CN117654450A - 一种血液中脂蛋白的吸附材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物分离工程领域，具体公开了一种血液中脂蛋白的吸附材料及其制备方法和应用。一种血液中脂蛋白的吸附材料，包括微球载体和微球载体上共价偶联的脂蛋白抗体。本申请的吸附材料能够用于吸附血液中不同种类的脂蛋白，且本申请的吸附材料能够结合凝胶排阻层析法或者超速离心法结合使用，以纯化血液中的细胞外囊泡。
Description
技术领域
本申请涉及生物分离工程领域，更具体地说，它涉及一种血液中脂蛋白的吸附材料及其制备方法和应用。
背景技术
细胞外囊泡(EV)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从30nm到1000nm不等。胞外囊泡主要由微囊泡(MV)和外泌体(Exosome)组成，外泌体主要特指直径在30nm-100nm之间的细胞外囊泡，而微囊泡主要指直径在100nm-1000nm的细胞外囊泡。细胞外囊泡广泛存在于各种体液中，携带细胞来源的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等等，并参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。
由于细胞外囊泡的这些特性，使其具有作为检测靶标的特质，因此可以通过检测细胞外囊泡中的生物标志物来对疾病进行早期的筛查，如肿瘤的早期筛查或者神经系统疾病的早期筛查等。此外，细胞外囊泡由于其良好的靶向性，可以作为天然的药物载体，即可以将药物包裹在细胞外囊泡中，达到药物靶向传递的目的。
在细胞外囊泡应用中，需要对细胞外囊泡的进行纯化，其中应用最多的是外泌体的纯化以及部分微囊泡的纯化。在所有细胞外囊泡的纯化技术手段中，超速离心和凝胶排阻层析是最常用的两种技术手段。然而在细胞外囊泡的纯化过程中，极易发生脂蛋白的污染。
脂蛋白是一类由富含固醇脂、甘油三酯的疏水性内核和由蛋白质、磷脂、胆固醇等组成的外壳构成的球状微粒.脂蛋白对于哺乳动物细胞外脂质的包装、储存、运输和代谢起着重要作用，脂蛋白代谢异常(通常伴随着脂质组分和蛋白质组分的改变)与动脉硬化症、糖尿病、肥胖症以及肿瘤发生密切相关。
脂蛋白根据密度大小可分为：乳糜微粒、极低密度脂蛋白、中间密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。
由于脂蛋白的种类复杂，并且其大小和密度与细胞外囊泡有很多相似之处，因此进行细胞外囊泡纯化的时候，很难将脂蛋白分离出去，从而导致外囊泡在纯化过程中容易受到脂蛋白的污染。
脂蛋白在血液中的浓度较高，高密度脂蛋白与低密度脂蛋白的浓度约为1015个颗粒/ml血液，而细胞外囊泡在血液中的浓度约为107-109个囊泡/ml血液。由于细胞外囊泡浓度远小于脂蛋白浓度，因此在细胞外囊泡的纯化过程中去除脂蛋白的污染非常困难。
目前常常采用下列几种手段来降低在细胞外囊泡纯化过程中的脂蛋白污染。
第一、通过采样时间和方式的控制
由于脂蛋白的代谢与进食的关系密切，有数据表明，在进食后3-4小时内乳糜微粒浓度增加了2倍。为了降低脂蛋白的污染，采用了事先筛选采血样本的方式。要求采血人群在采样前控制饮食，或者在进食后一定时间内采样。这种方式在临床应用中非常困难，降低了试剂应用的可行性。并且，即使是控制了采样的时间，也只能降低部分脂蛋白如乳糜微粒等的量，而无法消除纯化过程中脂蛋白的污染。另外该种方式在实际的临床应用中难以执行，检测人员无法确定待检患者的饮食情况，因此这种手段只能在特定的研究项目中应用。
第二、采用不同原理的纯化方式相结合
通常所用的纯化技术包括超速离心+凝胶排阻层析，即将血样按照常规的超速离心分离细胞外囊泡的方式，在＞100000×g的离心力下超速离心超过10小时，然后收集相应的细胞外囊泡层，将收集到的细胞外囊泡再通过凝胶排阻层析，按照颗粒大小进行分离纯化。通过两种不同的纯化手段的结合，可以大幅度减少细胞外囊泡中脂蛋白的污染。
上述纯化过程也可以按照不同的顺序进行，有研究者将血液样本先利用凝胶排阻层析进行细胞外囊泡分离，然后将收集到的细胞外囊泡再进行超速离心，在100000×g的离心力下超速离心20小时，可以纯化得到纯度较高的细胞外囊泡。
该种方式存在如下问题：1、时间消耗大，这两种纯化方式结合后的操作时间往往超过24小时，持续时间很长；
2、在纯化过程中细胞外囊泡的损失比较大，因为经过多次的样本转移，损失很大，回收率低；
3、即使两种方式相结合，也只能是有限度的降低脂蛋白的污染。
第三、吸附剂吸附
目前对于血液中脂蛋白的吸附剂，其主要针对血液中的低密度脂蛋白进行吸附和去除。常用的低密度脂蛋白吸附和去除技术主要包括下列几种方式：
1、以透析膜为载体，在载体上修饰配基进行吸附。透析膜包括聚枫膜、聚醚膜等，吸附配基主要是肝素。
2、以微球为载体，在载体上修饰配基进行吸附。这种形式的吸附材料种类众多，是主流的吸附剂形式。微球主要包括壳聚糖、纤维素或者聚乙烯醇的微球。常用的吸附配基有肝素、硫酸葡聚糖、酸性氨基酸等。也有通过磺酸基、磷酸基等配基修饰的方式进行吸附。
该种脂蛋白污染的消除方式存在下列缺点：
1、目前的脂蛋白吸附剂只能吸附某一类脂蛋白，其原因在于：目前的脂蛋白吸附材料主要应用于血液净化领域，主要目的是对高血脂症的治疗，用于治疗那些对于降血脂药物不敏感的高脂血症，因此目前的脂蛋白吸附剂主要针对的是血液中的低密度脂蛋白LDL，吸附的目的在于降低血液中低密度脂蛋白的浓度。
2、目前脂蛋白吸附材料特异性较差
目前的脂蛋白吸附材料，主要依赖在不同pH环境下，脂蛋白电荷性质与吸附材料的电荷相吸引和结合的方式进行吸附，而在同等环境下，血液中有多种组分可以与该吸附材料结合，从而导致吸附材料的特异性较差。
3、目前脂蛋白吸附材料结合量低，反应时间长
对于目前的脂蛋白吸附材料来说，血液与脂蛋白吸附材料的作用时间通常超过一个小时。且目前吸附材料的脂蛋白结合量通常较低，血液净化反应的时间较长。本发明所描述的血液细胞外囊泡的纯化场景，需要有较快的结合速度与结合效率。
基于上述问题，本申请提出了一种血液中脂蛋白的吸附材料及其制备方法和应用。
发明内容
为了解决上述问题，本申请提供一种血液中脂蛋白的吸附材料及其制备方法和应用。
第一方面，本申请提供一种血液中脂蛋白的吸附材料，采用如下的技术方案：
一种血液中脂蛋白的吸附材料，包括微球载体和微球载体上共价偶联的脂蛋白抗体。
优选的，所述微球载体包含但不限于琼脂糖凝胶微球、纤维素微球、聚苯乙烯微球和聚乙烯醇微球。
优选的，所述聚苯乙烯微球的制备方法如下：
A1.将稳定剂、表面活性剂溶解于去离子水中形成均匀溶液，得到水相；A2.将功能单体和交联剂溶于致孔剂中，并加入引发剂，制备油相；
A3.将A2制备的油相加入A1制备的水相中，进行聚合反应，在聚合反应完毕后，对所得物质进行抽滤洗涤以去除未反应的残余物，最终得到聚苯乙烯微球。
优选的，步骤A1中，所述稳定剂包含但不限于聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇，且稳定剂的质量百分比浓度为1％-10％，所述表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯与聚氧丙烯的共聚物和脂肪酸酯类，且所述表面活性剂质量百分比浓度为1％-5％；
步骤A2中，所述功能单体与交联剂的摩尔数比例为2:1-8:1，功能单体、交联剂与致孔剂的用量比例为功能单体和交联剂的总体积与致孔剂体积的体积比例1:1-1:5，所述引发剂的摩尔数为功能单体与交联剂总摩尔数的1％-10％；
步骤A3中，油相与水相的体积比为1:2-1:10；聚合反应温度为20℃-100℃；聚合反应时间为1-20h。
优选的，所述微球载体的粒径在50μm-600μm。
优选的，所述微球载体的粒径在100μm-500μm。
优选的，所述微球载体的孔径在50nm-3000nm。
优选的，所述微球载体的孔径为150nm-1000nm。
优选的，所述脂蛋白抗体包含载脂蛋白AI抗体、载脂蛋白B100抗体、载脂蛋白B48抗体的一种或多种。
优选的，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
第二方面，本申请提供一种血液中脂蛋白的聚苯乙烯基质吸附材料的制备方法，采用如下的技术方案：
一种血液中脂蛋白的聚苯乙烯基质吸附材料的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备微球载体；
S2、活化微球载体；
S3.将金黄色葡萄球菌蛋白A或者链球菌蛋白G溶解在修饰缓冲液中得到第二混合液；
S4.将第一混合液和第二混合液混合后在适当温度下反应得到反应产物，反应完成后用修饰缓冲液对反应产物进行洗涤；
S5.将S4洗涤后的反应产物用封闭缓冲液进行封闭，封闭后用修饰缓冲液重悬，得到第一复合液；
S6.将脂蛋白抗体溶解在偶联缓冲液中，得到第二复合液；
S7.将步骤第一复合液和第二复合液混合反应，反应结束后对反应产物进行洗涤，然后再用偶联缓冲液重悬；
S8.将辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶解在二甲基亚砜中，然后加入到步骤S7所得到的溶液中进行反应，反应得到的产物先用洗脱缓冲液洗涤，然后再用储存缓冲液洗涤后保存在储存缓冲液中，得到产品。
优选的，所述微球载体为聚苯乙烯微球载体，将S2中制备的微球载体加入至修饰缓冲液中，并在修饰缓冲液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺进行反应，反应完成后洗涤数次并用修饰缓冲液重悬得到活化后的微球载体，修饰缓冲液为10-100mM MES缓冲液，其pH为5.5-7.5，修饰缓冲液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的用量为：每100mg微球载体悬浮在5-10ml修饰缓冲液中，并与10-120mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和10-120mgN-羟基琥珀酰亚胺进行反应，反应温度20℃-30℃；修饰缓冲液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基磺基琥珀酰亚胺的用量为：每100mg微球载体悬浮在5-10ml修饰缓冲液中，并与10-120mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和10-120mg N-羟基磺基琥珀酰亚胺进行反应，反应温度20℃-30℃；
优选的，步骤S3中，金黄色葡萄球菌蛋白A或者链球菌蛋白G的用量与配基的摩尔数比为1:1-10:1，修饰缓冲液为10-100mM MES缓冲液，其pH为5.5-7.5；
步骤S4中，反应温度为20℃-30℃，反应时间2-4h，修饰缓冲液为10-100mM MES缓冲液，其pH为5.5-7.5；
步骤S5中，封闭缓冲液为20-120mM的Tris-HCl缓冲液，其pH为7.5-8.5，修饰缓冲液为10-100mM MES缓冲液，其pH为5.5-7.5；
步骤S6中，偶联缓冲液为浓度为50mM-100mM的磷酸盐缓冲液，pH为6.5-8.5，抗体用量为：每100ug步骤S5中得到的微球载体，偶联50-1000ug抗体；
步骤S7中，反应温度为20℃-30℃，反应时间为30-60min；
步骤S8中，辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)在二甲基亚砜中的浓度为1mM-5mM，辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)、二甲基亚砜与S7中所得产物混合后辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)的终浓度为100-500uM，反应温度为20℃-30℃，反应时间为30-60min；洗脱缓冲液为50-150mM的甘氨酸缓冲液，pH为2.0-3.0，储存缓冲液为50mM-60mM的磷酸盐缓冲液，pH为7.0-7.5。
第三方面，本申请提供一种脂蛋白吸附材料的应用，采用如下的技术方案：
一种脂蛋白吸附材料的应用，将吸附材料用于吸附血液中不同种类的脂蛋白，所述的脂蛋白包括但不限于高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及乳糜微粒。
一种脂蛋白吸附材料的应用，将吸附材料结合凝胶排阻层析法或者超速离心法结合使用，以纯化血液中的细胞外囊泡。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本发明所述的脂蛋白吸附材料，能结合包括高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白以及乳糜微粒等不同种类的脂蛋白。
2、本发明所述的脂蛋白吸附材料，能特异性的结合不同种类的脂蛋白，而对血液中其它组分无非特异的结合。
3、本发明所述的脂蛋白吸附材料，采用了定向共价偶联技术，相对于常规的偶联技术，大幅度提高了吸附材料的结合效率。
4、将本发明所述的脂蛋白吸附材料应用于血液细胞外囊泡纯化过程中，可大幅减少血液脂蛋白的污染，且能快速去除血液中的脂蛋白，大幅度的节省纯化时间。进而大幅度节省细胞外囊泡整体纯化时间。
附图说明
图1是本申请应用实施例1与应用对比例1制备的纯化产物的纳米颗粒跟踪分析(NTA)图；
图2是本申请应用实施例1与应用对比例1制备的纯化产物采用CD9抗体的Westernblot检测图；
图3本申请应用实施例1与应用对比例1制备的纯化产物采用Apo A抗体的Westernblot检测图；
图4是本申请应用实施例1与应用对比例1制备的纯化产物的电子显微镜检测图；
图5是本申请应用实施例1与应用对比例1制备的纯化产物的lipoprotein脂蛋白检测系统检测结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。本申请所采用的血清均由血液通过离心法制备而成，且血液均来源于同一个人的血液样本；本申请中的超速离心机为Beckman公司Optima MAX-XP超速离心机，转子型号为MLA-55，离心管为聚碳酸酯离心管型号为Beckman355630；聚乙烯吡咯烷酮PVP采用的是sigma 81420；P123采用的是麦克林生化T832531；功能单体甲基丙烯酸甲酯MMA采用的是Sigma M55909；乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA采用的是默克52465；链球菌蛋白G采用的是Sigma 08062，本申请应用例及对比例中的血清制备方法以及来源均与应用例1中相同——即将同一个人的血液样本采用离心法制备血清；本申请中的UC+SEC指代为应用对比例1中超速离心结合凝胶排阻层析法制得的纯化产物；Method 1指代本申请应用实施例1制备的纯化产物。
实施例
实施例1
S1.制备微球载体：A1、分别准确称取聚乙烯吡咯烷酮30g和P123 10g放入50OmL去离子水中，搅拌至均匀透明，以形成均匀溶液，得到水相；
A2：将10ml功能单体甲基丙烯酸甲酯和5ml交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯溶于60ml致孔剂二氯甲烷中，再加入1ml偶氮二异丁腈，制备得到油相，其中功能单体和交联剂的总摩尔数0.125mmol；
A3：取A2中制得的油相76ml，加入到400ml A1中配制的水相中，缓慢搅拌，并将温度控制在80℃，反应12小时，反应结束后，抽滤去除液体，干燥得到聚苯乙烯微球。
S2.活化微球载体：取100mg S1中制得的聚苯乙烯微球，用50mM pH6.0的MES缓冲液悬浮得到反应液，向反应液中加入100mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和100mg N-羟基磺基琥珀酰亚胺25℃反应15min。反应后用50mM pH6.0的MES缓冲液洗涤3次，并用5ml的50mM pH6.0的MES缓冲液重悬得到第一混合液。
S3.将60mg链球菌蛋白G溶解在5ml的50mM pH6.0的MES缓冲液中得到第二混合液。
S4.将第一混合液和第二混合液混合后在25℃反应3小时，反应后用50mM pH6.0的MES缓冲液对反应产物洗涤3次。
S5.将S4步骤中洗涤后的反应产物用100mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液进行封闭，在25℃封闭1小时。封闭后用100mM、pH7.2的磷酸缓冲液洗涤3次，并用5ml同样的缓冲液重悬，得到第一复合液。
S6.将10mg抗人载脂蛋白B100单克隆抗体，2mg人载脂蛋白B48单克隆抗体及2mg抗人载脂蛋白AI单克隆抗体溶解在2ml的100mM pH7.2的磷酸缓冲液中，得到第二复合液。
S7.取1ml步骤S5中得到第一复合液与S8得到的第二复合液混合并在25℃封闭反应45min。反应得到的产物用100mM pH7.2的磷酸缓冲液洗涤三次，然后用300ul同样的缓冲液重悬。
S8.将0.2mg辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶解在217ul的二甲基亚砜中，得到2.5mM的DSS溶液。然后取100ul 2.5mM的DSS溶液，加入到步骤S7所得到的溶液中，并在25℃反应45min。反应后用100mM pH2.8的甘氨酸缓冲液洗脱缓冲液洗涤3次，然后用100mMpH7.2的磷酸缓冲液洗涤3次后保存在100mM pH7.2的磷酸缓冲液中，得到产品。
基于上述实施例，本申请还提出了一种血液中脂蛋白吸附柱，吸附柱采用上述实施例制备的脂蛋白吸附材料制备而成。
具体的，吸附柱包括柱管、吸附球筛板和堵头。本实施例中柱管两端均设置为开口，且柱管为聚丙烯材质，容积可选1ml、3ml、6ml、12ml以及其它规格的柱管，本制备例选择6ml的柱管。筛板设置有两块，沿柱管长度方向两块筛板依次设置，且靠近柱管底部的筛板为下筛板，另一筛板为上筛板，上筛板和下筛板间隔设置以形成容置吸附球，吸附球为上述实施例中脂蛋白吸附材料。
堵头设置有两个，沿上筛板靠近下筛板的方向两堵头分别为上堵头、下堵头，两堵头均位于对应侧筛板远离吸附球的一侧，以封堵柱管的开口。
本实施例中吸附柱的装配方法具体如下：
a1.柱管、筛板等用去离子水清洗；
a2.在柱管中装入下筛板，直到底部；
a3.在柱管中装入吸附球，本实施例中脂蛋白吸附材料的装填量为3ml；
a4.在柱管中装入上筛板；
a5.装上柱管的上下堵头。
实施例2
S1.制备琼脂糖微球，本实施例中琼脂糖微球采用的是市售产品NHS修饰的琼脂糖微球；
S2.取NHS修饰的琼脂糖微球5ml，用1mM盐酸分三次抽滤清洗后加入100mM MOPS缓冲液中在温度4℃的环境下震荡反应4小时，得到第一混合液缓冲液含0.1M NaCl且pH为7.2。
S3.将100mg链球菌蛋白G溶解在10ml的100mM，pH7.2且含0.1M NaCl MOPS缓冲液中，得到第二混合液。
S3.将步骤第一混合液与第二混合液所获得的溶液混合，在25℃反应3小时，反应后用100mM，pH7.2含0.1M NaCl MOPS缓冲液对反应产物洗涤3次。
S4.将S3步骤中洗涤后的反应产物用50mM pH8.0的乙醇胺缓冲液在25℃封闭1小时。封闭完成后用100mM pH7.2的磷酸缓冲液洗涤3次，并用5ml同样的缓冲液重悬，得到第一复合液。磷酸缓冲液的配制方法为业内公开，行业内技术人员均知晓。
S5.将10mg抗人载脂蛋白B100单克隆抗体，2mg人载脂蛋白B48单克隆抗体，及2mg抗人载脂蛋白AI单克隆抗体，溶解在2ml的100mM pH7.2的磷酸缓冲液中，得到第二复合液。
S6.取1ml步骤S4得到的第一复合液与S5得到的第二复合液混合并在25℃封闭反应45min。反应得到的产物用100mM pH7.2的磷酸缓冲液洗涤三次，然后再用300ul同样的缓冲液重悬。
S7.将0.2mg辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶解在217ul的二甲基亚砜中，得到2.5mM的DSS溶液。然后取100ul2.5mM的DSS溶液，加入到步骤S6所得到的溶液中，并在25℃下反应45min。反应后用100mM pH2.8的甘氨酸缓冲液洗脱缓冲液洗涤3次，然后用100mMpH7.2的磷酸缓冲液洗涤3次后保存在100mM pH7.2的磷酸缓冲液中，得到产品。
基于上述实施例，本申请还提出了一种血液中脂蛋白吸附柱，吸附柱采用上述实施例制备的脂蛋白吸附材料制备而成。
具体的，吸附柱包括柱管、吸附球筛板和堵头。本实施例中柱管两端均设置为开口，且柱管为聚丙烯材质，容积可选1ml、3ml、6ml、12ml以及其它规格的柱管，本制备例选择6ml的柱管。筛板设置有两块，沿柱管长度方向两块筛板依次设置，且靠近柱管底部的筛板为下筛板，另一筛板为上筛板，上筛板和下筛板间隔设置以形成容置吸附球，吸附球为上述实施例中脂蛋白吸附材料。
堵头设置有两个，沿上筛板靠近下筛板的方向两堵头分别为上堵头、下堵头，两堵头均位于对应侧筛板远离吸附球的一侧，以封堵柱管的开口。
本实施例中吸附柱的装配方法具体如下：
a1.柱管、筛板等用去离子水清洗；
a2.在柱管中装入下筛板，直到底部；
a3.在柱管中装入吸附球，本实施例中脂蛋白吸附材料的装填量为3ml；
a4.在柱管中装入上筛板；
a5.装上柱管的上下堵头。
应用实施例
应用实施例1
s1.取3.6ml血清加入0.4ml的1M且pH为7.4磷酸缓冲液混合均匀；
s2.将实施例1制备的吸附柱用100mM pH7.4磷酸缓冲液洗涤3次；
s3.将s1中得到的稀释后的血清缓慢加入到s2步骤中的脂蛋白吸附柱中，并用4ml的100mM且pH为7.4的磷酸缓冲液洗涤吸附柱，收集流穿液；
s4.将s3中收集到的流穿液，用100mM pH7.4磷酸缓冲液稀释至8ml；在100,000×g,4℃超速70min，离心后去上清，沉淀用8ml的100mM pH7.4磷酸缓冲液重悬，得到纯化产物，检测纯化产物的外泌体含量，脂蛋白含量等指标，本方法纯化时间为40min，整体操作时间为60min。
应用实施例2
s1.取3.6ml血清加入0.4ml的1M磷酸缓冲液pH7.4混合均匀；
s2.将实施例1制备得到的脂蛋白吸附柱用100mM pH7.4磷酸缓冲液洗涤3次；
s3.将s1中得到的稀释后血清缓慢加入到s2步骤中的脂蛋白吸附柱中，并用4ml100mM pH7.4磷酸缓冲液洗涤吸附柱，收集流穿液。
s4.将s3中收集到的流穿液，上样到外泌体专用凝胶排阻层析柱(iZON qEVcolumn)上，qEV柱事先用100mM pH7.4磷酸缓冲液洗涤。后续所有操作步骤按照产品说明书进行。
s5.用100mM pH7.4磷酸缓冲液洗脱s4得到的吸附柱，每0.5ml一管，收集洗脱液，并检测洗脱液中的外泌体含量，脂蛋白含量等指标，本方法纯化时间为26min，整体操作时间为50min。
应用实施例3
s1.取4ml血清加入0.4ml的1M磷酸缓冲液pH7.4混合均匀；
s2.将实施例1制备得到的脂蛋白吸附柱用100mM pH7.4磷酸缓冲液洗涤3次；
s3.将s1中得到的稀释后血清缓慢加入到s2步骤中的脂蛋白吸附柱中，并用4ml100mM pH7.4磷酸缓冲液洗涤吸附柱，收集流穿液。
s4.将s3中收集到的流穿液，上样到外泌体专用凝胶排阻层析柱(iZON qEVcolumn)上，qEV柱事先用100mM pH7.4磷酸缓冲液洗涤。后续所有操作步骤按照产品说明书进行。
s5.用100mM pH7.4磷酸缓冲液洗脱s4得到的吸附柱，每0.5ml一管，收集洗脱液，并检测洗脱液中的外泌体含量，脂蛋白含量等指标，本方法纯化时间为30min，整体操作时间为50min。
应用实施例4
s1.取3.6ml血清加入0.4ml的1M磷酸缓冲液pH7.4混合均匀；
s2.将实施例2制备得到的脂蛋白吸附柱用100mM pH7.4磷酸缓冲液洗涤3次；
s3.将s1中得到的稀释后血清缓慢加入到s2步骤中的脂蛋白吸附柱中，并用4ml100mM pH7.4磷酸缓冲液洗涤吸附柱，收集流穿液。
s4.将s3中收集到的流穿液，上样到外泌体专用凝胶排阻层析柱(iZON qEVcolumn)上，qEV柱事先用100mM pH7.4磷酸缓冲液洗涤。后续所有操作步骤按照产品说明书进行。
s5.用100mM pH7.4磷酸缓冲液洗脱s4得到的吸附柱，每0.5ml一管，收集洗脱液，并检测洗脱液中的外泌体含量，脂蛋白含量等指标，本方法纯化时间为28min，整体操作时间为57min。
应用对比例
应用对比例1
s1.取4ml血清样本，用100mM pH7.4磷酸缓冲液稀释至8ml。
s2.上述血清样本100,000×g,采用超速离心机在4℃超速120min，离心后去上清，沉淀用4ml的100mMpH7.4磷酸缓冲液重悬；
s3.将s2得到的液体上样到外泌体专用凝胶排阻层析柱上，凝胶排阻层析柱预先用100mM pH7.4磷酸缓冲液洗涤，后续按照凝胶排阻层析柱的产品说明书进行；
s4.用100mM pH7.4磷酸缓冲液洗脱s3得到的吸附柱，每0.5ml一管，收集洗脱液，并检测洗脱液中的外泌体含量，脂蛋白含量等指标，本方法纯化时间为150min，整体操作时间为300min。
性能检测试验
检测方法
脂蛋白检测，采用Apo lipoprotein脂蛋白免疫检测系统(R&D Systems DAPB00)对应用例及应用对比例制得的纯化产物进行不同脂蛋白占比进行检测，具体操作参见厂家说明书，并将检测结果记录于表1中，应用实施例1和应用对比例1制备的纯化产物的lipoprotein脂蛋白检测系统检测结果图见图5。
外泌体纯化效率，采用每毫升中粒子颗粒数量来表示纯化产物中外泌体的数量，粒子颗粒数量用经典的纳米颗粒跟踪分析方法(NTA)。本申请中纳米颗粒跟踪分析方法采用Malvern公司的Nanosight LM10-HS,选择488nm激光模式和NTA3.1软件系统，操作按照厂家说明书，具体结果参照图1。
WesternBlot检测，主要分析纯化产物中两种蛋白标志物，分别为CD9蛋白和ApoA1蛋白。其中CD9蛋白是外泌体膜上的标志性蛋白，用于检测外泌体。ApoA1是高密度脂蛋白的标志性蛋白，用于检测脂蛋白的残留。操作采用常规电泳和转印操作，该操作方法是业内技术人员所熟知的。所用抗体均来源于Abcam，其中兔抗CD9多克隆抗体(ab236630)，兔抗APOA1(ab300085)，HRP标记的羊抗兔多抗(ab150077)，具体结果见图2和图3。
透射电镜(TEM)检测，2ul的纯化产物滴在聚醋酸甲基乙烯酯-碳电子显微镜格栅上，室温孵育10min，然后将格栅用纯水洗涤3次，再将格栅浸泡到pH7.0的乙酸双氧铀缓冲液中，浸泡3min。用吸水纸吸干多于液体，将格栅在室温下风干。然后将格栅放置在电子显微镜(JEM-1400PLUS)下检测，具体结果参见图4。
表1
两种外泌体纯化方法中不同脂蛋白家族占比比较
结合表1和图5可知，基于本发明描述的脂蛋白吸附材料的血液外泌体纯化方法，在脂蛋白的去除效率上远超现有的超速离心+凝胶排阻层析法。
Apo lipoprotein脂蛋白检测系统结果显示，经过本发明所描述的脂蛋白吸附材料吸附，然后再结合凝胶排阻层析，基本上不能检测到产物中的脂蛋白。而作为对比的超速离心结合凝胶排阻层析纯化血液中的外泌体。产物中仍然有脂蛋白残留，其中低密度脂蛋白占比最高并超过80％。
结合图1，从NTA结果显示可知，应用实施例1和应用对比例1得到的外泌体浓度看，二者都能得到高浓度的外泌体，且二者浓度相当。不同的是，采用本发明的脂蛋白吸附柱结合凝胶排阻层析法得到的外泌体粒径高于超速离心+凝胶排阻层析法，且二者平均粒径具体为117nm和85nm。
结合图2和图3，从CD9的结果可以看出，应用本发明所描述的脂蛋白吸附材料的血液外泌体纯化方法(Method 1)，与超速离心结合凝胶排阻层析方法(UC+SEC)纯化血液外泌体，两种方法都能得到较高浓度的外泌体，但是超速离心结合凝胶排阻层析方法不能全部消除脂蛋白的污染，Werstern blot中仍然能够显示出载脂蛋白A1 ApoA1的印迹条带。
结合图4，从电子显微镜结果即二者电镜图可以看出，本发明所描述的脂蛋白吸附材料的血液外泌体纯化方法(Method 1)与超速离心结合凝胶排阻层析方法(UC+SEC)纯化血液外泌体都能得到相应的外泌体，相比较之下超速离心+凝胶排阻层析法得到的外泌体平均粒径稍小，而本发明所描述的方法纯化收集到的外泌体平均粒径稍大，而两种方法得到的外泌体的区别在于两种方法的峰值有所不同，但外泌体颗粒的范围基本一致。
根据应用对比例1和应用实施例1的操作时间和纯化时间记录可知，本发明所描述的脂蛋白吸附材料的血液外泌体纯化方法纯化血液外泌体，所需时间更短，效率更高。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种血液中脂蛋白的吸附材料，其特征在于，包括微球载体和微球载体上共价偶联的脂蛋白抗体。
2.根据权利要求1所述的一种血液中脂蛋白的吸附材料，其特征在于：所述微球载体包含但不限于琼脂糖凝胶微球、纤维素微球、聚苯乙烯微球和聚乙烯醇微球。
3.根据权利要求1所述的一种血液中脂蛋白的吸附材料，其特征在于：所述微球载体的粒径为50μm-600μm。
4.根据权利要求1所述的一种血液中脂蛋白的吸附材料，其特征在于：所述微球载体的孔径为50nm-3000nm。
5.根据权利要求4所述的一种血液中脂蛋白的吸附材料，其特征在于：所述微球载体的粒径为100μm-500μm，所述微球载体的孔径为150nm-1000nm。
6.根据权利要求1所述的一种血液中脂蛋白的吸附材料，其特征在于：所述脂蛋白抗体包含载脂蛋白AI抗体、载脂蛋白B100抗体、载脂蛋白B48抗体的一种或多种。
7.一种血液中脂蛋白的吸附材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、制备微球载体；
S2、活化微球载体；
S3.将金黄色葡萄球菌蛋白A或者链球菌蛋白G溶解在修饰缓冲液中得到第二混合液；
S4.将活化微球载体和第二混合液混合后在适当温度下反应得到反应产物，反应完成后用修饰缓冲液对反应产物进行洗涤；
S5.将S4洗涤后的反应产物用封闭缓冲液进行封闭，封闭后用修饰缓冲液重悬，得到第一复合液；
S6.将脂蛋白抗体溶解在偶联缓冲液中，得到第二复合液；
S7.将第一复合液和第二复合液混合反应，反应结束后对反应产物进行洗涤，然后再用偶联缓冲液重悬；
S8.将辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶解在二甲基亚砜中，然后加入到步骤S7所得到的液体中进行反应，反应得到的产物先用洗脱缓冲液洗涤，然后再用储存缓冲液洗涤后保存在储存缓冲液中，得到产品。
8.根据权利要求7所述的一种血液中脂蛋白的吸附材料的准备方法，其特征在于：
步骤S3中，金黄色葡萄球菌蛋白A或者链球菌蛋白G的用量与微球载体的摩尔数比为1:1-10:1，修饰缓冲液为10-100mM MES缓冲液，其pH为5.5-7.5；
步骤S4中，反应温度为20℃-30℃，反应时间2-4h，修饰缓冲液为10-100mM MES缓冲液，其pH为5.5-7.5；
步骤S5中，封闭缓冲液为20-120mM的Tris-HCl缓冲液，其pH为7.5-8.5，修饰缓冲液为10-100mM MES缓冲液，其pH为5.5-7.5；
步骤S6中，偶联缓冲液为浓度为50mM-100mM的磷酸盐缓冲液，pH为6.5-8.5，抗体用量为：每100ug步骤S7中得到的微球载体偶联50-1000ug抗体；
步骤S7中，反应温度为20℃-30℃，反应时间为30-60min；
步骤S8中，辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)在二甲基亚砜中的浓度为1mM-5mM，辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)、二甲基亚砜与S7中所得产物混合后辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)的终浓度为100-500uM，反应温度为20℃-30℃，反应时间为30-60min；洗脱缓冲液为50-150mM的甘氨酸缓冲液，pH为2.0-3.0，储存缓冲液为50mM-60mM的磷酸盐缓冲液，pH为7.0-7.5。
9.一种脂蛋白吸附材料的应用，其特征在于，将权利要求1-6任意一项所述的吸附材料或权利要求7或8所述的制备方法制备的吸附材料用于吸附血液中不同种类的脂蛋白，所述的脂蛋白包括但不限于高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及乳糜微粒。
10.一种脂蛋白吸附材料的应用，其特征在于，将权利要求1-6任意一项所述的吸附材料或权利要求7或8所述的制备方法制备的吸附材料结合凝胶排阻层析法或者超速离心法结合使用，以纯化血液中的细胞外囊泡。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990004416A1 (en) * | 1988-10-25 | 1990-05-03 | Invitron Corporation | Specific removal of ldl from blood |
| CN101224415A (zh) * | 2007-09-30 | 2008-07-23 | 南开大学 | 用于体外全血灌流吸附低密度脂蛋白的吸附剂及制备方法 |
| CN104475041A (zh) * | 2014-10-22 | 2015-04-01 | 哈尔滨工业大学 | 制备琼脂糖磁性微球的新方法及其在分离纯化IgG抗体中的用途 |
| CN105738628A (zh) * | 2014-12-12 | 2016-07-06 | 上海复星长征医学科学有限公司 | 一种纯化羊抗人血浆载脂蛋白a-i多克隆抗体的方法 |
| CN107486176A (zh) * | 2017-09-11 | 2017-12-19 | 广州康盛生物科技有限公司 | 一种用于血液净化的吸附材料及其制备方法 |
| CN109613264A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-12 | 中拓生物有限公司 | 一种灵敏度高的载脂蛋白c2测定试剂盒 |
-
2023
- 2023-12-15 CN CN202311726189.8A patent/CN117654450A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990004416A1 (en) * | 1988-10-25 | 1990-05-03 | Invitron Corporation | Specific removal of ldl from blood |
| CN101224415A (zh) * | 2007-09-30 | 2008-07-23 | 南开大学 | 用于体外全血灌流吸附低密度脂蛋白的吸附剂及制备方法 |
| CN104475041A (zh) * | 2014-10-22 | 2015-04-01 | 哈尔滨工业大学 | 制备琼脂糖磁性微球的新方法及其在分离纯化IgG抗体中的用途 |
| CN105738628A (zh) * | 2014-12-12 | 2016-07-06 | 上海复星长征医学科学有限公司 | 一种纯化羊抗人血浆载脂蛋白a-i多克隆抗体的方法 |
| CN107486176A (zh) * | 2017-09-11 | 2017-12-19 | 广州康盛生物科技有限公司 | 一种用于血液净化的吸附材料及其制备方法 |
| CN109613264A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-12 | 中拓生物有限公司 | 一种灵敏度高的载脂蛋白c2测定试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RICHARD E. OSTLUND，等: "Removal of Apolipoprotein B from Dog Whole Blood by Ex Vivo Hemoadsorption on Antibody-Agarose Beads", ARTIF ORGANS, vol. 12, no. 6, 31 December 1988 (1988-12-31), pages 491 * |
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