CN108031442A - 一种纳米脂质磁球及其制备方法、分离提取游离dna的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种纳米脂质磁球及其制备方法、分离提取游离dna的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种纳米脂质磁球及其制备方法、分离提取游离DNA的试剂盒及其应用，属于分子生物学技术领域。试剂盒包括以下组分：纳米脂质磁球悬浮液；裂解吸附液；所述洗涤液A包括1mol/LNaCl，5.0mol/L盐酸胍，质量浓度0.5％的SDS和体积浓度60％乙醇；洗涤液B包括体积浓度80％的乙醇；洗脱液包括12mmol/LTris1‑HCl和2mmol/L EDTA；磁性分离架。所述试剂盒检测肺癌患者血清样品，发现提取DNA有103或以上基因拷贝，足以满足基因诊断要求。

Description

一种纳米脂质磁球及其制备方法、分离提取游离DNA的试剂盒 及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种纳米脂质磁球及其制备方法、分离提取游离DNA的试剂盒及其应用。
背景技术
血清或血浆中的游离核酸包括DNA和RNA二大类，后者又分为信使RNA(mRNA)和小RNA(microRNA)等。现有资料揭示，恶性肿瘤患者血循环中的游离DNA不仅含量显著高于健康人和良性疾病患者，而且原发肿瘤的遗传突变在血清游离DNA中也可以检测到，如表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor，EGFR)酪氨酸编码区基因突变检测作为肺癌患者的药物敏感标志，已经在临床个体化靶向治疗(Targetedtherapy)研究中得到应用。
肺癌是预后最差的恶性肿瘤之一，因而寻找肺癌患者血清游离DNA中的相应肿瘤分子标志十分重要。通过利用qPCR检测健康人、良性及恶性肺癌患者的血清中分离得到的游离DNA的含量，从而得到肺癌患者的游离DNA含量。
血浆游离核酸在技术上操作上从Lo等报道的煮沸法提取血浆DNA，发展到商业化血浆核酸手动提取或者自动提取试剂盒，应用血浆中游离核酸进行分子诊断变得更加准确、敏感和迅速。但是由于血浆、血清以及其他体液中循环DNA含量通常较低，同时血浆、血清中和体液中存在不同数量和类型的DNA和RNA，这些不稳定性可能使得待分离的核酸被遗漏，影响检测的准确性，因此，提供一种高效分离游离DNA的方法是现有阶段亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纳米脂质磁球及其制备方法、分离提取游离DNA的试剂盒及其应用，所述试剂盒能够高效的快速肺癌血清游离DNA。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种纳米脂质磁球的制备方法，包括以下步骤：
1)将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为200mg：2.35ml。
2)向所述步骤1)中得到的磁球悬浮液中依次加入二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵(GHDC)、胆固醇、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液，混合，得到混合物；所述磁球悬浮液、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的体积与二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵(GHDC)、胆固醇的质量比为1ml：0.25ml：0.1ml：10mg：10mg；所述1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液的浓度为9～11mg/ml；壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的浓度为9～11mg/ml；
3)将所述步骤2)中混合物进行超声处理，得到超声处理的混合物；
4)将所述步骤3)中超声处理的混合物进行减压浓缩，得到纳米脂质磁球。
优选的，所述超声处理的条件：超声功率为27％，超声2s，间隔1s，总时间6min，温度25℃。
优选的，所述超声处理进行30s后，将超声溶液用水进行稀释，稀释的倍数为1:5～6。
优选的，所述减压浓缩为旋转蒸发，所述旋转蒸发的真空度为0.8Mpa以上；所述旋转蒸发的转速为250～300rpm；所述旋转蒸发的时间为30min。
本发明提供了上述方案制备得到的纳米脂质磁球，1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和复合包载Fe3O4磁性纳米颗粒合成的磁性脂质体；纳米脂质磁球的粒径为176.5～183.5nm。
本发明提供一种分离提取游离DNA的试剂盒，包括以下组分：
(1)纳米脂质磁球悬浮液；所述纳米脂质磁球悬浮液中纳米脂质磁球的浓度为33.3mg/ml；所述纳米脂质磁球为上述方案制备得到；
(2)裂解吸附液，所述裂解吸附液包括以下含量组分：0.8mol/LNaCl，体积分数为1.8％Triton X-100，质量浓度为1.0％SDS，10.0mol/L盐酸胍，30mmol/LTris-HCl，15mmol/L EDTA和摩尔浓度为7.85mol/L的异丙醇；所述裂解吸附液的pH值为6～7；
(3)洗涤液A，所述洗涤液A包括以下含量组分：1mol/LNaCl，5.0mol/L盐酸胍，质量浓度为0.5％的SDS和体积浓度为60％乙醇；
(4)洗涤液B，所述洗涤液B包括以下含量组分：体积浓度为80％的乙醇；所述洗涤液B的pH值为6.0；
(5)洗脱液，所述洗脱液包括以下含量组分：12mmol/L Tris1-HCl和2mmol/LEDTA；所述洗脱液的pH值为7.0～7.25；
(6)磁性分离架。
本发明提供了所述的试剂盒在分离提取游离DNA中的应用。
优选的，所述游离DNA为20bp～1500bp。
优选的，所述分离提取游离DNA的方法包括以下步骤：
A.将400μl裂解吸附液、10μl纳米脂质磁球悬浮液和样本100ul，混匀，将得到的混合液在50℃条件下水浴加热15min，水浴加热期间每隔5min涡旋震荡10s，得到吸附有游离DNA的纳米脂质磁球悬浮液；
B.将所述吸附有游离DNA的纳米脂质磁球置于磁性分离架上静置15min，磁分离后弃去上清液，得到吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀；
C.向所述步骤B得到的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀中加入1ml洗涤液A，第一次洗涤，然后置于磁性分离架上静置2min，磁分离后弃去上清液，得到第一次洗涤的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀；
D.向所述步骤C得到的第一次洗涤的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀中加入1ml洗涤液B，第二次洗涤，然后置于磁性分离架上静置2min，磁分离后去上清液，在25℃条件下放置10min，得到第二次洗涤的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀；
E.向所述步骤D得到的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀中加入50μl洗脱液，混合，得到的混合液在55～60℃放置10min；待磁分离后回收上清液，得到游离DNA。
优选的，所述分离提取游离DNA的样品为肺癌患者血清或血浆或其他无细胞体液。
优选的，所述游离DNA为20bp～1500bp。
本发明提供了一种纳米脂质磁球的制备方法：采用滴定水解法进行，具体是将稀碱溶液添加到摩尔比为2:1的三价铁盐((Fe3+)和二价铁盐(Fe2+))的混合溶液中，使铁盐溶液的pH值逐步升高，达到6～7，使之水解生成四氧化三铁纳米晶体。
本发明提供了一种分离提取游离DNA的试剂盒，将纳米脂质磁球用于捕获与疾病相关的细胞，达到细胞富集的目的，为裂解吸附液充分裂解细胞提供便利，洗涤液A洗涤细胞碎片或其他影响DNA释放的杂质，洗涤液B进一步洗涤游离DNA片段，洗脱液具有较强的洗脱性能，将富集的DNA从纳米脂质磁球中洗脱下来。本发明所述试剂盒提取到的DNA片段是需要再去检测才能够用来诊断疾病，具体以提取的游离DNA为模板，以GAPDH基因拷贝数作为评估指标，发现85％的I～II期肺癌患者中含有103或以上基因拷贝，足以满足基因诊断要求。
附图说明
图1为实施例1中使用所述试剂盒进行荧光定量PCR检测DNA的标准曲线；
图2是实施例4中健康自愿者及肺癌良性疾病患者实验结果统计分析比对图；
图3是实施例4中I～II期肺癌患者实验结果统计分析比对图。
具体实施方式
本发明提供了纳米脂质磁球的制备方法，包括以下步骤：
1)将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为200mg：2.35ml。
2)向所述步骤1)中得到的磁球悬浮液中依次加入二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵(GHDC)、胆固醇、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液，混合，得到混合物；所述磁球二氯甲烷混合物、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的体积与GHDC、胆固醇的质量比为1ml：0.25ml：0.1ml：10mg：10mg；所述1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液的浓度为9～11mg/ml；壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的浓度为9～11mg/ml；
3)将所述步骤2)中混合物进行超声处理，得到超声处理的混合物；
4)将所述步骤3)中超声处理的混合物进行减压浓缩，得到纳米脂质磁球悬浮液。
本发明将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为200mg：2.35ml。
在本发明中，所述Fe3O4磁性纳米颗粒的粒径优选为183.5nm，更优选为176.5nm。所述Fe3O4磁性纳米颗粒的制备方法：滴定水解法，即将稀碱溶液添加到摩尔比为2:1的三价铁盐((Fe3+)和二价铁盐(Fe2+)的混合溶液中，使铁盐溶液的pH值逐步升高，达到6～7，使之水解生成四氧化三铁纳米晶体。得到的磁球悬浮液后，本发明向所述磁球悬浮液中依次加入二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵(GHDC)、胆固醇、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液，混合，得到混合物；所述磁球二氯甲烷混合物、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的体积与GHDC、胆固醇的质量比为1ml：0.25ml：0.1ml：10mg：10mg；所述1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液的浓度为9～11mg/ml，优选为10mg/ml；壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的浓度为9～11mg/ml，优选为10mg/ml；
本发明对所述混合方式没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的混合方式即可。
在本发明中，所述1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液的浓度优选为10mg/ml；壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的浓度为10mg/ml。各成分材料的作用：二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵(GHDC)：是一类阳离子化试剂,也是一种带有活性基团的季铵盐型阳离子表面活性剂、胆固醇：是磁球骨架的链接者、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液：充当表面活性剂、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液(DOPC)：是一种磁性材料，可大大提高材料的生物相容性。
得到混合物后，将所述混合物进行超声处理，得到超声处理的混合物。
在本发明中，所述超声处理的条件优选如下：超声功率为27％，超声2s，间隔1s，总时间6min，温度25℃。本发明对所述超声处理的仪器没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的超声处理仪即可。本发明实施例中，所述超声处理仪来自上海新芝生物技术研究所，型号为JY92-Ⅱ。
在本发明中，所述超声处理进行30s后，将超声溶液优选用水进行稀释，得到稀释液。所述稀释的倍数优选为1:5～6。混合或超声的过程中，溶液会逐渐由无色变浑浊，形成均匀分布的黑色溶液。得到稀释液后，本发明将所述超声处理的混合物进行减压浓缩，得到纳米脂质磁球。
在本发明中，所述减压浓缩优选为旋转蒸发，所述旋转蒸发的真空度优选为0.8Mpa以上，更优选为0.7～0.8Mpa；所述旋转蒸发的转速优选为250～300rpm，更优选为280rpm；所述旋转蒸发的时间优选为30min。所述旋转蒸发的温度优选为24～25℃，更优选为25℃。得到的纳米脂质磁球悬浮液的相对密度为30～40mg/ml。
本发明提供了上述方案制备得到的纳米脂质磁球悬浮液，1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和复合包载Fe3O4磁性纳米颗粒合成的磁性脂质体；纳米脂质磁球的粒径为176.5～183.5nm。
本发明提供一种分离提取游离DNA的试剂盒，包括以下组分：
上述方案制备得到的纳米脂质磁球悬浮液；所述纳米脂质磁球悬浮液中纳米脂质磁球的浓度为30～40mg/ml；所述纳米脂质磁球为上述方法制备得到；
(1)纳米脂质磁球悬浮液；所述纳米脂质磁球悬浮液中纳米脂质磁球的浓度为33.3mg/ml；
(2)裂解吸附液，所述裂解吸附液包括以下含量组分：0.8mol/LNaCl，体积分数为1.8％Triton X-100，质量浓度为1.0％SDS，10.0mol/L盐酸胍，30mmol/LTris-HCl，15mmol/L EDTA和摩尔浓度为7.85mol/L的异丙醇；所述裂解吸附液的pH值为6～7；
(3)洗涤液A，所述洗涤液A包括以下含量组分：1mol/LNaCl，5.0mol/L盐酸胍，质量浓度为0.5％的SDS和体积浓度为60％乙醇；
(4)洗涤液B，所述洗涤液B包括以下含量组分：体积浓度为80％的乙醇；所述洗涤液B的pH值为6.0；
(5)洗脱液，所述洗脱液包括以下含量组分：12mmol/L Tris1-HCl和2mmol/LEDTA；所述洗脱液的pH值为7.0～7.25；
(6)磁性分离架。
本发明提供的试剂盒包括纳米脂质磁球。所述纳米脂质磁球的粒径优选为176.5～183.5nm，更优选为180.2nm。
在本发明中，制备得到的纳米脂质磁球具有定向捕获目的细胞的作用，使待检样品中能够靶向富集待检测细胞，从而提高样品中游离DNA的得率。
本发明提供的试剂盒包括裂解吸附液。所述裂解吸附液包括以下含量组分：0.8mol/LNaCl，体积分数为1.8％TritonX-100，质量浓度为1.0％SDS，10.0mol/L盐酸胍，30mmol/L Tris-HCl，15mmol/L EDTA和摩尔浓度为7.85mol/L的异丙醇；所述裂解吸附液的pH值为6～7。所述裂解吸附液有利于样品裂解吸附在纳米脂质磁球上。
本发明提供的试剂盒包括洗涤液A。所述洗涤液A包括以下含量组分：1mol/LNaCl，5.0mol/L盐酸胍，质量浓度为0.5％的SDS和体积浓度为60％乙醇。所述洗涤液A的作用是使DNA与纳米脂质磁球结合后，初步洗涤。
本发明提供的试剂盒包括洗涤液B。所述洗涤液B包括以下含量组分：体积浓度为80％的乙醇；所述洗涤液B的pH值为6.0。所述洗涤液B深度洗涤。
本发明提供的试剂盒包括洗脱液。所述洗脱液包括以下含量组分：12mmol/LTris1-HCl和2mmol/L EDTA；所述洗脱液的pH值为7.0～7.25。所述洗脱液的作用将DNA从纳米脂质磁球溶液中洗脱出来；
本发明提供的试剂盒包括磁性分离架。所述磁性分离架的作用是分离捕获到细胞的磁球。
本发明提供了所述的试剂盒在分离提取游离DNA中的应用。
在本发明中，所述分离提取游离DNA的方法优选包括以下步骤：
A.将400μl裂解吸附液、10μl纳米脂质磁球和样本100ul，混匀，将得到的混合液在50℃条件下水浴加热15min，水浴加热期间每隔5min涡旋震荡10s，得到吸附有游离DNA的纳米脂质磁球；
B.将所述吸附有游离DNA的纳米脂质磁球置于磁性分离架上静置15min，磁分离后弃去上清液，得到吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀；
C.向所述步骤B得到的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀中加入1ml洗涤液A，第一次洗涤，然后置于磁性分离架上静置2min，磁分离后弃去上清液，得到第一次洗涤的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀；
D.向所述步骤C得到的第一次洗涤的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀中加入1ml洗涤液B，第二次洗涤，然后置于磁性分离架上静置2min，磁分离后去上清液，在25℃条件下放置10min，得到第二次洗涤的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀；
E.向所述步骤D得到的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀中加入50μl洗脱液，混合，得到的混合液在55～60℃放置10min；待磁分离后回收上清液，得到游离DNA。
在本发明中，所述游离DNA优选为20bp～1500bp。
在本发明中，所述分离提取游离DNA的样品优选为肺癌患者血清或血浆或其他无细胞体液。
在本发明中，所述分离得到的游离DNA通过进一步qPCR才能检测得到游离DNA的含量及数据统计分析，再根据游离DNA的含量或检测基因，进一步确定检测样品是否有患肺癌的风险。
在本发明中，通过qPCR确定游离DNA的含量的方法没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的qPCR方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种纳米脂质磁球及其制备方法、分离提取游离DNA的试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
用分析天平称取GHDC 10.0mg，称取胆固醇10.0mg；启动通风橱(以下操作均在通风橱中进行)；用定量移液器取磁球溶液1mL于1.5mL的离心管中，置于磁性分离架上，分离磁球，弃去溶剂，用移液管取1mL二氯甲烷到离心管中，摇匀，将溶液移至100mL的磨口梨形瓶中，再用移液管取1mL二氯甲烷到离心管中，清洗残存的磁球，将清洗液也移至梨形瓶中。重复清洗一次；将称量好的GHDC、胆固醇加入梨形瓶中，用移液管取250uL的DOPC溶液，100uL的壳聚糖十六烷基季胺盐溶液至梨形瓶中，混匀；将梨形瓶快速超声波细胞粉碎仪中，启动仪器，设置超声功率为27％，超声2S，间隔1S，总时间6min，温度25℃，启动仪器；30S后停止超声，用定量移液器取6mL超纯水至梨形瓶中，继续超声至时间结束；取出梨形瓶，将其移至旋转蒸发仪上，启动真空泵，待真空度达到0.8Mpa以上时，将旋转蒸发仪上的转速迅速调到最大，进行真空旋转蒸发；30min后拧开旋钮，放入空气，先关闭真空泵，再关闭旋转蒸发仪，取下梨形瓶；将反应后的溶液移至15mL的离心管中；贴上标签(注明样品名，制备人及制备时间)2～8℃保存备用。所述纳米脂质磁球平均粒径为180±3.5nm。
将制备得到的纳米脂质磁球进行结合细胞的实验，测定裸磁球表面点位、所述纳米脂质磁球的结合细胞后的粒径及结合细胞后复合物表面电位变化。结果见表1。
表1裸磁球与结合细胞后的磁球的粒径及电位
未结合细胞的纳米脂质磁球平均粒径为180±3.5nm，结合细胞后磁球-细胞复合物的平均粒径明显增大。纳米脂质磁球带正电位，平均电位为4.6±0.2mv，结合细胞后电位趋向于电中性，平均电位为0.4±0.1mv。这表明本发明制备的磁球具有较高的细胞结合能力。
对比例1
采用市售普通磁球与本发明制备的纳米脂质磁球对物理参数进行对比，结果见表2。
表2纳米脂质磁球与常规的磁球物理参数对比
物理参数 纳米脂质磁球 市售普通正电性磁球
粒径 180±3.5nm 270±15.0nm
电位 4.6±0.2mv 2.3±0.4mv
由表2可知，本发明制备的纳米脂质磁球粒径小于常规正电性磁球，而电位高于市售普通正电性磁球。这为磁球吸附细胞和DNA片段垫定物理基础。
实施例2
肺癌患者血清或血浆等无细胞体液中游离DNA定量检测试剂盒的准备如下组分，制作成肺癌患者血清或血浆等无细胞体液中游离DNA定量检测试剂盒：
(1)纳米脂质磁球；
(2)裂解液及吸附液：pH 6.5～6.8，3.8M盐酸胍，1MNaCl，
1％Tritonx-100，0.5％SDS，10mM Tris，1mM EDTA含1/5异丙醇；
(3)洗涤液I：1MNaCl，0.5％SDS，60％乙醇；
(4)洗涤液II：70％乙醇；
(5)洗脱液：pH 7.0～7.25，10mM Tris1-HCl；
(6)磁性分离架。
实施例3
肺癌患者血清或血浆等无细胞体液中游离DNA定量检测试剂盒的应用实例
3.1研究对象：选取上海市虹口区上海市肺科医院2015年1月1日～2016年12月31日收治的疾病患者300例，其中肺癌200例，良性疾病100例，年龄在26～74岁之间，中位年龄50岁。所有患者均经病理检测确诊，同时选择健康志愿者100例作为对照，其中年龄在24～64岁之间，中位年龄44岁。
3.2样本采集及DNA提取
(1)样本采集：收集400份血清，-80℃保存备用。
(2)DNA提取：在1.5ml离心管中加入100μl血液；加入400μl裂解吸附液及10μl纳米脂质磁球，混匀，56℃水浴放置10～15分钟；将离心管放在磁性分离架上静置，磁珠吸附完全、溶液澄清后弃去上清液；加入500μl洗涤液I，涡旋洗涤20～30秒后，置于磁性分离架上，静置1～2分钟，磁分离后去上清；重复洗涤3次，并吸干离心管盖上的残留液；加入500μl洗涤液II，涡旋20～30秒，静置1～2分钟，磁分离后去上清；重复洗涤5次，去上清后，吸干离心管盖上的残留液；将离心管留在磁性分离架上，打开盖子室温度下放置5～10分钟；加入30μl洗脱液，用枪头将磁珠吹分散，56℃放置5分钟；磁分离后回收上清，将上清-20℃保存或直接测定分析。
3.3荧光定量PCR检测
(1)PCR反应体系：50μl体系内含有2×Blood DirectPCRMasterMix 25μl、GAPDH基因上下游引物(10μM)各1.25μl、DNA产物2.5μl、RNase-Free ddH2O补齐至50μl；
(2)PCR反应条件:预变性:95℃3min；变性：94℃15s、退火：60℃20s、延伸：72℃1min、35个循环；补充延伸：72℃5min；
(3)扩增产物鉴定：2％的琼脂糖凝胶电泳(美国Promega公司，含核酸显色剂EB)电泳(120V，25min)后，于凝胶成像仪中拍片鉴定扩增片段(100-200bp)。
3.4统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析。
实施例4
肺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒检测结果分析
4.1建立检测方法
对癌细胞基因组DNA进行PCR扩增，产物经纯化后作为检测模板建立标准曲线，结果如图1所示：在104～109拷贝数范围内，DNA含量与循环数呈线性关系，y＝-3.54x+43.52，Y轴截距为43.52，斜率为-3.54，误差为0.017，相关系数(r)为0.999。
4.2健康自愿者的游离DNA含量
100例健康志愿者中79例未能检出游离DNA，21例检测到DNA，其中含量为102或以下拷贝数量级的14例，103拷贝数量级者5例，另2例DNA含量分别达到1.59×105和1.2×106。因此，以游离DNA含量＞1x 103拷贝作为阳性标准，则93％的健康自愿者属于DNA检测阴性。统计分析如表1所示：游离DNA含量在不同年龄组受检者之间无统计学显著差异(P＞0.05)。
表1游离DNA含量在不同年龄组受检者之间
4.3肺癌良性疾病患者的游离DNA含量
100例肺癌良性疾病患者中75例未能检出游离DNA，25例检测到DNA，其中含量超过阳性标准者仅5例，即95％的肺癌良性疾病患者属于DNA检测阴性。统计分析如表2所示：游离DNA含量在健康自愿者及肺癌良性疾病之间无统计学显著差异(P＞0.05)。
表2肺癌良性疾病患者的游离DNA含量统计分析
健康人 良性疾病
A 94例 95例
B 14例 20例
C 2例 5例
4.4肺癌患者的游离DNA含量
200例肺癌患者血样中游离DNA含量低于103拷贝数量级者31例，占15.5％，其中未检测到DNA者8例，占4％。84.5％(169例)肺癌患者的游离DNA含量超过阳性标准，统计分析如表3所示：(1)DNA读数log转换后，与年龄进行相关分析，结果显示相关系数r＝-0.087，p＝0.222，即未发现两者存在线形相关；(2)DNA分层(＜1000，1000～10000，≥10000)后与组织类型比较，卡方检验结果χ2＝17.893，p＝0.007，即游离DNA水平与组织类型有关。
范围为1.05×103～8.04×109。将游离DNA含量分为A(未能检出，拷贝数为0)、B(低含量，拷贝数为10～102)、C(中等含量，拷贝数为103～106)和D(高含量，拷贝数为107～109)四组后进行统计分析，如图2所示，图2的结果清晰显示健康自愿者及肺癌良性疾病患者主要属于A和B组，而肺癌患者则多数分布在C和D组，游离DNA检测阳性率在肺癌患者中显著增高(P＜0.05)。游离DNA的重要诊断价值之一是从中找出特异性基因标志并用于肿瘤早期诊断，而这种新颖诊断手段的前提条件是早期患者血清中含有足够数量的DNA。为此，我们从本组肺癌病例中选择I～II期患者共94例进行了分析(图3)，结果揭示属于C组和D组者分别占64.9％(61例)和19.1％(18例)，说明85％(79/94例)的I～II期肺癌患者血清中的DNA含量足以进行基因检测。
参考值范围：肺癌≥1.0×104；血清循环DNA含量＞1.0×103做进一步筛查以确诊患病/复发。
对比例5
用本发明提供的纳米磁球和市售普通磁球对不同长度的DNA片段进行吸附试验，统计DNA片段的回收率。结果见表3。
表3纳米脂质磁球与常规的磁球对小片段DNA回收的对比效果
DNA片段大小(bp) 纳米脂质磁球回收率(％) 常规正电性磁球回收率(％)
100 98.5±3.2 90.0±1.5
200 94.0±1.5 80.0±4.5
300 90.0±2.5 80.0±2.0
500 88.5±0.5 78.0±4.3
1000 86.0±2.5 70.0±5.5
由图3可知，与常规正电性磁球相比，纳米脂质磁球对各个片段大小的DNA片段都具有较高的回收效率，而且回收效率显著高于常规正电性磁球。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种纳米脂质磁球的制备方法，包括以下步骤：
1)将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为200mg：2.35ml。
2)向所述步骤1)中得到的磁球悬浮液中依次加入二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、胆固醇、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液和壳聚糖十六烷基季胺盐溶液，得到混合料液；所述磁球悬浮液、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的体积与GHDC、胆固醇的质量比为1ml：0.25ml：0.1ml：10mg：10mg；所述1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液的浓度为9～11mg/ml；壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的浓度为9～11mg/ml。
3)将所述步骤2)中混合物进行超声处理，得到超声处理的混合物；
4)将所述步骤3)中超声处理的混合物进行减压浓缩，得到纳米脂质磁球。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述超声处理的条件：超声功率为27％，超声2s，间隔1s，总时间6min，温度25℃。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述超声处理进行30s后，将超声溶液用水进行稀释，稀释的倍数为1:5～6。
4.根据权利要求1～3任意一项所述制备方法，其特征在于，所述减压浓缩为旋转蒸发，所述旋转蒸发的真空度为0.8Mpa以上；所述旋转蒸发的转速为250～300rpm；所述旋转蒸发的时间为30min。
5.权利要求1～4任意一项所述方法制备的纳米脂质磁球，其特征在于，1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和复合包载Fe3O4磁性纳米颗粒合成的磁性脂质体；纳米脂质磁球的粒径为176.5～183.5nm。
6.一种分离提取游离DNA的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
(1)纳米脂质磁球悬浮液；所述纳米脂质磁球悬浮液中纳米脂质磁球的浓度为33.3mg/ml；所述纳米脂质磁球为权利要求1～4任意一项所述方法制备得到或权利；
(2)裂解吸附液，所述裂解吸附液包括以下含量组分：0.8mol/LNaCl，体积分数为1.8％TritonX-100，质量浓度为1.0％SDS，10.0mol/L盐酸胍，30mmol/LTris-HCl，15mmol/LEDTA和摩尔浓度为7.85mol/L的异丙醇；所述裂解吸附液的pH值为6～7；
(3)洗涤液A，所述洗涤液A包括以下含量组分：1mol/LNaCl，5.0mol/L盐酸胍，质量浓度为0.5％的SDS和体积浓度为60％乙醇；
(4)洗涤液B，所述洗涤液B包括以下含量组分：体积浓度为80％的乙醇；所述洗涤液B的pH值为6.0；
(5)洗脱液，所述洗脱液包括以下含量组分：12mmol/LTris1-HCl和2mmol/LEDTA；所述洗脱液的pH值为7.0～7.25；
(6)磁性分离架。
7.权利要求6所述的试剂盒在分离提取游离DNA中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述分离提取游离DNA的方法包括以下步骤：
A.将400μl裂解吸附液、10μl纳米脂质磁球悬浮液和样本100μl混匀，将得到的混合液在50℃条件下水浴加热15min，所述水浴加热期间每隔5min涡旋震荡10s，得到吸附有游离DNA的纳米脂质磁球悬浮液；
B.将所述吸附有游离DNA的纳米脂质磁球置于磁性分离架上静置15min，磁分离弃去上清液，得到吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀；
C.向所述步骤B得到的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀中加入1ml洗涤液A，进行第一洗涤，然后置于磁性分离架上静置2min进行磁分离，弃去上清液，得到第一洗涤的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀；
D.向所述步骤C得到的第一洗涤的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀中加入1ml洗涤液B，进行第二洗涤，然后置于磁性分离架上静置2min，磁分离后去上清液，在25℃条件下放置10min，得到第二次洗涤的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀；
E.向所述步骤D得到的吸附有游离DNA的纳米脂质磁球沉淀中加入50μl洗脱液，得到的混合液在55～60℃放置10min；待磁分离后回收上清液，得到游离DNA。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述样品为肺癌患者血清或血浆或其他无细胞体液。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述游离DNA为20bp～1500bp。
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