CN109554473A

CN109554473A - 一种在宫颈癌检测中应用的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109554473A
Application number: CN201811555722.8A
Authority: CN
Inventors: 李旭辉; 张雷; 郭书娟
Original assignee: Jingshan Biotechnology Jiangsu Co Ltd
Current assignee: Jingshan Biotechnology Jiangsu Co Ltd
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2019-04-02

Abstract

本发明涉及一种在宫颈癌检测中应用的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括检测MSF1基因甲基化的试剂，所述检测MSF1基因甲基化的试剂是检测MSF1基因第2种转录本NM_001113493.1的第一个外显子上游225～305bp处的CpG岛区段甲基化的试剂。本发明所检测的MSF1基因的CpG区域在和MSF1基因的其他区域比较起来，宫颈癌中的阳性率最高；通过锁核酸修饰的PCR扩增引物能提高引物的Tm值从而高灵敏检出MSF1的甲基化DNA片段。

Description

一种在宫颈癌检测中应用的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，特别涉及一种在宫颈癌检测中应用的试剂盒及其应用。

背景技术

已有研究表明人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生的高危因素。通过观察细胞形态的宫颈液基薄层细胞检测(TCT)联合HPV检测是目前临床用于筛查宫颈癌的主要方法。TCT受人为干扰因素大，从取样-涂片-观察 -判读都受人为因素的影响；而HPV感染多提示短暂性感染，对预测宫颈癌的发生价值相对较低。目前从肿瘤发生的分子机制入手来寻找肿瘤早诊的分子标志物已经成为一种趋势。基因启动子区域CpG岛甲基化能使基因表达沉默，从而引起一系列细胞的分子水平事件。目前国际已经公认基因甲基化是肿瘤发生进展过程中的早期事件。因此通过检测基因的甲基化对于预测细胞的癌变已经开始应用在不同的肿瘤早期诊断上，例如通过外周血中游离 DNA的基因甲基化早诊大肠癌；通过分析肺泡灌洗液细胞中基因甲基化早诊肺癌，等等。

发明内容

本发明提供一种在宫颈癌检测中应用的试剂盒，所述试剂盒包括检测 MSF1基因甲基化的试剂，所述检测MSF1基因甲基化的试剂是检测MSF1基因第2种转录本NM_001113493.1的第一个外显子(位于1～363bp)的 225～305bp之间的CpG岛区段甲基化的试剂。MSF1基因第2种转录本 NM_001113493.1参见文献Theo deVos,Reimo Tetzner,FabianModel,et al., Circulating Methylated SEPT9DNA in Plasma Is a Biomarker forColorectal Cancer.Clinical Chemistry,2009,55(7):1337-46；第一个外显子(位于1～363bp) 的225～305bp之间序列为SEQ ID NO:1：

CCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGC CGCTGCCCTCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCC。

在一种实施方式中，所述试剂盒包括样品DNA提取试剂、DNA甲基化修饰转化试剂以及基于荧光定量PCR方法检测MSF1基因甲基化的试剂，所述基于荧光定量PCR方法检测MSF1基因甲基化的试剂是检测MSF1基因第2种转录本NM_001113493.1的第一个外显子上游225～305bp处的CpG岛区段甲基化的试剂。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括用PCR方法检测内对照参考基因的试剂，所述内对照参考基因优选为ACTB基因；检测所述内参基因的试剂包括一对非甲基化位点扩增引物、一条检测非甲基化位点探针。

在一种实施方式中，检测所述ACTB基因的试剂包括扩增ACTB基因引物和探针：上游引物序列SEQ ID NO:2：ATAATAAAAAGGAGGTTGGAT；下游引物序列SEQ ID NO:3：CTCCCRCAAAACAACCAC；和检测探针序列 SEQ ID NO:4：CCACCTTACCCTAAACACTACAAC。

在一种实施方式中，所述检测MSF1基因甲基化的试剂包括扩增MSF1基因的一对在5’端锁核酸修饰的引物和一条检测甲基化位点的探针：上游引物序列SEQ ID NO:5：+TT+T+AGTTAGCGCGTAGGGTTC；下游引物序列 SEQ ID NO:6：+AA+C+TAATAAACAACGAATCGCG；和检测探针序列SEQ ID NO:7：ACGCCCCCGACGAAACC。

在一种实施方式中，所述样品DNA来自于宫颈组织和/或宫颈细胞刷片 DNA。

在一种实施方式中，本发明提供上述试剂盒在宫颈癌检测中的应用。

本发明所描述的通过分析宫颈细胞样本中基因的甲基化辅助诊断宫颈癌的方法及试剂盒与应用的优点包括：1、所检测的MSF1基因的CpG区域在和MSF1基因的其他区域比较起来，宫颈癌中的阳性率最高；2、在经过亚硫酸盐转化过的DNA序列中，由于非CpG岛上的C碱基都转化为T碱基，导致引物的Tm值过低，因此通过锁核酸修饰的PCR扩增引物能提高引物的Tm值从而高灵敏检出MSF1的甲基化DNA片段。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明MSF1基因的甲基化探针和内对照AcbB的非甲基化探针的qPCR实验曲线示意图，其中短虚线曲线是MSF1基因的甲基化探针，长虚线曲线是ActB基因的探针；图1(a)宫颈癌阳性样本的qPCR原始起峰图，图(b)宫颈癌阴性样本的qPCR原始起峰图，和(c)没有经过锁核酸修饰的MSF1基因引物在宫颈癌阳性样本的qPCR原始起峰图。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

实施例一本发明检测宫颈癌的试剂盒

本发明检测宫颈癌的试剂盒关键的构思在于，通过筛选比较发现MSF1 基因第2种转录本，NM_001113493.1，第一个外显子上游的225～305bp之间的CpG岛区段在宫颈癌中发生高度甲基化，因此本发明以该区段的CpG岛甲基化作为检测目标区，来辅助早期诊断宫颈癌。

本发明检测MSF1基因的甲基化程度的试剂盒是基于荧光定量PCR的方法，包括一个内对照参考基因ActB。MSF1基因包括一对高敏性在5’端锁核酸修饰的引物、一条检测甲基化位点的探针；ActB基因包括一对引物、一条检测非甲基化位点探针。各种序列如表1、表2。

1.PCR引物设计

表1.基因PCR引物序列

备注：+后面的碱基为锁核酸修饰的碱基

2.探针设计

表2.探针序列

探针名称	探针序列(5’-3’)	序列名称
			MSF1-p	FAM-ACGCCCCCGACGAAACC–BHQ1	SEQ ID NO:7
ActB-p	HEX-CCACCTTACCCTAAACACTACAAC-BHQ1	SEQ ID NO:4

3、宫颈组织，和宫颈细胞刷片DNA提取

宫颈组织和宫颈细胞刷片的DNA都采用商业化试剂盒进行提取，例如天根生化科技(北京)有限公司的TIANamp Genomic DNA kit(离心柱法)

4、DNA的甲基化修饰转化

采用7.5M的亚硫酸铵，70℃处理2个小时对DNA进行转化。经过亚硫酸盐处理后，DNA中发生了甲基化的CpG岛上的C碱基仍然保持C碱基，而没有发生甲基化的CpG岛上的C碱基则变成了U碱基，这样就造成了甲基化的DNA和非甲基化的DNA的序列差异，可以为后续的核酸检测方法检出。转化后的DNA液体经过磁珠法DNA纯化后，可以立即使用或放入-20℃保存待用，作为后续荧光定量qPCR反应的模板。

5、荧光定量检测：

qPCR反应体系配制；

qPCR反应体系	组成
		2×Premix Ex Taq(TakaRa公司)	10μl
两个基因的上游引物	各0.25μM(终浓度)
		两个基因的下游引物	各0.25μM(终浓度)
MSF1基因探针	0.40μM(终浓度)
		AcbB基因探针	0.40μM(终浓度)
亚硫酸盐转化后的DNA模板	5μl

补水到20μl。

qPCR反应条件

MSF1基因的甲基化探针和内对照AcbB的非甲基化探针的qPCR实验曲线如图1。其中短虚线曲线是MSF1基因的甲基化探针，长虚线曲线是ActB 基因的探针。可以看见在临床样本中ActB基因总是阳性，表明临床来源的样本和实验流程没有问题；而MSF1基因甲基化只有在宫颈癌阳性样本中发生，在宫颈癌阴性样本中没有检出。

图1(a)是宫颈癌阳性样本的qPCR原始起峰图，Actb的Ct＝24.8，MSF1 的Ct＝28.4，△Ct值＝3.8；图1(b)是宫颈癌阴性样本的qPCR原始起峰图，图1(c)没有经过锁核酸修饰的MSF1基因引物在宫颈癌阳性样本的qPCR 原始起峰图，ActB的Ct＝26.2,MSF1的Ct＝32.8，△Ct值＝6.6。

经过5’端锁核酸修饰的MSF1基因引物的扩增效率，较没有锁核酸修饰的引物，扩增效率提高了2^(6.6-3.8)＝2^2.8＝6.96倍。

实施例二.本发明试剂盒的应用

本发明所描述的宫颈细胞基因甲基化检测试剂盒和方法，基于 ThermoFisher公司的ABI7500Fast Dx荧光定量仪器对临床上经过病理已经确认为宫颈癌患者的宫颈刷片样本，和非宫颈癌对照人群的宫颈刷片样本的甲基化值进行了检测，结果如下表。

在宫颈癌组和非宫颈癌组的宫颈刷片样本中检出的MSF1基因甲基化的Ct 值，和内参基因的Ct值，以及△Ct值＝MSF1基因的Ct值-Actb的Ct值。而根据文献(1)MSF1基因第2种转录本，NM_001113493.1，第一个外显子(位于1～363bp)的289～351bp之间的CpG岛区段所用的引物探针得到的△Ct 值(文献)如下表

可见，本发明能准确区分出宫颈癌患者和非宫颈癌对照，我们定义当△ Ct值＜9时，能以灵敏度＝100％，特异性＝100％检出宫颈癌患者；

当使用文献所选择的CpG岛设计的引物探针时，灵敏度只能达到85％，特异性仍然可以达到100％；参见文献Theo deVos,Reimo Tetzner,Fabian Model,et al.,Circulating Methylated SEPT9DNA in Plasma Is a Biomarker for ColorectalCancer.Clinical Chemistry,2009,55(7):1337-46。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

序列表

<110> 敬善生物科技江苏有限公司

<120> 一种在宫颈癌检测中应用的试剂盒及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 81

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

cccagccagc gcgcagggcc cgggccccgc cgggggcgct tcctcgccgc tgccctccgc 60

gcgacccgct gcccaccagc c 81

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataataaaaa ggaggttgga t 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcccrcaaa acaaccac 18

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccaccttacc ctaaacacta caac 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttagttagc gcgtagggtt c 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aactaataaa caacgaatcg cg 22

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgcccccga cgaaacc 17

Claims

1.一种在宫颈癌检测中应用的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测MSF1基因甲基化的试剂，所述检测MSF1基因甲基化的试剂是检测MSF1基因第2种转录本NM_001113493.1的第一个外显子上游225～305bp处的CpG岛区段甲基化的试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括样品DNA提取试剂、DNA甲基化修饰转化试剂以及基于荧光定量PCR方法检测MSF1基因甲基化的试剂，所述基于荧光定量PCR方法检测MSF1基因甲基化的试剂是检测MSF1基因第2种转录本NM_001113493.1的第一个外显子上游225～305bp处的CpG岛区段甲基化的试剂。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用PCR方法检测内对照参考基因的试剂，所述内对照参考基因优选为ACTB基因；检测所述内参基因的试剂包括一对非甲基化位点扩增引物、一条检测非甲基化位点探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：检测所述ACTB基因的试剂包括扩增ACTB基因引物和探针：

上游引物序列SEQ ID NO:2：ATAATAAAAAGGAGGTTGGAT；

下游引物序列SEQ ID NO:3：CTCCCRCAAAACAACCAC；

检测探针序列SEQ ID NO:4：CCACCTTACCCTAAACACTACAAC。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述检测MSF1基因甲基化的试剂包括扩增MSF1基因的一对在5’端锁核酸修饰的引物和一条检测甲基化位点的探针：

上游引物序列SEQ ID NO:5：+TT+T+AGTTAGCGCGTAGGGTTC；

下游引物序列SEQ ID NO:6：+AA+C+TAATAAACAACGAATCGCG；

检测探针序列SEQ ID NO:7：ACGCCCCCGACGAAACC。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述样品DNA来自于宫颈组织和/或宫颈细胞刷片DNA。

7.权利要求1-6任一所述的试剂盒在宫颈癌检测中的应用。