CN105861672A - 一种人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学领域，提供了一种人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒及检测方法。试剂盒中包括：septin9基因甲基化检测位点对应的引物序列；septin9基因检测位点探针序列；内参基因检测位点对应引物序列；内参基因检测位点探针序列，Septin9基因检测位点为septin9基因CpG岛3的一个位点；内参基因为Actin。本发明检测试剂盒的设计及结果判读在整个检测流程中简单方便，检测结果可靠、特性性和灵敏性高。游离DNA酶解对septin9基因甲基化检测，样本损失量小。该方法简便快速且经济实用。本发明可辅助大肠癌的筛查和诊断，进而提高治愈率和降低死亡率。

Description

一种人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒及 检测方法
技术领域
本发明属于生物学和医学领域，具体涉及一种人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒及检测方法。
背景技术
大肠癌是一种发生于下消化道系统的严重疾病，是世界三大恶性肿瘤之一。全世界每年新发大肠癌病例136.1万，直接导致69.4万人死亡。随着我国人民生活水平提高、饮食习惯变化，大肠癌发病率正在提升，特别是北京、上海等大中城市大肠癌已逐渐成为除肺癌外最常见的恶性肿瘤。大肠癌早期症状并不明显，因民众癌症筛查意识薄弱和对现有检测技术的排斥，大多数患者感到不适去医院就诊时，已到了治愈率极低的癌症中晚期，这导致大肠癌的死亡率一直居高不下。大肠癌如果在早期被检测出来，患者能获得更高的治愈率，支付更低的医疗费用。
临床上常用的大肠癌筛查方法大致有两种，潜血试验(fecal occult bloodtesting，FOBT)、结肠镜检查。潜血试验是大肠癌的诊断方法当中最常见的。可利用简便易行的便潜血试验监测该疾病。根据临床观察，发现大肠癌通常能够导致患者表现为不同程度的出血，目前多用于作为大规模人群普查的初筛手段。大便隐血测试其采样方法复杂，敏感性低，结果易受食物及药物等的影响，假阳性率和假阴性率较高。有报道表明，FOBT灵敏度只有15％-30％，具有较大的提供空间。
结肠镜是大肠癌筛查和确诊的金标准，但其检测繁琐，检测前需要相应做清肠准备。并且，该检查可能引起消化道出血、穿孔、感染等并发症，致使大众对该检测有心理上排斥。另外，在受检者如患有心肺功能障碍、严重结肠炎、心脏病等不能进行结肠镜检查。因此，两种大肠癌检查方法都存在不同程度的缺陷。在国外，45岁以上人群FOBT筛查率不足15％，结肠镜筛查率也不超过50％。在国内，FOBT和结肠镜检测预计均不到4％。由于上述方法存在灵敏度或侵入性的问题，所以现在需要一种更为准确和方便的筛查方法来提高大肠癌的筛查率。
大肠癌的早期发现和早期诊断是早期治疗获得高治愈率的基础，也是降低大肠癌死亡率的关键。特别是在生物治疗技术被广泛推广的今天，采取手术联合生物治疗进行早期大肠癌的治疗，五年生存率几乎可达100％。因此，不断的做好早期大肠癌的临床筛查工作至关重要。
发明内容
本发明的目的正是为了克服上述技术的不足，而提供一种人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒及检测方法，涉及游离DNA中septin9基因甲基化检测，辅助在大肠癌筛查、临床诊断和预后评估领域的应用，提供一种大肠癌中可用于稳定、高效率检测肿瘤的生物标记物septin9甲基化检测的方法及其用途。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括：septin9基因甲基化检测位点对应的引物序列；septin9基因检测位点探针序列；内参基因检测位点对应引物序列；内参基因检测位点探针序列，Septin9基因检测位点为septin9基因CpG岛3的一个位点；内参基因为Actin。
所述septin9基因甲基化检测位点对应的引物序列包括：
正向引物：5’-GACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGT-3’
反向引物：5’-AAATGATCCCATCCAGCTG-3’
所述septin9基因检测位点探针序列：FAM-TTGACCGCGGGGTCCGAC-MGB。
使用Actin作为内参基因，内参基因的的引物及探针序列如下：
正向引物：5’-GCGCCGTTCCGAAAGTT-3’
反向引物：5’-CGGCGGATCGGCAAA-3’
检测探针：VIC-ACCGCCGAGACCGCGTC-MGB。
所述septin9基因检测探针和内参基因检测探针5’端荧光探针为FAM、VIC、TET中的一种。
所述试剂盒中还包括阴性质控品、阳性质控品和空白对照。
所述阳性质控品为全甲基化的人类基因组DNA；所述阴性质控品为非甲基化人类基因组DNA。
试剂盒检测的样本是外周血、尿液或唾液。
这种采用人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒的检测方法，该方法包括如下步骤：
(a)外周血血浆分离；
(b)磁珠法提取游离DNA；
(c)游离DNA定量及酶解；
(d)实时荧光定量PCR检测Septin9和Actin基因；
检测该标记物的技术为荧光定量PCR技术，采用Taqman探针法检测；
Septin9基因检测位点为septin9基因CpG岛3的一个位点，其检测引物及探针序列如下：
正向引物：5’-GACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGT-3’
反向引物：5’-AAATGATCCCATCCAGCTG-3’
所述septin9基因甲基化位点检测探针：FAM-TTGACCGCGGGGTCCGAC-MGB
在荧光定量PCR检测方法中，使用Actin作为内参照基因，其检测引物及探针序列如下：
正向引物：5’-GCGCCGTTCCGAAAGTT-3’
反向引物：5’-CGGCGGATCGGCAAA-3’
检测探针：VIC-ACCGCCGAGACCGCGTC-MGB
通过对游离DNA酶解方法，来检测septin9基因甲基化可作为大肠癌筛查的生物标记物。
本发明的有益效果为：(1)游离DNA酶解再通过实时荧光定量PCR技术对septin9基因甲基化检测，样本损失量小。相对于用亚硫酸亚处理，该方法简便快速且经济实用。(2)本发明可辅助大肠癌的筛查和诊断，进而提高治愈率和降低死亡率，是对目前大肠癌无创筛查一个重要技术补充。(3)为大肠癌诊断、治疗与预后提供新的试剂盒，方便临床应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
本发明提供一种大肠癌的生物标记物septin9甲基化检测，其特征序列如下：
Septin9：aaaaacactcgagaataatgctgtggcttaggatggctgttgtgccggacccggcatcttcccaggggggctgtgttgttgggctgagtttcttaggtactggacccccaaatccccaaatacggcgtggacaggtggcccagtaggggctggactatccgataggcccaggtgctggagttcagacaagacataccctggcctggcgtggaagatacggggtgctattaatggcagcaatggctgcatttctgaaacccgggctcccaggccgacgagggtgtgcacgcatctgaaatgtctgtggttttgcagttcccatgtccacaaactcacttggttgaaaatagttcaaaatatccaaagcatgagggagggagtgcctgcttttcttaaaaaggaaggacttgatttcatctacttaaaaagccacccaaacctagaacattttccgcaagagaccccctgccccccgcctctccagaatggctggagagtctcagcactcctgcacatttgggatatttcagagggggtggggaggggcaagtgggcagcgagcgacctcagacccaggatgagctgtcaggcgctccccggccacacattcaagggaccggagtgcagttgtagcgttgcggcctgctgcttcgggggtgggggtgttgttccatgctgtgaattctcacatggcccctgactctgggcagaggccgagggtctaagggacggggtgacagggagagcatgcaggagtgggtttctggctttccagggcgagtggaagaagcgcctctctctcttgtaggtgacagacctggggggcccttcttgaggatgagagcctgttgcttctcaagttctgtgtctaacccaggtccccaggtctaccccagcccctcggccctgcctgccttgtggatgatatagtttaagggtagagaccgctggcctggagggaaggctaggcctcaggttagggcccagaagggagggagaagcccttggggcagctccctttctgctcactcactgcctagctccttccttcacaccttccttcggaaacgtctgctcctgacaaggtctacttcctgctctcaggaggcccttattgtggaggaagggaggcgtcgcccgtccctggcttctctgacagccgtgttccatccccgccctgtgccccttctcccggacagtgccttctccagggctcacccaggagggtgcagcggtggcccccggggcggtggtcgtggtgggggtgttagctgcaggggtgccctcggtgggtgggagttggtggcctctcgctggtgccatgggactcgcatgttcgccctgcgcccctcggctcttgagcccacaggccgggatcctgcctgccagccgcgtgcgctgccgtttaacccttgcaggcgcagagcgcgcggcggcggtgacagagaactttgtttggctgcccaaatacagcctcctgcagaaggaccctgcgcccggggaaggggaggaatctcttcccctctgggcgcccgccctcctcgccatggcccggcctccacatccgcccacatctggccgcagcggggcgcccggggggaggggctgaggccgcgtctctcgccgtcccctgggcgcgggccaggcggggaggaggggggcgctccggtcgtgtgcccaggactgtcccccagcggccactcgggccccagccccccaggcctggccttgacaggcgggcggagcagccagtgcgagacagggaggccggtgcgggtgcgggaacctgatccgcccgggaggcgggggcggggcgggggcgcagcgcgcggggaggggccggcgcccgccttcctcccccattcattcagctgagccagggggcctaggggctcctccggcggctagctctgcactgcaggagcgcgggcgcggcgccccagccagcgcgcagggcccgggccccgccgggggcgcttcctcgccgctgccctccgcgcGACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGTcggaccccgcggtcaacgcgcagctggatgggatcatttcggacttcgaaggtgggtgctgggctggctgctgcggccgcggacgtgctggagaggaccctgcgggtgggcctggcgcgggacgggggtgcgctgaggggagacgggagtgcgctgaggggagacgggacccctaatccaggcgccctcccgctgagagcgccgcgcgcccccggccccgtgcccgcgccgcctacgtgggggaccctgttaggggcacccgcgtagaccctgcgcgccctcacaggaccctgtgctcgttctgcgcactgccgcctgggtttccttccttttattgttgtttgtgtttgccaagcgacagcgacctcctcgagggctcgcgaggctgcctcggaactctccaggacgcacagtttcactctgggaaatccatcggtcccctccctttggctctccccggcggctctcgggccccgcttggacccggcaacgggatagggaggtcgttcctcacctccgactgagtggacagccgcgtcctgctcgggtggacagccctcccctcccccacgccagtttcggggccgccaagttgtgcagcccgtgggccgggagcaccgaacggacacagcccaggtcgtggcagggtctagagtgggatgtcccatggcccccatccaggcctggggatatcctcatccgcctcccagaatcgggccgtgggggacagaaggggcctgcgtgcgggcagggagagtattttggctctctcctgtcttcggggtttacaaagtgtgttgggacttgcggggctgctctgtccaagcctgggtctggcgtccgcgtctctgagcctgtgagtgcgtgcgctttcctgcgtcctcttgactgccggtgctggggctctgcgtcctgcgtccgcgggagtaaatacagcaggcgaaggggaagctcacacaatggtctccagcgctctggggcagggcttctgaggggcgggcctgcctctgccgggacctggagcccccgcccctcggagaggctcctaggctgacttgggcagagccctctggtgggccgggagggggaaaggctgtgttgaaatgagcaaactgtccaggtgtcaggccaagctgggaggtgaccagcctgaggtcctccccgctccatggccagaaccagggctgacatctgggtgtcctgagcccagctgcccacacggcccacctggggtcagccctatctgagtgggggaggcggggcctcctgggggaccagaactttggctggacgccaagcagagtgccagtggctgttcttcagggctgggcctgaggagggtgtggggcggcgaagggacgggagggggttgtgatccagtggccactggcgctgtgcagagtgtgagctggaaacatcgtagttactttgtcagcttagtggtgaaagccctttttcaggctctatccctttgcatccctgcttcccagagggaggggaggtctgggtctgcagagctgggagggcttgctgttcccgcccccctcccccacaacacctcctcatctggacatctttgggcacatgctcatactggggtctccctaggtccactgtgttccgttgagcctcctgcagtccccgagtgaatgtgacctccctgcccctgcctctttgcaactcctccctgcgaccgctcctccaggggccttccttgtcccaaatgtccaagtggcacgacttagccggtctgaccactttccagtaagcccttatggagagaggccctgtgttgtgcagagctctcctcctgcctgcgggatcgaggtctctgctctcagttcctaacagaaagtgtcgggcccccagtgggatttctggggaagaactctcgtgtctcaacgggagccctgtggcgggaggggaggccagggtttggggttgtgttcgttgtacagctgtcaccatttgcactatgaaagttgttagtgccccttcct
本发明还同时提供了上述生物标记物的用途：制备用于筛查大肠癌或辅助大肠癌病理鉴定、诊断和预后的试剂盒。
作为本发明septin9基因甲基化检测方法的改进：包括样本前处理和检测引物和探针系统；
检测该标记物的技术为荧光定量PCR技术，采用Taqman探针法检测。
Septin9基因检测位点为septin9基因CpG岛3的一个位点，其检测引物及探针序列如下：
正向引物：5’-GACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGT-3’
反向引物：5’-AAATGATCCCATCCAGCTG-3’
所述septin9基因甲基化位点检测探针：FAM-TTGACCGCGGGGTCCGAC-MGB
在荧光定量PCR检测方法中，使用Actin作为内参照基因，其检测引物及探针序列如下：
正向引物：5’-GCGCCGTTCCGAAAGTT-3’
反向引物：5’-CGGCGGATCGGCAAA-3’
检测探针：VIC-ACCGCCGAGACCGCGTC-MGB
本发明的游离DNA中septin9基因甲基化检测可用于大肠癌的筛查，辅助在大肠癌筛查、临床诊断和预后评估领域的应用。本发明主要是基于游离DNA中septin9基因甲基化检测主要通过以下步骤实现：
(a)外周血血浆分离；
(b)磁珠法提取游离DNA；
(c)游离DNA定量及酶解；
(d)实时荧光定量PCR检测Septin9和Actin基因。
本发明所述的大肠癌生物标记物为Septin9基因CpG岛3的一个甲基化位点；其应用主要表现在：该甲基化基因在大肠癌患者血浆游离DNA中与正常人中显示出差异性，可用于对大肠癌患者进行筛查，用于辅助大肠癌病理鉴定、诊断和预后。
本发明的技术方案是提供一种用于筛查大肠癌患者和辅助大肠癌病理鉴定、诊断和预后的试剂盒，其由游离DNA提取、DNA酶解、引物系统组成和目标基因扩增系统组成。
本发明通过实验得出：通过对游离DNA酶解方法，来检测septin9基因甲基化可作为大肠癌筛查的生物标记物。
本发明提供一种大肠癌的生物标记物septin9甲基化检测试剂盒的应用具体方法如下：
实施例1.血浆分离及游离DNA提取
1.血浆分离
1)用EDTA抗凝管收集5mL-10mL外周血；
2)对血液样本进行离心，1,600g，10分钟；
3)将收集的血浆样本小心转移至2mL离心管中；
4)4℃条件下对血浆样本进行离心，16,000g，10分钟；
5)将收集的血浆样本小心转移至新的2mL离心管中；
6)收集完成的血浆样本至于-20℃保存。
2.游离DNA的提取
1)在5mL无核酸酶管中加入2mL Lysis Buffer、100uL PK、15uL助沉剂、30uL磁珠(使用前颠倒或使用移液器吹吸混匀磁珠)、600-1300uL(最好1000uL)样品，震荡混匀。室温，上下颠倒混匀20分钟，使磁珠和核酸充分结合。
2)将混合液转至1.5mL离心管中，置于磁力架上1分钟，吸弃液体。
3)重复步骤2，直至所有混合液转完，取下离心管。
4)加入750uL Wash BufferⅠ，使磁珠重新悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，置于磁力架上1分钟，吸弃液体，取下离心管。
5)加入750uL Wash BufferⅡ，使磁珠重新悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，置于磁力架上1分钟，吸弃液体。
6)重复步骤5一次。
7)加入45uL Elution Buffer，使磁珠重新悬浮，55℃水浴10分钟，其间每隔2min轻轻混匀磁珠一次。
8)将离心管置于磁力架1分钟，将液体转移至新的1.5mL无核酸酶离心管，取2uL测浓度(Qubit dsDNA HS Kit)。
实施例2.游离DNA酶解
1)在0.5mL薄壁管中加入30ng游离DNA，1U的BstUI酶及缓冲液，总体积为50uL。
2)60℃水浴,10小时。
3)经酶解后，含甲基化的DNA会保留，未甲基化的DNA被酶解。
实施例3.荧光定量PCR检测目的基因
基于Taqman探针的荧光定量PCR检测：
按照以下荧光定量PCR体系将试剂按以下顺序依次加入到200μL EP管中：
混匀后稍离心，在ABI 7500中进行荧光定量PCR反应，反应参数设置为：
实施例4.结果判读
荧光定量PCR定量检测septin9基因和actin基因。对于大肠癌患者血浆样本，其septin9基因存在CpG岛3的一个甲基化位点；而actin不存在甲基化位点。对于正常人样本，septin9基因存在CpG岛3的一个甲基化位点；而actin不存在甲基化位点。
实验设计：
阳性对照为：全甲基化人类基因组；空白对照为：无核酶去离子水；待检测样本：经酶解处理的游离DNA。
结果判读：阳性对照septin9及内参actin均检测到信号值小于40Ct值；
空白对照septin9及内参actin具有背景值大于40Ct值；
待检测样本：1)大肠癌样本septin9信号值小于40Ct值；actin信号值大于40Ct值；
2)健康人样本septin9与actin信号值均大于40Ct值。
显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括：septin9基因甲基化检测位点对应的引物序列；septin9基因检测位点探针序列；内参基因检测位点对应引物序列；内参基因检测位点探针序列，Septin9基因检测位点为septin9基因CpG岛3的一个位点；内参基因为Actin。
2.根据权利要求1所述的人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于：所述septin9基因甲基化检测位点对应的引物序列包括：
正向引物：5’-GACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGT-3’
反向引物：5’-AAATGATCCCATCCAGCTG-3’
所述septin9基因检测位点探针序列：FAM-TTGACCGCGGGGTCCGAC-MGB。
3.根据权利要求1所述的人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于：使用Actin作为内参基因，内参基因的的引物及探针序列如下：
正向引物：5’-GCGCCGTTCCGAAAGTT-3’
反向引物：5’-CGGCGGATCGGCAAA-3’
检测探针：VIC-ACCGCCGAGACCGCGTC-MGB。
4.根据权利要求1所述的人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于：所述septin9基因检测探针和内参基因检测探针5’端荧光探针为FAM、VIC、TET中的一种。
5.根据权利要求1所述的人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阴性质控品、阳性质控品和空白对照。
6.根据权利要求1所述的人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为全甲基化的人类基因组DNA；所述阴性质控品为非甲基化人类基因组DNA。
7.根据权利要求1所述的人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于：试剂盒检测的样本是外周血、尿液或唾液。
8.一种采用如权利要求1所述的人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒的检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(a)外周血血浆分离；
(b)磁珠法提取游离DNA；
(c)游离DNA定量及酶解；
(d)实时荧光定量PCR检测Septin9和Actin基因；
检测该标记物的技术为荧光定量PCR技术，采用Taqman探针法检测；
Septin9基因检测位点为septin9基因CpG岛3的一个位点，其检测引物及探针序列如下：
正向引物：5’-GACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGT-3’
反向引物：5’-AAATGATCCCATCCAGCTG-3’
所述septin9基因甲基化位点检测探针：FAM-TTGACCGCGGGGTCCGAC-MGB
在荧光定量PCR检测方法中，使用Actin作为内参照基因，其检测引物及探针序列如下：
正向引物：5’-GCGCCGTTCCGAAAGTT-3’
反向引物：5’-CGGCGGATCGGCAAA-3’
检测探针：VIC-ACCGCCGAGACCGCGTC-MGB
通过对游离DNA酶解方法，来检测septin9基因甲基化可作为大肠癌筛查的生物标记物。
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