JPS6339895A - 液体支持体を用いるバイオアフイニテイ−およびイオン交換分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアフイニティおよびイオン交換による分離の実
施に関し、そしてより詳細にはパーフルオロカーボン故
に基づく液体支持体を用いるバイオファ二ティおよびイ
オン交換による分離の実施および特異的な結合性および
イオン性反応を介する分子の捕捉へのそれらの使用に関
する。

アフイニテイ分離は１つの分子の、もう一つの分子によ
る特異的な結合を用いることにようなされるすべての分
離として定義されうる。バイオアフイニテイ分離はアフ
イニテイ分離においてそのアフイニテイ反応に関与する
成分の一つが生物学的に活性であるかま念は生物学的に
重要であるアフイニテイ分離として定義される＠バイオ
アフイニテイ分離は一般に結合対の一方の成分としてタ
ンパク質または核酸のような生物学的巨大分子の少くと
も１種を包含する。かかるバイオアフイニテイ結合対の
例をあげれば、抗原−抗体、基質−酵素、エフェクター
−酵素、阻害剤−酵素、相補性核酸ストランド、結合タ
ン／ζり質−ビタミン、結合タンパク質−核酸、反応性
色素−タンパク質、反応性色素−核酸その他である。リ
ガンドおよび結合剤なる用語は特異的なバイオアフイニ
テイ結合対における２つの構成分を表わすのに使用され
る。この種の特異的な結合は２徨の溶媒間の溶質の分配
とは別個のものである。かかる分配は親水性または疎水
性考察に基づくものであって、例えば溶媒抽出、高性能
液体クロマトグラフィーおよびガス液体クロマトグラフ
ィーがそうである。

アフイニテイ分離は一般にリガンドまたは結合剤で誘導
体形成された固形支持体の使用を必要とすると考えられ
ている。これらの分離法はバッチ法またはクロマトグラ
フィー法として構成され、後者が一般に好ましい。アフ
イニテイクロマトグラフイーはよく知られておりそして
例えばＣ、Ｒ，Ｌｏｖ６１氏のｒＡｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ　ｔ。

Ａｆｆｉｎｉｔｙ　　ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＪ
　　Ｎｏｒｔｈ　　Ｈｏ１ｌａ！１ｄＰｕｂユｉｓｂｉ
ｎｇ　　Ｃｏｍｐａｎｙ　　出版ＡｍＳｔｅｒｄａｍ、
Ｎｅｗ　　Ｙｃｒｋ（ｊ９７８年）に概説されている。

Ｌｏｗｅ氏はアフィニテイ分離に使用される固形支持体
く望ましい特性について記載している。Ｌｏｗｅ氏によ
れば、固形支持体は大きな分子を均一にそして害されず
に導入および排出せしめかつリガンドを固定するための
大きな表面積を提供する之めにゆるい、多孔質の網目を
形成すべきであり、化学的に不活性でかつ物理的化学的
に安定であるべきであシ、そして支持体は次にリガンド
が安定した結合ができるように官能化できねばならない
。

さらに、粒子は良好な液体流れ特性を確保するために均
一で原形でかつ硬質でなければならないＯ アフイニテイクロマトグラフイーに適する支持体物質の
一覧表は広範囲であり、ここでは概括しない（Ｌｏｗｅ
氏の１９７８年の部分的列挙を参照されたい）。一般に
所定の支持体がすべての前記目標を達成するのは不可能
である。一つの妥協は表面績の大きい多孔質支持体例え
ば多孔質ガラスまたは多孔質ポリアクリルアミドビーズ
の使用に明らかに見てとれる。この独の支持体はこれら
支持体中の通路が曲が９くねっておりそして管路末端に
デツドスは−スがあるゆえに不純物質の洗去が困難であ
るという欠点を有する（Ｅｖｅｌｅｉｇｈ、ｒＪｎｕｎ
ａｌ　ｏｆ　ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＪ１５９．
１２９〜１４５（１９７８））。多孔質支持体のもう一
つの欠点は表面積の全部を大きな巨大分子が利用できる
わけではないという点である。すなわち、細孔寸法は巨
大分子が入り込むには／」・さ過ぎ、それにより有効表
面積および容量が限定されることもあＱうる（Ｚａｂｏ
ｒｓｋｙＪＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉ−ｃａｔ
ｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍ
ｅｓ　ａｎｄ　ＰｒｏｔｅｉｎｓＪｌ　、４１　＋Ｅｄ
、Ｃｈａｎｇ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ（１９７７）
）。

標準的な固形支持体アフイニテイクロマトグラフィーの
もう一つの実際上の欠点は、カラムの適用端で結合部位
が標的結合剤分子で充填されるに伴いカラムの効率が低
下することである。

そこで結合剤はカラムをさらに流下して遊離のリガンド
を見つけ出さねばならず、それゆえ結合前に標的が溶離
する確率が増大する。試料が新鮮な支持体に一定に露出
される向流クロマトグラフィーによりこの欠点が克服さ
れる。しかしながら、アフィニティ支持体はその支持体
がスラリーとして都合よくポンプ送シされないので一般
的にはかかる方法に用いられない。固形支持体は包装さ
れた床（例えばカラム）に使用するのに理想的に適して
いる。これらは良好に包装でき、多孔質フリット上に容
易に保持され、そして硬いので自己支持性である。しか
しながらそのものを輸送しようとする場合に問題が生じ
る。これらは流れの小さい領域で不可逆的に沈降し、閉
塞されると塊として固まり、そして粒子は相互の接触お
よび収容壁との接触により摩耗する傾向がある。粒子の
スラリーは低濃度では輸送でき念。しかしながらこれは
担体液の輸送をも要するので実際的でない。実際的な連
続システムを計画するに際しての主要な問題は一段階か
ら次段階に流体を持ち越すことなぐいかにして包装され
たスラリーを輸送するかである。シールまたは堰は摩耗
および不変に漏洩することをもたらすか、またはその内
部に沈降物が圧密されるゆえの失敗そして支持体の破砕
が速やかに明白となる。

固形支持体を用いる連続的なりロマトグラフイー分離は
、溶離液の下降カーテン中の固定した地点で試料を加え
、分能された成分を下方の周辺部の周囲で集める回転式
環状床を用いて可能と冷された。かかる装置は建設およ
び操作が煩雑であυそして床の本体（支持体）が分離に
使用されないという主要な欠点がある。さらに、溶出液
流れの均一な分配、密封および分離の最適化に関連する
問題により一般的利用が阻止される。

固形支持体のさらにもう一つの欠点はそれが試料からの
屑で詰まる傾向があることである。

これは生物学的試料からの細胞性情または他の源からの
物理的な屑でありうるが、しかしながら試料はカラムの
良好な流動特性を保つためにしばしば処理に先立ち濾過
する必要がある。

アフイニテイ分離はしばしば他の方法の構成部分を形成
する。その−例はへテロジニアスイムノアツセイにおけ
る使用である。ここではアフイニテイ分離は血清または
血漿のような複雑な混合物から被分析物を捕捉するのに
使用される。被分析物を捕捉したのち、不純物が洗い去
られそして任意の数のよく知られたアッセイプロトコル
を用いて被分析物が検出される。

この分野における通常の固形支持体のいくつかをろげれ
ば、プラスチック球（ビーズ）、プラスチック試験管の
内部、ミクロ力価プレートウェルの内部、磁性粒子、お
よび多孔質ガラス粒子である。これらの系の最大の欠点
は一般的に表面積が限定されていることで、それにより
容量および捕捉効率が限定される。このことが次に感度
（応答変化／濃度変化）および検出限界（最小検出濃度
）の限定をもたらすこととなる。

るる種の分離問題は液−液抽出により伝統的に処理され
てきた。例えば、精製された核酸を必要とする核酸ハイ
ブリッド形成によるアッセイにおいては、試料からのＤ
ＮＡまたはＲＮＡのような核酸を固形支持体に結合させ
る必要がある。

核酸がプローぺで探介されうるためには、（もし細胞内
にあれば）はしめ溶解によ多細胞から放出され、次に溶
解物から抽出されねばならない。最も普通の抽出法では
水性フェノール／クロロホルム混合物を使用している（
ＭａｎｉａｔＩＳ氏他、　　ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　
Ｃ１ｏｎ４ｎｇ：Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａ
ｎｕａｌＪｐｐ、４５８〜９．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

１９８２）。溶解物の大部分であるタンパク質は抽出を
妨害する傾向がある。核酸の抽出に続き、過剰の７エノ
ールをエーテルで抽出しそして次にエーテル蒸発させね
ばならない。次に核酸を含有する溶液を固形支持体への
沈漬に先立ち濃縮する（例えばＣｈｕｒ　ｃｈ氏他、ｒ
Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔ、Ａｃａｄ。

５ｃｉＪ　ＵＳＡ、８１，１９９１（１９８４））。こ
れは工程に沿って物質損失の機会の多い長たらしくてき
わどい方法である。

幾つかの液相アフイニテイ分配による分離が行われた。

Ｐ−Ａ　Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｐ氏のｒＰａｒｔｉｔｉｏ
ｎｏｆ　　Ｃ’ｅｌｌ　　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　　ａｎ
ｄ　　ＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓＪ。

ＡｌｍｑｕｉＳｔ　　ａｎｄ　　Ｗｉｋｓｅｌｌ、Ｅｄ
、：Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ。

（１９７１）Ｋはデキストランの水溶液とポリエチレン
グリコールの非混和性に基づく分配系の開発が報告され
ている。Ｓ、Ｄ、Ｆｌａｎａ、ｇａｎ氏他のｒｃｒｏａ
ｔｉａｎ　Ｃｈｅｍ、ＡｃｔａＪ　４７＋４４９（１９
７５）ではリガンドをポリエチレングリコールに付着さ
せ、かくして分離を推進させるための特異的な結合親和
性を付与することにより前記の系を親和性てよジ仲介さ
れた分離ができるように改良している。

この系は結合剤が、特異的な結合相互作用が起りつる前
にはじめにある程度リガンド含有相中に分配される必要
がめるという点で有用性が限定される。この系はパッチ
法にのみ応用でき、クロマトグラフィー法には応用でき
ないという点でさらに限定される。

パーフルオロカーボン乳濁液ばＫｅｅｓｅ氏他により報
告されるように細胞−基質相互作用の研究（で用いられ
てきた［ＪＰｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｊ
ＵＳＡ、凹、５６２２〜５６２６（１９８３））。足場
依存性細胞は伝統的に固形支持体上で生育するが、Ｋｅ
ｅｓｅ氏らはそれらが液体パーフルオロカーボンと組織
培養基との相境界で生育しうろことを示した。

Ｋｅｅｓｅ氏らはＲンタフルオロベンゾイルクロライド
のような表面活性化合物がかかる細胞の生育にとって有
効な表面を提供することを示し念。

しかしながら、酸ハライドと培養基中に存在する細胞ま
たはタンパク質との間に何の反応もないことを示す証拠
から、彼らはこのペンタフルオロベンゾイルクロライド
がパーフルオロカーボン液滴の表面で加水分解されてペ
ンタフルオロ安息香酸を生成すると推測した。さらに彼
らはその酸表面が液体パーフルオロカーボンａ面上に変
性タンパク質の層を沈積せしめて細胞の付着に適する表
面を提供すると推測した。酸クロライドーアミン基の反
応が存在しないことのもう一つの証明として、彼らはパ
ーフルオロベンゾイルクロライドを用いることなく水ま
たはエチレングリコールを含有する乳濁液を超音波処理
することにより細胞付着および増証させることができた
。ＫｅｅＳｅ氏らは未知の表面活性化合物がこの処理に
より形成されたと推測した。

アフイニテイ分離は強力な方法でらるゆえ、そして現在
入手しうる支持体が種々の欠陥を有するゆえに、改良さ
れた支持体が必要とされている。これらは下記の性質を
有するべきである。

すなわち、物理的および化学的に安定であること、化学
的に不活性であること、種々の生物学的試料と相容性で
あること、バッチ法およびクロマトグラフィー法および
向流型適用疋使用できること、表面積が高いこと、クロ
マトグラフィー適用において高い流速を許容しうろこと
、表面にリガンドまたは結合剤を容易で安定に付着させ
られること、捕捉した生成物を簡単に濃縮できること、
すべての分離法を容易に自動化しうること、および支持
体を簡単に効率的に再生しうろこと。

本発明の液体支持体はリガンドまたは結合剤が罹災に付
着される液体担体に基づくものでちる。液体担体は化学
的に不活性で、水非混和性で、水とはかなり異なる比重
を有し、そしてリガンドおよび結合剤に対する非特異的
結合が低い。

バイオアフイニテイ分離を実施する方法は、１）液体担
体の乳濁液の液滴表面上にリガンドまたは結合剤を付着
させることにより液体支持体を形成させる工程、および ２）前記液体支持体を用いて、担体に付着したリガンド
または結合剤に対して相補的な標的結合剤またはリガン
ドを混合物から捕捉する工程、 からなる。

リガンドまたは結合剤は表面のイ３飾によりまたはリガ
ンドまたは結合剤の修飾により直接法または分配法で表
面に付着される。

本発明の液体支持体はバイオアフイニテイ分離を実施す
るに際して先例のない長所を提供するものである。本発
明の液体支持体には液体アフイニテイ支持体であること
に加え、電荷相互作用に基づく分離、例えば担体に付着
したリガンドが荷電した有機部分でありそして所望の生
成物のその環境からの分離が通常イオン又ｔヶ分離（ク
ロマドグ２フイー）と呼ばれる工程によるものである場
合の分５４１も包含されるので、本発明のバイオアフイ
ニテイ分離はかかるイオン交換分離を包含することが意
図されそして液体アフイニテイ支持体は液体イオン交換
支持体を包含することが意図される。液体アフイニテイ
支持体を用いる最大の長所である２点は、向流アフイニ
テイ分離が開発でき、そして捕捉された生成物が簡単に
濃縮できることである。その他の長所は分離工程が容易
に自動化できそしてクロマトグラフィー適用において流
速を高くできることである。本発明の液体支持体は、水
性ｆＲ境中で安定であること、水と非混和性であること
、水とかなシ異なる比重を有すること、好ましくは水よ
り重くて水性環境から容易に分離できること、天然のタ
ンパク負、核酸または生物学的試料の他の成分への非特
異的結合が低いこと、および生物学的試料中に存在する
関係外のすべでの溶質を溶解できないことなどのような
付加的な性質を提供するものである。

本発明の液体アフイニテイ支持体には担体および確実に
付着したリガンドまたは結合剤が包含される。バイオア
フイニテイ分離を実施するのに有用な担体は前記した性
質を有しておりぞしてそれには液体パーフルオロカーボ
ンｐ＝　（以下ＬＰＦと略記する）、炭化水素類および
シリコーン類が包含される。パーフルオロカーボンとは
その構造中にできるだけ高い割合または比較的高い割合
の弗素原子を含有する分子を意味する。

ＬＰＦは不活性で生物学的適合性を有することが知られ
ている。液体パーフルオロカーボンは抗生物質を含有す
る等張緩衝液中のパーフルオロカーボンの乳濁液の形態
で代用上液として使用されてきた（Ａｇａｒｗａ１氏の
ｒＤｅｆｅｎｓｅ　５ｃｉｅｎｃｅＪｏｕｒｎａｌＪ　
５０，５１〜５４（１９８０））。その使用はこれら乳
濁液中における酸素の溶解度の高さによるものでありそ
してパーフルオロカーボン液滴の表面修飾を何ら必要と
しない。しかしながらこれは乳欄液を安定化させるため
に燐脂質のような界面活性剤の存在を必要とする。ＬＰ
Ｆ類は水と非混和性でありそして親水性および疎水性溶
質のいずれをも非常に溶解し難い。種類としてはＬＰＦ
類は支持体を試料マトリックスから簡単に重力により分
離できる比Ｍ（約２）を有する稠密な液体である。

炭化水素類および７リコーン類は液体アフイニテイ支持
体における担体として機能するための要件に合致する他
の種類の物質である。

リガンドとは抗原、ハプテン、核酸、酵素基質、ビタミ
ン、染料、荷電した有機分子、またに酵素エフェクター
および阻害剤を含む他の小さな有機分子を意味しそして
結合剤とは抗体、酵素、核酸、結合タンパク質、結合タ
ンパク質の合成模造物例えばポＩＪ　リジンおよびポリ
エチレンイミン、または特異的な結合性またはイオン性
（電荷性）相互作用をしうる他の生物学的巨大分子を意
味する。

アフイニテイ支持体はリガンドま７’（は結合剤を担体
に確実に付着していなければならない。

確実に付着とはバイオアフイニテイおよびイオン交換に
よる分離に包含される工程の間残存できる一方でリガン
ドが担体表面上を二次元的に移動できる付着を意味する
。しかしながら、この付着は所望される場合、例えばリ
ガンド−結合剤接合体を生成することになる蒸発による
ような鎖線工程期間中、およびリガンドまたは結合剤の
パーフルオロ界面活性剤による競合的置換によるような
、担体の再生が所望される場合に可逆的である必要があ
ると予期される。これはリガンドまたは結合剤が精製さ
れた生成物を汚染しないため、また支持体の容！損失を
阻止するためにも必要である。固形支持体を用いた場合
はこれは通常リガンドまたは結合剤を支持体に共有的に
結合させることによりなされる。

リガンドまたは結合剤を確実沼付着させることに加え、
担体の一般的、不、活性性を変更しないことならびに非
特異的結合を増大させるかも知れない官能基を導入しな
いことが望ましい。さらに、独々のリガンドまたは結合
剤に応用しうる一般的方法を開発することが望ましい。

リガンドまたは結合剤を担体液滴の表面に付着させた液
体アフイニティ支持体を調製する方法の一つは直接法と
呼ばれる。この方法においては、可溶性の反応性、２−
フルオロ化化合物を含有するＬＰＦをリガンドまたは結
合剤の水溶液を用いて乳化する。ＬＰＦ中に溶解しうる
化合物は一般的に高い割合の弗素原子を含有するもので
ある。商業的に入手しつるパーフルオロアルキルおよび
パーフルオロアリール化合物が使用されつる。適当な反
応性の基はアフィニティクロマトグラフィーの分野の専
門家にはよく知られており、アミン基と反応性である基
が好ましい。適当な化合物の例にはペンタフルオロベン
ゾイルクロライド、パーフルオロオクチルクコライド、
およびパーフルオロオクチル無水物が包含される。次に
水溶液中の所望のリガンドまたは結合剤を反応性化合物
を含有する担体で乳化して反応性の基をリガンドまたは
結合剤上に存在するアミノ基（または他の適当な官能基
）と反応せしめる。

液滴表面上のパーフルオロ化された試薬の蛍がリガンド
または結合剤例えばタンパク質の最適な層を得るのに重
要であることが判明した。

試薬が多すぎるとタンパク質層が非常に厚く沈積して、
ゆがんでかつ剪断に対し感受性である液滴を生ずる。さ
らに、被覆が厚いとリガンドまたは結合剤の利用が非効
率的となる。試薬が少な過ぎると支持体の容量が低くな
り、これも望ましくない。本発明におけるパーフルオロ
化された反応性試薬の量の最適化は固形支持体で通常用
いられる結合試薬の最適化と同様であり、固形アフイニ
テイ支持体の調製における専門家によく知られている。

この方法において重要な因子は反応性試薬の加水分解に
対する感受性、反応混合物の−および露出される時間で
ある。

液体アフイニテイ支持体を調製する第２のそして好まし
い方法は分配法と呼ばれる。この方法と直接法との基本
的相異は、分配法においてはリガンドまたは結合剤が修
飾されてそれが担体液滴表面に選択的で親和性の高い（
安全な）結合ができる点にある。これをなす意味の−っ
は、表面への付着に先立ち、高度にフルオロ置換または
パーフルオロ置換されたリガンドまたは結合剤を含有す
る試薬を調製および精製することにある。幾つかのよく
知られた化学的方法が高度にフルオロ化された基をリガ
ンド丑たは結合剤に共有的に結合させるのに用いられう
る。

考慮されるべき因子は用いられるフルオロ化化合物の反
応性、反応媒体のｐＨ１反応の時間および温度である。

種々のパーフルオロカルボン酸の酸クロライド、無水物
およびイミダゾリドのような化合物、例えばパーフルオ
ロオクタノイルクロライド、Ａ−フルオロオクチルアセ
チルおよびプロパノイルクロライドおよびパーフルオロ
オクタノイルおよびパーフルオロオクチルプロ、６ノイ
ルイミダゾリドが本発明の液体アフイニテイ支持体の調
製にうまく使用された。イミダゾリド誘導体はその反応
性が低くてより反応を制御できるので好ましい。一般に
、この反応はリガンドまたは結合剤の水溶液を時間、温
度および…条件を制御してテトラヒドロフランのような
水混和性有機溶媒中に溶解されたフルオロ化された試薬
と混合することにより実施される。誘導体化されたリガ
ンドまたは結合剤は反応の副生物および有機溶媒からケ
゛ル濾過または透析により分離される。誘導体化の度合
いはトリニトロベンゼンスルホネート標識のような任意
の知られた方法により判定されうる。置換されたリガン
ドまたは結合剤はここで特異的なＬＰＦのような適当な
担体を用いて液体アフイニテイ支持体を形成させるのに
使用できる態勢となる。液体アフイニテイ支持体はパー
フルオロデカリンのようなＬＰＦを誘導体化されたリガ
ンドまたは結合剤の緩衝された浴液で乳化させてこれら
リガンドまたは結合剤を液滴表面上に分配させることに
より形成される。リガンドまたは結合剤はまた乳化剤（
界面活性剤）としても作用しそして吸着された層は再合
着を阻止する。

液滴表面への確実な付着を生ずるに必要な誘導体化（置
換）の度合いはツヤ−フルオロアンカー基（足場基）の
性質、ＩＪ　ｆｆンＰ上のアンカー基の空間的配置、リ
ガンドの寸法および性質。

および液体支持体の最終的な用途の如何に応じかなり変
動することが予期される。一般に、置換度が高ければ高
い程付着が強くなる。しかしガからこのことは立体的考
察ならびにすがンＰまたは結合剤の生物学的活性を保持
する必要により限定されうる。代表的なタンパク買上の
利用しうるアミノ基の約２０％上にアンカー基を置くこ
とが好ましいことが判った。もしグルコースオキシダー
ゼおよびウレアーゼのアミノ基の２０％をノや一フルオ
ロオクチルイミダゾリドで標識しても、これら酵素はそ
れらのもとの活性の実質上すべてを保有していることが
判明した。緩衝液で洗浄しても、酵素はパーフルオロデ
カリン液滴表面から洗去されるのに抵抗した。

液体支持体の第６の製法は分配法の変法である。この方
法においては、高度にフルオロ置換またはパーフルオロ
置換された部分と荷電した有機部分とを包含する試薬が
用いられる。高度にフルオロ置換または−４−フルオロ
置換された部分は疎水性部分として作用し一方荷電した
有機部分が親水性部分として作用して荷電性（イオン性
）界面活性剤を構成する。この水溶性または水混和性界
面活性剤が例えばＬＰＦと混合されうる。その結果、荷
電した有機分子（部分）がフルオロ置換された部分によ
り担体液滴の表面に確実に付着される。研究室において
は、混合は分液ロートまたはフラスコ中で行われうる。

うす巻きミキサーで攪拌することにより少量の液体支持
体が調製されうる。一般に、液体イオン交換支持体を形
成したのち、反応混合物を水または水性緩衝溶液で洗浄
して過剰のフルオロ界面活性剤を除去することができる
。とり込まれた界面活性剤により乳濁液が安定となり、
一方支持体が分離および抽出操作に用いられる場合に荷
電した部分であるリガンｒにより選択性が与えられる。

フルオロ置換された部分を有する荷電した有機分子には
ゾニル（Ｚｏｎｙｌ）■フルオロ界面活性剤（Ｅ、１．
ｄｕ　ＰｏｎＦＪｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏ
ｍｐａｎｙの登録商標）なる名称の下に入手しうる種類
の界面活性剤が包含される。これらにはＺｏｎｙｌ■Ｆ
ＳＰ　、　ＰＳＥホスヘート塩である［Ｆ（ＣＦ２ＣＦ
２）３．、−８ｃｕ２ｃＨ２ｏ）、、噸）（○−ＮＨ”
４）２，１；Ｚｏｎｙｌ■ＦＳＣサルフェート塩である
Ｆ（ＣＦ２ＣＦ２　）３−８ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＩ
（２Ｎ”（ＣＨｓ　’Ｉ　３−０８Ｏ２０ＣＨ３；等が
包含される。

ここに記載される方法は担体表面にリガンＰまたは結合
剤を付着させるのに良好な一般的操作を提供するもので
あるが、特定のりガンＰまたは結合剤に特定の操作方法
を用いる必要がありうる。かかる操作の一つは、ＩｇＣ
）クラスの抗体のＦｃ部分を高度にフルオロ化された試
薬を用いて特別に置換して抗体をＬＰＦの表面に特定の
方向で結合させることであろう。これにより抗体は乳濁
液の水性部分罠配向したその特異的な結合部分、すなわ
ちＦ（ａｂ）結合部位で付着されうる。かかる配向によ
りより効率的に抗体が使用できそして捕捉効率が高くな
ると予期される。

このことにより抗体のＦｃ部分を水相に接近できなくし
て混合物中に存在するかも知れないリウマトイｒ因子に
よる非特異的な結合による妨害も最小限に抑制されうる
。

前記した方法のいずれも本発明に使用できるが、分配法
が直接法に比べ幾つかの長所を有する。これらの長所に
は、より厳密な品質管理ができる液体アフイニテイ支持
体の個々の構成分の製法を提供できること、高価なまた
は希少のりガンＰまたは結合剤の最適な使用を促進でき
ること、単一のＩＪ　ｆｆンＰ層を創出して支持体上の
結合部位の立体障害を最小にできること、および各リガ
ンドまたは結合剤上に多数の結合部位を付与して液滴表
面上への結合をより強力にできること、があげられる。

液体アフイニテイ支持体中に存在する固有のリガンドま
たは結合剤の二次元的移動性によりジッパ−作用が起り
うるゆえに特にＤＮＡのような大きな巨大分子の場合に
もう一つの長所が提供されうる。ジッパ−作用とは標的
分子の種々の結合部位が液滴表面上の移動性結合部位に
逐次的に結合することを意味する。担体のそれぞれの逐
次的な部位へのかかる結合はＤＮＡと担体の結合部位と
の整列および次の結合部位への付着を促進する。これに
より大きくかつ場合によりもろい巨大分子の確実で、剪
断抵抗性のある捕捉が得られると予期される。このジツ
・ぐ−効果は固形アフイニテイ支持体では不可能であろ
う。

慣用の固形支持体に比較した液体支持体のもう一つの長
所は支持体の形成に使用された試薬を滅菌できることの
みならず汚染された支持体を再滅菌できることである。

後者のことは固形支持体では不可能である。リガンＰま
たは結合剤を担体に付着させる分配法が特に再滅菌し易
い。−４′−フルオロ誘導体化されたリガンドまたは結
合剤はノ９−フルオロ界面活性剤を用いて支持体から回
収できそして再付着に先立ち限外濾過により滅菌されう
る。

ＬＰＦ類は限外濾過または圧熱滅菌によっても滅菌され
うる。次に支持体は同じ成分を用いて再生されるかまた
は新鮮なＬＰＦで置換されうる。

それにより価値あるりがン？または結合剤が回収および
再使用されうる。ある種の支持体はそのりがンＰまたは
結合剤が適当な滅菌条件下に生物学的活性を保持できる
場合は成分を分離することなく滅菌することもできる。

これらの考察は肉体外車液処理、またはヒトに使用する
ための治療剤の製造のような適用にとって特に重要であ
る。

前記した液体アフイニテイ支持体の使用は慣用の固形ア
フイニテイ支持体の使用とは完全に相異する。液体アフ
イニテイ支持体は分離様式が選択できる。固形支持体は
一般に並行流れ操作に限定されるが、液体支持体は向流
様式または連続式マルチパッチ様式で操作できる。この
柔軟性ゆえに特定の分離法を用いる必要によるよりもむ
しろ系全体の必要性およびコントレインｈ　（ｃｏｎｔ
ｒａｉｎｔｓ）により支配される分離法が開発されうる
。分離された物質は解離剤の使用により’ｌ’ｔＥ体ア
フ・ｆニテイ支持体から回収されうる。

クロマトグラフィー適用においては、固形アフイニテイ
支持体は屑がカラムを閉塞させて高い背圧、流体流れ減
少そして一般的な操作効率の低下を惹起するのを阻止す
るためにｐ過した試料の使用を通常必要とする。液体ア
フイニテイ支持体はそれらの固有の変形性ゆえに閉塞に
対しては抵抗性を有する。さらに、変形性、柔軟性およ
び即座の形状回復々る固有の性質ゆえにこれら支持体は
固形支持体の場合に起こる閉塞や支持体の物理的摩耗の
懸念を伴うことなく１、）を通して容易に輸送されうる
。高濃度の液体アフイニテイ支持体を含有する乳濁液で
さえも容易に輸送されうる。

管中を好都合に輸送される能力ゆえに分離工程が容易に
自動化できるものとなる。標゛準的な２ンプおよびパル
プのみが必要とされ、そして多くの状況下では高濃度の
乳濁液がパルプとして効果的に作用するので、セレノイ
Ｐパルプすらも回避されうる。制限されたオリフィスで
は、稠密なＬＰＦに基づくスラリはオリフィスの通過に
抵抗しそして水性流れの通過を阻止し、一方乳濁液の通
過を制御しうる。乳濁液の流れはオリフィスの寸法およ
びこの絞りを横切る相対的な流体圧により容易に制御さ
れうる。

パッチ様式において液体アフイニテイ支持体を使用でき
ることもまた固形アフイニテイ支持体に比較した長所を
提供する。すなわち、支持体の密度が高いゆえに水相か
らの分離が速やかかつ簡単であり、支持体が非多孔質で
あるゆえに支持体の洗浄が簡単でかつ効率的であり、そ
して多孔質支持体の困難さまたは極度に小さい粒子の脆
さが回避される一方で支持体の表面積の高さを利用でき
る。

標準的な固相アフイニテイ支持体を用いた場合にはそれ
が再現可能にかつ一貫して輸送できないゆえに実施でき
危かった向流アフイニテイ分離が本発明のバイオアフイ
ニテイ分離法では利用できる。かかる分離は最大捕捉効
率を与えるものである、何故なら標的リガンｒまたは結
合剤が最も涸渇している試料流れの先端が残留標的分子
を捕捉する最大の能力を有する新しいアフイニテイ支持
体に対して常に露出されるからである。これは特に連続
法において用いられる場合に工程流れからの希薄な生成
物を収集するのに大いに有利に用いられうる。これら分
離のもう一つの長所は廃棄物の如き有害物質の試料流Ａ
１からの、噴少（（あり、これは肉体外血漿減少に分い
てなされねばならないことである。

本発明方法はまだいわゆる混合および沈降法においても
用いられうる。そこでは試料流れおよび液体支持体が混
合領域中で一緒にされそれにより標的物質が支持体によ
り捕捉されうる。

生成した乳濁液を次に沈降タンクに入れ、そこで稠密な
アフイニテイ支持体が沈下し、排出されて標的物質が最
終的に回収されそして支持体が再生される。この混合お
よび沈降法は簡単な連続的アフイニテイ分離法を提供す
るものである。

本発明の液体アフイニテイ支持体の特別な分析上の応用
の一つは溶液からのＤＮＡの捕捉への使用である。分配
法が液滴表面に付着したヒストンタン・ぐり質を用いて
液体アフイニテイ支持体を形成させるのに使用される。

ヒストンは細胞中でＤＮＡと相互作用してＤＮＡを緻密
な形に包む強く陽性に荷電したタンク４り質である。驚
くべきことに、／９−フルオロ−２−プチルテトラヒＰ
ロフランまたは他の担体の表面上に、修飾された仔牛胸
腺ヒストンを有する液体アフィニテイ支持体が水溶液か
らＤＮＡを捕捉しうろことが見出された。捕捉されたＤ
ＮＡ支持体複合物は蒸発により濃縮すると適当な膜に付
着しうるヒストン−ＤＮＡ複合物を生ずる。ここでもま
た、驚くべきことに、ＤＮＡのこの形が適当なプローペ
とのハイブリッｒ形成に適当であることが見出された。

この方法は現在の液−液抽出またはカラム溶離法よりも
優れており、この両方法は溶液から単離したのちＤＮＡ
をハイブリッド形成膜に適用する前に濃縮する必要があ
るのである。

前記した方法にピストンが使用されたが一方他のりガン
Ｐ例えば、ｔ？　ＩＪリジン、抗−ＤＮＡ抗体、または
相補性塩基配列のみを捕捉する特異的なオリゴヌクレオ
チド配列も用いられうる。

液体アフイニテイ支持体を使用する長所を示す他の分析
上の応用はイムノアッセイである。

かかるアッセイの一つけ着色が戸紙、多孔質膜、プラス
チック・ンｒルまだは他の固形物質の表面上に視認可能
状に検出されうる定性的酵素結合イムノソルベントアッ
セイＣＥＬＩＳＡ）である。このアッセイは定量的アッ
セイおよび色の他に他の検出可能なシグナルの使用に容
易に適合されうる。ＥＬＩＳＡの伝統的な形式において
は、多孔質支持体の使用によりイムノアッセイの着色し
た生成物が細孔の内側に捕えられることになり、従って
そのものが検出しうるシグナルを提供することへの寄与
を減少させている。また、着色した生成物がしばしば溶
液中に拡散して検出可能々シグナルをさらＫ［少させる
ことによりアッセイの明確な感度が限定される。これら
アッセイの明確な感度は本発明ので表体アフイニテイ支
持体を使用しそしてその支持体をアッセイの適当な段階
で蒸発させることにより、改善されうる。これは前記Ｄ
ＮＡアッセイについて記載された系と同様に被分析物が
捕捉されたのち、または着色生成物に変換される酵素基
質の添加直前に行うことができる。

液体支持体を蒸発させることの代替法は結合でれた標的
物質をリガン１４または結合剤から放出させることであ
る。修飾された仔牛ヒスト／を用いてＤＮＡを捕捉する
場合は、かかる放出は支持体の洗浄に用いられる緩衝液
の塩濃度を調整することにより達成されうる。抗体で被
覆された支持体上に抗原を捕捉する場合は、これは高声
緩衝液、緩和なカオトロピック試薬またはフルオロ界面
活性剤を用いてなされよう。

本発明の液体イオン交換支持体は液体アフイニテイ支持
体について前記したそれと同様に有用であるがイオン交
換の原理で操作される。

以下の実施例によりさらに本発明を説明する。

実施例　１ 液体アフイニテイ支持体の調製 直接法 ｐＨ９，２５の０．２Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液２５−
中に溶解した牛血清アルブミン（ＢＳＡ）　５００　Ｒ
９にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）　
２５ｗｊｐを加えることにより螢光標識された牛血清ア
ルブミン（ＦＩＴＣ−ＢｓＡ）を調製した。この反応混
合物を室温で３０分間攪拌しそして０．９％塩化ナトリ
ウム（標準食塩水）で平衡となしたＢｌｏ−Ｇｅ１■Ｐ
　−６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　
、　Ｒ１ｃｈｍｏｎｄ％ＣＡ）を含有する２５Ｘ２．２
鐸のカラムに適用した。ＦＩＴＣ−ＢＳＡはカラムの排
除量中に溶出され、未反応のＦＩＴＣ’は含有していな
かった。ＦＩπ−ＢＳＡを分光分析にかけると接合度は
ＢＳＡ　１モル当りＦＩＴＣ８，６５モルであることが
示された。

パーフルオロデカリン（Ｆｌｕｔｅｃ　ＰＰ５　、医薬
等級、ＩＳＣＣｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ、　、　Ａｖ
ｏｎｍｏｕｔｈ　、英国）中の（）９−フルオロオクチ
ル）アセチルクロライドであるＩＦ（、ＩＨ−）や−フ
ルオロデカノイルクロライド（Ｒｉｅｄｅｌ−Ｄｅ−Ｈ
ａｅｎａｇ、　５ｅａｌｚｅ−Ｈａｎｎｏｖｅｒ　、西
ドイツ）の溶液は次のようにして調製した。・（−フル
オロデカリン１−中に酸フロラ（Ｉ’２μｌを添加する
ことにより濃厚原液を調製した。パーフルオロデカリン
１ｄにこの原液０，０．２５．１．２５．２．５．５お
よび１０μｊを添加することによりパーフルオロデカリ
ン１１Ｌｔ当りｏ、　ｉ、５，１０．２０および４０μ
ｇの酸クロライＰを含有する操作溶液を調製した。必要
な容量を計算する場合酸クロライドに対し２１１／ｍｌ
なる密度が採られる。

液体アフイニテイ支持体の乳濁液は前記調製された操作
溶液各α１ｙＬｌを標準食塩水中のＦＩＴＣ−ＢＳＡ　
１ダ／！ｔのうずまき溶液１．〇−中に滴下することに
より調製された。１０〜１５秒間渦巻状に攪拌したのち
この乳濁液を撮動ミキサー上約３０分間穏やかに混合し
そして標準食塩溶液１ｄを用いて沈降させることにより
洗浄して未結合のＦＩＴＣ−ＢＳＡを除去した。標準食
塩水中各１ｄずつを用いて２回洗浄操作を反復した。

この乳濁液を・９−フルオロデカリン液滴の表面に包含
した螢光の存在だついて螢光顕微鏡下に検査した。螢光
量は用いられる酸クロライｒの濃度が高くなるに伴い大
きくなる。酸クロライドの濃度が２０および４０μ／ｌ
／ｍｌである場合。

液滴に幾分かのゆがみが明らかに存在する。対照操作溶
液、すなわち酸クロライＰなしのツク−フルオロデカリ
ンが用いられる場合は、かすかな螢光しか視察されなか
った。このことば液滴の表面には最小限の非特異的吸着
しか存在しないこと、およびより重大なことは、これら
の支持体の調製に本発明による方法が用いられなかった
場合は何ら液体アフイニテイ支持体が得られないことを
示している。

実施例　２ 液体アフィニテイ支持体の調製 直接法 ＦＩＴＣ’−ＢＳＡは実施例ＩＫおけると同様にして調
製した。一連の実験において、実施例１の操作で用いら
れる・ぐ−フルオロデカリンの代りに種種の液体・臂−
フルオロカーボンを、そして（パーフルオロオクチル）
アセチルクロシイＰの代りに種々の反応性化合物を用い
、他の９種の支持体を調製した。液体・母−フルオロカ
ーボンはパーフルオロトリッチルアミン、ツアーフルオ
ロ（テトラテカヒＰロファンスラレン）およびノぐ−フ
ルオロ−２−プチルーテトラヒドロフラン（すべてＳＣ
Ｍ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製品、Ｇａ１ｎａｓｖｉｌｌ
ｅ　、ＦＬ）であった。反応性化合物は・２−フルオロ
オクタノイルクロライｒ、ノナ−フルオロオクタン酸無
水物、およびノ４−フルオロベンゾイルクロライド（Ｓ
ＣＭ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製品、Ｇａ１ｎｅｓｖｉｌ
ｌｅ　、　ＦＬ）であった。

これら成分の全ての組み合わせから調製される乳濁液は
螢光面微鏡下に観察した場合明るい螢光層を生じた。反
応性化合物が包含されない対照実験ではかすかな螢光が
示されるのみだった。このことは種々の１夜体パーフル
オロカーボンおよび種々の反応性の／７−フルオロ化さ
れた化合物が直接法によりリガンＰを担体に付着させる
のに使用できたことを示している。

二官能性酸クロライｒであるパーフルオロスクシニルク
ロライＰが反応性化合物として使用された場合は、何ら
乳濁液は得られなかった。

むしろ架橋したｒル様物質が得られた。

実施例　６ 液体アフイニテイ支持体による抗体の捕捉ノ？−フルオ
ロトリブチルアミン１　ａｔ中にパーフルオロオクタノ
イルクロライｒ２．ｏμｌを添加することにより原液を
調製した。この原液１０μｌｋパーフルオロトリブチル
アミン１ゴで金沢することにより操作溶液を調製した。

この操作溶液０．１コを標準食塩水中のウサギ免疫グロ
ブリン（）　１１Ｎｉ／ｒＬｌのうずまき溶液中に滴下
した。約１５秒間渦巻かせたのち、この乳濁液を室温で
３０分分間中かに混合した。この乳濁液を標準食塩水中
各１−ずつを用いて３回洗浄した。

上澄み液体の大部分を除去しそしてＦＩＴＣ−標識され
アフイニテイｎ製されたヤギの抗つサギＩｇＧ抗体１．
５１１１Ｐ／ｄ５０μｌを液体アフイニテイ支持体の乳
濁液と１０分間室温で混合した。次にこの乳濁液を標準
食塩水溶液各１　ｍｌずつを用いて３回洗浄した。

同一の平行実験においては、標準食塩水洗浄溶液を１１
　ＢＳＡを含有する洗浄溶液で置換した。

得られる乳濁液の双方を螢光顕微鏡の下検査すると、液
滴を被覆する明るく、均一な螢光層を有することが判っ
た。このことは担体に付着したりガンＰがウサギＩｇＧ
である場合は、このものは適当な抗体によりかお免疫化
学的に識別されうることを示している。洗浄溶液中にＢ
ＡＡを含有または含有しない洗液で洗った試料の間に伺
らの差も認められないので、ＦＩＴＣ−標識された抗体
は少ししかまたは何ら非特異的に捕捉されなかったと見
られる。

実施例　４ 液体アフイニテイ支持体の調製および使用分配法 Ａ、　　ＣノＪ？−フルオロオクチル）プロパノイルイ
ミダゾリドであるＩ　Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ノ卆−フ
ルオロウンデカン酸イミダゾリＰは下記のようにして、
４１−フルオロオクチルプロノ９ン酸から調製された、
すなわち、乾燥ＴＨＦ　１５　ｒｕｔ中に（パーフルオ
ロオクチル）プロｉ４ン酸４．９１を溶解させ、そして
乾燥ＴＨＦ　３５　ｄ中のカルボニルジイミダゾールｔ
　ｓ　ｙの攪拌溶液中に室温で加えた。この反応混合物
を３０分間攪拌すると、その間に生成物が結晶化し始め
た。この混合物を氷水中で冷却しそしてガラスフリット
濾過用ロートで濾過した。結晶を氷冷ＴＥ（Ｆ約５０ゴ
で洗いそして乾燥空気流で乾燥した。（・９−フルオロ
オクチル）プロパノイルイミダゾリドの収量は３．８ｇ
、理論量の６８チであった。融点１２８℃。

ｐｉ（８，０の燐酸塩緩衝液中のアフイニテイ精製され
たヤギの抗ヒトＩｇＧ　（Ｔａｇｏ、　Ｂｕｒｌｉｎｇ
ａｍｅ　、　ＣＡ）の１　Ｗ／ｍｌ溶液６．０ａ／を氷
浴中で冷却した。この冷却溶゛液中に、　ＴＨＦ中の前
記のようＫして調製されり（・ンーフルオロオクチル）
フロノぐノイルイミダゾリＰの２０　ｍ４／ｒｎｌ溶液
１１．６　ｔｎｌを攪拌下に滴下した。この反応を継続
して攪拌しながら２時間進行させた。この反応混合物を
ｐＨ８，０の燐酸塩ａｍ液で平衡化したＢｌｏ−Ｇｅ１
■Ｐ　−６（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｏｏｒａｔｏｒｉｅｓ
　、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　、　ＣＡ）を含有する３×２
６副のカラムに適用した。／卆−フルオロアルキル化さ
れた抗体はカラムのボイド量中に溶出されそして総量約
２１罰中に集められた。その濃度は分光分析により測定
され（誘導体化について何ら補正せず）そして約ａ、１
７ｍｙｉ−であると判明した。反応の度合いは下記のよ
うＫして判定された、すなわち、反応混合物をトリニト
ロペ／ゼンスルホン酸を用いる標準操作により残留アミ
ノ基について分析した。ＸｇＧに付着したアンカー基の
廿は対照（イミダゾリドなし）とイミダゾｌ）　ｈ％を
含有する調製物との間の、存在する利用しうるアミノ基
の量の差から計算した。利用しうるアミンの反応チは２
５％であった。

Ｂ、ｐ）（８，０の燐酸塩緩衝液中の、前記工程図にお
けるようにして調製された（ノン−フルオロオクチル）
プロパノイル置換ヤギ抗ヒトＩｇ（）の０、１０　Ｗ／
Ｌｌ溶液５．　Ｏｙｔｌにノ９−フルオロデカリン０．
２５ｍ／を渦巻かせながら添加した。この混合物を１分
間渦巻状に攪拌させそして次に０．１％水性ＢＳＡ各３
　ｒｙｔｌずつを用いて３回洗浄した。

乳濁液液滴の表面上置結合したヤギの抗ヒトＬｇＧｆ、
（有するかくして調製された液体アフイニテイ支持体の
免疫化学的反応性および容量は以下のようにして測定さ
れた。すなわち、０．１％水性ＢＳＡ中のＦＩＴＣ−Ｉ
ｇ（）　（ＦＩＴＣ−標識されたヒトＩｇＣ）は実施例
１記載の操作により調製され、Ｉｇ（）１モル当り２．
５６モルのＦＩＴＣを有することが判明）３２６μｌ／
−溶液３．２ｄｔｌ−螢光測定に適する石英キュベツト
中に加えた。キュベツトに小さな磁気攪拌パーおよび支
持体５０μｌを加えた。キュベツ、トを１分間攪拌し、
１０分間沈降せしめそして上澄み液の螢光強度をその場
で測定した。

この正確な操作を１１回反復し、次に混合時間を５分間
に延長して反復しそして終りに混合時間を５０分に延長
して反復した。この操作期間中反志混合物を過度に光線
に露出させないように注意が払われた。上澄み液の螢光
強度は仁の過程全体を通して１実に減少していて、ＦＩ
ＴＣ−標識されたＩｇ（）が支持体により溶液から除去
されていることを示していた。この操作をＦＩＴＣ−Ｉ
ｇＧの１６３．８２および５３μｇ屓溶液６．２ゴずつ
を用いて反復した。その結果を以下の第１表にまとめる
。表からこの特定のＦＩＴＣ−ＩｇＧＫ対するこの支持
体５０μｇのおよその容量は１２１μｇであることが示
される。

第１表 １０６　　　　　　　　　　　５ろ 実施例　５ ＤＮＡ抽出 パーフルオロデカリンおよびヒストンニ基づく液体アフ
ィニティ支持体を実施例１記載の方法をわずかに修正し
て用いることＫより調製した。・ぐ−フルオロデカリン
中のノぐ−フルオロペンゾイルクロライｒ１ｏｏμＩ／
ｍｌ溶液を調製しそしてこの溶液０．１　ｍｌを燐酸塩
緩衝された食塩水中の仔牛胸腺ヒストンのＩ　Ｔｎ９／
ｒｔｔｔ溶液１１ｊｔｌの渦巻き液中に加えて支持体を
得た。

制限酵素ｎａｅｌｌを用いて標準的操作によりプラスミ
？ｐＢＲ３２２を消化した。受容されうる消化がなされ
たか否かは末端デオキシヌクレオチノルトランスフエラ
ーゼを用いる放射性燐標識されたＡＴＰでの末端標識化
、続く電気泳動およびオートラジオグラフィーによりフ
ラグメントを検出することによって示された。１３個の
異なる放射性フラグメントが観察され、このことは受容
されうる消化がなされたことを示している。

ｐＨ８，０の１１０Ｉｎトリス緩衝液中のｐＢＲろ２２
消化物２０　μｌを１ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐｉ（
８，０の１０ｍＭ　トＩＪス緩衝液１８０μｌと混合し
た。５μｇの試料をとり分けて対照として用いた。ＤＮ
Ａを抽出するには、５０μＩの沈降した支持体を残留物
に加えそしてこの混合物を３０分分間中かに揺り動かし
た。沈降後、上澄み液の試料５μ！をとり分けぞして残
る上澄み液を他の試該管に移した。

ｖｔだな支持体乳濁液を用いて抽出工程をさらに４回反
復した。

上澄み液試料を標準的操作により６〜アクリルアミ１゛
、７Ｍ尿素グル上の電気泳動により分析した。このｒル
を乾燥しそしてＫＯｄａｋ　）（ＡＲ−５フイルム上で
約４８時間オートラジオグラフィーしフィルムを商業的
な処理装置で現像した。

オートラジオグラフを検査するとかなりの量の標識され
た核酸がヒストン被覆された支持体により吸着されたこ
とが示された。比較的分子量の高い種類が吸着され一方
比較的分子量の低い種類が溶液中に残存した。オリゴヌ
クレオチＰの電気泳動移動度を既知分子量を有する標準
物のそれと比較することにより、２１より大きい数を含
有するオリゴヌクレオチｒが使先的に混合物から抽出さ
れたと判断された。

実施例　６ ＤＮＡ抽出およびハイブリッＰ形成 １ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ８，０の１０　ｍＭ　
）リス緩衝液中に２０　Ｗ／ｍｌ溶液を連続希釈するこ
とにより、実施例５の記載のようにして調製された消化
されたｐＢＲ３２２の２０μＩ／ｍｅ溶液を調製した。

この溶液１００μｌをｐＨ７，８を有する。試験管中の
０．９％塩化ナトリウムおよび０．１％ＢＳＡを含有す
る２　５　ｍＭ燐酸塩緩衝液１００μｌ中に加えた。

これに実施例５に記載されるようにして調製されたノ９
−フルオロデカリンおよびヒストンに基づく液体アフイ
ニテイ支持体５０μｌを加えた。

試論管にキャップをしそして室温で６０分分間中かに揺
り動かした。沈降後、上澄み液を捨てそして得られる支
持体−ＤＮＡ複合物を−Ｚ８の、Ｏ４９％塩化ナトリウ
ムを含有する２５ｍＭ燐酸塩緩衝液０．５　ｍｌで洗浄
した。この複合物をＨｙｂｒｉ−８１０シ装置（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ　、　Ｉｎｃ、　。

Ｂｅ　ｔｈｅ　ｓｄａ　、ＭＤ　）中に保持されたＧｅ
ｎｅｓｃｒｅｅｎ　＋ＴＩＪ　ハイブリツＰ形成膜上の
知られた位置に幾つかの連続した１０〜２０μｇ量ずつ
で移しだ。この液体パーフルオロカーボン担体を添加の
間蒸発させた。消化物のもとの溶液１００μｌの試料を
膜の他の部分に付与した。風乾した膜をさらに処理して
膜に結合した核酸を変性、中和および予めハイプリツｒ
形成させた。

この膜を標識されたｐＢＲ３２２の過剰を用い６５℃で
一夜ハイブリッド形成させた（未消化りＢＲ３２２は標
準二ツクトランスレーション系ヲ用いて３２Ｐで標識）
。膜を洗浄し、乾燥し、そして乾燥した膜をＫｏｄａｋ
　）（ＡＲ−５フイルムに一夜露光させた。このフィル
ムを商業的な処理製行中で現像した。

この完全な操作をもとのｐＢＩＲ３２２消化物のそれぞ
れ２　ｔｔｌ／ｒｎｌ　−２００ｎ１Ａｌ　−２０ｒＪ
／ｒｎｔ　−２ｎＥ／ｒｎｌおよび２００　ｐｇ／ｍ！
濃度のものを用いて反復した。以下の第２表に全試料の
オートラ・フォグラフイーの肉眼による検視結果を示す
。

第　　２　　表 ２０　μｇΔａ　　　　　　強　　　　　　　　　強２
　μｌ／ｒｔｔｌ　　　　　　　強　　　　　　　　　
強２００　ｎｆｊ／！ｔ　　　　　　　強　　　　　　
　　　強２０　ｎｌ／／ｍｌ　　　　　　　強　　　　
　　　　　強２　ｎ９／ｍｅ　　　　明瞭　　　　　強
２００　ｐｉ／ｍｌ　　　　非常にかすか　　　　　明
瞭これらの結果は、本発明の液体アフイニテイ支持体に
結合することにより捕捉されたＤＮＡがなおハイブリッ
ド形成しうろこと、およびこの操作により試料がａ縮さ
れうろことを示している。この後者の指摘点は特に２個
の低濃度試料により示されＢｏ 実施例　７ ＤＮＡの抽出および回収 試験管中で２０　ｍＭのトリス、１０　ａＭの塩化ナト
リウムおよび１　ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐｉ（８，
０の緩衝液１　ａｔ中に１０μｇを溶解させることによ
りＥ、　ｃｏｌｉの菌株ＢのＤＮＡ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓシ。

Ｌｏｕｉ　ｓ　、ＬｉＯ）の１０　ｐｌ！／ｒｎｅ溶液
を調製した。この溶液中に実施例５で調製された、ピス
トンに基づく液体アフイニテイ支持体１５０μｌを加え
た。

試験管にキャップをしそして室温で６０分間穏やかに揺
り動かした。沈降後上澄み液を除去しそして支持体−Ｄ
ＮＡ複合物を水１　ｍｌずつで５回洗浄した。３．０Ｍ
酢酸すｌ−’Ｊウム溶ｆｉ　１　ｍｌを複合物に加えそ
して試験管をさらに６０分間揺り動かした。沈降後、上
澄み液をもう一つの試験管に移し、これにエチルアルコ
ール２．５　ｍｌを添加した。試験管を１３，０ＯＯＸ
Ｏで約５分間遠心分離すると、その間に沈殿物が沈降し
た。

上澄み液を除去したのち、ペレットをｐｉ（８，０の２
０ｍＭ）リス緩衝液約２０μ！中に溶解させた。

この溶液を、溶液中のもとのＤＮＡおよびＤＮＡ　−ヒ
ストン複合物の試料と一緒にｌ１１７％アガロースｒル
に適用しそして慣用法により電気泳動した。このｒルを
エチジウムグロマイｒを用いて染色して移動したＤＮＡ
を可視化した。未処理ＤＮＡ試料のそれと比較した。ベ
レットからの螢光バンドの位置により、本発明の液体ア
フイニテイ支持体により吸着されたＤＮＡが酢酸ナトリ
ウム処理により（支持体からＤＮＡ−ヒストン複合物を
置換することなく）置換されそしてエタノール沈殿によ
り回収されうろことが示された。

実施例　８ 抗原の捕捉および回収 実施例４（Ａ）記載のようにして調製された・卆−フル
オロアルキル化された抗体を分析して２６チ置換である
ことが判明した。・！−フルオロデカリンに基づく液体
アフイニテイ支持体が実施例４（Ｂ）記載の方法により
調製された。

ｐＨ８，０の０．１Ｍ燐酸ナトリウム（ＰＢ）中のヒト
ＩｇＯ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃ
ｈ　Ｌａｂｓ　、Ａｖｏｎｄａｌｅ　、　ＰＡ　）の１
ｍ９／ｃｌ溶液Ｉ　ｙｔｌ中に１．５μＣ１を有する　
エヒト免疫グロブリン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕ
ｃｌｅａｒ　、　Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ’）　１０μｉｌ
を加えることにより放射性のヒ）　ＩｇＧ溶液を調製し
た。この溶液５０μｉをヤギＩｇ０２５０μＩを含有す
るＦＢ１ｍＡ’中に加え次に支持体５０μｌを加えた。

容器を３０分間継続して揺り急かすことにより反応混合
物を混ぜ合せた。この混合物を沈下せしめ、上澄み液を
捨て、沈降した支持体をｐＢ１　ｒ！ｌｔずつを用いて
ろ回洗浄しそしてガンマ計数器で計測して捕捉された結
合された抗原（ヒトＩｇＯ）を測定した。計測後、ｐＨ
１１，６の１．０Ｍナトリウム炭酸塩／水酸化物緩衝溶
液１　ｍｌを加えそしてこの混合物を３０分間回転させ
ることにより混ぜ合せた。この混合物を沈下せしめ、上
澄み液を捨て、沈降した支持体をＰＢ１ｍ！？ずつで３
回洗いそして計測して残留する抗原を測定した。

回収しまた支持体を使用して抗原捕捉および除去の工程
を第２回目のサイクルにて反復した。その結果は次のと
おりであった。

ＰＭ これらのデータは本発明の液体アフイニテイ支持体が抗
原を捕捉しうることおよびかかるＩｇＧが捕捉された抗
体と置換するとと々〈支持体から置換されうろことを示
しているっ 実施例　９ 液体陽イオン交換支持体の調製および使用５０αｌのポ
リプロピレン製遠心管中で・ぞ−フルオロデカリン２０
ＷＬｌ、脱イオン水２０ｙｔ１．および陰イオン系フル
オロ界面活性剤でちるかｎｙ１＠ＦＳＰ　４　ｍｌを混
合することにより陽イオン交換支持体を調製した。この
混合物を渦巻きミキサー上１０〜１５秒間はげしく攪拌
し、そして次に約１１０００ｒｐで６〜５分間遠心分離
した。水＋ｔｉを除去しそして乳濁液に脱イオン水２０
ｄを加えた。この乳濁液を渦巻きミキサーで混合しそし
て前記したようにして遠心分離した。過剰のフルオロ界
面活性剤を除去するものであるこの洗浄操作を３回反復
した。

この陽イオン交換支持体乳濁液全水溶液から陽性に荷電
した色素を抽出するのに使用した。

メチレンブルー溶液（８８η／１）１ｒｔｔｔを乳濁液
１ｄに加えた。この混合物を数秒間渦巻かせそして乳濁
液を数分間沈下せしめた。水相を除去しそして６６６　
ｎｍでの吸収を分光測光により測定した。当初の色素溶
液の吸収は１．６１７であった。

これが抽出後は０．０１１８に低下しており、このこと
は本発明の液体イオン交換支持体を用いると色素の９９
％がうまく除去できることを示している。

実施例　１０ 陰イオン交換支持体の調製および使用 Ｚｏｎｙｌ■ＦＳＰに代えて陽イオンフルオロ界面活性
剤であるＺｏｎｙｌ■ＦＳＣを用いる以外は実施例９の
記載に従い同量を用いて陰イオン交換支持体乳濁液を調
製した。

この乳濁液を水溶液から負に荷電した色素を抽出するの
に使用した。クレゾールレッド溶液（０，０５０Ｍ　Ｎ
ａＨ２ＰＯａ溶液中１２　Ｗ／ｌ！　）　１　ｒｔｔｌ
を前記乳濁液１ゴ中に加えた。この混合物を数秒間渦巻
かせそしてこの乳濁液を数分間沈下せしめた。

水相を除去しそして４３４　ｎｍでの吸収を分光測光に
より測定した。当初の色素溶液の吸収である０、６２５
０から抽出後は０．０１２２に低下しており、このこと
は色素の９８チが除去されたことを示す。

１．０ＭのＮａＣｔおよび０．０５０ＭのＮａＨ２ＰＯ
４を含有する溶液の１ａｔずつを用いて４回洗浄するこ
とにより約７４チの色素が支持体からうまく回収された
。

実施例　１１ 陽イオン交換支持体を用いる色素の分離メチレンブルー
（約９■／ｌ）およびクレゾールレッド（約１２ダ／ｌ
）を含有する紫色水溶液（ＮａＯＨを用いてＰ１１８に
調整）２ｄを実施例９の記載のよってして調製された陽
イオン交換乳濁ｉ’ｆｉ　２　ｒａｔに加えた。この混
合物をはげしく渦巻かせそして乳濁液を数分間沈下させ
た。下方の・ヤーフルオロカーボン相が青色となり、赤
色色素が水層中に残り、このことは本発明の液体イオン
交換支持体により反対に荷電した８類が分離されること
を示している。

実施例　１２ 液体陰イオン交換支持体を用いるタン・ゼク質の抽出 脱イオン水２０ｄ−パーフルオロデカリン２０ｒｎ５お
よび中性フルオロ界面活性剤であるＺｏｎｙｌ＠ＦＳＮ
と陽イオン性フルオロ界面活性剤であるＺｏｎｙＩ■Ｆ
ＳＣとの１：４混合物５０　ｆｉｌを１２５ｍ／の分液
ロート中に加えることにより陰イオン交換支持体を調製
した。Ｚｏｎｙｌ■Ｆ’ＳＮは乳濁液を安定させぞして
タンノｊり質の非特嚢的な吸着を減少させるために用い
られた。この混合物を穏やかに振盪させそして５分間沈
下させた。分液ロート中に６つのＩｄが形成された。液
体支持体を含有する基底層をとり出して保有しそして中
間体性）相を捨てた。残る泡（最上層）に脱イオン水を
加えそして得られるパーフルオロカーボン支持体乳濁液
を最初に保有された支持体と合した。これを同量の水で
２回洗浄した。

フルオレセイン標識されたヒト血清アルブミン（ＦＩＴ
Ｃ−Ｈ８Ａ）５０μ９１ｒｒｔｌを含有するμ（６，０
の１０ｒｎＭ燐酸塩緩衝液２扉ｊを陰イオン交換支持体
乳濁液２　ｒａｔ中に添加した。この混合物をはげしく
渦巻かせそ［７て乳濁液を数分間沈下させた。水７０を
除去しそして乳濁液を緩衝溶液２ｍｌ！すって４回洗浄
した。乳濁液の少量をとり分けて螢光顕倣鏡下に検査し
た。液滴表面上に螢光が観察され、このことは標識され
たＨ８Ａの存在を示している。Ｚｏｎｙｌ”　ＦＳＣの
非存在下にＺＯｎ７１■ＦＳＮを用いて調製された中性
乳濁液を用いて実験を反復した場合は１滴表面上に何ら
螢光が観察されなかった。

前記実験を反復しぞしてイオン交換支持体で第１回の抽
出後に水相中に残留するすべての螢光を偏光計で測定し
た。この測定により９６％のタン・平り質が水相から除
去されたことが示された。０．２５　Ｍ　ＮａＨ２Ｐ○
４溶ｆｆ　２　ｙｒｔｌずつを用いて４回抽出すること
によりＦＩＴＣ−Ｅ（ＳＡの７５チがうまく回収できた
。これらと同じ条件下で、少量（く２５％）しかフルオ
レセイン標識ＩｇＧ（ＦＩＴＣ−ＩｇＣ）　）は抽出さ
れず、このことは本発明の液体イオン交換支持体を用い
てタン・にり質分離が行えることを示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）本質的に （Ａ）水の比重とはかなり異なる比重を有しておりそし
   てさらにリガンドまたは結合剤へ の比特異的結合が低い、化学的に不活性で 水非混和性の液体担体、および （Ｂ）前記担体の表面に確実に付着したリガンドまたは
   結合剤、 からなる液体支持体。 ２）液体アフイニテイ支持体である特許請求の範囲第１
   項記載の支持体。 ３）液体担体が液体パーフルオロカーボン、炭化水素お
   よびシリコーンからなる群から選択される特許請求の範
   囲第２項記載の液体アフイニテイ支持体。 ４）前記リガンドが抗原、ハプテン、核酸、酵素基質、
   ビタミン、染料、および酵素のエフェクター並びに阻害
   剤からなる群から選択される特許請求の範囲第２項記載
   の液体アフイニテイ支持体。 ５）前記結合剤が抗体、酵素、核酸、結合タンパク質お
   よび結合タンパク質の合成模造物からなる群から選択さ
   れる特許請求の範囲第２項記載の液体アフイニテイ支持
   体。 ６）（Ａ）液体担体の乳濁液の液滴表面上にリガンドま
   たは結合剤を付着させることにより液 体アフイニテイ支持体を形成させる工程、 および （Ｂ）前記液体アフイニテイ支持体を用いて、担体に付
   着したリガンドまたは結合剤に対 して相補的な標的結合剤またはリガンドを 混合物から捕捉する工程、 からなるバイオアフイニテイ分離法。 ７）液体アフイニテイ支持体が本質的に （Ａ）水の比重とはかなり異なる比重を有しておりそし
   てさらにリガンドまたは結合剤へ の比特異的結合が低い、化学的に不活性で 水非混和性の液体担体、および （Ｂ）前記担体の表面に確実に付着したリガンドまたは
   結合剤、 からなる特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８）液体担体が液体パーフルオロカーボン、炭化水素お
   よびシリコーンからなる群から選択される特許請求の範
   囲第７項記載の方法。 ９）前記リガンドが抗原、ハプテン、核酸、酵素基質、
   ビタミン、染料、および酵素のエフェクター並びに阻害
   剤からなる群から選択される特許請求の範囲第７項記載
   の方法。 １０）前記結合剤が抗体、酵素、核酸、結合タンパク質
   および結合タンパク質の合成模造物からなる群から選択
   される特許請求の範囲第７項記載の方法。 １１）（Ａ）反応性のパーフルオロ化された化合物を液
   体パーフルオロカーボン中に溶解させる 工程、および （Ｂ）前記溶液をリガンドまたは結合剤の水溶液を用い
   て乳化させる工程、 からなる液体アフイニテイ支持体の製法。 １２）前記リガンドが抗原、ハプテン、核酸、酵素基質
   、ビタミン、染料、および酵素エフェクター並びに阻害
   剤からなる群から選択される特許請求の範囲第１１項記
   載の方法。 １３）前記結合剤が抗体、酵素、核酸、結合タンパク質
   および結合タンパク質の合成模造物からなる群から選択
   される特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １４）（Ａ）リガンドまたは結合剤に高度にフルオロ化
   されたアンカー基を付着させることによ りリガンドまたは結合剤を修飾する工程、 および （Ｂ）液体パーフルオロカーボンを、アンカーで修飾さ
   れたリガンドまたは結合剤を用い て乳化する工程、 からなる液体アフイニテイ支持体の製法。 １５）前記リガンドが抗原、ハプテン、核酸、酵素基質
   、ビタミン、染料、および酵素のエフェクター並びに阻
   害剤からなる群から選択される特許請求の範囲第１４項
   記載の方法。 １６）前記結合剤が抗体、酵素、核酸、結合タンパク質
   および結合タンパク質の合成模造物からなる群から選択
   される特許請求の範囲第 １４項記載の方法。 １７）（Ａ）核酸を含有することが疑われる試料を、相
   補性結合剤をその表面上に有する液体ア フィニテイ支持体と接触させることにより 前記試料からその核酸を捕捉する工程、 （Ｂ）工程（Ａ）で形成された支持体：核酸複合物を濃
   縮して結合剤：核酸複合物を形成させ る工程、および （Ｃ）核酸ハイブリッド形成分析により核酸を分析する
   工程、 からなる核酸分析法。 １８）結合剤が結合タンパク質、核酸および結合タンパ
   ク質の合成模造物からなる群から選択される特許請求の
   範囲第１７項記載の分析法。 １９）（Ａ）被分析物を含有することが疑われる試料を
   該被分析物に対して相補性であるバイオ アフイニテイ結合対の一員をその表面上に 有する液体アフイニテイ支持体と接触させ ることにより前記試料から被分析物を捕捉 する工程、 （Ｂ）工程（Ａ）で形成された支持体：被分析物複合物
   を濃縮して結合剤：被分析物複合物を 形成させる工程、および （Ｃ）適当な免疫分析法により被分析物について分析す
   る工程、 からなる被分析物検出のための免疫分析法。 ２０）液体イオン交換支持体である特許請求の範囲第１
   項記載の支持体。 ２１）本質的に （Ａ）水の比重とはかなり異なる比重を有しておりそし
   てさらにリガンドまたは結合剤へ の比特異的結合が低い、化学的に不活性で 水非混和性の液体担体、および （Ｂ）高度にフルオロ置換またはパーフルオロ置換され
   た部分および荷電した有機部分を 包含する試薬、 からなる特許請求の範囲第２０項記載の支持体。 ２２）前記試薬が荷電したフルオロ−界面活性剤である
   特許請求の範囲第２１項記載の支持体。 ２３）（Ａ）液体担体の乳濁液の液滴表面に、荷電した
   有機部分を付着させることにより液体イ オン交換支持体を形成させる工程、および （Ｂ）前記液体イオン交換支持体を用いて、担体に付着
   した電荷とは反対の電荷を有する 標的分子を混合物から捕捉する工程、 からなるイオン交換分離法。