CN109097468A - Opcml基因启动子甲基化水平的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Opcml基因启动子甲基化水平的检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种OPCML基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒，包括以下物质：(a)酶切反应液(10μL/测试)，包括双蒸水7μL，10×Buffer R 2μL，Bsh1236I 1μL；(b)OPCML基因的引物及探针组；(c)PCR工作液；(d)标准品1‑5，浓度分别为7.0×107copies/mL、7.0×106copies/mL、7.0×105copies/mL、7.0×104copies/mL、7.0×103copies/mL。利用本发明的试剂盒及MSRE结合MNAzyme qPCR技术，可快速、准确地检测出卵巢癌患者外周血中OPCML基因启动子甲基化水平。

Description

OPCML基因启动子甲基化水平的检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种OPCML基因启动子甲基化水平的检测试剂盒及其应用，尤其用于MSRE结合MNAzyme qPCR检测卵巢癌患者外周血中OPCML基因启动子甲基化水平。
背景技术
目前，卵巢癌发病率位居女性生殖系统恶性肿瘤第三位，病死率居第一位，占所有因癌症死亡女性患者的3％。卵巢癌90％以上为上皮性卵巢癌，发病隐匿，临床确诊时约80％患者疾病已为晚期，预后差。晚期卵巢癌(FIGOⅡ-Ⅳ期)患者5年生存率仅为30～45％，而早期卵巢癌(FIGOⅠ期)患者5年生存率高达90％以上。因此，除积极寻找新的有效的治疗方式外，探讨卵巢癌发生发展的生物学机制，研发新型卵巢癌早期诊断技术迫在眉睫。
现有技术中尚无简便有效的、精确的、可常规用于卵巢癌早期诊断的检测方法。CA125是目前普遍使用的卵巢癌标志物，但仅有50～60％的I期卵巢癌患者CA125水平升高，且其他疾病如卵巢子宫内膜异位囊肿等亦可引起CA125水平升高，故其敏感性和特异性较差，卵巢癌阳性预测值仅有10％～35％。总体而言，对于血清CA125检测、经阴道超声探查等传统的早期诊断方法单一或联合应用，目前均无证据显示可降低人群的卵巢癌发病率和(或)病死率。其主要原因在于这些方法的假阴性或假阳性率均过高，敏感性和特异性达不到临床需要。
DNA甲基化是一项重要的表观遗传学机制，在人类癌症发生发展中发挥着重要的作用。特定基因的启动子区甲基化异常引起了人们的广泛关注，被认为是癌症诊断的潜在标志物。在癌症中只有极少数的单独基因被证明是甲基化比例很高的。因此，检测一组基因的甲基化状态，与检测单独基因的甲基化状态相比，诊断灵敏度更高、特异性更好。目前研究已证实原发性卵巢癌可有多种抑癌基因的甲基化，提示卵巢癌显示出CpG岛甲基化表征。作为癌症发生的早期事件，抑癌基因DNA异常甲基化检测可以在患者出现临床表现或者影像学证据之前做到分子诊断，为卵巢癌的早期诊断提供了新的途径。
目前，研究已证实癌症患者血清富含肿瘤DNA(Serum free circulating DNA，SfcDNA)，可用于癌症分子生物学诊断。使用体液标本(血清、尿液等)检测其中游离肿瘤特异DNA在其他癌症如肺癌、头颈部肿瘤、前列腺癌等已被证实可行。更为重要的是，肿瘤游离DNA不仅在晚期转移癌症患者血清内存在，对于早期患者，血清内同样可检测到肿瘤游离DNA，研究认为其来源于侵入体内循环但无浸润机体实质器官能力的肿瘤细胞，或是由凋亡肿瘤细胞释放进入体内循环。因此，利用血清游离DNA(SfcDNA)进行癌症的早期分子生物学诊断是当前研究的一大热点。
虽然国内外研究者利用卵巢癌患者血清游离DNA甲基化检测，在卵巢癌早期诊断中的研究取得了令人振奋的进步，但是在实际操作过程中存在以下局限性：1、血清游离DNA微量(正常人浓度平均为：0.03ug/ml，肿瘤患者浓度平均为0.18ug/ml)，并且多以小片段形式存在，大大增加了提取的难度，降低了临床检测的敏感性和特异性；2、目前DNA甲基化的主要研究方法为甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)，其操作繁琐，DNA经亚硫酸氢盐修饰后丢失严重，一般只用于单个基因检测，特异性和敏感性均较低；3、卵巢癌抑癌基因失活的不确定性及血清游离DNA的局限性，导致单一卵巢癌甲基化标记物检测无法满足临床要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种OPML基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒及其应用，特异性强、准确性高。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种OPCML基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒，包括以下物质：
(a)酶切反应液(10μL/测试)，包括双蒸水7μL，10×Buffer R 2μL，Bsh1236I 1μL；
(b)OPCML基因的引物及探针组，序列为：
其中：序列中大写字母为DNA序列，小写字母为RNA序列；
(c)PCR工作液
；
(d)标准品1-5，浓度分别为7.0×107copies/mL、7.0×106copies/mL、7.0×105copies/mL、7.0×104copies/mL、7.0×103copies/mL。
本发明还提供一种上述的OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(A)取患者血清10μL加入到酶切反应液中，轻轻混匀后37℃孵育16小时，标准品与血清同步处理；
(B)取上述酶切DNA 5μL加入到PCR工作液中，进行PCR检测；
(C)结果判断：根据标准曲线自动计算未知标本的相应基因拷贝浓度，若发现有标本Ct值小于15，须将其剔除此次结果分析，该标本稀释后再测直至其Ct值大于15。
本发明的甲基化敏感性限制性内切酶结合MNAzyme定量PCR(MSRE MNAzyme qPCR)检测技术，较好地克服了血清循环DNA甲基化检测敏感性、特异性不高的缺点，可作为一种有效的早期上皮性卵巢癌诊断检测手段。
本发明还提供一种OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)亚硫酸氢盐处理后测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)法检测卵巢癌组织中OPCML基因启动子的甲基化状态，具体为：
(1-1)取卵巢癌组织标本20mg，用剪刀剪碎后放入1.5ml的离心管中，利用DNA抽提试剂盒抽提组织样本中的DNA，抽提的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度，利用DNA修饰试剂盒修饰提取后的DNA，然后把修饰后的DNA溶解在20μLBuffer TE中；
(1-2)引物系列为：
上游引物5'-GTTTTTTTTGTAGG-GGAAGT-3'，
下游引物5'-CAACAACTCCATCCCTAACC-3'，产物长度243bp；
对修饰后的DNA进行PCR扩增，反应体系25μl，包括：
修饰后的DNA——2μl，10×Buffer——2.5μl，2.5mmol/L dNTP——2μl，25mmol/LMgCl2——1μl，10μmol/L上游引物——0.5μl，10μmol/L下游引物——0.5μl，5U Taq酶——0.2μl，无菌蒸馏水——16.3μl；
循环条件：
(1-3)利用PCR产物胶纯化试剂盒对步骤(1-2)取得的PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物与质粒连接，转化到感受态细菌中进行蓝白斑筛选，挑取10个白色阳性克隆送公司进行测序，对测序结果与基因组序列进行比对，分析OPCML基因启动子的甲基化状态；
(2)根据步骤(1)的分析结果确定扩增位置及设计引物，引物及探针系列包括：
；
(3)选取OPCML基因启动子甲基化阳性样本，制备标准品
(3-1)在步骤(1-3)的测序确定阳性的标本中选取1个组织进行DNA提取；
(3-2)将步骤(3-2)提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度；
(3-3)对步骤(3-2)提取的DNA进行PCR扩增，引物为OPCML-F和OPCML-R，反应体系为：
反应参数为：
(3-4)利用PCR产物胶纯化试剂盒，对步骤(3-3)得到的PCR产物进行纯化；
(3-5)步骤(3-4)所得纯化产物与PGEM-T Easy Vector连接，将连接后的产物转染到DH5α细胞中，方法同步骤(1-3)，然后选取白色克隆产物送入公司进行测序，确定该基因片段(测序后的阳性克隆产物)的序列与目标基因一致；
(3-6)进行质粒提取，然后将质粒DNA用无菌蒸馏水稀释20倍，然后用紫外分光光度计测OD260，通过OD260和分子量计算拷贝数：
copies/mL＝(6.02×1023copies/mol)×(浓度g/mL)/(MW g/mol)；
对已知拷贝数标准品进行倍比稀释，形成6个梯度：7.0×102-7.0×107copies/mL；
(4)甲基化敏感的限制性内切酶MSRE酶切处理DNA样本，酶切体系为：
轻轻混匀后37℃孵育16h；
(5)MSRE MNAzyme qPCR扩增步骤(4)中酶切后的DNA样本，反应体系为：
(6)MSRE MNAzyme qPCR的线性范围、特异性、灵敏度及重复性实验
(6-1)线性范围：以步骤(3)制备的6个标准品进行MSRE MNAzyme qPCR，确定其线性范围；
(6-2)特异性：以阳性标本和阴性标本进行PCR扩增，用扩增曲线的状态判断特异性；
(6-3)灵敏度：用已知拷贝数的标准品，进行倍比稀释，能够扩增出曲线的最低检测限，判断灵敏度；
(6-4)重复性：选取一个已知拷贝数的标准品，如7.0×105copies/mL进行PCR扩增，分别在同一时间内扩增8次进行批内重复性测定，在不同的时间内扩增8次进行批间重复性测定；
(7)用MSRE MNAzyme qPCR法检测卵巢癌患者血清中OPCML基因启动子甲基化水平
检测临床标本血清，用甲基化敏感的限制性内切酶BstUI(Bsh1236I)酶切，酶切体系为：
轻轻混匀后37℃孵育16小时；
MNAzyme qPCR：上述酶切后DNA作为模板，反应体系为：
反应参数为：
检测多例卵巢癌患者血清的OPCML基因甲基化水平，并进行统计学分析。
其中，所述步骤(5)中探针的制备方法为：MSRE MNAzyme qPCR法除常规一对PCR引物之外，还需要两个部分酶及一条报告探针，每个部分酶由(i)靶标结合感应臂、(ii)酶催化核心和(iii)底物结合臂；MNAzyme由A、B两个partzymes组成，当模板存在的时候，A、B两个partzymes的(i)靶标结合感应臂通过碱基互补配对结合到模板上，这样A、B两个partzymes的(ii)酶催化核心便组成一个完整的酶催化核心；随后，两个(iii)底物结合臂通过碱基互补配对与报告探针结合，这里的报告探针与TaqMan探针类似，在探针的两端分别连接荧光基团和相应的淬灭基团，此时MNAzyme具有催化活性，可以将探针催化裂解，使荧光基团与淬灭基团分离，从而使荧光基团在激发光照射下发出荧光。
本发明还提供一种OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒的用途，用于MSRE结合MNAzyme qPCR检测卵巢癌患者外周血中OPCML基因启动子甲基化水平。
上述的OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒还可以用于MSRE结合MNAzymeqPCR检测卵巢内膜样癌、卵巢浆液性囊腺癌、黏液性囊腺癌、透明细胞癌患者外周血中OPCML基因启动子甲基化水平。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明的试剂盒及MSRE结合MNAzymeqPCR技术，可快速、准确地检测出卵巢癌患者外周血中OPCML基因启动子甲基化水平。
附图说明
图1为本发明中线性范围实验结果图；
图2为本发明中特异性实验结果图；
图3为本发明中灵敏度实验结果图；
图4为本发明中MNAzyme qPCR原理示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供一种OPCML基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒，包括以下物质：
(a)酶切反应液(10μL/测试)，包括双蒸水7μL，10×Buffer R 2μL，Bsh1236I 1μL；
(b)OPCML基因的引物及探针组，序列为：
其中：序列中大写字母为DNA序列，小写字母为RNA序列；
(c)PCR工作液；
；
(d)标准品1-5，浓度分别为7.0×107copies/mL、7.0×106copies/mL、7.0×105copies/mL、7.0×104copies/mL、7.0×103copies/mL。
上述的OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(A)取患者血清10μL加入到酶切反应液10μL/测试中，轻轻混匀后37℃孵育16小时，标准品与血清同步处理；
(B)取上述酶切DNA 5μL加入到PCR工作液15μL/测试中，进行PCR检测；
(C)结果判断：根据标准曲线自动计算未知标本的相应基因拷贝浓度，若发现有标本Ct值小于15，须将其剔除此次结果分析，该标本稀释后再测直至其Ct值大于15。
本发明的甲基化敏感性限制性内切酶结合MNAzyme定量PCR(MSRE MNAzyme qPCR)检测技术，较好地克服了血清循环DNA甲基化检测敏感性、特异性不高的缺点，可作为一种有效的早期上皮性卵巢癌诊断检测手段。
利用本发明的试验盒检测OPCML基因启动因子甲基化水平的过程，所用到的产品包括：
QIAGEN公司DNA抽提试剂盒及其说明书，Chemicon公司的DNA修饰试剂盒及其说明书。
本发明还提供一种OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)亚硫酸氢盐处理后测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)法检测卵巢癌组织中OPCML基因启动子的甲基化状态，具体为：
(1-1)取卵巢癌组织标本20mg，用剪刀剪碎后放入1.5ml的离心管中，按照QIAGEN公司DNA抽提试剂盒说明操作，抽提组织样本中的DNA，抽提的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度，按照Chemicon公司的DNA修饰试剂盒说明书操作，修饰提取后的DNA，然后把修饰后的DNA溶解在20μL Buffer TE中；
(1-2)引物系列为：
上游引物5'-GTTTTTTTTGTAGG-GGAAGT-3'，
下游引物5'-CAACAACTCCATCCCTAACC-3'，产物长度243bp；
对修饰后的DNA进行PCR扩增，反应体系25μl，包括：
修饰后的DNA——2μl，10×Buffer——2.5μl，2.5mmol/L dNTP——2μl，25mmol/LMgCl2——1μl，10μmol/L上游引物——0.5μl，10μmol/L下游引物——0.5μl，5U Taq酶——0.2μl，无菌蒸馏水——16.3μl；
循环条件：
(1-3)利用PCR产物胶纯化试剂盒对步骤(1-2)取得的PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物与质粒连接，转化到感受态细菌中进行蓝白斑筛选，挑取10个白色阳性克隆送公司进行测序，对测序结果与基因组序列进行比对，分析OPCML基因启动子的甲基化状态；
(2)根据步骤(1)的分析结果确定扩增位置及设计引物，引物及探针系列包括：
；
(3)选取OPCML基因启动子甲基化阳性样本，制备标准品
(3-1)在步骤(1-3)的测序确定阳性的标本中选取1个组织，按照QIAGEN公司DNA抽提试剂盒说明操作，进行DNA提取；
(3-2)将步骤(3-2)提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度；
(3-3)对步骤(3-2)提取的DNA进行PCR扩增，引物为OPCML-F和OPCML-R，反应体系为：
反应参数为：
(3-4)利用PCR产物胶纯化试剂盒，对步骤(3-3)得到的PCR产物进行纯化；
(3-5)步骤(3-4)所得纯化产物与PGEM-T Easy Vector连接，将连接后的产物转染到DH5α细胞中，方法同步骤(1-3)，然后选取白色克隆产物送入公司进行测序，确定该基因片段的序列与目标基因一致；
此处的基因片段是挑选的阳性克隆产物测序结果；目标基因是预想的扩增片段，这里只是验证一下扩增序列的正确性，因为这是标准品的制备。
(3-6)质粒提取，然后将质粒DNA用无菌蒸馏水稀释20倍，然后用紫外分光光度计测OD260，通过OD260和分子量计算拷贝数：
copies/mL＝(6.02×1023copies/mol)×(浓度g/mL)/(MW g/mol)；
对已知拷贝数标准品进行倍比稀释，形成6个梯度：7.0×102-7.0×107copies/mL；
(4)甲基化敏感的限制性内切酶MSRE酶切处理DNA样本，酶切体系为：
轻轻混匀后37℃孵育16h；
(5)MSRE MNAzyme qPCR扩增步骤(4)中酶切后的DNA样本，反应体系为：
其中，所述步骤(5)中探针的制备方法为：MSRE MNAzyme qPCR法除常规一对PCR引物之外，还需要两个部分酶及一条报告探针，每个部分酶由(i)靶标结合感应臂、(ii)酶催化核心和(iii)底物结合臂，如图4。MNAzyme由A、B两个partzymes组成，当模板存在的时候，A、B两个partzymes的(i)靶标结合感应臂通过碱基互补配对结合到模板上，这样A、B两个partzymes的(ii)酶催化核心便组成一个完整的酶催化核心；随后，两个(iii)底物结合臂通过碱基互补配对与报告探针结合，这里的报告探针与TaqMan探针类似，在探针的两端分别连接荧光基团和相应的淬灭基团，此时MNAzyme具有催化活性，可以将探针催化裂解，使荧光基团与淬灭基团分离，从而使荧光基团在激发光照射下发出荧光。MNAzyme只能催化裂解探针底物，而不会破坏模板序列。
(6)MSRE MNAzyme qPCR的线性范围、特异性、灵敏度及重复性实验
(6-1)线性范围：以步骤(3)制备的6个标准品进行MSRE MNAzyme qPCR，确定其线性范围；在DNA浓度为7.0×102-7.0×107copies/mL时，有很好的线性范围，直线相关系数为0.999，PCR扩增效率为99.239％，见图1。
(6-2)特异性：以阳性标本和阴性标本进行PCR扩增，用扩增曲线的状态判断特异性；3个不同浓度阳性标本PCR扩增后形成明显的“S”型曲线，而3个阴性标本进行扩增得出结果为阴性，说明特异性高，见图2。
(6-3)灵敏度：用已知拷贝数的标准品，进行倍比稀释，能够扩增出曲线的最低检测限，判断灵敏度；经检测，本方法检测限为7.0×102copies/mL，见图3。
(6-4)重复性：选取一个已知拷贝数的标准品，如7.0×105copies/mL进行PCR扩增，分别在同一时间内扩增8次进行批内重复性测定，批内CV值为0.30％；在不同的时间内扩增8次进行批间重复性测定，批间CV值为0.74％，见表一。
表一 批内和批间重复性测定
。
(7)用MSRE MNAzyme qPCR法检测卵巢癌患者血清中OPCML基因启动子甲基化水平
检测临床标本血清，用甲基化敏感的限制性内切酶BstUI(Bsh1236I)酶切，酶切体系为：
轻轻混匀后37℃孵育16小时；
MNAzyme qPCR：上述酶切后DNA作为模板，反应体系为：
反应参数为：
检测了50例卵巢癌患者血清的OPCML基因甲基化水平，结果显示≥55岁组OPCML甲基化浓度明显高于<55岁组，差异有统计学意义(P<0.05)，FIGO分期组甲基化浓度差异有统计学意义(P<0.05)，而不同病理分型的甲基化水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表二。
表二 卵巢癌患者OPCML甲基化水平差异比较[M(Q25-Q75)，copies/mL]
。
本发明公开的OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒，可用于MSRE结合MNAzyme qPCR检测卵巢癌患者外周血中OPCML基因启动子甲基化水平。也可以用于卵巢内膜样癌、卵巢浆液性囊腺癌、黏液性囊腺癌、透明细胞癌患者外周血中OPCML基因启动子甲基化水平，有助于早期诊断。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种OPCML基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒，其特征在于，包括以下物质：
(a)酶切反应液(10μL/测试)，包括双蒸水7μL，10×Buffer R 2μL，Bsh1236I 1μL；
(b)OPCML基因的引物及探针组，序列为：
其中：序列中大写字母为DNA序列，小写字母为RNA序列；
(c)PCR工作液
；
(d)标准品1-5，浓度分别为7.0×107copies/mL、7.0×106copies/mL、7.0×105copies/mL、7.0×104copies/mL、7.0×103copies/mL。
2.一种如权利要求1所述的OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(A)取患者血清10μL加入到酶切反应液中，轻轻混匀后37℃孵育16小时，标准品与血清同步处理；
(B)取上述酶切DNA 5μL加入到PCR工作液中，进行PCR检测；
(C)结果判断：根据标准曲线自动计算未知标本的相应基因拷贝浓度，若发现有标本Ct值小于15，须将其剔除此次结果分析，该标本稀释后再测直至其Ct值大于15。
3.一种如权利要求1所述的OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)亚硫酸氢盐处理后测序法检测卵巢癌组织中OPCML基因启动子的甲基化状态，具体为：
(1-1)取卵巢癌组织标本20-25mg，用剪刀剪碎后放入1.5mL的离心管中，利用DNA抽提试剂盒抽提组织样本中的DNA，抽提的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度，利用DNA修饰试剂盒修饰提取后的DNA，然后把修饰后的DNA溶解在20μLBuffer TE中；
(1-2)引物系列为：
上游引物5'-GTTTTTTTTGTAGG-GGAAGT-3'，
下游引物5'-CAACAACTCCATCCCTAACC-3'，产物长度243bp；
对修饰后的DNA进行PCR扩增，反应体系25μL，包括：
修饰后的DNA 2μL，10×Buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，25mmol/L MgCl2 1μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，5U Taq酶0.2μL，无菌蒸馏水16.3μL；
循环条件：
(1-3)利用PCR产物胶纯化试剂盒对步骤(1-2)取得的PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物与质粒连接，转化到感受态细菌中进行蓝白斑筛选，挑取10个白色阳性克隆进行测序，对测序结果与基因组序列进行比对，分析OPCML基因启动子的甲基化状态；
(2)根据步骤(1)的分析结果确定扩增位置及设计引物，引物及探针系列包括：
；
(3)选取OPCML基因启动子甲基化阳性样本，制备标准品
(3-1)在步骤(1-3)的测序确定阳性的标本中选取1个组织进行DNA提取；
(3-2)将步骤(3-1)提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度；
(3-3)对步骤(3-2)提取的DNA进行PCR扩增，引物为OPCML-F和OPCML-R，反应体系为：
反应参数为：
(3-4)利用PCR产物胶纯化试剂盒，对步骤(3-3)得到的PCR产物进行纯化；
(3-5)步骤(3-4)所得纯化产物与PGEM-T Easy Vector连接，将连接后的产物转染到DH5α细胞中，方法同步骤(1-3)，然后选取白色克隆产物进行测序，确定测序后的阳性克隆产物的序列与目标基因一致；
(3-6)质粒提取，然后将质粒DNA用无菌蒸馏水稀释20倍，然后用紫外分光光度计测OD260，通过OD260和分子量计算拷贝数：
copies/mL＝(6.02×1023copies/mol)×(浓度g/mL)/(MW g/mol)；
对已知拷贝数标准品进行倍比稀释，形成6个梯度：7.0×102-7.0×107copies/mL；
(4)甲基化敏感的限制性内切酶MSRE酶切处理DNA样本，酶切体系为：
轻轻混匀后37℃孵育16h；
(5)MNAzyme qPCR扩增步骤(4)中酶切后的DNA样本，反应体系为：
(6)MSRE MNAzyme qPCR的线性范围、特异性、灵敏度及重复性实验
(6-1)线性范围：以步骤(3)制备的6个标准品进行MSRE MNAzyme qPCR，确定其线性范围；
(6-2)特异性：以阳性标本和阴性标本进行PCR扩增，用扩增曲线的状态判断特异性；
(6-3)灵敏度：用已知拷贝数的标准品，进行倍比稀释，能够扩增出曲线的最低检测限，判断灵敏度；
(6-4)重复性：选取一个已知拷贝数的标准品，进行PCR扩增，分别在同一时间内扩增8次进行批内重复性测定，在不同的时间内扩增8次进行批间重复性测定；
(7)用MSRE MNAzyme qPCR法检测卵巢癌患者血清中OPCML基因启动子甲基化水平
检测临床标本血清，用甲基化敏感的限制性内切酶BstUI酶切，酶切体系为：
轻轻混匀后37℃孵育16小时；
MNAzyme qPCR：上述酶切后DNA作为模板，反应体系为：
反应参数为：
检测多例卵巢癌患者血清的OPCML基因甲基化水平，并进行统计学分析。
4.根据权利要求3所述的OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中探针的制备方法为：MSRE MNAzyme qPCR法除常规一对PCR引物之外，还需要两个部分酶及一条报告探针，每个部分酶由(i)靶标结合感应臂、(ii)酶催化核心和(iii)底物结合臂；MNAzyme由A、B两个partzymes组成，当模板存在的时候，A、B两个partzymes的(i)靶标结合感应臂通过碱基互补配对结合到模板上，这样A、B两个partzymes的(ii)酶催化核心便组成一个完整的酶催化核心；随后，两个(iii)底物结合臂通过碱基互补配对与报告探针结合，在探针的两端分别连接荧光基团和相应的淬灭基团。
5.一种如权利要求1～4中任一项所述的OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒的用途，其特征在于，用于MSRE结合MNAzyme qPCR检测卵巢癌患者外周血中OPCML基因启动子甲基化水平。
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