CN108949923A - 一种扩增msf1基因的方法及试剂盒与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种MSF1基因DNA扩增方法，以及通过分析MSF1基因的甲基化状态来辅助诊断宫颈癌的方法和试剂盒及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种MSF1基因DNA扩增方法，以及通过分析MSF1基因的甲基化状态来辅助诊断宫颈癌的方法和试剂盒及其应用。
背景技术
已有研究表明人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生的高危因素。通过观察细胞形态的宫颈液基薄层细胞检测(TCT)联合HPV检测是目前临床用于筛查宫颈癌的主要方法。TCT受人为干扰因素大，从取样-涂片-观察-判读都受人为因素的影响；而HPV感染多提示短暂性感染，对预测宫颈癌的发生价值相对较低。目前从肿瘤发生的分子机制入手来寻找肿瘤早诊的分子标志物已经成为一种趋势。基因启动子区域CpG岛甲基化能使基因表达沉默，从而引起一系列细胞的分子水平事件。目前国际已经公认基因甲基化是肿瘤发生进展过程中的早期事件。因此通过检测基因的甲基化对于预测细胞的癌变已经开始应用在不同的肿瘤早期诊断上，例如通过外周血中游离DNA的基因甲基化早诊大肠癌；通过分析肺泡灌洗液细胞中基因甲基化早诊肺癌，等等。
但是，现有的检测甲基化的方法普遍存在位点特异性较差，干扰信号过高，反应灵敏度不够等问题，因此迫切需要一种能够高通量、高特异性、高灵敏度扩增目标基因位点的PCR扩增方法。
发明内容
本公开的一个目的是提供一种MSF1基因DNA扩增方法，所述方法包括：将待测标本、对照基因进行PCR反应，其中PCR反应中DNA标本是经过亚硫酸氢盐处理的、转化后的DNA标本，优选地，所述PCR扩增反应体系中包括3`端进行了去羟基化修饰的封闭探针。
本公开的一个目的是提供一种MSF1基因DNA扩增方法，所述方法包括：将待测标本、对照基因进行荧光定量PCR反应，其中PCR反应中DNA标本是经过亚硫酸氢盐处理的、转化后的DNA标本，所述PCR扩增反应体系中包括3`端进行了去羟基化修饰的封闭探针。
本发明的一个目的是通过分析宫颈癌患者以及非宫颈癌对照人群的宫颈组织中MSF1基因的启动子区域的甲基化程度存在明显差异，从而证明通过检测MSF1的甲基化可以作为辅助诊断宫颈癌的生物标志物。
本公开的一个目的在于提供实现检测MSF1基因甲基化的方法试剂盒及其使用方法。
本公开针对MSF1基因的第三种转录本的第1号外显子上的CpG岛的甲基化进行检测。
在一方面，本公开涉及一种MSF1基因扩增方法，所述方法是基于PCR的方法，包括：(1)PCR引物设计；(2)样品DNA提取；(3)DNA的甲基化修饰转化；(4)PCR扩增。PCR扩增后的产物可以进行常规实验室分析，包括但不限于电泳分析，定量分析，相互作用分析，DNA片段提纯，测序分析等。在进一步的一方面，本公开涉及一种MSF1基因扩增方法，所述方法是基于荧光定量PCR的方法，包括：(1)PCR引物设计；(2)探针设计；(3)样品DNA提取；(4)DNA的甲基化修饰转化；(5)荧光定量PCR扩增。
在一方面，任选地本公开的PCR引物包括检测MSF1基因的引物和对照基因引物，优选地所述对照基因是ActB基因。
在一方面，任选地本公开的探针包括检测MSF1基因甲基化位点和对照基因的探针，优选地，还包括封闭MSF1基因非甲基化位点的探针。
在一方面，任选地本公开的样品DNA是体外样本，包括血液、体液、组织样本等，任选地，所述样本来自于临床样本，优选地，所述样本是宫颈组织，和宫颈细胞刷片。
在一方面，任选地本公开的样品DNA采用商业化试剂盒进行提取，例如天根生化科技(北京)有限公司的TIANamp Genomic DNA kit(离心柱法)。
在一方面，任选地本公开的DNA的甲基化修饰转化采用亚硫酸盐处理，优选采用6-8M的亚硫酸铵，60-80℃处理1-5个小时对DNA进行转化，最优选采用7.5M的亚硫酸铵，70℃处理2个小时对DNA进行转化。当然，本公开方法也可以选择亚硫酸氢盐转化试剂盒，包括QIAGEN、默克密理博、Sigma-Aldrich、Zymo、Life Technologies等。
在一方面，任选地，本公开的DNA经过甲基化修饰转化后再进一步进行纯化，优选地，所述纯化采用磁珠分选法。
在一方面，任选地本公开还包括计算扩增的MSF1基因甲基化的Ct值，和对照基因的Ct值。
在一方面，本公开涉及诊断宫颈癌的方法，所述方法包括检测MSF1基因甲基化程度，然后根据事先确定的阈值判断宫颈癌的风险。任选地，所述MSF1基因甲基化程度可以体现为图形或者数值，任选地，所述图形如图1或2所示。
在一方面，本公开涉及诊断宫颈癌的方法，所述方法包括对来自样本的荧光定量PCR扩增的结果进行分析处理，然后根据处理的结果判断宫颈癌的风险。
在一方面，本公开涉及一种检测MSF1基因甲基化程度的试剂盒，所述试剂盒包括检测MSF1基因的引物，检测MSF1基因甲基化位点的探针，ActB基因对照引物和探针。
在进一步的方面，任选地，本公开还包括封闭MSF1基因非甲基化位点的探针。
在进一步的方面，任选地，本公开的探针末端是淬灭剂标记的，优选用不同的淬灭剂标记，更优选地，检测MSF1基因甲基化位点的探针在3’末端用Dabcyl标记，封闭MSF1基因非甲基化位点的探针在3’末端用C3标记，ActB基因的探针在3’末端用BHQ1标记，进一步优选地，检测MSF1基因甲基化位点的探针在5’端还用荧光染料标记。
优选地，所述的封闭MSF1基因非甲基化位点的探针为寡核苷酸链，更优选地，所述的阻断片段的3`端修饰为：磷酸化处理、脱羟基化处理或者间臂：C3 Spacer、C6 Spacer、C12 Spacer中的一种或者多种。最优选地，所述阻断片段的序列为C3 Spacer修饰。
优选地，所述的MSF1基因和对照基因的探针的5`端报告荧光基团为FAM、JOE、TAMRA、HEX、Texas Red、Cy3、Cy5中的一种或者多种，所述靶基因和对照基因的探针的3`端猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一种或者多种。
在一方面，本公开涉及一种检测MSF1基因甲基化程度的引物及其在制备用于诊断宫颈癌的试剂盒中的用途，所述引物序列为：
MSF1-F GTGGATATTAAAAAGGAGTAGTAAG
MSF1-R ACAACCTCCTCTCTCCAC。
在一方面，本公开涉及一种检测MSF1基因甲基化程度的探针及其在制备用于诊断宫颈癌的试剂盒中的用途，所述探针序列为：AAATAAAACGCGACGCATTAT，优选地，所述探针同时标记荧光染料和淬灭剂，更优选地，所述探针在5’标记荧光染料，在3’标记淬灭剂。
在一方面，本公开涉及一种封闭MSF1基因非甲基化程度的探针及其在制备用于诊断宫颈癌的试剂盒中的用途，所述探针序列为：AAATAAAACACAACACATTATAACCC，优选地，所述探针在3’端标记淬灭剂。
附图说明
图1宫颈癌阳性样本的qPCR原始起峰图。长散点曲线表示对照基因ActB的起峰曲线；短散点曲线表示甲基化MSF1基因的起峰曲线。
图2宫颈癌阴性样本的qPCR原始起峰图。长散点曲线表示对照基因ActB的起峰曲线；短散点曲线表示甲基化MSF1基因的起峰曲线。
具体实施方式
一种MSF1基因扩增方法，所述方法包括：将待测DNA进行PCR反应扩增，其中包括针对MSF1基因的第三种转录本的第1号外显子上的CpG岛的甲基化位点进行扩增。
一种MSF1基因扩增方法，所述方法包括：将待测DNA进行荧光定量PCR反应，其中包括针对MSF1基因的第三种转录本的第1号外显子上的CpG岛的甲基化位点进行扩增。
根据前述任一项的方法，其中所述PCR扩增方法包括：(1)PCR引物设计；(2)样品DNA提取；(3)DNA的甲基化修饰转化；(4)PCR扩增。
根据前述任一项的方法，其中PCR扩增后的产物可以进行常规实验室分析，优选地所述分析包括电泳分析，定量分析，相互作用分析，DNA片段提纯，测序分析等。
根据前述任一项的方法，其中所述方法是基于荧光定量PCR的方法，包括：(1)PCR引物设计；(2)探针设计；(3)样品DNA提取；(4)DNA的甲基化修饰转化；(5)荧光定量PCR扩增。
根据前述任一项的方法，其中所述方法的PCR引物包括扩增MSF1基因和对照基因的引物，优选地所述对照基因是ActB基因。
根据前述任一项的方法，其中所述MSF1基因引物序列为：
MSF1-F GTGGATATTAAAAAGGAGTAGTAAG
MSF1-R ACAACCTCCTCTCTCCAC。
根据前述任一项的方法，其中所述方法还包括检测MSF1基因甲基化位点和对照基因的探针，优选地，还包括封闭MSF1基因非甲基化位点的探针，任选地，所述封闭探针是3`端进行了去羟基化修饰的封闭探针。
根据前述任一项的方法，其中所述方法的DNA样品来自于体外样本，包括细胞、血液、体液、组织样本等，任选地，来自于临床样本，优选地，所述样本是宫颈组织和/或宫颈细胞刷片。
根据前述任一项的方法，其中所述方法的样品DNA采用商业化试剂盒进行提取，例如天根生化科技(北京)有限公司的TIANamp Genomic DNA kit(离心柱法)。
根据前述任一项的方法，其中所述方法的DNA经过甲基化修饰转化后再进一步进行纯化，优选地，所述纯化采用磁珠分选法。
根据前述任一项的方法，其中所述方法还包括计算MSF1基因扩增后的Ct值，和对照基因扩增后的的Ct值。
一种诊断宫颈癌的方法，所述方法包括检测MSF1基因甲基化程度，然后根据事先确定的阈值判断宫颈癌的风险，任选地，所述MSF1基因甲基化程度可以体现为图形或者数值，任选地，所述图形如图1和/或2所示，任选地，所述数值是Ct值。
一种诊断宫颈癌的方法，所述方法包括下列步骤：(1)对MSF1基因进行检测，(2)对检测到的MSF1基因进行定量，(3)对定量结果进行数据转换，优选地所述数据转化体现为图形或者数值，任选地，所述图形如图1和/或2所示，任选地，所述数值是Ct值，(4)将目标基因数值与对照基因数值进行比较，得出诊断结果。
一种诊断宫颈癌的方法，所述方法采用前述任一项的方法或其组合来判断宫颈癌的风险。
根据前述任一项的方法，其中所述方法包括对来自样本的荧光定量PCR扩增的结果进行处理，然后根据处理的结果判断宫颈癌的风险，任选地，所述处理包括图形处理和/或数值处理。
一种扩增MSF1基因的试剂盒，所述试剂盒包括扩增MSF1基因的引物，结合MSF1基因甲基化位点的探针，ActB对照基因引物和探针。
根据前述试剂盒，其中所述试剂盒还包括封闭MSF1基因非甲基化位点的探针。
根据前述试剂盒，所述试剂盒用于实施前述任一项的方法。
一种扩增MSF1基因的引物及其在制备用于诊断宫颈癌的试剂盒中的用途。
一种检测MSF1基因甲基化程度的探针及其在制备用于诊断宫颈癌的试剂盒中的用途。
一种封闭MSF1基因非甲基化程度的探针及其在制备用于诊断宫颈癌的试剂盒中的用途。
根据前述任一项，所述扩增MSF1基因的引物序列为：
MSF1-F GTGGATATTAAAAAGGAGTAGTAAG
MSF1-R ACAACCTCCTCTCTCCAC。
根据前述任一项，所述对照基因引物序列为：
ActB-F ATAATAAAAAGGAGGTTGGAT
ActB-R CTCCCRCAAAACAACCAC
根据前述任一项，所述探针序列为：AAATAAAACGCGACGCATTAT，优选地，所述探针同时标记荧光染料和淬灭剂，更优选地，所述探针在5’标记荧光染料，在3’标记淬灭剂
根据前述任一项，所述探针序列为：AAATAAAACACAACACATTATAACCC，优选地，所述探针在3’端标记淬灭剂。
根据前述任一项，所述探针序列为：CCACCTTACCCTAAACACTACAAC，优选地，所述探针在3’端标记淬灭剂。
根据前述任一项，任选地，本公开的探针末端是淬灭剂标记的，优选用不同的淬灭剂标记，更优选地，检测MSF1基因甲基化位点的探针在3’末端用Dabcyl标记，封闭MSF1基因非甲基化位点的探针在3’末端用C3标记，ActB基因的探针在3’末端用BHQ1标记，进一步优选地，检测MSF1基因甲基化位点的探针在5’端还用荧光染料标记。
优选地，所述的封闭MSF1基因非甲基化位点的探针为寡核苷酸链，更优选地，所述的阻断片段的3`端修饰为：磷酸化处理、脱羟基化处理或者间臂：C3 Spacer、C6 Spacer、C12 Spacer中的一种或者多种。最优选地，所述阻断片段的序列为C3 Spacer修饰。
优选地，所述的MSF1基因和对照基因的探针的5`端报告荧光基团为FAM、JOE、TAMRA、HEX、Texas Red、Cy3、Cy5中的一种或者多种，所述靶基因和对照基因的探针的3`端猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一种或者多种。
根据前述任一项，本公开的试剂盒针对MSF1基因包括一对引物、一条检测甲基化位点的探针、一条封闭非甲基化位点的探针；针对ActB基因包括一对引物、一条检测非甲基化位点探针。各种序列如表1、表2所示。
1、PCR引物设计：
表1基因PCR引物序列
注：F表示上游引物，R表示下游引物
2、探针设计：
针对MSF1基因，即使是癌组织的临床样本，中间也总掺杂有很多正常细胞，而正常细胞的MSF1基因是不发生甲基化的，为了提高甲基化DNA片段检测的灵敏度，这里我们设计了一条MSF1基因的封闭探针，只能和非甲基化的MSF1序列结合。封闭探针的3’端进行C3修饰使得不能延伸。而内对照的ActB是不发生甲基化的，因此只需要设计非甲基化探针。
表2探针序列
注：M表示甲基化探针，U表示非甲基化探针，B表示封闭探针
3、宫颈组织和宫颈细胞刷片DNA提取：
宫颈组织和宫颈细胞刷片的DNA都采用商业化试剂盒进行提取，例如天根生化科技(北京)有限公司的TIANamp Genomic DNA kit(离心柱法)。
4、DNA的甲基化修饰转化：
采用7.5M的亚硫酸铵，70℃处理2个小时对DNA进行转化。经过亚硫酸盐处理后，DNA中发生了甲基化的CpG岛上的C碱基仍然保持C碱基，而没有发生甲基化的CpG岛上的C碱基则变成了U碱基，这样就造成了甲基化的DNA和非甲基化的DNA的序列差异，可以为后续的核酸检测方法检出。转化后的DNA液体经过磁珠法DNA纯化后，可以立即使用或放入-20℃保存待用，作为后续荧光定量qPCR反应的模板。
5、荧光定量检测：
qPCR反应体系配制；
补水到20μl。
qPCR反应条件
MSF1基因的甲基化探针和内对照AcbB的非甲基化探针的qPCR实验曲线案例如图1和图2所示。其中红色曲线是MSF1基因的甲基化探针，绿色曲线是AcbB基因的非甲基化探针。可以看见在临床样本中AcbB基因检测非甲基化都是阳性，表明临床来源的样本和实验流程没有问题；而MSF1基因甲基化只有在宫颈癌阳性样本中发生，在宫颈癌阴性样本中没有检出。
本公开提供的DNA扩增方法优点在于可以特异性扩增细胞中MSF1甲基化基因，由于基因中的甲基化和非甲基化位点很多，各种干扰也很多，因此，能否特异性扩增出目标位点的DNA片段是进行下一步任何分析的基础。现有技术中的MSF1甲基化基因扩增方法存在特异性差，扩增目标产量低等特点，所得到的扩增产物难以进行高精度、高准确性的分析，例如荧光定量分析等。本公开提供的MSF1甲基化基因引物能够特异性、高通量扩增目标基因片段，在此基础上，能够胜任高灵敏度，高特异性的荧光定量PCR分析。通过上述图1和图2的结果可以看到，本公开的扩增方法可以胜任荧光定量PCR反应，得到的反应的曲线非常清晰，具有较高的分辨率。基于上述结果，本领域技术人员也可以理解，本公开的扩增方法得到的产物也可以胜任进行普通的实验室分析，包括但不限于电泳分析，定量分析，相互作用分析，DNA片段提纯，测序分析等。
本公开的DNA扩增方法与荧光定量方法的结合使得对于试验结果再进行进一步的分析，从而通过分析宫颈细胞样本中基因的甲基化来辅助诊断宫颈癌成为可能。
本公开所描述的通过分析宫颈细胞样本中基因的甲基化辅助诊断宫颈癌的方法及试剂盒与应用的优点包括：通过检测宫颈细胞中MSF1基因的甲基化状态能较TCT和HPV病毒检测更贴近宫颈细胞的真实癌变状态。本公开的试剂盒与方法还具有灵敏度高，特异性强、重复性好、操作简单、安全等优点，检测结果具有较高的精密度和重复性等优点。本公开的试剂盒与方法学的灵敏度可以达到每一管反应(20μl)中绝对灵敏度为10pg DNA，即可检出2-3个基因组拷贝数，相对灵敏度高于1000:1，即可在1000个非靶点序列中，有效扩增1个靶点序列。
实施例
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1用本发明所描述的宫颈细胞基因甲基化检测方法，基于ThermoFisher公司的ABI7500Fast Dx荧光定量仪器对临床上经过病理已经确认为宫颈癌患者的宫颈刷片样本，和非宫颈癌对照人群的宫颈刷片样本的甲基化值进行了检测，结果如表3；以表3的数据作图展示的效果如图1和图2所示：
表3.在宫颈癌组和非宫颈癌组的宫颈刷片样本中检出的MSF1基因甲基化的Ct值，和对照基因的Ct值。
可见，本发明能准确区分出宫颈癌患者和非宫颈癌对照，我们定义当△Ct值＜9时，就怀疑所检测的宫颈刷片样本中含有癌细胞，可以通过病理方法对宫颈细胞的癌变情况进行进一步确认。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种MSF1基因扩增方法，所述方法包括：将待测DNA进行PCR反应，其中针对MSF1基因的第三种转录本的第1号外显子上的CpG岛的甲基化位点进行扩增。
2.根据权利要求1的方法，其中PCR扩增后的产物可以进行进一步分析，优选地所述分析包括电泳分析，定量分析，相互作用分析，DNA片段提纯，测序分析等。
3.一种MSF1基因扩增方法，其中所述方法是基于荧光定量PCR的方法，所述方法包括：(1)PCR引物设计；(2)探针设计；(3)样品DNA提取；(4)DNA的甲基化修饰转化；(5)荧光定量PCR扩增。
4.一种扩增MSF1基因的试剂盒，所述试剂盒包括扩增MSF1基因的引物，结合MSF1基因甲基化位点的探针，ActB对照基因引物和探针。
5.根据前述权利要求任一项的方法或试剂盒，所述扩增MSF1基因的引物序列为：
MSF1-F GTGGATATTAAAAAGGAGTAGTAAG
MSF1-RACAACCTCCTCTCTCCAC。
6.根据前述权利要求任一项的方法或试剂盒，其中还包括扩增对照基因的引物，优选所述对照基因是ActB基因，更优选所述扩增ActB基因的引物序列为：
ActB-F ATAATAAAAAGGAGGTTGGAT
ActB-R CTCCCRCAAAACAACCAC。
7.根据前述权利要求任一项的方法或试剂盒，其中还包括使用检测MSF1基因甲基化位点和对照基因的探针，优选地，所述检测MSF1基因甲基化位点的探针序列为：AAATAAAACGCGACGCATTAT。
8.根据前述权利要求任一项的方法或试剂盒，其中所述方法还包括封闭MSF1基因非甲基化位点的探针，优选地，所述封闭探针序列为：
AAATAAAACACAACACATTATAACCC。
9.一种诊断宫颈癌的方法，所述方法包括下列步骤：(1)对MSF1基因进行检测，(2)对检测到的MSF1基因进行定量，(3)对定量结果进行数据转换，优选地所述数据转化体现为图形或者数值，任选地，所述图形如图1和/或2所示，任选地，所述数值是Ct值，(4)将目标基因数值与对照基因数值进行比较，得出诊断结果。
10.扩增MSF1基因的引物，及其在制备用于诊断宫颈癌的试剂盒中的用途，优选地，所述引物是权利要求5中所述的引物。
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