CN114276992A - 一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法 - Google Patents
一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114276992A CN114276992A CN202111524286.XA CN202111524286A CN114276992A CN 114276992 A CN114276992 A CN 114276992A CN 202111524286 A CN202111524286 A CN 202111524286A CN 114276992 A CN114276992 A CN 114276992A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- exosome
- separation
- purification kit
- composition
- complete
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 81
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 36
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 21
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 21
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 18
- -1 hexadecyl quaternary ammonium salt Chemical class 0.000 claims description 18
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 10
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 7
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102100034283 Annexin A5 Human genes 0.000 claims description 3
- 101100165655 Arabidopsis thaliana BRO1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002029 Claudin Human genes 0.000 claims description 3
- 108050009302 Claudin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 claims description 3
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102100032790 Flotillin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100032564 Golgin subfamily A member 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010074556 Golgin subfamily A member 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 claims description 3
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101710113864 Heat shock protein 90 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 claims description 3
- 101000780122 Homo sapiens Annexin A5 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000847538 Homo sapiens Flotillin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101100082597 Homo sapiens PDCD6IP gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101000613251 Homo sapiens Tumor susceptibility gene 101 protein Proteins 0.000 claims description 3
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims description 3
- 102100033344 Programmed cell death 6-interacting protein Human genes 0.000 claims description 3
- 102100030552 Synaptosomal-associated protein 25 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040879 Tumor susceptibility gene 101 protein Human genes 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 claims description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 3
- 108040000979 soluble NSF attachment protein activity proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108020005198 Long Noncoding RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000000089 atomic force micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 208000017497 prostate disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本申请提供了一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法，所述试剂盒包括用于捕获外泌体、形成特异性结合体的免疫磁球，用于吸引所述免疫磁球的磁分离架，用于分离特异性结合体的洗脱液和用于洗涤外泌体的洗涤液。采用本申请制备的完整外泌体分离、纯化试剂盒能够快速捕获、分离和纯化外泌体，既可以简便快速使用，又可以保证外泌体完整性，且分离得到的外泌体具有较高的纯度，分离过程中添加的各种试剂不会影响后续检测分析，是一种快速、高效的完整外泌体分离、纯化试剂盒。采用本申请制备的试剂盒，可以简便快速，同时保证外泌体完整性将外泌体吸附、分离、并进行纯化，不会破坏外泌体的完整性和生物活性。
Description
技术领域
本申请属于生物技术领域，具体涉及一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法。
背景技术
外泌体是由活细胞分泌的纳米级双层膜囊泡，是细胞信号传导的重要介质，并且具有促进肿瘤血管生成和转移的各种生物学效应。外泌体不仅含有蛋白质、DNA和mRNA，也含有非编码RNA，包括MicroRNA、lncRNA和circular RNA。lncRNA(Linc00152)在胃癌患者血浆外泌体中表达显著升高，而且外泌体能保护Linc00152，使其能在血液中稳定存在，因此外泌体Linc00152有可能作为胃癌诊断新的生物标志物。而且前列腺癌患者尿液中外泌体lncRNA-p21表达显著增加，表明外泌体lncRNA-p21可用来鉴别前列腺癌和前列腺良性疾病。外泌体介导的生物分子转运具有调节受体细胞生物学功能的重要作用。研究也表明外泌体相关的lncRNA能调节细胞功能，在肿瘤发生发展中具有重要作用。
目前，均通过免疫磁珠捕获外泌体，获得外泌体-磁珠复合物，然后将该复合物进行表征检测。然而并不能充分的证明磁珠所捕获的是外泌体而不是其他囊泡。目前并没有一种合适的方法在保证外泌体完整性的前提下将外泌体从免疫磁珠上分离下来，并进行纯化的试剂盒。
因此，国内亟需一种既可以简便快速，又可以保证外泌体完整性的试剂盒及检测分析方法将外泌体吸附、分离、并进行纯化。
发明内容
本申请旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本申请的实施例提出了一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法。
为实现上述目的，本申请所提供的技术方案为：一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，所述试剂盒包括：
免疫磁球，用于从体液中捕获外泌体，形成特异性结合体；
洗脱液，用于将所述特异性结合体分离，形成纯化的外泌体；
洗涤液，用于对经过分离的所述外泌体进行洗涤。
更进一步的技术方案是，所述免疫磁球的制备过程如下：
S1：将1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季胺盐和Fe3O4纳米颗粒共溶解在氯仿中，获得第一组合物；
S2：在步骤S1中的所述第一组合物中加入蒸馏水，得到第二组合物，使用探头式超声仪对所述第二组合物进行超声振荡，然后蒸发得到免疫磁珠溶液；
S3：将二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵溶解在无水乙醇中，同时加入溶酶体相关膜蛋白3抗体，共孵育得到第三组合物；
S4：在步骤S3中的所述第三组合物中加入步骤S2中的所述免疫磁珠溶液，反应后获得免疫磁球溶液；
S5：用磁分离架将步骤S4中的所述免疫磁球分开并清洗，以去除多余的游离抗体，然后将所述免疫磁球放置在磷酸缓冲盐溶液中，并在0～4℃储存。
更进一步的技术方案是，步骤S1中1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季胺盐和Fe3O4的体积比为2:2:1:2。
更进一步的技术方案是，步骤S2中探头式超声仪每次超声振荡为1s，间隔为2s，总时间振荡为6分钟；步骤S2中二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵与溶酶体相关膜蛋白3的质量比为500:3。
更进一步的技术方案是，步骤S4中反应时间为22～26h；步骤S4中加入所述免疫磁珠溶液后，按照原始物质的体积质量比：胆固醇：二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵为1:1。
更进一步的技术方案是，步骤S5中所述磁分离架为磁场强度大于2500Gs的永久磁体。
更进一步的技术方案是，所述免疫磁珠的粒径为10nm～10μm；所述免疫磁珠包括带有以下表面包被抗体：CD9、CD63、CD81、CD44、CD31、Rab5b、EpCAM、TSG101、HSP90、HSP70、ANXA5、FLOT1、ICAM1、ALIX、GM130、ICAM-1、SNAP、MHCI/II、HLA-G、Integrins、Claudins、Tim4，且所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
更进一步的技术方案是，一种完整外泌体分离、纯化试剂盒在血浆、血清、尿液、乳汁、脑脊液、肿瘤腹水、唾液、细胞培养上清中分离外泌体的应用。
更进一步的技术方案是，一种完整外泌体分离、纯化试剂盒的检测分析方法，包括以下步骤：
(1)向免疫磁珠-外泌体复合物重悬液中加入洗脱液混匀，得到消化组合物；其中免疫磁珠-外泌体复合物与洗脱液的配比为50:1～10～1；
(2)将所述消化组合物置于温度范围20℃至40℃进行消化反应，持续时间1～10分钟，得到第一分离组合物；
(3)向所述第一分离组合物内添加等量于洗脱液加入量的洗脱液抑制剂并混合均匀，得到第二分离组合物；
(4)对所述第二分离组合物进行磁分离，所得上清部分即为外泌体溶液。
更进一步的技术方案是，所述洗脱液有效成分为胰蛋白酶，所述洗脱液中还包括溶解有胰蛋白酶的不含二价金属离子的水溶液；所述胰蛋白酶包括猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、羊胰蛋白酶和基因工程表达的胰蛋白酶中的一种或多种。
本申请在采用了上述方案后，其有益效果在于：
(1)采用本申请制备的完整外泌体分离、纯化试剂盒能够快速捕获、分离和纯化外泌体，既可以简便快速使用，又可以保证外泌体完整性，且分离得到的外泌体具有较高的纯度，分离过程中添加的各种试剂不会影响后续检测分析，是一种快速、高效的完整外泌体分离、纯化试剂盒。
(2)采用本申请制备的试剂盒中的检测分析方法：通过使用特定浓度的洗脱液使免疫磁珠表面抗体与抗原之间的化学键断裂分开，从而将外泌体从免疫磁珠上分离，同时保持外泌体的完整性以及生物活性，其所包含的内容物如蛋白、核酸等不受破坏，可以进一步用于外泌体形态、生物活性等研究以及TEM、NTA等表征检测方法。
附图说明
为了使本申请所述的内容更加便于理解，下面结合附图与具体实施方式对本申请所述的技术方案做进一步的说明，但是本申请不仅限于此。
图1为本申请中免疫磁球的粒径测试结果统计图；
图2为本申请中免疫磁球的原子力显微镜观察图；
图3为本申请实施例1捕获、分离、纯化的外泌体Western blot结果；
图4为本申请实施例1捕获、分离、纯化的外泌体电镜测试结果。
具体实施方式
为了使本申请实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本申请一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合及检测分析方法作具体阐述。
一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，所述试剂盒包括：
免疫磁球，用于从体液中捕获外泌体，形成特异性结合体；
洗脱液，用于将所述特异性结合体分离，形成纯化的外泌体；
洗涤液，用于对经过分离的所述外泌体进行洗涤。
更进一步的技术方案是，所述免疫磁球的制备过程如下：
S1：将1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季胺盐和Fe3O4纳米颗粒共溶解在氯仿中，获得第一组合物；
S2：在步骤S1中的所述第一组合物中加入蒸馏水，得到第二组合物，使用探头式超声仪对所述第二组合物进行超声振荡，然后蒸发得到免疫磁珠溶液；
S3：将二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵溶解在无水乙醇中，同时加入溶酶体相关膜蛋白3抗体，共孵育得到第三组合物；
S4：在步骤S3中的所述第三组合物中加入步骤S2中的所述免疫磁珠溶液，反应后获得免疫磁球溶液；
S5：用磁铁将步骤S4中的所述免疫磁球分开并清洗，以去除多余的游离抗体，然后将所述免疫磁球放置在磷酸缓冲盐溶液中，并在0～4℃储存。
在一些实施例中，步骤S1中1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季胺盐和Fe3O4的体积比为2:2:1:2。
在一些实施例中，步骤S2中探头式超声仪每次超声振荡为1s，间隔为2s，总时间振荡为6分钟；步骤S2中二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵与溶酶体相关膜蛋白3的质量比为500:3。
在一些实施例中，步骤S4中反应时间为22～26h；步骤S4中加入所述免疫磁珠溶液后，按照原始物质的体积质量比：胆固醇：二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵为1:1。
在一些实施例中，步骤S5中所述磁分离架为磁场强度大于2500Gs的永久磁体。
在一些实施例中，所述免疫磁珠的粒径为10nm～10μm；所述免疫磁珠包括带有以下表面包被抗体：CD9、CD63、CD81、CD44、CD31、Rab5b、EpCAM、TSG101、HSP90、HSP70、ANXA5、FLOT1、ICAM1、ALIX、GM130、ICAM-1、SNAP、MHCI/II、HLA-G、Integrins、Claudins、Tim4，且所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
在一些实施例中，一种完整外泌体分离、纯化试剂盒在血浆、血清、尿液、乳汁、脑脊液、肿瘤腹水、唾液、细胞培养上清中分离外泌体的应用。
一种完整外泌体分离、纯化试剂盒的检测分析方法，包括以下步骤：
(1)向免疫磁珠-外泌体复合物重悬液中加入洗脱液混匀，得到消化组合物；其中免疫磁珠-外泌体复合物与洗脱液的配比为50:1～10～1；
(2)将所述消化组合物置于温度范围20℃至40℃进行消化反应，持续时间1～10分钟，得到第一分离组合物；
(3)向所述第一分离组合物内添加等量于洗脱液加入量的洗脱液抑制剂并混合均匀，得到第二分离组合物；
(4)对所述第二分离组合物进行磁分离，所得上清部分即为外泌体溶液。
在一些实施例中，所述洗脱液有效成分为胰蛋白酶，所述洗脱液中还包括溶解有胰蛋白酶的不含二价金属离子的水溶液；所述胰蛋白酶包括猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、羊胰蛋白酶和基因工程表达的胰蛋白酶中的一种或多种。
将本申请制备的免疫磁球进行表征，具体方法如下：
取20μL免疫磁球溶液，用纯水稀释至2mL，通过Zetasizer Nano ZS检测粒径；取10μL免疫磁球在云母片上制样，待干后通过原子力显微镜观察形态。
免疫磁球的粒径测试结果统计图与免疫磁球的原子力显微镜观察图参见附图1与附图2所示。
实施例1
以下以一个具体实施例及附图3和附图4进一步说明本申请的工作原理：
从GC患者收集抗凝血样(7.5mL)，然后以1000rpm/min离心10分钟。小心地将上清液置于EP管中。将免疫磁球(30μL)加入管中，然后在室温下孵育30分钟(每10分钟混合一次)。将EP管置于磁分离架上分离5min，除去上清液，得到免疫磁球捕获的外泌体溶液。在EP管中加入洗脱液(2mL)，37℃消化10分钟后加入洗脱液抑制剂(2mL)，涡旋5min后立即置于磁分离架上10min，收集上清液，从而获得外泌体悬浮液。全部过程只需数分钟即可完成外泌体-免疫磁球的分离，而且分离条件非常温和，不会破坏外泌体的完整性和生物活性。
将捕获、分离、纯化的外泌体，通过蛋白质印迹法(Western blot)裂解，结果如附图3所示，本申请捕获、分离、纯化的外泌体的电镜测试结果如附图4所示。
实施例2
以下以一个具体实施例进一步说明本申请的工作原理：
收集肺癌患者外周血7.5mL，然后以1000rpm/min离心10min。随后，取出血清并放入EP管中。加入20μL免疫磁球，室温孵育30分钟，每5分钟混合一次。孵育后，将EP管置于磁分离架上进行分离5分钟。然后，吸出上清液，产生富含免疫磁球的外泌体。再在EP管中加入洗脱液2mL，37℃消化10min后加入洗脱液抑制剂2mL，涡旋5min后立即置于磁选架上静置10min分离后，收集上清液，从而获得外泌体悬浮液。全部过程只需数分钟即可完成外泌体-免疫磁球的分离，而且分离条件非常温和，不会破坏外泌体的完整性和生物活性。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改和改进等，均应包括在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
免疫磁球，用于从体液中捕获外泌体，形成特异性结合体；
洗脱液，用于将所述特异性结合体分离，形成纯化的外泌体；
洗涤液，用于对经过分离的所述外泌体进行洗涤。
2.根据权利要求1所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于：所述免疫磁球的制备过程如下：
S1：将1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季胺盐和Fe3O4纳米颗粒共溶解在氯仿中，获得第一组合物；
S2：在步骤S1中的所述第一组合物中加入蒸馏水，得到第二组合物，使用探头式超声仪对所述第二组合物进行超声振荡，然后蒸发得到免疫磁珠溶液；
S3：将二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵溶解在无水乙醇中，同时加入溶酶体相关膜蛋白3抗体，共孵育得到第三组合物；
S4：在步骤S3中的所述第三组合物中加入步骤S2中的所述免疫磁珠溶液，反应后获得免疫磁球溶液；
S5：用磁分离架将步骤S4中的所述免疫磁球分开并清洗，以去除多余的游离抗体，然后将所述免疫磁球放置在磷酸缓冲盐溶液中，并在0～4℃储存。
3.根据权利要求2所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于：步骤S1中1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季胺盐和Fe3O4的体积比为2:2:1:2。
4.根据权利要求2所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于：步骤S2中探头式超声仪每次超声振荡为1s，间隔为2s，总时间振荡为6分钟；步骤S2中二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵与溶酶体相关膜蛋白3的质量比为500:3。
5.根据权利要求2所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于：步骤S4中反应时间为22～26h；步骤S4中加入所述免疫磁珠溶液后，按照原始物质的体积质量比：胆固醇：二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵为1:1。
6.根据权利要求2所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于：步骤S5中所述磁分离架为磁场强度大于2500Gs的永久磁体。
7.根据权利要求1所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于：所述免疫磁珠的粒径为10nm～10μm；所述免疫磁珠包括带有以下表面包被抗体：CD9、CD63、CD81、CD44、CD31、Rab5b、EpCAM、TSG101、HSP90、HSP70、ANXA5、FLOT1、ICAM1、ALIX、GM130、ICAM-1、SNAP、MHCI/II、HLA-G、Integrins、Claudins、Tim4，且所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
8.一种根据权利要求1～7任一项所述的完整外泌体分离、纯化试剂盒在血浆、血清、尿液、乳汁、脑脊液、肿瘤腹水、唾液、细胞培养上清中分离外泌体的应用。
9.一种完整外泌体分离、纯化试剂盒的检测分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向免疫磁珠-外泌体复合物重悬液中加入洗脱液混匀，得到消化组合物；其中免疫磁珠-外泌体复合物与洗脱液的配比为50:1～10～1；
(2)将所述消化组合物置于温度范围20℃至40℃进行消化反应，持续时间1～10分钟，得到第一分离组合物；
(3)向所述第一分离组合物内添加等量于洗脱液加入量的洗脱液抑制剂并混合均匀，得到第二分离组合物；
(4)对所述第二分离组合物进行磁分离，所得上清部分即为外泌体溶液。
10.根据权利要求9所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒的检测分析方法，其特征在于：所述洗脱液有效成分为胰蛋白酶，所述洗脱液中还包括溶解有胰蛋白酶的不含二价金属离子的水溶液；所述胰蛋白酶包括猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、羊胰蛋白酶和基因工程表达的胰蛋白酶中的一种或多种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111524286.XA CN114276992A (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111524286.XA CN114276992A (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114276992A true CN114276992A (zh) | 2022-04-05 |
Family
ID=80872139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111524286.XA Pending CN114276992A (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114276992A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116143934A (zh) * | 2023-03-21 | 2023-05-23 | 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 | 一种干细胞外泌体提取试剂盒及其应用 |
| CN116555160A (zh) * | 2023-06-29 | 2023-08-08 | 亿航(苏州)生物医药有限公司 | 一种白芍外泌体和汤剂体的提取方法 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108031442A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-05-15 | 猎源（上海）生物医药科技有限公司 | 一种纳米脂质磁球及其制备方法、分离提取游离dna的试剂盒及其应用 |
| CN108802374A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-11-13 | 中山大学附属第五医院 | 基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术 |
| KR20190027759A (ko) * | 2017-09-07 | 2019-03-15 | 인천대학교 산학협력단 | 자성비드 및 분자비컨을 이용한 엑소좀의 다중검출방법 |
| US20190285618A1 (en) * | 2016-10-26 | 2019-09-19 | The Broad Institute, Inc. | Exosomes and uses thereof |
| CN111474356A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-07-31 | 江西省达臻医疗科技有限公司 | 一种双免疫磁珠分选试剂及其制备方法和在体液外泌体富集中的应用 |
| CN111487404A (zh) * | 2019-01-28 | 2020-08-04 | 猎源（上海）生物医药科技有限公司 | 体液肿瘤细胞dna提取试剂盒 |
| CN111484976A (zh) * | 2019-01-28 | 2020-08-04 | 举康(上海)生物科技有限公司 | 肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测系统 |
| CN111505264A (zh) * | 2019-01-30 | 2020-08-07 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 外泌体分离方法、免疫磁珠和试剂盒 |
| CN111575228A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-08-25 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法 |
| US20210102191A1 (en) * | 2019-10-08 | 2021-04-08 | Consiglio Nazionale Delle Ricerche | Method for the isolation of intact extracellular vesicles |
| CN113304119A (zh) * | 2021-06-09 | 2021-08-27 | 台州职业技术学院 | 一种外泌体联合索拉非尼脂质体的构建方法 |
| CN113667643A (zh) * | 2021-07-25 | 2021-11-19 | 李国雷 | 一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合及制备方法 |
-
2021
- 2021-12-14 CN CN202111524286.XA patent/CN114276992A/zh active Pending
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20190285618A1 (en) * | 2016-10-26 | 2019-09-19 | The Broad Institute, Inc. | Exosomes and uses thereof |
| KR20190027759A (ko) * | 2017-09-07 | 2019-03-15 | 인천대학교 산학협력단 | 자성비드 및 분자비컨을 이용한 엑소좀의 다중검출방법 |
| CN108031442A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-05-15 | 猎源（上海）生物医药科技有限公司 | 一种纳米脂质磁球及其制备方法、分离提取游离dna的试剂盒及其应用 |
| CN108802374A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-11-13 | 中山大学附属第五医院 | 基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术 |
| CN111487404A (zh) * | 2019-01-28 | 2020-08-04 | 猎源（上海）生物医药科技有限公司 | 体液肿瘤细胞dna提取试剂盒 |
| CN111484976A (zh) * | 2019-01-28 | 2020-08-04 | 举康(上海)生物科技有限公司 | 肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测系统 |
| CN111505264A (zh) * | 2019-01-30 | 2020-08-07 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 外泌体分离方法、免疫磁珠和试剂盒 |
| US20210102191A1 (en) * | 2019-10-08 | 2021-04-08 | Consiglio Nazionale Delle Ricerche | Method for the isolation of intact extracellular vesicles |
| CN111474356A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-07-31 | 江西省达臻医疗科技有限公司 | 一种双免疫磁珠分选试剂及其制备方法和在体液外泌体富集中的应用 |
| CN111575228A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-08-25 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法 |
| CN113304119A (zh) * | 2021-06-09 | 2021-08-27 | 台州职业技术学院 | 一种外泌体联合索拉非尼脂质体的构建方法 |
| CN113667643A (zh) * | 2021-07-25 | 2021-11-19 | 李国雷 | 一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合及制备方法 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116143934A (zh) * | 2023-03-21 | 2023-05-23 | 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 | 一种干细胞外泌体提取试剂盒及其应用 |
| CN116143934B (zh) * | 2023-03-21 | 2023-07-25 | 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 | 一种干细胞外泌体提取试剂盒及其应用 |
| CN116555160A (zh) * | 2023-06-29 | 2023-08-08 | 亿航(苏州)生物医药有限公司 | 一种白芍外泌体和汤剂体的提取方法 |
| CN116555160B (zh) * | 2023-06-29 | 2023-10-13 | 亿航(苏州)生物医药有限公司 | 一种白芍外泌体和汤剂体的提取方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114276992A (zh) | 一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法 | |
| JP6716683B2 (ja) | 安定なナノ磁性粒子分散 | |
| CN110343664B (zh) | 提取外泌体及外泌体蛋白的方法 | |
| US11479765B2 (en) | Method of isolating exosomes using encapsulation and aqueous micellar system | |
| CN106366196B (zh) | 一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法 | |
| CN110231207B (zh) | 一种分离外泌体的方法 | |
| CN109215998B (zh) | 改进磁性硅颗粒及其用于核酸纯化的方法 | |
| CN109148067B (zh) | 表面共价有机框架材料修饰的磁性纳米材料及制备、应用 | |
| CN112011513B (zh) | 基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法 | |
| EP3299816A1 (en) | Separation method, detection method, signal measurement method, disease determination method, drug efficacy assessment method, kit, liquid composition, and specimen diluent | |
| CN111575228A (zh) | 一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法 | |
| CN113024673B (zh) | 磷脂酰丝氨酸多肽配体修饰的二氧化硅微球 | |
| CN112831457A (zh) | 一种分离和浓缩外泌体的方法 | |
| Malhotra et al. | Novel devices for isolation and detection of bacterial and mammalian extracellular vesicles | |
| CN113101737A (zh) | 一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用 | |
| CN116116385B (zh) | 一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法 | |
| CN116333987A (zh) | 一种外泌体提取方法获得的nk细胞外泌体在抗肿瘤中的应用 | |
| CN114736868B (zh) | 一种温度响应功能复合物、一种外泌体均相分离纯化方法 | |
| CN111874897A (zh) | 一种高靶向性细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料及制备方法和应用 | |
| CN114164203B (zh) | 一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法 | |
| CN114459877A (zh) | 用于富集外泌体的dna四面体复合磁性纳米材料及制备 | |
| CN113174359B (zh) | 一种外泌体捕获纸芯片及其制备方法与应用 | |
| CN112980006A (zh) | 蛋白交联纳米亲和微球及制备方法和应用 | |
| CN112569902B (zh) | 一种可富集及固定蛋白质的复合材料及其制备方法与应用 | |
| CN111893086B (zh) | 胎儿有核红细胞捕获载体、提取装置及方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |