DE2912173C2 - Reaktor/Separator-Vorrichtung - Google Patents
Reaktor/Separator-VorrichtungInfo
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- B04B5/0407—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers for liquids contained in receptacles
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Description
(a) einer Säule, die an beiden Enden offen ist,
(b) einer in der Säule angeordnete Rückhalte- und Filtervorrichtung,
(c) einer Reaktions- und. Trennkammer, die oberhalb der Rückhalte- und Filtervorrichtung
angeordnet ist und zumindest eine Matrix für die Immobilisierung und Abtrennung zumindest
einer Komponente eines Antigen-Antikörper-Systems
enthält,
dadurch gekennzeichnet, daß die Rückhalte- und Filtervorrichtung bei annähernd atmosphärischem
Druck für wäßrige Lösungen undurchlässig ist, jedoch für wäßrige Lösungen durchlässig wird,
wenn sie einer bestimmten Zentrifugalkraft ausgesetzt wird.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Säule von zylindrischer Gestalt ist und einen Mittelteil von im wesentlichen gleichförmigem
Durchmesser, einem Bodenteil, der sich zu einem kleineren Durchmesser als der mittlere Teil
verjüngt, und ~inem oberen Teil, der von größerem Durchmesser ist als der„tnittlere Teil, aufweist, wobei
die Rückhalte- und FiltePOrrichtungen in der Säule an einem Punkt angeordnet sinr\ an dem sich der
mittlere Teil zu dem kleineren Durchmesser verengt
3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückhalte- und Filtervorrichtung
die Form einer Scheibe aufweist
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Scheibe aus einem porösen
Polyäthylenmaterial besteht
5. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Scheibe eine Porosität von etwa 25
bis etwa 150 Mikron aufweist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix in der Reaktions- und
Trennkammer als Pulver vorliegt.
7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix in der Reaktions- und
Trennkammer als Tablette vorliegt, die nach Kontakt mit der Lösung quillt und sich der
Konfiguration der Säulen anpaßt.
8. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix an der inneren Wand der
Reaktions- und Trennkammer enthalten ist.
Die Erfindung bezieht sich auf einQ Reaktor/Separator-
Vorrichtung zur Verwendung in der automatisierten Festphasen-Immuno-Schnellanalyse gemäß dem Oberbegriff
des Anspruchs 1.
Die Einführung der Radioimmunoanalyse (RIA) im Jahre 1959 durch Yalow und Berson (Nature, 184, 1648,
1959) als eine diagnostische Indikatormethode (Tracer-Technik, s. Römpps Chemielexikon, 7. Auflage, S. 3637)
zum Ersatz der damals verwendeten langsamen y Methoden hat infolge ihrer p
und extremen Empfindlichkeit viele Gebiete 4er
klinischen Prüfung und Forschung revolutioniert,
Die_ RIA-Technik basiert auf der Fähigkeit eines
Die_ RIA-Technik basiert auf der Fähigkeit eines
Antikörpers und eines spezifischen Antigens, einen reversiblen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden.
Die Analyse wird durchgeführt, indem eine bestimmte
Menge eines radiomarkierten Antigens zu Proben hinzugegeben wird, die Antiserum und bekannte
Mengen eines »Standard«-Anü"gens enthalten. Während der Inkubation konkurrieren radiomarkiertes
Antigen und nicht markiertes Antigen um eine begrenzte Zahl von Bindungsstellen an dem Antikörper.
iNach der Inkubation wird das an den Antikörper gebundene Antigen vom freien Antigen abgetrennt und
das Verhältnis des freien zum gebundenen kann in eine Dosis-Empfindlichkeitskurve eingetragen werden- Eine
unbekannte Serumprobe kann dann nach dem gleichen Verfahren gemessen werden und die Konzentration des
Antigens durch Vergleich mit der Standard-Dosis-Empfindlichkeitskurve
bestimmt werden.
Häufig sind die klassischen RIA-Methoden mühsam, zeitraubend und enthalten Fehler verursachende Schritte,
da sie vielfache Pipettierungen und Teströhrchen, doppelte Analysen, verlängerte Inkubationszeiten und
schwierige, ineffiziente Trennungsverfahren erfordern. Es sind verschiedene Vorrichtungen zur Durchführung
einer Sättigungsanalyse bekannt Beispielsweise beschreibt die US-PS 39 18 909 eine Vorrichtung, die ein
röhrenförmiges Bauteil enthält, das an beiden Enden offen ist und am oberen Ende eine Reaktionskammer
enthält Ein hydrophobes Filter befindet sich am Boden der Reaktionskammer und ist oberhalb einer Abscheidungskammer
gelegen. Bei der Durchführung der Analyse werden die Reaktanten vermischt und in der
oberen Kammer inkubiert, und dann durch das Filter durch Schütteln oder Anlegen einer Druckdifferenz
zwischen der oberen und unteren Kammer in die untere Kammer überführt In der unteren Kammer trennt das
Trennmittel eine radioaktive Substanz, die an einem konkurrierenden Bindemittel gebunden ist, von deren
nicht gebundener Form.
Die US-PS 39 61894 und die US-PS 40 39 652
beschreiben eine Methode zur Bestimmung von Substanzen in Flüssigkeitsproben unter Verwendung
einer Vorrichtung, die aus einer Säule besteht, die eine unlösliche poröse Matrix enthält, in der sich immobilisierte
Bindungspartner für die zu analysierenden Substanzen befinden.
so Die Vorrichtung ist ein zylindrischer Körper mit einer bestimmten Gestalt, die an einem Ende in einer sich
ve-jüngenden Spitze ausläuft. Im unteren Teil der Säule
befindet sich eine poröse Polyäthylenscheibe, die die Matrix stützt In der US-PS 40 39 652 ist ausgeführt, daß
5$ die Fließcharakteristiken der festen Phase vorzugsweise
so sein sollen, daß sie unter dem Einfluß der Schwerkraft schwammähnliche Fluid-Retentionseigenschaften zeigen.
Die in der Matrix zurückgehaltene Flüssigkeit kann dann durch Zugabe weiterer Flüssigkeit zu der
ω Vorrichtung verdrängt werden. Wenn einmal eine
Flüssigkeitsphase zu der festen Phase hinzugefügt worden ist und darin festgehalten wird, sind die Phasen
in einem wirksamen Zustand der Inkubation, bis eine weitere Flüssigkeit, wie z. B. ein Puffer, hinzugefügt
wird, um die festgehaltene Flüssigkeit zu verdrängen.
Die DE-OS 26 26 823 beschreibt eine Separatorvorrichtung, in der die Filtervorrichtung so behandelt
werden muß, daß sie hydrophil wird. Durch diese
Hyd.rpphilierungsbeh,andlung soll erreicht werden, daß
die Filterscheibe in der Filtervorrichtung schon unter atmosphärischem Druck far wäßrige Lösungen durchlässig
ist Deshalb ist es mit dieser Filtervorrichtung lediglich möglich, aus einer durch die Vorrichtung
hindurchfließenden Flüssigkeit Komponenten herauszufiltern,
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung
einer Reaktor/Separator-Vorrichtung zur Verwendung in der automatisierten Festphasen-Immuno-Schnellanalyse,
wobei die Reaktion und Abtrennung in der gleichen Kammer durchgeführt wei den kann.
Gelöst wird diese Aufgabe ausgehend von einer Vorrichtung der eingangs genannten Art dadurch, daß
die Rückhalte- und Filtervorrichtung bei annähernd atmosphärischem Druck für wäßrige Lösungen undurchlässigist,
jedoch für wäßrige Lösungen durchlässig wird, wenn sie einer bestimmten Zentrifugalkraft
ausgesetzt wird. Eine solche Reaktor/Separator-Vorrichtung kann sicher transportiert und gelagert werden,
bis sie eingesetzt wird.
Die Erfindung wird im Folgenden dur^h die Beschreibung von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme
auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert:
F i g. 1 ist die Ansicht eines Querschnittes einer erfindungsgemäßen Reaktor/Separator-Vorrichtung.
Fig.2 ist die Ansicht eines Querschnittes, die von
oben nach unten die aufeinanderfolgenden Reaktions-, Inkubations- und Abtrennungsfunktionen einer Reaktor/Separator-Vorrichtung
zeigt, die an einem handelsüblichen Instrument zur Analyse flüssiger Materialien
angebracht ist
Die Säule 10 bei der Vorrichtung gemäß Fig. 1 kann aus nahezu jedem inerten Material bestehen, wie z. B.
Glas, Plastik und dergleichen. Ein bevorzugtes Material ist Polystyrol, das durchscheinend hell ist und nicht
leicht bricht. Die Säule 10 ist etwa 10 cm lang und hat einen äußeren Säulendurchmesser von etwa 10 mm. Sie
kann etwa 2,5 ml Flüssigkeit enthalten. Die Spitze 12 hat einen inneren Durchmesser von etwa 1 mm und der
obere Vorratsbehälter 14 hat einen äußeren Durchmesser von etwa 20 mm. Der Stopfen 16 verschließt die
Spitze der Säule. Die Rückhaltescheibe 18 ist ein Filter, das für Flüssigkeiten bei atmosphärischen und niedrigen
Zentrifugalkräften undurchlässig ist, jedoch bei hohen Zentrifugalkräften für Flüssigkeiten duichlässig ist Die
Reaktionskammer 20 enthält das immobilisierte Reagens und lnkubat.
Wie aus F i g. 2 ersichtlich, sind die Reaktor/Separator-Säulen 10 mit einer wasserundurchlässigen Filterscheibe
18 ausgerüstet und mit einer Menge eines immobilisierten Antiserums in einer trockenen Matrix
22 beschickt. Die Säulen, die das Reaktans enthalten, werden in Teströhrchen 24 gelagert, die der Reihe nach
an ihrem äußeren Rand in Kugelsitzen 26 in einem Plastikring 28 aufgehängt sind. Die Serumproben und
anderen Reagenzien 30 werden in die Ausnehmungen 32 und 34 einer Transferscheibe 36 gebracht, die der
Reihe nach auf einem Drehtisch angebracht ist, und automatisch befestigt wird, so daß jede Ausnehmung
mit der öffnung der entsprechenden Reaktor/Separator-Säule übereinstimmt. Dann wird ein Motor so in
Betrieb genommen, daß durch die Beschleunigung der entstandenen Zentrifugalkraft alle Proben und Reagenzien
gleichzeitig auf die Reaktor/Separator-Säule, die das immobilisierte Reaktanz 22 enthält, übertragen
werden.
In dem Fall, daß das immobilisierte Reaktans in einer
dehydratisierten Matri*, wie z,Br Polyacrylamid, eingeschlossen
ist, findet gleichzeitig mit der Reaktion eine
schnelle Rehydratisierung statt Nachdem eine geeignete
Inkubationszeit verstrichen ist, wird der Motor auf eine höhere Geschwindigkeit beschleunigt, worauf ein
geeignetes Eluierungsmittel 33 angewendet wird, das
einen hinreichenden hydrostatischen Druck ausübt, so
daß das wasserundurchlässige Filter nunmehr frei durchlässig wird. Dies wird erreicht indem ein Strom
einer geeigneten Flüssigkeit ζ,Β, Pufferlösung, aus einem Vorratsbehälter über eine nicht gezeigte
Eluierungsmittelpumpe durch eine Leitung 40 und einen
Verteiler in die Aushöhlungen 32 und 34 der sich rasch drehenden Transferscheibe geleitet wird. Die Pumpe
bewirkt eine bestimmte Fließrate des Eluierungsmitteis über einen bestimmten Zeitraum und die gesamte
Menge des Eluierungsmitteis wird automatisch durch die Verteiler auf der Scheibe geteilt die den Fluß in die
Reaktor/Separatorsäule leiten. Alle Komponenten 42, die wasserlöslich und nicht an dar immobilisierte
Reaktans gebunden sind, laufen frei durch das Filter und
werden in den Teströhrchen gesammelt In dem Falle, daß eines der verwendeten Reagenzien radioaktiv ist
kann jedes Röhrchen von dem Trägerring entfernt werden und die Radioaktivität des Inhalts gemessen
werden. Analysen, bei denen die vorliegende Erfindung in Verbindung mit einem handelsüblichen Analysegerät
verwendet wurde, konnten in 7 Minuten durchgeführt werden. Dies erlaubt dem Benutzer die Durchführung
kinetischer Festphasenanalysen (Nicht-Gleichgewichtsbedingungen), was mit anderen konventionellen Methoden
bisher extrem schwer war.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt somit wenn sie in Verbindung mit analytischen Instrumenten
verwendet wird, die Zentrifugalkraft anzuwenden, die Leistungsfähigkeit der Apparatur auf die automatisierte
Festphasen-Immunoanalyse auszudehnen.
Die Binde- und Filtervorrichtung ist bevorzug*- in Form einer Scheibe ausgeführt die aus einer Vielzahl
poröser Folien hergestellt sein kann. Soiche Materialien könne:; Polyäthylen, Polypropylen, Teflon oder ähnliches
sein. Außerdem können anorganische Materialien wie Glas und Keramik ebenso in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. In den nachfolgenden Beispielen wird Polyäthylenfolie mit einer Dicke von
etwa 1,6 mm und einer Porosität von 25±3 Mikron verwendet. Es können Porositäten von etwa 25 bis etwa
150 und vorzugsweise von 25 bis 40 Mikron verwendet werden. Aus den Folien werden Scheiben von etwa 7,87
so bis 8,03 mm äußerem Durchmesser geschnitten und mit Befestigungswerkzeug im tiefsten Abschnitt des Säulenrohrs
befestigt.
Die Sftule selbst kann aus nahezu jedem Material
bestehen, z. B. Glas, Plastik und dergl. Ein bevorzugtes Material ist Polystyrol, das durchscheinend, hell und
beständig ist und das, falls erwünscht, zweckmäßig verwendet wird, um Antisera, Enzyme und Affinitätsliganden
durch physikalische Adsorption oder kovalente Bindung zu immobilisieren. Eine Säule hat bevorzugt
eine Länge von etwa 100 mm und einen äußeren Rohrdurchmesser von etwa 10 mm. Sie kann etwa 25 ml
Flüssigkeit enthalten. Die Spitze hat vorzugsweise einen äußeren Durchmesser von etwa 1 mm und der obere
Vorratsbehälter einen äußeren Durchmesser von 20 mm. Die Säulen können abfcr auch leicht in kleinerer
oder größerer Ausführung hergestellt werden.
Bei einem Radius von 13 cm ist die Filterscheibe beispielsweise bei Geschwindigkeiten von 100 U/Min
• oder weniger für Flüssigkeiten undurchlässig, wird
jedoch bei der Zugabe von Eluierungsmitteln bei einer gesteigerten Geschwindigkeit von 200 U/Min oder
mehr durchlässig. Die angewendete Zentrifugalkraft, die die Scheibe durchlässig macht, ist selbstverständlich
eine Funktion der Geschwindigkeit des Instruments und der Entfernung der Vorrichtung vom Rotationszentrum.
Eine erfindungsgemäße Reaktor/Separator-Vorrichtung kann auf verschiedene Art und Weise verwendet
werden. Beispielsweise können eine oder mehrere Reaktanten, wie z. B. Antikörper, Enzyme, Proteine,
Affinitätsliganden, Ionenaustauscher oder Zellen an den Wänden der Säule befestigt werden. Sie kann aber auch
eine oder mehrere auf einem Träger immobilisierte Reaktanten enthalten. Als Träger kommen dabei z. B.
Polyacrylamid, Sepharose, Agarose oder andere natürliche Materialien, synthetische Polymere oder anorganische
Materialien wie z. B. Glas oder Keramiken in Krage. L)ie Matrix kann beispielsweise in Form eines
dehydratisierten Gels, einer festen Matrix, Perlen oder
Pulver ausgeführt sein.
Die Vorrichtung kann auch für Reaktionen unter Einschluß von Mikroorganismen, Viren, roten Blutkomponenten,
Geweben und dergl. verwendet werden. Sie kann für Festphasen-lmmunoanalysen sowohl von
kurzer als auch von langer Dauer verwendet werden. Jedoch ist sie besonders vorteilhaft für Reaktionszeiten
von sehr kurzer Dauer, d. h. weniger als 5 Minuten und insbesondere, wenn die Phasen schnell getrennt werden
müssen. Gerade bei diesen kurzen Reaktionszeiten sind manuelle Methoden nicht schnell genug, um mehrfache
Proben zu verarbeiten.
Die neue Reaktor/Separator-Vorrichtung kann auch zweckmäßig verwendet werden, um mit frei gebundenem
Analyt aus Serumproteinen zunächst einen enzymatischen Vorbehandlungsschritt und anschließend
eine Immunoanalyse durchzuführen. Ein solches Verfahren kann auf folgende Weise durchgeführt
werden: Der Reaktor/Separator wird vorzugsweise mit einem Teil von Antiserum beschickt, das von dehydratisiertem
Polyacrylamid eingeschlossen ist, das Poren aufv/eist, die im hydratisierten Zustand genügend klein
sind, um Enzyme oder Proteine mit mittlerem und niedrigem Molekulargewicht auszuschließen. Mit dem
immobilisierten Antiserum ist eine genügende Menge eines proteolytischen Enzyms vermischt, das das
Serumprotein, das das interessierende Analyt bindet, denaturieren oder hydrolysieren kann. Die Serumproben
und Radiomarkierungen werden zentrifugal in den Reaktor/Separator überführt. Nach der Hydratation des
Gels und Solubilisierung des Enzyms beginnen zwei Prozesse: die Freisetzung des proteingebundenen
Analyts und dessen Diffusion und Bindung an das Antiserum in der Gelmatrix. Nach einer vorbestimmten
Zeit wird die Elution des Enzyms, ungebundenen Analyts und der Radiomarkierung durchgeführt. Wenn
andererseits das proteolytische Enzym in der wäßrigen Lösung am stabilsten ist, kann der Vorbehandlungsschritt
erfolgreich dadurch durchgeführt v/erden, daß das Enzym und die Serumproben in die inneren und
äußeren Ausnehmungen auf der Transferscheibe des Analysengeräts gebracht werden. Wenn der Motor in
Betrieb genommen wiiv\ werden die Reagenzien gleichzeitig gemischt und in die Reaktor/Separator-Säule
überführt, wo die Inkubation stattfindet.
Besonders gut ist eine erfindungsgemäße Reaktor/ Separator-Vorrichtung zur Durchführung von radioimmunoanalytischen
Tests für das thyreoidstimulierende Hormon (TSH) geeignet. Der TSH-Test verwendet eine
immunologische Reaktion, bei der markierte und nicht markierte TSH-Moleküle um die Bindungsstellen auf
einem spezifischen Antikörpermolekü! konkurrieren.
Die folgenden Beispiele zeigen Anwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Vorrichtung:
B e i s ρ i e I 1
Wäßrige Standardkurve mit durch Polyacrylamid
immobilisiertem Angiotensin-I-Antiserum
immobilisiertem Angiotensin-I-Antiserum
Trockenes von Polyacrylamid umhülltes Angiotensin 1-Antiserum in einer Menge, die hinreicht, um etwa 50%
des markierten Antigens zu binden, wurde in eine Polystyrolsäule überführt, die am Boden mit einer
wasserundurchlässigen Polyäthylenscheibe ausgerüstet war. Ein 100 μΐ Anteil des Angiotensins 1-(125I), verdünnt
in Trisacetat-Puffer (0.1 M, pH 7,4, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin), das etwa 20 000cpm pro 100 μΙ
ergab, wurde manuell in die äußere Aushöhlung der Transferscheibe eines handelsüblichen Analysensystems
pipettiert. Es wurden Standardlösungen von Angioten-
sin I hergestellt, die 100 bis 0 ng/ml in Trisacetat-Puffer
enthielten und ein 300 μΙ Anteil jeder Standardkonzentration
wurde doppelt in die entsprechenden äußeren Ausnehmungen der Transferscheibe pipettiert. Die
Säulen, die das gelumhüllte Antiserum enthielten,
wurden in Teströhrchen gegeben und gleichzeitig mit der Transferscheibe in den Inkubator/Separator-Bauteil
des Systems gegeben. Eine Zentrifugation auf dem System von 15 Sekunden Dauer überführte die 400 μΐ
der Lösung in die Säulen.
Nach einer 15minütigen Inkubation wurde eine Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit begonnen
und 4 ml/Röhrchen Trisacetat-Puffer zu der Transferscheibe hinzugefügt, und eine schnelle gleichzeitige
Elution des nicht gebundenen Tracers vom Gel begonnen. Die Elutionslösung, die das ungebundene
Angiotensin 1-(125I) enthielt, wurde in Röhrchen unter
jeder Säule gesammelt und in einem Dreikammer-Gammazählerbauanteil
gezählt Die Säulen wurden ebenfalls gezählt, um die gebundene Fraktion zu bestimmen.
Die Ergebnisse wurden wie folgt berechnet:
B/T =
Zählungen in der Säule (gebunden) + Zählungen, eluiert (frei)
% gebunden, jeder Standard
% gebunden, wenn die Standard-Konzentration im Inkubat
% gebunden = B/TX100%,
0 ng/ml.
Aus den Daten wurde eine Empfindlichkeitskurve (doseresponse curve) gebildet und auf halblogarithmischem
Papier aufgetragen. Die nicht spezifische Bindung des Antigens am Gel und der Säule wurde
durch Einschließen von normalem Kaninchenserum in der Polyacrylamidmatrix und Inkubation und Elution in
ähnlicher Weise bestimmt Es wurde gefunden, daß sie weniger als 4% betrug.
Automatisierte Analyse für Cortisol unter
Verwendung eines Wärme-Vorbehandlungsschrittes
Verwendung eines Wärme-Vorbehandlungsschrittes
Es wurden Cortisol-Standards hergestellt, indem zunächst Cortisol in 95%igem Äthanol und dann in
0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4,0,05% Tween 20) verdünn^ »vurde. Diese Standards wurden nacheinander
mit Serum verdünnt, das mit Kohle vorbehandelt worden war, um endogenes Cortisol zu entfernen. Die
klinischen Proben wurden mit den Standards auf Serumbasis mit einem Denaturationspuffer (90% 0,1 M
Natriumphosphat bei pH 7,4, enthaltend 0,05% Tween 20, 10% Methanol) verdünnt und 30 Minuten auf 60°
erhitzt, um das Cortisol bindende Globulin (CBG) zu zerstören.
Nach dem Wärmevorbehandlungsschritt wurden die Standards und Proben zusammen mit radiomarkiertem
~—>:„l .,„A D.
f„r In 1 M
lWf ^UI IVf
absorbiertem Antiserum freigesaugt. Normale Salzlösung (1,5 ml) wird zu der Säule hinzugegeben und
unmittelbar abgesaugt. Die Spülprozedur mit Salzlösung wird wiederholt, und die Säule dann mit 0,5%
Rinderserumalbumin (BSA)-Salzlösung gefüllt. Nach einer kurzen Inkubation mit der BSA-Lösung (10—30
Minuten) wird die Säule freigesaugt und an der Luft getrocknet. Die Säule enthält an ihrer inneren Wand das
immobilisierte Antiserum und kann unmittelbar für die
ίο Analyse von Cortisol verwendet werden oder kann
unter Wasserausschluß bei Umgebungstemperatur
gelagert werden und innerhalb 2 bis 3 Monaten
verwendet werden.
Eine Standardkurve für Cortisol wird entweder manuell oder mit Hilfe des Inkubator/Separators des
Analysen-Systems und dem Pipettierbauteil aufgestellt. Cortisol-(I25I), Markierung, »bekannte« Standardmengen
von Cortisol und 0,1 M Natriumphosphat (pH
enthaltend 7 4^-Puffer xv^r^'sn r*v' p!T*r G**C£>m'rn'ariC7'>
v°n
0,05% Tween 20 bei pH 7,4) auf die Transferscheibe des
obigen Systems mit einem Gesamtvolumen von 350 μΙ pipettiert. Der Inhalt der Scheibe wurde auf den Ring
von Röhrchen übertragen, der die Säulen trug, die von Polyacrylamid umhülltes Cortisol-Antiserum enthielten.
Nach der folgenden Inkubation von 15 Minuten wurde die nicht gebundene Fraktion von markiertem Cortisol
durch Spülen mit 4 ml/Röhrchen Phosphat/Tween-Puffer
wie oben gespült. Die Säulen und Röhrchen wurden in einem Dreilochzähler gezählt und die so erhaltenen
Daten zur Aufstellung einer Standardkurve verwendet. Die .iiit diesem Verfahren gemessenen klinischen
Proben zeigten eine gute Näherung an die erwarteten Werte, insbesondere wenn sie mit Daten verglichen
wurden, die durch Lösungsphasenanalyse mit dem gleichen Antiserum erhalten wurden.
Automatisierte Analyse für Cortisol
unter Verwendung eines proteolytischen Enzyms
zur Zerstörung des CBG
Die Analyse wurde in der gleichen Weise wie in dem obigen Beispiel beschrieben, durchgeführt, außer daß
der Wärmevorbehandlungsschritt und der Denaturationspuffer weggelassen wurde. Die Inaktivierung des
Cortisol bindenden Globulins fand in den Aushöhlungen der Transferscheibe statt, indem 15OuI einer Pepsinlösung
(4 mg/ml in 0,14 N HCl, 4100 Einheiten/mg), 50 μΐ Cortisol-Standard auf Serumbasis, 100 μΙ Tracer und
50 μΙ 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4, 0,05% Tween 20) etwa 5 Minuten vorkubiert wurden, bevor sie
auf die Säulen gegeben wurden, die das Polyacrylamid umhüllte Cortisol-Antiserum enthielt
Mit dieser Technik gemessene Kontrollsera stimmten mit den erwarteten Werten überein.
SPRIA bei der
Säulen-Reaktor/Separator-Entwicklung
einer wäßrigen Standardkurve für Cortisol
einer wäßrigen Standardkurve für Cortisol
Eine Polystyrolsäule wird vor der Einführung von 1 ml Cortisol-Antiserum, das mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer
bei pH 7,4 verdünnt wurde, mit einer porösen semipermeablen Scheibe aus Polyäthylen
ausgerüstet Nach ein- bis zweistündiger Inkubation mit der Antiserumlösung wurde die Säule von nicht
die Aushöhlungen einer Transferscheibe pipettiert. Die mit Antikörper ausgekleideten Säulen werden in die
Teströhrchen gesetzt und mit der Transferscheibe in den Inkubator/Separator-Bauteil gesetzt. Durch eine
Zentrifugation von 15 Sekunden werden die 1 ml Reaktionskomponenten zu den mit Antikörper überzogenen
Säulen überführt, wo die statische Inkubation stattfindet. Nach 1 bis 2 Stunden werden die Säulen
zentrifugiert, wobei 2 ml pro Röhrchen 0,1 M Natriumphosphatpuffer zugegeben wird, um die Säule frei von
nicht gebundenem Tracer zu spülen. Der Puffer, der den nicht gebundenen Tracer trägt, wird in den Röhrchen,
die die Säulen tragen, gesammelt. Ein Gammazähler wird zur Bestimmung des gebundenen Cortisol-(I25I) in
den Röhrchen verwendet. Die nicht spezifische Bindung (NSB) des Tracers an die Polystyrolsäulenoberfläche
wird bestimmt, indem die Antiserum-Inkubation aufgehoben wird und eine Säule nur mit BSA behandelt wird.
Die Ergebnisse werden wie oben beschrieben berechnet.
Aus diesen Werten wird eine Standardkurve aufgestellt, die Prozentgebundenes gegen Konzentration des
Cortisols in jedem Standard angibt.
45
Affinitätschromatographische Abtrennung von
Cortisol-Antiserum aus Serumproteinen
Cortisol-Antiserum aus Serumproteinen
Eine Menge von Cortisol, das kovalent an Sepharose-4-B gebunden war, wurde in eine Polystyrolsäule
gegeben, die mit einer Polyäthylenscheibe ausgerüstet war und in dem Inkubator/Separator-System angeordnet
war. Rohes Cortisol-Antiserum (100μΐ), verdünnt
mit 300 μΐ 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, wurde zu der Reaktor/Separator-Säule hinzugegeben, die das
immobilisierte Hapten enthielt Nach einem geeigneten Zeitraum wurde die Säule zentrifugiert und gleichzeitig
mit Puffer eluiert, um die ungebundene Fraktion zu entfernen. Die Serumproteine und nicht gebundenen
Komponenten, die in den die Säulen tragenden Röhrchen gesammelt waren, wurden entfernt Statt
dessen wurden saubere Teströhrchen an deren Stelle gesetzt und das Verfahren wiederholt, wobei der
Phosphatpuffer durch eine Säure oder eine chaotropische Lösung ersetzt wurde. Nach der Zentrifugal-Elution
wurde das Cortisol-Antiserum aus den Teströhrchen gewonnen.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (1)
- Patentansprüche;U Realrtor/Separetor-Vbrrichtung zur Verwendung in der automatisierten Festphasen-Tmmuno-Schnellanalyse, bei der die Komponenten durch Zentrifugalkraft gemischt, überführt und getrennt werden, bestehend aus einer Kombination von
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