JPH04504911A - 生物学的物質の分離及び採取様遠心分離管及び多孔性選択手段の組合せ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 生物学的物質の分離及び採取様遠心分離管及び多孔性選択手段の組合せ 技　術　分　野 本発明は、成る所望の生物学的物質を含む液体から、成る所望の生物学的物質を 分離且つ採取する方法、並びにこれら分離及び採取を達成する装置に関する。さ らに、特に本発明は、液体が浸透可能であるが、しかし選択手段に対して、デス オキシリボ核酸（ＤＮＡ）又は他の生物学的物質について親和力を有する部位を 含有し、それ故選択的に結合する、ここで規定されるような多孔性選択手段を結 合させる本発明の遠心分離管を用いて、ブロス、ゲル等を含むＤＮＡのような生 物学的物質を含有する液体から高密度の生物学的物質を採取することに関する。

結合した物質は、次に溶離によりこの多孔性物質から回収できる。

背　景　技　術 分子生物学及びこれに類似の学問における最近の進歩は、少量の生物学的物質、 例えばＤＮＡセグメント及び蛋白の採取、精製、及び分析において、より早くし かもより正確な技術を要求している。

電気泳動及び他のクロマトグラフィ分離法のような方法は、必要な工程として、 種々のタイプの吸着カラム、例えばイオン交換カラムの使用、電気的溶離又は冷 凍スクイズ技術によるゲルスライスからの採取又は例えばアセトンによる選択的 沈澱の何れかを従来用いて、ゲル、ブロス或いは同様な媒体から、これら生物学 的物質の分離及び採取をすべて要求している。さらに最近では、電気泳動的分離 後ゲルからＤＮＡを採取する別の方法がもたらされ、それは所望のゲルスライス をカオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）塩、例えば沃化ナトリウム（Ｎａｌ ）に溶解し、次にガラスピーズ、即ち水中のシリカマトリックスの懸濁液へＤＮ Ａを選択的に結合し、次に遠心分離にかけることを含む。Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６、Ｎｏ、２．　ｐｐ、６１５〜６１９（１９７ ９）。

同様なやり方で、最近の採取法はＤＮＡ含有アガロースゲルの可溶化、次にＤＮ Ａのみを吸着するための溶液への「精製マトリックス」の添加を含む。洗浄緩衝 液による吸着したＤＮＡの脱離、そして次に遠心分離は、この方法によりＤＮＡ を採取する。Ｂｉｏ−Ｒａｄｉａｔｉｏｎｓ、ＮＯ，７３，１９８９年夏、（Ｂ ｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａ　ｔｏｒ　ｉｅｓ、Ｒｉ　ｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）ｏ又 、「Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ ａｌ、Ｍａｎｉａｔｉｓら、ｐｐ、４６６〜４６７　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２）参照。これは又遠心分離管 を用いる。

さらに、積重ねフィルターと組合せた種々のタイプの試験管、ピペット、遠心分 離管、濃縮器及び同様な装置、並びに液体からの固体、特に生物学的物質の濾過 分離、他の液体からの液体の分離及び成る化学的及び生物学的テスト法における これら装置の使用は、既に記述されている。例えば、米国特許第４５５７９０２ 号参照。それは、試薬を分離する積重ねフィルターディスクと組み合わされた気 体、蒸気及びエロゾルを検出するための種々の試薬を含む試験管に関する。又、 Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　１４０２（１９８７）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）参照。それは、クロマト グラフィ・スピンカラム装置及びラジオラベルしたヌクレオチドを採取する技術 を記述している。さらに、米国特許第３７３２９８１号は、除去可能なキャップ 及び「スナップ・オフ（ｓｎａｐ−ｏｆｆ）Ｊチップを付けたカラムを開示して いる。非フィルター配置中の管の壁を有するフィルターペーパーフラッシュと組 み合わされた公知の装置も記述され、それではフィルターペーパーは、亜鉛粉末 、シリカゲル、不活性石英及びシリカゲル（塩化金を含浸させた）の組合せによ り含浸される。又従来のフィルター配置におけるよりも、管の軸に沿って置かれ たフィルター媒体を含む管の例は、米国特許第４６００５０７号の遠心分離管で ある。

従来のフィルターとして機能する、管中で配置された多孔膜を有する遠心分離管 、ピペット及び同様なものの代表例は、遠心分離ピペットでは米国特許第４４８ ３８２５号に示されたものであり、そして蛋白濃縮器では米国特許第４３０１１ １８号に示されたものである。米国特許第４６３２７６１及び４７８７９７１号 は、それに追加したものであり、そして米国特許第４８３２８５１号は、非常に 複雑なマルチ室装置に関する。又、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｎｅｗｓ、Ｎｏ、１２ 　（１９８９）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、　。

Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ、）並びにそれに相当する製品文献参照。

それらは、遠心分離管を通る濾過層の「低結合膜」を開示しており、それらは最 低の結合をするフィルターとして好ましく記載され、それにより遠心分離により 、所望の生体分子を選択的に結合する膜を教示していない。同様な装置は、５ｃ ｈｌｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｕｅｌｌ刊行物ｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓＪ、ｌ５ｓｕ ｅ　３０．Ｓｐｒｉｎｇ、１９８９（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｈｕｅ １１、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ，Ｕ、Ｓ、Ａ、）により示されたものを含み、それはそ れらのＣｅｎｔｒｅｘフィルター装置、モして又Ｋｏｎｔｅｓカタログ、１９８ ３．１１月１日、２１９ベ一ジＨｔｅｍＫ−４１３９００）（Ｋｏｎｔｅｓ　Ｃ ｏ、、Ｖｉｎｅｌａｎｄ。

Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅ）’＋　Ｕ、Ｓ、Ａ、）の濾過管を開示している。

前述の各装置において、膜は非常に複雑な精密に作動された装置にしばしば組み 込まれた、濾過装置としてのみ用いられ、それらの何れも成る生物学的物質を選 択的に結合し、それにより分離し、次に高濃度で結合部位から生物学的物質を溶 離する部位を含む多孔性選択手段を、簡単な遠心分離管の配置と組み合わせて用 いる概念を教示していない。

これらの方法及び装置は、種々の有効性があるが、カラムの組み立て、ガラス懸 濁物の場合のような特別な試薬のピペットによる採取、例えばゲルスライスによ るような一時に二、三のサンプルのみの処理、又は有毒な溶媒の使用及び／又は 所望の生成物の低い収率をもたらす種々の随伴する溶離技術のような複雑性を特 徴とする。

例えばｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＪ　（前出）、ｐｐ。

１６４〜１７２参照。その１６４ページで、アガロースゲルからＤＮＡを採取す るために多くの方法が開発されたが、しかしその何れも全く満足されないことを 述べている。一般に分子生物学の研究並びに特に提案されたゲノムプロジェクト の増大と共に、これらの問題を避けるＤＮＡ又は他の生体分子のサンプルの多く を、選択的に分離し採取する便益の増大が、従って非常に望ましい。

発　明　の　開　示 本発明によれば、ブロス、ゲル又は同様物を含む、成る所望の生物学的物質、例 えばＤＮＡ又はそのヌクレオチドセグメント、ラジオラベルＤＮＡ又はリボ核酸 （ＲＮＡ）　、ニック翻訳生成物、プラスミドＤＮＡ、蛋白又は同様物又はその 混合物を含有する液体から、高濃度で該物質を選択的に分離し、そして採取する ための新しい装置及びそれを用いる方法が提供され、それにより採取されるべき 生物学的物質を選択的に結合する部位をその中で一体的に組み込み、一方濾液を 遠心力の下で通過させる、一般に１枚以上の重合体状の多孔性のシート又は膜の 形の、多孔性の選択手段を管の中心軸に対して横切る、その中に組み込まれた一 般に円筒形の遠心分離管によりなる本発明の装置中で、液体は遠心分離される。

多孔性の選択手段は、次に種々の溶離技術により、選択手段から採取された結合 した生物学的物質及び未結合の物質のすべてを洗い流すことができる。

用語「選択手段」により、クロマトグラフィのゲル又は他の媒体から又は生物学 的物質から採取、分離或いは分割されるべき成る所望の生物学的物質を選択する 手段を意味する。ここで用いられる時、これら手段は多孔性、即ち液体及び成る 望ましくない物質を透過するが、所望の生物学的物質を選択的（そして望ましく は離脱可能に）結合できる部位を与えるプラスチック重合体のウェブ、膜又は他 の物理的構造よりなるマトリックス又は担体よりなる。そして、上記の部位は、 プラスチック重合体それ自体と一体的な部分に存在するか、又は最も好ましくは プラスチック重合体内に物理的、又は化学的に組み込まれた有機又は無機の粒状 体中又は上に存在する。有機の粒状物の中で、疎水性及び親水性のものが含まれ る。例えばプラスチック重合体中に組み込まれた粒子を含む複合体の場合、これ らの部位は、粒状の物質それ自体、例えばセルロース例えば微結晶セルロース、 又はより好ましくはＤＮＡと結合し、それ故ＤＮＡ選択手段を提供するシリカの 表面を構成する。

他の態様では、部位はその活性化された部位が、例えば蛋白選択手段を提供する 、下記のようなゲルタールアルデヒド等が結合するシリカのような粒状物の化学 的活性化、又は変性の結果である。一方、より好ましくはないが、結合部位を提 供するための化学的活性化又は変性は、それら自体上の生物学的物質に結合する ように働く蛋白、又はＤＮＡのような生物学的分子のそれへの付着の如き、多孔 性膜それ自体への付加の形であろう。これら蛋白結合部位の代表的なものは、抗 体、抗体結合蛋白、レクチン、酵素等である。

他の選択手段は、種々の他の生体分子を選択的に結合することについて当業者に より容易に認識され、そして粒状物質を含むが必ずしも制限されない、所望の生 物学的物質を結合できる他のタイプのセル状、サブセル状、生体分子状、有機又 は無機の物体をその中に組み込んだマトリックスを含む。

ここで用いられる時、用語「濾液」により、すべての未結合物質、即ちそれらの サイズのため選択手段の孔を通過できたが、それらの性質のため選択部位のすへ てに結合せず、従って遠心分離管の底に集められた物質を含む液体の濾過物を意 味する。逆に、用語「エキス（ｅｘ）濾液」は、ここで用いられる時、それらの サイズのため選択手段の孔を通過できず、そのため後の除去のため表面上に残っ た未結合物質に関する。

遠心分離に用いられるように適合され、そして選択手段特に大きな表面積を有す るものを含む、直に使用されるカートリ、ツジ状の装置を提供するのに、種々の 物質の早い採取のための順応性のある方法が得られる。有利には、この装置は極 めて少量の生物学的物質を採取するためのミクロフユージに非常に有効に用いら れるのに、大きくスケールダウンできる。その上、従来技術と比べて比較的低い コストで、ここで用いられる選択手段はそれらの高い保持能力のため、９５％よ り大きく所望の物質を採取する方法を提供する。

用いられる温度は、厳密を要せず、広く変化できるが、有利には大多数の場合で は外界温度で行うことができる。

選択手段は、規定された方法の目的に一致する任意の所望の厚さのものであるが 、好ましい態様ではこの物質は比較的薄い膜の形である。この形では、膜はそれ に適用される遠心力に抵抗するのに十分な剛さでなければならないか、又は本発 明の装置内の多孔性支持体上に組み込まれなければならない。この記述の目的の ため、多孔性の選択手段はその好ましい形即ち多孔性の膜、そして最も好ましく は微孔性の膜として以下に例示され述べられるが、流体又は未結合物質に対して 多孔性であるが、物理的或いは化学的な手段により特定の生体分子と選択的に結 合するすべての選択手段が、ここで包含されることを意味することを理解するだ ろう。

膜に加えて、他の態様において液体を通過させつつ、又所望の生体分子をそれら に選択的に結合する、それら上又は内に電荷基を育する、さらに厚い固体状態の 多孔性選択手段が考えられる。これらのさらに剛い物質の代表例は、例えばイオ ン交換活性化有機シート例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース等 のようなセルロース性シートの如き物質である。

好適な多孔性の物質の他の例は、ナイロン、セルロース性誘導体或いは変性ポリ 弗化ビニリデン；樹脂により互いに結合したフィブリルから形成した微孔性の物 質、又は当業者に周知の同様な微孔性の物質のような物質から形成される注型重 合体状微孔性の膜を含む。

これら物質の例は、米国特許第４７０２８４０．４５２３９９５及び４８００１ ９０号に記載されたものを含む。

もち論、膜或いは同様な選択手段は、それを通過する成る所望の生物学的物質を 選択的に結合する能力を有することは、本発明にとり必須である。上述のマトリ ックス及び選択手段の中で、成る所定の生物学的物質の採取にどれが適切である かの選択は、物質等の性質及び本性に応じて、当業者により従来通り容易に決め られることのできるものである。

本発明を実施するのに、それ放物質の三相分別が提供され、その際第−相のさら に大きな生物学的又は他の物質がエキス濾液として膜の上面上に残り、すべての 残りの生物学的物質は選択手段に入り、そこで第二相として所望の生物学的物質 が選択的結合、或いはクロマトグラフィの何れかにより結合され、そして第三相 として多くの残りの生物学的物質は濾液として多孔性膜を通過する。本発明にお いて最も関心のあることは、第二相の結合した生物学的物質の分離であり、それ 故利用される選択手段は、すべての残りの生物学的物質を通過させつつ、所望の 物質のみを結合又はさもなければ保持する能力を有するものでなければならない 。

そのため、本発明の装置は、所望の物質が濾液中又はエキス濾液中の何れかに残 る二相分離だけを達成する、簡単な通過フィルターを利用する装置から区別され るべきである。本発明の濾液又はエキス濾液はさらに利用できるが、本発明の主 要且つ重大な目的は、膜の結合した又はさもなければ捕捉された生物学的物質を 除去することにある。膜の濾過の態様は、従って膜に結合しない生物学的物質を 通過させつつ、より大きな生物学的物質及び／又は混存物、例えば白血球、赤血 球等を上部で分離するように働く。

：、三の有用性は、選択的結合及び濾過の本発明の組合せから生ずる。特に有用 な態様は、ＤＮＡ及び／又はＤＮＡフラグメントが最初ゲル電気泳動、ゲル等電 点電気泳動又は他のゲルクロマトグラフィ法（その二、三のものはｒＭｏｌｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｐｐ、１６４〜１７４（前出）に記載されている） により分離された後のそれらの採取である。この態様では、ＤＮＡバンドを含む ゲルの部分（通常、アガロース又はポリアクリルアミドであるが、これら物質に 制限されない）は、取り出され、任意の周知の手段により液体にされ、そして遠 心分離管の頂部に置かれる。遠心分離中、ゲル並びにそれが含む任意の生物学的 物質は膜に入り、もしあればより大きな粒子をエキス濾液として表面上に残す。

ゲル中に存在するＤＮＡは、シリカ又は微結晶セルロースのような膜の好適な選 択部位に結合し、そして残りの液体化したゲル及び未結合分子は、濾液として膜 を通過する。この方法は、一般にＤＮＡセグメントに適用可能であるが、それは 約５６０塩基対（ｂ　ｐ）〜２３キロ塩基対（ｋｂ）のサイズに及ぶセグメント の採取に特に有効である。

結合した生物学的物質を有する膜又は同様な手段は、次に取り出され、そして洗 浄されてすべての残りの液体状のゲル又は他の非結合物質を除く。膜中に残るＤ ＮＡ又はＤＮＡフラグメントは、次に周知のやり方で溶離される。この態様を助 けるために、膜は好ましくは遠心分離管から取り出し可能であるが、ここに参考 として引用される米国特許第３７３２９８１号に開示されたのと同様なやり方で 、膜の洗浄を助けるために、管の閉じた即ち底部が開けられて濾液を取り出し、 そして流れ出る通路をもたらすこともできるだろう。

特に好ましい態様では、遠心分離管は選択手段が設けられる分離可能な上部の容 器（この要素それ自体が一体化した管から除去可能であるが）、並びに濾液を集 めるための下部の容器よりなる二つの部分の管から構成される。

本発明の他の態様は、同じ三相分別分離、並びに特に好ましくは成る化学的に活 性化された、又は変性された粒状物、例えばシリカ或いはセルロース粒子、好ま しくは微結晶セルロースを用いるものに基づくアッセイよりなる。一つの特別な 態様では、例えば種々の蛋白、例えば全血又は好ましくは血清中の特定の抗原、 又は抗体の存在についてアッセイされるべき物質は、例えば対応する抗体がリガ ンドとしてシリカ結合化学基、例えばシリカに結合したポリエチレンイミン、ゲ ルタールアルデヒド、蛋白Ａ又は蛋白Ｇ又は同様物、又はセルロース、例えば微 結晶セルロース等（そのすべては膜マトリックスと一体となっている）を通して 結合している、活性化シリカ含有膜を設けられた本発明の装置を用いて遠心分離 される。従って、例えば多孔性又は微孔性のマトリックス中のシリカに、酵素リ アクター研究のため又は抗体、抗原又は選択された基質に結合するために蛋白に 結合するゲルタールアルデヒド、蛋白を分離し、アルブミン或いはＩｇＧと結合 するカルボキシメチル活性化した負に電荷したシリカ、又は弱アニオン性交換の ためのアミノ活性化した正に電荷したシリカのような化学基が結合できる。一方 、レクチンコンカナバリンＡ或いは水晶体処理アグルチニンのようなリガンドが 結合できる。コンカナバリンＡの場合、これはアフィニティ電気泳動で用いられ て、双触角グリカンに結合する。

ｒＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＪ　１９８９．　１０　（８〜９）。

ｐｐ、ｓｅｓ及び５７４゜さらに、シリカがスルホプロピル基により活性化され て、蛋白等を分離するために負に電荷した強力チオン性交換結合をもたらす、微 孔性プラスチック・シリカシートが使用できる。蛋白Ｇ又は蛋白Ａは、同様にア ルブミン又は他の醗酵槽の上澄み液からｒｇＧの分離に活性物として使用できる 。前述の活性化されたシリカ・微孔性シートは、例えばＭＰＳ　（商標）シート のように周知であり市販されており、ＡＣＴＩ−ＭＯＤ　（商標）及びＡｃｔｉ −Ｄｉｓｋ（商標）分離及び精製カートリッジに組み込まれ、これらのすべては ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ、Ｕ、Ｓ、Ａ 、の製品である。もち論、アッセイにおける使用に加えて、これらの前述の活性 化された選択手段のそれぞれは、前述のように、本発明の他の分離及び採取法で 使用できる。

この「アッセイ」態様において、選択手段の重要な結合の態様は、それが注ぐに つれ濾液からそれを選択的に取り出し、選択手段内で結合するのに十分な量とし て、当業者に周知の任意のものである検出物質を活性化することにより、アッセ イされるべき物質を「濃縮する」。検出物質が色の変化を形成する時、アッセイ された物質の存在は、肉眼により認められる色の変化により示されるか、又は結 合酵素、放射性アイソトープ、スピン共鳴指示薬、核磁気指示薬、蛍光ラベル等 を含む任意の周知の生物学的アッセイ指示薬を用いて指示できる。指示薬の性質 及び結合により達成される濃度の程度に応じて、例えば膜を洗浄して正のアッセ イを達成することは、必要又は不必要である。膜を洗浄すること又はアッセイの 完了のため、結合した物質を取り出すことが必要又は望ましい時、除去可能な膜 を用いるのが好ましい。

図面は、選択手段として多孔性の膜を組み込んだ、ｌＯとして全体的に示された 二つの部分の遠心分離管を示す、本発明の一つの態様の断面図である。

操作する例における以外で、又は他に示された時以外で、ここで用いられる成分 、パラメーター又は反応条件の量を表すすべての数字は、用語「約」によりすべ ての場合に修飾されるものと理解されるべきである。

本発明の装置は、好ましくは二つの部分よりなる遠心分離機で用いられるように 適合された管状の容器であり、その上部は下部に或いはその中に組み合わされて 、単一の液密の遠心分離管を形成する。

さらに詳しくは、この新規な装置の上部は、採取されるべき生物学的物質を含む 流体サンプルを受容する容器を形成する。本発明の必須な特徴として、この上部 の底部は、前記の多孔性の選択手段によりなり、そして最も好ましくは採取され るべき生物学的物質を選択的に結合できる成る部位を、その中に一体的に組合せ た、取り出し可能な多孔性或いは微孔性の膜又は複数の膜よりなり、しかしその 膜は、二つの組み合わされたシールされた部分の底部に集められる、望ましくな い浸透可能な濾液を通す。好ましくは、そして特に滅菌物質の場合には、上部容 器の頂部は周知の手段によりシールされて汚染を防ぐ。浸透可能な液体が集めら れる装置の底部は、前述のように、任意のシール手段と組み合わされて、上部の 容器と脱着可能な液体が浸透できないジヨイントを形成する。このシタインドは 、上部の容器の膜を形成する底部の丁度下の点である。しかし、さらに好ましく は、図面に画かれているように、上部の容器は下部の容器より狭い直径を有して 、上部の容器は下方のものの中に入り、そして任意の上記の液体が浸透しない継 ぎ目手段等によりそれに付着される。上部は、当業者において周知である任意の 手段、例えばガスケット或いは０−リング、あり継ぎ、テーパー付ジヨイント、 クリック止めはめあい、ペイヨネットはめあい、ねじ付ニップル等を用いるか、 又は超音波溶接のような溶接手段により、下部と除去可能であるがシール可能な ように接合すべきであるか、又は上部と一体的に形成されるが、ただし多孔性の 選択手段、例えば環状の溝の下で円周状の折点を設けられる。

接合された時、全装置は遠心分離で分離物質中に従来から用いられているタイプ の管を形成するが、しかしそれは１個以上の前記の多孔性の選択手段、例えば膜 等により管の軸を横切って分割される。

遠心分離管の正確なサイズ及び形状は、本発明の重要な特徴ではない。しかし、 非常に少量の生物学的物質が一般に処理されるので、ミクロフユージに用いられ る「ミクロプレパラティブ（ｍ　ｉ　ｃ　ｒ　。

ｐｒｅｐａｒａｔ　１ｖｅ）Ｊスケールの管が、非常に有利に利用できるだろう 。

図に示されているのは、上部（要素２０〜２５）及び下部（要素３０〜３４）よ りなる、本発明による二部の遠心分離管（包括的に要素ｌＯと名付けられる）で ある。

上部は、一般に円筒状である上部容器２０、好ましくは上部容器２０の頂部に除 去可能に付着し、最も好ましくはそれと一体となったキャップ２５、上部容器２ ０の頂部の環状のリップ２２、下部に対して一方に片寄るように適合されたフラ ンジ２６、流体を通過させるように適合された孔又はスリット２４を有する、好 ましくは下部容器３０と好ましくは一体となった支持部材よりなる底部２３、そ して多孔性の選択手段、例えば膜２１（底部２３を完全に覆って、流体が先ず選 択手段２１を通過しなければ、孔又はスリット２４を通って上部容器２０の内部 から通ることができない）よりなる。

下部は、上部容器２０を受容するように適合された下部容器３０及び、上部容器 ２０のフランジ２６と係合するように適合された上部フランジ３２よりなる。下 部容器３０は、その丸い底部３４に向う内方向のテーパー３３よりなる。内方向 のテーパー３３は、上部容器２０の底部２３が、摩擦はめあいを与えるように、 それに対して一方に片寄るように、位置した円周３１で始まる。上部容器２゜は 、第一にフランジ２６．３２の互いに一方に片寄ることにより支持され、そして 第二に円周３１の摩擦はめあいにより支持される。

円周３１の摩擦はめあいは、さらに溶接手段、例えば超音波溶接により確実にさ れるが、又実質的に流体が浸透しないシールとして働き、それは遠心分離管１０ が遠心分離を行った後にそれを取り扱うのに有用である。選択手段２１が好まし くは微孔性のため、上部容器２０に入れられた流体は、一般に遠心分離により生 ずる力にかけられる前に、それを通過せず、そして上部容器２ｏはそのキャップ ２５が閉じられた時、上部及び下部の間のより強いはめあいに頼ることなく取り 扱われる。所望ならば、上部及び下部の間のはめあいは、ねじ付ニップル、クリ ック止めジヨイント等を含む任意の他の周知のはめあい手段により行うことがで きる。

管ＩＯ全全体、遠心分離機の受容孔に対して、フランジ３２の底部を一方に片寄 せることにより、その操作中遠心分離機内に支持されるか、又はスペーサー及び ／又は相補的な形状のホルダーを含む任意の他の周知の手段により、遠心分離機 内に確保される。

別の態様において、図に示されていないが、上部容器２ｏ及び下部容器３０は、 同じ直径のものでもよく、その場合それらは同じ中心軸に沿って互いに確実に、 しかし除去可能に固定されなければならない。

操作中、以下に詳述されるように、分離且つ採取又はアッセイされるへきＤＮＡ 又は他の生物学的物質を含むゲル、ブロス又は溶液は、これら流体を液化するの に必要な物質（もしあるならば）と共に、上部容器２０に加えられ、それは次に 又は前辺って下部容器３０にはめあわされる。遠心分離管ｌＯ全全体、次に周知 のやり方で遠心分離にかけられ、それは選択手段２１の孔を通過できるすべての 物質を拡散させる。分離又はアッセイされるべき所望の生物学的物質は、選択手 段２１内の結合部位に結合するようになり、一方残りの濾液、他の生物学的物質 及び分子（もしあるならば）は、下部容器３０の底部３４に集められる。遠心分 離後、選択手段２１及び結合した生物学的物質を含む上部容器２０は、下部容器 ３ｏから分離され、そして結合した生物学的物質は、下達するように周知のやり 方で溶離される。結合した生物学的物質の溶離前、例えば膜の洗浄は、余りに大 きくて膜２１を通ることができない物質の、すべての相の除去を生じさせるだろ う。

重要ではないが、選択手段以外の装置を形成するのに用いられる材料は、採取さ れるべき生物学的物質と反応又は結合しないもので必ずなければならず、そして ガラス又は金属、又はさらに望ましくはプラスチック、例えばポリエチレン（特 に高密度）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリテトラフ ルオロエチレン、メチル或いはポリメチルメタクリレート又は同様物（例えばＫ ｏｎｔｅｓ　Ｃｏ、、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、により市販されている、市販の遠心分離又はミクロ遠心分離管の製 造に用いられている）から製造される。ガラスに結合するＤＮＡの能力のため、 目的とする用途がシリカに結合するＤＮＡ又は他の同様な物質と一緒の時、この 物質から作られないことが望ましい。

本発明の好ましい態様において、生物学的物質が結合されるべき選択手段のマト リックス又はウェブは、最も好ましくは適切な厚さの膜の形の多孔性、望ましく は微孔性の物質であり、全体に一体的に分散した、好ましくは粒状の結合部位の 形の有機又は無機物を有する重合体状樹脂様のマトリックス、並びに孔のサイズ 分布が比較的不均一である、粒子と樹脂状マトリックスとの間、及び隣接する粒 子の間、並びに該樹脂状マトリックス内に形成された孔のネットワークよりなる 。本発明は、重合体マトリックスそれ自体が一体化した活性結合部位を含む選択 手段を含むが、この好ましい態様では、樹脂状マトリックスは望ましくは生物学 的物質又はそれらを含む液体混合物に対して、本質的に不活性でなければならず 、−刃孔は、採取される生物学的物質を保持するサイズでなければならないと同 時に、濾液を装置の脱着可能な下部に集めるように通過させるものでなければな らない。

この態様で用いられる膜のマトリックスを形成する重合体は、広く変化できるが 、望ましくは市販のポリ塩化ビニル、又はそれと少量のモノエチレン性単量体、 例えば酢酸ビニル、塩化ビニリデン、プロピレン、エチレン或いはこれらの混合 物との共重合体から製造される熱可塑性樹脂である。一方、マトリックスはポリ テトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）　、酢酸セルロース又は三酢酸セルロース 、ポリアミド例えばナイロン、ポリスルホン、硝酸セルロース、これらの混合物 或いはアロイ等のような材料から形成できる。しかし、一般に溶媒により容易に 可塑化されるか、又は熱又は圧力によりシンター可能であるか、又は前記のマト リックスから容易に得ることができ、そして本発明で用いられる条件下で化学的 、且つ物理的に安定な任意の熱可塑性樹脂も使用できる。

分散した粒状物は、好ましくは前述のようなシリカ又は、化学的に活性化された シリカ（望ましくは市販のシリカヒドロゲル又は沈降水和シリカの形）、又はセ ルロース、例えば微結晶セルロースであるか、所望の生物学的物質を総合且つ分 離するように働く、有機及び無機の他の選択された物質を含む。又、使用できる 粒状物の中に、無機の物質例えば水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム、二酸 化チタン、水酸化第一鉄、水和吸収粘土又はけい操上、ボラックス及びヒドロキ シアパタイト（これらの全てはＤＮＡと結合するのに用いられる）が含まれる。

一方、親水性及び疎水性の物質の両方を含む有機の物質、例えばヒドロキシエチ ルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、デキストラン、アルギン酸、アセ チルサリチル酸、ポリアクリレート／セルロースグラフト重合体、橋かけ結合ポ リアクリレート、コラーゲン、アガロース、キトサン、ヒドロキシ含有ガム、例 えばガラクトマンナン、グルコマンナン、β−１゜３−カードラン、コンニャク 及びこれらの混合物等の粒子が使用できる。

この記述の目的のために、ＤＮＡと結合する好ましい粒状物、即ちシリカは、特 にゲル例えばアガロースからのＤＮＡの採取を記述する時、以下に使用される。

例えばＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　（前出）参照。

選択手段の全重量に対する粒状物質の量は、重要ではないが、望ましくは１０− ９０％Ｗ／Ｗ、好ましくは４０−６０％Ｗ／Ｗの範囲である。

本発明の装置及び方法において、膜として使用できるその中に配合された好適な 粒子を有する一つの多孔性の物質は、１９７５年１月２１日にＢｒｕｃｅ　Ｓ、 Ｇｏｌｄｂｅｒｇに付与された米国特許第３８６２０３０号に記載され、その特 許は参考としてこの記述に引用される。その中に記載されたように、孔はマトリ ックスと粒子との間、そして粒子それ自体の間で樹脂状マトリックス内に形成さ れる。

これらの膜は、当業者に周知の種々のやり方で製造できる。従って、一つの好ま しい態様に従って、微孔性のミクロン以下の膜を形成する方法が前記の米国特許 第３８６２０３０号に開示され、それは以下の工程よりなる。

ａ１重合体状樹脂、無機又は有機の粒子（粒子は、重合体１部当り約１部〜重合 体１部当り約２部に及ぶ重量で存在する）、溶媒例えばシクロヘキサノン（重合 体１部当り約１．５部〜重合体１部当り約３部に及ぶ重量で存在する）、並びに 非溶媒（好ましくは水）（溶媒の量の約１〜約１．３倍に及ぶ重量で存在する） の混合物を含む組成物（溶媒は、全組成物の少なくとも３０重量％を占める）を 形成する工程。

ｂ、実質的に平らなシートよりなる膜を形成するために、室温又はそれ以上で該 組成物を押出し又は成形する工程。

Ｃ，シート中の溶媒を抽出媒体により置換するために、抽出媒体中に平らなシー トを通す工程。

ｄ、該シートから該抽出媒体を除く工程。

この方法により製造される一つの代表的な膜は、ＭＰＳ　（商標）膜（ＦＭＣＣ ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ。

Ｐａ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）であり、それは７０〜８０％の範囲の多孔度容積を有す る微孔性のポリ塩化ビニル・シリカシートである。水銀侵入孔度測定により測っ て、孔のサイズは０．２μｍ〜２．０μｍの範囲にある。支持体は、非常に親水 性であり、正に変化できる負の電荷を有し、そして８０ｍ２／Ｈの表面積を有す る。この物質は通常の条件下で非圧縮性であり、水蒸気で滅菌可能であり、そし て０．４５ｇ／ｃｍ’の低い乾燥密度を有する。活性部位は、シリカ付着化学的 作用を経て有機官能性を付与する多孔性のマトリックス内に含まれるシリカに帰 因する。その上、このＭＰＳ膜は、例えば少な（とも約２６０μｇ／ｃｍ”のＤ ＮＡ総合能力を有することが分かった。

上記の膜に加えて、本発明では又ここに参考として引用される米国特許第４３７ ３５１９号（３−Ｍ　Ｃｏｒｐ、Ｍｉｎｎｅａｐ。

１　ｉｓ、Ｍｉｎｎ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）に記載されたようなポリテトラフルオロエ チレン（ＰＴＦＥ）フィブリルマトリックスを有する成る膜も又使用できる。

シートの形のこれらの膜は、以下よりなる。

ａ、ポリテトラフルオロエチレンフィブリルマトリックス及びす、該マトリック スの網目にからませたＰＴＦＥＩ重量部当り０．５〜１０部の親水性の吸収性粒 子（吸収性粒子は、乾燥粒子１ｇ当り０．５ｇより多い水の吸収性容量を有する ）。

この膜を製造するのに親水性の粒子は、ＰＴＦＥエマルションに配合されてペー ストを形成し、それは大きな応力にかけられて、ＰＴＦＥをフィブリル化し、そ して粒子をフィブリルマトリックスの網目にからませる。ＰＴＦＥをフィブリル 化する多くの方法があり、そして殆ど全ての非シンター法が本発明の複合体を製 造する方法に適用可能である。しかし、最も好適なのは、Ｒｅｅらの米国特許第 ４１５２６６１号に記載されたものである。

基本的にフィブリル化は、水膨潤粒状物質及びＰＴＦＥ粒子のペーストの形成、 ５０°Ｃ以上の緊密な混合、二軸カレンダー及び乾燥工程を含む。これは、約０ ．０２５〜０．５ミクロｍの範囲の厚さを有するＰＴＦＥフィブリルを有する膜 をもたらす。

吸収剤タイプの粒子のサイズは、乾燥した時ｏ、１〜３００ミクロｍの広い範囲 内にある。好ましくは、親水性の重合体吸収剤の粒子のサイズの範囲は、１．０ 〜８ｏミクロｍである。粒子は、乾燥粒子１ｇ当り０．５（即ち０．５〜４０ｇ の範囲）の水の吸収容量を有する。

ＰＴＦＥ膜用の親水性吸収剤は、アルギン酸、ポリアクリレート・セルロースグ ラフト共重合体、コラーゲン、キチン、キトサン、粘土、カゼイン、ツエイン。

デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、澱粉、変性澱粉、ヒドロキシエ チル澱粉、加水分解ポリアクリロニトリル、酸析・メタクリロニトリル重合体、 ポリアクリルアミド、加水分解ポリアクリルアミド（Ｄｏｗ　ＣｈｅｍｉｃａＩ 　Ｃｏ、、Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、がらの５ｅｐａｒａｎ　 （商りＡＰ−３０）、セルロース、カルボキシメチルセルロース、並びに前記の 物質の誘導体又は混合物よりなる粒子である。一つの好ましい物質は、乾燥物質 １ｇ当り２〜１０ｇの水の水吸収容量を有する橋かけ結合デキストラン誘導体で ある。満足しうる容積吸収は、０．１〜１０ｍｍの範囲、好ましくは０８２５、 　〜５ｍｍの範囲にある。

親水性の吸収剤粒子は、複合体の処理特性を改善し、そしてそれらの製造を助け るために、０．１〜１００ミクロｍのサイズに及ぶ不活性のより吸収性の低い希 釈粒状物と混合できる。希釈粒子の例は、粉末状重合体、例えばポリエチレン、 ポリプロピレン及びポリスチレン、並びに無機物例えばカオリン、タルク、シリ カ、ペンナイト及びバーミキュライトを含む。

このＰＴＦＥ膜中の粒状物質は、全組成物（その５０％以内は不活性希釈粒子で ある）の４０〜９０重量％、そして好ましくは８０〜９０重量％に当たる。全粒 状物の最も好ましい量は、約８５重量％である。

選択的にＤＮＡ等と結合する部位を含む追加の多孔性の膜は、Ｊ。

Ｔ、Ｂａｋｅｒ　Ｃｏ、（Ｓａｒｇｅｎｔ−Ｗｅｌｃｈ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 　Ｃｏｍｐａｎｙ、５ｋｏｋｉｅ、１１１．、Ｕ、Ｓ。

Ａ、により販売）により製造されたシリカに基づくマトリックスを含む。マトリ ックス、例えばこれらシリカゲルを含むＥ−ＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｐｅｃ ｉａｌｔｉｅｓ（Ｃａｒｌｉｓｌｅ。

Ｐａ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）からのボロシリケートガラスミクロフィルタ ーも又本発明の装置及び方法にうまく使用できる。

前述のように、本発明は一つの好ましい態様において、好ましくはシリカ含有膜 である前述の多孔性の選択手段を含む背中で液体化したゲル又は同様な物質を遠 心分離し、それによりＤＮＡを膜に結合し、一方残りの濾液は膜を通過し、そし て溶離により膜から濃縮したＤＮＡを採取することにより、ゲルからＤＮＡを採 取する方法を含む。さらに特に、電気泳動クロマトグラフィ法からのＤＮＡ含有 ゲルが前記のように処理される時、方法か１種以上のカオトロピック塩、即ちア ガロース又は同様な媒体への水の結合を切断し、従って結合部位へのＤＮＡの結 合を増大する塩（Ｎａｒ、ベルクロレート、５ＣＮ−塩等のような塩、好ましく はＮａＩを含む）の存在下で行うのが必須である。

もし重要でな＋３れば、用いられる塩の量は、塩及びその溶解度に依存して広く 変化できるが、望ましくは処理されるゲル又は溶液の量に対して、一般に飽和に 近い、当業者に周知の高濃度で存在すべきである。

遠心分離後、その時ＤＮＡが膜に選択的に結合しているが、濾過可能な液体は、 捨てるために下部の容器中に膜に加圧下通過させ、そして全ての濾過できない不 溶性の物質が、膜の表面及び孔の上及び／又は中に集められ、膜は次に洗浄され てＮａＩ及び／又は濾過不可能物質を除き、そしてＤＮＡは水又は好適な低イオ ン度溶液、例えばトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｒＴｒｉｓＪ） により膜から溶離し、それからＤＮＡは次に例えば沈澱により、濃縮した形で採 取される。

溶離前ＮａＩ又は他のカオトロピック塩を除く洗浄工程を行うのに、洗浄溶液中 の塩の量は、結合したＤＮＡを洗浄して取り去らないように調節されるのが重要 なことである。これは、アルコール濃度の低い、しかも例えばＮａＣ１を用いる 高い十分なイオン度の緩衝溶液を用いることにより、容易に達成できる。この洗 浄工程後、ＤＮＡは次に望ましくは塩の濃度の低い分離緩衝溶液により溶離され る。いずれにせよ、これらの二つの段階のそれぞれにおいて、緩衝溶液の正確な 性質は、ＤＮＡ又は他の結合した生体分子の採取を最大にするために、当業者に より周知のやり方でｐＨ１塩濃度、アルコール濃度等について従来通り変化でき る。それ故、例えば実施例に示されるように、試薬の濃度における小さな変化は 、採取されるＤＮＡの量に顕著に影響する。

上記の結合、洗浄、溶離及び濃縮工程のそれぞれは、当業者に周知の技術を用い て行うことができる。一つの好ましい態様では、方法は前記の本発明の装置を用 いて、以下のプロトコールにより行うことができる。

１）ＤＮＡサンプルに飽和沃化ナトリウム２倍量（２０μりを加える（採取の研 究のため、概して１０μｌの容量で２μｇのＤＮＡが存在する）。もしサンプル が溶液のサンプルならば、それは一時にユニットに適用され、そしてもしサンプ ルがゲルのスライスならば、それは望ましくは２容量の飽和ＮａＩ溶液をゲルス ライスに加えること（もしＴｒｉｓ−硼酸項−ＥＤＴＡ　（ＴＢＥ）緩衝液が３ 倍容積の８　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１０４を用いるならば、ＥＤＴＡはエチレンジアミ ン四酢酸である）により、先ず溶解されなければならない。

５分間５５〜６０℃に加温することは、溶解を早める。（これは、Ｔｒｉｓ−酢 酸塩緩衝液系に働くが、もしＴｒｉｓ−硼酸塩緩衝液系が用いられるならば、ゲ ルは同様には溶解しない）。

２）サンプルを本発明の装置（ミクロ遠心分離管）に導入し、そしてそれを約６ ０秒間室温でそれをインキュベートさせる。

３）約１５〜３０秒間、ミクロ遠分離機中でスピンする。（ミクロ遠心分離管の 底部で通過物を集める）。

４）ユニットに各緩衝液を加え、そして工程３におけるようにそれをスピンする ことにより、水冷洗浄緩衝液（結合部位に結合したＤＮＡを保つのを助けるのに 用いられる、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０，５０％エタノール、及び２００ ｍＭ　ＮａＣ１）１００μｌずつで３回洗浄。（他の溶液、例えば８０％エタノ ールも又かなりうまく働く）。結合したＤＮＡを洗い流すのを避けるために、高 い十分なイオン度を保つのが重要である。

５）５５℃で真空デシケータ−又はインキュベーター中でインキュベートするこ とにより残存エタノールを除く。多くの用途にとり残存エタノールは問題ではな く、酵素系によるサンプルの次の処理を含む使用では、全ての残存エタノールの 完全な除去は重要である。

６）２０μｆのＴＥ（即ち１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０ ）を加え、１分間インキュベートし、次に新しい遠心分離管中でスピンする。第 二の２０μｌで方法を繰り返す。最初の溶離は、サンプルの約７０〜８０％を取 り出すように見え、一方採取は第二の溶離により約９０％に改善される。ここで 述べた容積は、最低の値であり、高いサンプルの濃度が重要でない時、さらに大 きな容積が使用できる。もし必要ならば、サンプルは次の処理前に、この点でエ タノールの沈＃（標準法）により濃縮できる。

実　施　例 以下の実施例は、本発明を説明する。

実施例１ ３″ＰｄＣＴＰにより末端ラベルされ、そしてＨｉｎｄｌｌＩ制限エンドヌクレ アーゼにより切断されたバクテリオファージラムダＤＮＡに、２倍量の飽和（８ ，０Ｍ）Ｎａ　Ｉ溶液を加え、得られた溶液をシリカ充填ポリ塩化ビニルＭＰＳ （商標）膜を含む、本発明による１、５ｍｌ容（ＳＰ　ＩＮＢ　ＩＮＤ　（商標 ））遠心分離管中で１３０００ｇで２分間室温で遠心分離し、シリカ対膜の重量 比は約５０＝５０である（ＳＰ　ＩＮＢ　ＩＮＤ及びＭＰＳは、ＦＭＣＣｏｒｐ 。

ｒａｔ　ｉｏｎ、Ｐｈｉ　Ｉａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、、Ｕ、Ｓ、Ａ。

の商標である）。

採取した膜を次に５０％エタノール、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ　ＮａＣ １及び１．０ｍＭのＥＤＴＡの洗浄緩衝液（ｐＨ７，２）により洗った。任意に この洗浄前に、膜は先ず膜の表面又は孔からすべての蛋白、ヌクレオチド又は同 様な不溶性性質を除くために、周知のやり方で逆洗浄される。

膜からの結合したＤＮＡの採取は、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８）及び １ｍＭ　ＥＤＴＡを含む低塩緩衝液５０μｌによりそれを溶離することにより達 成された。適用した放射能の測定は、以下の表に示されるように、ＤＮＡの９５ ％の採取を示した。

サンプル　２８８７５０　１００ 未　結　合　４１５０　１．　４ 洗浄（４Ｘ１００）　１３０００　４．５溶離（２５０μＩＩ＞　２７４３００ 　９５’ＣＰＭ＝１分当りのカウント。

前記のやり方により、しかし上記の３２ｐ末端ラベルしたＤＮＡの代わりに３１ Ｓ末端ラベルＤＮＡ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈ ｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌからの市販物）を用い、Ｓ−ラベル物質の約３５〜４０％ しか採取されなかった。採取におけるこの低下は、３″Ｓラベルそれ自体の存在 によるものと考えられる。これは、実施例１と同じやり方で２８３−及び３２ｐ −末端ラベルＤＮＡの混合物を実験し、２１ｐ−ラベルＤＮＡが９０〜９５％採 取されたことにより立証された。

実施例２ 実施例１の５ＰＩＮＢ　ＩＮＤ遠心分離管を用いて、線状化ｐＢＲ３２２ＤＮＡ を結合し、溶離した。一度ＤＮＡが結合すると、下記の表に示されるようにＮａ Ｃ１濃度及びエタノールの％を変えた緩衝液を用いて、遠心分離管の膜からＮａ 　Ｉ　（ＤＮＡ結合緩衝液）を洗い流した。

ＤＮＡ結合及び溶離について以下のプロトコールを用いた。

２μｇの線状化ｐＢＲ３２２ＤＮＡをユニット当りに加えた。ＤＮＡを２５μｌ ！ずつの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）により２回溶離し、そして採取し たＤＮＡを凍結乾燥し、５０１ｔｌ！の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）に 再懸濁した。次に再懸濁したＤＮＡを電気泳動し、そして標準ホトによるエチジ ウムプロミド染色ゲルの写真の比較により定量した。ニック翻訳を１反応当り５ ０μＣｉ（ミクロキュリー）のアルファー（”Ｐ）ｄＣＴＰ　（シチジントリホ スフェート）、４００Ｃｉ／ｍモルを用いてＢＲＬのＮ１ｃｋＴｒａｎｓｌａｔ ｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＢＲＬ　Ｃｏｒｐ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＯ，、Ｕ、 Ｓ、Ａ、）を使用し、周知の酵素ラベル化法により行った。

以下の表は、支持されたＮａＣ１及びエタノールの濃度を含む１０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓによる残存Ｎａｌの洗い流し後、ＳＰ　ＩＮＢ　ＩＮＤユニットからの線状化 ｐＢＲ３２２ＤＮＡの採取をリストしている。又、ニック翻訳されたＤＮＡにつ いて、コントロールの％としてｚｉｐの相対的挿入がリストされている。

表　■ １０ｍＭ　Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液　相対的挿入３ｔｐｍＭ　ＮａＣ１％ＥｔＯＨ溶 離したＤＮＡ％　（コントロールの％）′５０　５０　２５　ｘｘ’ ａ、コントロールは、８ｘｌＯ’ｃｐｍ／μｇにラベルされたニック翻訳線状化 ｐＢＲ３２２ＤＮＡであった。

ｂ２ニック翻訳を行うには、不十分なりＮＡが採取された。

上述から最良の採取は、ＮａＣ１を含まず８０％及び７０％のＥｔＯＨを含む緩 衝液を用いる洗浄により得られ（それぞれ１００％及び７５％の回収率）、次に 良い溶離は、２００ｍＭ　ＮａＣ］　（６０％）より１００ｍＭ　ＮａＣ１（７ ５％）について得られ、即ち洗浄緩衝液として５０％ＥｔＯＨを用い、モしてＮ ａＣ１濃度を半分にすることにより、ラベルしたＤＮＡの特異的活性において顕 著な増大が得られ、２００ｍＭ　ＮａＣ１によるコントロールの１８％対１００ ｍＭ　ＮａＣ１によるコントロールの５４％。

実施例３（比較） それらが本発明で規定された選択手段の代わりに、濾過膜を用いた以外は、その 物理的構造が実施例１及び２で用いたものと非常に似ていた２本の市販の遠心分 離管を、本発明の装置と比べて、ＤＮＡを含む溶液からＤＮＡを採取する際のそ れぞれの有効性をめた。

以下の例において、微孔性膜含有管（０，４５μｍ　Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜を有す るＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（商標）−ＭＣ，Ｍｉ　１１１ｐｏ ｒｅ　Ｃｏｒｐ、、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭａＳＳ、）及び超濾過膜含有管（３００ ＯＮＭＷＬ　（ノミナル分子量）ＰＴＴＫポリスルホン膜を有するＭｉｌｌｉｐ ｏｒｅ　ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ　（商標）−ＭＣ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ 、）を、実施例ＩのＭＰＳ膜含有装置（ＳＰ　ＩＮＢ　ＩＮＤ）と比較した。

２倍量（２０μりの飽和沃化ナトリウムを、制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＥ　 ＩＦにより消化した、バクテリオファージラムダＤれている三つのユニットのそ れぞれに加え、１分間室温でインキュベートした後、ユニットを３０秒間ミクロ 遠心分離機中でスピンした。通過物の１０μｌをゲル電気泳動による次の分析に 採った。膜をＩ００μｆずつの水冷洗浄緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８， ０，２００ｍＭ　ＮａＣ１，５０％エタノール）により２回洗った。第一の洗浄 液の１５μｌを、後のゲル分析に保存した。残存エタノールを５５℃のインキュ ベーションにより除いた。４０μｌの低塩緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｍＭ 　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，０）を次にユニットに加えた。１分間のインキュベート後 、ユニットを遠心分離して、ユニットから（少なくともＳＰ　ＩＮＢ　ＩＮＤユ ニットから）ＤＮＡを溶離した。２μｌを後のゲル分析のために採った。

サンプルをＩＶ／ｃｍの電圧勾配で１％Ｓｅａ　Ｋｅｍ（商標）ＬＥアガロース ゲルで一晩処理した。ゲルの分析は、ＳＰ　ＩＮＢ　ＩＮＤユニット及び超フィ ルターを有するユニットの両者は、添加からの通過物中の物質が非常に少ないこ とを示すことを明らかにした。

微孔性の膜を有するユニットは、殆ど全てのＤＮＡが最初のスピンで通過するこ とを示した。洗浄工程からのサンプルは、検出可能な量のＤＮＡを含んだ洗浄液 のみが、微孔性膜からのものであったことを示した。溶離工程からのサンプルは 、５ＰＩＮＢＩＮＤユニツトに結合していたＤＮＡが事実溶離し、そして少量の ＤＮＡが超濾過膜の回りに漏れたことを示した。基本的に結果は予想された通り であり、従来の技術の装置では、ＤＮＡは一度に膜を通過したか、又は膜により ブロックされたかの何れかであった。何れの場合でもＤＮＡは、ＳＰ　ＩＮＢ　 ＩＮＤユニットの場合におけるようには、ＤＮＡは特異的に結合していなかうた 。

ｍ　Ａｍ”””　”’　ＰＣｒ／ＬＩＳ９０１０６２８６

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．閉じた底部を有する円筒状のハウジング、並びにハウジングの中心軸を横切 る内部の平面を完全に充たすその中に位置する、所望の生物学的物質を結合可能 な多孔性の選択手段を特徴とする遠心分離管。
2. ２．該ハウジングは、離脱可能に下部の容器に結合した上部の容器よりなり、そ して前記の多孔性の選択手段は、上部の容器の底部よりなることを特徴とする請 求項１の遠心分離管。
3. ３．前記の上部の容器は、前記の下部の容器と同軸であって、しかも少なくとも 一部その中に位置することを特徴とする遠心分離管。
4. ４．該ハウジングは、所望の生物学的物質と非反応性の物質よりなることを特徴 とする請求項１の遠心分離管。
5. ５．前記の多孔性選択手段は、所望の生物学的物質を結合できる部位を含む多孔 性膜よりなることを特徴とする、請求項１の遠心分離管。
6. ６．選択手段は、注型重合体状微孔性膜であることを特徴とする、請求項５の遠 心分離管。
7. ７．選択手段は、粒状物を含む多孔性の膜よりなる複合体であることを特徴とす る、請求項５の遠心分離管。
8. ８．結合部位は、化学的に変性された結合部位であることを特徴とする、請求項 ５の遠心分離管。
9. ９．化学的変性は、該粒状物ヘの生物学的分子の付着を含むことを特徴とする請 求項８の遠心分離管。
10. １０．分子は、蛋白分子又はデスオキシリボ核酸であることを特徴とする、請求 項９の遠心分離管。
11. １１．蛋白は、抗体、抗体結合蛋白、レクチン又は酵素であることを特徴とする 、請求項１０の遠心分離管。
12. １２．該膜は、少なくとも１種の重合体状プラスチックのマトリックスよりなる ことを特徴とする請求項５の遠心分離管。
13. １３．該プラスチックは、ポリ塩化ビニル、塩化ビニルとそれより少ない量の酢 酸ビニル、塩化ビニリデン、プロピレン、エチレン又はこれらの混合物との重合 体、ポリテトラフルオロエチレン、酢酸セルロース、三酢酸セルロース、硝酸セ ルロース、ポリスルホン、ポリアミド又はこれらの混合物又はアロイであること を特徴とする、請求項１２の遠心分離管。
14. １４．結合部位は、該プラスチックと化学的に一体となっていることを特徴とす る、請求項１３の遠心分離管。
15. １５．該結合部位は、膜内に固定的に配合された無機物又は有機物よりなること を特徴とする、請求項５の遠心分離管。
16. １６．有機物は、親水性又は疎水性の有機粒状物であることを特徴とする、請求 項１５の遠心分離管。
17. １７．粒状物は、化学的に変性されて、該結合部位を生成することを特徴とする 、請求項１５の遠心分離管。
18. １８．化学的変性は、該粒状物ヘの生物学的分子の付着を含むことを特徴とする 、請求項１７の遠心分離管。
19. １９．分子は、蛋白分子又はデスオキシリボ核酸であることを特徴とする、請求 項１８の遠心分離管。
20. ２０．蛋白は、抗体、抗体結合蛋白、レクチン又は酵素であることを特徴とする 、請求項１９の遠心分離管。
21. ２１．前記の変性は、粒状物ヘのイオン性基又は親水性基の付加よりなることを 特徴とする、請求項１７の遠心分離管。
22. ２２．該結合部位は、シリカ、水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム、二酸化 チタン、水酸化第一鉄、水和吸収粘土、珪藻土、ボラックス、ヒドロキシアバタ イト又はこれらの混合物よりなる無機の粒状物であることを特徴とする、請求項 １５の遠心分離管。
23. ２３．該結合部位は、徴結晶セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロ キシメチルセルロース、デキストラン、アルギン酸、アセチルサリチル酸、ポリ アクリレート／セルロースグラフト共重合体、橋かけ結合ポリアクリレート、コ ラーゲン、アガロース、キトサン、ヒドロキシ含有ガム又はこれらの混合物より なる有機の粒状物であることを特徴とする、請求項１５の遠心分離管。
24. ２４．該結合部位は、リガンド又はそれに結合したリガンドで終わるスペーサー を有し、該リガンドは、所望の生物学的物質を結合できる１個以上の部位を有す ることを特徴とする、請求項８の遠心分離管。
25. ２５．該結合部位は、それに結合した少なくとも１種のイオン交換樹脂を有し、 該樹脂は所望の生物学的物質と結合できることを特徴とする、請求項８の遠心分 離管。
26. ２６．該結合部位は、該生物学的物質を離脱可能に結合できる分離及び精製装置 を特徴とする、請求項５の遠心分離管。
27. ２７．該結合部位は、所望の生物学的物質がそれに結合した時、活性化される指 示ラベルをさらに含むことを特徴とする、請求項５の遠心分離管。
28. ２８．選択手段は、その中にシリカを一体的に組合せた徴孔性ポリ塩化ビニル膜 よりなるデスオキシリボ核酸選択手段であることを特徴とする、請求項１又は２ の遠心分離管。
29. ２９．シリカは、それヘ所望の生物学的物質を結合させるように、化学的に活性 化されていることを特徴とする、請求項２８の遠心分離管。
30. ３０．選択手段は、親水性の吸収性粒子を含むポリテトラフルオロエチレンフィ ブリルマトリックスであることを特徴とする、請求項１の遠心分離管。
31. ３１．所望の生物学的物質を含む液体から、所望の生物学的物質を選択的に分離 し、且つ採取する方法において、該液体を請求項１で規定した遠心分離管中で遠 心分離し、該管の選択手段から該生物学的物質を採取することを特徴とする方法 。
32. ３２．所望の生物学的物質を含む液体から、所望の生物学的物質を選択的に分離 し、且つ採取する方法において、該液体を遠心分離管中で遠心分離し、該管は分 離可能な上部の容器及び底部の容器に分けられ、該上部容器の底部は、濾液を通 過させつつそれヘ所望の生物学的物質を選択的に結合できる多孔性の選択手段よ りなり、それにより該生物学的物質を選択手段に結合させ、そして結合した生物 学的物質を溶離により選択手段から採取することを特徴とする方法。
33. ３３．所望の生物学的物質を含む液体から、所望の生物学的物質を選択的に分離 し、且つ採取する方法において、該液体を遠心分離管中で遠心分離し、該管は分 離可能な上部の容器及び底部の容器に分けられ、該上部容器の底部は濾波を通過 させつつ、それヘ所望の生物学的物質を選択的に結合できる多孔性の選択手段よ りなり、それにより選択手段の表面の上又はその孔中に未結合生物学的物質より なる第一の相、選択手段に結合した生物学的物質よりなる、第二の相及び下部の 容器中の全ての濾液よりなる第三の相を形成し、そして結合した生物学的物質を 溶離により、選択手段から採取することを特徴とする方法。
34. ３４．遠心分離管は、請求項５に規定されているようなものであることを特徴と する請求項３１の方法。
35. ３５．遠心分離管は、請求項５に規定されているようなものであることを特徴と する請求項３２の方法。
36. ３６．遠心分離管は、請求項５に規定されているようなものであることを特徴と する請求項３３の方法。
37. ３７．遠心分離管は、請求項８に規定されているようなものであることを特徴と する請求項３１の方法。
38. ３８．遠心分離管は、請求項８に規定されているようなものであることを特徴と する請求項３２の方法。
39. ３９．遠心分離管は、請求項８に規定されているようなものであることを特徴と する請求項３３の方法。
40. ４０．該液体は、デスオキシリボ核酸を含む液体化アガロースゲルよりなり、方 法はカオトロピック塩の存在下で行われることを特徴とする、請求項３１の方法 。
41. ４１．カオトロピック塩は、沃化ナトリウムであることを特徴とする請求項４０ の方法。
42. ４２．選択手段は、デスオキシリボ核酸、ラジオラベルしたデスオキシリボ核酸 又はリボ核酸、蛋白又はニッタ翻訳生成物を選択的に結合できる結合部位をその 中に一体的に組合せた多孔性の膜であることを特徴とする、請求項３１の方法。
43. ４３．結合部位は、シリカ、水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム、二酸化チ タン、水酸化第一鉄、水和吸収粘土、珪藻土、ボラックス、ヒドロキシアパタイ ト又はこれらの混合物よりなる無機の粒状物であることを特徴とする、請求項４ ２の方法。
44. ４４．結合部位は、微結晶セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキ シメチルセルロース、デキストラン、アルギン酸、アセチルサリチル酸、ポリア クリレート／セルロースグラフト共重合体、橋かけ結合ポリアクリレート、コラ ーゲン、アガロース、キトサン、ヒドロキシ含有ガム又はこれらの混合物よりな る有機の粒状物であることを特徴とする、請求項４２の方法。
45. ４５．選択手段は、注型重合体状微孔性膜であることを特徴とする請求項３１の 方法。
46. ４６．結合部位は、化学的に変性された結合部位であることを特徴とする請求項 ４２の方法。
47. ４７．選択手段は、その中にシリカを一体的に組合せた微孔性ポリ塩化ビニル膜 よりなるデスオキシリボ核酸選択手段であることを特徴とする、請求項３１の方 法。
48. ４８．シリカは、それへ所望の生物学的物質を結合させるように、化学的に活性 化されていることを特徴とする請求項４７の方法。
49. ４９．生物学的物質は、未ラベル又は２２Ｐ−ラベルＤＮＡであり、選択手段は シリカ充填ポリ塩化ビニル膜であることを特徴とする、請求項３１又は３２の方 法。