CN114164203B - 一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法 - Google Patents
一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114164203B CN114164203B CN202210126779.6A CN202210126779A CN114164203B CN 114164203 B CN114164203 B CN 114164203B CN 202210126779 A CN202210126779 A CN 202210126779A CN 114164203 B CN114164203 B CN 114164203B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- microspheres
- zirconium dioxide
- nano
- stirring
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
- G01N33/5434—Magnetic particles using magnetic particle immunoreagent carriers which constitute new materials per se
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
- H01F41/00—Apparatus or processes specially adapted for manufacturing or assembling magnets, inductances or transformers; Apparatus or processes specially adapted for manufacturing materials characterised by their magnetic properties
- H01F41/02—Apparatus or processes specially adapted for manufacturing or assembling magnets, inductances or transformers; Apparatus or processes specially adapted for manufacturing materials characterised by their magnetic properties for manufacturing cores, coils, or magnets
- H01F41/0253—Apparatus or processes specially adapted for manufacturing or assembling magnets, inductances or transformers; Apparatus or processes specially adapted for manufacturing materials characterised by their magnetic properties for manufacturing cores, coils, or magnets for manufacturing permanent magnets
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
- G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides
- G01N2405/06—Glycophospholipids, e.g. phosphatidyl inositol
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
- G01N2446/20—Magnetic particle immunoreagent carriers the magnetic material being present in the particle core
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Power Engineering (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
- Inorganic Compounds Of Heavy Metals (AREA)
Abstract
本发明涉及一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法,所述纯化方法采用可与磷脂酰丝氨酸可逆性结合的金属氧化物微球或磁珠对细胞外囊泡进行纯化,纯化材料包括纳米二氧化锆微球、纳米二氧化钛微球或纳米三氧化二铝微球、纳米二氧化锆磁性微球、纳米二氧化钛磁性微球或纳米三氧化二铝磁性微球、多孔二氧化锆纳米微球、多孔二氧化钛纳米微球或多孔三氧化二铝纳米微球。本发明的纯化方法可以快速纯化多种样本:血清/血浆,尿液,细胞培养上清;通量适中,能够最大程度的保留细胞外囊泡,洗脱得到纯度较高的细胞外囊泡,不含螯合剂等可能影响后续实验的试剂。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体,直径从10nm到1000nm不等。胞外囊泡主要由微囊泡(Microvesicles, MVs)和外泌体(Exosomes, Exs)组成,微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡,直径约为100nm – 1000nm。外泌体由细胞内的多泡小体(multivesicular bodies)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外,直径约为10nm- 200nm。EVs从大多数细胞类型分泌,并且存在于体液(包括血浆、血清、尿液和脑脊液)中。EVs可充当天然载体,用于在细胞之间递送大分子,包括蛋白、核酸(诸如DNA和RNA)、生物活性脂质和碳水化合物。已显示EVs信号传导在各种各样的生理和病理病况(包括致癌性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病和代谢病症)中发挥重要作用。EVs表面含有从起源的细胞的表面继承的标志物(蛋白/碳水化合物),允许对细胞和组织特异性EV进行分类和靶向。EVs内含物(包括但不限于蛋白和RNA)取决于其起源细胞,供体病理生理状态,细胞状况、诸如氧化应激或代谢应激以及供体对治疗干预的应答,且因此可以充当特定身体或疾病状况的生物标志物的来源。血液在全身循环,并且在临床实践中定期收集,使其成为疾病生物标志物的理想来源。血清和血浆,血液的液体和无细胞相,含有EV以及其他颗粒,循环的游离蛋白,循环的游离DNA和脂质。血浆样品中的某些组分(诸如白蛋白和补体系统)的丰度使得检测稀有代谢物和蛋白特别有挑战性。蛋白检测主要基于抗体-抗原相互作用,通常被称为免疫测定。传统的方法、如凝胶电泳(western印迹)和酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫化学发光以及较新的数字方法、如单分子阵列(Simoa)和Erenna使用该原理。免疫测定性能取决于抗体的质量(灵敏度和特异性),与检测方法无关。抗体-抗原相互作用特性取决于抗体特异性和相互作用的环境,其包括:盐和蛋白的缓冲液浓度、pH和抗原的可用性。血浆和血清富含不同组分、诸如蛋白和代谢物,并且具有丰富蛋白的该复杂环境对于蛋白免疫测定而言是不良的环境,尤其是如果靶标分析物丰度较低。使用EVs需克服该问题,因为EVs或EVs的亚群的纯化将减少样品的复杂性,并且允许从样品检测低丰度的靶标或表位。此外,生物流体(诸如血浆或血清)中的RNA本质上是不稳定的,并且经受将其消化的各种类型的RNA酶。EVs携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等,参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎症疾病以及癌症中都发现细胞外囊泡水平的升高,它们很有可能成为这类疾病的诊断标志物,因此,对细胞外囊泡进行准确的定性和定量研究显得尤为重要。
目前市场上大规模细胞外囊泡纯化的策略主要有两种:
切向流方式超滤,通过不同孔径的膜来浓缩样本细胞外囊泡,由于是物理过滤,所以只要是大于孔径的蛋白和其他可溶物都会被浓缩下来,会造成细胞外囊泡不纯,切向流超滤也会机械剪切损伤细胞外囊泡,导致细胞外囊泡破裂,使细胞外囊泡回收率会降低。
排阻色谱柱方式,排阻色谱树脂柱类似于分子筛的原理,大粒径的分子或者囊泡会先流出,小粒径的分子和囊泡会进入树脂球延迟而后流出,通过粒径的截流来分离合适大小的细胞外囊泡,因为细胞外囊泡不是一种粒径,是不同粒径的混合物,排阻色谱柱会损失一部分细胞外囊泡,同时相同粒径的分子和可溶物也会被收集,由于不是亲和结合,所以没有浓缩的功能,最终细胞外囊泡纯化后体积变化不大,达不到浓缩的目的。
其他方法包括通过有或没有密度梯度的超速离心分离细胞外囊泡。尽管该过程产生相对纯的EVs群体,但其费力,效率低下,并且生成高样品间差异。化学沉淀,纯化细胞外囊泡产物不纯因此,对于免疫测定方法以及其他检测方法,具有低细胞外囊泡纯度的分离方法不是最优的。此外,这些方法富集血浆中发现的许多种类的细胞外囊泡,代表从多种细胞类型分泌的细胞外囊泡的高度异质的群体。来自不同细胞起源的细胞外囊泡类型的大型混合物可以干扰免疫测定,或过度代表来自正常组织和细胞的蛋白和RNA特征,其掩蔽来自疾病细胞外囊泡的概况。由于这些原因,用于分离总细胞外囊泡群体或纯化细胞外囊泡的特定亚群的简单且可重现的方法可以显著增强基于细胞外囊泡相关的蛋白和微小核糖核酸的生物标志物的检测。
鉴于此,申请此专利。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题,本发明提供了一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法,纯化速度更快,纯化效果更好。
本发明的目的是提供一种细胞外囊泡纯化材料。
本发明的另一目的是提供一种细胞外囊泡纯化方法。
根据本发明的具体实施方式的细胞外囊泡纯化材料,所述纯化材料为:金属氧化物微球或金属氧化物磁珠,所述金属氧化物微球或金属氧化物磁珠可与磷脂酰丝氨酸可逆性结合。
进一步的,所述金属氧化物微球为二氧化锆、二氧化钛或三氧化二铝的非磁性纳米微球或多孔纳米微球,所述金属氧化物磁珠为二氧化锆、二氧化钛或三氧化二铝的磁性纳米微球。
优选的,所述非磁性纳米微球为纳米二氧化锆微球、纳米二氧化钛微球或纳米三氧化二铝微球,所述磁性纳米微球为纳米二氧化锆磁性微球、纳米二氧化钛磁性微球或纳米三氧化二铝磁性微球,所述纳米多孔微球为多孔二氧化锆纳米微球、多孔二氧化钛纳米微球或多孔三氧化二铝纳米微球。
根据本发明的具体实施方式的细胞外囊泡纯化材料,进一步的,所述纳米二氧化锆微球的制备方法包括以下步骤:
(1)二氧化锆前驱体的制备:将二氧化锆粉、第一份浓硫酸和硫酸铵进行混合并加热至溶解,放至室温后加入第二份浓硫酸,混合均匀,形成二氧化锆前驱体;优选的,所述二氧化锆粉、第一份浓硫酸、硫酸铵和第二份浓硫酸的重量体积比为0.09-0.11g:9-11ml:2-4g:18-22ml;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
(3)纳米二氧化皓微球制备:将步骤(2)得到的所述A液通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化锆前驱体,再滴加入N,N-二甲基甲酰胺,反应完成后抽滤白色沉淀,用无水乙醇洗涤后干燥即得所述纳米二氧化皓微球;优选的,所述A液、二氧化锆前驱体、N,N-二甲基甲酰胺的体积比为7:3:2。
根据本发明的具体实施方式的细胞外囊泡纯化材料,进一步的,所述纳米二氧化钛微球的制备方法包括以下步骤:
(1)二氧化钛前驱体的制备:将钛酸四丁酯溶于无水乙醇中,然后加入去离子水充分混匀后,加入浓盐酸,密封后室温放置1-3天,得到淡黄色透明液体即为二氧化钛前驱体;优选的,所述钛酸四丁酯、无水乙醇、去离子水、浓盐酸的体积比为4:2:50:0.7;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
(3)纳米二氧化钛微球制备:将步骤(2)得到的所述将A液通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化钛前驱体,再滴加入N,N-二甲基甲酰胺,反应完成后抽滤白色沉淀,用无水乙醇洗涤后干燥即得所述纳米二氧化钛微球;优选的,所述A液、二氧化钛前驱体、N,N-二甲基甲酰胺的体积比为7:3:2。
根据本发明的具体实施方式的细胞外囊泡纯化材料,进一步的,所述纳米三氧化二铝微球的制备方法包括以下步骤:
(1)三氧化二铝前驱体的制备:将偏铝酸钠溶解于去离子水中,充分搅拌至完全溶解,形成均匀透明的液体即为三氧化二铝前驱体;优选的,所述偏铝酸钠和去离子水的重量体积比为0.1g:50ml;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
(3)纳米三氧化二铝微球制备:将步骤(2)得到的所述将A液通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述三氧化二铝前驱体,再滴加入N,N-二甲基甲酰胺,反应完成后抽滤白色沉淀,用无水乙醇洗涤后干燥即得所述纳米三氧化二铝微球;优选的,所述A液、三氧化二铝前驱体、N,N-二甲基甲酰胺的体积比为7:3:2。
步骤(3)中,所述反应的时间为10-12小时。
根据本发明的具体实施方式的细胞外囊泡纯化材料,进一步的,所述纳米二氧化锆磁性微球的制备方法包括以下步骤:
(1)二氧化锆前驱体的制备:将二氧化锆粉、第一份浓硫酸和硫酸铵进行混合并加热至溶解,放至室温后加入第二份浓硫酸,混合均匀,形成二氧化锆前驱体;优选的,所述二氧化锆粉、第一份浓硫酸、硫酸铵和第二份浓硫酸的重量体积比为0.09-0.11g:9-11ml:2-4g:18-22ml;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
Ⅰ:四氧化三铁微球粉末的制备:将三氯化铁和硫酸亚铁溶于步骤(2)得到的所述A液中,充分搅拌至混合均匀,搅拌状态下滴加入饱和碳酸氢铵溶液,同时通入氮气搅拌并升温,温度升高到75-85℃时,滴加氢氧化钠溶液,观察液体变为纯黑色后继续氮气氛围下搅拌混合,磁吸收获黑色沉淀,将所述黑色沉淀先用无水乙醇进行洗涤,再用去离子水洗涤后烘干,形成四氧化三铁微球粉末;优选的,所述烘干的温度为60℃;所述氢氧化钠溶液的浓度为1M;所述三氯化铁、硫酸亚铁、饱和碳酸氢铵溶液和1M氢氧化钠溶液的重量体积比为3.24g:2.78g:50ml:10ml;
Ⅱ:纳米二氧化锆磁性微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤Ⅰ得到的所述四氧化三铁微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化锆前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,磁吸褐色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述褐色沉淀,烘干,即得所述纳米二氧化锆磁性微球;优选的,所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、四氧化三铁微球粉末、二氧化锆前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为70ml:2g:30ml:20ml。
根据本发明的具体实施方式的细胞外囊泡纯化材料,进一步的,所述纳米二氧化钛磁性微球的制备方法包括以下步骤:
(1)二氧化钛前驱体的制备:将钛酸四丁酯溶于无水乙醇中,然后加入去离子水充分混匀后,加入浓盐酸,密封后室温放置1-3天,得到淡黄色透明液体即为二氧化钛前驱体;优选的,所述钛酸四丁酯、无水乙醇、去离子水、浓盐酸的体积比为4:2:50:0.7;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
Ⅰ:四氧化三铁微球粉末的制备:将三氯化铁和硫酸亚铁溶于步骤(2)得到的所述A液中,充分搅拌至混合均匀,搅拌状态下滴加入饱和碳酸氢铵溶液,同时通入氮气搅拌并升温,温度升高到75-85℃时,滴加氢氧化钠溶液,观察液体变为纯黑色后继续氮气氛围下搅拌混合,磁吸收获黑色沉淀,将所述黑色沉淀先用无水乙醇进行洗涤,再用去离子水洗涤后烘干,形成四氧化三铁微球粉末;优选的,所述烘干的温度为60℃;所述氢氧化钠溶液的浓度为1M;所述三氯化铁、硫酸亚铁、饱和碳酸氢铵溶液和1M氢氧化钠溶液的重量体积比为3.24g:2.78g:50ml:10ml;
Ⅱ:纳米二氧化钛磁性微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤Ⅰ得到的所述四氧化三铁微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化钛前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,磁吸褐色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述褐色沉淀,烘干,即得所述纳米二氧化钛磁性微球;优选的,所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、四氧化三铁微球粉末、二氧化钛前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为50ml:2g:50ml:20ml。
根据本发明的具体实施方式的细胞外囊泡纯化材料,进一步的,所述纳米三氧化二铝磁性微球的制备方法包括以下步骤:
(1)三氧化二铝前驱体的制备:将偏铝酸钠溶解于去离子水中,充分搅拌至完全溶解,形成均匀透明的液体即为三氧化二铝前驱体;优选的,所述偏铝酸钠和去离子水的重量体积比为0.1g:50ml;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
Ⅰ:四氧化三铁微球粉末的制备:将三氯化铁和硫酸亚铁溶于步骤(2)得到的所述A液中,充分搅拌至混合均匀,搅拌状态下滴加入饱和碳酸氢铵溶液,同时通入氮气搅拌并升温,温度升高到75-85℃时,滴加氢氧化钠溶液,观察液体变为纯黑色后继续氮气氛围下搅拌混合,磁吸收获黑色沉淀,将所述黑色沉淀先用无水乙醇进行洗涤,再用去离子水洗涤后烘干,形成四氧化三铁微球粉末;优选的,所述烘干的温度为60℃;所述氢氧化钠溶液的浓度为1M;所述三氯化铁、硫酸亚铁、饱和碳酸氢铵溶液和1M氢氧化钠溶液的重量体积比为3.24g:2.78g:50ml:10ml;
Ⅱ:纳米三氧化二铝磁性微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤Ⅰ得到的所述四氧化三铁微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述三氧化二铝前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,磁吸褐色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述褐色沉淀,烘干,即得所述纳米三氧化二铝磁性微球;优选的,所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、四氧化三铁微球粉末、三氧化二铝前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为50ml:2g:50ml:20ml。
根据本发明的具体实施方式的细胞外囊泡纯化材料,进一步的,所述多孔二氧化锆纳米微球的制备方法包括以下步骤:
(1)二氧化锆前驱体的制备:将二氧化锆粉、第一份浓硫酸和硫酸铵进行混合并加热至溶解,放至室温后加入第二份浓硫酸,混合均匀,形成二氧化锆前驱体;优选的,所述二氧化锆粉、第一份浓硫酸、硫酸铵和第二份浓硫酸的重量体积比为0.09-0.11g:9-11ml:2-4g:18-22ml;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
ⅰ:聚苯乙烯微球粉末的制备:将第一份苯乙烯和第一份过硫酸铵加入到步骤(2)得到的所述A液中,氮气氛围下充分搅拌并乳化,搅拌升温到45-55℃,滴加第二份苯乙烯,滴加完成后,再加入第二份过硫酸铵,升温到80-90℃,继续氮气氛围下搅拌至混匀,降温到45-55℃后,滴加氯化钠溶液,抽滤白色沉淀后,先用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,再用去离子水进行洗涤,烘干,形成聚苯乙烯微球粉末;所述过硫酸铵的浓度均为200mg/ml;氯化钠溶液的浓度为2M;所述烘干的温度为60℃;所述第一份苯乙烯、第一份过硫酸铵、A液、第二份苯乙烯、第二份过硫酸铵和氯化钠溶液的重量体积比为30g:2.5ml:200ml:30g:2.5ml:20ml;
ⅱ:多孔二氧化锆纳米微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤ⅰ得到的所述聚苯乙烯微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化锆前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,烘干,即得所述多孔二氧化锆纳米微球;优选的,所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、聚苯乙烯微球粉末、二氧化锆前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为70ml:2g:30ml:20ml。
根据本发明的具体实施方式的细胞外囊泡纯化材料,进一步的,所述多孔二氧化钛纳米微球的制备方法包括以下步骤:
(1)二氧化钛前驱体的制备:将钛酸四丁酯溶于无水乙醇中,然后加入去离子水充分混匀后,加入浓盐酸,密封后室温放置1-3天,得到淡黄色透明液体即为二氧化钛前驱体;优选的,所述钛酸四丁酯、无水乙醇、去离子水、浓盐酸的体积比为4:2:50:0.7;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
ⅰ:聚苯乙烯微球粉末的制备:将第一份苯乙烯和第一份过硫酸铵加入到步骤(2)得到的所述A液中,氮气氛围下充分搅拌并乳化,搅拌升温到45-55℃,滴加第二份苯乙烯,滴加完成后,再加入第二份过硫酸铵,升温到80-90℃,继续氮气氛围下搅拌至混匀,降温到45-55℃后,滴加氯化钠溶液,抽滤白色沉淀后,先用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,再用去离子水进行洗涤,烘干,形成聚苯乙烯微球粉末;所述过硫酸铵的浓度均为200mg/ml;氯化钠溶液的浓度为2M;所述烘干的温度为60℃;所述第一份苯乙烯、第一份过硫酸铵、A液、第二份苯乙烯、第二份过硫酸铵和氯化钠溶液的重量体积比为30g:2.5ml:200ml:30g:2.5ml:20ml;
ⅱ:多孔二氧化钛纳米微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤ⅰ得到的所述聚苯乙烯微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化钛前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,烘干,即得所述多孔二氧化钛纳米微球;优选的,所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、聚苯乙烯微球粉末、二氧化钛前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为50ml:2g:50ml:20ml。
根据本发明的具体实施方式的细胞外囊泡纯化材料,进一步的,所述多孔三氧化二铝纳米微球的制备方法包括以下步骤:
(1)三氧化二铝前驱体的制备:将偏铝酸钠溶解于去离子水中,充分搅拌至完全溶解,形成均匀透明的液体即为三氧化二铝前驱体;优选的,所述偏铝酸钠和去离子水的重量体积比为0.1g:50ml;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
ⅰ:聚苯乙烯微球粉末的制备:将第一份苯乙烯和第一份过硫酸铵加入到步骤(2)得到的所述A液中,氮气氛围下充分搅拌并乳化,搅拌升温到45-55℃,滴加第二份苯乙烯,滴加完成后,再加入第二份过硫酸铵,升温到80-90℃,继续氮气氛围下搅拌至混匀,降温到45-55℃后,滴加氯化钠溶液,抽滤白色沉淀后,先用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,再用去离子水进行洗涤,烘干,形成聚苯乙烯微球粉末;所述过硫酸铵的浓度均为200mg/ml;氯化钠溶液的浓度为2M;所述烘干的温度为60℃;所述第一份苯乙烯、第一份过硫酸铵、A液、第二份苯乙烯、第二份过硫酸铵和氯化钠溶液的重量体积比为30g:2.5ml:200ml:30g:2.5ml:20ml;
ⅱ:多孔三氧化二铝纳米微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤ⅰ得到的所述聚苯乙烯微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述三氧化二铝前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,烘干,即得所述多孔三氧化二铝纳米微球;优选的,所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、聚苯乙烯微球粉末、三氧化二铝前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为50ml:2g:50ml:20ml。
根据本发明的具体实施方式的细胞外囊泡纯化方法,所述纯化方法为:采用所述纯化材料对细胞外囊泡进行纯化。
优选的,待测样品中加入结合缓冲液,再加入所述纯化材料,混合并作用后,将细胞外囊泡吸附在纯化材料中,再将所述纯化材料经洗脱液洗脱,即得纯化的细胞外囊泡。
具体的,500微升样品与500微升结合缓冲液混合后,加入100ul所述金属氧化物微球或金属氧化物磁珠轻柔混合后,所述金属氧化物微球或金属氧化物磁珠与磷脂酰丝氨酸可逆性结合,室温作用15分钟,细胞外囊泡被吸附在微球或磁珠表面,而其他杂质不被吸附而去除,然后将吸附了细胞外囊泡的微球或磁珠经生理盐水或磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液洗涤,最后经乙酸钠-碳酸氢钠或10%氨水或50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷洗脱液洗涤,得到纯化的细胞外囊泡。
具体的,所述结合缓冲液为乙酸-乙酸钠溶液,所述结合缓冲液为1M pH 5.5的乙酸-乙酸钠溶液。
优选的,样品在结合缓冲液的作用下,所述微球或磁珠与磷脂酰丝氨酸可逆性结合,细胞外囊泡被吸附在微球或磁珠表面,而其他杂质不被吸附而去除,然后将吸附了细胞外囊泡的微球或磁珠经洗液洗涤,最后经洗脱液洗涤,得到纯化的细胞外囊泡;所述洗脱液为乙酸钠-碳酸氢钠或10%氨水或50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷洗脱液中的一种或者组合。
脂质双层由具有疏水尾和亲水性磷酸头的两亲性磷脂组成。在生物系统中,磷脂的亲水性磷酸盐头暴露在脂质双层的外表面上。众所周知,一些金属氧化物,如氧化锆(ZrO2)、氧化钛(TiO2)和氧化铝(Al2O3)等可以可逆结合具有高特异性的磷酸基团,通过利用这一特性,金属氧化物已被广泛用于高选择性合成富集磷酸化肽、水溶性有机磷和有机磷农药。鉴于此,我们尝试使用微米级的金属氧化物通过双齿结合富集细胞外囊泡。在脂质双层表面上的磷酸盐基团和金属氧化物之间,由于其简单的高度亲和力结合,这种基于固相的选择性富集具有很大的优势,例如提高了EVs分离效率,减少了非特异性蛋白吸附,缩短样品处理时间。
本发明纯化方法的原理:捕获法提取细胞外囊泡是基于磷脂酰丝氨酸(PS)的可逆结合洗脱,本发明采用与细胞外囊泡高亲和力的微球粒子/磁性粒子的纯化方式。样品在结合缓冲液(EV-CB)的作用下细胞外囊泡特异的吸附在微球/磁珠的表面,而其他非磷脂蛋白质等杂质则不被吸附而去除;吸附了细胞外囊泡的微球或磁珠经洗液洗涤去除蛋白质、杂质,最后纯的细胞外囊泡被洗脱液EB洗脱。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明的纯化方法可以快速提取:纯化全过程缩短至1小时以内(微球法),或30分钟以内(磁珠法);
(2)本发明的纯化方法操作更便捷:只需要简单离心(或磁吸)/混合操作;
(3)采用本发明的纯化方法可以纯化多种样本:血清/血浆,尿液,细胞培养上清;
(4)本发明的纯化方法通量适中:适合中等样本量细胞外囊泡快速纯化,磁珠法适配自动提取仪和相应的操作程序后,可以实现高通量自动化提取样本细胞外囊泡。
(5)采用本发明的纯化材料微球或磁球,载体更灵活,直接与磷脂酰丝氨酸(PS)特异结合,能够最大程度的保留细胞外囊泡,洗脱得到纯度较高的细胞外囊泡,不含螯合剂等可能影响后续实验的试剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a为本发明的二氧化锆纳米微球纯化得到的细胞培养上清外囊泡电镜图;
图1b为本发明的二氧化钛纳米微球纯化得到的细胞培养上清外囊泡电镜图;
图1c为本发明的三氧化二铝纳米微球纯化得到的细胞培养上清外囊泡电镜图;
图2为本发明的非磁性纳米微球纯化得到的细胞培养上清外囊泡NTA鉴定图;
图3为本发明的非磁性纳米微球纯化得到的细胞培养上清细胞外囊泡的流式鉴定图;
图4a为本发明的二氧化锆纳米微球纯化得到的牛奶来源细胞外囊泡电镜图;
图4b为本发明的二氧化钛纳米微球纯化得到的牛奶来源细胞外囊泡电镜图;
图4c为本发明的三氧化二铝纳米微球纯化得到的牛奶来源细胞外囊泡电镜图;
图5为本发明的非磁性纳米微球纯化得到的牛奶来源细胞外囊泡的流式鉴定图;
图6a为本发明的二氧化锆纳米微球纯化得到的人尿液来源细胞外囊泡电镜图;
图6b为本发明的二氧化钛纳米微球纯化得到的人尿液来源细胞外囊泡电镜图;
图6c为本发明的三氧化二铝纳米微球纯化得到的人尿液来源细胞外囊泡电镜图;
图7为本发明的非磁性纳米微球纯化得到的人尿液来源细胞外囊泡的流式鉴定图;
图8 为本发明的不同金属氧化物磁珠纯化细胞上清细胞外囊泡得率流式比较鉴定图。
图9为本发明的纳米多孔微球作为填料进行纯化得到的人尿液细胞外囊泡的电镜图;
图10为本发明采用纳米多孔微球作为填料进行纯化得到的人尿液细胞外囊泡的CSFE染色流式鉴定图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式,都属于本发明所保护的范围。
在一些较为具体的实施方案中,所述细胞外囊泡纯化材料为:可与磷脂酰丝氨酸可逆性结合的金属氧化物微球或金属氧化物磁珠。
具体的,所述金属氧化物微球为二氧化锆、二氧化钛或三氧化二铝的非磁性纳米微球或多孔纳米微球,所述金属氧化物磁珠为二氧化锆、二氧化钛或三氧化二铝的磁性纳米微球。
进一步的,所述非磁性纳米微球为纳米二氧化锆微球、纳米二氧化钛微球或纳米三氧化二铝微球,所述磁性纳米微球为纳米二氧化锆磁性微球、纳米二氧化钛磁性微球或纳米三氧化二铝磁性微球,所述纳米多孔微球为多孔二氧化锆纳米微球、多孔二氧化钛纳米微球或多孔三氧化二铝纳米微球。
所述细胞外囊泡纯化方法为:采用金属氧化物微球或金属氧化物磁珠对细胞外囊泡进行纯化。
优选的,样品在结合缓冲液的作用下,所述微球或磁珠与磷脂酰丝氨酸可逆性结合,细胞外囊泡被吸附在微球或磁珠表面,而其他杂质不被吸附而去除,然后将吸附了细胞外囊泡的微球或磁珠经洗液洗涤,最后经洗脱液洗涤,得到纯化的细胞外囊泡;所述洗脱液为EB洗脱液。
具体的,所述纳米二氧化锆微球的制备方法包括以下步骤:
(1)二氧化锆前驱体的制备:将二氧化锆粉、第一份浓硫酸和硫酸铵进行混合并加热至溶解,放至室温后加入第二份浓硫酸,混合均匀,形成二氧化锆前驱体;优选的,所述二氧化锆粉、第一份浓硫酸、硫酸铵和第二份浓硫酸的重量体积比为0.09-0.11g:9-11ml:2-4g:18-22ml;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
(3)纳米二氧化皓微球制备:将步骤(2)得到的所述A液通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化锆前驱体,再滴加入N,N-二甲基甲酰胺,反应完成后抽滤白色沉淀,用无水乙醇洗涤后干燥即得所述纳米二氧化皓微球;优选的,所述A液、二氧化锆前驱体、N,N-二甲基甲酰胺的体积比为7:3:2。
具体的,所述纳米二氧化钛微球的制备方法包括以下步骤:
(1)二氧化钛前驱体的制备:将钛酸四丁酯溶于无水乙醇中,然后加入去离子水充分混匀后,加入浓盐酸,密封后室温放置1-3天,得到淡黄色透明液体即为二氧化钛前驱体;优选的,所述钛酸四丁酯、无水乙醇、去离子水、浓盐酸的体积比为4:2:50:0.7;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
(3)纳米二氧化钛微球制备:将步骤(2)得到的所述将A液通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化钛前驱体,再滴加入N,N-二甲基甲酰胺,反应完成后抽滤白色沉淀,用无水乙醇洗涤后干燥即得所述纳米二氧化钛微球;优选的,所述A液、二氧化钛前驱体、N,N-二甲基甲酰胺的体积比为7:3:2。
具体的,所述纳米三氧化二铝微球的制备方法包括以下步骤:
(1)三氧化二铝前驱体的制备:将偏铝酸钠溶解于去离子水中,充分搅拌至完全溶解,形成均匀透明的液体即为三氧化二铝前驱体;优选的,所述偏铝酸钠和去离子水的重量体积比为0.1g:50ml;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
(3)纳米三氧化二铝微球制备:将步骤(2)得到的所述将A液通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述三氧化二铝前驱体,再滴加入N,N-二甲基甲酰胺,反应10-12小时完成后抽滤白色沉淀,用无水乙醇洗涤后干燥即得所述纳米三氧化二铝微球;优选的,所述A液、三氧化二铝前驱体、N,N-二甲基甲酰胺的体积比为7:3:2。
具体的,所述纳米二氧化锆磁性微球的制备方法包括以下步骤:
(1)二氧化锆前驱体的制备:将二氧化锆粉、第一份浓硫酸和硫酸铵进行混合并加热至溶解,放至室温后加入第二份浓硫酸,混合均匀,形成二氧化锆前驱体;优选的,所述二氧化锆粉、第一份浓硫酸、硫酸铵和第二份浓硫酸的重量体积比为0.09-0.11g:9-11ml:2-4g:18-22ml;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
Ⅰ:四氧化三铁微球粉末的制备:将三氯化铁和硫酸亚铁溶于步骤(2)得到的所述A液中,充分搅拌至混合均匀,搅拌状态下滴加入饱和碳酸氢铵溶液,同时通入氮气搅拌并升温,温度升高到75-85℃时,滴加氢氧化钠溶液,观察液体变为纯黑色后继续氮气氛围下搅拌混合,磁吸收获黑色沉淀,将所述黑色沉淀先用无水乙醇进行洗涤,再用去离子水洗涤后烘干,形成四氧化三铁微球粉末;优选的,所述烘干的温度为60℃;所述氢氧化钠溶液的浓度为1M;所述三氯化铁、硫酸亚铁、饱和碳酸氢铵溶液和1M氢氧化钠溶液的重量体积比为3.24g:2.78g:50ml:10ml;
Ⅱ:纳米二氧化锆磁性微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤Ⅰ得到的所述四氧化三铁微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化锆前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,磁吸褐色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述褐色沉淀,烘干,即得所述纳米二氧化锆磁性微球;优选的,所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、四氧化三铁微球粉末、二氧化锆前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为70ml:2g:30ml:20ml。
具体的,所述纳米二氧化钛磁性微球的制备方法包括以下步骤:
(1)二氧化钛前驱体的制备:将钛酸四丁酯溶于无水乙醇中,然后加入去离子水充分混匀后,加入浓盐酸,密封后室温放置1-3天,得到淡黄色透明液体即为二氧化钛前驱体;优选的,所述钛酸四丁酯、无水乙醇、去离子水、浓盐酸的体积比为4:2:50:0.7;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
Ⅰ:四氧化三铁微球粉末的制备:将三氯化铁和硫酸亚铁溶于步骤(2)得到的所述A液中,充分搅拌至混合均匀,搅拌状态下滴加入饱和碳酸氢铵溶液,同时通入氮气搅拌并升温,温度升高到75-85℃时,滴加氢氧化钠溶液,观察液体变为纯黑色后继续氮气氛围下搅拌混合,磁吸收获黑色沉淀,将所述黑色沉淀先用无水乙醇进行洗涤,再用去离子水洗涤后烘干,形成四氧化三铁微球粉末;优选的,所述烘干的温度为60℃;所述氢氧化钠溶液的浓度为1M;所述三氯化铁、硫酸亚铁、饱和碳酸氢铵溶液和1M氢氧化钠溶液的重量体积比为3.24g:2.78g:50ml:10ml;
Ⅱ:纳米二氧化钛磁性微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤Ⅰ得到的所述四氧化三铁微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化钛前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,磁吸褐色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述褐色沉淀,烘干,即得所述纳米二氧化钛磁性微球;优选的,所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、四氧化三铁微球粉末、二氧化钛前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为50ml:2g:50ml:20ml。
具体的,所述纳米三氧化二铝磁性微球的制备方法包括以下步骤:
(1)三氧化二铝前驱体的制备:将偏铝酸钠溶解于去离子水中,充分搅拌至完全溶解,形成均匀透明的液体即为三氧化二铝前驱体;优选的,所述偏铝酸钠和去离子水的重量体积比为0.1g:50ml;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
Ⅰ:四氧化三铁微球粉末的制备:将三氯化铁和硫酸亚铁溶于步骤(2)得到的所述A液中,充分搅拌至混合均匀,搅拌状态下滴加入饱和碳酸氢铵溶液,同时通入氮气搅拌并升温,温度升高到75-85℃时,滴加氢氧化钠溶液,观察液体变为纯黑色后继续氮气氛围下搅拌混合,磁吸收获黑色沉淀,将所述黑色沉淀先用无水乙醇进行洗涤,再用去离子水洗涤后烘干,形成四氧化三铁微球粉末;优选的,所述烘干的温度为60℃;所述氢氧化钠溶液的浓度为1M;所述三氯化铁、硫酸亚铁、饱和碳酸氢铵溶液和1M氢氧化钠溶液的重量体积比为3.24g:2.78g:50ml:10ml;
Ⅱ:纳米三氧化二铝磁性微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤Ⅰ得到的所述四氧化三铁微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述三氧化二铝前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,磁吸褐色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述褐色沉淀,烘干,即得所述纳米三氧化二铝磁性微球;优选的,所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、四氧化三铁微球粉末、三氧化二铝前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为50ml:2g:50ml:20ml。
具体的,所述多孔二氧化锆纳米微球的制备方法包括以下步骤:
(1)二氧化锆前驱体的制备:将二氧化锆粉、第一份浓硫酸和硫酸铵进行混合并加热至溶解,放至室温后加入第二份浓硫酸,混合均匀,形成二氧化锆前驱体;优选的,所述二氧化锆粉、第一份浓硫酸、硫酸铵和第二份浓硫酸的重量体积比为0.09-0.11g:9-11ml:2-4g:18-22ml;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
ⅰ:聚苯乙烯微球粉末的制备:将第一份苯乙烯和第一份过硫酸铵加入到步骤(2)得到的所述A液中,氮气氛围下充分搅拌并乳化,搅拌升温到45-55℃,滴加第二份苯乙烯,滴加完成后,再加入第二份过硫酸铵,升温到80-90℃,继续氮气氛围下搅拌至混匀,降温到45-55℃后,滴加氯化钠溶液,抽滤白色沉淀后,先用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,再用去离子水进行洗涤,烘干,形成聚苯乙烯微球粉末;所述过硫酸铵的浓度均为200mg/ml;氯化钠溶液的浓度为2M;所述烘干的温度为60℃;所述第一份苯乙烯、第一份过硫酸铵、A液、第二份苯乙烯、第二份过硫酸铵和氯化钠溶液的重量体积比为30g:2.5ml:200ml:30g:2.5ml:20ml;
ⅱ:多孔二氧化锆纳米微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤ⅰ得到的所述聚苯乙烯微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化锆前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,烘干,即得所述多孔二氧化锆纳米微球;优选的,所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、聚苯乙烯微球粉末、二氧化锆前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为70ml:2g:30ml:20ml。
具体的,所述多孔二氧化钛纳米微球的制备方法包括以下步骤:
(1)二氧化钛前驱体的制备:将钛酸四丁酯溶于无水乙醇中,然后加入去离子水充分混匀后,加入浓盐酸,密封后室温放置1-3天,得到淡黄色透明液体即为二氧化钛前驱体;优选的,所述钛酸四丁酯、无水乙醇、去离子水、浓盐酸的体积比为4:2:50:0.7;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
ⅰ:聚苯乙烯微球粉末的制备:将第一份苯乙烯和第一份过硫酸铵加入到步骤(2)得到的所述A液中,氮气氛围下充分搅拌并乳化,搅拌升温到45-55℃,滴加第二份苯乙烯,滴加完成后,再加入第二份过硫酸铵,升温到80-90℃,继续氮气氛围下搅拌至混匀,降温到45-55℃后,滴加氯化钠溶液,抽滤白色沉淀后,先用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,再用去离子水进行洗涤,烘干,形成聚苯乙烯微球粉末;所述过硫酸铵的浓度均为200mg/ml;氯化钠溶液的浓度为2M;所述烘干的温度为60℃;所述第一份苯乙烯、第一份过硫酸铵、A液、第二份苯乙烯、第二份过硫酸铵和氯化钠溶液的重量体积比为30g:2.5ml:200ml:30g:2.5ml:20ml;
ⅱ:多孔二氧化钛纳米微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤ⅰ得到的所述聚苯乙烯微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化钛前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,烘干,即得所述多孔二氧化钛纳米微球;优选的,所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、聚苯乙烯微球粉末、二氧化钛前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为50ml:2g:50ml:20ml。
具体的,所述多孔三氧化二铝纳米微球的制备方法包括以下步骤:
(1)三氧化二铝前驱体的制备:将偏铝酸钠溶解于去离子水中,充分搅拌至完全溶解,形成均匀透明的液体即为三氧化二铝前驱体;优选的,所述偏铝酸钠和去离子水的重量体积比为0.1g:50ml;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;优选的,聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
ⅰ:聚苯乙烯微球粉末的制备:将第一份苯乙烯和第一份过硫酸铵加入到步骤(2)得到的所述A液中,氮气氛围下充分搅拌并乳化,搅拌升温到45-55℃,滴加第二份苯乙烯,滴加完成后,再加入第二份过硫酸铵,升温到80-90℃,继续氮气氛围下搅拌至混匀,降温到45-55℃后,滴加氯化钠溶液,抽滤白色沉淀后,先用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,再用去离子水进行洗涤,烘干,形成聚苯乙烯微球粉末;所述过硫酸铵的浓度均为200mg/ml;氯化钠溶液的浓度为2M;所述烘干的温度为60℃;所述第一份苯乙烯、第一份过硫酸铵、A液、第二份苯乙烯、第二份过硫酸铵和氯化钠溶液的重量体积比为30g:2.5ml:200ml:30g:2.5ml:20ml;
ⅱ:多孔三氧化二铝纳米微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤ⅰ得到的所述聚苯乙烯微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述三氧化二铝前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,烘干,即得所述多孔三氧化二铝纳米微球;优选的,所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、聚苯乙烯微球粉末、三氧化二铝前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为50ml:2g:50ml:20ml。
以下通过实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而,所选的实施例仅用于说明本发明,而不限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种细胞外囊泡的纯化方法:采用纳米二氧化锆微球对细胞外囊泡进行纯化;
纳米二氧化锆微球的制备方法如下:
(1)自制二氧化锆前驱体:准确称量0.10g二氧化锆粉,放入150 mL烧杯中,加入10mL浓硫酸和3 g硫酸铵,盖上表面皿,放到电炉上加热溶解;待样品全部溶解后,取下稍冷,放入200 mL容量瓶中,加入20 mL浓硫酸;
(2)A液:0.05g 聚维酮和2g 十二烷基苯磺酸钠 溶于100ml 去离子水中充分搅拌溶解备用;
(3)纳米二氧化皓微球制备:将70ml A液加入搅拌瓶中,通入氮气,30℃ 800rpm搅拌15分钟,搅拌状态下缓慢加入30ml 二氧化锆前驱体,继续搅拌1小时,20ml N,N-二甲基甲酰胺以3秒每滴的速度加入混合液中,滴加完成后,升温到40℃ 800rpm 氮气氛围下继续搅拌12小时,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤3遍,600℃ 马弗炉干燥2小时即得。
实施例2
本实施例提供了一种细胞外囊泡的纯化方法:将样品放入缓冲液中,然后放入可与磷脂酰丝氨酸可逆性结合的纳米二氧化钛微球,细胞外囊泡被吸附在微球表面,而其他杂质不被吸附而去除,然后将吸附了细胞外囊泡的微球经洗液洗涤,最后经EB洗脱液洗涤,得到纯化的细胞外囊泡;
纳米二氧化钛微球的制备方法如下:
(1)自制二氧化钛前驱体:8ml 钛酸四丁酯溶于4ml无水乙醇中,缓慢加入100ml去离子水充分搅拌后,加入1.4ml浓盐酸,密封后室温放置48小时得到淡黄色透明液体;
(2)A液:0.05g 聚维酮和2g 十二烷基苯磺酸钠 溶于100ml 去离子水中充分搅拌溶解备用;
(3)纳米二氧化钛微球制备:将50ml A液加入搅拌瓶中,通入氮气,30℃ 800rpm搅拌15分钟,搅拌状态下缓慢加入50ml 二氧化钛前驱体,继续搅拌1小时,20ml N,N-二甲基甲酰胺以3秒每滴的速度加入混合液中,滴加完成后,升温到40℃ 800rpm 氮气氛围下继续搅拌12小时,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤3遍,600℃ 马弗炉干燥2小时即得。
实施例3
本实施例提供了一种细胞外囊泡的纯化方法:将样品放入缓冲液中,然后放入可与磷脂酰丝氨酸可逆性结合的纳米三氧化二铝微球,细胞外囊泡被吸附在微球表面,而其他杂质不被吸附而去除,然后将吸附了细胞外囊泡的微球经洗液洗涤,最后经EB洗脱液洗涤,得到纯化的细胞外囊泡;
纳米三氧化二铝微球的制备方法如下:
(1)自制三氧化二铝前驱体:室温下将0.1g偏铝酸钠溶解于50ml的去离子水中,充分搅拌溶解制得均匀透明液体;
(2)A液:0.05g 聚维酮和2g 十二烷基苯磺酸钠 溶于100ml 去离子水中充分搅拌溶解备用;
(3)纳米三氧化铝微球制备:将50ml A液加入搅拌瓶中,通入氮气,30℃ 800rpm搅拌15分钟,搅拌状态下缓慢加入50ml 三氧化铝前驱体,继续搅拌1小时,20ml N,N-二甲基甲酰胺以3秒每滴的速度加入混合液中,滴加完成后,升温到40℃ 800rpm 氮气氛围下继续搅拌12小时,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤3遍,600℃ 马弗炉干燥2小时即得。
实施例4
本实施例提供了一种细胞外囊泡的纯化方法:将样品放入缓冲液中,然后放入可与磷脂酰丝氨酸可逆性结合的纳米二氧化锆磁性微球(磁球),细胞外囊泡被吸附在磁球表面,而其他杂质不被吸附而去除,然后将吸附了细胞外囊泡的磁球经洗液洗涤,最后经EB洗脱液洗涤,得到纯化的细胞外囊泡;
纳米二氧化锆磁性微球的制备方法如下:
(1)自制二氧化锆前驱体:准确称量0.1 g二氧化锆粉,放入150 mL烧杯中,加入10mL浓硫酸和3 g硫酸铵,盖上表面皿,放到电炉上加热溶解;待样品全部溶解后,取下稍冷,放入200 mL容量瓶中,加入20 mL浓硫酸;
(2)A液:0.05g 聚维酮和2g 十二烷基苯磺酸钠 溶于100ml 去离子水中充分搅拌溶解备用;
(3)四氧化三铁微球制备:将3.24g 三氯化铁和2.78g 硫酸亚铁溶于100ml A液中,充分搅拌后,用A液定容到200ml,30℃ 800rpm搅拌15分钟,搅拌状态下滴加入50ml饱和碳酸氢铵溶液,同时通入氮气搅拌并升温,温度升高到80℃时,滴加10ml 1M的氢氧化钠溶液,观察液体变为纯黑色后继续氮气氛围下搅拌2小时,磁吸收获黑色沉淀,无水乙醇洗涤3遍,去离子水洗涤3遍后,60℃烘箱干燥12小时;
(4)纳米二氧化锆磁性微球制备:将70ml A液加入搅拌瓶中,准确称量2g 四氧化三铁微球粉末,通入氮气,30℃ 800rpm搅拌15分钟,搅拌状态下缓慢加入30ml 二氧化锆前驱体,继续搅拌1小时,20ml N,N-二甲基甲酰胺以3秒每滴的速度加入混合液中,滴加完成后,升温到40℃ 800rpm 氮气氛围下继续搅拌12小时,磁吸褐色沉淀后,用无水乙醇洗涤3遍,100℃ 马弗炉干燥4小时即得。
实施例5
本实施例提供了一种细胞外囊泡的纯化方法:将样品放入缓冲液中,然后放入可与磷脂酰丝氨酸可逆性结合的纳米二氧化钛磁性微球(磁球),细胞外囊泡被吸附在磁球表面,而其他杂质不被吸附而去除,然后将吸附了细胞外囊泡的磁球经洗液洗涤,最后经EB洗脱液洗涤,得到纯化的细胞外囊泡;
纳米二氧化钛磁性微球的制备方法如下:
(1)自制二氧化钛前驱体:8ml 钛酸四丁酯溶于4ml无水乙醇中,缓慢加入100ml去离子水充分搅拌后,加入1.4ml浓盐酸,密封后室温放置48小时得到淡黄色透明液体;
(2)A液:0.05g 聚维酮和2g 十二烷基苯磺酸钠 溶于100ml 去离子水中充分搅拌溶解备用;
(3)四氧化三铁微球制备:将3.24g 三氯化铁和2.78g 硫酸亚铁溶于100ml A液中,充分搅拌后,用A液定容到200ml,30℃ 800rpm搅拌15分钟,搅拌状态下滴加入50ml饱和碳酸氢铵溶液,同时通入氮气搅拌并升温,温度升高到80℃时,滴加10ml 1M的氢氧化钠溶液,观察液体变为纯黑色后同时通入氮气搅拌2小时,磁吸收获黑色沉淀,无水乙醇洗涤3遍,去离子水洗涤3遍后,60℃烘箱干燥12小时;
(4)纳米二氧化钛磁性微球制备:将50ml A液加入搅拌瓶中,准确称量2g 四氧化三铁微球粉末,通入氮气,30℃ 800rpm搅拌15分钟,搅拌状态下缓慢加入50ml 二氧化钛前驱体,继续搅拌1小时,20ml N,N-二甲基甲酰胺以3秒每滴的速度加入混合液中,滴加完成后,升温到40℃ 800rpm 氮气氛围下继续搅拌12小时,磁吸褐色沉淀后,用无水乙醇洗涤3遍,100℃ 马弗炉干燥4小时即得。
实施例6
本实施例提供了一种细胞外囊泡的纯化方法:将样品放入缓冲液中,然后放入可与磷脂酰丝氨酸可逆性结合的纳米三氧化二铝磁性微球(磁球),细胞外囊泡被吸附在磁球表面,而其他杂质不被吸附而去除,然后将吸附了细胞外囊泡的磁球经洗液洗涤,最后经EB洗脱液洗涤,得到纯化的细胞外囊泡;
纳米三氧化二铝磁性微球的制备方法如下:
(1)自制三氧化二铝前驱体:室温下将0.1g偏铝酸钠溶解于50ml的去离子水中,充分搅拌溶解制得均匀透明液体;
(2)A液:0.05g 聚维酮和2g 十二烷基苯磺酸钠 溶于100ml 去离子水中充分搅拌溶解备用;
(3)四氧化三铁微球制备:将3.24g 三氯化铁和2.78g 硫酸亚铁溶于100ml A液中,充分搅拌后,用A液定容到200ml,30℃ 800rpm搅拌15分钟,搅拌状态下滴加入50ml饱和碳酸氢铵溶液,同时通入氮气搅拌并升温,温度升高到80℃时,滴加10ml 1M的氢氧化钠溶液,观察液体变为纯黑色后同时通入氮气搅拌2小时,磁吸收获黑色沉淀,无水乙醇洗涤3遍,去离子水洗涤3遍后,60℃烘箱干燥12小时;
(4)纳米三氧化二铝磁性微球制备:将50ml A液加入搅拌瓶中,准确称量2g 四氧化三铁微球粉末,通入氮气,30℃ 800rpm搅拌15分钟,搅拌状态下缓慢加入50ml 三氧化二铝前驱体,继续搅拌1小时,20ml N,N-二甲基甲酰胺以3秒每滴的速度加入混合液中,滴加完成后,升温到40℃ 800rpm 氮气氛围下继续搅拌12小时,磁吸褐色沉淀后,用无水乙醇洗涤3遍,100℃ 马弗炉干燥4小时即得。
实施例7
本实施例提供了一种细胞外囊泡的纯化方法:将样品放入缓冲液中,然后放入可与磷脂酰丝氨酸可逆性结合的多孔二氧化锆纳米微球,细胞外囊泡被吸附在微球表面,而其他杂质不被吸附而去除,然后将吸附了细胞外囊泡的微球经洗液洗涤,最后经EB洗脱液洗涤,得到纯化的细胞外囊泡;
多孔二氧化锆纳米微球的制备方法如下:
(1)自制二氧化锆前驱体:准确称量0.1 g二氧化锆粉,放入150 mL烧杯中,加入10mL浓硫酸和3 g硫酸铵,盖上表面皿,放到电炉上加热溶解;待样品全部溶解后,取下稍冷,放入200 mL容量瓶中,加入20 mL浓硫酸;
(2)A液:0.05g 聚维酮和2g 十二烷基苯磺酸钠 溶于100ml 去离子水中充分搅拌溶解备用;
(3)聚苯乙烯(PS)微球制备:准确称量30g苯乙烯和2.5ml 浓度为200mg/ml的过硫酸铵加入室温1200rpm搅拌的200ml A液中,氮气氛围下充分搅拌乳化4小时,氮气氛围下1200rpm搅拌升温到50℃,以5秒每滴的速度加入30g苯乙烯混合液中,滴加完成后,再加入2.5ml 浓度为200mg/ml的过硫酸铵,升温到85℃ 1200rpm 氮气氛围下继续搅拌2小时,降温到50℃后,继续滴加20ml 浓度为2M的氯化钠溶液,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤3遍,去离子水洗3遍,60℃烘箱干燥12小时;
(4)多孔二氧化锆纳米微球制备:将70ml A液加入搅拌瓶中,准确称量2g PS微球粉末,通入氮气,30℃ 400rpm搅拌15分钟,搅拌状态下缓慢加入30ml 二氧化锆前驱体,继续搅拌1小时,20ml N,N-二甲基甲酰胺以3秒每滴的速度加入混合液中,滴加完成后,升温到40℃ 400rpm 氮气氛围下继续搅拌12小时,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤3遍,600℃马弗炉干燥4小时即得。
实施例8
本实施例提供了一种细胞外囊泡的纯化方法:将样品放入缓冲液中,然后放入可与磷脂酰丝氨酸可逆性结合的多孔二氧化钛纳米微球,细胞外囊泡被吸附在微球表面,而其他杂质不被吸附而去除,然后将吸附了细胞外囊泡的微球经洗液洗涤,最后经EB洗脱液洗涤,得到纯化的细胞外囊泡;
多孔二氧化钛纳米微球的制备方法如下:
(1)自制二氧化钛前驱体:8ml 钛酸四丁酯溶于4ml无水乙醇中,缓慢加入100ml去离子水充分搅拌后,加入1.4ml浓盐酸,密封后室温放置48小时得到淡黄色透明液体;
(2)A液:0.05g 聚维酮和2g 十二烷基苯磺酸钠 溶于100ml 去离子水中充分搅拌溶解备用;
(3)聚苯乙烯(PS)微球制备:准确称量30g苯乙烯和2.5ml 浓度为200mg/ml的过硫酸铵加入室温1200rpm搅拌的200ml A液中,氮气氛围下充分搅拌乳化4小时,氮气氛围下1200rpm搅拌升温到50℃,以5秒每滴的速度加入30g苯乙烯混合液中,滴加完成后,再加入2.5ml 浓度为200mg/ml的过硫酸铵,升温到85℃ 1200rpm 氮气氛围下继续搅拌2小时,降温到50℃后,继续滴加20ml 浓度为2M的氯化钠溶液,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤3遍,去离子水洗3遍,60℃烘箱干燥12小时;
(4)多孔二氧化钛纳米微球制备:将50ml A液加入搅拌瓶中,准确称量2g PS微球粉末,通入氮气,30℃ 400rpm搅拌15分钟,搅拌状态下缓慢加入50ml 二氧化钛前驱体,继续搅拌1小时,20ml N,N-二甲基甲酰胺以3秒每滴的速度加入混合液中,滴加完成后,升温到40℃ 400rpm 氮气氛围下继续搅拌12小时,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤3遍,600℃马弗炉干燥4小时即得。
实施例9
本实施例提供了一种细胞外囊泡的纯化方法:将样品放入缓冲液中,然后放入可与磷脂酰丝氨酸可逆性结合的多孔三氧化二铝纳米微球,细胞外囊泡被吸附在微球表面,而其他杂质不被吸附而去除,然后将吸附了细胞外囊泡的微球经洗液洗涤,最后经EB洗脱液洗涤,得到纯化的细胞外囊泡;
多孔三氧化二铝纳米微球的制备方法如下:
(1)自制三氧化二铝前驱体:室温下将0.1g偏铝酸钠溶解于50ml的去离子水中,充分搅拌溶解制得均匀透明液体;
(2)A液:0.05g 聚维酮和2g 十二烷基苯磺酸钠 溶于100ml 去离子水中充分搅拌溶解备用;
(3)聚苯乙烯(PS)微球制备:准确称量30g苯乙烯和2.5ml 浓度为200mg/ml的过硫酸铵加入室温1200rpm搅拌的200ml A液中,氮气氛围下充分搅拌乳化4小时,氮气氛围下1200rpm搅拌升温到50℃,以5秒每滴的速度加入30g苯乙烯混合液中,滴加完成后,再加入2.5ml 浓度为200mg/ml的过硫酸铵,升温到85℃ 1200rpm 氮气氛围下继续搅拌2小时,降温到50℃后,继续滴加20ml 浓度为2M的氯化钠溶液,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤3遍,去离子水洗3遍,60℃烘箱干燥12小时;
(4)多孔三氧化二铝纳米微球制备:将50ml A液加入搅拌瓶中,准确称量2g PS微球粉末,通入氮气,30℃ 400rpm搅拌15分钟,搅拌状态下缓慢加入50ml 三氧化二铝前驱体,继续搅拌1小时,20ml N,N-二甲基甲酰胺以3秒每滴的速度加入混合液中,滴加完成后,升温到40℃ 400rpm 氮气氛围下继续搅拌12小时,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤3遍,600℃ 马弗炉干燥4小时即得。
纯化效果试验
1、非磁性纳米微球纯化细胞培养上清外囊泡
分别采用实施例1-3得到的纳米二氧化锆微球、纳米二氧化钛微球和纳米三氧化二铝微球对细胞培养上清外囊泡进行纯化,具体方法为:
新鲜培养293T细胞培养上清,3000g离心10分钟,去除细胞碎片。取500ul于1.5mlEP管中,加入等体积结合缓冲液(200mM 乙酸-乙酸钠 pH 5.5),按重量加入0.5%(M/V)非磁性纳米微球轻柔混匀,室温放置15分钟,10000g 离心5分钟,弃上清,用洗涤液(0.02%OB-2生理盐水)1ml重悬微球,10000g 离心3分钟,弃上清,重复洗涤2次;加入50ul 洗脱液A(100mM 乙酸钠-碳酸氢钠 pH 10.0)重悬微球,室温放置5分钟,10000g离心5分钟,上清转移到新的1.5ml EP管中,加入450ul 洗脱液B(生理盐水)混匀后,产物即为细胞培养上清外囊泡,可直接后续实验或者-80℃冻存。
将采用纳米二氧化锆微球、纳米二氧化钛微球和纳米三氧化二铝微球纯化得到的细胞培养上清外囊泡分别进行电镜(TEA)和纳米粒子示踪(NTA)和CSFE染色流式鉴定。
传统细胞外囊泡鉴定方法为:电镜图片(TEA),纳米粒子示踪(NTA)和特异性标记物的蛋白印记杂交(WB)进行鉴定,由于细胞外囊泡有组织特异性,单纯的WB不具有普遍性,我们采用 CSFE染色流式鉴定的方法检测细胞外囊泡的活性和数量。
鉴定结果:电镜图片如图1a,图1b,图1c所示,图1a为本发明的非磁性纳米二氧化锆微球纯化得到的细胞培养上清外囊泡电镜图;图1b为本发明的纳米二氧化钛微球纯化得到的细胞培养上清外囊泡电镜图;图1c为本发明的非磁性纳米三氧化二铝微球纯化得到的细胞培养上清外囊泡电镜图;纳米粒子示踪(NTA)鉴定结果如图2所示,CSFE染色流式鉴定结果如图3所示。
从电镜图片、纳米粒子示踪(NTA)图和CSFE染色流式细胞仪的鉴定结果图中可以看出,金属氧化物可以在特定的缓冲体系下,可逆结合细胞培养上清外囊泡,采用本发明的金属氧化物微球对细胞外囊泡进行纯化,效果较好,且可以重复利用。
2、非磁性纳米微球纯化牛奶来源细胞外囊泡
分别采用实施例1-3得到的纳米二氧化锆微球、纳米二氧化钛微球和纳米三氧化二铝微球对牛奶来源细胞外囊泡进行纯化,具体方法为:
保质期无菌纯牛奶,按体积1:1用200mM 乙酸-乙酸钠 pH 4.7 稀释,轻柔混匀,37℃ 孵育3小时,室温2500RPM 离心收集上清液备用;
取1ml上清液于1.5ml EP管中,按重量加入0.5%(M/V)纳米金属氧化物微球轻柔混匀,室温放置15分钟,10000g 离心5分钟,弃上清,用洗涤液(0.02%OB-2生理盐水)1ml重悬微球,10000g 离心3分钟,弃上清,重复洗涤2次;加入50ul 洗脱液A(100mM 乙酸钠-碳酸氢钠 pH 10.0)重悬微球,室温放置5分钟,10000g离心5分钟,上清转移到新的1.5ml EP管中,加入450ul 洗脱液B(生理盐水)混匀后,产物直接后续实验或者-80℃冻存。
鉴定结果:电镜图片如图4a,图4b和图4c所示,图4a为本发明的二氧化锆纳米微球纯化得到的牛奶来源细胞外囊泡电镜图;图4b为本发明的二氧化钛纳米微球纯化得到的牛奶来源细胞外囊泡电镜图;图4c为本发明的三氧化二铝纳米微球纯化得到的牛奶来源细胞外囊泡电镜图; CSFE染色流式鉴定结果如图5所示。
从电镜图片和CSFE染色流式细胞仪的鉴定结果图中可以看出,金属氧化物可以在特定的缓冲体系下,可逆结合牛奶来源细胞外囊泡,采用本发明的金属氧化物微球对细胞外囊泡进行纯化,效果较好,且可以重复利用。
3、非磁性纳米微球纯化人尿液细胞外囊泡
分别采用实施例1-3得到的纳米二氧化锆微球、纳米二氧化钛微球和纳米三氧化二铝微球对人尿液细胞外囊泡进行纯化,具体方法为:
新鲜收集尿液,3000g离心10分钟,去除沉渣和碎片。取500ul于1.5ml EP管中,加入等体积结合缓冲液(200mM 乙酸-乙酸钠 pH 5.5),按重量加入0.5%(M/V)纳米金属氧化物微球轻柔混匀,室温放置15分钟,10000g 离心5分钟,弃上清,用洗涤液(0.02%OB-2生理盐水)1ml重悬微球,10000g 离心3分钟,弃上清,重复洗涤2次;加入50ul 洗脱液A(100mM乙酸钠-碳酸氢钠 pH 10.0)重悬微球,室温放置5分钟,10000g离心5分钟,上清转移到新的1.5ml EP管中,加入450ul 洗脱液B(生理盐水)混匀后,产物直接后续实验或者-80℃冻存。
鉴定结果:电镜图片如图6a,图6b和图6c所示,图6a为本发明的二氧化锆纳米微球纯化得到的人尿液来源细胞外囊泡电镜图;图6b为本发明的二氧化钛纳米微球纯化得到的人尿液来源细胞外囊泡电镜图;图6c为本发明的三氧化二铝纳米微球纯化得到的人尿液来源细胞外囊泡电镜图; CSFE染色流式鉴定结果如图7所示。
从电镜图片和CSFE染色流式细胞仪的鉴定结果图中可以看出,金属氧化物可以在特定的缓冲体系下,可逆结合人尿液细胞外囊泡,采用本发明的金属氧化物微球对细胞外囊泡进行纯化,效果较好,且可以重复利用。
总之:金属氧化物微球在特定的缓冲体系下可以可逆结合生物膜中的磷脂酰丝氨酸,可以纯化样本中的细胞外囊泡;不同样本对其纯化细胞外囊泡效率稳定,金素氧化物材料可以适用纯化样本细胞外囊泡的新方法。
4、不同磁性纳米微球纯化细胞培养上清外囊泡比较
分别采用实施例4-6得到的纳米二氧化锆磁性微球、纳米二氧化钛磁性微球和纳米三氧化二铝磁性微球对细胞培养上清外囊泡进行纯化,具体方法为:
新鲜培养293T细胞培养上清,3000g离心10分钟,去除细胞碎片。取500ul于1.5mlEP管中,加入等体积结合缓冲液(200mM 乙酸-乙酸钠 pH 5.5),按重量加入0.5%(M/V)磁性纳米金属氧化物微球轻柔混匀,室温放置15分钟,样本EP管置于磁力架磁吸3分钟,弃上清,用洗涤液(0.02%OB-2生理盐水)1ml重悬磁性微球,样本EP管置于磁力架磁吸1分钟,弃上清,重复洗涤2次;加入50ul 洗脱液A(100mM 乙酸钠-碳酸氢钠 pH 10.0)重悬微球,室温放置5分钟,置于磁力架磁吸3分钟,上清转移到新的1.5ml EP管中,加入450ul 洗脱液B(生理盐水)混匀后,产物直接后续实验或者-80℃冻存。
3种不同金属氧化物磁性微球纯化细胞外囊泡后经CSFE染色后鉴定如图8.
从图8中可以看出,不同金属氧化物结合细胞外囊泡的亲和力不同,相同条件下样本细胞外囊泡的回收率不同,采用纳米二氧化锆磁性微球纯化效果最好(98.0%),纳米二氧化钛磁性微球次之(93.8%),纳米三氧化二铝磁性微球效果较差(23.1%)。
5、亲和吸附层析柱纯化人尿液细胞外囊泡
采用实施例7得到的多孔二氧化锆纳米微球、作为填料装入层析柱对人尿液细胞外囊泡进行纯化,具体方法为:
(1)装柱
按照所需多孔微球填料用量(g)= 层析柱外柱体积(ml)× 15%,计算所需多孔微球填料量,干净烧杯中用适量无水乙醇悬浮填料,层析柱外柱垫入相应大小的筛板,用适量无水乙醇润湿筛板,竖直状态下将全部填料转入层析柱中,静置10分钟,垫入另外一片筛板压紧填料,无水乙醇补满层析柱,竖直置于铁架台上,下方放置收集容器,打开层析柱下方封帽,让液体自然流出,用无菌水注满层析柱后自然流出,加入1/2体积结合缓冲液(200mM乙酸-乙酸钠 pH 5.5),自然流出2个柱体积时封闭下出液口,亲和层析柱装柱完成。
(2)纯化
样本收集与前处理
收集当天500ml 新鲜尿液于无菌容器中,样本经4℃,10000g离心10分钟,或者过0.45μm滤膜后备用。
准确称量9g 二氧化锆多孔纳米材料,按步骤(1)装入60ml体积的亲和层析柱,平衡好层析柱。
细胞外囊泡大规模纯化及鉴定
1 在合适体积的无菌三角瓶中,收集450ml前处理样品,加入50ml结合缓冲液BB(1M 乙酸-乙酸钠 PH 5.5),轻柔混合均匀,室温放置10分钟。
2 将层析柱置于铁架台上,下方放置液体收集器皿,开启层析柱上盖和下帽,让液体自然流出,分次加入步骤1样品混合液,让所有样本混合液通过层析柱。
3 层析柱中加入60ml洗涤液(0.02% OB-2 生理盐水),让液体自然流出,重复洗涤2次。
4层析柱中加入20ml洗涤洗脱液A(100mM 乙酸钠-碳酸氢钠 PH 10.0),待液体将要滴出时,加盖层析柱下帽,室温放置10分钟。取下层析柱下帽,收集液体到新的无菌管中。
5 收集管中加入40ml洗脱液B(生理盐水),轻柔混匀后编号,收集管中即为样品纯化细胞外囊泡,可用于后续实验或者-80℃冻存。
结果:采用多孔二氧化锆纳米微球作为填料装入层析柱对人尿液细胞外囊泡进行纯化,得到的人尿液细胞外囊泡进行电镜鉴定如图9所示,CSFE染色流式细胞仪鉴定结果如图10所示。
从图中可以看出,本发明的纳米多孔微球可以在特定的缓冲体系下,可逆结合人尿液中细胞外囊泡,大体积样本在重力作用下通过二氧化锆金属氧化物特异结合细胞外囊泡,其余非囊泡物质和蛋白不被结合而流出,达到样本中细胞外囊泡的亲和层析浓缩,得率可达到90%以上。
采用多孔纳米微球对细胞外囊泡进行纯化的原理:亲和层析捕获法是基于多孔材料与磷脂酰丝氨酸(PS)的可逆结合洗脱,本发明采用与细胞外囊泡高亲和力的大孔径材料的纯化方式。样品在结合缓冲液(EV-SB)的作用下细胞外囊泡特异的吸附在多孔材料的表面,而其他非磷脂蛋白质等杂质则不被吸附而去除。吸附了细胞外囊泡的多孔材料经洗液洗涤去除蛋白质、杂质,最后纯的细胞外囊泡被洗脱液EB洗脱。目前市场上尚未见同类亲和纯化产品。
本发明的多孔纳米微球参数如下:
比表面积:120M2/g;
密度:0.95g/cm3;
粒径: 45μm;
回收得率:≥90% 。
本发明采用45um大孔径微球包裹磷脂酰丝氨酸(PS)特异性结合材料,推出了细胞外囊泡固相纯化试剂盒,9g亲和纯化填料至少可结合500ml样本的细胞外囊泡,纯化得率可达90%以上,洗脱后细胞外囊泡纯度高,无螯合剂等试剂掺入,对后续实验影响较小。
对比例1
试验方法:本对比例采用免疫吸附法对细胞外囊泡进行纯化,Takara 固相材料采用马铃薯凝集素标记。
试验结果:与实施例2采用纳米二氧化锆微球对细胞外囊泡进行纯化的结果进行比较,本发明的实施例2的微球载体更灵活,直接与生物膜系统中的结构蛋白磷脂酰丝氨酸(PS)特异结合,能够最大程度的保留样本中的细胞外囊泡。对比例1的Takara 固相材料采用马铃薯凝集素标记,只能捕获糖基化修饰的细胞外囊泡亚群,由于凝集素与糖基结合不是很特异,所以纯化得到的细胞外囊泡不纯,且未被糖基化的细胞外囊泡丢失。
对比例2
采用特有的Tim4标记磁珠通过钙离子桥间接结合磷脂酰丝氨酸(PS),对细胞外囊泡进行纯化。
试验结果:与实施例4采用纳米二氧化锆磁性微球对细胞外囊泡进行纯化的结果进行比较,本发明的实施例4的磁性微球采用磷脂酰丝氨酸(PS)高亲和力结合磁微粒材料,可以直接与PS可逆结合,实验步骤比较简单,洗脱得到纯度较高的细胞外囊泡,不含螯合剂等可能影响后续实验的试剂。对比例2 采用特有的Tim4标记磁微粒通过钙离子桥间接结合PS,成本较高,细胞外囊泡结合磁珠后易脱落,操作步骤繁琐,同时洗脱后的细胞外囊泡中含有大量螯合剂,影响细胞外囊泡活性及后续实验。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种细胞外囊泡纯化材料,其特征在于,所述纯化材料为纳米二氧化锆微球,所述纳米二氧化锆微球的制备方法包括以下步骤:
(1)二氧化锆前驱体的制备:将二氧化锆粉、第一份浓硫酸和硫酸铵进行混合并加热至溶解,放至室温后加入第二份浓硫酸,混合均匀,形成二氧化锆前驱体;所述二氧化锆粉、第一份浓硫酸、硫酸铵和第二份浓硫酸的重量体积比为0.09-0.11g:9-11ml:2-4g:18-22ml;
(2)A液的制备:聚维酮和十二烷基苯磺酸钠溶于去离子水中充分搅拌溶解,形成A液;聚维酮、十二烷基苯磺酸钠和去离子水的重量体积比为0.05g:2g:100ml;
(3)纳米二氧化皓微球制备:将步骤(2)得到的所述A液通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化锆前驱体,再滴加入N,N-二甲基甲酰胺,反应完成后抽滤白色沉淀,用无水乙醇洗涤后干燥即得所述纳米二氧化锆微球;所述A液、二氧化锆前驱体、N,N-二甲基甲酰胺的体积比为7:3:2。
2.一种细胞外囊泡纯化材料,其特征在于,所述纯化材料为纳米二氧化锆磁性微球,所述纳米二氧化锆磁性微球的制备方法包括以下步骤:
采用权利要求1中的步骤1)制备二氧化锆前驱体;
采用权利要求1中的步骤2)制备A液;以及
步骤Ⅰ:四氧化三铁微球粉末的制备:将三氯化铁和硫酸亚铁溶于步骤(2)得到的所述A液中,充分搅拌至混合均匀,搅拌状态下滴加入饱和碳酸氢铵溶液,同时通入氮气搅拌并升温,温度升高到75-85℃时,滴加氢氧化钠溶液,观察液体变为纯黑色后继续在氮气氛围下搅拌混合,磁吸收获黑色沉淀,将所述黑色沉淀先用无水乙醇进行洗涤,再用去离子水洗涤后烘干,形成四氧化三铁微球粉末;所述烘干的温度为60℃;所述氢氧化钠溶液的浓度为1M;所述三氯化铁、硫酸亚铁、饱和碳酸氢铵溶液和1M氢氧化钠溶液的重量体积比为3.24g:2.78g:50ml:10ml;
和步骤Ⅱ:纳米二氧化锆磁性微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤Ⅰ得到的所述四氧化三铁微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化锆前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,磁吸褐色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述褐色沉淀,烘干,即得所述纳米二氧化锆磁性微球;所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、四氧化三铁微球粉末、二氧化锆前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为70ml:2g:30ml:20ml。
3.一种细胞外囊泡纯化材料,其特征在于,所述纯化材料为多孔二氧化锆纳米微球,所述多孔二氧化锆纳米微球的制备方法包括以下步骤:
采用权利要求1中的步骤1)制备二氧化锆前驱体;
采用权利要求1中的步骤2)制备A液;以及
ⅰ:聚苯乙烯微球粉末的制备:将第一份苯乙烯和第一份过硫酸铵加入到步骤(2)得到的所述A液中,氮气氛围下充分搅拌并乳化,搅拌升温到45-55℃,滴加第二份苯乙烯,滴加完成后,再加入第二份过硫酸铵,升温到80-90℃,继续氮气氛围下搅拌至混匀,降温到45-55℃后,滴加氯化钠溶液,抽滤白色沉淀后,先用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,再用去离子水进行洗涤,烘干,形成聚苯乙烯微球粉末;所述过硫酸铵的浓度均为200mg/ml;氯化钠溶液的浓度为2M;所述烘干的温度为60℃;所述第一份苯乙烯、第一份过硫酸铵、A液、第二份苯乙烯、第二份过硫酸铵和氯化钠溶液的重量体积比为30g:2.5ml:200ml:30g:2.5ml:20ml;
ⅱ:多孔二氧化锆纳米微球的制备:向步骤(2)得到的所述A液中加入步骤ⅰ得到的所述聚苯乙烯微球粉末,通入氮气,搅拌状态下加入步骤(1)得到的所述二氧化锆前驱体,继续搅拌至混合均匀,边搅拌边滴加 N,N-二甲基甲酰胺,滴加完成后,升温到35-45℃,氮气氛围下继续搅拌,抽滤白色沉淀后,用无水乙醇洗涤所述白色沉淀,烘干,即得所述多孔二氧化锆纳米微球;所述烘干的温度为100℃,所述烘干的时间为4小时;所述A液、聚苯乙烯微球粉末、二氧化锆前驱体、 N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为70ml:2g:30ml:20ml。
4.一种细胞外囊泡纯化方法,其特征在于,所述纯化方法为:采用权利要求1-3任一所述的纯化材料对细胞外囊泡进行纯化。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210126779.6A CN114164203B (zh) | 2022-02-11 | 2022-02-11 | 一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法 |
US17/740,283 US20230258629A1 (en) | 2022-02-11 | 2022-05-09 | Extracellular vesicle purification material and purification method |
CA3159270A CA3159270A1 (en) | 2022-02-11 | 2022-05-18 | Extracellular vesicle purification material and purification method |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210126779.6A CN114164203B (zh) | 2022-02-11 | 2022-02-11 | 一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114164203A CN114164203A (zh) | 2022-03-11 |
CN114164203B true CN114164203B (zh) | 2022-05-10 |
Family
ID=80489661
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210126779.6A Active CN114164203B (zh) | 2022-02-11 | 2022-02-11 | 一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230258629A1 (zh) |
CN (1) | CN114164203B (zh) |
CA (1) | CA3159270A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117122736B (zh) * | 2023-08-28 | 2024-04-05 | 北京大学口腔医学院 | 一种凋亡囊泡自组装改性plga多孔微球复合材料及其用途 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108975391A (zh) * | 2018-07-26 | 2018-12-11 | 四川理工学院 | 一种金属氧化物纳米微球的合成方法 |
CN110343664A (zh) * | 2018-04-03 | 2019-10-18 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 提取外泌体及外泌体蛋白的方法 |
CN111358957A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-07-03 | 西安组织工程与再生医学研究所 | 磁性纳米颗粒 |
CN113774008A (zh) * | 2021-08-14 | 2021-12-10 | 光武惠文生物科技(北京)有限公司 | 一种外泌体的提取方法及其应用 |
CN215856071U (zh) * | 2021-08-03 | 2022-02-18 | 北京青莲百奥生物科技有限公司 | 一种用于分离细胞外囊泡的离心管和提取细胞外囊泡的试剂盒 |
-
2022
- 2022-02-11 CN CN202210126779.6A patent/CN114164203B/zh active Active
- 2022-05-09 US US17/740,283 patent/US20230258629A1/en active Pending
- 2022-05-18 CA CA3159270A patent/CA3159270A1/en active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110343664A (zh) * | 2018-04-03 | 2019-10-18 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 提取外泌体及外泌体蛋白的方法 |
CN108975391A (zh) * | 2018-07-26 | 2018-12-11 | 四川理工学院 | 一种金属氧化物纳米微球的合成方法 |
CN111358957A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-07-03 | 西安组织工程与再生医学研究所 | 磁性纳米颗粒 |
CN215856071U (zh) * | 2021-08-03 | 2022-02-18 | 北京青莲百奥生物科技有限公司 | 一种用于分离细胞外囊泡的离心管和提取细胞外囊泡的试剂盒 |
CN113774008A (zh) * | 2021-08-14 | 2021-12-10 | 光武惠文生物科技(北京)有限公司 | 一种外泌体的提取方法及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114164203A (zh) | 2022-03-11 |
US20230258629A1 (en) | 2023-08-17 |
CA3159270A1 (en) | 2023-08-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110231207B (zh) | 一种分离外泌体的方法 | |
JP6126619B2 (ja) | 細胞分離方法 | |
JP6661368B2 (ja) | マルチソート細胞分離法 | |
JP2002538458A (ja) | 生物学的流体の分離のための装置を用いる方法 | |
CN108841777A (zh) | 基于静电吸附的胞外囊泡及其内含物的提取方法及装置 | |
CA2790024A1 (en) | Methods and reagents for improved selection of biological materials | |
JPH06505673A (ja) | 磁気分離機、磁気分離方法、リガンド測定方法ならびに分離方法 | |
EP3299816A1 (en) | Separation method, detection method, signal measurement method, disease determination method, drug efficacy assessment method, kit, liquid composition, and specimen diluent | |
CN114164203B (zh) | 一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法 | |
Xu et al. | Research development on exosome separation technology | |
Rosado et al. | Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection | |
CN113101737B (zh) | 一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用 | |
Ströhle et al. | Affinity-based isolation of extracellular vesicles and the effects on downstream molecular analysis | |
KR101533230B1 (ko) | 다단 미세유체 칩 및 이를 이용한 시료의 선택적 분리방법 | |
Zhang et al. | Application of nanomaterials in proteomics-driven precision medicine | |
Gomes et al. | Magnetic hydrophobic‐charge induction adsorbents for the recovery of immunoglobulins from antiserum feedstocks by high‐gradient magnetic fishing | |
CN215856071U (zh) | 一种用于分离细胞外囊泡的离心管和提取细胞外囊泡的试剂盒 | |
CN114276992A (zh) | 一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法 | |
US20040132044A1 (en) | Magnetic beads and uses thereof | |
CN114736868B (zh) | 一种温度响应功能复合物、一种外泌体均相分离纯化方法 | |
CN112430569B (zh) | 蛋白sftpc作为肺癌诊断标志物的应用、试剂盒 | |
CN109136164A (zh) | 一种基于lbl法修饰肝素分离细胞外囊泡的方法 | |
CN112322583B (zh) | 基于凝血的细胞外囊泡捕获技术 | |
CN212560306U (zh) | 一种循环肿瘤细胞的富集装置 | |
CN115558629A (zh) | 一种外泌体提取亲和磁珠及其提取试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |