbens), wie Bentonit, Cellulose, Bromacetylcellulose, vernetzte Dextrane (Sephadex), Sepharose, Kunststoffperlen (aus nicht vernetztem Polystyrol oder Polypropylen), Enzacryl AA, Nitro- cellulose-Membranen usw. Der gebildete Antikörper-Antigen-Komplex wird von der festen Phase festgehalten und der gebundene Anteil kann von dem freien Anteil durch Filtration abgetrennt werden^^Bei einem weiteren Verfahren werden die freien (nicht gebundenen) Antigene an Adsorbentien gebunden, die durch Zentrifugetion ausgefällt werden können. Pulverisiertes Talkum (Magnesiumnilicat), Kaolin (Aluminiuinsilicat), QUSO (Mikrokörner von Siliciumdioxid), Cellulosepulver usw. sind einige einfache Adsorbentien, die angewandt werden können. Viele Trennungen werden durchgeführt unter Anwendung von adsorbierender Aktivkohle, die mit Dextran überzogen ist. Das Dextran verhält sich eher wie ein Sieb, das es den kleineren Molekülen des freien Antigens erlaubt, hindurchzugehen, die dann an die Aktivkohle gebunden werden, wobei das gebundene Antigen in Lösung bleibt, nachdem die Aktivkohle durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt worden ist.

Es ist ferner bekannt, Ionenaustauscher und andere Harze anzuwenden, urn freie Antigene durch elektrostatische Kräfte zu binden, und dieses Verfahren wurde bisher hauptsächlich angewandt zur Bestimmung kleiner Moleküle, wie Thyroidhormonen (T-3 und T-4). Beispiele für derartige Verfahren sind in den US-PS 3 659 104, 3 710 117 und 3 961 894 angegeben.

Bei einem derartigen Verfahren, wie es zur Trennung des Antigen-Antikörper-Komplexes von freiem Antigen angewandt wird, wird eine Säule, die mit einem Material gefüllt ist, das vorzugsweise entweder das freie Antigen oder den Antigen-Antikörper-Komplex adsorbiert, angewandt. Das inkubierte wäßrige Reaktionsgemisch wird von oben auf eine solche Säule aufgebracht und die Säule dann eluiert. Die Radioaktivität entweder der Säule oder des Eluats wird dann bestimmt und der Gehalt an Antigen in der Ausgangslösung aus dieser Zählung berechnet.

809831/05?* "^/7

In der Praxis hat es sich gezeigt, daß dieses Verfahren etwas mühsam ist und nicht geeignet zur schnellen Durchführung einer großen Zahl von radioimmunologischen Bestimmungen mit Hilfe mechanischer Vorrichtungen. Ein Grund hierfür besteht darin, daß es notwendig ist, die nicht adsorbierte Komponente vollständig aus der Säule auszuwaschen, was Zeit und eine verhältnismäßig große Menge Pufferlösung erfordert.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes spezifisches Bindungsverfahren zu entwickeln, bei dem die Trennung der gebundenen Form der markierten Komponente von der freien Form auf neuartige Weise erreicht wird, die vorteilhafter ist als die bisher bekannten Trennungsverfahren.

Die Erfindung betrifft ein spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in oder der Liganden-Bindungskapazität von einem flüssigen Medium, wobei das flüssige Medium zur Bestimmung des Liganden zusammengebracht wird mit Bestimmungsreagentien, umfassend 1. als markierte Komponente den Liganden oder ein Bindungsanaloges davon mit einer Markierung und 2. ein Bindungsreagens für den Liganden; oder zur Bestimmung der Liganden-Bindungskapazität des flüssigen Mediums, von dem angenommen wird, daß es ein Bin-

Vjvobei

dungsmittel für den Liganden enthält^ das flüssige Medium zusammengebracht wird mit Bestimmungsreagentien, umfassend als markierte Komponente den Liganden oder ein Bindungsanaloges davon mit einer Markierung, wobei ein Reaktionsgemisch entsteht, das gebundene Formen der markierten Komponente, die an das Bindungsreagens gebunden ist, und freie Formen der markierten Komponente, die nicht an das Bindungsmittel gebunden ist , enthält, wobei die gebundene Form von der freien Form getrennt wird und die Markierung in der gebundenen oder freien Form gemessen wird. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Trennung der gebundenen Form von der freien Form durchführt, indem man zumindest einen Teil des Reaktionsgemisches in eine Säule mit einem adsorbierenden Material zieht, das für die gebundene Form oder die freie Form spezifisch ist, wobei die gebundene Form und die freie Form über die Länge der Säule getrennt werden.

809831/0S79

Bei einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die Adsorbenssäule die Form eines Rohrs, das mit einer ausreichenden Menge eines kapillaren Absorbens gefüllt ist, um eine vollständige Aufnahme des gesamten Reaktionsgemisches nach Berührung des einen Endes des Rohrs mit dem Gemisch zu ermöglichen. Vorzugsweise wird die Adsorbenssäule senkrecht gehalten, während der kapillaren Absorption, was zu einer Trennung durch aufsteigende Chromatographie führt. IAn die Trennung der gebundenen von der freien Form über die Säule zu verbessern, kann ein Volumen einer inerten Flüssigkeit, wie eines Puffers nach Absorption des Reaktionsgemisches von der Säule absorbiert werden.

Das Prinzip der Trennung besteht darin, daß das Adsorbens selektiv für die gebundene oder freie Form ist, üblicherweise für die letztere, und damit nicht spezifische Bindungen eingeht, wodurch diese Form im wesentlichen gegen die Bewegung des Reaktionsgemisches durch die Adsorbenssäule immobilisiert wird. Die andere Form wird natürlich durch den Fluß des Reaktionsgemisches vom Anfangsteil der Säule, wo die immobilisierte Form ist, weggetragen, wodurch eine Trennung der gebundenen von der freien Form stattfindet.

Der große Vorteil dieses Trennungsverfahrens besteht darin, daß die erforderliche Trennungsstufe reduziert wird auf die einfache Aufgabe, das Reaktionsgemisch mit dem Säulenadsorbens eine ausreichende Zeit lang zusammenzubringen, um die notwendige Absorption der Flüssigkeit in das Adsorbens zu ermöglichen. Die entstehende Säule, in der die getrennte, gebundene und freie Form enthalten ist, ist geeignet für die anschließenden Messungen, besonders wenn es sich um eine radioaktive Markierung handelt. Ferner sind bei Anwendung des erfindungsgemäßen Säulenchromatographieverfahren die mechanischen Schritte zur Einleitung der Trennung und Entfernung der Trennvorrichtung zur Messung der Lage der einzelnen Komponenten leicht automatisierbar. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß wenn eine gefährliche Markierung, wie eine radioaktive

809831/057*

- sr-

Markierung verwendet wird, die gesamte zu dem Reaktionsgemisch zugesetzte Markierung in einer einzigen leicht wegwerfbaren Vorrichtung, nämlich der Adsorptionssäule, sich ansammelt.

Das erfindungsgemäße Trennverfahren ist allgemein anwendbar auf den Nachweis bzw. die Bestimmung von Liganden durch spezifische Bindungsverfahren, wie die radioimmunologische Bestimmung von Antigenen und Haptenen, einschliei31ich Thyroxin (T-4) und Digoxin, und auf die Bestimmung der Bindungskapazität einer Probe für verschiedene Liganden, wie der Serumbindungskapazität für Trijodthyronin (T-3).

Bei den beiliegenden Figuren ist, _ ,

^{& G} cjbzw. Bohrung

Fig. 1 ein Querschnitt durch die HöhlungTeiner Zählvorrichtung bei Durchführung einer Messung entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform nach der Erfindung; Fig. 2 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen bekannte Mengen Thyroxin mit Hilfe von Säulen, enthaltend vernetzten Polyvinylalkohol;

Fig. 3 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen bekannte Mengen von Digoxin unter Verwendung von Säulen mit vernetztem Polyvinylalkohol;

Fig. 4 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen bekannte Mengen Thyroxin unter Verwendung von Säulen mit vernetztem Dextran;

Fig. 5 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen bekannte Mengen Digoxin unter Verwendung von Säulen mit vernetztem Dextran;

Fig. 6 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen bekannte Mengen Thyroxin unter Verwendung von Säulen, die gefüllt waren mit mit Formaldehyd behandelter Stärke;

../10

809831/057S

- -κί-IS

Fig. 7 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen bekannte Mengen Digoxin unter Verwendung von mit Stärke gefüllten Säulen und

Fig. 8 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen bekannte Mengen Digoxin unter Verwendung von Silicagelsäulen.

Im Rahmen dieser Beschreibung haben die folgenden Ausdrücke die angegebene Bedeutung: "Ligand" ist die Substanz oder Gruppe von Substanzen, deren Vorhandensein oder Menge in einem flüssigen Medium bestimmt werden soll; "bindendes Mittel für den Liganden" ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß anderer Substanzen besitzt, und "Bindungsanaloges des Liganden" ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die sich in Bezug auf die Bindungsaffinität zu dem bindenden Mittel für den Liganden im wesentlichen wie der Ligand selbst verhält.

Die Trennung der gebundenen von der freien Form der markierten Komponente bei spezifischen Bindungsbestimmungen durch selektive Adsorption ist bekannt. Bei den bekannten Verfahren wird die Wechselwirkung zwischen dem Reaktionsgemisch und dem Adsorbens entweder durch Zugabe des Adsorbens in Form eines Pulvers,von Perlen oder Streifen zu dem Reaktionsgemisch und anschließende physikalische Entfernung des Adsorbens, z.B. durch Zentrifugieren, Filtrieren oder fintfernen des Streifens, oder durch Perkulieren des Reaktionsgemisches oder Durchleiten von oben nach unten unter dem Einfluß der Schwerkraft durch ein Bett des Adsorbens durchgeführt, wobei der Auslauf nur die gebundene oder freie Form der markierten Komponente enthält.

Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt ein besseres Trennverfahren unter Anwendung eines selektiven Adsorbens,

wobei das Reaktionsgemisch z.B. durch Kapillarwirkung, was bevorzugt ist, oder durch Einwirken einer äußeren Kraft, wie eines Vakuums, in eine Säule aus dem Adsorbens gezogen wird. Während es unter gewissen Umständen notwendig oder günstig sein kann, nur einen Teil des Reaktionsgemisches in die Adsorbenssäule zu ziehen, werden üblicherweise das Volumen des Reaktionsgemisches und die Kapazität der Säule so gewählt, daß das gesamte Reaktinnsgemisch in die Adsorbenssäule gezogen wird. Die selektive Adsorption der gebundenen oder freien Form findet unmittelbar nach Berührung zwischen dem Reaktionsgemisch und dem Adsorbens im Anfangsteil der Adsorbenssäule statt. Die nicht adsorbierte Form bewegt sich jedoch entlang der Säule mit dem fortschreitenden Lösungsmittel in dem Reaktionsgemisch. iJach Beendigung des Fortschreitens des Reaktionsgemisches in der Säule ist nahezu die gesainte, selektiv adsorbierte Form am Anfang der Säule immobilisiert, während die andere Form sich gegen das Ende der Säule hin findet.

üiine Verbesserung der Trennung zwischen der gebundenen und freien Form kann erreicht werden, wenn, man nach Aufnahme des Reaktionsgemisches den Anfangsteil der Säule einem Volumen einer Flüssigkeit aussetzt, die gegenüber der selektiven Adsorption der einen Art am Anfangsteil der Säule inert ist, aber die als weiteres Lösungsmittel wirkt und die andere Form in der Adsorbenssäule weiter trägt. Im üblichen Falle ist diese Flüssigkeit Wasser oder eine wäßrige Pufferlösung.

Da zahlreiche Adsorbentien, die für die gebundene oder freie Form selektiv sind, in der Literatur angegeben sind, soll hier keine erschöpfende Aufzählung angegeben werden. Die Adsorbenssäule ist vorzugsweise so ausgebildet, daß das Reaktionsgemisch durch Kapillarwirkung eingezogen werden kann. Das kann erreicht werden, indem man ein Adsorbens anwendet, das selbst kapillarabsorbierend ist, oder durch Vermischen des Adsorbens mit einem kapillarabsorbierenden Material oder

809831/0571 "^/12

beides. Besonders geeignete Adsorbentien sind z.B. vernetzter Polyvinylalkohol, vernetzte Dextrane, Stärke und Silicagel. Diese Adsorbentien sind angemessen hydrophil und gegenüber wäßrigen Reaktionsgemischen inert und können so gewählt werden, daß sie vorzugsweise die freien Formen, wie sie bei üblicherweise durchgeführten Bindungsbestinunungen auftreten, adsorbieren.

Die Adsorbenssäule liegt vorzugsweise in Form eines Bettes des Adsorbens in einem Rohr vor, das an einem Ende durch Rückhaltvorrichtungen festgehalten wird. Ein Beispiel für eine brauchbare Läule ist ein Plastikrohr (aus Polypropylen oder Polystyrol), das mit teilchenförmigen! Adsorbens gefüllt ist, das zwischen porösen Scheiben aus Kunststoff, Glaswolle oder Papier festgehalten wird.

In der Regel ist das für die Bestimmung angewandte Volumen des Reaktionsgemisches gering und beträgt z.B. 0,5 bis 1 ml, Die Adsorbenssäule sollte so dimensioniert sein, daß die nicht adsorbierte Komponente von der bevorzugt adsorbierten Komponente, die im Anfangsteil der Säule verbleibt, ausreichend weit entfernt ist, sodaß eine getrennte Ilessung der Markierung möglich ist. wenn z.B. das Adsorbensmaterial in einem Rohr enthalten ist, kann der innere Durchmesser des Rohrs 0,1 bis 1,0 cm betragen und liegt vorzugsweise bei ungefähr 0,5 cm. Das Aufnahmeende eines solchen Rohrs ist vorzugsweise verengt, sodaß ein Stopfen aus porösem Material, z.B. aus Glaswolle, festgehalten werden kann, der zur Rückhaltung des Adsorbens dient, während er für das wäßrige Reaktionsgemisch durchlässig ist. Eine praktische Länge für ein solches Rohr beträgt 5 bis 10 cm.

Im Prinzip kann irgendeine bekannte Markierung, wie oben angegeben, angewandt werden. Es ist jedoch besonders vorteilhaft, eine Markierung anzuwenden, die in der Adsorbenssäule gemessen werden kann, ohne Entfernung des Adsorbens.

../13

Für ein solches System wird das Adsorbens in einer Vorrichtung festgehalten, die für die Markierungseigenschaft durchlässig ist. Die Anwendung von radioaktiven Markierungen, besonders Gammastrahlen des Isotopen, paßt gut in dieses ochema. In der Literatur sind zahlreiche Verfahren an^ege-

125 151 ben, bei denen radioaktive Markierungen, wie ^J, ^J J,

Co usw. für Bindungsbe Stimmungen angewandt v/erden. Die

vorliegende Erfindung betrifft ein Trennverfahren, das gut geeignet ist für radiologische Bestimmungen, da die Säule selbst für die Messung angewandt v/erden kann und nach Beendigung des Versuchs weggeworfen werden kann und die gesamte für die Bestimmung angewandte Radioaktivität enthält.

Die selektive Messung der Radioaktivität im Eingangsbereich der Säule ist eine einfache Verfahrensstufe aufgrund der physikalischen Trennung der Komponenten in der Säule und der geringen Strahlungsintensitäten der vorzugsweise an-

125 gewandten radioaktiven Markierungen (am häufigsten J mit Intensitäten von nicht mehr als 200 kcprn). In der Regel umfaßt eine Zählvorrichtung zur Messung der Radioaktivität eine sogenannte Bohrung (well), d.h. eine Vertiefung oder Hülse zur Aufnahme einer zu messenden Probe. Außerhalb der Seitenwand dieser Bohrung befindet sich mindestens ein Detektor. Wenn der Abstand zwischen der nicht adsorbierten Komponente und der adsorbierten Komponente größer ist als die Tiefe der Bohrung, kann die selektive Messung automatisch durchgeführt werden durch Einführen der Säule in die Bohrung mit dem Eintrittsbereich nach innen. Wenn das nicht der Fall ist und die Tiefe der Bohrung größer ist als der Abstand zwischen den beiden Komponenten, ist es möglich, den Teil der Säule, der die nicht adsorbierte Komponente enthält, mit einem für die radioaktive Strahlung undurchlässigen Absorptionsmaterial, z.B. Blei, abzuschirmen, sodaß der Detektor nur auf die Radioaktivität in dem Eintrittsbereich der Säule anspricht. Eine solche Abschirmung besitzt eine Form und Größe, die in Übereinstimmung steht mit der speziellen Geometrie der Zählvorrichtung und der Probe. Die Abschirmung kann die Form

809831/0571 _#./_i4

einer Platte oder vorzugsweise eines zylindrischen Rohrs mit einem inneren Durchmesser besitzen, der nur etwas größer ist als der (äußere Durchmesser) der Säule.

Wie in Fig. 1 angegeben, ist die Bohrung 1 der Zählvorrichtung teilweise durch ein iletallrohr 2, z.B. aus Blei, abgeschirmt, das abnehmbar angeordnet ist. Die Abschirmung 2 ist in Fig. 1 schematisch dicht neben tier Wand der Bohrung 1 dargestellt, aber, wie oben gesagt, sollte die Abschirmung vorzugsweise dicht um das die Probe enthaltende Testrohr 4 angeordnet sein. Gegenüber dem nicht abgeschirmten Teil der Bohrung 1 befindet sich der Detektor 3. In die Bohrung ist das Testrohr 4 eingeführt, in dem die Inkubation ursprünglich durchgeführt wurde,und aus dem das Reaktionsgemisch in das Rohr 5 gezogen .wurde, das mit dem selektiven Absorbens 6 gefüllt ist. Das Absorbens 6 wird durch zwei Stopfen 7 und 8, z.B. aus Glaswolle, festgehalten. Als Folge der Aufnahme des Reaktioiisgemiscb.es durch das Absorbens 6 in dem Rohr 5 ist die Flüssigkeit bis zu der Grenze 9 gestiegen, und auf diese Weise wurde die nicht adsorbierte Komponente in den Bereich der Bohrung 1 transportiert, der durch die Abschirmung 2 abgeschirmt ist, während die adsorbierte Komponente in dem unteren Eintrittsbereich des Rohrs 5 in dem nicht abgeschirmten Bereich der Bohrung enthalten ist. Auf diese Weise wird nur die Radioaktivität des Mntrittsbereichs selektiv gemessen. Wenn die gesamte Radioaktivität des Materials in dem Rohr 5 gemessen werden soll, wird die Abschirmung 2 entfernt.

j£s sind auch Radioaktivi tätszähl vorrichtungen bekannt, bei denen ein Detektor sich unterhalb des Bodens der Bohrung befindet zusätzlich zu dem seitlichen Detektor. Wenn eine solche Zählvorrichtung für das erfindungsgemäße Verfahren angewandt wird, muß darauf geachtet werden, daß der Detektor, der sich unterhalb des Bodens der Bohrung befindet, abgeschirmt wird, um zu vermeiden, daß er Strahlung von der darüberliegenden nicht adsorbierten Komponente, die in der

8098-3.1/JD S ?r

air

Adsorptionssäule nach oben gewandert ist,- zählt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann angewandt werden auf den Nachweis bzw. die Bestimmung irgendeines Liganden, für den es einen spezifischen Bindungspartner gibt. Der Ligand ist üblicherweise ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glykoprotein, Steroid oder anderes organisches Molekül, für das ein spezifischer Bindungspartner in biologischen Systemen existiert oder synthetisiert werden kann. Der Ligand wird praktisch üblicherweise gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antigenen und deren Antikörpern, Haptenen und deren Antikörpern, Hormonen, Vitaminen, lietaboliten und pharmakologischen Mitteln und deren Rezeptoren und Bindungssubstanzen. Spezifische Beispiele für Liganden, die erfindungsgemäß nachgewiesen werden können, sind Hormone, wie Insulin, Choriongonadotropin, Thyroxin, Trijodthyronin und Östriol, Antigene und Haptene, wie Ferritin, Bradykin, Prostaglandine, und tumorspezifische Antigene, Vitamine, wie Biotin, Vitamin B-to» folsäure, Vitamin Ii und Ascorbinsäure; Hetaboliten, wie 3',5'-Adenosin-monophosphat und 3¹,5'-Guanosin-monophosphat; pharmakologische Mittel, wie Dilantin, Digoxin, Morphin, Digitoxin und Barbiturate;Antikörper, wie mikrosomen Antikörper und Antikörper zu Hepatitis und Allergenen;und spezifisch bindende Rezeptoren, wie Thyroxin-bindendes Globulin, Avidin, Intrinsikfaktor und Transkobalamin.

Bei einer bevorzugten Arbeitsweise wird der Nachweis bzw. die Bestimmung des Liganden in dem flüssigen Medium üblicherweise wäßrigen Medium durchgeführt durch ein verbessertes radioimmunologisches Bestimmungsverfahren der Art, bei der das wäßrige Medium mit einer radioaktiv markierten Form des Liganden oder eines Bindungsanalogen davon und einem Antikörper zu dem Liganden vermischt wird und das entstehende Reaktionsgemisch inkubiert wird, wobei eine gebundene Form des radioaktiv markierten Liganden oder Analogen gebildet wird, die an den Antikörper gebunden ist, und eine freie Form des

809831/057§

../16

radioaktiv markierten Liganden oder Analogen, die nicht an den Antikörper gebunden ist, wobei die gebundene Form und die freie Form getrennt werden und die Radioaktivität der abgetrennten gebundenen oder freien Form gemessen wird. Die erfindungsgernäße Verbesserung besteht darin, daß man die Trennung der gebundenen Form von der freien Form durchführt, indem man das Ueaktionsgeinisch mit einer Säule eines kapillarabsorbierenden Adsorptionsmaterial zusammenbringt, das für die gebundene Form oder die freie Form spezifisch ist und das das gesamte Reaktionsgemisch durch Kapillarwirkung einsaugen kann, wodurch die gebundene Form und die freie Form entlang der Säule getrennt werden.

Aus der Gesamtradioaktivität (Gesamtzählung) und der Radioaktivität des Eintrittsbereichs der Säule (Teilzählung), wie sie nach der Trennung der Komponenten gemessen wird, wird die prozentuale Rückhaltung (Retention) nach der folgenden Formel berechnet:

prozentuale Rückhaltung = Teilzählung _im

Gesamtzählung ^υ

Zur Bestimmung der unbekannten Menge des Liganden ist es zunächst nötig, eine Reihe von Bestimmungen mit unterschiedlichen bekannten Mengen an Liganden durchzuführen und dadurch eine Kurve zu bilden, bei der die prozentuale Standardrückhaltung gegen die Konzentration aufgetragen ist. Diese Kurve wird dann angewandt zur Bestimmung einer unbekannten Konzentration aus der prozentualen Rückhaltung, die aus den Radioaktivitätszählungen berechnet worden ist.

Im.Prinzip wird die Gesamtradioaktiv!tat bestimmt durch die Menge des radioaktiv markierten Liganden oder Analogen, die angewandt wird zur Herstellung des Reaktionsgemisches. Um jedoch Ungenauigkeiten zu vermeiden, die durch ein ungenaues Aufbringen bzw. Zugeben der markierten Komponente auftreten können, kann es günstiger sein, die Gesamtradioaktivität experimentell zu bestimmen. Das kann erfolgen entweder

809831/057S ../17

-Vf-

vor oder nach der selektiven Bestimmung der Radioaktivität des Eintrittsbereichs der Adsorbenssäule. Die Gesamtradioaktivität kann bestimmt werden nach Inkubation und vor der Einführung der Adsorbenssäule in das Reaktionsgemisch. Wahlweise ist es, wenn die selektive Zählung des Eintrittsbereichs durch teilweise Abschirmung der Bohrung der Zählvorrichtung durchgeführt werden soll, erfindungsgemäß auch möglich, die Gesaintradioaktivität nach der Trennung der Komponenten zu messen. Hierzu wird nachdem die Zählung des Eintrittsbereichs der Säule abgeschlossen ist, die Abschirmung aus der Bohrung entfernt, wodurch der gesamte Körper der Zählvorrichtung ausgesetzt wird, die dann auf die Gesamtradioaktivität anspricht.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch geeignet zur Bestimmung der Liganden-Bindungskapazität in einem flüssigen Medium. Bei einer solchen Bestimmung wird von dem flüssigen Medium angenommen, daß es ein Bindungsmittel für den Liganden enthält. Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Verfahren modifiziert werden zur Durchführung des sogenannten "T-3-Aufnähmetests". Bei diesem Test wird das Thyroidhormon im Serum indirekt bestimmt durch Bestimmung der verfügbaren Bindungsstellen von Thyroid-bindendem Globulin (TBG), das in dem Serum vorhanden ist. Bei diesem Versuch wird angenommen, daß die Menge an TBG in normalen Sera verhältnismäßig konstant ist und daß es den größten Teil des verfügbaren Thyroidhormons bindet. Wenn markiertes T-3 (Trijodthyronin) zu einer Serumprobe zugesetzt wird, wird es von dem TBG gebunden im Verhältnis zu den restlichen verfügbaren Bindungsstellen. Wenn eine große Menge an markiertem T-3 vor dem beruin gebunden wird, zeigt das eine große Zahl verfügbarer BindungssteHen und damit einen geringen Gehalt an Thyroidhormon an und umgekehrt. Die Messung des ungebundenen markierten T-3 kann damit in Zusammenhang gebracht werden mit der Schilddrüsenfunktion. Bei der klinischen Anwendung des T-3 Aufnahmetests reicht es in vielen Fällen, das Verhältnis der T-3 Aufnahme im Vergleich mit einem normalen Standardserum zu bestimmen. Dieses Verhältnis kann erhalten werden durch Teilung der Teilzählung

80983 1 /057§ --/18

- VS -

(wie oben definiert), die von der unbekannten Probe erhalten worden ist, durch die Teilzählung einer Standardserumprobe, die einem parallelen identischen Bestimmungsverfahren unterworfen worden ist.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bestimmung der Bindungsfähigkeit eines flüssigen üblicherweise wäßrigen Mediums für einen Liganden durchgeführt durch ein verbessertes radioimmunologisches Verfahren der Art, bei der das wäßrige Medium mit einer radioaktiv markierten Form des Liganden oder eines Bindungsanalogen davon zusammengebracht und das entstehende Gemisch inkubiert wird unter Bildung einer gebundenen Form des radioaktiv markierten Ligandenoder Analogen, das\an'ein Bindungsmittel des wäßrigen Mediums gebunden ist, und eine* freien Form des radioaktiv markierten Liganden oder Analogen, daürnicht an das Bindungsmittel gebunden ist, wobei die gebundene Form und die freie Form getrennt werden und die Radioaktivität der getrennten gebundenen oder freien Form gemessen wird. Die erfindungsgemäße Vebeesserung besteht darin, daß man die Trennung der gebundenen Form von der freien Form durchführt, indem man das Reaktionsgemisch mit einer Säule mit einem kapillarabsorbierenden Adsorbens zusammenbringt, das für die gebundene Form oder die freie Form spezifisch ist und das imstande ist, das gesamte Reaktionsgemisch durch Kapillarwirkung einzusaugen, wodurch die gebundene Form und die freie Form entlang der Säule getrennt werden.

Die Erfindung betrifft auch eine Analyseneinheit (testkit) zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. üine Analyseneinheit zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium umfaßt 1. den Liganden oder ein Bindungsanaloges davon, der bzw. das mit einer Markierung, wie einem radioaktiven Atom, versehen ist, 2. ein Bindungsmittel für den Liganden, wie einen Antikörper, und 3· eine Säule aus einem Adsorbens, das für den Liganden oder den Bindungskomplex des Liganden mit dem Bindemittel spezifisch ist. Die Erfindung umfaßt ferner eine Analyseneinheit zur Bestimmung der Liganden-Bindungskapazität eines flüssigen Mediums, enthaltend

809831/0571

1. den Liganden oder ein Bindung.sanaloges davon, der (das) mit einer Markierung, wie einem radioaktiven Atom versehen ist, und 2. eine Säule von einem Adsorbens, wie oben näher erläutert. Die Analyseneinheit kann zusätzlich eine wäßrige Pufferlösung und Ligandeiistandards enthalten.

Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert:

Herstellung von vernetztem Polyvinylalkohol

5 ml konz. Salzsäure wurden unter Rühren zu einer Lösung von 10 g in kaltem Wasser löslichem kristallinen Polyvinylalkohol (PVA) Typ II (Katalog Nr. P 8136 der Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) in 600 ml Wasser gegeben. Die entstehende viskose Lösung wurde mit einem Rührer mit hoher Kraft gerührt und auf 65⁰C erwärmt. Dann wurden 10 ml einer 25-%igen wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd zugegeben und das Heaktionsgemisch 20 Minuten bei 65°C gerührt. Der entstehende unlösliche vernetzte PVA wurde abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen, bis die Waschflüssigkeit neutral war. Der nasse Filterkuchen wurde mit Äthanol oder Aceton gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Ausbeute an körnigem weißen Polymer betrug 11,0 g. Beim Erhitzen auf 260⁰C wurde kein Schmelzen, Erweichen oder Zersetzung beobachtet. Das Produkt erwies sich als in Wasser und organischen Lösungsmitteln, einschließlich unter Rückfluß siedendem Dimethylformamid (DMF)₁ unlöslich.

Herstellung der Adsorbenssäulen

Es wurden Kunststoffrohre mit einer Länge von ungefähr 8 cm und einem inneren Durchmesser von ungefähr 0,5 cm angewandt. Eine poröse Scheibe wurde auf den Boden jedes Rohres gepreßt, sodaß sie mit dem Boden bündig abschloß, aber nicht

809831/0571 .

- SW-

herausfiel. Die Säule wurde dann gleichmäßig mit ungefähr 0,1 g trockenem Adsorbens (wie vernetztem Polyvinylalkohol, wie oben hergestellt) bis auf eine Höhe von ungefähr 6 cm gefüllt und eine zweite poröse Scheibe koaxial in dichtem Kontakt mit dem oberen Ende des Adsorbensbettes gepreßt.

Beispiel 1 Radioimmunologische Bestimmung von Thyroxin

(T-4)

Um eine radioimmunologische Bestimmung von T-4 durchzuführen, wurden die folgenden Reagentien alle gelöst in Tris-maleat-Puffer, pH 7,4, (hergestellt durch Lösen von 2,85 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 1,2 g Maleinsäure und 0,43 g Äthylendiamin-tetraessigsäure in 290 ml destilliertem V/asser) nacheinander in Reagensgläser gegeben:

1. 200 /ul ¹²⁵J-T-4 (ungefähr 100 kcpm)

2. 200 /Ul T-4 Standard (1:4 verdünnt im Konzentrationsbereich von 4-60 yug/l) oder eine 1:4 verdünnte klinische Serumprobe

3. 50 /Ul ANS-Lösung (8-Anilin-i-naphthalensulfonsäureammoniuinsalz, 4 g/l

4. 200 /Ul Anti-T-4-Antikörper (gelöst in 5 ml Puffer).

Die Reagensgläser wurden nach der dritten und vierte Stufe leicht geschüttelt, um ein gründliches Vermischen der Reagentien sicherzustellen. Dann wurde nach 20 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur eine Adsorbenssäule mit vernetztem PVA als Adsorbens, die wie oben hergestellt worden war, senkrecht in das Reagensglas gestellt, und das Reaktionsgemisch konnte in dem trockenen vernetzten Polyvinylalkohol aufsteigen. Wenn das gesamte Reaktionsgemisch adsorbiert war, wurde die Gesamtradioaktivität (Gesamtzählung) bestimmt. Zu diesem Zweck wurde die Adsorbenssäule in die Bohrung eines Gammazählers eingeführt, ohne Verwendung eines Metallschilds. Die Radioaktivität des Eintrittsteils der Säule (enthaltend freies -T-4) wurde dann bestimmt (Teilzählung) unter Verwendung

809831/0571 "^/2Λ

- 24 -

des Metallschilds, um zu verhindern, dai3 die Radioaktivität aus dem Restteil der Säule mitgezählt wird. Die prozentuale Rückhaltung Jeder Säule wurde berechnet nach der Gleichung

prozentuale Rückhaltung = Teilzählung _inn

Gesamtzählung ^{x IUU}

.Wine Standardkurve wurde erhalten durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen die entsprechenden Konzentrationen von Thyroxinstandard (Fig. 2).

Unbekannte Mengen an T-4, z.B. in Serum, können auf die oben angegebene Weise mit Hilfe der Standardkurve der Fig. 2bestimmt werden. Unter Anwendung dieser Standardkurve wurden zwei Vergleichsseren, die bezeichnet werden als Led-I und Led-II (Lederle Diagnostics, American Cyanamid Company, Pearl River, W.Y., USA) jeweils im Duplikat untersucht.

Han erhielt die folgenden Ergebnisse:

7,0 und 7,9 /Ug/100 ml (erwarteter Wert = ¹ 8-11 ,ug/100)

Led-I
Led-II

16,5 und 17,6 ,ug/100 ml (erwarteter Wert =

' 16,9-25,5 yUg/100 ml).

Beispiel 2 Radioimmunologische Bestimmung von Digoxin

Säulen mit vernetztem Polyvinylalkohol als Adsorbens wurden,wie oben beschrieben, hergestellt. Der bei diesem Versuch angewandte Puffer war ein Phosphatpuffer, pH 7,^, (6,25 g/l Natriuinbiphosphat, pH eingestellt mit i\iatriumhydroxidlösung).

Um die radioimmunologische Bestimmung von Digoxin durchzuführen, wurden die folgenden Keagentien stufenweise in Reagensgläser gegeben:

../22

809831/0579

1. 200 ^uI ¹²⁵J-Digoxin (27 kcpm)

2. 150 /Ul Standarddigoxin. Die Standards wurden hergestellt durch Verdünnen von 1 ml Vorratslösung mit einer Konzentration von 0,5, 2,0 und 5,0 /Ul/inl mit 1 ml normalem Serum und 1 ml Puffer. Die Standards wurden so 1:3 verdünnt.

3. 150 yul Antidigoxin-Kaninchenantiserum in Phosphatpuffer, enthaltend 0,2 % Rinderserumalbumin

Das Reaktionsgemisch wurde 40 Minuten im Reagensglas bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde eine Adsorbenssäule, wie in Beispiel 1 senkrecht in das Reagensglas gestellt,und das Reaktionsgemisch konnte in den trockenen vernetzten Polyvinylalkohol aufsteigen. Wenn das gesaute Reaktionsgemisch adsorbiert war, wurde die Gesamt- und Teilradioaktivität gezählt und die prozentuale Rückhaltung, wie in Beispiel 1 berechnet und eine Standardkurve auf ähnliche Weise gebildet (Fig. 3).

Unbekannte Mengen an Digoxin, z.B. in Serum, können auf die oben angegebene V/eise mit Hilfe der Standardkurve der Fig. 3 bestimmt werden.

Unter Anwendung dieser Standardkurve wurden zwei Vergleichssera (Led-I und Led-II) jeweils im Duplikat untersucht. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Led-I 1,0 ng/ml (erwarteter Wert: 0,8-1,2 ng/ml) Led-II 3,8 ng/ml (erwarteter tfert: 2,5-4,0 ng/ml).

Beispiel 3 Radioimmunologische Bestimmung der

Trijodthyronin-(T-3)-Aufnähme

Säulen mit vernetztem Polyvinylalkohol als Adsorbens wurden, wie oben beschrieben, hergestellt. Der bei diesem Ver-

../23 809831/057f

- 23 -

such angewandte Puffer wurde hergestellt durch Lösen von 14,4 g Citronensäure und 43,75 g Natriumbiphosphat (NaHpPO, .8H₂O) und 2,7 ml 37-%igem Formaldehyd in 1 1 Wasser.

Der Test wurde durchgeführt durch Zugabe der folgenden Reagentien in ein Reagensglas:

1PS

1. 200 /Ul "^J-T-3 (in Citronensäurepuffer, 120 kcpm)

2. 20 /Ul Serum (Standard oder klinische Probe)

Das heagensglas wurde leicht geschüttelt, um ein gründliches Vermischen des Inhalts sicherzustellen. Eine Adsorbenssäule wurde dann, wie in Beispiel 1, senkrecht in das Reagensglas gestellt, und das Reaktionsgemisch konnte in dem vernetzten Polyvinylalkohol aufsteigen. Unmittelbar nachdem das ganze Reaktionsgemisch absorbiert war, wurden 200 ,ul Puffer in das Reagensglas gegeben und konnten ebenfalls in die Säule aufsteigen.

Eine Teilzahlung der Radioaktivität an der Eintrittsstelle der Säule wurde mit dem Hetallschild durchgeführt.

Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Zählungen der Säule mit der klinischen Probe _ Zählungen der Säule mit dem Standardserum ~

χ = 1 normal, χ <1 niedrig, x> 1 hoch.

Die Ergebnisse für geringe, normale und hohe Seragehalte in Werten für die bekannte T-3-Aufnähme waren: 0,6, 0,9 bzw. 1,5.

Beispiel 4 Radioimmunologische Bestimmung von Thyroxin

(T-4)

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt mit dem einzigen Unterschied, daß anstelle von Säulen mit vernetzten! PVA

../24 809831/057S

Säulen der gleichen Art angewandt wurden, die mit Sephadex G-10 (vernetztem Dextran (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden)) gefüllt waren.

Die prozentuale Rückhaltunf; wurde wie in Beispiel 1. berechnet,und die erhaltenen Werte wurden gegen die entsprechenden Konzentrationen der T-4 Standards aufgetragen. Man erhielt die in Fig. 4 angegebene Kurve.

Unbekannte Mengen an T-4, z.B. in Serum, wurden auf die oben angegebene Weise mit Hilfe der Standarclkurve bestimmt.

Beispiel 5 Radioimmunologische Bestimmung von Digoxin

Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, wobei anstelle von Säulen mit vernetztem PVA Säulen mit Dextran, wie in Beispiel 4, angewandt wurden.

Die Gesamtzählungen und Teilzählungen der Radioaktivität wurden bestimmt und die prozentuale Rückhaltung, wie in Beispiel 1 beschrieben, berechnet. Mit Hilfe der erhaltenen Standardkurve, die in Fig. 5 angegeben ist, wurden unbekannte Mengen Digoxin, z.B. in Serum, auf die oben angegebene Weise bestimmt.

Beispiel 6 Radioimmunologische Bestimmung von Thyroxin

(T-4)

A. Herstellung von mit Formaldehyd behandelter Stärke

Zu. einer Suspension von 100 g Stärke (Starch Soluble Analar brand, The British Drug House, Poole, England) in 200 ml Wasser wurden 45 ml einer 40-#igen wäßrigen Formaldehydlösung gegeben und anschließend 10 ml konz. Salzsäure. Das Gemisch wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Das feste Produkt wurde wiederholt mit Wasser gewaschen bis zur Heutralität und dann mit Aceton und getrocknet.

../25 809831/057«

2757588

B. Herstellung der Adsorbenssäulen

Die Säulen wurden, wie oben angegeben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß sie mit mit Formaldehyd behandelter Stärke, die entsprechend A hergestellt worden war, gefüllt wurden.

C. Radioimmunologische Bestimmung voxi T-4

Die folgenden Reagentien wurden jeweils in Trismaleat-Puffer gelöst und stufenweise in Reagensgläser gegeben:

1. 100 /Ul ¹²⁵j-T-4 (ungefähr 90 kcpm)

2. 100 /Ul T-4 Standard (verdünnt 1:4 im Konzentrationsbereich von 4-60 /Ug/1) oder eine 1:4 verdünnte klinische Serumprobe

3. 50 /Ul AUS-Lösung (8-Anilin-i-naphthalin-sulfonsäureammoniumsalz, 4 g/l)

4. 100 /Ul Anti-T-4-Antikörper (gelöst in 3 ml Puffer)

JiJs wurde genau das Verfahren des Beispiels 1 wiederholt und durch Auftragen der berechneten prozentualen Rückhaltung die in Fig. 6 angegebene Standardkurve erhalten.

Beispiel 7 Radioimmunologische Bestimmung von Digoxin

J^s wurde entsprechend Beispiel 2 gearbeitet, wobei anstelle der mit vernetztem PVA gefüllten Säulen, Säulen verwendet wurden, die mit Stärke (ungefähr 0,5 g)(Starch Soluble Analar brand, The British Drug House, Poole, England) gefüllt waren.

Die folgenden Volumina νοα iieagentien wurden angewandt:

1. 150 /Ul ¹²⁵J-Digoxin (27 kcpm)

2. 50 /Ul Standarddigoxin oder Serumprobe

3. 100 /Ul Antidigoxin-Kaninchenantiserum

../26 809831/057S

ilan erhielt die in Fig. 7 angegebene btandardkurve.

Mit Hilfe der Standardkurve wurden zwei klinische Vergleichsseren untersucht (Dreifachbestimmung) und die Ergebnisse mit den DigoxinbeStimmungen nach Standardverfahren verglichen. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Serumprobe Nr. 1: 1,2 ng/ml (erwarteter Wert 1,0-1,5 ng/ml) Serumprobe Nr. 2: 3,7 ng/ml (erwarteter Wert 2,0-5,0 ng/ml)

Beispiel 8 Radioimmunologische Bestimmung von Üigoxin

Es wurde ähnlich wie in Beispiel 2 gearbeitet, wobei anstelle von Säulen mit vernetztem PVA Säulen verwendet wurden, die mit Silicagel gefüllt waren (Korngröße 0,037-0,074 mm, Kieselgel 60, Katalog Nr. 9385, #. Merck, Darmstadt).

Die folgenden Volumina von Reagentien wurden verwendetϊ

1. 200 /Ul ¹²⁵J-Digoxin

2. 150 /Ul Standarddigoxin oder Serumprobe

3. 150 /Ul Antidigoxin-Kaninchenserum

Das Reaktionsgemisch wurde 50 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend eine Adsorbenssäule

in das Reagensglas gegeben, und das Reaktionsgemisch konnte in dem trockenen Silicagel aufsteigen.Wemdas gesamte Reaktionsgemisch adsorbiert war, wurde ein weiteres Volumen von 400 /Ul Phosphatpufferlösung in das Reagensglas gegeben, das ebenfalls in der Silicagelsäule aufsteigen konnte. Die Gesamt- und Teilzahlung der Radioaktivität wurde gemessen und die Rückhaltwerte, wie in Beispiel 1, berechnet. Die Standardkurve ist in Fig. 8 angegeben.

Mit Hilfe der Standardkurve wurden 20 Versuche an einem (pooled) klinischen Serum durchgeführt. Wan erhielt folgende Ergebnisse:

../27 8098 31/057t

-VT-

Konzentration an Digoxin 2751588

gefunden: 2,9 ng//Ul

nach anderen Verfahren bestimmt*: 2,5-3,0 ng/yul

Variationskoeffizient = 12 %

* (Digoxin Test Kit, Katalog IJr. 070-06, Schwarz-Mann, Orangeburg, New York, USA)

Beispiel 9 Radioimmunologische Bestimmung der Trijod-

thyronin-(T-3)-Aufnähme

Pasteurpipetten aus Glas wurden so abgeschnitten, daß sie eine Säule mit einer Länge von ungefähr 7 cm und einem inneren Durcliinesser von ungefähr 6 ram mit einer Verengung am unteren Teil bildeten, Ein kleiner Pfropfen Glaswolle wurde auf den Boden der Säule geschoben und die Säule mit feinem Silicagel (0,037-0,074 mm Kieselgel, Katalog Nr. 9385, E. Merck, Darmstadt) gefüllt. Ein zweiter Pfropfen aus Glaswolle wurde in die Säule geschoben, um den Inhalt festzuhalten.

Das Verfahren, die Reagentien und Volumina waren die gleichen wie in Beispiel 3, mit der Ausnahme, daß, nachdem das Reaktionsgemisch adsorbiert war, 500 /ul destilliertes Wasser (anstelle der 200 /Ul Puffer in Beispiel 3) in das Reagensglas gegeben wurden und in der Säule aufsteigen konnten.

Die Teilzählung der Radioaktivität wurde durchgeführt und die T-3-Aufnähme (x) wie in Beispiel 3 berechnet. Für Sera mit geringem, normalem und hohem Gehalt erhielt man in Werten für die bekannte T-3-Aufnähme die folgenden Ergebnisse:

Serum: Standard nieder normal hoch

Zählungen 26,9 19,3 27,3 45,9

T-3 berechnetes Aufnahmeverhältnis 0,72 1,02 1,71

T-3 nach bekanntem Ver- 0,70 1,02 1,37

fahren bestimmtes Aufnahmeverhältnis ^x

(*Trilute brand T-3 Uptake Test Kit, Ames Company Division of Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA)

₆₂₃₁ 809831/0571

33 L e e r s e i t e

Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Bestimmung eines Liganden. oder der Liganden-Bindungskapazität in einem flüssigen Medium durch spezifische Bindung, wobei zur Bestimmung des Liganden das flüssige Medium zusammengebracht wird mit Bestimmungsreagentien, enthaltend 1. als markierte Komponente den Liganden oder ein Bindungsanaloges dazu, der bzw. das mit einer Markierung versehen ist, und 2. ein Bindungsreagens für den Liganden «oder zur Bestimmung der Liganden-Bindungskapazität des flüssigen Mediums, von dem angenommen wird, daß es ein Bindungsmittel für den Liganden enthält, das flüssige Medium zusammengebracht wird mit Bestimmungsreagentien, enthaltend als markierte Komponente den Liganden oder ein Bindungsanaloges davon, der bzw. das eine Markierung enthält, unter Bildung eines Reaktionsgemisches, in dem eine gebundene Form der markierten Komponente, die an das Bindungsreagens gebunden ist, und eine freie Form der markierten Komponente, die nicht an das Bindungsmittel gebunden ist, entsteht wobei die gebundene und die freie Form getrennt und die Markierung in einer der getrennten Formen gemessen wird, dadurch gekennzeichnet , daß man die Trennung der gebundenen Form von der freien Form durchführt, indem man mindestens einen Teil des Reaktionsgemisches in eine Säule aus einem Adsorbensmaterial zieht, das für die gebundene Form oder die freie Form spezifisch ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man, nachdem das gesamte Reaktionsgemisch oder ein Teil davon in die Adsorbenssäule gezogen ist, das gleiche Ende der Säule, das mit dem Reaktionsgemisch

809831/05?·'

ORIGINAL INSPECTEP

275)588

in Berührung gebracht worden ist, mit einem Volumen eines fUr die selektive Adsorption der gebundenen oder freien Form inerten Lösungsmittels zusammenbringt und diese Flüssigkeit zur Verstärkung der Trennung ebenfalls in die Säule zieht.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als inerte Flüssigkeit Wasser oder einen wäßrigen Puffer verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Adsorbensnaterial verwendet, das auf das Reaktionsgemisch eine kapillare Absorptionswirkung ausübt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man ein ausreichend großes Volumen des Adsorbens verwendet, daß das gesamte Reaktionsgemisch in die Säule gezogen werden kann.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5_f dadurch gekennzeichnet , daß man als Adsorbenseaterial vernetzten Polyvinylalkohol, vernetztes Dextran, Stärke oder Silicagel verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man Antigene oder deren Antikörper, Heptene oder deren Antikörper, Hormone, Vitamine, Metaboliten oder pharmazeutische Mittel oder deren Rezeptoren oder Bind'Uigssubstanzen bestimmt.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet , daß man als Bindungsmittel einen Antikörper verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß man als Markierung ein

809831/0571 --/3

gaamastrahlendes radioaktives Atom verwendet. 2751588

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dae aan die Radioaktivität der gebundenen oder der freien Fora bestirnt, indes aan die Säule in eine Bohrung einer Zählvorrichtung für radioaktive Strahlung einführt und den Teil der Säule, in dem sich die freie oder gebundene Fon, deren Radioaktivität jeweils nicht gemessen werden soll, befindet» selektiv von der. Zählvorrichtung durch ein für radioaktive Strahlung undurchlässiges Material abschirmt.

11. V_erfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß aan zur Abschirmung den betreffenden Teil der Bohrung alt einem für radioaktive Strahlung undurchlässigen Material auskleidet.

12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch g e -k e nn ζ e i c hnet, daß aan eine Adsorbenssäule in Fora eines Rohrs verwendet, das ein Voluaen des Adsorbensmaterials enthält, das durch entsprechende Vorrichtungen in dem Rohr festgehalten wird.

13· Analyseneinheit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß sie zur Bestimmung eines Liganden 1. den Liganden oder ein Bindungsanaloges davon, der bzw. das alt einer Markierung versehen ist, 2. ein Bindungsmittel für den Liganden und 3. eine Säule aus einem Adsorbensaaterial, das für den Liganden oder den Bindungskoaplex des Liganden alt dea Bindungsmittel selektiv 1st, und zur Bestimmung der keit eines flüssigen Mediums für einen Liganden 1. den Liganden oder ein Bindungsanaloges davon, der bzw. das eine Markierung enthält, und 2. eine Säule von einem Adsorbensma te rial, das für den Liganden oder den Blndungskoaples aus dem Liganden . und einea Bindungsalttel für den Liganden, das in dem Medium vermutet wird, spezifisch ist, enthält.

809831/0$?§ ../4

14. Analyseneinheit nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet , daß sie zusätzlich eine wäßrige Pufferlösung und Standardlösungen des Liganden bzw. für die Liganden-Bindungskapazität enthält.

809831/0571