CN104245958A - 核酸的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明提供修饰的寡核苷酸以及其用于在核酸的检测中使用的方法。所述寡核苷酸和方法具体应用于扩增和/或检测靶核酸序列中的遗传变异的区域。

Description

核酸的检测
通过交叉引用并入
本申请要求2012年2月20日提交的澳大利亚临时专利申请号2012900624和2012年5月29日提交的澳大利亚临时专利申请号2012902218的优先权，所述专利申请的全部内容通过交叉引用并入。
技术领域
本发明总体上涉及分子生物学领域。更具体地说，本发明提供修饰的寡核苷酸及其用于检测靶核酸的方法。所述寡核苷酸和方法可具体应用于扩增和/或检测靶核酸序列中的遗传变异区域。
背景
多种遗传性和后天性疾病与遗传变异如点突变、缺失和插入相关。遗传变异如单核苷酸多态性可在预测对药物的应答和提供疾病风险和严重程度的预后指示方面提供信息。一些遗传变体与疾病的存在直接相关，而其它遗传变体与疾病风险和/或预后相关。存在由单基因中的突变引起的超过500种人遗传疾病。这些疾病包括囊性纤维化、肌营养不良症、α1-抗胰蛋白酶缺陷、苯丙酮酸尿症、镰状细胞贫血或性状、以及各种其它血红蛋白病。此外，对几种常见多基因病状(如动脉粥样硬化性心脏病)具有增加的易感性的个体已显示与特定DNA序列多态性的遗传有关联。癌症被认为由于细胞增殖或分化中所涉及的基因的遗传病变的积聚而发展。
病原体内的遗传变异性可在相关的疾病的严重程度和治疗性干预的性质中起作用。实例包括(i)与细菌如结核的抗药性菌株相关的突变；(ii)病毒如HIV中与特定核苷酸相关的治疗诱导的抗性；以及(iii)HCV中预测治疗应答的特定序列。
遗传分析在临床中对于评估疾病风险、诊断疾病、预测患者的预后或对治疗的应答以及监测患者进展变得日臻常规。所述遗传测试的引入取决于用于区别遗传变异的简单、便宜且快速的测定的研发。
体外核酸扩增的方法在遗传学和疾病诊断方面具有广泛应用。这类方法包括聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。这些靶扩增策略中的每种都需要使用寡核苷酸引物。扩增过程导致扩增子的指数式扩增，所述扩增子在其5’末端并入寡核苷酸引物并且含有位于所述引物之间的序列的新合成的拷贝。
涉及PCR的用于检测小遗传变异的常用方法包括高分辨熔解曲线分析和使用分子信标。熔解曲线和分子信标是用于检测代表大部分群体的序列的适合方法，但它们不适合于以下情况：其中必须在未突变的DNA(如针对癌症中涉及的后天性突变)、基因分型罕见的/新出现的病毒株或鉴别药物敏感细菌的背景中的抗药性细菌的大背景中检测突变。
作为实例，PCR是极其通用的并且已经研发了基本方案的许多改进。PCR中使用的引物可与靶序列完全匹配或它们可包含错配的和或修饰的碱基。在引物的5’端处的另外标签序列可有助于捕获PCR扩增子并且标记的引物的含入可有助于检测。已经进行将非靶标相关序列(非互补标签序列)引入寡核苷酸引物的5’部分中的其它方案，以便引入限制性位点用于克隆或以便标记扩增子用于使用通用引物进行第二轮扩增，所述扩增子与原始靶标不相关。虽然本领域已知给定引物的5’一半可容许不与初始靶标杂交的碱基的插入，但还完全公认引物的3’部分不太容易存在错配的碱基。
这一观察导致用于扩增受阻突变系统(ARMS)(还被称为等位基因特异性PCR(AS-PCR))的寡核苷酸引物的研发(Newton等人1989Nucleic Acids Research17：2503-2516)。ARMS引物促进小遗传变异如单核苷酸多态性(SNP)的区别。这种能力是基于以下事实：具有错配的3’残基的寡核苷酸将不如与完全匹配的序列相比的引物那样有效地起作用。Kwok等人证明这种区别是不完全的并且取决于错配中涉及的DNA碱基(Kwok，等人1990Nucleic Acids Research18：999-10005)。引物与模板之间的双错配(其中一个错配位于引物的3’端处)提供ARMS引物有效地区别等位基因的增大的能力(Kwok，等人1990Nucleic Acids Research18：999-10005)。ARMS引物必须进行良好设计，其中3’错配的强度通过第二错配的强度进行平衡。这还通过谨慎选择PCR的退火温度来平衡，所述退火温度对错配的引物退火至其靶标的效率有影响。ARMS测定的设计可能是困难的，并且其中所有引物有效地区别开的反应条件例如温度的研发是繁琐的。
通用碱基表现出置换四个正常碱基而不显著地使相邻的碱基对相互作用脱稳或破坏修饰的寡核苷酸的预期功能生物化学效用的能力。本领域熟知包含通用碱基的寡核苷酸将充当DNA测序或PCR的引物。最常用的简并修饰的碱基是脱氧肌苷，其用作“通用”碱基，因为它能够与所有四种天然核苷酸进行摆动碱基配对，但不是以相等亲和力(I-C＞I-A＞I-T～I-G＞I-I)。因此，肌苷已被广泛地用于如含糊序列的扩增的应用中的PCR中，所述应用需要在引物和探针的某些碱基位置处的简并性。
WO2006/092941描述了使用由三个不同的Tm部分组成的双特异性寡核苷酸来增强来自PCR的特异性扩增。双特异性寡核苷酸(DSO)由3个序列区组成。DSO的5’部分是靶特异性的并且具有高Tm。DSO的中间部分是由2至10个“通用”碱基组成的分离部分，所述碱基不是标准DNA碱基中的任一种(即，不是G、A、T或C)。DSO的3’部分是靶特异性的。DSO可容许寡核苷酸的5’部分和3’部分内的错配，并且因此使用DSO作为引物来有效地区别小遗传变异要求严格的引物退火条件。中间部分中的通用碱基能够与所有四种常规DNA碱基进行非特异性碱基配对。因此，这些DSO引物能够沿引物的整个长度与初始靶标结合(因为所述碱基是通用的而不是错配的)，但是可设定温度以使得通用部分在引物退火过程中可以不被结合。然而，一旦被拷贝，扩增子将含有与通用碱基的位置相对的变体序列，并且因此通用碱基的存在不会将任何特异性独特序列引入到使用DSO引物产生的扩增子中。
尽管存在已被研发用于扩增、检测和分析序列的相对大量的技术，仍非常需要用于区别遗传变异的更快速、精确和便宜的测定。还需要改进包含遗传变异性区的序列在所述变异性是不提供信息的并且使扩增变得复杂的情况下的扩增的方法。此外，需要更好的方法来增加以多重形式、特别是在检测小遗传变异(例如单核苷酸多态性——SNP)时分析多于一个靶标的能力。
发明概述
本发明通过提供能够将独特的特异性序列引入扩增子中的寡核苷酸来满足至少一个上述需求。通过本文所提供的寡核苷酸引入扩增子中的独特序列可用于在否则将仅包含小遗传变异(SNP)的扩增的靶多核苷酸中提供较大的变异性区，从而有助于更容易的区别。或者，在靶序列中的遗传变异性是不提供信息的和/或使扩增困难的情况下，本文所提供的寡核苷酸可用于使用独特序列来置换扩增子中的那些可变区，从而改进相关序列的扩增和检测功效。
本发明至少部分地涉及以下实施方案1至118：
实施方案1.一种用于确定样品中靶多核苷酸的存在或不存在的方法，所述方法包括：
提供引物寡核苷酸，所述引物寡核苷酸包含
第一引物组分，所述第一引物组分终止于所述寡核苷酸的5’端并且能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸的链的第一部分杂交，以及
第二引物组分，所述第二引物组分终止于所述寡核苷酸的3’端并且能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链的第二部分杂交；
使潜在包含所述靶多核苷酸的样品与所述引物寡核苷酸在适合于所述第一引物组分和所述第二引物组分与所述靶多核苷酸链杂交的条件下相接触，以便由此形成双链的双链体，其中所述双链体的中间区段的至少一条链包含至少四个核苷酸的序列，所述至少四个核苷酸的序列由于所述中间区段的相对链中不存在与所述至少四个核苷酸的序列共有碱基对互补性的核苷酸序列而保持与所述中间区段的所述相对链未杂交；
使所述样品与能够使用所述靶多核苷酸链作为模板的聚合酶相接触以便延伸所述双链体的所述引物寡核苷酸的长度并且由此产生包含位于第一端组分与第二端组分中间的内部组分的扩增子，其中
所述扩增子的所述第一端组分能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链的所述第一部分杂交，
所述扩增子的所述第二端组分能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链的所述第二部分杂交，以及
所述扩增子的所述第一端组分和所述第二端组分与所述靶多核苷酸链的所述杂交使所述扩增子的所述内部组分定位成与所述靶多核苷酸链中、位于所述靶多核苷酸链的所述第一部分与所述第二部分之间的中间核苷酸序列相对，所述中间核苷酸序列不与所述内部组分共有碱基对互补性；以及
检测是否产生所述扩增子，其中检测到所述扩增子指示所述样品中存在所述靶多核苷酸，并且未能检测到所述扩增子指示所述样品中不存在所述靶多核苷酸。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述检测包括检测所述扩增子的所述内部组分或与所述扩增子的所述内部组分互补的核苷酸序列。
实施方案3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中在所述通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链杂交时，所述第一引物组分的熔解温度大于所述第二引物组分的熔解温度。
实施方案4.根据实施方案1至3中任一个所述的方法，其中所述双链的双链体的所述中间区段的所述至少一条链包含保持与所述双链体的所述相对链未杂交的至少五个、至少六个、至少七个或至少8个核苷酸。
实施方案5.根据实施方案1至4中任一个所述的方法，其中所述引物寡核苷酸包含位于所述第一引物组分与所述第二引物组分之间的第三引物组分，其中所述第三引物组分由以下核苷酸序列组成：
其不与所述靶多核苷酸链中的所述中间核苷酸序列共有碱基对互补性，并且
与所述扩增子的所述内部组分中的核苷酸序列一致。
实施方案6.根据实施方案5所述的方法，其中所述第三引物组分部分或完全位于所述引物寡核苷酸的3’一半中。
实施方案7.根据实施方案5或实施方案6所述的方法，其中所述第三引物组分和中间核苷酸序列中的核苷酸的数目相等。
实施方案8.根据实施方案5或实施方案6所述的方法，其中所述第三引物组分中的核苷酸的数目超过所述中间核苷酸序列中的核苷酸的数目。
实施方案9.根据实施方案5或实施方案6所述的方法，其中所述第三引物组分中的核苷酸的数目小于所述中间核苷酸序列中的核苷酸的数目。
实施方案10.根据实施方案9所述的方法，其中所述第三引物组分中的核苷酸的数目是介于1与200个核苷酸、1与150个核苷酸、1与100个核苷酸、1与75个核苷酸、1与50个核苷酸、1与25个核苷酸、5与200个核苷酸、5与150个核苷酸、5与100个核苷酸、5与100个核苷酸、5与75个核苷酸、5与50个核苷酸、5与25个核苷酸、10与200个核苷酸、10与150个核苷酸、10与100个核苷酸、10与100个核苷酸、10与75个核苷酸、10与50个核苷酸、或10与25个核苷酸之间，小于所述靶多核苷酸中位于与所述第一引物组分和第二引物组分杂交的所述靶多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案11.根据实施方案1至10中任一个所述的方法，其中所述第一引物组分中的核苷酸的数目超过所述第二引物组分中的核苷酸的数目。
实施方案12.根据实施方案1至4中任一个所述的方法，其中所述双链的双链体的所述中间区段的所述至少一条链是所述靶多核苷酸链的组分。
实施方案13.根据实施方案12所述的方法，其中所述靶多核苷酸链的所述组分由所述中间核苷酸序列组成。
实施方案14.根据实施方案12或实施方案13所述的方法，其中所述第一引物组分和所述第二引物组分通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链的分开的不连续的组分杂交，从而使所述不连续的组分并置并且在所述靶多核苷酸链中形成包含未杂交的核苷酸的环部分。
实施方案15.根据实施方案12至14中任一个所述的方法，其中所述引物寡核苷酸的所有核苷酸通过互补碱基配对与所述靶寡核苷酸链杂交。
实施方案16.根据实施方案14或实施方案15所述的方法，其中所述靶多核苷酸的所述环部分包含介于1与200个之间的核苷酸、1与150个之间的核苷酸、1与100个之间的核苷酸、1与75个之间的核苷酸、1与50个之间的核苷酸、1与25个之间的核苷酸、5与200个之间的核苷酸、5与150个之间的核苷酸、5与100个之间的核苷酸、5与100个之间的核苷酸、5与75个之间的核苷酸、5与50个之间的核苷酸、5与25个之间的核苷酸、10与200个之间的核苷酸、10与150个之间的核苷酸、10与100个之间的核苷酸、10与100个之间的核苷酸、10与75个之间的核苷酸、10与50个之间的核苷酸、或10与25个之间的核苷酸。
实施方案17.根据实施方案1至16中任一个所述的方法，其中所述接触包括
接触第二引物寡核苷酸，所述第二引物寡核苷酸与为所述第一靶多核苷酸链的补体的第二靶多核苷酸链共有碱基对互补性，以及
使用所述第二靶多核苷酸链作为模板，使用聚合酶来延伸所述第二引物寡多核苷酸的长度并且由此产生第二扩增子。
实施方案18.根据实施方案17所述的方法，其中所述检测包括检测所述第二扩增子。
实施方案19.根据实施方案1至17中任一个所述的方法，其中所述方法包括使用以下各项中的任何一个或多个：聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
实施方案20.根据实施方案1至19中任一个所述的方法，其中
所述靶多核苷酸链包含在所述靶多核苷酸的群体的两个或更多个单独成员之间变化的多态区，
所述第一引物组分和所述第二引物组分各自能够由于以下而与所述群体的多个成员杂交：所述第一引物组件与所述靶多核苷酸链的定位在所述多态区上游的组分共有序列互补性，并且所述第二引物组件与所述靶多核苷酸链的定位在所述多态区下游的组分共有序列互补性，以及
当所述第一引物组分和所述第二引物组分与所述靶多核苷酸杂交时，所述多态区保持与所述引物寡核苷酸未杂交。
实施方案21.根据实施方案20所述的方法，其中所述多态区包含一个或多个核苷酸的缺失，以使得所述多态区的长度在所述靶多核苷酸的所述群体的所述两个或更多个单独成员之间不同。
实施方案22.根据实施方案20或实施方案21所述的方法，其中所述多态区包含一个或多个核苷酸的取代，以使得所述多态区核苷酸序列在所述靶多核苷酸的所述群体的所述两个或更多个单独成员之间不同。
实施方案23.根据实施方案1至19中任一个所述的方法，其中
所述靶多核苷酸链包含单核苷酸多态性(SNP)和/或点突变；
所述扩增子包含
(i)与所述SNP互补的核苷酸，和/或
(ii)与所述点突变互补的核苷酸；
以及
所述第一或第二引物组分能够通过互补碱基配对与以上(i)和/或(ii)杂交。
实施方案24.根据实施方案23所述的方法，其中所述第二引物组分包含与所述SNP互补的所述核苷酸，或与所述点突变互补的所述核苷酸，所述核苷酸位于
所述第二引物组分的所述3’末端处，
所述第二引物组分的所述3’末端上游一个、两个、三个、四个、五个或多于五个核苷酸处，
所述第二引物组分的所述3’末端处，其中所述第二引物组分还包含与所述靶多核苷酸非互补的核苷酸，所述核苷酸位于所述3’末端上游两个、三个、四个、五个、六个或多于六个核苷酸处，或
所述第二引物组分的所述3’末端上游一个、两个、三个、四个、五个或多于五个核苷酸处，其中所述第二引物组分还包含与所述靶多核苷酸非互补的另一核苷酸，并且所述另一核苷酸位于与所述SNP或点突变互补的所述核苷酸的3’或5’。
实施方案25.根据实施方案1至19中任一个所述的方法，其中
所述靶多核苷酸链包含在所述靶多核苷酸的群体的至少两个单独成员之间不同的多态区，
所述多态区包含一个或多个核苷酸的缺失，以使得所述多态区在所述靶多核苷酸的所述群体的所述两个或更多个单独成员之间不同，以及
所述第一引物组分或所述第二引物组分能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链中的所述多态区杂交，其中所述多态区存在于仅一个子组的群体成员的所述靶多核苷酸链中。
实施方案26.根据实施方案1至25中任一个所述的方法，其中所述检测是否产生所述扩增子包括测量由与双链DNA结合的染料和/或扩增子序列特异性探针提供的信号。
实施方案27.根据实施方案26所述的方法，其中所述与双链DNA结合的染料为SYBR绿。
实施方案28.根据实施方案26所述的方法，其中所述序列特异性探针为分子信标、小沟结合物(MGB)探针或探针。
实施方案29.根据实施方案1至25中任一个所述的方法，其中所述检测包括使用包含至少两个或更多个部分酶组分寡核苷酸的多组分核酸酶(MNA酶)，其中至少第一部分酶组分和第二部分酶组分在存在所述扩增子的情况下自组装以便形成催化活性的MNA酶，其中所述第一部分酶组分和第二部分酶组分各自包含底物臂部分、催化核心部分以及感应臂部分；
其中在自组装时，所述第一部分酶组分和所述第二部分酶组分的所述感应臂部分充当所述MNA酶的感应臂，所述第一部分酶组分和所述第二部分酶组分的所述底物臂部分充当所述MNA酶的底物臂，并且所述第一部分酶组分和所述第二部分酶组分的所述催化核心部分充当所述MNA酶的催化核心；
并且其中所述MNA酶的所述感应臂通过互补碱基配对与所述扩增子中的一些或全部杂交，以便将所述第一部分酶组分和所述第二部分酶组分维持靠近以用于缔合其对应的催化核心部分，以便形成所述MNA酶的所述催化核心，所述催化核心能够修饰至少一种底物，并且其中所述MNA酶的所述底物臂接合底物以使得所述MNA酶的所述催化核心可修饰所述底物并且由此提供可检测作用。
实施方案30.根据实施方案29所述的方法，其中所述MNA酶的第一和/或第二感应臂与包含以下各项或由以下各项组成的核苷酸序列互补或大体上互补：
所述扩增子的所述内部组分或其组分，或
与所述扩增子的所述内部组分或其组分互补的核苷酸序列。
实施方案31.根据实施方案30所述的方法，其中所述MNA酶的所述第一和/或所述第二感应臂另外与所述扩增子中包含以下各项或由以下各项组成的核苷酸序列互补：
所述扩增子的所述第一端组分和/或所述第二端组分或其组分，或
与所述扩增子的所述第一端组分和/或所述第二端组分或其组分互补的核苷酸序列。
实施方案32.根据实施方案29所述的方法，其中所述MNA酶的第一和/或第二感应臂与以下各项互补或大体上互补：
所述扩增子中不包含以下各项或不由以下各项组成的核苷酸序列：所述扩增子的所述内部组分或其组分，或
与所述扩增子中不包含以下各项或不由以下各项组成的核苷酸序列互补的核苷酸序列：所述扩增子的所述内部组分或其组分。
实施方案33.根据实施方案29至32中任一个所述的方法，其中所述MNA酶的所述第一和/或所述第二感应臂包含与以下各项互补的核苷酸：
所述靶多核苷酸链中存在的单核苷酸多态性(SNP)和/或点突变，或
与所述靶多核苷酸链中存在的所述SNP互补的核苷酸，和/或与所述点突变互补的核苷酸。
实施方案34.根据实施方案29至33中任一个所述的方法，其中
所述靶多核苷酸链包含在所述靶多核苷酸的群体的两个或更多个单独成员之间不同的多态区，以及
所述MNA酶的所述第一和/或第二感应臂另外与所述扩增子中包含以下各项或由以下各项组成的核苷酸序列互补：
所述群体的给定成员的所述多态区或其组分，或
与所述群体的给定成员的所述多态区或其组分互补的核苷酸序列。
实施方案35.根据实施方案34所述的方法，其中所述多态区包含核苷酸的一个或多个缺失、插入和/或取代，以使得所述多态区的序列在所述群体的所述单独成员之间变化。
实施方案36.根据实施方案29所述的方法，其中所述MNA酶的感应臂包含以下各项或由以下各项组成：第一感应臂组分、第二感应臂组分以及第三感应臂组分，其中
所述第一感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子杂交；
所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子杂交；以及
所述第三感应臂组分位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间并且在所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分与所述扩增子杂交时不能通过互补碱基配对与所述扩增子杂交。
实施方案37.根据实施方案36所述的方法，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目等于或超过所述扩增子中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述扩增子的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案38.根据实施方案36所述的方法，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目小于所述扩增子中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述扩增子的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案39.根据实施方案38所述的方法，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目是介于1与50个核苷酸、1与40个核苷酸、1与30个核苷酸、1与20个核苷酸、1与10个核苷酸、5与50个核苷酸、5与40个核苷酸、5与30个核苷酸、5与20个核苷酸、5与10个核苷酸、10与50个核苷酸、10与40个核苷酸、10与30个核苷酸、或10与20个核苷酸之间，小于所述扩增子中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述扩增子的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案40.根据实施方案29所述的方法，其中所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的分开的不连续的组分杂交，从而使所述不连续的组分并置并且在所述扩增子中形成包含未杂交的核苷酸的环部分。
实施方案41.根据实施方案40所述的方法，其中所述扩增子的所述环部分包含介于1与50个之间的核苷酸、1与40个之间的核苷酸、1与30个之间的核苷酸、1与20个之间的核苷酸、1与10个之间的核苷酸、1与5个之间的核苷酸、5与50个之间的核苷酸、5与40个之间的核苷酸、5与30个之间的核苷酸、5与20个之间的核苷酸、5与10个之间的核苷酸、10与50个之间的核苷酸、10与40个之间的核苷酸、10与30个之间的核苷酸、或10与20个之间的核苷酸。
实施方案42.根据实施方案40或实施方案41所述的方法，其中所述扩增子的所述环部分包含扩增子的所述内部组分。
实施方案43.根据实施方案5至11中任一个所述的方法，其中所述靶多核苷酸链包含在所述靶多核苷酸的群体的两个或更多个单独成员之间不同的多态区，以及：
所述提供包括提供多种形式的所述引物寡核苷酸，其中所述引物寡核苷酸的不同形式与以下各项共有碱基对互补性：
不同形式的所述多态区，或，
所述靶多核苷酸链的邻近或大体上邻近一种或多种形式的所述多态区的一部分；
所述与所述引物寡核苷酸相接触包括使潜在包含所述靶多核苷酸群体的一个或多个成员的样品与所述多种形式的所述引物寡核苷酸在适合于杂交的条件下相接触；以及
其中所述多种形式的所述引物寡核苷酸各自包含所述第三引物组分，所述第三引物组分位于所述第一引物组分与所述第二引物组分之间并且由不与所述靶多核苷酸链中的所述中间核苷酸序列共有碱基对互补性的核苷酸序列组成。
实施方案44.根据实施方案43所述的方法，其中所述检测包括使用包含第一感应臂组分、第二感应臂组分以及第三感应臂组分的MNA酶，其中
所述第一感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的所述内部组分、并且任选地与所述扩增子的所述第一端组分杂交；以及
所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的所述第二端组分杂交；以及
所述第三感应臂组分位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间并且在所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分与所述扩增子杂交时不能通过互补碱基配对与所述多态区或与所述多态区互补的核苷酸序列杂交。
实施方案45.根据实施方案44所述的方法，其中
多种形式的包含所述多态区的所述扩增子通过所述样品与聚合酶的所述接触来产生，其中所述扩增子的所述每种形式的所述多态区不同；以及
所述感应臂包含以下各项或由以下各项组成：第一感应臂组分、第二感应臂组分和第三感应臂组分，所述第三感应臂组分不与所述扩增子中包含所述多态区或由其组成的核苷酸序列互补，其中
所述第一感应臂组分能够在所述多态区的上游通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子杂交，
所述第二感应臂组分能够在所述多态区的下游通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子杂交，
所述第三感应臂组分位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间，并且不能通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子的所述多态区杂交。
实施方案46.根据实施方案43所述的方法，其中
多种形式的包含所述多态区的所述扩增子通过所述样品与聚合酶的所述接触来产生，其中所述形式的所述扩增子的所述多态区不同；以及
所述感应臂包含第一感应臂组分和第二感应臂组分或由其组成，其中
所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分通过互补碱基配对与任何给定形式的所述扩增子的分开的不连续的组分杂交，从而使所述不连续的组分并置并且在所述扩增子中形成包含未杂交的核苷酸的环部分，以及
所述环部分的所述未杂交的核苷酸包含所述扩增子的所述多态区。
实施方案47.根据实施方案43至46中任一个所述的方法，其中所述多态区包含核苷酸插入、缺失和/或取代中的任何一种或多种，以使得所述靶多核苷酸群体的所述两个或更多个单独成员可不同。
实施方案48.根据实施方案1至47中任一个所述的方法，其中所述引物寡核苷酸和/或靶多核苷酸和/或扩增子包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合或由其组成。
实施方案49.根据实施方案1至48中任一个所述的方法，其中所述靶多核苷酸和/或扩增子是基因组DNA、互补DNA(cDNA)或RNA。
实施方案50.根据实施方案1至29、32、36至41、43或46中任一个所述的方法，其中所述引物寡核苷酸包含与功能活性的催化性核酸互补的核苷酸序列。
实施方案51.根据实施方案50所述的方法，其中所述扩增子包含所述功能活性的催化性核酸，并且所述检测是否产生所述扩增子包括检测所述扩增子中存在的所述功能活性的催化性核酸的催化活性。
实施方案52.根据实施方案50或实施方案51所述的方法，其中所述功能活性的催化性核酸是DNA酶或核酶。
实施方案53.根据实施方案51或实施方案52所述的方法，其中所述检测所述扩增子中存在的所述功能活性的催化性核酸的催化活性包括使所述扩增子与所述功能活性的催化性核酸的底物相接触。
实施方案54.一种分离的引物或部分酶寡核苷酸，其包含
第一组分，所述第一组分终止于所述寡核苷酸的5’端并且能够通过互补碱基配对与第二多核苷酸的第一部分杂交，
第二组分，所述第二组分终止于所述寡核苷酸的3’端并且能够通过互补碱基配对与所述第二多核苷酸的第二部分杂交，以及
位于所述第一组分与第二组分之间的第三组分，所述第三组分包含在所述第一组分和第二组分与所述第二多核苷酸杂交时不与所述第二多核苷酸中的相对核苷酸序列共有碱基对互补性的至少四个核苷酸的序列；
其中所述第三组分部分或完全位于所述寡核苷酸的3’一半。
实施方案55.根据实施方案54所述的寡核苷酸，其中所述第三组分包含不与所述第二多核苷酸中的所述相对核苷酸序列共有碱基对互补性的至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个核苷酸的序列。
实施方案56.根据实施方案54或实施方案55所述的寡核苷酸，其中所述第一组分中的核苷酸的数目：
小于所述第三组分中的核苷酸的数目；或
多于所述第三组分中的核苷酸的数目。
实施方案57.根据实施方案54至56中任一个所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含DNA、互补DNA(cDNA)、RNA或其任何组合。
实施方案58.根据实施方案54至57中任一个所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是部分酶感应臂的组分。
实施方案59.根据实施方案54至58中任一个所述的寡核苷酸在根据实施方案1至53中任一个所述的方法中的用途。
实施方案60.一种分离的双链核酸双链体，其包含通过互补碱基配对与第二多核苷酸杂交的如实施方案54至58中任一个所述的寡核苷酸，其中
所述寡核苷酸的第一组分终止于所述寡核苷酸的5’端并且通过互补碱基配对与第二多核苷酸的第一部分杂交，
所述寡核苷酸的第二组分终止于所述寡核苷酸的3’端并且通过互补碱基配对与所述第二多核苷酸的第二部分杂交，以及
所述寡核苷酸的第三组分位于所述第一组分与第二组分之间并且包含不与所述第二多核苷酸中的相对核苷酸序列共有碱基对互补性的至少两个核苷酸的序列；以及
所述寡核苷酸的所述第三组分部分或完全位于所述寡核苷酸的3’一半。
实施方案61.根据实施方案60所述的双链核酸双链体，其中所述第三组分中的核苷酸的数目等于所述第二多核苷酸中位于与所述第一组分和第二组分杂交的所述第二多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案62.根据实施方案61所述的双链核酸双链体，其中所述第三组分中的核苷酸的数目超过所述第二多核苷酸中位于与所述第一组分和第二组分杂交的所述第二多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案63.根据实施方案61所述的双链核酸双链体，其中所述第三组分中的核苷酸的数目小于所述第二多核苷酸中位于与所述第一组分和第二组分杂交的所述第二多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案64.根据实施方案61所述的双链核酸双链体，其中所述第三组分中的核苷酸的数目是介于1与200个核苷酸、1与150个核苷酸、1与100个核苷酸、1与75个核苷酸、1与50个核苷酸、1与25个核苷酸、5与200个核苷酸、5与150个核苷酸、5与100个核苷酸、5与100个核苷酸、5与75个核苷酸、5与50个核苷酸、5与25个核苷酸、10与200个核苷酸、10与150个核苷酸、10与100个核苷酸、10与100个核苷酸、10与75个核苷酸、10与50个核苷酸、或10与25个核苷酸之间，小于所述第二多核苷酸中位于与所述第一组分和第二组分杂交的所述第二多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案65.根据实施方案60至64中任一个所述的双链核酸双链体，其中所述寡核苷酸和/或第二多核苷酸是基因组DNA、互补DNA(cDNA)或RNA。
实施方案66.一种包含感应臂的多组分核酸酶(MNA酶)，所述感应臂包含第一感应臂组分和第二感应臂组分或由其组成，其中
所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与组装易化子多核苷酸杂交，以便由此形成双链的双链体，其中所述双链体的中间组分的至少一条链包含保持与所述双链体的相对链未杂交的至少两个核苷酸。
实施方案67.根据实施方案66所述的MNA酶，其中所述感应臂包含以下各项或由以下各项组成：第一感应臂组分、第二感应臂组分和位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间的第三感应臂组分，其中在所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分与所述组装易化子多核苷酸的所述杂交时，所述第三感应臂组分由于不存在与所述组装易化子多核苷酸的碱基对互补性而不能与所述组装易化子多核苷酸杂交。
实施方案68.根据实施方案67所述的MNA酶，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目等于或超过所述组装易化子多核苷酸中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述组装易化子多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案69.根据实施方案67所述的MNA酶，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目小于所述组装易化子多核苷酸中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述组装易化子多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案70.根据实施方案69所述的MNA酶，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目是介于1与200个核苷酸、1与150个核苷酸、1与100个核苷酸、1与75个核苷酸、以及50个核苷酸、1与25个核苷酸、5与200个核苷酸、5与150个核苷酸、5与100个核苷酸、5与100个核苷酸、5与75个核苷酸、5与50个核苷酸、5与25个核苷酸、10与200个核苷酸、10与150个核苷酸、10与100个核苷酸、10与100个核苷酸、10与75个核苷酸、10与50个核苷酸、或10与25个核苷酸之间，小于所述组装易化子多核苷酸中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述组装易化子多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案71.根据实施方案66所述的MNA酶，其中所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述组装易化子多核苷酸的分开的不连续的组分杂交，从而使所述不连续的组分并置并且在所述组装易化子多核苷酸中形成包含未杂交的核苷酸的环部分。
实施方案72.根据实施方案71所述的MNA酶，其中所述组装易化子多核苷酸的所述环部分包含介于1与50个之间的核苷酸、1与40个之间的核苷酸、1与30个之间的核苷酸、1与20个之间的核苷酸、1与10个之间的核苷酸、1与5个之间的核苷酸、5与50个之间的核苷酸、5与40个之间的核苷酸、5与30个之间的核苷酸、5与20个之间的核苷酸、5与10个之间的核苷酸、10与50个之间的核苷酸、10与40个之间的核苷酸、10与30个之间的核苷酸、或10与20个之间的核苷酸。
实施方案73.根据66至72中任一个所述的MNA酶，其中所述组装易化子多核苷酸是用于通过所述MNA酶检测的靶多核苷酸。
实施方案74.一种核酸复合物，其包含通过互补碱基配对与所述组装易化子多核苷酸杂交的如实施方案66至73中任一个所述的MNA酶。
实施方案75.根据实施方案66至73中任一个所述的MNA酶用于检测样品中靶多核苷酸的存在或不存在的用途，其中所述多核苷酸靶标是所述组装易化子。
实施方案76.一种用于确定样品中靶多核苷酸的存在或不存在的方法，所述方法包括：
提供能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸杂交的引物寡核苷酸，
使潜在包含所述靶多核苷酸的样品与所述引物寡核苷酸在适合于所述引物寡核苷酸与所述靶多核苷酸通过互补碱基配对杂交的条件下相接触，以便由此形成双链的双链体，
使所述样品与能够使用所述靶多核苷酸作为模板的聚合酶相接触以便延伸所述双链体的所述引物寡核苷酸的长度并且由此产生扩增子，以及
使用根据实施方案66所述的MNA酶来检测是否产生所述扩增子，其中检测到所述扩增子指示所述样品中存在所述靶多核苷酸，并且未能检测到所述扩增子指示所述样品中不存在所述靶多核苷酸。
实施方案77.根据实施方案76所述的方法，其中所述第一感应臂组分包含与以下各项共有碱基对互补性的核苷酸序列：
(i)所述扩增子或其组分，或
(ii)与所述扩增子或其组分互补的核苷酸序列；
并且所述检测包括检测所述第一感应臂组分是否通过互补碱基配对与以上的(i)或(ii)杂交。
实施方案78.根据实施方案76所述的方法，其中
所述靶多核苷酸包含在所述靶多核苷酸的群体的两个或更多个单独成员之间变化的多态区，
提供一系列所述引物寡核苷酸，所述引物寡核苷酸各自能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸群体的至少一个所述靶多核苷酸杂交，其中每个所述引物寡核苷酸与仅存在于所述靶多核苷酸群体的所述成员中的一些中的特定形式的所述多态区共有碱基对互补性；以及
每个所述引物寡核苷酸包含在所述样品与聚合酶的所述接触之后并入到所述扩增子的群体中的每个中的一致的标签部分核苷酸序列，其中所述扩增子群体的每个所述成员包含仅存在于所述扩增子群体的所述成员中的一些中的多态区；
并且其中所述检测包括确定所述MNA酶的所述第一感应臂是否通过互补碱基配对与所述扩增子群体的成员的所述标签部分杂交。
实施方案79.一种用于确定样品中靶多核苷酸的存在或不存在的方法，其中所述靶多核苷酸包含在所述靶多核苷酸的群体的两个或更多个单独成员之间变化的多态区，所述方法包括：
提供能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸杂交的引物寡核苷酸，其中所述引物寡核苷酸与仅存在于所述群体的所述成员中的一些中的特定形式的所述多态区或与所述靶多核苷酸的邻近或大体上邻近所述特定形式的所述多态区的一部分共有碱基对互补性；
使潜在包含所述靶多核苷酸的样品与所述引物寡核苷酸在适合于所述引物寡核苷酸与所述靶多核苷酸通过互补碱基配对杂交的条件下相接触，以便由此形成双链的双链体，
使所述样品与能够使用所述靶多核苷酸作为模板的聚合酶相接触以便延伸所述双链体的所述引物寡核苷酸的长度并且由此产生包含所述特定形式的所述多态区的扩增子；以及
使用根据权利要求66所述的MNA酶来检测是否产生所述扩增子，其中检测到所述扩增子指示所述样品中存在所述靶多核苷酸，并且未能检测到所述扩增子指示所述样品中不存在所述靶多核苷酸。
实施方案80.根据实施方案76至79中任一个所述的方法，其包括使用以下各项中的任何一个或多个来产生所述扩增子的拷贝：聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
实施方案81.根据实施方案79或80所述的方法，其中
所述提供包括提供多种形式的所述引物寡核苷酸，其中不同形式的所述引物寡核苷酸与不同形式的所述多态区或所述靶多核苷酸的邻近或大体上邻近一种或多种形式的所述多态区的一部分共有碱基对互补性；
所述与所述引物寡核苷酸相接触包括使潜在包含所述靶多核苷酸群体的一个或多个成员的样品与所述多种形式的所述引物寡核苷酸在所述适合于杂交的条件下相接触；以及
所述检测包括使用所述MNA酶检测是否产生包含不同多态区的多种形式的所述扩增子。
实施方案82.根据实施方案79至81中任一个所述的方法，其中多种形式的所述扩增子是通过所述样品与聚合酶的所述接触产生，其中所述形式的所述扩增子的所述多态区不同；以及
所述MNA酶的所述感应臂包含以下各项或由以下各项组成：第一感应臂组分和包含与所述扩增子的不同部分互补的核苷酸序列的第二感应臂组分以及位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间的第三感应臂组分，其中
所述第一感应臂组分能够在所述多态区的上游通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子杂交，
所述第二感应臂组分能够在所述多态区的下游通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子杂交，
所述第三感应臂组分位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间，并且由于所述第三感应臂组分中不存在与任何所述形式的所述扩增子的所述多态区共有碱基对互补性的核苷酸序列而不能通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子的所述多态区杂交。
实施方案83.根据实施方案82所述的方法，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目等于或超过包含所述多态区的所述扩增子中的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案84.根据实施方案82所述的方法，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目小于包含所述多态区的所述扩增子中的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案85.根据实施方案84所述的方法，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目是介于1与50个核苷酸、1与40个核苷酸、1与30个核苷酸、1与20个核苷酸、1与10个核苷酸、5与50个核苷酸、5与40个核苷酸、5与30个核苷酸、5与20个核苷酸、5与10个核苷酸、10与50个核苷酸、10与40个核苷酸、10与30个核苷酸、或10与20个核苷酸之间，小于所述组装易化子多核苷酸中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述组装易化子多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
实施方案86.根据实施方案79或实施方案80所述的方法，其中
多种形式的包含所述多态区的所述扩增子通过所述样品与聚合酶的所述接触来产生，其中所述形式的所述扩增子的所述多态区不同；以及
所述感应臂包含以下各项或由以下各项组成：第一感应臂组分和第二感应臂组分，其中
所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分通过互补碱基配对与任何给定形式的所述扩增子的分开的不连续的组分杂交，从而使所述不连续的组分并置并且在所述扩增子中形成包含未杂交的核苷酸的环部分，以及
所述扩增子中的所述未杂交的核苷酸包含所述多态区。
实施方案87.根据实施方案86所述的方法，其中在所述靶多核苷酸中包含未杂交的核苷酸的所述环部分包含介于1与200个之间的核苷酸、1与150个之间的核苷酸、1与100个之间的核苷酸、1与75个之间的核苷酸、以及50个核苷酸、1与25个之间的核苷酸、5与200个之间的核苷酸、5与150个之间的核苷酸、5与100个之间的核苷酸、5与100个之间的核苷酸、5与75个之间的核苷酸、5与50个之间的核苷酸、5与25个之间的核苷酸、10与200个之间的核苷酸、10与150个之间的核苷酸、10与100个之间的核苷酸、10与100个之间的核苷酸、10与75个之间的核苷酸、10与50个之间的核苷酸、或10与25个之间的核苷酸之间。
实施方案88.根据实施方案81至87中任一个所述的方法，其进一步包括使用酶促反应来提供所述靶多核苷酸中的一个或多个的扩增的拷贝。
实施方案89.根据实施方案88所述的方法，其包括使用第二寡核苷酸来扩增所述新生多核苷酸中的一个或多个，所述第二寡核苷酸与所述靶多核苷酸的与所述引物寡核苷酸不同的组分大体上互补。
实施方案90.根据实施方案78至89中任一个所述的方法，其中所述多态区包含核苷酸插入、缺失和/或取代中的任何一种或多种，以使得所述靶多核苷酸群体的所述单独成员可不同。
实施方案91.根据实施方案76至90中任一个所述的方法，其中所述引物寡核苷酸和/或靶多核苷酸和/或扩增子和/或MNA酶包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合或由其组成。
实施方案92.根据实施方案76至91中任一个所述的方法，其中所述靶多核苷酸和/或扩增子是基因组DNA、互补DNA(cDNA)或RNA。
实施方案93.根据实施方案29至42或76至92中任一个所述的方法，其中所述MNA酶能够修饰包含可检测部分和淬灭剂部分的底物，其中可检测作用是由所述底物通过所述MNA酶的裂解提供，所述MNA酶使所述可检测部分和所述淬灭剂部分分开，从而指示所述样品中所述靶多核苷酸的存在。
实施方案94.根据实施方案93所述的方法，其进一步包括放大在所述底物通过所述MNA酶修饰时产生的所述可检测作用。
实施方案95.根据实施方案29至42或76至93中任一个所述的方法，其中所述靶多核苷酸来自细菌、病毒、真菌/酵母、原生生物或线虫。
实施方案96.根据实施方案29至42或76至93中任一个所述的方法，其中所述靶多核苷酸来自肠道病毒。
实施方案97.根据实施方案1至53或76至96中任一个所述的方法，其中所述方法在体外或离体进行。
实施方案98.根据实施方案5至10中任一个所述的方法，其中
所述样品包含靶多核苷酸的群体；
所述靶多核苷酸链包含在所述靶多核苷酸的所述群体的至少两个单独成员之间变化的多态区；
所述提供包括提供两种形式的所述引物寡核苷酸，其中
第一所述形式的所述引物寡核苷酸的所述第一或所述第二引物组分与所述靶多核苷酸群体的第一成员的所述靶多核苷酸链的所述多态区共有碱基对互补性，
第二所述形式的所述引物寡核苷酸的所述第一或所述第二引物组分与所述靶多核苷酸群体的第二成员的所述靶多核苷酸链的所述多态区共有碱基对互补性，
所述靶多核苷酸群体的所述第一成员和所述第二成员的所述多态区在核苷酸序列方面不同，以及
所述第一形式和所述第二形式的所述引物寡核苷酸的所述第三组分在核苷酸序列方面不同；
所述样品的所述接触包括使所述样品与所述第一形式和所述第二形式的所述引物寡核苷酸相接触；以及
所述样品与所述聚合酶的所述接触产生所述扩增子的群体，其中
所述扩增子群体的第一成员包含与所述靶多核苷酸群体的所述第一成员的所述多态区共有序列互补性的端组分，
所述扩增子群体的第二成员包含与所述靶多核苷酸群体的所述第二成员的所述多态区共有序列互补性的端组分，以及
所述扩增子群体的所述第一成员和所述第二成员的所述内部组分的所述核苷酸序列不同。
实施方案99.根据实施方案14至16中任一个所述的方法，其中
所述样品包含靶多核苷酸的群体；
所述靶多核苷酸链包含在所述靶多核苷酸的所述群体的至少两个单独成员之间变化的多态区；
所述提供包括提供两种形式的所述引物寡核苷酸，其中
第一所述形式的所述引物寡核苷酸的所述第一或所述第二引物组分与所述靶多核苷酸群体的第一成员的所述靶多核苷酸链的所述多态区共有碱基对互补性，
第二所述形式的所述引物寡核苷酸的所述第一或所述第二引物组分与所述靶多核苷酸群体的第二成员的所述靶多核苷酸链的所述多态区共有碱基对互补性，
所述靶多核苷酸群体的所述第一成员和所述第二成员的所述多态区在核苷酸序列方面不同，
通过所述第一所述形式的所述引物寡核苷酸杂交的所述靶多核苷酸链的所述不连续的组分之间的核苷酸的数目不同于通过所述第二所述形式的所述引物寡核苷酸杂交的所述靶多核苷酸链的所述不连续的组分之间的核苷酸的数目，以及
通过所述第一形式的所述引物寡核苷酸与所述靶多核苷酸链的所述杂交形成的所述环部分的所述核苷酸序列不同于通过所述第二形式的所述引物寡核苷酸与所述靶多核苷酸链的所述杂交形成的所述环部分的所述核苷酸序列；
所述样品的所述接触包括使所述样品与所述第一形式和所述第二形式的所述引物寡核苷酸相接触；以及
所述样品与所述聚合酶的所述接触产生所述扩增子的群体，其中
所述扩增子群体的第一成员包含与所述靶多核苷酸群体的所述第一成员的所述多态区共有序列互补性的端组分，
所述扩增子群体的第二成员包含与所述靶多核苷酸群体的所述第二成员的所述多态区共有序列互补性的端组分，以及
所述扩增子群体的所述第一成员和所述第二成员的所述内部组分的所述核苷酸序列不同。
实施方案100.根据实施方案98或实施方案99所述的方法，其中所述多态区包含核苷酸的一个或多个缺失、插入和/或取代，以使得所述多态区的所述序列在所述靶多核苷酸群体的所述第一和第二成员之间变化。
实施方案101.根据实施方案100所述的方法，其中所述多态区包含SNP和/或点突变。
实施方案102.根据实施方案100所述的方法，其中所述多态区在所述靶多核苷酸群体的所述第一成员与第二成员之间在长度上变化。
实施方案103.根据实施方案98至102中任一个所述的方法，其中所述检测是否产生所述扩增子包括测量由与双链DNA结合的染料和/或扩增子序列特异性探针提供的信号。
实施方案104.根据实施方案103所述的方法，其中所述与双链DNA结合的染料为SYBR绿。
实施方案105.根据实施方案98至104中任一个所述的方法，其中所述方法包括使用以下各项中的任何一个或多个：聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
实施方案106.根据实施方案103至105中任一个所述的方法，其中所述检测包括使用熔解曲线分析来监测所述扩增子群体的所述第一成员和第二成员的所述产生。
实施方案107.根据实施方案98至106中任一个所述的方法，其中所述靶多核苷酸和/或扩增子是基因组DNA、互补DNA(cDNA)或RNA。
实施方案108.根据实施方案75所述的用途，其中所述MNA酶能够修饰包含可检测部分和淬灭剂部分的底物，其中可检测作用是由所述底物通过所述MNA酶的裂解提供，所述MNA酶使所述可检测部分和所述淬灭剂部分开，从而指示所述样品中所述靶多核苷酸的存在。
实施方案109.根据实施方案75所述的用途，其进一步包括放大在所述底物通过所述MNA酶的修饰时产生的所述可检测作用。
实施方案110.根据实施方案54至58中任一个所述的分离的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所述第三组分包含以下各项或由以下各项组成：如SEQ ID NO：182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195或196中的任一项所定义的核苷酸序列或所述序列中的任一项的补体。
实施方案111.一种试剂盒，其包含根据实施方案54至58、110或110中任一个所述的寡核苷酸。
实施方案112.一种试剂盒，其包含根据实施方案60至65中任一个所述的双链核酸双链体。
实施方案113.一种试剂盒，其包含根据实施方案66至73中任一个所述的MNA酶。
实施方案114.一种试剂盒，其包含根据实施方案74所述的核酸复合物。
实施方案115.根据实施方案36所述的方法，其中所述第一感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的所述内部组分、并且任选地与所述扩增子的所述第一端组分杂交；以及
所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的所述第二端组分杂交。
实施方案116.根据实施方案115所述的方法，其中所述第一感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的所述内部组分和所述扩增子的所述第一端组分杂交；以及
所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的所述第二端组分杂交。
实施方案117.根据实施方案50所述的方法，其中所述引物寡核苷酸的所述第三组分包含与功能活性的催化性核酸互补的核苷酸序列。
本发明还至少部分地涉及以下实施方案1至33：
实施方案1.一种用于确定样品中靶多核苷酸的存在或不存在的方法，所述靶多核苷酸是以下各项的组分：
(i)Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)野生型基因；
(ii)包含编码G12V或G12S突变的核苷酸序列的Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)基因；或
(iii)肠道病毒，
所述方法包括：
提供引物寡核苷酸，所述引物寡核苷酸包含
第一引物组分，所述第一引物组分终止于所述寡核苷酸的5’端并且能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸的链的第一部分杂交，以及
第二引物组分，所述第二引物组分终止于所述寡核苷酸的3’端并且能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链的第二部分杂交；
使潜在包含所述靶多核苷酸的样品与所述引物寡核苷酸在适合于所述第一引物组分和所述第二引物组分与所述靶多核苷酸链杂交的条件下相接触，以便由此形成双链的双链体，其中所述双链体的中间区段的至少一条链包含至少四个核苷酸的序列，所述至少四个核苷酸的序列由于所述中间区段的相对链中不存在与所述至少四个核苷酸的序列共有碱基对互补性的核苷酸序列而保持与所述中间区段的所述相对链未杂交；
使所述样品与能够使用所述靶多核苷酸链作为模板的聚合酶相接触以便延伸所述双链体的所述引物寡核苷酸的长度并且由此产生包含位于第一端组分与第二端组分中间的内部组分的扩增子，其中
所述扩增子的所述第一端组分能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链的所述第一部分杂交，
所述扩增子的所述第二端组分能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链的所述第二部分杂交，以及
所述扩增子的所述第一端组分和所述第二端组分与所述靶多核苷酸链的所述杂交使所述扩增子的所述内部组分定位成与所述靶多核苷酸链中、位于所述靶多核苷酸链的所述第一部分与所述第二部分之间的中间核苷酸序列相对，所述中间核苷酸序列不与所述内部组分共有碱基对互补性；以及
检测是否产生所述扩增子，其中检测到所述扩增子指示所述样品中存在所述靶多核苷酸，并且未能检测到所述扩增子指示所述样品中不存在所述靶多核苷酸。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中
所述靶多核苷酸是包含编码G12V突变的核苷酸序列的Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)基因的组分，
所述引物寡核苷酸包含位于所述第一引物组分与第二引物组分之间的第三引物组分，其中
所述第三引物组分由以下核苷酸序列组成：其不与所述靶多核苷酸链中的所述中间核苷酸序列共有碱基对互补性并且与所述扩增子的所述内部组分中的核苷酸序列一致，以及
所述引物寡核苷酸包含以下各项或由以下各项组成：如SEQ IDNO：35、36、37、38、39、40、41、42、50、59、60、61、62、172、173、174、175、176、292、297、293、298、294、299、295、300、296、301、66、87、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或99中的任一个中所定义的序列。
实施方案3.根据实施方案2所述的方法，其包括
使所述样品与第二引物寡核苷酸相接触，所述第二引物寡核苷酸与为所述第一靶多核苷酸链的补体的第二靶多核苷酸链共有碱基对互补性，其中所述接触是在适合于所述第二引物寡核苷酸与所述第二靶多核苷酸链通过互补碱基配对杂交的条件下，以及
使用所述第二靶多核苷酸链作为模板，使用聚合酶来延伸所述第二引物寡多核苷酸的长度并且由此产生第二扩增子，其中
(i)所述引物寡核苷酸包含以下各项或由以下各项组成：如SEQID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、50、59、60、61、62、172、173、174、175、176、292、297、293、298、294、299、295、300、296或301中的任一个中所定义的序列，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：26中所定义的序列或由其组成；
(ii)所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：66或87中所定义的序列或由其组成，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：65中所定义的序列或由其组成；
(iii)所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：70至79或99中的任一个中所定义的序列或由其组成，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：69中所定义的序列或由其组成；或
(iv)所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：87中所定义的序列或由其组成，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：26或171中所定义的序列或由其组成。
实施方案4.根据实施方案1所述的方法，其中
所述靶多核苷酸是包含编码G12V突变的核苷酸序列的Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)基因的组分，
所述第一引物组分和第二引物组分通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链的分开的不连续的组分杂交，从而使所述不连续的组分并置并且形成在所述靶多核苷酸链中包含未杂交的核苷酸的环部分；以及
所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：177、178或171中的任一个中所定义的序列或由其组成。
实施方案5.根据实施方案4所述的方法，其包括
使所述样品与第二引物寡核苷酸相接触，所述第二引物寡核苷酸与为所述第一靶多核苷酸链的补体的第二靶多核苷酸链共有碱基对互补性，其中所述接触是在适合于所述第二引物寡核苷酸与所述第二靶多核苷酸链通过互补碱基配对杂交的条件下，以及
使用所述第二靶多核苷酸链作为模板，使用聚合酶来延伸所述第二引物寡多核苷酸的长度并且由此产生第二扩增子，其中：
(i)所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：177或178中所定义的序列或由其组成，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：26中所定义的序列或由其组成；或
(ii)所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：171中所定义的序列或由其组成，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：87中所定义的序列或由其组成。
实施方案6.根据实施方案3或实施方案5所述的方法，其中所述检测是否产生所述扩增子包括使用第一部分酶和第二部分酶，其中
(i)所述第一部分酶包含如SEQ ID NO：22、24、23、47、53、54、64、164、165、287、288、289、290或291中的任一个中所定义的序列，并且所述第二部分酶包含如SEQ ID NO：18中所定义的序列；
(ii)所述第一部分酶包含如SEQ ID NO：64、24、67、68或88中的任一个中所定义的序列，并且所述第二部分酶包含如SEQ IDNO：63中所定义的序列；或
(iii)所述第一部分酶包含如SEQ ID NO：24中所定义的序列，并且所述第二部分酶包含如SEQ ID NO：18中所定义的序列。
实施方案7.根据实施方案1所述的方法，其中：
所述靶多核苷酸是包含编码G12S突变的核苷酸序列的Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)基因的组分，
所述引物寡核苷酸包含位于所述第一引物组分与第二引物组分之间的第三引物组分，其中
所述第三引物组分由以下核苷酸序列组成：其不与所述靶多核苷酸链中的所述中间核苷酸序列共有碱基对互补性并且与所述扩增子的所述内部组分中的核苷酸序列一致，以及
所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：166至169中的任一个中所定义的序列或由其组成。
实施方案8.根据实施方案7所述的方法，其包括
使所述样品与第二引物寡核苷酸相接触，所述第二引物寡核苷酸与为所述第一靶多核苷酸链的补体的第二靶多核苷酸链共有碱基对互补性，其中所述接触是在适合于所述第二引物寡核苷酸与所述第二靶多核苷酸链通过互补碱基配对杂交的条件下，以及
使用所述第二靶多核苷酸链作为模板，使用聚合酶来延伸所述第二引物寡多核苷酸的长度并且由此产生第二扩增子，其中
(i)所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：166至169中的任一个中所定义的序列或由其组成，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQID NO：26中所定义的序列或由其组成；或
(ii)所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：166中所定义的序列或由其组成，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：171中所定义的序列或由其组成。
实施方案9.根据实施方案1所述的方法，其中：
所述靶多核苷酸是包含编码G12S突变的核苷酸序列的Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)基因的组分，
所述第一引物组分和第二引物组分通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链的分开的不连续的组分杂交，从而使所述不连续的组分并置并且形成在所述靶多核苷酸链中包含未杂交的核苷酸的环部分；以及
所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：170或171中所定义的序列或由其组成。
实施方案10.根据实施方案9所述的方法，其包括
使所述样品与第二引物寡核苷酸相接触，所述第二引物寡核苷酸与为所述第一靶多核苷酸链的补体的第二靶多核苷酸链共有碱基对互补性，其中所述接触是在适合于所述第二引物寡核苷酸与所述第二靶多核苷酸链通过互补碱基配对杂交的条件下，以及
使用所述第二靶多核苷酸链作为模板，使用聚合酶来延伸所述第二引物寡多核苷酸的长度并且由此产生第二扩增子，其中
(i)所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：170中所定义的序列或由其组成，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：26或171中所定义的序列或由其组成；或
(ii)所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：171中所定义的序列或由其组成，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：166或170中所定义的序列或由其组成。
实施方案11.根据实施方案8或实施方案10所述的方法，其中所述检测是否产生所述扩增子包括使用第一部分酶和第二部分酶，其中所述第一部分酶包含如SEQ ID NO：161或162中所定义的序列，并且所述第二部分酶包含如SEQ ID NO：18中所定义的序列。
实施方案12.根据实施方案1所述的方法，其中
所述靶多核苷酸是肠道病毒基因的组分，
所述引物寡核苷酸包含位于所述第一引物组分与第二引物组分之间的第三引物组分，其中
所述第三引物组分由以下核苷酸序列组成：其不与所述靶多核苷酸链中的所述中间核苷酸序列共有碱基对互补性并且与所述扩增子的所述内部组分中的核苷酸序列一致，以及
所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：317中所定义的序列或由其组成。
实施方案13.根据实施方案12所述的方法，其包括
使所述样品与第二引物寡核苷酸相接触，所述第二引物寡核苷酸与为所述第一靶多核苷酸链的补体的第二靶多核苷酸链共有碱基对互补性，其中所述接触是在适合于所述第二引物寡核苷酸与所述第二靶多核苷酸链通过互补碱基配对杂交的条件下，以及
使用所述第二靶多核苷酸链作为模板，使用聚合酶来延伸所述第二引物寡多核苷酸的长度并且由此产生第二扩增子，其中所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：317中所定义的序列或由其组成，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：318中所定义的序列或由其组成。
实施方案14.根据实施方案13所述的方法，其中所述检测是否产生所述扩增子包括使用第一部分酶和第二部分酶，其中所述第一部分酶包含如SEQ ID NO：314中所定义的序列，并且所述第二部分酶包含如SEQ ID NO：315中所定义的序列。
实施方案15.一种用于确定样品中靶多核苷酸的存在或不存在的方法，所述靶多核苷酸为表皮生长因子受体(EGFR)基因的组分并且所述靶多核苷酸包含在所述靶多核苷酸的群体的两个或更多个单独成员之间变化的多态区，所述方法包括：
提供能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸杂交的引物寡核苷酸，其中所述引物寡核苷酸与仅存在于所述群体的所述成员中的一些中的特定形式的所述多态区或与所述靶多核苷酸的邻近或大体上邻近所述特定形式的所述多态区的一部分共有碱基对互补性；
使潜在包含所述靶多核苷酸的样品与所述引物寡核苷酸在适合于所述引物寡核苷酸与所述靶多核苷酸通过互补碱基配对杂交的条件下相接触，以便由此形成双链的双链体，
使所述样品与能够使用所述靶多核苷酸作为模板的聚合酶相接触以便延伸所述双链体的所述引物寡核苷酸的长度并且由此产生包含所述特定形式的所述多态区的扩增子；以及
使用多组分核酸酶(MNA酶)来检测是否产生所述扩增子，其中
所述MNA酶的感应臂包含以下各项或由以下各项组成：第一感应臂组分和包含与所述扩增子的不同部分互补的核苷酸序列的第二感应臂组分，以及位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间的第三感应臂组分，其中
所述第一感应臂组分能够在所述多态区的上游通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子杂交，
所述第二感应臂组分能够在所述多态区的下游通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子杂交，
所述第三感应臂组分位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间，并且由于所述第三感应臂组分中不存在与任何所述形式的所述扩增子的所述多态区共有碱基对互补性的核苷酸序列而不能通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子的所述多态区杂交。
实施方案16.根据实施方案15所述的方法，其中所述感应臂的所述第一感应臂组分包含以下各项或由以下各项组成：如SEQ IDNO：120、127、128或129中的任一个中所定义的序列。
实施方案17.根据实施方案16所述的方法，其中所述MNA酶包含能够通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子杂交的第二感应臂，以及
(i)所述感应臂包含如SEQ ID NO：120中所定义的序列或由其组成，并且所述第二感应臂包含如SEQ ID NO：119中所定义的序列或由其组成；或
(ii)所述感应臂包含如SEQ ID NO：127、128或129中的任一个中所定义的序列或由其组成，并且所述第二感应臂包含如SEQ IDNO：119中所定义的序列或由其组成。
实施方案18.根据实施方案17所述的方法，其中
所述感应臂包含如SEQ ID NO：128或129中所定义的序列或由其组成，并且所述第二感应臂包含如SEQ ID NO：119中所定义的序列或由其组成，以及
所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：131中所定义的序列或由其组成。
实施方案19.根据实施方案18所述的方法，其包括
使所述样品与第二引物寡核苷酸相接触，所述第二引物寡核苷酸与为所述第一靶多核苷酸链的补体的第二靶多核苷酸链共有碱基对互补性，其中所述接触是在适合于所述第二引物寡核苷酸与所述第二靶多核苷酸链通过互补碱基配对杂交的条件下，以及
使用所述第二靶多核苷酸链作为模板，使用聚合酶来延伸所述第二引物寡多核苷酸的长度并且由此产生第二扩增子，其中所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：131中所定义的序列或由其组成，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：122中所定义的序列或由其组成。
实施方案20.根据实施方案17所述的方法，其包括
使所述样品与第二引物寡核苷酸相接触，所述第二引物寡核苷酸与为所述第一靶多核苷酸链的补体的第二靶多核苷酸链共有碱基对互补性，其中所述接触是在适合于所述第二引物寡核苷酸与所述第二靶多核苷酸链通过互补碱基配对杂交的条件下，以及
使用所述第二靶多核苷酸链作为模板，使用聚合酶来延伸所述第二引物寡多核苷酸的长度并且由此产生第二扩增子，其中所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：122中所定义的序列或由其组成，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：123至126或130中的任一个中所定义的序列或由其组成。
实施方案21.一种分离的引物或部分酶寡核苷酸，其包含
第一组分，所述第一组分终止于所述寡核苷酸的5’端并且能够通过互补碱基配对与第二多核苷酸的第一部分杂交，
第二组分，所述第二组分终止于所述寡核苷酸的3’端并且能够通过互补碱基配对与所述第二多核苷酸的第二部分杂交，以及
位于所述第一组分与第二组分之间的第三组分，所述第三组分包含在所述第一组分和第二组分与所述第二多核苷酸杂交时不与所述第二多核苷酸中的相对核苷酸序列共有碱基对互补性的至少四个核苷酸的序列；
其中
所述第三组分部分或完全位于所述寡核苷酸的3’一半，以及
所述寡核苷酸包含以下各项或由以下各项组成：如SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、50、59、60、61、62、172、173、174、175、176、292、297、293、298、294、299、295、300、296、301、66、87、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、99、166至171、317、120、127、128、129或131中的任一个中所定义的序列。
实施方案22.根据实施方案21所述的引物寡核苷酸，其中所述引物寡核苷酸包含以下各项或由以下各项组成：如SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、50、59、60、61、62、172、173、174、175、176、292、297、293、298、294、299、295、300、296、301、66、87、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、99、166至171、317或131中的任一个中所定义的序列。
实施方案23.根据实施方案21所述的部分酶寡核苷酸，其中所述部分酶寡核苷酸包含以下各项或由以下各项组成：如SEQ ID NO：120、127、128或129中的任一个中所定义的序列。
实施方案24.一种分离的引物寡核苷酸，其包含以下各项或由以下各项组成：如SEQ ID NO：177、178、170或171中的任一个中所定义的序列。
实施方案25.一种试剂盒，其包含一种多种根据实施方案21至24中任一个所述的分离的寡核苷酸。
实施方案26.根据实施方案25所述的试剂盒，其包含
(i)第一引物寡核苷酸，其包含以下各项或由以下各项组成：如SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、50、59、60、61、62、172、173、174、175、176、292、297、293、298、294、299、295、300、296或301中的任一个中所定义的序列，以及第二引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：26中所定义的序列或由其组成；
(ii)第一引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：66或87中的任一个中所定义的序列或由其组成，以及第二引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：65中所定义的序列或由其组成；
(iii)第一引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：70至79或99中的任一个中所定义的序列或由其组成，以及第二引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：69中所定义的序列或由其组成；
(iv)第一引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：87中所定义的序列或由其组成，以及第二引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：26或171中所定义的序列或由其组成；
(v)第一引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：177或178中所定义的序列或由其组成，以及第二引物寡核苷酸，其包含如SEQ IDNO：26中所定义的序列或由其组成；
(vi)第一引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO；171中所定义的序列或由其组成，以及第二引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：87中所定义的序列或由其组成；
(vii)第一引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：166至169中的任一个中所定义的序列或由其组成，以及第二引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：26中所定义的序列或由其组成；
(viii)第一引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：166中所定义的序列或由其组成，以及第二引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：171中所定义的序列或由其组成；
(ix)第一引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：170中所定义的序列或由其组成，以及第二引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：26或171中所定义的序列或由其组成；
(x)第一引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：171中所定义的序列或由其组成，以及第二引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：166或170中所定义的序列或由其组成；
(xi)第一引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：317中所定义的序列或由其组成，以及第二引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：318中所定义的序列或由其组成；
(xii)第一部分酶寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：120、127、128或129中的任一个中所定义的序列，以及第二感应臂部分酶寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：119中所定义的序列；或
(xiii)第一引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：131中所定义的序列或由其组成，以及第二引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：122中所定义的序列或由其组成。
实施方案27.根据实施方案26所述的试剂盒，其进一步包含：
(i)第一部分酶，其包含如SEQ ID NO：22、24、23、47、53、54、64、164、165、287、288、289、290或291中的任一个中所定义的序列，以及第二部分酶，其包含如SEQ ID NO：18中所定义的序列；
(ii)第一部分酶，其包含如SEQ ID NO：64、24、67、68或88中的任一个中所定义的序列，以及第二部分酶，其包含如SEQ ID NO：63中所定义的序列；
(iii)第一部分酶，其包含如SEQ ID NO：24中所定义的序列，以及第二部分酶，其包含如SEQ ID NO：18中所定义的序列；
(iv)第一部分酶，其包含如SEQ ID NO：161或162中所定义的序列，以及第二部分酶，其包含如SEQ ID NO：18中所定义的序列；
(v)第一部分酶，其包含如SEQ ID NO：314中所定义的序列，以及第二部分酶，其包含如SEQ ID NO：315中所定义的序列；
(vi)引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：122中所定义的序列或由其组成，以及第二引物寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO：123至126或130中的任一个中所定义的序列或由其组成；或
(vii)第一部分酶，其包含如SEQ ID NO：128或129中所定义的序列，以及第二部分酶，其包含如SEQ ID NO：119中所定义的序列。
实施方案28.一种MNA酶，其包含根据实施方案23所述的部分酶寡核苷酸。
实施方案29.根据实施方案1所述的方法，其中
所述靶多核苷酸是Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)野生型基因的组分，
所述引物寡核苷酸包含位于所述第一引物组分与第二引物组分之间的第三引物组分，其中
所述第三引物组分由以下核苷酸序列组成：其不与所述靶多核苷酸链中的所述中间核苷酸序列共有碱基对互补性并且与所述扩增子的所述内部组分中的核苷酸序列一致，以及
所述引物寡核苷酸包含以下各项或由以下各项组成：如SEQ IDNO：27、28、29、30、31、32、49、33、34、55、56、57、58、83、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285或286中的任一个中所定义的序列。
实施方案30.根据实施方案29所述的方法，其包括
使所述样品与第二引物寡核苷酸相接触，所述第二引物寡核苷酸与为所述第一靶多核苷酸链的补体的第二靶多核苷酸链共有碱基对互补性，其中所述接触是在适合于所述第二引物寡核苷酸与所述第二靶多核苷酸链通过互补碱基配对杂交的条件下，以及
使用所述第二靶多核苷酸链作为模板，使用聚合酶来延伸所述第二引物寡多核苷酸的长度并且由此产生第二扩增子，其中
(i)所述引物寡核苷酸包含以下各项或由以下各项组成：如SEQID NO：27、28、29、30、31、32、49、33、34、55、56、57或58中的任一个中所定义的序列，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQID NO：26中所定义的序列或由其组成；
(ii)所述引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：83中所定义的序列或由其组成，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：69中所定义的序列或由其组成；或
(iii)所述引物寡核苷酸包含以下各项或由以下各项组成：如SEQID NO：257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285或286中的任一个中所定义的序列，并且所述第二引物寡核苷酸包含如SEQ ID NO：65中所定义的序列或由其组成。
实施方案31.根据实施方案30所述的方法，其中所述检测是否产生所述扩增子包括使用第一部分酶和第二部分酶，其中：
(i)所述第一部分酶包含如SEQ ID NO：19至21、51或52中的任一个中所定义的序列，并且所述第二部分酶包含如SEQ ID NO：18中所定义的序列；
(ii)所述第一部分酶包含如SEQ ID NO：80中所定义的序列，并且所述第二部分酶包含如SEQ ID NO：63中所定义的序列；
(iii)所述第一部分酶包含如SEQ ID NO：242至256中的任一个中所定义的序列，并且所述第二部分酶包含如SEQ ID NO：241中所定义的序列；
实施方案32.一种分离的引物寡核苷酸，其包含以下各项或由以下各项组成：如SEQ ID NO：27、28、29、30、31、32、49、33、34、55、56、57、58、83、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285或286中的任一个中所定义的序列。
实施方案33.一种试剂盒，其包含一种或多种根据实施方案32所述的分离的寡核苷酸。
本发明还至少部分地涉及以下实施方案1至40：
实施方案1.一种用于检测靶多核苷酸的方法，所述方法包括：
提供第一寡核苷酸，其包含与所述靶多核苷酸大体上互补的第一组分和与所述靶多核苷酸大体上非互补的第二组分；
使所述靶多核苷酸与所述第一寡核苷酸在适合于所述第一寡核苷酸与所述靶多核苷酸杂交的条件下相接触，并且使用酶促反应来扩增所述靶多核苷酸以便产生所述靶多核苷酸的扩增的拷贝，所述扩增的拷贝包含所述第一寡核苷酸的所述第二组分；以及
检测所述靶多核苷酸的所述扩增的拷贝。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的所述第二组分位于所述第一寡核苷酸的与所述靶多核苷酸大体上互补的第一组分与第三组分之间。
实施方案3.根据实施方案2所述的方法，其中所述第一组分和第三组分中的核苷酸的数目小于所述第二组分中的核苷酸的数目。
实施方案4.根据实施方案2所述的方法，其中所述第一组分和第三组分中的核苷酸的数目等于所述第二组分中的核苷酸的数目。
实施方案5.根据实施方案2所述的方法，其中所述第一组分和第三组分中的核苷酸的数目多于所述第二组分中的核苷酸的数目。
实施方案6.根据实施方案1至3中任一个所述的方法，其中所述第二组分在所述第一寡核苷酸与所述多核苷酸靶标结合时形成环。
实施方案7.根据实施方案1至6中任一个所述的方法，其中所述检测包括检测所述扩增的拷贝中的所述寡核苷酸的所述第二部分。
实施方案8.根据实施方案1至6中任一个所述的方法，其中所述检测包括检测所述扩增的拷贝中与所述第一寡核苷酸的所述第二部分互补的核苷酸序列。
实施方案9.根据实施方案1至8中任一个所述的方法，其中扩增所述靶多核苷酸包括使用第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸与所述靶多核苷酸的与所述第一寡核苷酸不同的组分大体上互补。
实施方案10.根据实施方案1至9中任一个所述的方法，其中所述酶促反应是以下各项中的任何一个或多个：聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
实施方案11.根据实施方案1至10中任一个所述的方法，其中所述酶促反应是聚合酶链反应(PCR)。
实施方案12.根据实施方案1至11中任一个所述的方法，其中所述检测包括使用包含至少两个或更多个部分酶组分的MNA酶，其中至少第一部分酶组分和第二部分酶组分在存在所述靶多核苷酸的所述扩增的拷贝的情况下自组装以便形成催化活性的多组分核酸酶(MNA酶)，其中所述第一部分酶组分和第二部分酶组分各自包含底物臂部分、催化核心部分以及感应臂部分：
其中在自组装时，所述第一部分酶组分和第二部分酶组分的所述感应臂部分充当所述MNA酶的感应臂，所述第一部分酶组分和第二部分酶组分的所述底物臂部分充当所述MNA酶的底物臂，并且所述第一部分酶组分和第二部分酶组分的所述催化核心部分充当所述MNA酶的催化核心；
并且其中所述MNA酶的所述感应臂与所述靶多核苷酸的所述扩增的拷贝相互作用，以便将所述第一部分酶组分和第二部分酶组分维持靠近以用于缔合其对应催化核心部分，以便形成所述MNA酶的所述催化核心，所述催化核心能够修饰至少一种底物，并且其中所述MNA酶的所述底物臂接合底物以使得所述MNA酶的所述催化核心可修饰所述底物并且由此提供可检测作用。
实施方案13.根据实施方案12所述的方法，其中所述MNA酶的第一感应臂与所述扩增的拷贝中的核苷酸序列大体上互补，所述核苷酸序列包含：
(i)所述第一寡核苷酸的所述第二部分或其组分；以及
(ii)所述靶多核苷酸的一部分。
实施方案14.根据实施方案12所述的方法，其中所述MNA酶的第一感应臂与所述扩增的拷贝中的核苷酸序列大体上互补，所述核苷酸序列包含：
(i)与所述第一寡核苷酸的所述第二部分或其组分互补的核苷酸序列；以及
(ii)所述靶多核苷酸的一部分。
实施方案15.根据实施方案1至14中任一个所述的方法，其中所述靶多核苷酸包含单核苷酸多态性(SNP)或点突变。
实施方案16.根据实施方案15所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含位于所述第二组分的3’端的与所述SNP或点突变互补的核苷酸。
实施方案17.根据实施方案15或实施方案16所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含位于所述第二组分的3’端的核苷酸，并且所述核苷酸不与所述多核苷酸靶标互补。
实施方案18.根据实施方案2至17中任一个所述的方法，其中
所述多核苷酸靶标包含在包含所述多核苷酸靶标的给定种类的个体之间变化的多态核苷酸序列；
所述第一寡核苷酸的所述第一组分在所述多态核苷酸序列5’端与所述多核苷酸靶标结合；
所述第一寡核苷酸的所述第三组分在所述多态核苷酸序列的3’端与所述多核苷酸靶标结合；以及
所述第一寡核苷酸的所述第二组分与所述多态核苷酸序列非互补。
实施方案19.如实施方案12至18中任一个所述的方法，其中所述底物包含可检测部分和淬灭剂部分，其中所述可检测作用由所述底物通过所述MNA酶的裂解提供，所述裂解使所述可检测部分和淬灭剂部分开。
实施方案20.根据实施方案12至19中任一个所述的方法，其进一步包括级联放大所述底物通过所述MNA酶修饰时产生的所述可检测作用。
实施方案21.根据实施方案1至20中任一个所述的方法，其进一步包括检测在序列上与所述第一靶多核苷酸不同的第二靶多核苷酸。
实施方案22.如实施方案21所述的方法，其包括：
提供另外寡核苷酸，其包含与所述第二靶多核苷酸大体上互补的第一组分和与所述第二靶寡核苷酸大体上非互补的第二组分；
使所述第二靶多肽与所述另外寡核苷酸在适合于所述另外寡核苷酸与所述第二靶多核苷酸杂交的条件下相接触，并且使用第二酶促反应来扩增所述第二靶多核苷酸以便产生所述第二靶多核苷酸的扩增的拷贝，所述扩增的拷贝包含所述另外寡核苷酸的所述第二组分；以及
检测所述第二靶多核苷酸的所述扩增的拷贝。
实施方案23.根据实施方案22所述的方法，其中所述另外寡核苷酸的所述第二组分位于所述第一寡核苷酸的与所述靶多核苷酸大体上互补的第一组分与第三组分之间。
实施方案24.根据实施方案23所述的方法，其中所述另外寡核苷酸的所述第一组分和第三组分中的核苷酸的数目：
(i)小于所述第二组分中的核苷酸的数目；
(ii)等于所述第二组分中的核苷酸的数目；或
(iii)多于所述第二组分中的核苷酸的数目。
实施方案25.根据实施方案22至24中任一个所述的方法，其中所述另外寡核苷酸的所述第二组分在所述另外寡核苷酸与所述第二多核苷酸靶标结合时形成环。
实施方案26.根据实施方案22至25中任一个所述的方法，其中所述第二酶促反应是以下各项中的任何一个或多个：聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
实施方案27.根据实施方案21至26中任一个所述的方法，其中所述第一多核苷酸靶标和第二多核苷酸靶标的所述检测同时进行。
实施方案28.根据实施方案21至26中任一个所述的方法，其中所述第一多核苷酸靶标和第二多核苷酸靶标的所述检测顺序地进行。
实施方案29.根据实施方案1至28中任一个所述的方法，其中所述方法在体外或离体进行。
实施方案30.根据实施方案1至29中任一个所述的方法，其中所述第一或第二靶多核苷酸是DNA、RNA或cDNA。
实施方案31.一种寡核苷酸，其包含三个组分，其中：
所述寡核苷酸的第一和第三组分与靶多核苷酸的不同组分大体上互补；以及
位于所述第一组分与所述第三组分之间的所述寡核苷酸的第二组分与所述靶多肽非互补。
实施方案32.根据实施方案31所述的寡核苷酸，其中所述第二组分在长度上多于3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。
实施方案33.根据实施方案31或实施方案32所述的寡核苷酸，其中所述第一组分在长度上多于3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。
实施方案34.根据实施方案31至33中任一个所述的寡核苷酸，其中所述第三组分在长度上多于3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。
实施方案35.根据实施方案31至33中任一个所述的寡核苷酸，其中所述第一组分和第三组分中的核苷酸的数目小于所述第二组分中的核苷酸的数目。
实施方案36.根据实施方案31至33中任一个所述的寡核苷酸，其中所述第一组分和第三组分中的核苷酸的数目等于所述第二组分中的核苷酸的数目。
实施方案37.根据实施方案31至33中任一个所述的寡核苷酸，其中所述第一组分和第三组分中的核苷酸的数目多于所述第二组分中的核苷酸的数目。
实施方案38.根据实施方案31至35中任一个所述的寡核苷酸，其中所述第二组分在所述寡核苷酸与所述多核苷酸靶标结合时形成环。
实施方案39.如实施方案31至38中任一个所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是DNA、RNA或cDNA。
实施方案40.根据实施方案31至39中任一个所述的寡核苷酸在根据实施方案1至30中任一个所述的方法中的用途。
附图简述
现在将参照如以下所阐述的附图1至16仅举例来描述本发明的优选实施方案。
图1：多核苷酸辅助的序列转换(PASS)引物与MNA酶读出：示出示例性PASS PCR策略，所述策略涉及包含不与目标靶序列互补的独特序列的一部分的PASS引物。独特序列(US)位于PASS引物中的两个序列(S1与S2)之间，所述两个序列均在很大程度上与靶标互补。S1是PASS引物的与靶标互补的区并且在US的5’端。S2是PASS引物的在很大程度上与靶标互补的区并且在US的3’端。PASS引物可被设计成当与靶序列结合时产生不同构象。例如，当S1和S2的结合位点之间的靶序列中的碱基数目(靶空位)小于US中的碱基数目时，那么US将在PASS引物与靶标结合时“环”出(图片(i))。当S1和S2的结合位点之间的的靶标中的碱基数目与US中的碱基数目相同时，那么US不会环出，而是形成“平面的”非互补区(图片(ii))。在另一个实施方案中，S1和S2的结合位点之间的靶序列中的碱基数目可多于US中的碱基数目，在这种情形下所述靶序列将在PASS引物与所述靶序列结合时“环”出。通过连续多轮的PCR，US并入到PCR扩增子的一条链中，并且US的补体(cUS)并入到PCR扩增子的相对链中。通过PASS引物产生的具有US的环(图片(i))或平面(图片(ii))区的扩增子可通过许多策略来检测。例如，所述图示出使用MNA酶检测(图片(iii))。
当PASS引物与MNA酶qPCR组合时，MNA酶可包含如所示与独特序列的补体(cUS)或可替代地独特序列结合的部分酶，而另一部分酶在扩增的目标靶序列上相邻地结合。由部分酶组分形成活性MNA酶可导致用荧光团和淬灭剂标记的通用探针的裂解，从而产生可实时监测的信号。
图2：被设计成区别单核苷酸多态性(SNP)和/或后天性点突变的PASS引物：PASS引物可被设计成增强单碱基变化如SNP或点突变的区别。在一个实施方案中，成环的PASS引物(图片(i))或平面的PASS引物(图片(ii))的S2可用于靶向和特异性地结合SNP或点突变。
PASS引物的S2中的与SNP或点突变匹配的碱基可位于所述引物的3’末端处，或可设置在S2内的其它位置处(图片(i)和图片(ii)的上图)。此外，另外碱基可在S2与目标靶标之间错配以便帮助更好的区别SNP(图片(i)和图片(ii)的下图)。
图3：使用PASS引物与多重MNA酶读出来区别单碱基变化：PASS引物可被设计成增强变体序列(如SNP或突变)之间的区别。这可在多重MNA酶qPCR反应中进行。仅因单个碱基而不同的两个序列的检测和其之间的区别在所述图中示出，其中变体1在左图中由圆圈指代并且变体2在右图中由三角形指代。PASS引物1的S2与变体1特异性地匹配，并且PASS引物1的US是呈环形式(环1)的第一非靶标独特序列1(US1)。PASS引物2的S2与变体2特异性地匹配，并且PASS引物2的US是呈环形式(环2)的第二非靶标独特序列(US2)。这些PASS引物的使用产生针对每一变体在(a)变体碱基和(b)经由PASS引物并入的US两者上不同的扩增子。
所得到的扩增子的检测可通过MNA酶介导。例如，MNA酶1可被设计成通过设计包含对于变体1与US1的补体两者具有特异性的序列的部分酶感应臂来检测变体1扩增子。MNA酶1可被设计成仅在存在具有变体1的扩增子的情况下裂解用荧光团1标记的通用探针1(Sub 1)。MNA酶2可被设计成通过设计包含对于变体2与US2的补体两者具有特异性的序列的部分酶感应臂来检测变体2扩增子。MNA酶2可被设计成仅在存在具有变体2的扩增子的情况下裂解用荧光团2标记的通用探针2(Sub 2)。
在这种策略中，变体1和变体2两者的实时检测、区别以及定量可在一个反应管中同时发生。
图4：将PASS引物与MNA酶qPCR组合：将PASS引物在具有MNA酶读出的qPCR中组合。正向引物(其在这个实施例中还可是PASS引物)定位在关于部分酶接点的不同位置处。正向/PASS引物的3’端位于(i)从部分酶接点5个碱基处，(ii)从部分酶接点3个碱基处或(iii)部分酶接点处
在qPCR反应中，MNA酶被设计成靶向通过PASS引物(i-iii)形成的3种情形中的每一种。对于每种情形来说，将具有成环的US(黑色三角形——测试1)或平面的US(白色方块——测试2)的PASS引物与具有匹配的MNA酶的标准(非PASS)引物(黑色圆圈——阳性对照)或与被设计成检测US的部分酶组合的标准(非PASS)引物(十字——阴性对照)进行比较。
图5：使用PASS引物来跳过高度可变的序列：经由使用PASS引物并入扩增子中的US还可用于跳过在待检测的保守序列之间存在的不提供信息的遗传变异区域。PASS引物可被设计成使得S1和S2与靶标的两个保守的非相邻的序列互补。与S1和S2杂交的区域之间的靶序列中的空位(靶空位)将包含待检测的三个变体之间的序列差异。PASS引物的US可被设计成在S1与S2之间的靶空位中包含相同数目的核苷酸。US可与所有三种变体错配。单个MNA酶可被设计成具有将与US的补体杂交并且裂解单个探针的部分酶感应臂以便检测变体1、2和/或3。
图6：使用PASS引物来环出高度可变的序列：经由使用PASS引物并入扩增子中的US还可用于去除在待检测的保守序列之间存在的不提供信息的遗传变异区域。靶环PASS引物可被设计成使得PASS引物的US包含比S1与S2之间的靶空位中的核苷酸少的核苷酸。使用靶环PASS引物扩增来自变体1的DNA将用PASS引物的US中的更少数目的核苷酸置换靶空位中的变体序列。单个MNA酶可被设计成具有将与US的补体杂交并且裂解单个探针的部分酶感应臂以便检测从PASS引物产生的任何扩增子。
图7：用于区别单核苷酸多态性(SNP)和/或后天性点突变的PASS引物的设计：PASS引物可被设计成区别单碱基变化如SNP或点突变。在一个实施方案中，成环的或平面的PASS引物的S2可用于靶向和特异性地结合SNP或点突变。例如，PASS引物的S2中的与SNP或点突变匹配的碱基可位于所述引物的3’末端处(设计1)、从3’端3个碱基处(设计2)，所述引物的3’末端处，其中错配碱基插入在从3’端3个碱基(设计3)，或从3’端3个碱基处，其中错配碱基插入在从3’端5个碱基(设计4)。MNA酶的部分酶A靶感应臂被设计成匹配每种PASS引物设计，而部分酶B对于所有设计来说是恒定的。
图8：使用PASS部分酶与MNA酶qPCR读出来检测变体菌株：目标靶序列可包含一串变体碱基，其中每个中的变体可彼此不同，例如变体1(V1)、变体2(V2)和变体3(V3)序列。引物组可被设计成对于每个变体序列V1、V2和V3具有特异性，并且针对每个产生扩增子。PASS部分酶的使用提供实时检测所述序列而不区别所述变体菌株的策略。这涉及使用MNA酶qPCR，其中MNA酶可包含PASS部分酶。PASS部分酶包含不与目标一个或多个靶序列/扩增子互补的独特序列(US)的一部分。US包含在两个互补的靶特异性区之间的PASS部分酶感应臂内，所述靶特异性区在很大程度上与所述靶标互补。部分酶中的US与V1、V2和V3中包含变体碱基的变体区对准。
PASS部分酶内的US不影响活性MNA酶的形成，并且因此任何变体或其组合的存在可导致用荧光团和淬灭剂标记的通用探针的裂解，从而产生可实时监测的信号。
图9：使用PASS酶与PASS引物与MNA酶qPCR读出来检测变体菌株：目标靶序列可包含一串变体碱基，其中每个中的变体可彼此不同，例如变体1(V1)、变体2(V2)和变体3(V3)序列。PASS引物组可被设计成对于每个变体序列V1、V2和V3具有特异性，但包含相同US(US1)，从而针对每个产生扩增子，所述扩增子仍然含有变体碱基而且还有相同US的补体序列(cUS1)。PASS部分酶的使用提供实时检测所述序列而不区别所述变体菌株的策略。这涉及使用MNA酶qPCR，其中MNA酶可包含在扩增的目标靶序列上相邻地结合的第一PASS部分酶和完全匹配的“标准”部分酶。第一PASS部分酶感应臂包含(i)与所有变体扩增子的保守序列完全匹配的区，(ii)不与任何变体扩增子互补并且与在所述变体扩增子之间不同的区对准的独特序列(US2)，和(iii)含有US1的区，其与通过使用变体特异性PASS引物组产生的所有扩增子(全部含有cUS1)中的cUS1结合。这一MNA酶可识别且结合所有变体。
PASS部分酶内的US序列不影响活性MNA酶的形成，并且因此任何变体序列或其组合的存在可导致用荧光团和淬灭剂标记的通用探针的裂解，从而产生可实时监测的信号。
图10：使用PASS部分酶与MNA酶qPCR读出来检测变体缺失菌株：目标变体靶序列可源自其中不同区已经缺失的野生型序列(图片i，缺失1和缺失2)。引物组可被设计成对于每个缺失变体序列具有特异性，并且针对每个产生扩增子。PASS部分酶的使用提供实时检测所述序列而不必区别特异性缺失的策略。这可使用MNA酶qPCR来实现，其中MNA酶可包含在扩增的目标靶序列上相邻地结合的第一PASS部分酶和第二完全匹配的(“标准”)部分酶。第一PASS部分酶包含不与扩增的靶序列互补的序列区(指代独特序列(US))，其被设计成对齐到在缺失扩增子之间变化的区域，以使得一个MNA酶可用于检测所有变体(图片ii)。PASS部分酶中存在的US可呈“平面”结构(formation)(图片ii(a))，其中PASS部分酶中的非互补碱基的数目匹配扩增的靶序列中的未结合的碱基的数目；或当所述部分酶中的非互补碱基的数目大于扩增的靶序列并且所述部分酶序列凸出或环出时为“成环的”(图片ii(b))；或可替代地所述部分酶中的非互补碱基的数目小于扩增的靶序列并且所述靶序列环出。
PASS部分酶内的US不影响活性MNA酶的形成，因此用荧光团和淬灭剂标记的通用探针可裂解，从而产生可实时监测的信号。
图11：使用PASS酶与PASS引物与MNA酶qPCR读出来检测变体菌株：目标变体靶序列可源自其中不同区已经缺失的野生型序列(图片(i)，缺失1和缺失2)。PASS引物组可被设计成对于每个缺失变体序列缺失1和缺失2具有特异性，但可包含相同US(US1)，从而针对每个缺失产生扩增子，所述扩增子含有缺失特异性变体碱基以及相同US的互补序列(cUS1)。用于实时检测扩增子而不区别所述变体菌株的示例性策略可使用PASS部分酶连同PASS引物。这可涉及使用MNA酶qPCR，其中MNA酶可包含在扩增的目标靶序列上相邻地结合的第一PASS部分酶和第二完全匹配的(“标准”)部分酶。PASS部分酶包含不与扩增的靶序列互补的序列区(指代独特序列(US2))(其被设计成对齐到在缺失扩增子之间变化的序列)和对应于US1的另一个区，以使得一个MNA酶可用于检测所有变体(图片(ii))。PASS部分酶中存在的US2可呈平面结构，其中PASS部分酶中的非互补碱基的数目匹配扩增的靶序列中的未结合的碱基的数目，或当PASS部分酶中的非互补碱基的数目大于或小于扩增的靶序列并且所述序列凸出或环出时是“成环的”(图片(ii))。
因为PASS部分酶内的US不影响活性MNA酶的形成，因此用荧光团和淬灭剂标记的通用探针可裂解，从而产生可实时监测的信号。
图12：使用靶环PASS引物或挤压(Pinch)PASS引物来环出不同长度的靶序列：经由使用PASS引物(靶环PASS引物或挤压PASS引物)并入扩增子中的独特序列插入物(USI)或独特序列接点(USJ)还可用于去除如在待检测的保守序列之间存在的不提供信息的基因变异的序列区域。
PASS引物可被设计为，(i)靶环PASS引物，以使得PASS引物的USI包含比位于cS1与cS2之间的靶序列中的那些核苷酸少的核苷酸，或(ii)挤压PASS引物的USJ使位于cS1与cS2之间的靶序列环出。环出的靶序列的长度可以是例如10个碱基、20个碱基、40个碱基、60个碱基、100个碱基或200个碱基(i或ii)，这可返回来与例如可包含位于环下方的2个未结合的碱基的原始环PASS引物相比较(iii)。
使用靶环PASS引物或挤压PASS引物扩增DNA将分别用靶环PASS引物或挤压PASS引物的USI或USJ中的更小数目的核苷酸置换环出的靶序列。MNA酶可被设计成具有将与所述USI或所述USJ的补体杂交并且裂解报道探针的部分酶感应臂以便检测从PASS引物或挤压PASS引物产生的任何扩增子。
图13：使用PASS部分酶或挤压PASS部分酶来环出不同长度的靶序列：PASS部分酶可被设计成使得(i)所述平面的PASS部分酶的USI包含与位于cS1与cS2之间的靶序列中的那些核苷酸相同数目的核苷酸，所述数目例如可以是5、10或15个碱基，(ii)所述环PASS部分酶的USI可包含比位于cS1与cS2之间的靶序列中的那些核苷酸更多或更少的核苷酸，例如，USI可以是5、10或15个碱基，或(iii)所述挤压PASS部分酶的USJ可使位于cS1与cS2之间的靶序列的(例如)5、10、15、20或40个碱基环出。
PASS部分酶可用于MNA酶qPCR中，其中MNA酶可包含在扩增的目标靶序列上相邻地结合的第一PASS部分酶或挤压PASS部分酶和完全匹配的(“标准”)部分酶。PASS部分酶内的USI或USJ序列不影响活性MNA酶的形成，因此用荧光团和淬灭剂标记的通用探针可裂解，从而产生可实时监测的信号。
图14：用于省略或选择基因组中的可变区的引物与部分酶A组合的选择。挤压PASS部分酶的研发使得能够灵活地选择待由MNA酶检测的序列，这在靶序列包含可变区时可以是一个优点。可采用许多不同的引物和MNA酶情形。策略包括(i)检测包括野生型的所有变体的上游通用正向引物，所述正向引物可与(i A)靶向可变区的下游标准MNA酶一起使用，其中不同的部分酶A(Pz A)可针对每个变体进行设计，但可与常见部分酶B(Pz B)一起使用以便检测多个变体；或与(i B)挤压PASS部分酶A一起使用，所述挤压PASS部分酶A在其独特序列接点(USJ)处挤出可变区，从而允许使用单个MNA酶检测所有变体。“X”表示变体碱基并且“0”表示所述变体碱基的补体。在另一种情形中，(ii)与MNA酶重叠的变体特异性正向引物可用于选择性地扩增相对于野生型序列的变体。当与标准MNA酶组合时(ii A)，特异性变体的检测是可能的，但是多个变体的检测需要每个变体特异性引物和部分酶A组(与常见Pz B)。或者，检测任何变体的存在可通过使用扩增每个可变区的特异性引物与挤压PASS部分酶A的组合(ii B)来实现，所述挤压PASS部分酶A在其独特序列接点(USJ)处挤出可变区，从而允许使用单个MNA酶检测所有变体。或者，(iii)与MNA酶重叠的变体特异性正向引物可用于选择性地扩增变体序列，并且每个变体特异性引物可包含其5’端上的非靶标相关的标签序列，其变得并入到针对每个变体的扩增子中。这减少MNA酶与引物之间针对结合扩增子的同一链的竞争并且减少多重反应中引物之间的竞争。这一标记的引物可与(iii A)标准MNA酶组合以便检测特异性变体(每个PzA被设计成检测基因组中的不同可变区)或与(iii C)标记的挤压PASS部分酶A组合，以使得所述部分酶A在其独特序列接点(USJ)处挤出所述可变区并且与扩增子中的标签序列的补体(c-标签)结合，从而减少正向引物与部分酶A之间的任何结合竞争并且允许使用单个MNA酶检测所有变体。
图15：含有由反义DNA酶组成的US的PASS引物。经由使用PASS引物并入扩增子中的独特序列还可用于将功能序列插入到扩增子中。PASS引物可被设计成使得所述独特序列由无活性的反义形式的DNA酶组成，同时仍与靶序列非互补。在PCR过程中扩增之后，催化活性的有义DNA酶插入到扩增子中并且可裂解底物以便实时产生信号(图15图片(ii))。相比之下，标准PASS引物可具有无催化潜力并且与靶序列非互补的US(图15图片(i))。PASS引物可与MNA酶qPCR组合以使得MNA酶包含与独特序列的补体(cUS)以及扩增的靶序列结合的第一部分酶。第二部分酶可在目标扩增子上与第一部分酶相邻地结合。活性MNA酶然后将裂解底物1(Sub 1)以便产生可实时监测的信号。第二底物2(Sub 2)可添加至两个反应，但在使用标准PASS部分酶时，底物2将保持未裂解并且不产生信号(图15图片(i))。然而，在使用含有DNA酶的反义作为US的PASS引物时，扩增导致活性DNA酶的形成，所述活性DNA酶将裂解底物2，从而产生可实时监测的信号(图15图片(ii))。底物2可用与底物1不同的荧光团标记以便可区别两种信号，或可替代地底物2可用与底物1相同的荧光团标记以便增强所产生的信号并且降低Ct值。
图16：描绘多组分核酸(MNA酶)的示例性设计的简图。通过示例性公开内容，MNA酶包含两种寡核苷酸组分(部分酶A和部分酶B)，所述两种寡核苷酸组分在存在组装易化子(例如靶DNA或RNA)的情况下自组装。当两种部分酶在存在组装易化子的情况下组装时，催化活性的MNA酶形成，所述MNA酶能够修饰(例如裂解或连接)底物。两种组分部分酶具有(i)感应臂，其与组装易化子结合，(ii)底物臂，其结合底物，以及(iii)部分催化核心序列。组装易化子分子(例如靶核酸序列)的存在提供指导部分酶组分以高度特异性性方式组装的“输入”信号。在一些实施方案中，组装易化子可以是例如测试样品中存在的靶核酸序列。在其它实施方案中，组装易化子可以是例如环境中所包含的用于指导部分酶组分在存在可检测的实体或事件的情况下自组装的合成寡核苷酸。通过组装的MNA酶修饰底物(底物探针、报道探针或报道底物)可提供可检测和/或定量的“可检测作用”。例如，当底物用荧光团(F)和淬灭剂(Q)双重标记时，底物通过活性MNA酶的裂解使所述荧光团与所述淬灭剂分离，从而导致荧光的伴随增加。
定义
除非上下文另外清楚地指明，否则如在本申请中所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述”包括复数引用。例如，短语“多核苷酸”还包括多个多核苷酸。
如本文所用，术语“包含(comprising)”意指“包括(including)”。词语“包含(comprising)”的变化形式如“包含(comprise)”和“包含(comprise)”具有相应变化的含义。因此，例如，“包含”核苷酸序列的多核苷酸可仅由所述核苷酸序列组成或可包含一个或多个另外核苷酸。
如本文所用，术语“多个”意指多于一个。在某些具体方面或实施方案中，多个可意指2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44，、45、46、47、48、49、50、51个或更多个，和其中可获得的任何整数，以及其中可获得的任何范围。
如本文所用，术语“受试者”包括具有经济、社会或研究重要性的任何动物，包括牛、马、绵羊、灵长类动物、禽类以及啮齿类动物物种。因此，“受试者”可以是哺乳动物，例如像人或非人哺乳动物。还涵盖微生物受试者，包括但不限于细菌、病毒、真菌/酵母、原生动物和线虫。根据本发明的“受试者”还包括传染性病原体如朊病毒。
如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”各自是指由通过肽键连接在一起的氨基酸组成的聚合物并且可互换使用。出于本发明的目的，“多肽”可构成全长蛋白质或全长蛋白质的一部分。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用并且是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基或其类似物、衍生物、变体、片段或组合的单链或双链聚合物，包括但不限于DNA、甲基化的DNA、烷基化的DNA、RNA、甲基化的RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、其扩增子或其任何组合。作为非限制性实例，核酸的来源可选自包括以下各项的组：合成、哺乳动物、人、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌(archael)或其任何组合。除非另外指明，术语“多核苷酸”和“核酸”、“寡核苷酸”包括对任何指定序列以及对与其互补的序列的引用。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指DNA或含有DNA的核酸分子或RNA或含有RNA的分子或其组合的区段。寡核苷酸的实例包括核酸靶标；底物，例如可通过MNA酶修饰的那些；引物，如用于通过如PCR的方法体外靶扩增的那些；以及MNA酶的组分。除非另外指明，术语“寡核苷酸”包括对任何指定序列以及对与其互补的序列的引用。寡核苷酸可包含至少一个添加或取代，包括但不限于包括以下各项的组：4-乙酰胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、2′-O-甲基胞苷、5-羧基甲基氨基甲基硫代尿苷、二氢尿苷、2′-O-甲基假尿苷、βD-半乳糖基辫苷(galactosylqueosine)、2′-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、βD-甘露糖基甲基尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-呋喃核糖基-2-甲硫基嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨基甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧基乙酸甲酯、尿苷-5-氧基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿苷、辫苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、怀丁苷(wybutosine)、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷、βD-阿拉伯糖基尿苷、βD-阿拉伯糖基胸苷。
如本文所用，术语“互补的”、“互补性”、“匹配”以及“匹配的”是指核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合)经由沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或摆动碱基配对彼此杂交的能力。键可经由腺嘌呤(A)碱基与尿嘧啶(U)碱基之间、腺嘌呤(A)碱基与胸腺嘧啶(T)碱基之间、胞嘧啶(C)碱基与鸟嘌呤(G)碱基之间的沃森-克里克碱基配对形成。摆动碱基配对是多核苷酸双链体中的两个核苷酸之间的非沃森-克里克碱基配对(例如鸟嘌呤-尿嘧啶、肌苷-尿嘧啶、肌苷-腺嘌呤以及肌苷-胞嘧啶)。被称为“互补的”或为彼此的“补体”的核苷酸是具有通过沃森-克里克碱基配对或摆动碱基配对在其对应碱基之间杂交在一起的能力的核苷酸。
如本文所用，术语“非互补的”、“不互补的”、“错配”以及“错配的”是指缺乏通过沃森-克里克碱基配对或摆动碱基配对在其对应碱基之间杂交在一起的能力的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其组合)。
如本文所用，“酶”是指可催化化学反应(例如多核苷酸的扩增、多核苷酸的裂解等)的任何分子。
如本文所用，“扩增子”是指为天然或人工核酸扩增或复制事件包括但不限于PCR、RT-PCR、SDA、HDA、RPA、LAMP、RCA、TMA、3SR或NASBA的产物的核酸(例如DNA或RNA，或其组合)。
如本文所用，术语“核酸酶”、“催化性核酸”、“具有催化活性的核酸”以及“催化性核酸酶”在本文中可互换使用并且应意指DNA或含有DNA的分子或复合物、或RNA或含有RNA的分子或复合物、或其组合(即DNA-RNA杂合分子或复合物)，其可识别至少一种底物并且催化所述至少一种底物的修饰(如连接或裂解)。催化性核酸中的核苷酸残基可包括碱基A、C、G、T和U以及其衍生物和类似物。以上术语包括单分子核酸酶，所述单分子核酸酶可包含单个DNA或含有DNA的分子(在本领域中还被称为“DNA酶(DNA enzyme)”、“脱氧核酶”或“DNA酶(DNAzyme)”)或RNA或含有RNA的分子(在本领域中还被称为“核酶”)或其组合，其为可识别至少一种底物并且催化所述至少一种底物的修饰(如连接或裂解)的DNA-RNA杂合分子。以上术语包括核酸酶，所述核酸酶包含DNA或含有DNA的复合物或RNA或含有RNA的复合物或其组合，其为可识别至少一种底物并且催化所述至少一种底物的修饰(如连接或裂解)的DNA-RNA杂合分子。术语“核酸酶”、“催化性核酸”、“具有催化活性的核酸”以及“催化性核酸酶”在其含义内包括MNA酶。
如本文所用，如本文所用的术语“MNA酶”和“多组分核酸酶”具有相同含义并且是指仅在存在MNA酶组装易化子(例如，靶标)的情况下形成能够催化修饰底物的活性核酸酶的两个或更多个寡核苷酸序列(例如部分酶)。MNA酶可催化一系列应答，包括底物的裂解、底物的连接以及一种或多种底物的其它酶促修饰。包含部分酶A和部分酶B的具有裂解活性的示例性MNA酶描绘于图16中。具有内切核酸酶或裂解活性的MNA酶还被称为“MNA酶裂解剂(cleaver)”。参考图16，部分酶A和B各自通过沃森-克里克碱基配对与组装易化子(例如靶DNA或RNA序列)结合。MNA酶仅在部分酶A和B的感应臂在所述组装易化子上彼此相邻杂交时形成。MNA酶的底物臂接合底物，所述底物的修饰(例如裂解)通过所述MNA酶的催化核心催化，所述催化核心通过部分酶A和B的催化结构域的相互作用形成。DNA/RNA嵌合报道底物的裂解在附图中举例说明。MNA酶可在荧光团与淬灭剂染料对之间裂解底物，从而产生信号。术语“多组分核酸酶”和“MNA酶”包含由两个分子组成的二分结构或由三个核酸分子组成的三分结构，或其它多分结构，例如由四个或更多个核酸分子形成的那些。
应理解如本文所用的术语“MNA酶”和“多组分核酸酶”涵盖所有已知的MNA酶和修饰的MNA酶，包括PCT专利公布号WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084和相关US专利公布号2007-0231810、2010-0136536以及2011-0143338(这些文献各自的内容以引用的方式整体并入本文)中的任何一个或多个中所公开的那些。由术语“MNA酶”和“多组分核酸酶”涵盖的MNA酶和修饰的MNA酶的非限制性实例包括具有裂解催化活性的MNA酶(如本文所举例说明)、包含一种或多种组装抑制剂的解散的(disassembled)或部分组装的MNA酶、包含一种或多种适体的MNA酶(“apta-MNA酶”)、包含一个或多个截短的感应臂和任选地一个或多个稳定化寡核苷酸的MNA酶、包含一种或多种活性抑制剂的MNA酶、多组分核酸无活性酶原(MNAi)、以及具有连接酶催化活性的MNA酶(“MNA酶连接酶”)，其各自在WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084、US 2007-0231810、US 2010-0136536、和/或US2011-0143338中的一个或多个中详细地描述。
如本文所用，术语“部分酶”、“组分部分酶”以及“部分酶组分”是指含有DNA或含有RNA或含有DNA-RNA的寡核苷酸，其中的两种或更多种仅在存在如本文所定义的MNA酶组装易化子的情况下可一起形成“MNA酶”。在某些优选实施方案中，一种或多种组分部分酶并且优选地至少两种可包含三个区或结构域：“催化”结构域，其形成催化修饰的催化核心的一部分；“感应臂”结构域，其可与组装易化子缔合和/或结合；以及“底物臂”结构域，其可与底物缔合和/或结合。部分酶可包含至少一种另外组分，包括但不限于适体，在本文被称为“apta-部分酶”。部分酶可包含多种组分，包括但不限于，具有截短的感应臂的部分酶组分和通过与组装易化子或底物相互作用来使MNA酶结构稳定的稳定臂组分。
如本文所用的术语多核苷酸辅助的序列转换(PASS)寡核苷酸是指包含与目标核酸靶标互补或大体上互补的5’组分、包含不存在于所述核酸靶序列中的核苷酸的“独特序列”(本文还被称为“US”)的中心组分、以及与所述目标核酸靶标互补或大体上互补的3’组分的寡核苷酸。PASS寡核苷酸可以引物(本文被称为“PASS引物”)的形式提供。PASS寡核苷酸可以是可进一步包含部分催化结构域和底物臂结构域的部分酶(本文被称为“PASS部分酶”)的感应臂组分。
术语“独特序列插入物”和“USI”’以及“独特插入物序列”和“US插入物”在本文可互换使用并且具有相同含义。术语“独特序列插入物”是指当较大多核苷酸与靶多核苷酸经由互补碱基配对杂交时，所述较大多核苷酸内不与所述靶多核苷酸互补的核苷酸序列(例如PASS寡核苷酸)。
术语“独特序列接点”和“USJ”以及“US接点”是指通过组合两种组分核苷酸序列形成的核苷酸的独特序列，每种组分与靶多核苷酸的通过间隔序列分离的不同部分互补。
如本文所用的术语“独特序列”可包含“独特序列插入物”或“独特序列接点”。
如本文所用的术语“组装易化子分子”、“组装易化子”、“MNA酶组装易化子分子”以及“MNA酶组装易化子”是指可有助于组分部分酶的自组装以便通过与MNA酶的感应臂的相互作用形成催化活性的MNA酶。如本文所用，组装易化子可有助于具有裂解、连接酶或其它酶活性的MNA酶的组装。在优选实施方案中，组装易化子是MNA酶的自组装所需的。组装易化子可包含一个分子或可包含可与一种或多种寡核苷酸“部分酶”的感应臂配对或结合的两种或更多种“组装易化子组分”。组装易化子可包含不与MNA酶的一个或多个感应臂共有序列互补性的一种或多种核苷酸组分。组装易化子可以是靶标。靶标可以是选自由以下各项组成的组的核酸：DNA、甲基化的DNA、烷基化的DNA、RNA、甲基化的RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、其扩增子或任何组合。所述核酸可以进行扩增。扩增可包括以下中的一种或多种：PCR、RT-PCR、SDA、HDA、RPA、LAMP、RCA、TMA、3SR、NASBA或连接酶反应。
如本文所用的术语“可检测的作用”是可被检测或定量作为底物的修饰已经发生的指示的作用。所述作用的大小可指示输入如组装易化子(例如靶标)的量。可检测作用可通过多种方法检测，所述方法包括荧光光谱、表面等离子体共振、质谱、NMR、电子自旋共振、偏振荧光光谱、圆二色性法、免疫测定、色谱法、辐射测定法、亮度测定法、闪烁照相术、电子方法、电化学方法、UV、可见光或红外光谱、酶促方法或其任何组合。
如本文所用的术语“多核苷酸底物”和“底物”包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基或其类似物、衍生物、变体、片段或组合的单链或双链聚合物，包括但不限于DNA、甲基化的DNA、烷基化的DNA、RNA、甲基化的RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、其扩增子或其任何组合(包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸碱基的混合聚合物)，其能够被酶识别、通过酶作用或被酶修饰(所述酶包括催化性核酸酶)。“多核苷酸底物”或“底物”可通过各种酶活性(包括但不限于裂解或连接)来修饰。“多核苷酸底物”或“底物”的修饰可提供“可检测作用”以用于监测酶的催化活性。
如本文所用的“报道底物”是被具体地适配成有助于测量与催化反应有关的底物的消失或产物的出现的底物。报道底物可在溶液中游离或结合(或“系链”)例如至表面或至另一分子。报道底物可通过很多种方式中的任一种进行标记，所述方式包括例如荧光团(有或没有一种或多种另外组分，如淬灭剂)、放射性标记、生物素(例如生物素化)或化学发光标记。
如本文所用，“通用底物(generic substrate)”或“通用底物(universalsubstrate)”是被多种MNA酶识别并且催化地作用的底物(例如报道底物)，所述多种MNA酶各自可识别不同的组装易化子。这类底物的使用有助于用于使用结构上相关的MNA酶(其全部识别通用底物)检测、鉴别或定量多种多样的组装易化子的单独测定的研发。这些通用底物可各自独立地用一种或多种标记进行标记。在优选的实施方案中，独立可检测的标记用于标记一种或多种通用底物以便允许用于使用MNA酶来独立地或同时地检测多种组装易化子的方便系统的形成。在一些实施方案中，通过MNA酶裂解的底物可以使用MNA酶或DNA酶连接酶进行重构并且因此再循环。在一些实施方案中，通过MNA酶裂解或连接的一种或多种底物可进一步用作另外一种或多种MNA酶或一种或多种DNA酶的组分或调节剂。
如本文所用的术语“探针”是指用于检测靶核酸的寡核苷酸。探针的非限制性实例包括TaqMan探针；分子信标探针；以及能够通过核酸酶催化修饰的核酸酶底物。
如本文所用的术语“通用探针(generic probe)”和“通用探针(universal probe)”是指可通过多种非相同的核酸酶催化修饰、从而有助于检测一种或多种靶核酸的探针。
如本文使用的“通用探针(generic probe)”或“通用探针(universalprobe)”还可被称为“通用底物”。在一些实施方案中通用底物可在不同位置系链至中固相支持体以便提供底物阵列。在这类实施方案中，系链的通用底物可全部用相同荧光团标记。在某些情况下，每种通用底物仅可通过在存在特异性MNA酶组装易化子分子的情况下形成的MNA酶裂解，并且信号可通过定位表面上的底物来进行定位，从而允许不同组装易化子的特异性检测。
术语“产物”是指由于底物的酶促修饰而产生的一个或多个新的分子。如本文所用，术语“裂解产物”是指由于酶的裂解或内切核酸酶活性而产生的新的分子。术语“连接产物”是指由于底物通过酶连接而产生的新的分子。
如本文所用，除非另外明确地指明，在多核苷酸的背景下使用术语“熔解温度”和“Tm”将被理解为提及如使用华莱士定律(Wallace rule)计算的熔解温度(Tm)，其中Tm＝2℃(A+T)+4℃(G+C)(参见Wallace等人，(1979)Nucleic Acids Res.6，3543)。
如本文所用，术语“碱基”将被理解为具有与术语“核苷酸”相同的含义。
如本文所用，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送系统。这类递送系统包括允许储存或将反应试剂(例如适当的容器中的标记、参比样品、支持材料等)和/或支持材料(例如用于进行测定的缓冲剂、书面说明书等)从一个位置输送或递送至另一个位置的系统。例如，试剂盒可包括含有相关反应试剂和/或支持材料的一个或多个封闭空间，如盒子。术语“试剂盒”包括分区试剂盒和组合试剂盒。
如本文所用，术语“分区试剂盒”是指包括两个或更多个单独容器的递送系统，所述容器各自含有总试剂盒组分的子部分。所述容器可一起或单独地递送至预定接受者。包括各自含有总试剂盒组分的子部分的两个或更多个单独容器的任何递送系统包括在术语“分区试剂盒”的含义内。
如本文所用，“组合试剂盒”是指将反应测定的所有组分包括于单个容器中(例如容纳每种所需组分的单个盒子中)的递送系统。
应理解关于列举的数值使用术语“约”包括所列举的数值和在所列举的值的加或减10％范围内的数值。
应理解在本文提及数值的范围时使用术语“之间”涵盖在所述范围的每个端点处的数值。例如，长度为10个残基与20个残基之间的多肽包括长度为10个残基的多肽和长度为20个残基的多肽。
本文的任何现有技术文献的描述、或源自或基于那些文献的声明并非承认所述文献或得到的声明是相关领域的公共常识的一部分。
出于描述的目的，除非另外说明，本文所提及的所有文献特此以引用的方式整体并入。
缩写：
以下缩写在本文和整个说明书中使用：
MNA酶：多组分核酸酶或多分核酸酶；
部分酶：含有寡核苷酸的部分酶；
S1；位于US的5’的序列一
S2；位于US的3’的序列二
cS1；位于US的3’的序列一的补体
cS2；位于US的5’的序列二的补体
PASS；多核苷酸辅助的序列转换
US；独特序列
cUS；独特序列的补体
USI；独特序列插入物
USJ；独特序列接点
cUSI；独特序列插入物的补体
cUSJ；独特序列接点的补体
ave；平均
PCR：聚合酶链反应；
gDNA：基因组DNA
rc：反向补体
NTC：无模板对照
qPCR：实时定量PCR
Ct；阈值循环
R2；相关系数
nM；纳摩尔
mM；毫摩尔
μL；微升
dNTP；脱氧核糖核苷酸三磷酸
ARMS：扩增受阻突变系统
WE-ARMS：摆动增强的ARMS
NF-H2O：无核酸酶的水；
LNA：锁定核酸；
F：荧光团；
Q：淬灭剂；
N＝A、C、T、G或其任何类似物；
N’＝与N互补或能够与N碱基配对的任何核苷酸；
(N)x：任何数目的N；
(N’)x：任何数目的N’；
W：A或T；
R：A、G或AA；
rN：任何核糖核苷酸碱基；
(rN)x：任何数目的rN；
rR：A或G；
rY：C或U；
M：A或C；
H：A、C或T；
D：G、A或T；
JOE或6-JOE：6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素；
FAM或6-FAM：6-羧基荧光素。
BHQ1：黑洞淬灭剂1
BHQ2：黑洞淬灭剂2
RT-PCR：逆转录聚合酶链反应
SDA：链置换扩增
HDA：解旋酶依赖性扩增
RPA：重组酶聚合酶扩增
LAMP：环介导的等温扩增
RCA：滚环扩增
TMA：转录介导的扩增
3SR：自主序列复制
NASBA：基于核酸序列的扩增
IB：IowaFQ
IBR：IowaRQ
shRNA：短发夹RNA
siRNA：短干扰RNA
mRNA：信使RNA
tRNA：转运RNA
snoRNA：小分子RNA
stRNA：小时序RNA
smRNA：小调节RNA
pre-microRNA：前体微小RNA
pri-microRNA：初始微小RNA
详述
以下详述以足够的细节传达本发明的示例性实施方案以便使本领域的普通技术人员能够实践本发明。所描述的各种实施方案的特征或限制不一定限制本发明的其它实施方案或作为整体的本发明。因此，以下详述不限制仅由权利要求所限定的本发明的范围。
本发明提供多核苷酸辅助的序列转换(PASS)寡核苷酸。PASS寡核苷酸可用作PASS引物以便有助于将独特特异性序列引入到扩增子中。通过寡核苷酸引入扩增子中的独特序列可用于增强给定核酸靶标中的小遗传变异(例如SNP)的检测，或可替代地用于置换扩增子中的可变序列的区以便改进相关序列的扩增和/或检测的功效。PASS寡核苷酸可以是PASS部分酶的感应臂组分，其中所述PASS部分酶感应臂含有与一个或一组核酸靶标非互补的“独特序列”以及与所述组的核酸靶标互补的序列。在一些实施方案中，PASS部分酶感应臂因此可与多个不同的核酸靶标杂交，所述核酸靶标仅凭借不能与所述PASS部分酶感应臂杂交的组分而彼此不同。PASS部分酶然后可与包含与核酸靶标的不同组件互补的感应臂的第二其它部分酶相互作用以便形成能够以类似效率检测多个不同的核酸序列的MNA酶。
因此，本发明的某些实施方案涉及适用于检测核酸的寡核苷酸。还提供包含所述寡核苷酸的组合物和试剂盒。
本发明的其它实施方案涉及用于检测核酸的方法。所述方法可用于检测给定靶核酸中的遗传多态性，或可替代地用于通过用来自所述寡核苷酸引物的独特序列置换靶序列的不合乎需要的一个或多个区来避免将这一个或多个区并入扩增子中。所述方法可包括使用寡核苷酸引物(例如PASS引物)扩增靶序列并且检测所产生的扩增子。所述扩增子可包含源自所述寡核苷酸引物的对于所扩增的靶序列来说外源的独特序列插入物或接点。或者，所述方法可包括用寡核苷酸引物扩增靶序列和/或使用包含一个或多个PASS部分酶的MNA酶检测所述靶序列。
PASS寡核苷酸
本发明的PASS寡核苷酸包含与存在于靶多核苷酸中的序列非互补的独特序列(US)。所述US可以独特序列插入物(USI)或独特序列接点(USJ)的形式提供。PASS寡核苷酸可用作基于聚合酶的酶促反应的引物(PASS引物)和/或被包括作为部分酶(PASS部分酶)的感应臂组分和/或底物臂组分。
在一些实施方案中，所述PASS寡核酸可包含至少两种组分。一种组分可与靶多核苷酸互补或大体上互补，而另一组分可与所述靶寡核苷酸非互补或大体上非互补。
在一些实施方案中，所述PASS寡核酸可进一步包含三种组分。第一和第二组分可与靶多核苷酸互补或大体上互补，而第三组分可与同一靶多核苷酸非互补或大体上非互补。所述寡核苷酸的第一组分和第二组分可与所述靶寡核苷酸的不同部分互补或大体上互补。所述寡核苷酸的与靶标非互补的第三组分可位于所述寡核苷酸的第一组分与第二组分之间。
在一些实施方案中，第三组分中的核苷酸的数目可等于所述靶多核苷酸中位于所述靶多核苷酸的与所述第一组分和第二组分杂交的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。具有这种特征的PASS寡核苷酸在本文还被称为平面的PASS寡核苷酸。
在其它实施方案中，第三组分中的核苷酸的数目超过所述靶多核苷酸中位于所述靶多核苷酸的与所述第一组分和第二组分杂交的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。在这类情况下，所述PASS寡核苷酸的未杂交的核苷酸可形成环结构。具有这种特征的PASS寡核苷酸在本文还被称为环PASS寡核苷酸。
在仍然其它实施方案中，第三组分中的核苷酸的数目小于所述靶多核苷酸中位于所述靶多核苷酸的与所述第一组分和第二组分杂交的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。具有这种特征的PASS寡核苷酸在本文还被称为靶环PASS寡核苷酸。
例如，第三组分可包含比所述靶多核苷酸中位于所述靶多核苷酸的与所述第一组分和第二组分杂交的部分之间的未杂交的核苷酸的数目少介于1与300个核苷酸、1与250个核苷酸、1与200个核苷酸、1与150个核苷酸、1与100个核苷酸、1与75个核苷酸、1与50个核苷酸、1与25个核苷酸、5与300个核苷酸、5与250个核苷酸、5与200个核苷酸、5与150个核苷酸、5与100个核苷酸、5与75个核苷酸、5与50个核苷酸、5与25个核苷酸、10与300个核苷酸、10与250个核苷酸、10与200个核苷酸、10与150个核苷酸、10与100个核苷酸、10与75个核苷酸、10与50个核苷酸、或10与25个核苷酸。在这类情况下，所述靶多核苷酸的位于所述第一组分与第二组分之间的未杂交的核苷酸可形成环结构。所述环结构可包含介于1与300个核苷酸、1与250个核苷酸、1与200个核苷酸、1与150个核苷酸、1与100个核苷酸、1与75个核苷酸、1与50个核苷酸、1与25个核苷酸、5与300个核苷酸、5与250个核苷酸、5与200个核苷酸、5与150个核苷酸、5与100个核苷酸、5与75个核苷酸、5与50个核苷酸、5与25个核苷酸、10与300个核苷酸、10与250个核苷酸、10与200个核苷酸、10与150个核苷酸、10与100个核苷酸、10与75个核苷酸、10与50个核苷酸、或10与25个核苷酸之间。所述环结构可包含10、20、30、40、50、60、100或200个核苷酸(图12)。
在一些实施方案中，第一组分可终止于PASS寡核苷酸的5’端并且第二组分可终止于PASS寡核苷酸的3’端。5’组分可比3’组分短。在其它实施方案中，5’组分可比3’组分长。在其它实施方案中，中心组分可比5’组分和/或比3’组分短。在仍然其它实施方案中，中心组分可比5’组分和/或比3’组分长。
PASS寡核苷酸可进一步包含另外的非互补序列，所述非互补序列可位于5’组分的5’端和/或3’组分的3’端。
仅作为非限制性实例，PASS寡核苷酸的5’组分、3’组分和/或中心组分的长度可少于75、少于70、60、50、45、40、35、30、25、20、17、55、13、10、9、8、7、6或少于5个核苷酸。例如，中心组分的长度可以是10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。在替代实施方案中，PASS寡核苷酸可包含第一组分和第二组分，所述第一组分和第二组分各自与靶多核苷酸的相异部分互补或大体上互补。靶多核苷酸的相异部分通过一个或多个间隔核苷酸分开。因此，在PASS寡核苷酸与靶多核苷酸通过互补碱基配对杂交后，靶多核苷酸的不连续的核苷酸并置，从而形成USJ。使靶多核苷酸中的空间上分离的核苷酸序列组分结合在一起可在所述靶多核苷酸中形成环结构。具有这些特征的PASS寡核苷酸在本文还被称为挤压PASS寡核苷酸。靶多核苷酸中的环结构可包含1与100个之间的核苷酸、1与75个之间的核苷酸、1与50个之间的核苷酸、1与25个之间的核苷酸、5与100个之间的核苷酸、5与75个之间的核苷酸、5与50个之间的核苷酸、5与25个之间的核苷酸、10与100个之间的核苷酸、10与75个之间的核苷酸、10与50个之间的核苷酸、或10与25个之间的核苷酸。所述环结构可包含10、20、30、40、50或60个核苷酸。
本发明的PASS寡核苷酸可以是部分酶(PASS部分酶)的补体。例如，PASS部分酶的一个或多个感应和/或底物臂可包含PASS寡核苷酸。因此，PASS部分酶可能能够与靶多核苷酸杂交并且与能够与所述靶多核苷酸的相邻部分杂交的第二部分酶组合以便组装成能够修饰底物的MNA酶，从而提供可检测事件。
本发明的PASS部分酶可包含感应臂和/或底物臂，其包含以下各物或由以下各物组成：如本文所描述的平面PASS寡核苷酸、环PASS寡核苷酸、靶环PASS寡核苷酸或挤压PASS寡核苷酸。
包含含有靶环PASS寡核苷酸或挤压PASS寡核苷酸或由其组成的感应臂和/或底物臂的PASS部分酶可引起多核苷酸中与所述感应臂和/或底物臂杂交的环结构的形成。靶多核苷酸中的环结构可包含介于1与60个之间的核苷酸、1与50个之间的核苷酸、1与40个之间的核苷酸、1与30个之间的核苷酸、1与20个之间的核苷酸、1与10个之间的核苷酸、5与60个之间的核苷酸、5与50个之间的核苷酸、5与40个之间的核苷酸、5与30个之间的核苷酸、5与20个之间的核苷酸、5与10个之间的核苷酸、10与60个之间的核苷酸、10与50个之间的核苷酸、10与40个之间的核苷酸、10与30个之间的核苷酸、或10与20个之间的核苷酸。靶多核苷酸中的环结构可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个核苷酸(图13)。
本文中提及与另一核苷酸序列“大体上互补”的核苷酸序列可意指第一序列在4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷酸的区上与第二序列的补体至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致。
本文中与另一核苷酸序列“互补”的核苷酸序列可意指第一序列在4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷酸的区上与第二序列的补体100％一致。
本文中提及与另一核苷酸序列“大体上非互补”的核苷酸序列可意指第一序列在4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷酸的区上与第二序列的补体小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％一致。
本文中与另一核苷酸序列“非互补”的核苷酸序列可意指第一序列在4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷酸的区上与第二序列的补体0％一致。
如本文所提供的PASS寡核苷酸可取决于所需应用具有任何适合的长度。仅作为非限制性实例，寡核苷酸的长度可少于100、少于75、少于70、60、50、45、40、35、30、25、20、17、55、13、10、9、8、7、6或少于5个核苷酸。
PASS寡核苷酸可结合的靶核酸(即多核苷酸)的非限制性实例包括DNA、甲基化的DNA、烷基化的DNA、互补DNA(cDNA)、RNA、甲基化的RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、其扩增子或其任何组合(包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸碱基的混合聚合物)。
因此，本文所提供的PASS寡核苷酸可包含以下各物或由以下各物组成：DNA、甲基化的DNA、烷基化的DNA、互补DNA(cDNA)、RNA、甲基化的RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、其扩增子或其任何组合(包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸碱基的混合聚合物)。
在某些实施方案中，本发明的PASS寡核苷酸可用作靶核酸序列的扩增中的引物。
参见图1中所示的实施方案，PASS引物可包含三个区。引物的5’组分(S1)包含与目标核酸靶标大体上互补的序列，引物的中间组分是非靶标特异性独特序列(US)并且引物的3’组分(S2)包含与目标核酸靶标大体上互补的序列。S1和S2可被设计成使得S2比S1进一步朝向靶序列的5’结合。如图片(i)中所示，S1和S2所结合的靶标的区域之间的空位中的核苷酸的数目可少于US中的碱基的数目，以使得当PASS引物与靶标结合时US形成环(图1，图片(i))。或者，在由S1和S2结合的靶序列之间可存在空位，如图1图片(ii)中所示。US可包含与S1与S2之间的空位相同数目的核苷酸(图1，图片(ii))、更少核苷酸或更多核苷酸(图1，图片(i))。
在一些实施方案中，S1的熔解温度(“Tm”)高于S2的Tm。
因此，在某些实施方案中，PASS寡核苷酸可具有三个区，即(i)具有高于3’区(S2)的Tm的5’区(S1)，所述5’区与靶核酸的第一组分互补或大体上互补并且能够退火至靶标；(ii)3’区(S2)，其可具有比S1低的Tm并且与靶标互补或大体上互补；以及(iii)位于S1与S2之间的间隔区(US)，其包含与靶标非互补或大体上非互补的独特序列(US)。
一般来说，当PASS引物用于扩增目标序列时，US并入至所得扩增子中(图1，图片(i)、(ii)以及(iii))。US可针对不同目来设计以(例如像)用于帮助使用被设计成与US或US的补体结合的分子信标或MNA酶部分酶检测扩增子(图1，图片(iii))。MNA酶部分酶或分子信标还可或可不与从PASS引物的3’端扩增的靶序列结合。
PASS引物的具体和非限制性实例包括包含如SEQ ID NO 10、11、13、14、16或17中的任一个所定义的序列的那些。
PASS寡核苷酸的示例性应用
-用PASS引物的靶扩增
本发明的PASS寡核苷酸可用作引物(PASS引物)以便扩增靶核酸序列并且将独特序列(US)并入至所得扩增子中。关于PASS引物可应用的扩增技术不存在具体限制。使用PASS寡核苷酸通过不同反应产生的扩增子可使用任何已知技术来检测。非限制性实例包括使用由与双链DNA结合的染料(例如，SYBR绿)提供的信号的那些检测技术和/或使用扩增子序列特异性探针(例如分子信标、小沟结合物(MGB)探针、探针)的那些。
一般来说，核酸扩增技术使用酶(例如聚合酶)来产生由一个或多个寡核苷酸引物特异性地结合的靶核酸的拷贝。其中可使用PASS寡核苷酸的扩增技术的非限制性实例包括以下中的一种或多种：聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)。
将来自本文所描述的PASS寡核苷酸的US引入扩增子中可帮助更好地区别单碱基差异，如单核苷酸多态性或后天性点突变。例如，PASS引物可被设计成增强变体序列如SNP或突变(例如点突变)之间的区别。
参见图2，PASS引物可被设计成增强单碱基变化如SNP或点突变的区别。例如，环PASS引物(图2图片(i))或平面PASS引物(图2图片(ii))的3’组分(S2)可用于靶向并且特异性地结合SNP或点突变。PASS引物的S2中的与SNP或点突变匹配的碱基可位于所述引物的3’末端处(图2，图片(i)和(ii)的上图)，或可位于S2内的其它位置处，例如像所述引物的3’末端的5’1、2、3、4、5或多于5个碱基。此外，另外碱基可在S2与目标靶序列之间错配以便帮助更好的区别SNP(图2图片(i)和图(ii)的下图)。例如，1、2或3个碱基可在S2与靶序列之间错配。错配的一个或多个碱基可位于例如引物的3’末端的5’1、2、3、4、5或多于5个碱基。
PASS引物可被设计成在涉及多个靶多核苷酸的多重反应中增强变体序列(例如SNP或突变)之间的区别。在这些实施方案中，包含不同靶多核苷酸结合特异性的两个或更多个PASS引物可用于检测不同靶多核苷酸。为了辨别源自不同多核苷酸靶标的扩增子，具有针对一种多核苷酸的特异性的第一PASS引物的中心组分(US)可不同于具有针对另一种不同的靶多核苷酸的特异性的第二PASS引物的中心组分(US)。
仅因单个碱基而不同的两个序列的检测和其之间的区别在图3中示出。变体1在左图中由圆圈指代并且变体2在右图中由三角形指代。PASS引物1的S2与变体1特异性地匹配，并且PASS引物1的US是呈环形式(环1)的第一US(US1)。PASS引物2的S2与变体2特异性地匹配，并且PASS引物2的US是呈环形式(环2)的第二US(US2)。PCR中这些PASS引物的使用针对每一变体产生在序列方面在(a)变体碱基和(b)经由PASS引物并入的US两者上不同的扩增子。不同的扩增子可使用任何适合的方式进行检测。在图3中所示的实施方案中，检测可使用多重MNA酶qPCR反应来实现。
来自PASS引物的独特序列(US)可出于“跳过”或去除存在于待检测的靶保守序列之间的不提供信息的遗传变异区域的目的而并入扩增子中。这可有助于例如在保守区通过序列的可变区分开的情况下检测单个病毒或细菌的多个菌株。在这类实施方案中，可能不必辨别源自不同多核苷酸靶标的扩增子，在这种情况下，不同PASS引物的中心组分(US)可以是一致的。或者，来自不同PASS引物的中心组分(US)的序列可不同以便辨别扩增子的来源。
仅作为非限制性实例，预测对具体疗法的应答的SNP(SNP-1)可在不提供关于治疗应答的有用信息的SNP(SNP-2)的直接下游。针对SNP-1的ARMS引物的设计将因针对SNP-2的多个等位基因的存在而变得复杂。PASS引物可被设计成具有对于SNP-1的提供信息的等位基因具有特异性的S2。PASS引物将针对靶标进行设计以使得S1和S2将在它们之间留下未杂交的靶序列。这一未杂交的靶序列将含有SNP-2。在用PASS引物扩增过程中，PASS引物中的独特序列(US)将置换SNP-2的序列，从而从反应中去除这种外来变异。SNP-1的不同等位基因之间的区别可使用两个PASS引物来实现。SNP的等位基因1将通过PASS引物1进行扩增，所述PASS引物1将含有与等位基因1特异性地匹配的S2，和US1。PASS引物2将扩增SNP的等位基因2。PASS引物2将含有与等位基因2特异性地匹配的S2，和US2(与US1不同的序列)。PCR中这些PASS引物的使用将针对每一变体产生在序列方面在(a)变体碱基和(b)经由PASS引物并入的US两者上不同、但无SNP-2的变体的扩增子。来自PASS引物1和PASS引物2的扩增子可使用如图3中所描述的MNA酶进行检测(参见MNA酶1和MNA酶2)。
具体地参见图5和图6中所示的实施方案，PASS引物可被设计成使得S1和S2与靶标的两个保守的非相邻的序列互补或大体上互补(图5，PASS引物)。与S1和S2杂交的区域之间的靶序列中的空位(靶空位)可含有待检测的三个变体之间的序列差异。所述变体可以是病毒或细菌菌株。PASS引物的US可被设计成含有与S1与S2之间的靶空位中相同数目的核苷酸(图5)，或PASS引物的US可被设计成含有比S1与S2之间的靶空位中的那些少的核苷酸(图6)。
用图5中的PASS引物扩增来自图5中的变体1、2以及3的DNA可产生具有完全相同的序列的扩增子，不考虑靶空位中的变异。来自PASS引物的US可置换S1与S2之间的靶空位中的遗传变异。因此用于检测所产生的所有扩增子的方法可依赖于单个US的检测，而不管扩增子从不同靶多核苷酸扩增。例如，如图5中所示，MNA酶可被设计成具有部分酶感应臂，所述部分酶感应臂与US的补体(cUS，图5)杂交并且裂解单个探针以便检测例如病毒或细菌的变体1、2以及3。
具体地参见图6，使用所示的靶环PASS引物扩增来自变体1的DNA将用PASS引物的US中的更少数目的核苷酸置换靶空位中的变体序列。在这一相同靶空位区中具有变异的病毒或细菌的其它菌株也将使用这种PASS引物有效地扩增。所得扩增子将全部具有相同序列，而不管靶空位的序列。单个MNA酶可被设计成具有部分酶感应臂，所述部分酶感应臂将与US的补体(cUS，图6)杂交并且裂解单个探针以便检测从PASS引物产生的任何扩增子。
所属领域的技术人员将容易地理解仅出于非限制性例证说明的目的提供以上所描述的PASS寡核苷酸/引物的应用。所公开的PASS寡核苷酸/引物可用于任何基于引物的核酸扩增技术中并且本发明并不限于所具体描述的那些实施方案。
-使用PASS引物检测所产生的扩增子
如以上所讨论，本发明的PASS引物可用于任何多核苷酸扩增技术中，所述多核苷酸扩增技术的非限制性实例包括PCR、RT-PCR、SDA、HDA、RPA、LAMP、RCA、TMA、3SR或NASBA。
通过使用PASS引物的技术产生的扩增子可使用本领域已知的任何适合的方法进行检测。
非限制性实例包括使用标记的探针、将可检测的标记并入引物中、使用催化性核酸等。
例如，扩增子可通过(SYBR绿与熔解曲线分析)来检测，其中第一PASS引物的独特序列(US1)与来自第二PASS引物的独特序列(US2)的Tm之间的Tm差异将提供所述扩增子的熔解温度的较大差异。另外地或可替代地，可使用分子信标，其中所述分子信标被设计成包含US1或US2。另外地或可替代地，MNA酶可用于检测所述扩增子。
在某些实施方案中，所使用的检测方法可被设计成检测并入扩增子中的PASS引物的中心组分(US)或US的组分。这在旨在检测源自相异多核苷酸的扩增子的多重测定中可以是特别有利的。例如，它允许更容易地区别相异靶多核苷酸中的小遗传变异如SNP和其它突变。
另外地或可替代地，所使用的检测方法可被设计成检测并入至扩增子中的PASS引物的5’(S1)和/或3’(S2)组分。
虽然在许多应用中使用序列特异性技术(例如基于并入扩增子中的PASS寡核苷酸的中心组分的特异序列的技术)检测扩增子可为优选的，但还考虑其它技术。例如，在扩增不是出于辨别源自不同靶多核苷酸的扩增子的目的而进行的实施方案中，通过其大小检测所产生的扩增子可能是完全足够的。例如当扩增涉及去除存在于待检测的靶保守序列之间的不提供信息的遗传变异的区域时，可为这种情况。
MNA酶可用于使用如PCR、RT-PCR、SDA、HDA、RPA、TMA、LAMP、RCA、3SR以及NASBA的技术来检测使用PASS引物产生的扩增子。MNA酶可包含一个或多个PASS部分酶。MNA酶是仅在存在组装易化子的情况下组装并且具有催化活性的多组分核酸酶，所述组装易化子可以是例如待检测的靶标，如使用PASS引物从多核苷酸序列产生的扩增子。MNA酶由多个部分酶(part-enzyme)或部分酶(partzyme)组成，其在存在一个或多个组装易化子的情况下自组装并且形成催化性地修饰底物的活性MNA酶(图16)。底物和组装易化子(靶标)是单独的核酸分子。部分酶具有多个结构域，包括(i)与组装易化子(如靶核酸)结合的感应臂；(ii)结合底物的底物臂，以及(iii)在组装时组合以便提供完整催化核心的部分催化核心序列。MNA酶可被设计成识别广泛范围的组装易化子，包括例如不同的靶核酸序列。响应于组装易化子的存在，MNA酶修饰其底物。这种底物修饰可与信号产生联系起来并且因此MNA酶可产生酶扩增的输出信号。组装易化子可以是存在于生物或环境样品中的靶核酸(例如使用PASS引物从多核苷酸靶标产生的扩增子)。在这类情况下，通过MNA酶活性检测底物的修饰指示靶标的存在。已经报道了能够裂解核酸底物的几种MNA酶，并且能够连接核酸底物的另外MNA酶也是本领域中已知的。MNA酶及其修饰形式是本领域已知的并且公开于PCT专利公布号WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084和相关US专利公布号2007-0231810、2010-0136536以及2011-0143338中(这些文献各自的内容以引用的方式整体并入本文)。
例如，MNA酶的任一或两个感应臂可以是与PASS引物或其组分互补的或大体上互补的。在某些实施方案中，MNA酶的一个感应臂与PASS引物的中心组件(US)或其组分互补或大体上互补，并且还与包含所述中心组分的扩增子的剩余部分的一部分互补。MNA酶的第二感应臂与同一扩增子的不与第一感应臂互补并且不包含US的不同部分互补。
MNA酶可用于被设计成检测包含源自不同PASS引物的不同中心组分(US)的多个相异的扩增子的存在。例如，第一MNA酶的一个或多个感应臂可以对于包含源自第一PASS引物的第一中心组分(US)的第一扩增子具有特异性，所述第一PASS引物能够与第一多核苷酸靶标结合并且有助于第一多核苷酸靶标的扩增；并且第二MNA酶的一个或多个感应臂可以对于包含源自第二PASS引物的第二中心组分(US)的第二扩增子具有特异性，所述第二PASS引物能够与第二多核苷酸靶标结合并且有助于第二多核苷酸靶标的扩增，所述第二多核苷酸靶标包含与所述第一多核苷酸靶标相异的序列。这有助于在单个测定中检测源自相异的多核苷酸靶标的多个相异的扩增子。所属领域的技术人员将容易地理解具有针对源自其它相异的多核苷酸靶标的另外相异的扩增子的特异性的另外MNA酶也可并入这类测定中。
仅作为非限制性实例，参考图3，其中MNA酶1可被设计成通过设计包含对于变体1和US1的补体两者具有特异性的序列的部分酶感应臂来检测变体1扩增子。MNA酶1可被设计成仅在存在变体1的扩增子的情况下裂解用荧光团1标记的通用探针1(Sub 1)。MNA酶2可被设计成通过设计包含对于变体2和US 2的补体两者具有特异性的序列的部分酶感应臂来检测变体2扩增子。MNA酶2可被设计成仅在存在具有变体2的扩增子的情况下裂解用荧光团2标记的通用探针2(Sub 2)。在这种策略中，变体1和变体2两者的实时检测、区别以及定量可在一个应答管中同时发生。图7示出针对靶多核苷酸中的变体碱基如SNP或点突变的选择性扩增设计的PASS引物的示例性设计。通过PASS引物产生的扩增子可例如通过MNA酶来检测。PASS引物可被设计成区别单碱基变化如SNP或点突变。例如，如图7中的成环的和平面的PASS引物中所示的S2可用于靶向并且特异性地结合SNP或点突变。PASS引物的S2中的与SNP或点突变匹配的核苷酸可位于所述引物的3’末端处(设计1)；从3’端3个核苷酸处(设计2)；所述引物的3’末端处，其中错配核苷酸插入在从3’端3个碱基(设计3)；或从3’端3个核苷酸处，其中错配核苷酸插入在从3’端5个碱基(设计4)。MNA酶可用于检测用PASS引物产生的扩增子。部分酶A靶感应臂被示出匹配每种PASS引物设计，并且部分酶B被示出对于所有设计来说恒定的。
所属领域的技术人员将容易地认识到平面、环、靶环以及挤压PASS引物可根据图7中所示的示例性设计来使用。所属领域的技术人员还将认识到可改变S2组件中所示的与SNP匹配的核苷酸和/或错配核苷酸的位置。例如，任一者可位于3’末端处，或从3’末端1、2、3、4或5个核苷酸处。
-使用PASS部分酶检测扩增子
包含一个或多个PASS部分酶的MNA酶可用于检测靶核酸和靶核酸扩增子。靶核酸扩增子可使用任何适合的技术产生。在一些实施方案中，靶核酸扩增子可用使用PASS引物的技术产生。
参见图8中所示的示例性实施方案，PASS部分酶可被设计成检测源自相关变体序列的多个扩增子。仅作为非限制性实例，目标靶序列可含有在不同靶标中不同的一串变体核苷酸(在图8中描绘为变体1(V1)、变体2(V2)以及变体3(V3)序列)。引物组可被设计成对于每个变体序列V1、V2和V3具有特异性，并且针对每个产生扩增子。PASS部分酶提供实时检测所述序列而不区别变体菌株的策略。这涉及使用MNA酶qPCR，其中MNA酶可包含PASS部分酶。例如，PASS部分酶可包含不与一个或多个目标靶序列/扩增子互补的独特序列(US)的一部分。US可位于PASS部分酶感应臂内、在与靶标互补的两个区之间。部分酶中的US可与V1、V2以及V3中含有变体碱基的变体区对准。具有这种设计的单个PASS部分酶可以相等或类似效率结合来自V1、V2以及V3的扩增子，从而允许它们的同时检测。
仍然参见图8中所示的示例性实施方案，PASS部分酶内的US不阻止活性MNA酶的形成，并且因此任何变体或其组合的存在可导致通用探针的裂解，从而提供可检测事件。例如，当探针用荧光团和淬灭剂标记时，这可产生可实时监测的信号。
本领域技术人员将认识到图8中所示的PASS部分酶的感应臂可包含以下各项或由以下各项组成：如本文所描述的平面PASS寡核苷酸、环PASS寡核苷酸、靶环PASS寡核苷酸或挤压PASS寡核苷酸，其各自被设计成避免与扩增子的变体区互补碱基杂交。
现在参见图10中描绘的示例性实施方案，PASS部分酶可被设计成与MNA酶qPCR读出一起检测变体缺失菌株，其中目标变体靶序列可源自一组包含具有不一致缺失区(图10图片i，缺失1和缺失2)的成员的野生型序列。引物组可被设计成对于每个缺失变体序列具有特异性，并且针对每个产生扩增子。PASS部分酶的使用提供实时检测所述序列而不必区别所述特异性缺失的策略。这可使用MNA酶qPCR来实现，其中MNA酶可包含在扩增的目标靶序列上相邻地结合的第一PASS部分酶和一个完全匹配的(“标准”)部分酶。PASS部分酶可包含不与靶序列互补的序列区(指代独特序列(US))，其被设计成对准在缺失扩增子之间变化的区域，以使得一个MNA酶可用于检测所有变体(图10图片ii)。存在于PASS部分酶中的US可呈平面形式，其中PASS部分酶的感应臂中的非互补碱基的数目匹配靶序列中未杂交的核苷酸的数目(图10图片ii(a))。或者，PASS部分酶感应臂中存在的US可呈环形式，其中PASS部分酶的感应臂中的非互补/未杂交的核苷酸的数目大于靶序列中的非互补/未杂交的核苷酸的数目(图10图片ii(b))。
本领域技术人员将认识到虽然图10描绘平面和环PASS寡核苷酸的使用，但图10中所示的PASS部分酶的感应臂可包含如本文所描述的靶环PASS寡核苷酸或挤压PASS寡核苷酸或由其组成，其各自被设计成避免与扩增子的可变缺失区互补碱基杂交。
单个PASS部分酶可以相等或类似效率结合由扩增缺失变体1和2产生的扩增子，从而允许它们的同时检测。
PASS部分酶内的US不阻止活性MNA酶的形成，因此用荧光团和淬灭剂标记的通用探针可裂解，从而提供可检测事件。这进而可提供可实时监测的信号。
在图9中描绘的另一个示例性实施方案中，靶标的检测可使用PASS部分酶与PASS引物的组合来实现。目标靶序列可包含变体核苷酸序列，其中不同靶标中的变体核苷酸序列不相同，例如变体1(V1)、变体2(V2)和变体3(V3)序列。PASS引物组可被设计成对于每个变体序列V1、V2和V3具有特异性，并且可进一步包含相同US(US1)，以使得扩增针对每个变体产生扩增子，所述扩增子含有(i)变体碱基和(ii)共用US的互补序列(cUS1)和在变体之间保守的序列。组合使用这些PASS引物与PASS部分酶提供实时检测所有变体序列而不区别变体菌株的策略。这涉及使用MNA酶qPCR，其中MNA酶可包含在扩增的目标靶序列上相邻地结合的第一PASS部分酶和完全匹配的“标准”部分酶。所描绘的PASS部分酶感应臂包含(i)与所有变体扩增子的保守序列完全匹配的区，(ii)不与任何变体扩增子互补并且与在所述变体扩增子之间不同的区对准的独特序列(US2)，和(iii)包含US1的区，其可结合通过使用变体特异性引物组产生的所有扩增子(全部包含cUS)。这一MNA酶可识别所有变体并且与所有变体杂交。
具有任一设计的单个PASS部分酶可以相等或类似效率结合通过变体序列的扩增产生的扩增子，从而允许它们的同时检测。本领域技术人员将认识到，虽然图9描绘平面PASS引物的使用，但图9中所示的PASS引物可被如本文所描述的环PASS引物、靶环PASS引物或挤压PASS引物取代，其各自被设计成在所产生的靶序列的拷贝中提供US。本领域技术人员还将认识到虽然图9描绘平面PASS部分酶构象，但所述感应臂可被包含以下各物的等效型式取代：环或靶环PASS寡核苷酸，其中US2与扩增子的可变序列非互补；或可替代地挤压PASS寡核苷酸感应臂，其有助于去除针对所述感应臂的扩增子中作为可供使用的结合区的可变序列。
每个PASS部分酶内的多个US不阻止活性MNA酶的形成，并且因此任何变体或其组合的存在可导致通用探针的裂解，从而提供可检测事件。例如，当探针用荧光团和淬灭剂标记时，这可产生可实时监测的信号。
在图11中所示的另一实施方案中，PASS部分酶可与PASS引物一起用于检测变体缺失。目标变体靶序列可源自其中不同区已经缺失的野生型序列(图11图片i，缺失1和缺失2)。PASS引物组可被设计成对于每个缺失变体序列缺失1和缺失2具有特异性，但可进一步包含相同US(US1)，从而针对每个缺失产生扩增子，所述扩增子含有缺失特异性变体碱基以及相同US的补体序列(cUS1)和保守的共用靶序列。用于实时检测扩增子而不区别变体缺失的示例性策略使用PASS部分酶连同PASS引物。这可涉及使用MNA酶qPCR，其中MNA酶可包含在扩增的目标靶序列上相邻地结合的第一PASS部分酶和完全匹配的(“标准”)部分酶。PASS部分酶可包含(i)不与扩增的靶序列互补的序列区(指代为独特序列(US2))(图片ii)，其被设计成对准在缺失扩增子之间变化的序列)；(ii)对应于US1的另一个区，以使得一个MNA酶可用于检测所有变体(图片ii)，和(iii)在所有缺失扩增子中保守的共用互补序列。存在于PASS部分酶中的US2可呈平面形式，其中PASS部分酶中的非互补碱基的数目匹配靶序列中未结合的碱基的数目。或者，存在于PASS部分酶中的US2可呈成环的构象，其中所述部分酶中的非互补碱基的数目大于靶序列中的数目，从而导致序列凸出或环出(图片ii)。具有任一设计的单个PASS部分酶可以相等或类似效率结合通过缺失变体的扩增产生的扩增子，从而允许它们的同时检测。
本领域技术人员将认识到，虽然图11描绘环PASS引物的使用，但图11中所示的PASS引物可被如本文所描述的平面PASS引物、靶环PASS引物或挤压PASS引物取代，其各自被设计成在所产生的靶序列的拷贝中提供US。本领域技术人员还将认识到虽然图11描绘平面或环PASS部分酶构象，但所述感应臂可被包含以下各物的等效型式取代：靶环PASS寡核苷酸，其中US2与扩增子的可变缺失序列非互补；或可替代地挤压PASS寡核苷酸感应臂，其有助于去除针对所述感应臂的扩增子中作为可供使用的结合区的可变缺失序列。
因为PASS部分酶内的US不影响活性MNA酶的形成，因此用荧光团和淬灭剂标记的通用探针可裂解，从而产生可实时监测的信号。
现在参见图14，使用一个或多个引物扩增靶序列可提供包含所述一个或多个引物和靶序列的靶序列扩增子。在这类情况下，MNA酶可被设计成检测所述扩增子。MNA酶可包含如图14B和14C中所示的PASS部分酶。例如，如图14(i)、14A(i)以及14B(i)中所示，MNA酶可被设计成使得任一或两种部分酶组分的感应臂通过碱基对互补性与扩增子的不包含引物序列或与所述引物序列互补的序列的区杂交(例如在扩增子的两个末端之间的区中，每个末端包含单独的引物序列，或每个末端包含与单独的引物序列互补的序列)。或者，MNA酶可被设计成使得任一或两种部分酶组分的感应臂与扩增子的包含引物序列或与所述引物序列互补的序列的区杂交(图14(ii)/(iii)、14A(ii)/(iii)、14B(ii)以及14C(iii))。在这类情况下，与引物序列杂交的感应臂可以是PASS部分酶的组分。例如，如图14B(i)/(ii)和14C(iii)中所示，可使用挤压PASS部分酶，从而导致引物序列的一部分和任选地扩增子的在所述引物序列上游或下游的另外序列环出。在一些实施方案中，靶序列扩增子可包含含有标签序列的一个或多个引物(图14(iii)、14A(iii)、14C(iii))。MNA酶可被设计成使得任一或两种部分酶组分的感应臂与扩增子的包含标签序列或与所述标签序列互补的序列的区杂交。在这类情况下，与引物序列杂交的感应臂可以是PASS部分酶的组分。例如，如图14C(iii)中所示，可使用挤压PASS部分酶，从而导致引物序列的一部分和任选地另外标签序列以及任选地扩增子的在所述引物序列上游或下游的序列的环出。本领域技术人员将容易地认识到平面、环、靶环以及挤压PASS部分酶可根据本文所描述的示例性方法来使用。
-使用PASS部分酶检测未扩增的靶核酸
本发明的PASS部分酶可用于检测之前未使用基于聚合酶的扩增技术扩增的核酸。
例如，PASS部分酶可被设计成检测变体靶序列。仅作为非限制性实例，目标靶序列可包含在不同靶标中不同的变体区。可变区可包含一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失。PASS部分酶可包含独特序列(US)的一部分，所述部分不与任何靶序列互补或至少不与变体靶序列的给定群体内的可变区中的任一个互补。US可位于PASS部分酶感应臂的各自与一个或多个靶序列互补的两个区之间。所述互补区中的一个可能够通过互补碱基配对与一个或多个靶序列、在一个或多个靶标的变体区的3’端杂交，而另一个可能够通过互补碱基配对与所述相同一个或多个靶序列、在所述一个或多个靶标中的可变区的5’端杂交。以此方式，PASS部分酶与包含可变区的一个或多个靶标的杂交可使US与所述US可保持与其未杂交的变体区对准。具有这种设计的单个PASS部分酶因此可以相等或类似效率结合多个不同的靶标，从而允许它们的同时检测。一般来说，可通过添加包含感应臂的第二部分酶来有助于检测，所述感应臂与所述靶序列的一部分互补，所述部分紧邻靶序列的通过PASS部分酶杂交的部分，从而有助于催化活性MNA酶的组装，所述MNA酶能够修饰底物以提供可检测信号。本领域技术人员将认识到PASS部分酶的感应臂可包含如本文所描述的平面PASS寡核苷酸、环PASS寡核苷酸、靶环PASS寡核苷酸或挤压PASS寡核苷酸或由其组成，其各自被设计成避免与靶序列的变体区互补碱基杂交。
-使用PASS寡核苷酸以将功能性核酸并入扩增子中
PASS寡核苷酸可用于将功能性序列并入扩增子中。功能性序列可借助于将US或UJS并入扩增子的PASS寡核苷酸(例如PASS引物)形成，其中与新的US或由所述UJS形成的新的序列互补的序列具有功能能力。例如，所并入的序列可以是DNA酶或核酶的序列。
现在参见图15并且具体地说图15图片(ii)，包含US的PASS引物可用于扩增靶核酸(例如基因组DNA)，并且在这种情况下将US并入扩增子中。PASS引物的US可包含无活性反义形式的功能性核酸。在扩增靶核酸之后，催化活性的有义形式的功能性核酸被插入扩增子中。本领域技术人员将容易地认识到平面、环以及靶环PASS引物可用于实现经由US将功能性核酸并入所产生的扩增子中的结果。在替代实施方案中，挤压PASS引物可用于产生扩增子中的UJS并且在这种情况下在扩增子内形成功能性核酸。
如图15图片(ii)的示例性实施方案中所示，使用包含无活性反义形式的催化性核酸(在这种情况下DNA酶)的US，从而产生包含功能上活性的有义形式的US的扩增子。存在于所述扩增子中的功能上活性有义形式的催化性核酸能够裂解底物以产生可检测信号，从而通知因此产生的扩增子的存在。如图15图片(ii)的最下部分中所示，MNA酶可任选地用于帮助检测包含功能催化性核酸(在这种情况下DNA酶)的扩增子。例如，可使用包含第一部分酶的MNA酶，所述第一部分酶能够通过互补碱基配对与功能催化性核酸的底物以及扩增子的部分相邻地或大致上相邻地杂交。MNA酶的第二部分酶组分可邻近所述第一部分酶与扩增子杂交(再次通过互补碱基配对)，从而有助于催化活性的MNA酶的组装，所述MNA酶能够裂解与扩增子中存在的催化性核酸的底物相同或或不同的底物，从而产生指示所述扩增子的存在的另外可检测信号。
-诊断应用
可根据本文所描述的方法出于诊断和/或预后目的使用PASS寡核苷酸。诊断和/或预后方法可离体或体外进行。然而，本发明的方法不一定出于诊断和/或预后目的使用，并且因此还考虑不是诊断或预后的应用。
在一些实施方案中，本文所描述的方法可用于诊断受试者中的感染。例如，所述方法可用于诊断受试者中的细菌、病毒、真菌/酵母、原生动物和/或线虫感染。在一个实施方案中，病毒可以是肠道病毒。受试者可以是牛、马、绵羊、灵长类动物、禽类或啮齿类动物物种。例如，受试者可以是哺乳动物，如人、狗、猫、马、绵羊、山羊或牛。受试者可患有由感染引起的疾病。例如，受试者可具有由肠道病毒感染引起的脑膜炎。因此，在某些实施方案中本发明的方法可用于诊断脑膜炎。
可对样品进行本发明的方法。样品可源自任何来源。例如，样品可从环境来源、工业来源或通过化学合成获得。
应理解如本文所考虑的“样品”包括例如通过纯化、稀释或添加任何其它一种或多种组分从其原始状态修改的样品。
可对生物样品进行本发明的方法，包括但不限于诊断和/或预后方法。生物样品可取自受试者。还可使用储存的生物样品。适合的生物样品的非限制性实例包括全血或其组分(例如血细胞、血浆、血清)、尿、唾液、淋巴液、胆汁、痰、眼泪、脑脊髓液、支气管肺泡灌洗液、滑液、精液、腹水瘤液、母乳以及脓液。
试剂盒
本发明提供包括用于进行本发明的方法的一种或多种试剂的试剂盒。通常，用于进行本发明的方法的试剂盒包括用于进行所述方法的所有必要的试剂。
在一些实施方案中，所述试剂盒可包括能够在存在适当的组装易化子(例如包含如本文所描述的PASS引物的扩增子)的情况下形成MNA酶的寡核苷酸组分。例如，所述试剂盒可包含含有第一和第二部分酶的至少第一和第二寡核苷酸组分，和包含底物的第二容器，其中所述第一部分酶和第二部分酶和所述底物自组装成MNA酶需要存在于测试样品中的组装易化子(例如扩增子)的缔合。因此，在这种实施方案中，第一部分酶和第二部分酶以及底物可应用于测试样品以便确定一个或多个靶扩增子的存在。
一般来说，所述试剂盒包括本文所提供的至少一种PASS寡核苷酸。所述试剂盒因此可包括PASS寡核苷酸，例如像平面PASS寡核苷酸、环PASS寡核苷酸、靶环PASS寡核苷酸和/或挤压PASS寡核苷酸。
另外地或可替代地，所述试剂盒可包括PASS引物，例如像平面PASS引物、环PASS引物、靶环PASS引物和/或挤压PASS引物。
另外或可替代地，所述试剂盒可包括包含感应臂和/或底物臂的PASS部分酶，所述感应臂和/或底物臂包含如本文所描述的PASS寡核苷酸(例如平面PASS寡核苷酸、环PASS寡核苷酸、靶环PASS寡核苷酸和/或挤压PASS寡核苷酸)或由其组成。所述试剂盒可进一步包括标准部分酶，所述标准部分酶被设计成在结合同一靶多核苷酸并且有助于催化活性的MNA酶的组装的背景下补充PASS部分酶，所述MNA酶能够修饰底物以便提供可检测信号。
通常，本发明的试剂盒还将包括其它试剂、洗涤试剂、酶和/或如进行本发明的方法如PCR或其它核酸扩增技术中所需的其它试剂。
所述试剂盒可以是如本文所定义的分区试剂盒或组合试剂盒。
分区试剂盒包括容纳在单独的容器中的试剂，并且可包括小型玻璃容器、塑料容器或塑料条或纸条。这类容器可允许试剂从一个隔室有效转移至另一个隔室，同时避免样品和试剂的交叉污染，以及以定量方式将每个容器的试剂或溶液从一个隔室添加至另一个。这类试剂盒还可包括将接受测试样品的容器、包含测定中所使用的试剂的容器、包含洗涤试剂的容器以及包含检测试剂的容器。
组合试剂盒在单个容器(例如在容纳每种所需组分的单个盒子中)中包括反应测定的所有组分。
本发明的试剂盒还可包括用于使用所述试剂盒组分进行适当的方法的说明书。本发明的试剂盒和方法可与自动分析设备和系统(例如包括但不限于实时PCR机器)结合使用。
对于扩增、检测、鉴别或定量不同靶标的应用来说，本发明的单个试剂盒可以是适用的，或者可替代地可能需要例如含有对于每个靶标具有特异性的试剂的不同试剂盒。本发明的方法和试剂盒可应用于希望检测、鉴别或定量任何实体的任何情况中。
本领域的普通技术人员将了解，在不脱离广泛描述的本发明的精神和范围的情况下，可对所述具体实施方案中所公开的本发明作出众多变化和/或修改。□＞因此，本实施方案在所有方面都被视为是说明性的而不是限制性的。
实施例
现在将参照以下具体实施例描述本发明，所述实施例决不应被解释为限制性的。
实施例1：使用MNA酶来检测经由PASS引物插入至扩增子中的序列
PASS PCR策略涉及具有含有不与目标靶序列互补的独特序列的区的引物。存在于PASS引物中的独特序列(US)在所述PASS引物结合靶标时可以是环出的或平面的(图1)。
在这个实施例中，将PASS引物与MNA酶qPCR进行组合，其中所述MNA酶包含与独特序列的补体(cUS)以及扩增的目标靶序列结合的第一部分酶，而第二部分酶与所述第一部分酶相邻地结合扩增的目标靶序列。部分酶A与部分酶B直接相邻地在目标靶序列上结合的点被称为部分酶接点。由部分酶组分形成活性MNA酶导致用荧光团和淬灭剂染料对标记的通用探针的裂解，从而产生可实时监测的信号。
引物和部分酶被设计成确定PASS引物的S2结构域(图1)与互补部分酶序列之间的不同重叠情形是否与检测CCB基因相容。这导致PASS引物的3’端在从部分酶接点5个碱基、从部分酶接点3个碱基或在部分酶接点处结合。针对每种情形设计PASS引物和非PASS“标准”引物。
1.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向CCB基因和/或经由PASS引物引入到扩增子中的任何cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基与cUS杂交并且包含US，即插入物2(i2)。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：1   部分酶A CCBA/72-P：
ACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO：2   部分酶B CCBB/72-P：
CTGGGAGGAGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：3   部分酶A CCB_1i2A/72-P：
AGACATACTA CAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO：4   部分酶A CCB_2i2A/72-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO：5   部分酶A CCB_3i2A/72-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGCGTGAT
1.2.报道底物
用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列以5’至3’的顺序书写。在当前实施例中，将底物在5’端用FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。以485 nm(FAM激发波长)进行激发，在530nm(FAM发射波长)下监测底物的裂解。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：6   底物Sub72-FIB：
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
1.3.用于扩增CCB DNA的PCR引物
用于这一实施例的靶序列通过使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物体外扩增人基因组DNA(gDNA)来产生。被设计成使得US在引物与靶标结合时环出的PASS引物被称为“环的”。其中US在引物与靶标结合时未环出的PASS引物被称为“平面的”。所有序列以5’至3’的顺序书写。在以下序列中，加下划线的碱基是US。
SEQ ID NO：7   反向引物3CCB：
CTCAGGAATTTCCCAGCTAC
SEQ ID NO：8   正向引物5CCB：
GTCTCAGTTCTTCTTGGATG
SEQ ID NO：9   正向引物5CCB_1：
CTTGGATGGTCATCTCCAGA
SEQ ID NO：10   正向PASS引物5CCB_1i2环：
AGTTCTTCTTGGATGGTCATAGACATACTACTCCAGA
SEQ ID NO：11   正向PASS引物5CCB_1i2平面：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTAGACATACTACTCCAGA
SEQ ID NO：12   正向引物5CCB_2：
GGATGGTCATCTCCAGAGC
SEQ ID NO：13   正向PASS引物5CCB_2i2环：
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：14   正向PASS引物5CCB_2i2平面：
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：15   正向引物5CCB_3：
TGGTCATCTCCAGAGCCCA
SEQ ID NO：16   正向PASS引物5CCB_3i2环：
CTTCTTGGATGGTCATCTCCAAGACATACTAGAGCCCA
SEQ ID NO：17   正向PASS引物5CCB_3i2平面：
GTCTCAGTTCTTCTTGGATGAGACATACTAGAGCCCA
1.4.靶序列
从IM9细胞系(Promega)提取的人gDNA用作CCB基因扩增的模板。
1.5.反应组成：靶序列的扩增和检测
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在Mx3005p(Stratagene)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和55℃30秒的5次循环、95℃15秒和52℃60秒的40次循环(在52℃步骤收集数据)。所有反应重复进行两次并且包括40nM正向引物、100nM部分酶A(如表1中所列出的组合)、200nM反向引物(3CCB)、200nM部分酶B(CCBB/72-P)、200nM底物(Sub72-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及gDNA模板(50ng)或无靶标(无核酶的H2O(NFH2O))。
表1：正向引物与部分酶A组合
1.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
阳性对照“标准”正向引物(非PASS引物，即不包含US)用于产生用以通过仅结合目标靶序列的MNA酶实时检测和定量CCB的扩增子。这一反应显示当所使用的靶序列是经由PCR扩增的人gDNA时，荧光随时间推移而增加(图4(i)至(iii)，阳性对照)。无DNA靶标对照的荧光低于含有DNA靶标的反应中的荧光并且在反应过程中不增加。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于随后裂解报道底物的催化活性MNA酶的靶标依赖性组装。
当正向引物是PASS引物并且部分酶A与cUS和靶特异性序列两者结合时，观察到荧光随时间推移而增加(图4(i)至(iii)，测试1和测试2)。此外，对于含有环和平面类型的PASS引物的反应，信号与阳性对照类似。与标准非PASS和环PASS引物相比，当使用平面PASS引物时，对于其中PASS引物开始于部分酶接点处的反应来说，观察到信号产生的稍微延迟(图4(iii)测试2平面)。
包括标准非PASS正向引物(即正常引物)和含有US和靶特异性序列两者的部分酶A的阴性对照反应的荧光低于测试1、测试2以及阳性对照反应并且在图4的图片(i)和(iii)所示的反应中不超过阈值。然而，图4的图片(ii)中所示的反应中的阴性对照显示荧光高于阈值的稍微增加。这并非是出人意料的，因为部分酶臂中的US与针对这一设计扩增的CCB靶序列之间存在一些同源性，并且这种同源性可使部分酶臂足够稳定用于形成MNA酶，尽管是无效率的。
部分酶A与PASS引物的S2结构域之间的所有重叠情形均是良好耐受的，其中对于测试1和测试2来说观察到较强信号(图4(i)至(iii))。
这些结果指示US可经由PASS引物(通过环或平面PASS类型引物)插入到PCR扩增子中并且这些扩增子可随后用MNA酶检测，并且PASS引物的S2与部分酶A之间的重叠是良好耐受的。
实施例2：使用PASS引物与MNA酶的组合来检测序列中的单碱基变化
PASS引物可被设计成区别因单碱基而变化的两个序列，以使得靶特异性3’端(S2)包含变体碱基(图2(i)和(ii)上图)并且还可包含位于变体碱基的5’的错配碱基(图2(i)和(ii)下图)。此外，US可针对每个变体不同，从而增加另一种水平的选择性和特异性(图3)。
在这个实施例中，被称为G12V的密码子12中的KRAS点突变针对野生型KRAS序列G12进行测定。野生型在密码子12(G12；GGT)上的变体碱基是位置2处的G并且对于突变体(G12V；GTT)来说，变体碱基是密码子12的位置2处的T。含有环或平面US的PASS引物被设计成对于G12V或G12序列具有特异性。变体碱基在S2中位于3’端处(图7，设计1)或距离3’端三个碱基(图7，设计2)。将设计1和2分别与还具有错配(M)、即在变体碱基的5’端的插入的两个碱基的设计3和4(图7，设计3和设计4)进行比较。与变体(US2)相比，将不同的US插入到用于野生型(US1)的PASS引物中。
将PASS引物与MNA酶qPCR组合，其中MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与独特序列的补体(cUS)以及针对每个变体碱基(野生型或突变体，有或没有错配)定制的扩增的靶序列结合(图7)。第二部分酶与第一部分酶在扩增的目标靶序列上相邻地结合。
PASS引物和部分酶被设计成确定不同情形对于KRAS野生型G12或点突变G12V的变体碱基是否具有特异性。
2.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向KRAS基因的野生型G12或突变G12V等位基因加经由PASS引物引入的任何cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列(野生型插入物i1和变体插入物i2)。一些部分酶A具有较长的(L)3’靶特异性区。粗体和斜体形式碱基表示变体碱基并且加下划线和斜体形式的碱基表示另外的错配碱基。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：18  部分酶BKRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：19  部分酶AG12_i1A/55-P：
CACAATCAGT ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：20  部分酶AG12_Mi1A/55-P：
CACAATCAGT ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：21  部分酶AG12_LMi1A/55-P：
CACAATCAGT ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：22  部分酶AG12V_i2A/55-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：23  部分酶AG12V_Mi2A/55-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：24  部分酶AG12V_LMi2A/55-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
2.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用FQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列5’至3’的顺序。
SEQ ID NO：25  底物Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
2.3.用于扩增KRAS DNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行人gDNA中的KRAS基因的体外扩增。PASS引物被设计成使得对于野生型具有特异性的正向引物包含US插入物1(i1)；并且对于突变体具有特异性的正向引物包含US插入物2(i2)。一些正向引物具有较长的(L)3’靶特异性区。在以下序列中，粗体形式的碱基与靶序列杂交，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列，粗体且加下划线的碱基是变体碱基，并且斜体形式的碱基表示与两个靶标错配(M)的另外碱基。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：26  反向引物3KRAS：
SEQ ID NO：27  正向PASS引物5G12_1i1环：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：28  正向PASS引物5G12_1i1平面：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：29  正向PASS引物5G12_2i1环：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：30  正向PASS引物5G12_2i1平面：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：31  正向PASS引物5G12_LM3i1环：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：32  正向PASS引物5G12_LM3i1平面：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：33  正向PASS引物5G12_M4i1环：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：34  正向PASS引物5G12_M4i1平面：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：35  正向PASS引物5G12V_1i2环：
AGACATACTA
SEQ ID NO：36  正向PASS引物5G12V_1i2平面：
AGACATACTA
SEQ ID NO：37  正向PASS引物5G12V_2i2环：
AGACATACTA
SEQ ID NO：38  正向PASS引物5G12V_2i2平面：
AGACATACTA
SEQ ID NO：39  正向PASS引物5G12V_LM3i2环：
AGACATACTA
SEQ ID NO：40  正向PASS引物5G12V_LM3i2平面：
AGACATACTA
SEQ ID NO：41  正向PASS引物5G12V_M4i2环：
AGACATACTA
SEQ ID NO：42  正向PASS引物5G12V_M4i2平面：
AGACATACTA
2.4.靶序列
从K562细胞系提取的人gDNA用作体外扩增野生型KRAS基因的模板并且从SW620细胞系提取的gDNA用于体外扩增含有点突变G12V的KRAS。
2.5.反应组成：靶序列的扩增和检测
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总体积体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和64℃60秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃15秒和54℃50秒的40次循环(在54℃收集数据)。所有反应重复进行两次并且包括40nM正向引物和100nM部分酶A(表2中所概括的组合)、200nM反向引物(3KRAS)、200nM部分酶B(KRAS_B/55-P)、200nM底物(Sub55-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及K562或SW620gDNA模板(50ng)或无靶标(NF H2O)。
表2：用于野生型和突变体的引物/部分酶组合。
2.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
正向PASS引物和对于G12和cUS1或G12V和cUS2具有特异性的部分酶A扩增并且检测特异性KRAS等位基因，从而使得荧光随时间推移而增加，达到如表3中所示的阈值Ct值。在含有野生型G12引物/部分酶设计1(平面和环)、设计3(平面和环)以及设计4(平面)的反应中，“测试”DNA(K562)的Ct值指示K562中野生型KRAS等位基因的成功扩增和检测，而针对阴性对照(SW620)的信号的缺乏指示用这些系统未检测到突变等位基因。这些系统允许gDNA中野生型与突变KRAS之间的完全区别。含有野生型G12引物/部分酶设计2(平面和环)和设计4(环)的反应中，“测试”DNA(K562)的Ct值指示K562中野生型KRAS等位基因的成功扩增和检测。阴性对照(SW620)的信号达到如表3中所示的阈值Ct值，从而指示当使用突变体模板时产生一些背景信号，然而，ΔCt值足够高以允许野生型序列与突变序列的清楚区别。
在含有G12V引物/部分酶设计3(环)的反应中，“测试”DNA(SW620)的Ct值指示SW620中突变KRAS等位基因的成功扩增和检测，而阴性对照(K562)的信号的缺乏指示用这种系统未检测到野生型等位基因。这种系统允许gDNA中突变与野生型KRAS之间的完全区别。含有突变G12V引物/部分酶设计1、2和4(平面和环)和设计3(平面)的反应中，“测试”DNA(SW620)的Ct值指示SW620中突变KRAS等位基因的成功扩增和检测。阴性对照(K562)的信号达到如表3中所示的阈值Ct值，从而指示当使用野生型模板时产生一些背景信号，然而，ΔCt值足够高以允许突变序列与野生型序列的清楚区别。
在所有系统中，在缺乏gDNA的无模板对照中没有观察到扩增。
这些结果指示US可经由PASS引物(通过环或平面PASS类型引物)插入到PCR扩增子中并且这些扩增子可随后用MNA酶检测。部分酶特异性地检测含有变体碱基和伴随插入的独特序列的扩增子。
表3：野生型(变体G)和突变体(变体T)组合的Ct值
注意：当对于阴性对照样品来说未产生Ct时，50的最终Ct用于产生ΔCt并且放置在前面的大于符号(＞)指示ΔCt将预期高于这一值。
实施例3：比较均与MNA酶组合的PASS引物与摆动增强的ARMS引物检测序列中的单碱基变化的特异性
在这个实施例中，被称为G12V的密码子12中的KRAS点突变针对野生型KRAS序列G12进行测定。平面PASS引物被设计成对于G12V或G12序列具有特异性。变体碱基(对于野生型来说G并且对于突变体来说T)位于3’靶特异性区(S2)中、在3’端处并且错配为在变体碱基的5’端插入的2个碱基(图7，设计3)。不同的US包含在用于野生型(US1)序列和突变(US2)序列的PASS引物中。将这些PASS引物与摆动增强的ARMS(WE-ARMS)引物进行比较(参见Hamfjord等人(2011)，“Wobble-enhanced ARMS Method for Detection of KRAS andBRAF Mutations”，Diagn Mol Pathol；20：158-165)，其中设计了对于G12V或G12具有序列特异性的引物，加上它们包含相对于两种等位基因引入的错配以便帮助区别因单碱基而不同的KRAS序列。对于这个实施例中使用的WE-ARMS引物来说，变体(突变的或野生型)碱基位于3’端处并且错配为在变体碱基的5’端插入的2个碱基。
将PASS引物与MNA酶qPCR组合，其中MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与独特序列的补体(cUS)、变体碱基(野生型或突变的)和错配的碱基以及扩增的靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶相邻地结合，从而与扩增的目标靶序列杂交。将WE-ARMS引物与MNA酶组合，其中第一部分酶与扩增的靶序列和变体碱基(野生型或突变体)的补体以及错配碱基结合。第二部分酶与第一部分酶相邻地结合，从而与扩增的目标靶序列杂交。
将PASS引物与WE-ARMS引物针对区别靶G12与G12V之间的单碱基变化的能力进行比较。
3.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向G12或G12V序列和经由引物引入的任何错配以及经由PASS引物引入的cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列(野生型插入物i1和变体插入物i2)。一些部分酶A具有较长的(L)3’靶特异性区。粗体和斜体形式的碱基表示变体碱基(野生型或突变的)并且加下划线和斜体形式的碱基表示另外的错配碱基。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：18  部分酶BKRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：21  韶分酶AG12_LMi1A/55-P：
CACAATCAGT ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：24  部分酶AG12V_LMi2A/55-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：43  部分酶AG12_MA/55-P：
ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：44  部分酶AG12V_MA/55-P：
ACAACGAGAGGTGCGGT
3.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用FQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列5’至3’的顺序。
SEQ ID NO：25  底物Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
3.3.用于扩增KRASDNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行人gDNA的体外扩增。PASS引物被设计成使得G12特异性正向引物包含US插入物1(i1)，并且G12V特异性正向引物包含US插入物2(i2)。一些正向引物具有较长的(L)靶特异性区。在以下序列中，粗体形式的碱基与靶序列杂交，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列，粗体且加下划线的碱基是变体碱基，并且斜体形式的碱基表示与两个靶标错配(M)的另外碱基。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：26  反向引物3KRAS：
SEQ ID NO：32  正向PASS引物5G12_LM3i1平面：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：40  正向PASS引物5G12V_LM3i2平面：
AGACATACTA
SEQ ID NO：45  正向WE-ARMS引物5G12_M：
SEQ ID NO：46  正向WE-ARMS引物5G12V_M：
3.4.靶序列
从K562细胞系提取的人gDNA用作体外扩增野生型基因的模板并且从SW620细胞系提取的gDNA用于体外扩增点突变G12V。
3.5.反应组成：靶序列的扩增和检测
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(Biorad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和64℃60秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃15秒和54℃50秒的40次循环(在54℃步骤收集数据)。所有反应重复进行两次并且包括40nM正向引物和100nM部分酶A(表4中所概括的组合)、200nM反向引物(3KRAS)、200nM部分酶B(KRAS_B/55-P)、200nM底物(Sub55-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及K562或SW620gDNA模板(50ng)或无靶标(NF H2O)。
表4：用于野生型和变体的引物/部分酶组合
3.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
使用PASS引物和WE-ARMS引物扩增、接着使用引物特异性部分酶检测的结果在表5中示出。
表5：G12与G12V组合的Ct值
^2个复制中仅一个产生信号，因此40的最终循环数用于平均Ct值。
注意：当对于阴性对照样品来说未产生Ct时，50的最终Ct用于产生ΔCt并且放置在前面的大于符号(＞)指示ΔCt将预期高于这一值。
与野生型变体匹配的PASS引物在测试K562 DNA中扩增G12等位基因，并且这通过含有与野生型扩增子和US1匹配的部分酶A的MNA酶检测。这种野生型PASS引物/部分酶系统对于野生型等位基因具有特异性并且当使用阴性对照模板(SW620)时没有产生信号。当对于变体突变体和US2具有特异性的部分酶A与野生型PASS引物结合使用时没有观察到交叉反应性。
与野生型变体匹配的WE-ARMS引物在测试K562 DNA中扩增G12等位基因，这通过含有与野生型扩增子匹配的部分酶A的MNA酶检测。这种野生型ARMS引物/部分酶系统对于野生型等位基因具有特异性并且当使用阴性对照模板(SW620)时没有产生信号。
与突变体变体匹配的PASS引物在测试SW620 DNA中扩增G12V等位基因，并且这通过与突变体扩增子和US2匹配的部分酶检测。这种突变体PASS引物/部分酶系统优先地扩增并且检测突变体等位基因，并且当使用阴性对照模板(K562)时仅在应答后期产生信号。突变体SW620与野生型K562 DNA之间的Ct差异大于15个循环(表5)，从而证明PASS引物和匹配的部分酶A允许区别突变体等位基因与野生型等位基因。当对于变体野生型和US1具有特异性的部分酶与突变体PASS引物结合使用时没有观察到交叉反应性。
与突变体变体匹配的WE-ARMS引物在测试SW620 DNA中扩增G12V等位基因，并且这通过与突变体扩增子匹配的部分酶检测。这种突变体WE-ARMS引物/部分酶系统优先地扩增并且检测突变体等位基因，并且当使用阴性对照模板(K562)时仅在应答后期产生信号。突变体SW620与野生型K562 DNA之间的Ct差异大于14个循环(表5)，从而证明ARMS引物和匹配的部分酶允许区别突变体等位基因与野生型等位基因。
当没有添加模板(无DNA)时，使用任何引物/部分酶对没有检测到扩增。
这个实施例中的数据证明了PASS引物以类似于或优于本领域熟知的用于检测单基因变化(ARMS)的替代技术进行的能力。
实施例4：比较均与MNA酶组合的PASS引物与摆动增强的ARMS(WE-ARMS)引物检测序列中的单碱基变化的灵敏度
在这个实施例中，使用在野生型KRAS模板背景中的G12V模板的连续稀释液来测定被称为G12V的密码子12中的KRAS点突变。对野生型背景中的G12V的1∶10、1∶100以及1∶1000的稀释液进行测试。
设计3(图7)平面PASS引物用于扩增G12V序列。将这与G12VWE-ARMS引物进行比较。将PASS引物与MNA酶qPCR组合，其中MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与独特序列的补体(cUS)以及含有变体(突变体)碱基和错配的碱基的补体的扩增的靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶相邻地结合在扩增的目标靶序列内。将WE-ARMS引物与MNA酶组合，其中第一部分酶与含有变体(突变体)碱基和错配碱基的补体的扩增的靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶相邻地结合在扩增的目标靶序列内。
将PASS引物与WE-ARMS引物进行比较以便研究每种策略的效率、线性以及灵敏度。
4.1.部分酶寡核苷酸
在PASS引物情况下，部分酶被设计成特异性地靶向G12V序列和经由引物引入的任何错配以及cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于起始模板错配的US(插入物i2)。一些部分酶A具有较长的(L)靶特异性区。粗体和斜体形式的碱基表示变体(突变体)碱基并且加下划线和斜体形式的碱基表示另外的错配碱基。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：18  部分酶BKRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：24  部分酶AG12V_LMi2A/55-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：44  部分酶AG12V_MA/55-P：
ACAACGAGAGGTGCGGT
4.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用FQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列按5’至3’的顺序。
SEQ ID NO：25  底物Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
4.3.用于扩增KRASDNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行人gDNA的体外扩增。在以下序列中，粗体形式的碱基与靶序列杂交，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的US(插入物i2)，粗体且加下划线的碱基是变体碱基，并且斜体形式的碱基表示与两个靶标错配(M)的另外碱基。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：26  反向引物3KRAS：
SEQ ID NO：40  正向PASS引物5G12V_LM3i2平面：
AGACATACTA
SEQ ID NO：46  正向WE-ARMS引物5G12V_M：
4.4.靶序列
从SW620细胞系提取的人gDNA用作体外扩增点突变G12V的模板。通过在从K562细胞系提取的野生型gDNA的恒定背景下连续稀释SW620gDNA来制作校准曲线。
4.5.反应组成：靶序列的扩增和定量
靶序列的实时扩增和定量在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(Biorad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和64℃60秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃15秒和54℃50秒的40次循环(在54℃步骤收集数据)。所有反应重复进行两次并且包括40nM正向引物和100nM部分酶A(表6中所概括的组合)、200nM反向引物(3KRAS)、200nM部分酶B(KRAS_B/55-P)、200nM底物(Sub55-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及SW620gDNA模板(50ng)，在K562gDNA模板的恒定背景下1∶10、1∶100或1∶1000稀释的SW620gDNA模板(50ng)，K562gDNA模板(50ng)或无靶标(NF H2O)。
表6：用于变体测定的引物/部分酶组合
设计 正向引物 部分酶A
PASS引物 5G12V_LM3i2平面 G12V_LMi2A/55-P
WE-ARMS引物 5G12V_M G12V_MA/55-P
4.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
PASS和WE-ARMS正向引物用于产生用以实时检测和定量KRAS点突变(G12V)的扩增子。MNA酶被设计成对于用于检测突变序列的特异性PASS或ARMS引物具有特异性。这一反应显示当反应包含对于G12V具有特异性的靶序列时荧光随时间推移而增加(表7)。
将含有G12V突变的SW620gDNA模板在包含野生型(G12)序列的K562模板的背景下连续稀释10倍。将gDNA的连续稀释液用PASS或WE-ARMS正向引物进行扩增。通过将gDNA浓度的对数相对于阈值循环(Ct)作图从而产生线性曲线图来产生用于PASS和WE-ARMS引物两者的标准曲线。每个稀释系列的平均Ct值在表7中示出。每个靶标的相关系数(R2)和反应效率也在表7中示出。两种引物的线性是可比较的，而PASS引物具有比WE-ARMS引物(78％)更大的效率(103％)。最佳效率应在90％至110％的范围内。
当在G12的背景下1∶1000稀释时，两种引物组均能够检测G12V序列。对于WE-ARMS引物来说，阴性对照K562模板的信号是在1∶1000稀释的样品(K562DNA中的SW620)的Ct之后仅1.3Ct，而PASS引物产生为在1∶1000稀释的样品的Ct之后4.8Ct的信号(表7)，从而指示对于G12V突变DNA来说，这种PASS引物/部分酶系统有比用这种ARMS系统所观察的更大的特异性。
无模板对照的荧光在反应过程中未增加。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于随后裂解报道底物的催化活性MNA酶的靶标依赖性组装。
表7：G12V PASS对比WE-ARMS引物的Ct值
^2个复制中的仅一个产生信号，因此40的最终循环数用于平均Ct值。
实施例5：使用PASS引物与MNA酶检测的组合进行KRAS密码子12的野生型和突变等位基因的多重反应以便区别每个序列中的单碱基变化
被称为G12V的密码子12中的KRAS点突变与野生型(G12)因一个核苷酸而不同。这一实施例在多重反应中组合野生型G12和突变G12V等位基因的检测。用于测定的模板包括在G12模板(K562 DNA)的背景下G12模板(SW480 DNA)的1∶10、1∶100以及1∶1000比例的连续稀释液；或在G12V模板(SW480 DNA)的背景下G12模板(K562DNA)的1∶10、1∶100以及1∶1000比例的连续稀释液。
基于设计3的平面PASS引物(图7)用于G12序列的特异性扩增并且基于设计3的环PASS引物(图7)用于G12V序列的特异性扩增。对比突变体(US2)，不同的US插入到用于野生型(US1)的PASS引物中。将PASS引物与MNA酶qPCR组合，其中用于检测G12扩增子的MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与独特序列1的补体(cUS1)、野生型变体碱基和另外的错配碱基以及扩增的靶序列结合。用于检测G12V扩增子的MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与独特序列2的补体(cUS2)、突变变体碱基和另外的错配碱基以及扩增的靶序列结合。两个“第一部分酶”与用不同的荧光团标记的不同部分底物序列结合以便能够分别监测野生型和突变体扩增子的积聚。G12和G12V两者的第二部分酶在扩增的目标靶序列上与第一部分酶相邻地结合；这一部分酶对于G12 MNA酶和G12V MNA酶两者来说是一致的，从而与两者的相同部分底物序列结合。
对在多重反应中组合野生型(G12)序列和突变(G12V)序列的同时扩增和检测的PASS引物的用途进行研究以便确定对每种测定的灵敏度和特异性的作用。
5.1.部分酶寡核苷酸
部分酶A被设计成特异性地靶向G12V或G12序列和经由PASS引物引入的任何错配和cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列。粗体和斜体形式的碱基表示变体突变或野生型碱基并且加下划线和斜体形式的碱基表示另外的错配碱基。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：18  部分酶B KRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：21  部分酶A G12_LMi1A/55-P：
CACAATCAGT ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：47  部分酶A G12V_LMi2A/6-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGCGTGAT
5.2.报道底物
用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列以5’至3’的顺序书写。在当前实施例中，将Sub55在5’端用Quasar 670部分(在以下底物的名称中由“Q670”指示)进行端标记并且在3’端用BlackHole2部分(在以下底物的名称中由“B2”指示)进行端标记并且被指定为Sub55-Q670B2。在620-650nm之间(CFX96(BioRad)的Quasar 670激发波长范围)进行激发，在675-690nm之间(CFX96(BioRad)的Quasar 670发射波长范围)监测Sub55-Q670B2的裂解。将Sub6_55在5’端用FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记并且被指定为Sub6_55-FIB。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测Sub6_55-FIB的裂解。这些底物具有两者所共用的一个臂(RNA碱基的3’)并且这个臂与为两个MNA酶所共用的部分酶结合。第二底物臂(RNA碱基的5’)与检测源自通过野生型或突变PASS引物扩增的序列的部分酶特异性地结合。小写碱基表示RNA并且大写体碱基表示DNA。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列以5’至3’的顺序。
SEQ ID NO：25  底物Sub55-Q670B2：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：48  底物Sub6_55-FIB：
ATCACGCCTCguCCCCAGCTC
5.3.用于扩增KRASDNA的PCR引物
用于这一实施例的靶序列通过使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物体外扩增人gDNA来产生。在以下序列中，粗体形式的碱基与靶序列杂交，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列(G12插入物i1和G12V插入物i2)，粗体和加下划线的碱基是变体碱基，并且斜体形式的碱基表示与两个靶标错配(M)的另外碱基。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：26  反向引物3KRAS：
SEQ ID NO：49  正向PASS引物5G12_LM3i1L平面：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：50  正向PASS引物5G12V_LM3i2L环：
AGACATACTA
5.4.靶序列
从K562细胞系提取的人gDNA用作体外扩增野生型KRAS G12的模板。通过在突变体gDNA SW480的恒定背景下连续稀释K562来制作校准曲线。从SW480细胞系提取的人gDNA用作体外扩增点突变G12V的模板。通过在野生型gDNA K562的恒定背景下连续稀释SW480gDNA来制作校准曲线。
5.5.反应组成组分：靶序列的多重扩增和定量
靶序列的实时扩增和定量在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃ 2分钟、95℃ 15秒和64℃ 60秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃ 15秒和54℃ 50秒的50次循环(在54℃步骤收集数据)。反应重复进行两次或四次并且包含40nM的每种正向引物(5G12_LM3i1L平面和5G12V_LM3i2L环)、100nM的每种部分酶A(G12_LMi1A/55-P和G12V_LMi2A/6-P)以及200nM的每种底物(Sub6_55-FIB和Sub55-Q670B2)。以及400nM的反向引物(3KRAS)、400nM部分酶B(KRAS_B/55-P)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及SW480或K562gDNA模板(50ng)、或在K562gDNA模板的恒定背景下1∶10、1∶100或1∶1000稀释的SW480gDNA模板(50ng)、或在SW480gDNA模板的恒定背景下1∶10、1∶100或1∶1000稀释的K562gDNA模板(50ng)或无靶标(NFH2O)。
5.6.结果：靶标的多重扩增和报道底物的裂解
G12和G12V的扩增和检测使用对于等位基因中的每个具有特异性的PASS引物和部分酶A同时发生。将DNA样品连续稀释10倍，如在K562(G12)背景下的SW480(G12V)或在SW480(G12V)背景下的K562(G12)。表8中所示的Ct值是重复两次(n＝2)或重复四次反应(n＝4)的结果的平均值。
用于G12或G12V的两种PASS引物组均是灵敏的，从而当在另一模板的背景下1∶1000稀释时检测特异性序列。多重测定是高度特异性的，其中在野生型和变体两者的阴性对照反应中没有产生信号(当仅分别对于G12V(SW480)或G12(K562)具有特异性的模板存在时(表8))。
对于所有测试的组合来说，无模板对照的荧光低于含有DNA靶标的反应中的荧光并且在反应过程中不增加。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于随后裂解报道底物的催化活性MNA酶的靶标依赖性组装。
表8：野生型(G12)和变体(G12V)PASS引物多重反应的Ct值
这个实施例证明多个独特序列在多重反应中的用途。这导致产生在由部分酶A结合的区中包含非常不同的序列的扩增子，虽然原始模板仅包含单碱基差异。PASS引物/匹配的部分酶策略允许较高水平的多重反应，因为所述策略极大地增加来自密切相关的靶标的扩增子的序列的差异。
实施例6：比较PASS引物中的不同独特序列插入物并且与MNA酶组合以便检测序列中的单碱基变化
PASS引物可被设计成区别因单个碱基而不同的两个序列，以使得靶特异性3’端(S2)包含变体碱基(图2(i)和(ii)上图)。此外，US可针对每个变体而不同，从而增加另一种水平的选择性和特异性(图3)。
在这个实施例中，将三个不同的独特序列插入到用于被称为G12V的密码子12中的KRAS点突变和野生型KRAS序列G12两者的PASS引物中。含有呈环或平面形式的US的PASS引物被设计成对于G12V或G12序列具有特异性，并且所述特异性引物还包含US插入物i1、i2、i3或i3a。突变体和野生型两者的变体碱基位于端3’处的S2中(图7设计1)。
将PASS引物与MNA酶qPCR组合，其中MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与独特序列的补体(cUS)以及针对每个变体碱基(野生型或突变体)定制的扩增的靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶在扩增的目标靶序列上相邻地结合。
PASS引物和部分酶针对每个US进行设计以便确定不同情形是否改进反应效率和对于KRAS野生型G12或点突变G12V的特异性。
6.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向KRAS基因的野生型G12或突变体G12V等位基因加经由PASS引物引入的任何cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列(插入物i1、i2或i3)。粗体和斜体形式的碱基表示变体碱基。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：18  部分酶B KRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：19  部分酶A G12_i1A/55-P：
CACAATCAGT ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：51  部分酶A G12_i2A/55-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：52  部分酶A G12_i3A/55-P：
CGTTGGCTAC ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：53  部分酶A G12V_i1A/55-P：
CACAATCAGT ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：22  部分酶A G12V_i2A/55-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：54  部分酶A G12V_i3A/55-P：
CGTTGGCTAC ACAACGAGAGGTGCGGT
6.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)上的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列5’至3’的顺序。
SEQ ID NO：25  底物Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
6.3.用于扩增KRASDNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行人gDNA中的KRAS基因的体外扩增。PASS引物被设计成使得对于野生型具有特异性的正向引物包含US插入物i1、i2、i3或i3a，并且对于突变体具有特异性的正向引物包含US插入物i1、i2或i3。在以下序列中，粗体形式的碱基与靶序列杂交，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列，并且粗体且加下划线的碱基是变体碱基。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：26  反向引物3KRAS：
SEQ ID NO：27  正向PASS引物5G12_1i1环：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：28  正向PASS引物5G12_1i1平面：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：55  正向PASS引物5G12_1i2环：
AGACATACTA
SEQ ID NO：56  正向PASS引物5G12_1i2平面：
AGACATACTA
SEQ ID NO：57  正向PASS引物5G12_1i3环：
CGTTGGCTAC
SEQ ID NO：58  正向PASS引物5G12_1i3a平面：
ACGTTGGCTAC
SEQ ID NO：59  正向PASS引物5G12V_1i1环：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：60  正向PASS引物5G12V_1i1平面：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：35  正向PASS引物5G12V_1i2环：
AGACATACTA
SEQ ID NO：36  正向PASS引物5G12V_1i2平面：
AGACATACTA
SEQ ID NO：61  正向PASS引物5G12V_1i3环：
CGTTGGCTAC
SEQ ID NO：62  正向PASS引物5G12V_1i3平面：
CGTTGGCTAC
6.4.靶序列
从K562细胞系提取的人gDNA用作体外扩增野生型KRAS基因的模板并且从SW620细胞系提取的人gDNA用于体外扩增含有点突变G12V的KRAS。
6.5.反应组成：靶序列的扩增和检测
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃ 2分钟、95℃ 15秒和64℃ 60秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃ 15秒和54℃ 50秒的40次循环(在54℃收集数据)。所有反应重复进行两次并且包括40nM正向引物和100nM部分酶A(表9中所概括的组合)、200nM反向引物(3KRAS)、200nM部分酶B(KRAS_B/55-P)、200nM底物(Sub55-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及K562或SW620gDNA模板(50ng)或无靶标(NF H2O)。
表9：用于野生型和突变体的引物和部分酶组合
6.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
含有不同US的PASS引物用于产生用以实时检测KRAS野生型和点突变(G12V)的扩增子。这一反应显示当所使用的靶序列是经由PCR扩增的测试人gDNA(分别为K562和SW620)时荧光随时间推移而增加。无模板对照的荧光低于含有DNA靶标的反应中的荧光并且在反应过程中未增加。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于随后裂解报道底物的催化活性MNA酶的靶标依赖性组装。
在含有包含US插入物i1、i2、i3(环)或i3a(平面)的野生型G12PASS引物(平面或环)的反应中，“测试”DNA(K562)的Ct值指示K562中野生型KRAS等位基因的成功扩增和检测，而阴性对照(SW620)的信号的缺乏指示用这些系统未检测到突变体等位基因。含有US插入物i3或i3a的PASS引物测定(环和平面)具有比US插入物i1和i2低的Ct(表10)。
表10：用于野生型和突变体测定的PASS引物与部分酶组合的Ct值
在含有包含US插入物i1、i2或i3的G12V PASS引物(平面或环)的反应中，“测试”DNA(SW620)的Ct值指示SW620中突变体KRAS等位基因的成功扩增和检测。阴性对照(K562)的信号达到如表10中所示的阈值Ct值，从而指示当使用野生型模板时产生一些背景信号，然而，ΔCt值足够高以允许突变序列与野生型序列的清楚区别。含有US插入物i3的PASS引物测定(环或平面)具有比US插入物i1和i2稍微低的Ct(表10)，然而在US插入物i2的情况下ΔCt较大。
总之，所有三种US插入物适合用于分析野生型和突变KRAS靶序列两者。结果中存在差异，其中在野生型测定中观察到比突变体测定中稍微更大的变化性，这由所获得的Ct值的更大范围证明。对于两种测定来说，并入US插入物i3导致更低Ct值，而并入US插入物i2导致更高Ct值。然而，所述实验证明多种不同的独特插入序列可用于扩增和检测同一靶标或不同靶标。如此，独特序列还可被视为通用独特序列，因为它们可被并入大量分析测定中。
实例7：比较被设计成扩增补体链的PASS引物的特异性和灵敏度与使用被设计成在标准和快速热循环条件下扩增KRAS的反向补体的PASS引物所获得的特异性和灵敏度
在之前实施例中，被设计成特异性地扩增被称为G12V的密码子12中的KRAS点突变的PASS引物靶向补体链。这导致PASS引物以胸腺嘧啶(T)结束并且具有与野生型KRAS序列的T:C错配。如果PASS引物被设计成靶向反向链，那么PASS引物然后将以A结束，从而将与野生型的错配改变成A:G。
在这个实施例中，扩增G12V的补体链的测定使用PASS引物(5G12V_LM3i2平面，SEQ ID NO.40)，其已显示在之前实施例中稳健地和特异性地作用；并且将这一测定与扩增G12V的反向补体链(rcG12V)的测定(5rcG12V_LM3i1环，SEQ ID No.66)相比较，其提供用于扩增rcG12V的稳健和灵敏的PASS引物。将PASS引物与MNA酶qPCR组合，其中MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与独特序列的补体(cUS)以及含有变体(突变体)碱基和错配的碱基的补体的扩增的靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶相邻地结合在扩增的目标靶序列内。此外，将快速热循环方案与在之前实验中已使用的标准方案相比较以便评估对特异性的任何影响。
使用两种热循环条件来比较用于扩增补体链或反向补体链的PASS引物(两种均并入设计3的形式(图7))以便研究每种策略的效率、线性以及灵敏度。
7.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向G12V序列的补体或反向补体(rc)以及通过PASS引物引入的任何错配和cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列(G12V插入物i2和rcG12V插入物i1)。所述部分酶A具有较长的(L)靶特异性区。粗体和斜体形式的碱基表示变体(突变体)碱基并且加下划线和斜体形式的碱基表示另外错配的碱基。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：18  部分酶B KRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：24  部分酶A G12V_LMi2A/55-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：63  部分酶B rcKRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：64  部分酶A rcG12V_LMi1A/55-P：
ACAATCAGT ACAACGAGAGGTGCGGT
7.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列5’至3’的顺序。小写体碱基表示RNA并且大写体碱基表示DNA。
SEQ ID NO：25  底物Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
7.3.用于扩增KRASDNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行人gDNA的体外扩增。在以下序列中，粗体形式的碱基与靶序列杂交，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列(G12V插入物i2和rcG12V插入物i1)，粗体且加下划线的碱基是变体碱基，并且斜体形式的碱基表示与两个靶标错配(M)的另外碱基。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：26  反向引物3KRAS_3：
SEQ ID NO：87  正向PASS引物5G12V_LM4i2平面：
AGACATACTA
SEQ ID NO：65  反向引物3rcKRAS：
SEQ ID NO：66  正向PASS引物5rcG12V_LM3i1环：
CACAATCAGT
7.4.靶序列
从SW480细胞系提取的人gDNA用作体外扩增点突变G12V的模板。通过在从K562细胞系提取的野生型gDNA的恒定背景下连续稀释SW480来制作校准曲线。从细胞系Calu1、A549、MDA-MB231以及HCT116提取的人gDNA分别用作其它KRAS变体G12C、G12S、G13D以及的G13D的阴性对照模板。
7.5.反应组成：靶序列的扩增和定量
靶序列的实时扩增和定量在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是：
1)“标准”热循环：95℃ 2分钟、95℃ 15秒和64℃ 60秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃ 15秒和54℃ 50秒的40次循环(在54℃步骤收集数据)或
2)“快速”热循环：95℃ 2分钟、95℃ 5秒和64℃ 20秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃ 5秒和54℃ 20秒的40次循环(在54℃步骤收集数据)。
反应用如表11中的引物和部分酶建立。每组反应条件重复两次进行测试并且包括40nM正向引物、200nM反向引物、100nM部分酶A、200nM部分酶B、200nM底物(Sub55-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及SW480gDNA模板(35ng)、或在K562gDNA模板的恒定背景下1∶10、1∶100或1∶1000稀释的SW480gDNA模板(35ng)，或阴性对照K562、Calu1、A549、MDA-MB231以及HCT-116的gDNA(35ng)或无靶标(NF H2O)。
表11：用于变体测定的引物/部分酶组合
7.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
对于所有反应来说，无模板对照的荧光低于含有DNA靶标的反应中的荧光。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于随后裂解通用报道底物的催化活性MNA酶的靶标依赖性组装。
被设计成扩增补体链或反向补体链的正向PASS引物用于产生用以实时检测和定量KRAS点突变G12V的扩增子。MNA酶被设计成对于所述补体链或所述反向补体链具有特异性并且通过特异性PASS引物引入的相关US用于检测突变序列。这一反应显示当反应包含对于G12V具有特异性的靶序列时荧光随时间推移而增加(表12)。
表12：G12V对比rcG12V PASS引物测定的Ct值
^2个复制中的仅一个产生信号；Ct值未进行平均化。
将对于G12V具有特异性的SW480DNA模板在野生型K562模板的背景下连续稀释10倍。将DNA的连续稀释液用补体或反向补体正向PASS引物进行扩增。当在野生型模板的背景下1∶1000稀释时，两种引物组均能够检测G12V序列。通过将DNA浓度的对数相对于阈值循环作图、从而产生线性曲线图来产生两种PASS引物的标准曲线，每种稀释液的Ct在表12中示出。所述表中所示的Ct值是重复两次反应的结果的平均值。每个靶标的相关系数(R2)和反应效率也在表12中示出。
在标准热循环条件下，针对补体链设计的PASS引物的最高标准(35ng)与阴性对照野生型(K562)、G12C(Calu1)、G12S(A549)以及G13D(MDA-MB231和HCT116)的信号之间的Ct差异(ΔCt)小于针对反向补体链(rcG12V)设计的PASS引物。此外，rcG12V测定的一些阴性对照未产生Ct值(表12)。这指示rcG12V PASS引物测定在这些实验条件下可能是特异性更高的。
对于G12V测定和rcG12V测定两者来说，当将在快速热循环条件下与标准热循环条件下产生的Ct值相比较时，存在ΔCt的增加，这指示在这些实验条件下较短循环时间改进两种反应的特异性(表12)。然而，对于rcG12V测定来说，更快循环时间降低反应的效率和线性(表12)。
用于扩增和检测G12V的补体和反向补体PASS引物测定展示良好灵敏度，从而在标准和快速热循环两者条件下在1000野生型(约10,000个拷贝)的背景下检测到低至1的G12V(约10个拷贝)。总之，rcG12V测定比G12V特异性更高。减少循环时间降低rcG12V反应的线性和效率，而更快循环时间增加G12V测定的特异性而不影响线性和效率。
这个实施例证明用于单碱基变化的测定的特异性可受PASS引物所结合和扩增的链影响。此外，修改实验条件如循环时间可用于改进反应的特异性。
实施例8：研究在PASS引物的成环的独特序列下方的靶序列中未结合的碱基的数目的影响
在这个实施例中，被称为rcG12V的密码子12中的KRAS点突变的反向补体链用于测试环PASS引物，所述环PASS引物被设计成在S1与S2之间的环下方的靶序列中包含0、1、2、3、4或5个未结合的碱基空位(在先前实施例中，在S1与S2之间存在一个或不存在碱基空位)。使用rcG12V的两种不同的设计，(i)变体碱基“A”位于3’端处的3’靶特异性区(S2)中并且S2具有26℃的Tm，并且错配为在变体碱基的5’端的插入的2个碱基(图7，设计3)；和(ii)变体碱基“A”位于3’靶特异性区(S2)中、距离3’端3个碱基，并且S2具有20℃的Tm，并且错配为在变体碱基的5’端的插入2个碱基(图7，设计4)。
将PASS引物与MNA酶qPCR组合，其中MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与独特序列的补体(cUS)、变体碱基和错配碱基以及扩增的靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶相邻地结合，从而与扩增的目标靶序列杂交。
将当与靶序列结合时在S1与S2之间具有不同大小空位的PASS引物针对其区别靶G12与G12V之间的单碱基变化的能力进行比较。
8.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向G12V序列的反向补体以及经由PASS引物引入的任何错配和cUS的扩增子。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列。粗体和斜体形式的碱基表示变体碱基并且加下划线且呈斜体形式的碱基表示另外的错配碱基。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：63  部分酶BrcKRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：67  部分酶A rcG12V_M3i2A/55-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：68  部分酶A rcG12V_M4i2A/55-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
8.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列5’至3’的顺序。
SEQ ID NO：25   底物Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
8.3.用于扩增KRASDNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行人gDNA的体外扩增。PASS引物被设计成使得G12V特异性正向引物包含US(插入物i2)。在以下序列中，粗体形式的碱基与靶序列杂交，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列，粗体且加下划线的碱基是变体碱基，斜体的碱基表示另外的错配碱基(M)，并且在词语环之后的括号中的数目指示在S1与S2之间的靶序列中未结合的碱基的数目。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：69 反向引物3rcKRAS_2：
SEQ ID NO：70 正向PASS引物5rcG12V_M3i2环(1)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：71 正向PASS引物5rcG12V_M3i2环(2)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：72正向PASS引物5rcG12V_M3i2环(3)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：73正向PASS引物5rcG12V_M3i2环(4)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：74 正向PASS引物5rcG12V_M4i2环(0)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：75 正向PASS引物5rcG12V_M4i2环(1)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：76 正向PASS引物5rcG12V_M4i2环(2)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：77 正向PASS引物5rcG12V_M4i2环(3)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：78 正向PASS引物5rcG12V_M4i2环(4)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：79 正向PASS引物5rcG12V_M4i2环(5)：
AGACATACTA
8.4.靶序列
从K562细胞系提取的人gDNA用作体外扩增野生型基因的模板并且从SW620细胞系提取的人gDNA用于体外扩增点突变G12V。
8.5.反应组成：靶序列的扩增和检测
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和64℃60秒的10次循环(每循环减1℃)、95℃15秒和54℃50秒的40次循环(在54℃步骤收集的数据)。所有反应重复进行两次并且包括40nM正向引物和100nM部分酶A(表13中所概括的组合)、200nM反向引物(3rcKRAS_2)、200nM部分酶B(rcKRAS_B/55-P)、200nM底物(Sub55-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及K562或SW620gDNA模板(50ng)或无靶标(NF H2O)。
表13：用于变体测定的引物/部分酶组合
8.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
使用PASS引物扩增、接着使用引物特异性部分酶检测的结果在表14中示出。
表14：rcG12V环PASS引物组合的Ct值
^2个复制中的仅一个产生信号；Ct未进行平均化。
在所有组合中，与突变体变体匹配的PASS引物扩增测试SW620DNA中的G12V等位基因，并且这通过与突变体和US2匹配的部分酶检测。当没有添加模板(无DNA)时，使用任何引物/部分酶对都没有检测到扩增。这种突变体PASS引物/部分酶系统优先地扩增并且检测突变体等位基因，并且当使用阴性对照模板(K562)时仅一个组合产生信号(表14)。
当比较与位于PASS引物的环区域下方的靶序列未结合的不同碱基空位(1至4)时，基于设计3(图7)、具有26℃的Tm的PASS引物显示G12V靶序列的扩增中非常小的差异(表14)。
当3、4或5个碱基空位出现在PASS引物的环区域下方时，基于设计4(图7)、具有20℃的Tm的PASS引物展示改进的Ct值。然而，这还导致检测到阴性对照(野生型)反应的信号，虽然具有12.9的ΔCt(表14)。这可指示具有更短S2区的PASS引物可受益于在S1与S2之间与环区下方的靶序列未结合的大量碱基空位的存在；而具有更长且更高Tm的S2区的PASS引物，在S1与S2之间环区下方的碱基空位的数目具有很小影响。
总之，这个实验组合之前实验证明可存在设计的灵活性，并且环PASS引物可在位于引物的S1区和S2区的补体之间的靶标的区中的各种数量的未结合的碱基的情况下起作用。
实施例9：当PASS引物和WE-ARMS引物在被设计成检测序列中的单碱基变化的测定中均与MNA酶组合时比较两种引物类型的交叉反应性
用WE-ARMS引物扩增变体(突变体)序列产生将与野生型序列在变体碱基和添加的错配碱基方面不同的扩增子。相比之下，用PASS引物扩增突变序列产生将与野生型序列不仅在突变体和错配碱基方面而且在插入的US方面不同的扩增子。当通过MNA酶实时检测通过WE-ARMS引物扩增的突变体扩增子时，部分酶A将与野生型序列仅在突变体和错配碱基方面不同，而对于通过PASS引物产生的扩增子来说，部分酶A还将包含与原始野生型序列不同的US。此外，如果希望还扩增和检测同一孔中的野生型，那么可使用与突变体相比不同的US，从而产生更大的序列多样性并且改进MNA酶区别突变体扩增子和野生型扩增子的能力。
在这个实施例中，当对于突变体具有特异性的引物与对于野生型具有特异性的部分酶A混合(反之亦然)时，针对任何交叉反应性对WE-ARMS和PASS引物系统进行测试。这涉及扩增被称为rcG12V的密码子12中的KRAS点突变的反向补体和野生型KRAS序列的反向补体rcG12。PASS引物被设计成对于rcG12V或rcG12序列具有特异性。突变体的变体碱基位于3’端处的3’靶特异性区(S2)中，并且错配碱基为从3’端处插入的4个碱基。野生型的变体碱基位于从3’端3个碱基，其中错配碱基为从3’端处插入的5个碱基。不同的US包含在用于野生型(插入物i4)序列和突变(插入物i1)序列的PASS引物中。将这些PASS引物与摆动增强的ARMS(WE-ARMS)引物进行比较(参见Hamfjord等人(2011)，“Wobble-enhanced ARMS Method for Detectionof KRAS and BRAF Mutations”，Diagn Mol Pathol；20：158-165)，其中设计了对于rcG12V或rcG12具有序列特异性的引物，加它们包含相对于两种等位基因诱导的错配以便帮助区别因单碱基而不同的KRAS序列。对于这个实施例中使用的WE-ARMS引物来说，变体(突变体或野生型)碱基位于3’端处并且错配为从3’端处插入的5个碱基。
将PASS引物与MNA酶qPCR组合，其中MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与独特序列的补体(cUS)、变体碱基(野生型或突变的)和错配的碱基以及扩增的靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶相邻地结合，从而与扩增的目标靶序列杂交。将WE-ARMS引物与MNA酶组合，其中第一部分酶与含有变体碱基(野生型或突变的)和错配碱基的补体的扩增的靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶相邻地结合，从而与扩增的目标靶序列杂交。
将PASS引物与WE-ARMS引物针对其在所述引物与部分酶错配时交叉反应的能力相比较。
9.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向rcG12或rcG12V序列和经由引物引入的任何错配以及经由PASS引物引入的cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列(野生型插入物i4和变体插入物i1)。一些部分酶A具有较长的(L)3’靶特异性区。粗体和斜体形式的碱基表示变体碱基(野生型或突变的)并且加下划线和斜体形式的碱基表示另外错配的碱基。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：63  部分酶B rcKRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：80  部分酶A rcG12_LMi4A/55-P：
TCAATACCAT ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：88  部分酶A rcG12V_LMa4i1A/55-P：
ACAATCAGT ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：81  部分酶A rcG12_MA/55-P：
ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：82  部分酶A rcG12V_MA/55-P：
ACAACGAGAGGTGCGGT
9.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列5’至3’的顺序。
SEQ ID NO：25   底物Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
9.3.用于扩增KRASDNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行人gDNA的体外扩增。PASS引物被设计成使得rcG12特异性正向引物包含US插入物i4，并且rcG12V特异性正向引物包含US插入物i1。一些正向引物具有较长的(L)靶特异性区。在以下序列中，粗体形式的碱基与靶序列杂交，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列，并且粗体且加下划线的碱基是变体碱基，并且斜体形式的碱基表示与两个靶标错配(M)的另外碱基。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：69  反向引物3rcKRAS_2：
SEQ ID NO：83  正向PASS引物5rcG12_LM4i4环：
TCAATACCAT
SEQ ID NO：99  正向PASS引物5rcG12V_LM3a4i1环：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：84  正向WE-ARMS引物5rcG12_M：
SEQ ID NO：85  正向WE-ARMS引物5rcG12V_M：
9.4.靶序列
从K562细胞系提取的人gDNA用作体外扩增野生型基因的模板并且从SW480细胞系提取的人gDNA用于体外扩增点突变G12V。
9.5.反应组成：靶序列的扩增和检测
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃5秒和64℃20秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃5秒和54℃20秒的50次循环(在54℃步骤收集数据)。所有反应重复进行两次并且包括40nM正向引物和100nM部分酶A(表15中所概括的组合)、200nM反向引物(3rcKRAS_2)、200nM部分酶B(rcKRAS_B/55-P)、200nM底物(Sub55-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及K562或SW480gDNA模板(50ng)或无靶标(NF H2O)。
表15：用于野生型和变体的引物/部分酶组合
9.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
使用PASS引物和WE-ARMS引物扩增、接着使用引物特异性部分酶或错配的部分酶检测的结果在表16中示出。
表16：G12与G12V组合的Ct值
^仅一个复制产生信号；Ct未进行平均化。
与野生型的反向补体链匹配的PASS引物扩增测试(K562)DNA中的rcG12等位基因并且这通过与野生型和US插入物i4匹配的部分酶检测。反向补体野生型PASS引物/部分酶系统优先地扩增并且检测野生型等位基因，并且当在这些实验条件下使用阴性对照模板(SW480)时在反应后期产生信号。野生型(K562)的Ct与从突变体(SW480)DNA产生的Ct之间的Ct差异是12个循环(表16)，从而证明PASS引物和匹配的部分酶允许区别突变体等位基因与野生型等位基因。当对于变体突变体和US插入物i1具有特异性的错配的部分酶与野生型PASS引物结合使用时没有观察到交叉反应性(表16)。
与野生型匹配的WE-ARMS引物扩增测试(K562)DNA中的rcG12等位基因，并且这通过与野生型匹配的部分酶检测。这种野生型ARMS引物/部分酶系统对于野生型等位基因具有特异性并且当使用阴性对照模板(SW480)时产生晚期信号。野生型(K562)的Ct与从突变体(SW480)DNA产生的Ct之间的Ct差异大于22个循环(表16)。当对于变体突变体具有特异性的错配的部分酶与野生型WE-ARMS引物结合使用时观察到交叉反应性。错配反应的Ct与匹配反应的Ct类似，从而指示被设计成对于变体突变体具有特异性的部分酶在所述反应条件下不能区别由WE-ARMS引物产生的野生型扩增子和突变体扩增子(表16)。
与突变体变体的反向补体链匹配的PASS引物扩增测试(SW480)DNA中的rcG12V等位基因并且这通过与突变体和US插入物i1匹配的部分酶检测。这种突变体PASS引物/部分酶系统特异性地检测突变体等位基因并且当使用阴性对照模板(K562)时没有产生信号。当对于野生型和US插入物i4具有特异性的部分酶与突变体PASS引物结合使用时没有观察到交叉反应性(表16)。
与突变体变体的反向补体匹配的WE-ARMS引物扩增测试(SW480)DNA中的rcG12V等位基因，并且这通过与突变体匹配的部分酶检测。这种突变体WE-ARMS引物/部分酶系统特异性地检测突变体等位基因并且当分析阴性对照模板(K562)时没有产生信号。当对于野生型具有特异性的错配的部分酶与野生型WE-ARMS引物结合使用时观察到交叉反应性。错配反应的Ct是比匹配反应稍后约9Ct，从而指示被设计成对于变体突变体具有特异性的部分酶在所述反应条件下具有较差的区别由WE-ARMS引物产生的野生型扩增子和突变体扩增子的能力(表16)。
当没有添加模板(无DNA)时，使用任何引物/部分酶对都没有检测到扩增。
这个实施例中的数据证明PASS引物以优于本领域熟知的用于检测单基因变化的替代技术(WE-ARMS)进行的能力。此外，当部分酶将要区别两个密切相关的序列时(可能在多重qPCR出现的情形)，通过PASS引物将US引入到扩增子中提供增加水平的特异性。PASS引物允许将另外的独特序列引入到扩增子中。不同的独特序列被引入到野生型扩增子和突变体变体扩增子中。这种另外序列增强所述差异并且防止部分酶对替代扩增子的交叉反应性，例如野生型PASS扩增子不能被匹配突变体PASS扩增子的部分酶检测到，并且反之亦然。这使得所述测定能够在多重反应中组合并且鉴别变体和野生型。相比之下，存在于野生型扩增子和突变体WE-ARMS扩增子与其完全匹配的部分酶之间的仅两个碱基的小差异不足以防止部分酶对替代扩增子的的交叉反应性，例如野生型WE-ARMS扩增子通过匹配突变体WE-ARMS扩增子的部分酶检测到，并且反之亦然，因此它们不能在多重反应中进行组合。
实施例10：PASS引物的S2区的长度对靶序列的扩增的影响
PASS引物中存在多个区，为US的5’的S1被设计成使PASS引物固着至目标靶序列，为独特序列的3’的S2提供PASS引物的起始部分，以及位于S1与S2之间的US。在这个实施例中，US将独特序列的一个区插入到扩增子中(图1)。所有区可针对具体应用通过加长或缩短其序列进行定制。
在这个实施例中，研究当与MNA酶检测组合以在qPCR中读出时PASS引物的S2区的长度对CCB基因的扩增的影响。PASS引物和部分酶被设计成确定PASS引物的S2结构域的长度的不同情形是否与CCB基因的扩增和检测相容。PASS引物(含有环或平面US)的S2结构域的长度从3’端改变并且是3、4、5、6或7个碱基长或从5’端改变并且是5、6或7个碱基长。
10.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向CCB基因和经由PASS引物引入的cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基与cUS杂交。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：86  部分酶B CCBB/2-P：
TGCCCAGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：89  部分酶A CCB_2i2A/2-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：90  部分酶A CCB_2i2L5_6A/2-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：91  部分酶A CCB_2i2L5_5A/2-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：92  部分酶A CCB_2i2P5_6A/2-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：93  部分酶A CCB_2i2P5_5A/2-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGAAACCTT
10.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在485nm(FAM激发波长)下激发，在530nm(FAM发射波长)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：94    底物Sub2-FIB：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
10.3.靶序列和用于扩增CCB DNA的PCR引物
用于这一实施例的靶序列是从IM9细胞系(Promega)提取的人gDNA中的CCB基因。寡核苷酸PASS引物在以下列出。在以下序列中，加下划线的碱基是US插入物i2。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：7     反向引物3CCB：
CTCAGGAATTTCCCAGCTAC
SEQ ID NO：13    正向PASS引物5CCB_2i2环：
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：95    正向PASS引物5CCB_2i2环3_6：
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCAGAG
SEQ ID NO：96    正向PASS引物5CCB_2i2环3_5：
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCAGA
SEQ ID NO：97    正向PASS引物5CCB_2i2环3_4：
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCAG
SEQ IDNO：98     正向PASS引物5CCB_2i2环3_3：
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCA
SEQ ID NO：14    正向PASS引物5CCB_2i2平面：
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：100   正向PASS引物5CCB_2i2平面3_6：
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAGAG
SEQ ID NO：101   正向PASS引物5CCB_2i2平面3_5：
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAGA
SEQ ID NO：102   正向PASS引物5CCB_2i2平面3_4：
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAG
SEQ ID NO：103    正向PASS引物5CCB_2i2平面3_3：
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCA
SEQ ID NO：104    正向PASS引物5CCB_2i2环5_6：
CTTCTTGGATGGTCATCTCAGACATACTACAGAGC
SEQ ID NO：105    正向PASS引物5CCB_2i2环5_5：
TTCTTGGATGGTCATCTCCAGACATACTAAGAGC
SEQ ID NO：106    正向PASS引物5CCB_2i2平面5_6：
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAAGACATACTACAGAGC
SEQ ID NO：107    正向PASS引物5CCB_2i2平面5_5：
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGATAGACATACTAAGAGC
10.4.反应组成：靶序列的扩增和检测
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在Mx3005p(Stratagene)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和55℃30秒的5次循环、95℃15秒和52℃60秒的40次循环(在52℃步骤收集数据)。所有反应重复进行两次并且包括40nM正向引物和200nM部分酶A(表17中所列出的组合)、200nM反向引物(3CCB)、200nM部分酶B(CCBB/2-P)、200nM底物(Sub2-FIB)、8mMMgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafeRNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及gDNA模板(50ng)或无靶标(NF H2O)。
表17：正向PASS引物和部分酶A组合
10.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
PASS引物用于产生用以实时检测和定量CCB的扩增子并且部分酶与cUS和扩增的靶特异性序列两者结合。这一反应显示当所使用的靶序列是经由qPCR扩增的人gDNA时荧光随时间推移而增加。无DNA靶标对照物的荧光低于含有DNA靶标的反应中的荧光并且在反应过程中不增加。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于随后裂解报道底物的催化活性MNA酶的靶标依赖性组装。
表18：PASS引物与部分酶组合的Ct值
当含有成环的US的正向PASS引物的S2区从3’端在长度上从7个碱基减少至6和5个碱基时，所述更短引物仍然产生可检测信号，然而Ct分别增加5.2和8.7(表18)。从3’端任何进一步减少S2在所测试的反应条件下未产生可检测信号。当环PASS引物的S2区从5’端从7个碱基减少至6个碱基时，Ct增加2.5，然而进一步减少长度导致在所测试的反应条件下无可检测信号。
当含有平面的US的正向PASS引物的S2区从3’端在长度上从7个碱基减少至6和5个碱基时，所有引物仍然产生可检测信号，其中对Ct值具有很小影响(表18)。从3’端将S2进一步减少至4和3个碱基仍然产生可检测信号，然而Ct分别增加1.8和4.3(表18)。当平面PASS引物的S2区从5’端从7个碱基减少至6和5个碱基时，仍然产生可检测信号而不显著影响Ct值(表18)。
作为对照，将对于缩短的PASS引物具有特异性的部分酶与较长的PASS引物组合，并且反之亦然。这导致碱基从扩增子或从部分酶环出。对于环PASS引物和平面PASS引物两者来说，当仅一个碱基从扩增子或部分酶环出时，仅存在约1的Ct较小增加，除了其中1个碱基环出部分酶的环PASS引物的Ct在这些实验条件下增加3.1。此外，当部分酶或扩增子包含2个碱基的环出区时，Ct增加约5至6Ct，除了其中2个碱基环出部分酶的环PASS引物在这些实验条件下不具有可检测信号。
总之，当PASS引物包含呈平面形式的US时，S2区可减少至4个碱基，而不过度影响反应的效率(Ct值)。然而，当PASS引物包含呈环形式的US时，使S2区减少即使1个碱基，这也对Ct值具有显著影响。应注意对于环PASS引物来说，在环区域下在S1与S2之间不存在可增加反应的严格度的空位。
这一实验的观察结果证明在遵循环或平面形式的PASS引物的区的设计中存在相当大的灵活性。任何区的最佳长度将取决于靶序列、具体应用和实验条件，包括但不限于缓冲液、盐浓度、反应温度、循环次数以及其它因素。
实施例11：对改变PASS引物内包含的US插入物的长度的研究
在这个实施例中，研究PASS引物中的US插入物的长度以便确定对扩增效率的影响。在之前实施例中，USI是10个碱基长。
设计了包含为8、9、10、12或13个碱基长的成环的US或为10、12、13、17、22或29个碱基长的平面US的PASS引物。将每个PASS引物与MNA酶检测组合以在qPCR中读出以便确定PASS引物中的US插入物的长度的不同情形是否与CCB基因的扩增和检测相容。
11.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向CCB基因和经由PASS引物引入的cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基与cUS杂交。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：86    部分酶B CCBB/2-P：
TGCCCAGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：89    部分酶A CCB_2i2A/2-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGAAACCTT
11.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在485nm(FAM激发波长)下激发，在530nm(FAM发射波长)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：94    底物Sub2-FIB：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
11.3.靶序列和用于扩增CCB DNA的PCR引物
用于这一实施例的靶序列是从IM9细胞系(Promega)提取的人gDNA中的CCB基因。寡核苷酸PASS引物在以下列出。在以下序列中，加下划线的碱基是US插入物。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：7    反向引物3CCB：
CTCAGGAATTTCCCAGCTAC
SEQ ID NO：13    正向PASS引物5CCB_2i2环：
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：108    正向PASS引物5CCB_2i2(-1)环_US9：
TTCTTCTTGGATGGTCATCTGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：109    正向PASS引物5CCB_2i2(-2)环_US8：
TTCTTCTTGGATGGTCATCTACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：110    正向PASS引物5CCB_2i2(+2)环_US12：
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAAAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：111    正向PASS引物5CCB_2i2(+3)环_US13：
TTCTTCTTGGATGGTCATCTCAAAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：14    正向PASS引物5CCB_2i2平面：
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：112    正向PASS引物5CCB_2i2(+2)平面_US12：
TCTCTTGTCTCAGTTCTTCTTAAAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：113    正向PASS引物5CCB_2i2(+3)平面_US13：
GTCTCTTGTCTCAGTTCTTCTCAAAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：114    正向PASS引物5CCB_2i2(+7)平面_US17：
CTCAAGTCTCTTGTCTCAGTTCCCGACAAAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：115    正向PASS引物5CCB_2i2(+12)平面_US22：
GGCTCTCAAGTCTCTTGTCTCCAAGTCCGACAAAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：116    正向PASS引物5CCB_2i2(+19)平面_US29：
TCTGGGGGCTCTCAAGTCTCCATGACACAAGTCCGACAAAGACATACTACCAGAGC
11.4.反应组成：靶序列的扩增和检测
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在Mx3005p(Stratagene)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和55℃30秒的5次循环、95℃15秒和52℃60秒的40次循环(在52℃步骤收集数据)。反应重复进行两次并且包括40nM正向PASS引物、200nM部分酶A(CCB_2i2A/2-P)、200nM反向引物(3CCB)、200nM部分酶B(CCBB/2-P)、200nM底物(Sub2-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及gDNA模板(50ng)或无靶标(NF H2O)。
11.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
PASS引物用于产生用以经由与cUS和扩增的靶特异性序列两者互补的部分酶实时检测CCB的扩增子。这一反应显示当所使用的靶序列是经由qPCR扩增的人gDNA时荧光随时间推移而增加。无DNA靶标对照物的荧光低于含有DNA靶标的反应中的荧光并且在反应过程中不增加。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于随后裂解报道底物的催化活性MNA酶的靶标依赖性组装。
表19：不同PASS引物的Ct值
当正向PASS引物包含成环的US时，将US的长度减少至9和8个碱基不影响Ct值，并且可检测信号与针对含有10个碱基的US插入物的原始PASS引物所观察到的类似(表19)。同样，将US增加至12个碱基不影响Ct值，然而当将US增加至13个碱基时在当前实验条件下Ct值稍微增加(表19)。
当正向PASS引物包含为平面的US时，将US的长度增加至高达22个碱基对Ct值具有最小影响(表19)。将US增加至29个碱基使Ct值增加1.2，从而显示在当前实验条件下对靶序列的扩增的轻微影响(表19)。
应注意，在这个实施例中，相同MNA酶用于测试所有US大小，无论US是呈环还是平面形式。这去除了用不同的MNA酶可能遇到的任何可变性并且产生纯粹反映PASS引物的扩增效率的结果。
这一实验的观察结果证明在遵循环或平面形式的PASS引物内的US插入物的长度的设计中存在相当大的灵活性。
实施例12：PASS部分酶用于跳过相关扩增子中的变体序列的用途。
将PASS部分酶与变体特异性引物在MNA酶qPCR反应中进行组合。以与PASS引物类似的方式，PASS部分酶还可被设计成包含相对于起始模板靶序列错配的区(图10)。在这个实施例中，引物被设计成特异性地扩增缺失变体序列而不是野生型序列，并且MNA酶包含在扩增的目标靶序列上相邻地结合的第一PASS部分酶和第二完全匹配的“标准”部分酶。所述PASS部分酶包含不与所述靶序列互补的序列区，即独特序列(US)，其被设计成对准其中变体序列包含于扩增子中的地方，以使得一个MNA酶可用于检测所有变体。存在于PASS部分酶中的US可呈平面形式，其中PASS部分酶中的非互补碱基的数目匹配靶序列中未结合的碱基的数目(图10，图片ii(a))。或者，当PASS部分酶中的非互补碱基的数目大于或小于靶序列并且所述序列凸起或环出时存在于所述部分酶中的US可以是成环的(图10，图片ii(b))。由部分酶组分形成活性MNA酶导致用荧光团和淬灭剂染料对标记的通用探针的裂解，从而产生可实时监测的信号。
在这个实施例中，特异性引物被设计成扩增以下四种EGFR外显子19缺失变体中的每个：c.2236-2250del15(v4)、c.2239-2248＞C(v13)、c.2239-2253del15(v15)或c.2240-2257del18(v20)。每个变体序列包含不同长度的缺失序列，从而产生各自需要特异性5’引物的可变靶标，所述引物被设计成使得它们跨越不同的缺失接点。PASS部分A被设计成检测所有四种变体扩增子，因为PASS部分酶的US区被设计成与缺失扩增子的可变区对准。PASS部分A与v13形成平面形式并且与变体v4、v15以及v20形成环形式。扩增的变体用含有PASS部分酶A和“标准”部分酶B的MNA酶或含有完全匹配的标准部分酶A和B的MNA酶进行测定，所述完全匹配的标准部分酶与位于所有变体扩增子或由从野生型模板错误引发(如果发生这种情况)产生的任何扩增子中心的完全保守区域互补。这用作对照以便证明PASS部分酶中的US对MNA酶检测变体序列的特异性的作用。
12.1.部分酶寡核苷酸
设计了部分酶，所述部分酶为完全匹配的“标准”部分酶，其中感应臂与靶序列完全互补；或“PASS”部分酶，其中不与扩增子互补的序列(US)的区已被插入到感应臂中，在与所述扩增子互补的两个区之间。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于所有四种靶序列错配的独特序列(US)。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：117    部分酶B EGFR_1B/56-P：
TGGCGTGGAGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：118    部分酶A EGFR_1A/56-P：
AACGAGGGGTCGAG
SEQ ID NO：119    部分酶B EGFR_2B/56-P：
TGGCGTGGAGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：120PASS  部分酶A EGFR_2US15A/56-P：
CTCTAGCTGTAGCAT ACAACGAGGGGTCGAG
12.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列按5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：121    底物Sub56-FIB：
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
12.3.用于扩增EGFR DNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行质粒DNA的体外扩增。在以下序列中，加下划线的碱基是相对于野生型的变体碱基。正向引物是缺失特异性的并且反向引物对于所有来说是恒定的。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：122    反向引物3EGFR：
GCCTGAGGTTCAGAGCCATGG
SEQ ID NO：123    正向引物5EGFRv4：
TTAAA ATTCCCGTCGCTATCAAGAC
SEQ ID NO：124    正向引物5EGFRv13：
ATTCCCGTCGCTATCAAGGAACC
SEQ ID NO：125    正向引物5EGFRv15：
TCCCGTCGCTATCAAGGAATCTC
SEQ ID NO：126    正向引物5EGFRv20：
TCCCGTCGCTATCAAGGAATCGA
12.4.靶序列
含有对应于EGFR基因的外显子19的区的序列的DNA质粒用作模板(IDT)。质粒包含野生型序列或对应于以下EGFR外显子19缺失变体的序列：c.2236-2250del15(v4)、c.2239-2248＞C(v13)、c.2239-2253del15(v15)或c.2240-2257del18(v20)。按照制造商的说明在使用之前通过用限制酶EcoR1(Thermo Scientific)消化来将质粒线性化。
从IM9细胞系提取的基因组DNA用作表示人野生型EGFR DNA的对照DNA样品。
12.5.反应组成：靶序列的扩增
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和61℃60秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃15秒和52℃60秒的40次循环(在52℃步骤收集数据)。每组反应条件重复两次进行测试并且包括40nM缺失特异性正向引物、100nM部分酶A和200nM部分酶B，如表20中所概括。所有反应还包括200nM反向引物(3EGFR)、200nM底物(Sub56-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及v4(104个拷贝)或v13(104个拷贝)或v15(104个拷贝)或v20(104个拷贝)的质粒DNA模板；或野生型(WT)(104个拷贝)、或IM9gDNA(35ng)，或在IM9gDNA模板的恒定背景下约1∶100稀释的v4、v13、v15或v20质粒模板(100ng)或无靶标(NF H2O)。
表20：用于变体测定的正向引物、部分酶以及模板组合
12.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
对于所有反应来说，无模板对照的荧光低于含有DNA靶标的反应中的荧光。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于随后裂解通用报道底物的催化活性MNA酶的靶标依赖性组装。
缺失特异性正向引物用于产生用以实时检测EGFR缺失变体的扩增子。ΔCt用作引物/部分酶A组合的特异性的度量并且被计算为缺失扩增子的Ct与来自野生型模板的背景扩增的Ct之间的Ct差异。被设计来扩增缺失v4和v15的引物对于所述缺失表现出高特异性，其中在所有反应中ΔCt为9.6或更大。相比之下，被设计成对于v20缺失具有特异性的引物非特异性地表现，从而扩增v20和野生型序列两者。当使用标准部分酶时，被设计成对于v13具有特异性的引物对于野生型质粒和IM9gDNA分别产生6.6和4.8的ΔCt。
对于v4和v15PASS部分酶测定来说，当独自使用gDNA(IM9)模板时未产生信号并且WT质粒在变体模板之后产生＞15Ct的ΔCt。对于v20来说，WT质粒和IM9gDNA分别产生4.6和5.5的ΔCt，并且对于v13来说，WT质粒和IM9gDNA分别产生10.3和10.2的ΔCt(表21)。
表21：使用缺失特异性引物和通用MNA酶进行的MNA酶qPCR的Ct值
注意：当对于阴性对照样品来说未产生Ct时，50的最终Ct用于产生ΔCt并且放置在前面的大于符号(＞)指示ΔCt将预期高于这一值。
当变体模板1∶100稀释时，v4、v13和v15测定可检测缺失扩增子并且区别缺失扩增子与针对PASS和在一定程度上标准部分酶测定的非特异性野生型背景信号。
总之，使用标准部分酶用于检测扩增子的反应产生ΔCt，所述ΔCt小于通过PASS部分酶测定产生的ΔCt(表21)。这证明相对于使用标准部分酶，使用PASS部分酶极大地改进反应的特异性。此外，同一PASS部分酶(无论它是以环(V4、v15和v20)还是平面形式(v13)与扩增子结合)能够检测所有四种变体，不管所缺失的序列如何。这一测定中的MNA酶使用具有感应臂的一个部分酶，所述感应臂具有与所有四种缺失变体互补的两个区和与为扩增子之间的变体的区错配的一个区(US插入物)。如此，这种部分酶将预期以类似效率与所有四种扩增子结合，从而允许用一个MNA酶同时检测所有四种变体。
实例13：组合PASS部分酶与PASS引物以便跳过扩增子中的变体序列并且改进变体与野生型序列之间的区别。
另一种PASS PCR策略涉及PASS部分酶与PASS引物的组合以便在分析相关扩增子时进一步改进反应效率和特异性。这种策略涉及被设计成具有以下的PASS引物：(i)对于EGFR外显子19中的缺失变体具有特异性的S2，(ii)所有EGFR序列共用的S1区以及(iii)位于S1与S2之间的不与靶序列互补的第一US插入物(US1)(图11，图片(i))。所述策略还具有包含PASS部分酶A的MNA酶。PASS部分A的靶感应臂包含几个结构域，所述结构域包含(i)US1(与从PASS引物产生的所有扩增子匹配)，(ii)第二US插入物US2(与从PASS引物产生的所有扩增子错配)以及(iii)与靶标的起始序列互补的多个区。PASS部分酶的US2区不与扩增的靶序列互补，并且被设计成使得US2在扩增子上对准，其中序列由于不同缺失的存在而变化。当PASS部分酶与靶扩增子结合时它可形成平面或环出构象(图11，图片(ii))。
在这个实施例中，完全匹配的“标准”缺失特异性引物和缺失特异性PASS引物被设计来扩增EGFR外显子19缺失c.2235-2249del15(v2)。扩增的缺失变体用以下进行实时测定：(i)含有形成平面或环出US2但缺乏US1的PASS部分酶的MNA酶(用于与标准引物一起使用)或(ii)含有并入呈平面或环形式的US1和US2两者的PASS部分酶的MNA酶(用于与PASS引物一起使用)。
13.1.部分酶寡核苷酸
设计了部分酶，所述部分酶为(i)标准部分酶，其中感应臂与扩增子完全互补，(ii)仅含有替代US2插入物(指定为US15或US9；即不与靶扩增子互补的序列的区)的PASS部分酶或(iii)含有US2(US15或US9)和US1(i4)(其与通过PASS引物插入到扩增子中的cUS1结合)的PASS部分酶。此外，标准部分酶被设计来在不与扩增子的引物区重叠的区中结合在可变区外部的所有扩增子(变体和野生型)。PASS部分酶被设计来在用变体缺失特异性引物扩增时结合跨EGFR外显子19中的可变区的所有缺失变体扩增子。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于模板错配的第二独特序列插入物(US2)。加下划线且斜体的区表示通过PASS引物并入到扩增子中的US1(i4)。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：118    部分酶B EGFR_1A/56-P：
ACAACGAGGGGTCGAG
SEQ ID NO：117    部分酶B EGFR_1B/56-P：
TGGCGTGGAGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：119    部分酶B EGFR_2B/56-P：
TGGCGTGGAGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：120    PASS部分酶A EGFR_2US15A/56-P：
CTCTAGCTGTAGCAT ACAACGAGGGGTCGAG
SEQ ID NO：127    PASS部分酶A EGFR_2US9A/56-P：
CTGTAGCAT ACAACGAGGGGTCGAG
SEQ ID NO：128    PASS部分酶A EGFR_2i4US9A/56-P：
CTGTAGCAT ACAACGAGGGGTCGAG
SEQ ID NO：129    PASS部分酶A EGFR_2i4US15A/56-P：
CTCTAGCTGTAGCAT ACAACGAGGGGTCGAG
13.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列按5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：121    底物Sub56-FIB：
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
13.3.用于扩增EGFR DNA的PCR引物
使用以下所列出的缺失特异性寡核苷酸PCR引物来进行质粒DNA的体外扩增。在以下序列中，加下划线的碱基是变体碱基并且加下划线且斜体形式的碱基表示US1(i4)。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：122    反向引物3EGFR：
GCCTGAGGTTCAGAGCCATGG
SEQ ID NO：130    正向引物5EGFRv2：
AGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAA
SEQ ID NO：131    正向PASS引物5EGFRv2_i4：
GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAA
13.4.靶序列
含有对应于EGFR基因的外显子19的区的序列的DNA质粒用作模板(IDT)。质粒包含野生型序列或对应于EGFR缺失变体v2的序列。按照制造商的说明在使用之前通过用限制酶EcoR1(ThermoScientific)消化来将质粒线性化。从IM9细胞系提取的基因组DNA用作表示人野生型EGFR DNA的对照DNA样品。
13.5.反应组成：靶序列的扩增
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和61℃60秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃15秒和52℃60秒的40次循环(在52℃步骤收集数据)。每组反应条件重复两次进行测试并且包括40nM正向缺失特异性引物、100nM部分酶A以及200nM部分酶B，如表22中所概括。所有反应包括200nM反向引物(3EGFR)、200nM底物(Sub56-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及v2(104个拷贝)的质粒DNA模板、在IM9 gDNA模板的恒定背景下约1∶100稀释的v2质粒(102个拷贝)模板(35ng)或野生型质粒(WT)(104个拷贝)、或IM9 gDNA(35ng)或无模板(NF H2O)。
表22：用于变体测定的引物、部分酶和模板组合
13.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
对于所有反应来说，无模板对照的荧光低于含有DNA靶标的反应中的荧光。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于随后裂解通用报道底物的催化活性MNA酶的靶标依赖性组装。
当与含有标准引物和标准MNA酶的测定相比时，引物与含有PASS部分酶的MNA酶的所有组合产生更大特异性(表23)。v2的完全匹配的“标准”检测的ΔCt范围是6至7，其中野生型信号在1∶100稀释的样品之后仅约1至2Ct。
表23：使用变体特异性引物和通用MNA酶进行的MNA酶qPCR的Ct值
注意：当对于阴性对照样品来说未产生Ct时，50的最终Ct用于产生ΔCt并且放置在前面的大于符号(＞)指示ΔCt将预期高于这一值。
和与靶序列形成成环的对准的PASS部分酶相比(Ct 25.3)，标准引物与包含与靶序列形成平面对准的仅含有US2的PASS部分酶的MNA酶的组合更早检测到靶标v2(Ct 23.3)。当用野生型模板(质粒和gDNA)测定时，环PASS部分酶和平面PASS部分酶两者展示出类似的高特异性，ΔCt为约14.5(表23)。当变体模板1∶100稀释时，含有标准引物和仅含有US2的PASS部分酶的v2测定可检测它并且区别来自野生型的非特异性扩增的信号，其中ΔCt为约5至6(表23)。
和与靶序列形成成环的对准的PASS部分酶相比(Ct19.0)，PASS引物与包含与靶序列形成平面对准的含有US2和US1的PASS部分酶的MNA酶的组合稍微更早检测到靶标v2(Ct 18.2)。当用野生型模板(质粒和gDNA)测定时，与环PASS部分酶相比，含有平面PASS部分酶的测定展示出稍微更大的特异性。当变体模板1∶100稀释时，含有PASS引物和含有US2和US1的PASS部分酶的v2测定检测并且区别来自野生型的非特异性扩增的信号，其中ΔCt为约10。
将PASS引物添加至含有PASS部分酶的PASS PCR策略改进反应效率(Ct更早)和反应特异性(ΔCt更大)。所述实验证明了将PASS引物与PASS部分酶组合用于在高度特异性和有效的测定中分析相关序列的能力。在这个实施例中，使用缺失特异性PASS引物连同具有与变体序列的不完全但相等互补性的单个PASS部分酶允许同时实时检测缺失扩增子。
实例14：测试含有PASS引物和包含PASS部分酶的MNA酶的PASS qPCR策略的灵敏度
在这个实施例中，使用在野生型模板的背景下v2模板的连续稀释液来测定被称为v2的外显子19中的EGFR缺失变体。测试了在野生型模板的背景下v2的1∶10、1∶100以及1∶1000的稀释液。
含有US1(i4)的呈平面形式的PASS引物用于v2序列的特异性扩增。将PASS引物与MNA酶qPCR组合，其中MNA酶包含第一PASS部分酶，所述第一PASS部分酶与独特序列的补体(cUS1)以及扩增的靶序列结合并且还包含不与扩增的靶序列互补的序列的区(US2)，所述区被设计成使得US2在扩增子上对准在变体序列所位于之处。第二部分酶与第一部分酶相邻地结合在扩增的目标靶序列内。
将PASS qPCR针对所述策略的效率、线性以及灵敏度进行测试。
14.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计为其中感应臂与扩增子完全互补的标准部分酶或含有US2(指定为US9)和US1插入物i4(其与通过PASS引物插入到扩增子中的cUS1结合)的PASS部分酶。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于模板错配的独特序列(US2)。加下划线且斜体形式的区表示US1(i4)。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：119    部分酶B EGFR_2B/56-P：
TGGCGTGGAGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：128    PASS部分酶A EGFR_2i4US9A/56-P：
CTGTAGCAT ACAACGAGGGGTCGAG
14.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用FQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：121    底物Sub56-FIB：
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
14.3.用于扩增EGFR DNA的PCR引物
使用以下所列出的缺失特异性寡核苷酸PCR引物来进行质粒DNA的体外扩增。在以下序列中，加下划线的碱基是变体碱基(相对于野生型序列)并且加下划线且斜体形式的碱基表示US1(i4)。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：122    反向引物3EGFR：
GCCTGAGGTTCAGAGCCATGG
SEQ ID NO：131    正向PASS引物5EGFRv2_i4：
GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAA
14.4.靶序列
含有对应于EGFR基因的外显子19的区的序列的DNA质粒用作模板(IDT)。质粒包含野生型序列或对应于EGFR缺失变体v2的序列。按照制造商的说明在使用之前通过用限制酶EcoR1(ThermoScientific)消化来将质粒线性化。从IM9细胞系提取的基因组DNA用作表示人野生型EGFR gDNA的对照DNA样品。
14.5.反应组成：靶序列的扩增
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和61℃60秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃15秒和52℃60秒的40次循环(在52℃步骤收集数据)。每组反应条件重复两次进行测试并且包括40nM正向引物(5EGFRv2_i4)、100nM部分酶A(EGFR_2i4US9A/56-P)、200nM部分酶B(EGFR_2B/56-P)、200nM反向引物(3EGFR)、200nM底物(Sub56-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及v2(104个拷贝)的质粒DNA模板、WT(104个拷贝)的质粒DNA模板、IM9gDNA模板(35ng)，在IM9gDNA模板的恒定背景下1∶10、1∶100、1∶1000稀释的v2(104个拷贝)的质粒DNA模板(35ng)或无靶标(NF H2O)。
14.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
PASS策略用于产生用以实时检测和定量EGFR缺失变体(v2)的扩增子。这一反应显示当反应包括对于v2具有特异性的靶序列时荧光随时间推移而增加(表23)。
表23：EGFR v2连续稀释液的Ct值
将对于v2缺失具有特异性的质粒DNA模板在野生型(IM9)模板的背景下连续稀释10倍。通过将DNA浓度的对数相对于阈值循环(Ct)作图产生的标准曲线产生线性曲线图，其中效率为92％并且R2为0.994。每一稀释液的Ct在表23中示出。所述表中所示的Ct值是重复两次反应的结果的平均值。
当在野生型的背景下1∶1000稀释时PASS测定能够检测v2序列。来自阴性对照野生型模板的信号在来自相等数量的变体模板的拷贝的信号之后约15.7Ct。
无模板对照的荧光在反应过程中未增加。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于随后裂解报道底物的催化活性MNA酶的靶标依赖性组装。
这证明如图11中所示的组合PASS引物与PASS部分酶的PASS策略对于检测变体序列是高度有效、特异性和灵敏的。
实施例15：可环出靶序列的不同长度的PASS引物和挤压PASS引物
在这个实施例中，位于与PASS引物的S1区和S2区互补的靶序列之间的靶特异性区的大小在大小上从2(原始环PASS引物)(图12(iii))增加至20、40、60、100以及200个靶碱基(靶环PASS引物)(图12(i))。为了做到这一点，将PASS引物的S1区进一步向5’移动，以使得与PASS引物的3’靶特异性区和5’靶特异性区互补的序列之间的靶序列具有环出的增加大小的非互补间隔序列。
挤压PASS寡核苷酸中的US不是非互补序列本身的插入物，而是包含通过并置靶标的两个非连续序列形成的独特序列接点(USJ)。在挤压PASS寡核苷酸中，序列S1和S2与靶标互补并且与通过间隔序列分开的两个区结合。当挤压PASS寡核苷酸与靶标杂交时，间隔靶序列环出，从而使互补靶区紧密靠近，从而形成包含USJ的扩增子。在这个实施例中，用位于与S1区和S2区互补的靶序列之间的不同大小的间隔靶区测试挤压PASS引物。环出的非互补间隔序列大小在10、20、60以及100个靶碱基的范围内(图12(ii))。
在这个实施例中，环PASS引物、靶环PASS引物以及挤压PASS引物用于扩增CCB基因的区并且将每一个与MNA酶检测组合以用于在qPCR中读出来确定通过不同PASS引物类型环出的靶标的不同情形是否与基因的扩增和检测相容。
15.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向CCB基因和/或经由PASS引物引入的任何cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交，粗体且加下划线的碱基表示在USJ的任一侧的两个碱基，并且加下划线的碱基与cUS插入物杂交。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：86    部分酶B CCBB/2-P：
TGCCCAGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：89    部分酶A CCB_2i2A/2-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：132    部分酶A CCB_2LT1(10)A/2-P：
ACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：133    部分酶A：CCB_2LT1(20)A4/2-P
ACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：134    部分酶A CCB_2LT1(60)A/2-P：
AACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：135    部分酶A：CCB_2LT1(100)A/2-P
ACAACGAGAGGAAACCTT
15.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用FQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在485nm(FAM激发波长)下激发，在530nm(FAM发射波长)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列按5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：94    底物Sub2-FIB：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
15.3.靶序列和用于扩增CCB DNA的PCR引物
用于这个实施例的靶序列是从IM9细胞系(Promega)提取的人gDNA中的CCB基因。寡核苷酸PASS引物在以下列出。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交，粗体且加下划线的碱基表示在USJ的任一侧的两个碱基，并且加下划线的碱基是USI。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：7    反向引物3CCB：
SEQ ID NO：13    正向PASS引物SCCB_2i2环：
AGACATACTA
SEQ ID NO：136    正向PASS引物5CCB_LTi2(20)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：137    正向PASS引物5CCB_LTi2(40)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：138    正向PASS引物5CCB_LTi2(60)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：139    正向PASS引物5CCB_LTi2(100)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：140    正向PASS引物5CCB_LTi2(200)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：141    正向挤压PASS引物5CCB_LT1(10)：
SEQ ID NO：142    正向挤压PASS引物5CCB_LT1(20)：
SEQ ID NO：143    正向挤压PASS引物5CCB_LT1(60)：
SEQ ID NO：144    正向挤压PASS引物5CCB_LT1(100)：
15.4.反应组成：靶序列的扩增和检测
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和55℃30秒的5次循环、95℃15秒和52℃50秒的50次循环(在52℃步骤收集数据)。所有反应重复进行两次并且包括40nM正向PASS引物、200nM部分酶A(组合在表24中列出)、200nM反向引物(3CCB)、200nM部分酶B(CCBB/2-P)、200nM底物(Sub2-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafeRNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位MyTaqTM HSDNA聚合酶(Bioline)以及gDNA模板(50ng)或无靶标(NF H2O)。
表24：PASS引物与部分酶A组合
15.5.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
扩增和检测的结果总结在以下表25中。
表25：PASS引物与部分酶A组合的Ct值
Ct值指示具有环设计或挤压设计的PASS引物都可有效地扩增靶基因(表25)。当将环/2设计与不与靶环PASS引物结合的靶标的序列的长度在20(环/20)至40(环/40)至60(环/60)至100(环/100)以及然后200(环/200)范围内的靶环设计相比时，Ct值分别增加1.4、2.5、4.4、7.3以及10.6(表25)。这指示引物可与靶标结合并且从靶标延伸，尽管存在不与引物杂交的靶标的长序列伸展段。
当将环/2设计与在S1与S2之间具有10(挤压/10)、20(挤压/40)、60(挤压/60)或100(挤压/100)个碱基的未结合序列的挤压PASS引物设计相比较时，Ct分别增加0.5、0.7、4.7以及11.1(表25)。这证明挤压引物可与靶标结合并且从靶标延伸，尽管存在不与引物杂交的靶标的长序列伸展段。挤压/60(vi)和环/60(iv)的Ct值是非常可比的，从而指示在cS1与cS2之间具有高达至少60个未杂交靶标的碱基的靶环PASS引物和挤压PASS引物可类似地并且有效地起作用。
这个实施例证明使用可在靶标中的序列上“跳跃”的PASS引物将是可行的。这在例如希望扩增具有同源性区和变异性区的两个靶标时具有应用。PASS引物(挤压或环)可被设计成与靶标的同源区结合，但不与可变区结合。这可产生可以相等效率扩增两个靶标的一种引物，因为由引物结合的碱基的数目对于两个靶标来说将是相同的。
实施例16：对PASS部分酶和挤压PASS部分酶环出不同长度的靶序列的研究
以与PASS引物或挤压PASS引物类似的方式，PASS部分酶或挤压PASS部分酶还可被设计成环出序列的多个区，无论所述序列是部分酶感应臂还是靶序列或两者。
在这个实施例中，引物被设计成特异性地扩增TFRC基因，并且MNA酶包含在扩增的目标靶序列上相邻地结合的第一PASS或挤压PASS部分酶和第二完全匹配的“标准”部分酶。PASS部分酶包含不与靶序列互补的USI区，所述USI区位于与目标靶序列(cS1和cS2)互补的两个序列区(S1和S2)之间。存在于PASS部分酶中的USI可呈平面形式，其中PASS部分酶中的非互补碱基的数目匹配靶序列中未结合的碱基的数目，在这个实施例中所述数目是5、10或15bp(图13(i))或成环的，其中部分酶中的非互补碱基的数目大于或小于靶序列中的数目并且序列(部分酶或靶标)凸起或环出，在这个实施例中部分酶被环出5、10或15bp(图13(ii))。或者，可使用不包含USI而包含USJ的挤压PASS部分酶，所述USJ在所述部分酶与所述靶标结合以使得它在与靶序列(cS1和cS2)互补的两个序列区(S1和S2)之间环出靶序列的一个区时形成。在这个实施例中被挤压PASS部分酶环出的区是5、10、15、20或40bp长(图13(iii))。部分酶被设计成使得由部分酶组分形成活性MNA酶可导致用荧光团和淬灭剂染料对标记的通用探针的裂解，从而产生可实时监测的信号。
将每种平面、环以及挤压PASS部分酶与PCR扩增组合以在qPCR中读出来确定通过环或平面PASS部分酶或挤压PASS部分酶的结合形成的cS1与cS2之间的未结合的靶标的不同情形是否与TFRC基因的检测和产生实时可检测信号的活性MNA酶的形成相容。
16.1.部分酶寡核苷酸
设计了部分酶，所述部分酶是a)完全匹配的“标准”部分酶，其中感应臂与靶序列完全且连续地互补；b)“PASS”部分酶，其中不与扩增子互补的序列区(USI)已被插入到感应臂中、在与所述扩增子互补的两个区之间；或c)挤压PASS部分酶，其中一个靶序列区已经在与扩增子互补的两个区之间环出，从而导致所述部分酶的感应臂中USJ的存在。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交，粗体且加下划线的碱基表示在USJ的任一侧的两个碱基，并且加下划线的碱基是相对于所有三个靶序列错配的USI。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：145    部分酶B TFRC_2B/84-P：
TGGACGAGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：146    部分酶A TFRC_2A/84-P：
ACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO：147    PASS部分酶A平面TFRC_2P2i15A/84-P：
ATTCACGTCTCATCA ACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO：148    PASS部分酶A平面TFRC_2P2i10A/84-P：
CGTCTCATCA ACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO：149    PASS部分酶A平面TFRC_2P2i5A/84-P：
CATCA ACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO：150    PASS部分酶A环TFRC_2L2i15A/84-P：
ATTCACGTCTCATCA ACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO：151    PASS部分酶A环TFRC_2L2i10A/84-P：
CGTCTCATCA ACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO：152    PASS部分酶A环TFRC_2L2i5A/84-P：
CATCA ACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO：153    挤压PASS部分酶A TFRC_2pp40A/84-P：
ACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO：154    挤压PASS部分酶A TFRC_2pp20A/84-P：
ACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO：155    挤压PASS部分酶A TFRC_2pp15A/84-P：
ACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO：156    挤压PASS部分酶A TFRC_2pp10A/84-P：
ACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO：157    挤压PASS部分酶A TFRC_2pp5A/84-P：
ACAACGAGAGGGTCGAG
16.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列按5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：158    底物Sub84-FIB：
CTCGACCCTCguCCCTCGTCCA
16.3.靶序列和用于扩增TFRC的PCR引物
用于这一实施例的靶序列是从IM9细胞系(Promega)提取的人基因组DNA中的TFRC基因。寡核苷酸PCR引物在以下列出。在引物序列的5’端粗体形式的序列对应于增加引物的Tm而不影响引物对基因靶标的特异性的标签(T1或T2)。这些标签改进后面数轮PCR反应的扩增效率。引物序列以5’至3’的顺序列出。
SEQ ID NO：159    反向引物3TFRC_T2：
CTCTTTCAGCACATTGCTCACA
SEQ ID NO：160    正向引物5TFRC_T1：
CTGGGCAAGGAACAATAACTC
16.4.反应组成：靶序列的扩增
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和59℃60秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃15秒和50℃50秒的50次循环(在50℃步骤收集数据)。每组反应条件重复两次进行测试并且包括100nM部分酶A，如表26中所概括。所有反应包括40nM正向引物(5TFRC_T1)、200nM部分酶B(TFRC_2B/84-P)、200nM反向引物(3TFRC_T2)、200nM底物(Sub84-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafeRNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HSDNA聚合酶(Bioline)以及IM9gDNA(50ng或50pg)或无靶标(NFH2O)。
表26：部分酶A
16.5.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
对于所有反应来说，无模板对照的荧光低于含有DNA靶标的反应中的荧光。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于随后裂解通用报道底物的催化活性MNA酶的靶标依赖性组装。
当与不含有PASS部分酶的标准MNA酶相比时，PASS部分酶(无论是具有5、10或15bp的独特序列的环或平面)都类似地表现，其中对于50ng的模板来说最大差异是0.6Ct并且对于50pg的模板来说最大差异是0.7Ct(表27)。
表27：使用PASS部分酶和挤压PASS部分酶进行的MNA酶qPCR的Ct值
环出扩增子的5bp的挤压PASS部分酶比标准MNA酶反应表现稍好。当与不含有PASS部分酶的标准MNA酶相比时，使环出的扩增子序列的大小增加至10、15以及20bp导致Ct的仅最小位移，其中对于50ng的模板来说最大增加是0.6Ct并且对于50pg来说最大增加是0.4Ct(表27)。当将环出扩增子的40bp的挤压PASS部分酶与标准MNA酶相比时，Ct增加9.1和21.8(分别50ng和50pg)。这指示多达40bp的较大区域可从扩增子环出(如果需要)，然而它在这些实验条件下可能影响Ct值。
总之，使用包含不完全结合扩增子序列的PASS部分酶或挤压PASS部分酶的MNA酶检测靶序列对所述测定的Ct值和灵敏度具有最小影响，其中所有PASS变化形式以与标准MNA酶测定类似的方式有力地检测50pg的模板。这证明当部分酶感应臂中的一个不与连续靶序列完全匹配时活性MNA酶仍可形成，并且在这个实验中环出的靶序列可以是至少多达40bp。
实施例17：用于检测序列中的单碱基变化的均与MNA酶组合的PASS引物和挤压PASS引物
在靶向被称为G12V和G12S的KRAS的密码子12中的点突变的测定中证明了含有USI或USJ的PASS引物的特异性。所述实施例研究了检测变体G12V和G12S并且区别这些变体与野生型和其它KRAS G12/G13变体的能力。
在这个实施例中，位于与靶环PASS引物的S1区和S2区互补的靶序列之间的靶特异性区的大小在大小上从1(图12(iii))变化至20、40、60、100以及200个靶碱基(对于G12V来说)并且从10变化至20、40以及60个靶碱基(对于G12S来说)(图12(i))。为了实现这一点，将PASS引物的S1区进一步向5’移动，以使得与PASS引物的3’靶特异性区和5’靶特异性区互补的序列之间的靶序列具有环出的增加大小的非互补间隔靶序列。挤压PASS寡核苷酸中的US本身不是非互补序列的插入物，而是包含通过并置靶标的两个非连续序列形成的独特序列接点(USJ)。在挤压PASS寡核苷酸中，序列S1和S2与靶标互补并且与通过间隔序列分开的两个区结合。当挤压PASS寡核苷酸与靶标杂交时，间隔靶序列环出，从而使互补靶区紧密靠近，从而形成包含USJ的扩增子。在这个实施例中，测试了挤压PASS引物，其中位于与S1区和S2区互补的靶序列之间的间隔靶序列的大小对于G12V来说是10或100个靶碱基并且对于G12S来说是10个靶碱基(图12(ii))。
将每种靶环PASS引物或挤压PASS引物与MNA酶检测在具有荧光读出的qPCR中组合以便确定通过靶环PASS引物或挤压PASS引物成环的靶标的不同情形是否相对于区别所述变体序列与野生型和/或其它变体的能力影响反应的特异性。
17.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向变体G12S或G12V的KRAS基因和/或经由PASS引物引入的任何cUS插入物。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交，呈粗体且加下划线的碱基表示在USJ的任一侧的两个碱基，加下划线的碱基与cUS插入物杂交并且粗体且斜体形式的碱基表示变体碱基(G12S或G12V)，并且加下划线且斜体形式的碱基表示另外的错配碱基。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：18    部分酶B KRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGC
SEQ ID NO：161    部分酶A：G12S_gi2A/55-P：
ACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：162    部分酶A：G12S_LT10A/55-P：
ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：63    部分酶B rcKRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：64    部分酶A rcG12V_LMi1A/55-P：
ACAATCAGT ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：164    部分酶A：rcG12V_LT10A/55-P：
ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：165    部分酶A：rcG12V_LT100A/55-P：
ACAACGAGAGGTGCGGT
17.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列按5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：25    底物Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
17.3.用于扩增KRAS DNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行人gDNA的体外扩增。在以下序列中，粗体形式的碱基与靶序列杂交，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的USI(G12S插入物i2和rcG12V插入物i1)，粗体且斜体形式的碱基是变体碱基，粗体且加下划线的碱基是USJ，并且加下划线且斜体形式的碱基表示与两个靶标错配的另外碱基。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：26    反向引物3KRAS：
GGTCCTGCACCAGTAATATGC
SEQ ID NO：166    正向PASS引物5G12S_gi2平面：
AGACATACTA
SEQ ID NO：167    正向PASS引物5G12S_LTi2(20)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：168    正向PASS引物5G12S_LTi2(40)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：169    正向PASS引物5G12S_LTi2(60)：
AGACATACTA
SEQ ID NO：170    正向挤压PASS引物5G12S_LT10：
SEQ ID NO：65    反向引物3rcKRAS：
SEQ ID NO：66    正向PASS引物5rcG12V_LM3i1环：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：172    正向PASS引物5rcG12V_LTi1(20)：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：173    正向PASS引物5rcG12V_LTi1(40)：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：174    正向PASS引物5rcG12V_Ti1(60)：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：175    正向PASS引物5rcG12V_LTi1(100)：
CACAATCAGT
SEQID NO：176    正向PASS引物5rcG12V_LTi1(200)：
CACAATCAGT
SEQ ID NO：177    正向挤压PASS引物5rcG12V_LT10：
SEQ IDNO：178    正向挤压PASS引物5rcG12V_LT100：
17.4.靶序列
从A549细胞系提取的人gDNA用作体外扩增点突变G12S的模板并且从SW480细胞系提取的人gDNA用作体外扩增点突变G12V的模板。从细胞系IM9(野生型)、Calul(G12C)、MDA-MB231(G13D)以及SW480(G12V)提取的人gDNA用作KRAS变体G12S的阴性对照模板，并且从细胞系IM9和Calul提取的人gDNA用作KRAS变体G12V的阴性对照模板。
17.5.反应组成：靶序列的扩增和检测
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和64℃ 60秒的10次循环、95℃15秒和54℃50秒的50次循环(在54℃步骤收集数据)。反应重复进行两次并且包括40nM正向PASS引物、100nM部分酶A、200nM反向引物以及200nM部分酶B(组合在表28中列出)。所有反应包括200nM底物(Sub55-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafeRNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位MyTaqTM HSDNA聚合酶(Bioline)。35ng的A549gDNA模板用作KRAS G12S靶标的阳性对照并且35ng的SW480(G12V)、IM9(WT)、Calul(G12C)以及MDA-MB231(MDA)(G13D)用作阴性对照，35ng的SW480gDNA模板用作KR4S G12V靶标的阳性对照并且35ng的IM9(WT)用作阴性对照，并且另外对照不包含靶标(NF H2O)。
表28：用于变体测定的引物/部分酶组合
17.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
扩增和检测的结果总结在以下表29中。
表29：PASS引物与部分酶组合的Ct值
*单个复制的Ct值，其它复制未产生信号，Ct未进行平均化
注意：当对于阴性对照样品来说未产生Ct时，50的最终Ct用于产生ΔCt并且放置在前面的大于符号(＞)指示ΔCt将预期高于这一值。
Ct值(表29)指示具有靶环设计或挤压设计的PASS引物都可扩增靶基因。当将G12S平面/10设计与其中未与PASS引物结合的靶标的序列的长度从20(环/20)增加至40(环/40)并且然后至60(环/60)的靶环设计相比时，Ct值分别增加3.0、6.2以及7.1。特异性还受靶环的大小的影响，其中不含靶环的平面/10关于来自野生型的脱靶信号最具特异性，但环/20和环/40关于来自其他变体序列的脱靶信号展示更大特异性。这指示引物可与靶标结合并且从靶标延伸，尽管存在不与引物杂交的靶标的长序列伸展段；并且这可进一步改进测定的特异性。
对于G12S来说，当挤压PASS引物与靶标中S1与S2之间的10个碱基的未结合的非互补序列一起使用时(挤压/10)，当与原始平面PASS引物相比时Ct增加0.7，从而指示通过挤压/10的有效引发(表29)。然而，对于挤压PASS引物来说，特异性较优异，其中对于任何阴性对照来说无明显信号。这证明挤压PASS引物可与靶标结合并且从靶标延伸，尽管存在不与引物杂交的靶标的长序列伸展段；并且这可改进反应的特异性。
当将G12V环/1 PASS引物设计与其中未与靶环PASS引物在S1与S2之间结合的靶标的序列的长度从20(环/20)增加至40(环/40)、60(环/60)、100(环/100)并且然后200(环/200)的环靶设计相比时，Ct值分别增加3.0、7.5、13、14.4以及18.2(表29)。特异性还受靶环的大小影响，其中最具特异性的反应来自环/20、环/40以及环/60。然而，与环/20相比，阳性反应的Ct对于环/40和环/60来说增加。当环是100或200bp(环/100或环/200)时，特异性优点丧失，因为Ct极大地增加。这指示引物可与靶标结合并且从靶标延伸，尽管存在不与引物杂交的靶标的长序列伸展段；并且这可进一步改进测定的特异性。
当使用挤压PASS引物G12V(挤压/10)(其在S1与S2之间具有10个碱基的未结合的序列)时，当与原始环PASS引物(环/1)相比时Ct增加0.8，从而指示通过挤压/10的有效引发(表29)。特异性也是可比的。当使用在S1与S2之间具有100bp的未结合的序列的挤压PASS引物时，当与环/1相比时Ct增加14.1，同时维持良好水平的特异性(表29)。这证明挤压PASS引物可与靶标结合并且从靶标延伸，尽管存在不与引物杂交的靶标的长序列伸展段；并且这可改进反应的特异性。
这个实施例证明使用可在靶标中的序列上“跳过”的PASS引物将是可行的。此外，PASS引物的类型(无论它包含USJ还是USI)可进行筛选以便在待区别变体序列时确定最具特异性的测定。
实施例18：比较均与等位基因特异性MNA酶、通用MNA酶或组合的PASS引物与摆动增强的ARMS(WE-ARMS)引物检测序列中的单碱基变化的灵敏度
在这个实施例中，使用野生型KRAS模板背景中的G12V模板的连续稀释液来测定被称为G12V的密码子12中的KRAS点突变。对野生型背景中的G12V的1∶10、1∶100以及1∶1000的稀释液进行测试。
设计3(图7)平面PASS引物用于扩增G12V序列。将这与G12VWE-ARMS引物进行比较。将PASS引物与等位基因特异性MNA酶qPCR读出、通用MNA酶qPCR读出或探针读出组合。在等位基因特异性系统中，MNA酶结合区与引物结合区(PASS或WE-ARMS引物)重叠；而在通用系统中，MNA酶或探针位于扩增子的内部，其中无涉及PASS或WE-ARMS引物的序列的重叠。在PASS测定中，等位基因特异性MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与独特序列的补体(cUS)以及含有变体(突变体)碱基和通过PASS引物引入的错配碱基的补体的扩增的靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶相邻地结合在扩增的目标靶序列内。通用MNA酶和探针均与变体(突变体)碱基下游的序列结合，并且这些测定仅依赖于引物来赋予对突变的特异性，因为它们不提供用于区别野生型和突变序列的任何固有机制。将WE-ARMS引物与MNA酶(与等位基因特异性MNA酶qPCR读出、通用MNA酶qPCR读出或探针)组合。在这些WE-ARMS引物测定中，等位基因特异性MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与含有变体(突变体)碱基和通过WE-ARMS引物引入的错配碱基的补体的扩增的靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶相邻地结合在扩增的目标靶序列内。通用MNA酶和探针均与变体(突变体)碱基下游的序列结合，并且如之前不提供用于区别野生型和突变序列的任何另外机制。
将PASS引物与WE-ARMS引物进行比较以便研究每种扩增和检测策略的效率、线性以及灵敏度。
18.1.部分酶寡核苷酸
在PASS引物的情况下，等位基因特异性MNA酶被设计成具有特异性地靶向G12V序列和经由引物引入的任何错配以及cUS插入物的部分酶。通用MNA酶被设计成具有不与变体碱基或经由引物引入的任何另外错配结合的部分酶(即在PASS引物的情况下它们不与cUS结合)。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于起始模板错配的US插入物(i2)。粗体和斜体形式的碱基表示变体(突变体)碱基并且加下划线和斜体形式的碱基表示另外错配的碱基。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：18    部分酶B KRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：24    PASS部分酶A G12V_LMi2A/55-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：44    部分酶A G12V_MA/55-P：
ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：179    部分酶A KRAS_5A/55-P：
ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：180    部分酶B KRAS_5B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGC
18.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列按5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：25    Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
18.3.探针
探针被设计成使得在PASS引物的情况下它既不与变体碱基或经由引物引入的任何错配结合，也不与cUS结合。将探针在5’端用6-FAM部分(在以下探针的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用小沟结合部分(在以下探针的名称中由“MGB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发波，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测探针的裂解。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交。序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：181    TaqMan探针KRAS_5-FMGB：
18.4.用于扩增KRAS DNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行人gDNA的体外扩增。在以下序列中，粗体形式的碱基与靶序列杂交，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的US插入物i2，粗体且加下划线的碱基是变体碱基，并且斜体形式的碱基表示与两个靶标错配(M)的另外碱基。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：26    反向引物3KRAS：
SEQ ID NO：87    正向PASS引物5G12V_LM4i2平面：
AGACATACTA
SEQ ID NO：46    正向WE-ARMS引物5G12V_M：
18.5.靶序列
从SW480细胞系提取的人gDNA用作体外扩增含有变体点突变G12V的KRAS基因的模板。通过在从细胞系K562提取的KRAS野生型gDNA的恒定背景下连续稀释SW480来制作校准曲线。
18.6.反应组成：靶序列的扩增和定量
靶序列的实时扩增和定量在25μL的总反应体积中进行。反应重复进行两次并且在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃5秒和54℃20秒的60次循环(在54℃步骤收集数据)。MNA酶反应包括40nM正向引物、100nM部分酶A、和200nM部分酶B(组合在表30中列出)以及400nM反向引物(3KRAS)、200nM底物(Sub55-FIB)和8mM MgCl2。TaqMan反应包括300nM正向引物、900nM反向引物(3KRAS)、250nM探针(KRAS_5-FMGB)以及4mM MgCl2。所有反应包括200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及SW480gDNA模板(35ng)，在K562gDNA模板的恒定背景下1∶10、1∶100或1∶1000稀释的SW480gDNA模板(35ng)，K562gDNA模板(35ng)或无靶标(NF H2O)。
表30：用于变体测定的寡核苷酸组合
18.7.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
PASS和WE-ARMS正向引物用于产生用以实时检测和定量KRAS点突变(G12V)的扩增子。MNA酶被设计成等位基因特异性的并且因此针对检测用于扩增突变序列的特异性PASS或WE-ARMS引物的补体进行定制；或MNA酶是通用的，其中与MNA酶杂交的序列存在于从靶KRAS变体的扩增或从脱靶野生型产生的所有扩增子中。类似地，还设计了将结合存在于所有KRAS变体和野生型扩增子中的序列的探针。这些反应显示当反应包含对于G12V具有特异性的靶序列时荧光随时间推移而增加(表31)。
将对于G12V具有特异性的SW480 DNA模板在包含G12的K562模板的背景下连续稀释10倍。将DNA的连续稀释液用PASS或WE-ARMS正向引物扩增并且用等位基因特异性MNA酶、通用MNA酶或探针实时检测，每种稀释液的Ct在表31中示出。所述表中所示的Ct值是重复两次反应的结果的平均值。ΔCt值指示当存在相当数量的DNA时，与脱靶野生型对照扩增子相比，针对检测KRAS突变体扩增子所观察到的循环数目的差异。
与通用MNA酶和探针相比，针对用等位基因特异性MNA酶检测的Ct值稍微增加(表31)；然而这种新颖的设计对反应提供较大特异性。PASS引物与等位基因特异性MNA酶的使用产生非常特异性的反应，其中没有信号从野生型阴性对照产生。组合等位基因特异性MNA酶与WE-ARMS引物还改进反应的特异性，从而使突变体与野生型之间的ΔCt增加至16.9，这与分别对于通用MNA酶和探针来说8.7和7.0形成对比。
应用PASS引物(代替WE-ARMS引物)与通用MNA酶或探针读出显示较大特异性，当与WE-ARMS引物相比时具有增加的ΔCt(表31)。此外，使用PASS引物增加了来自野生型的G12V序列的检测限。使用WE-ARMS引物，通用MNA酶不能清楚地区别1∶100突变体稀释液和阴性对照(K562-野生型)，其中Ct差异为1.2。相比之下，PASS引物容易地允许检测1∶100并且在1∶1000稀释液与阴性对照之间具有1.6的Ct差异。和WE-ARMS与读出相比，在使用PASS引物时还观察到类似优点。使用WE-ARMS引物，读出不能清楚地区别1∶100与阴性对照(K562-野生型)，其中Ct差异为0.2；而PASS引物容易地检测1∶100并且在1∶1000样品与阴性对照之间具有0.6的Ct差异。这证明PASS引物的优点是PASS引物的设计所固有的，并且优异结果不仅仅与用于读出(等位基因特异性MNA酶对比通用MNA酶对比探针)的方法相关。如在这个实验中所证明，PASS引物在与其它qPCR化学法如结合时也具有优点。此外，PASS引物可与另外qPCR化学法如分子信标或Scorpion probe探针组合。
表31：在扩增突变DNA(SW480)或野生型DNA(K562)或K562DNA中SW480的稀释液之后G12V PASS对比WE-ARMS引物的Ct值对于每种技术组合，可与野生型区别的最低稀释度(其中ΔCt为至少2个循环)加下划线。
实施例19：比较与MNA酶读出组合的PASS引物中的不同独特序列(US)
在这个实施例中，将十五种不同的独特序列(US)插入到对于CCB基因具有特异性的PASS引物中。呈环或平面形式的含有US插入物的PASS引物包含US i1、i1a、i2、i2a、i2b、i3、i4、i5、i5a、i6、i7、i8、i9、i10或i11(表32)。
将PASS引物与MNA酶qPCR组合，其中MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与独特序列的补体(cUS)以及针对CCB定制的扩增的靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶在扩增的目标靶序列上相邻地结合。
针对每种US设计了PASS引物和部分酶以便确定各种独特序列是否与基因的扩增和检测相容。
表32：每种US插入物的编号和序列
插入物编号 序列(5’至3’)
i1(SEQ ID NO：182) CACAATCAGT
i1a(SEQ ID NO：183) CACAATGATG
i2(SEQ ID NO：184) AGACATACTA
i2a(SEQ ID NO：185) AGACAGTTAC
i2b(SEQ ID NO：186) AGAGTCATTC
i3(SEQ ID NO：187) CGTTGGCTAC
i4(SEQ ID NO：188) TCAATACCAT
i5(SEQ ID NO：189) GATTCGAGAA
i5a(SEQ ID NO：190) GATTCGAGTT
i6(SEQ ID NO：191) GTTACCTGAA
i7(SEQ ID NO：192) CATTAGTGCC
i8(SEQ ID NO：193) CATTGACAGA
i9(SEQ ID NO：194) CGAAAGCGAC
i10(SEQ ID NO：195) CGTCTCATCA
i11(SEQ ID NO：196) GGATTAGATC
19.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向CCB基因加经由PASS引物引入的任何cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列插入物(i1、i1a、i2、i2a、i2b、i3、i4、i5、i5a、i6、i7、i8、i9、i10或i11)。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：86    部分酶B CCBB/2-P：
TGCCCAGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：197    部分酶A CCB_2i1A/2-P：
CACAATCAGT CAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：198    部分酶A CCB_2i1aA/2-P：
CACAATGATG CAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：89    部分酶A CCB_2i2A/2-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：199    部分酶A CCB_2i2aA/2-P：
AGACAGTTAC CAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：200    部分酶A CCB_2ibA/2-P：
AGAGTCATTC CAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：201    部分酶A CCB_2i3A/2-P：
GTTGGCTAC CAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：202    部分酶A CCB_2i4A/2-P：
TCAATACCAT ACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：203    部分酶A CCB_2i5A/2-P：
GATTCGAGAA ACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：204    部分酶A CCB_2i5aA/2-P：
GATTCGAGTT CAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：205    部分酶A CCB_2i6A/2-P：
GTTACCTGAA CAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：206    部分酶A CCB_2i7A/2-P：
CATTAGTGCC CAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：207    部分酶A CCB_2i8A/2-P：
CATTGACAGA ACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：208    部分酶A CCB_2i9A/2-P：
GAAAGCGAC ACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：209    部分酶A CCB_2i 10A/2-P：
CGTCTCATCA ACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：210    部分酶A CCB_2i11A/2-P：
GGATTAGATC ACAACGAGAGGAAACCTT
19.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列按5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：94    底物Sub2-FIB：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
19.3.用于扩增CCB DNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行人gDNA中的CCB基因的体外扩增。PASS引物被设计成使得正向引物对于CCB具有特异性并且包含US插入物(i1、i1a、i2、i2a、i2b、i3、i4、i5、i5a、i6、i7、i8、i9、i10或i11)。在以下序列中，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列插入物。L表示呈环形式的US并且P表示呈平面形式的US。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：7    反向引物3CCB：
CTCAGGAATTTCCCAGCTAC
SEQ ID NO：211    正向PASS引物 5CCB_Pi1：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCACAATCAGTCCAGAGC
SEQ ID NO：212    正向PASS引物5CCB_Li1：
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATCACAATCAGTCCAGAGC
SEQ ID NO：213    正向PASS引物5CCB_Pi1a：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCACAATGATGCCAGAGC
SEQ ID NO：214    正向PASS引物5CCB_Li1a：
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATCACAATGATGCCAGAGC
SEQ ID NO：215    正向PASS引物5CCB_Li2：
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：216    正向PASS引物5CCB_Pi2：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO：217    正向PASS引物5CCB_Pi2a：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACAGTTACCCAGAGC
SEQ ID NO：218    正向PASS引物5CCB_Li2a：
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATAGACAGTTACCCAGAGC
SEQ ID NO：219    正向PASS引物5CCB_Pi2b：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGAGTCATTCCCAGAGC
SEQ ID NO：220    正向PASS引物5CCB_Li2b：
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATAGAGTCATTCCCAGAGC
SEQ ID NO：221    正向PASS引物5CCB_Pi3：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCGTTGGCTACCCAGAGC
SEQ ID NO：222    正向PASS引物5CCB_Li3：
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATCGTTGGCTACCCAGAGC
SEQ ID NO：223    正向PASS引物5CCB_Pi4：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGTCAATACCATCCAGAGC
SEQ ID NO：224    正向PASS引物5CCB_Li4
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATTCAATACCATCCAGAGC
SEQ ID NO：225    正向PASS引物5CCB_Pi5
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGGATTCGAGAACCAGAGC
SEQ ID NO：226    正向PASS引物5CCB_Li5
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATGATTCGAGAACCAGAGC
SEQ ID NO：227    正向PASS引物5CCB_Pi5a：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGGATTCGAGTTCCAGAGC
SEQ ID NO：228    正向PASS引物5CCB_Li5a：
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATGATTCGAGTTCCAGAGC
SEQ ID NO：229    正向PASS引物5CCB_Pi6：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGGTTACCTGAACCAGAGC
SEQ ID NO：230    正向PASS引物5CCB_Li6：
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATGTTACCTGAACCAGAGC
SEQ ID NO：231    正向PASS引物5CCB_Pi7：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCATTAGTGCCCCAGAGC
SEQ ID NO：232    正向PASS引物5CCB_Li7：
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATCATTAGTGCCCCAGAGC
SEQ ID NO：233    正向PASS引物5CCB_Pi8：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCATTGACAGACCAGAGC
SEQ ID NO：234    正向PASS引物5CCB_Li8：
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATCATTGACAGACCAGAGC
SEQ ID NO：235    正向PASS引物5CCB_Pi9：
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCGAAAGCGACCCAGAGC
SEQ ID NO：236    正向PASS引物5CCB_Li9：
TTCTTCTTGGATGGTCATCTCGAAAGCGACCCAGAGC
SEQ ID NO：237    正向PASS引物5CCB_Pi10：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCGTCTCATCACCAGAGC
SEQ ID NO：238    正向PASS引物5CCB_Li10：
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATCGTCTCATCACCAGAGC
SEQ ID NO：239    正向PASS引物5CCB_Pi11：
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGGGATTAGATCCCAGAGC
SEQ ID NO：240    正向PASS引物5CCB_Li11：
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATGGATTAGATCCCAGAGC
19.4.靶序列
从IM9细胞系提取的人gDNA用作体外扩增CCB基因的模板。
19.5.反应组成：靶序列的扩增和检测
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和55℃30秒的5次循环、95℃15秒和52℃50秒的40次循环(在52℃下收集数据)。所有反应重复进行两次并且包括40nM正向引物和200nM部分酶A(如表33中所概括)、200nM反向引物(3CCB)、200nM部分酶B(CCBB/2-P)、200nM底物(Sub2-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HSDNA聚合酶(Bioline)以及IM9gDNA模板(50ng)或无靶标(NF H2O)。
表33：正向PASS引物与部分酶A组合
19.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
在含有包含US、i1、i1a、i2、i2a、i2b、i3、i4、i5、i5a、i6、i7、i8、i9、i10或i11的CCB PASS引物(平面和环)的反应中，50ng gDNA(IM9)的Ct值指示成功扩增和检测(表34)。
环PASS引物测定的Ct显示对于插入物序列i1、i1a、i2、i2b、i5、i5a、i6、i7、i8、i10以及i11来说非常小的变化，其中Ct在21.3至22.9的范围(表34)。其它环PASS引物i2a、i3、i4以及i9具有在26.0至30.9范围内的Ct(表34(未加下划线的))，从而指示当在这些反应条件下与这一靶标偶联时独特序列影响扩增的效率。对从含有插入物i2a、i3或i4的独特序列的环PASS引物产生的扩增子的二级结构的分析显示可能影响扩增效率的牢固发夹的潜在形成。
平面PASS引物测定的Ct显示对于插入物序列i1、i1a、i2、i2b、i4、i5、i5a、i6、i7、i8、i10以及i11来说非常小的变化，其中Ct在21.2至22.5的范围(表34)。其它平面PASS引物i2a、i3以及i9具有在25.0至29.0范围内的Ct(表34(未加下划线的))，从而指示当在这些反应条件下与这一靶标偶联时独特序列影响扩增的效率。对从含有插入物i2a和i3的独特序列的平面PASS引物产生的扩增子的二级结构的分析显示可能影响扩增效率的牢固发夹的潜在形成。
总之，十五种US插入物中的十一种(环)和十二种(平面)适合用于分析CCB序列。然而，实验证明多种不同的独特插入物序列可用于扩增和检测同一靶标并且如果扩增效率看起来受到影响，那么测试另一种插入物序列可改进信号。在这种CCB扩增子的背景下不能良好表现的那些US插入物可适用于靶向其它基因的PASS系统中。
表34：用于CCB测定的PASS引物与部分酶组合的Ct值
实施例20：比较PASS引物中的不同独特序列插入物并且与MNA酶组合以便检测序列中的单碱基变化
PASS引物可被设计成区别因单个碱基而不同的两个序列，以使得靶特异性3’端(S2)包含变体碱基和错配的碱基(图2(i)和(ii)下图)。此外，US可针对每个变体不同，从而增加另一种水平的选择性和特异性(图3)。
在这个实施例中，将十五种不同的独特序列插入到用于被称为rcG12的密码子12中的反向补体KRAS野生型序列的PASS引物中。呈环或平面形式的含有US的PASS引物被设计成对于G12序列具有特异性并且包含US插入物i1、i1a、i2、i2a、i2b、i3、i4、i5、i5a、i6、i7、i8、i9、i10或i11(表32)。
将PASS引物与MNA酶qPCR组合，其中MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与独特序列的补体(cUS)以及含有野生型序列和错配碱基的补体的扩增的靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶在扩增的目标靶序列上相邻地结合。
针对每种US设计了PASS引物和部分酶以便确定不同情形是否相对于突变变体G12S改进对于KRAS野生型G12的反应效率和特异性。
20.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向KRAS基因的野生型rcG12加经由PASS引物引入的任何cUS插入物和错配。在一些序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交，粗体且加下划线的碱基表示当与G12S模板相比时不同的野生型变体碱基，加下划线且斜体形式的碱基表示错配碱基，并且加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列插入物(i1、i1a、i2、i2a、i2b、i3、i4、i5、i5a、i6、i7、i8、i9、i10或i11)。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：241    部分酶B：rcG12_2B/55-P
GAGCTGGGGAGGCTAGC
SEQ ID NO：242    部分酶A：rcG12_2i1A/55-P
CACAATCAGT ACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO：243    部分酶A：rcG12_2i1aA/55-P
CACAATGATG ACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO：244    部分酶A：rcG12_2i2A/55-P
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO：245    部分酶A：rcG12_2i2aA/55-P
AGACAGTTAC ACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO：246    部分酶A：rcG12_2i2bA/55-P
AGAGTCATTC CAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO：247    部分酶A：rcG12_2i3A/55-P
GTTGGCTAC ACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO：248    部分酶A：rcG12_2i4A/55-P
CAATACCAT ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：249    部分酶A：rcG12_2i5A/55-P
GATTCGAGAA ACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO：250    部分酶A：rcG12_2i5aA/55-P
GATTCGAGTT ACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO：251    部分酶A：rcG12_2i6A/55-P
GTTACCTGAA ACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO：252    部分酶A：rcG12_2i7A/55-P
CATTAGTGCC ACAACGAGAG6TGCGG
SEQ ID NO：253    部分酶A：rcG12_2i8A/55-P
CATTGACAGA ACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO：254    部分酶A：rcG12_2i9A/55-P
GAAAGCGAC ACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO：255    部分酶A：rcG12_2i10A/55-P
CGTCTCATCA ACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO：256    部分酶A：rcG12_2i11A/55-P
GGATTAGATC ACAACGAGAGGTGCGG
20.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列按5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：25    底物Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
20.3.用于扩增KRAS DNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行人gDNA中的KRAS基因的体外扩增。PASS引物被设计成使得正向引物对于野生型具有特异性并且包含US插入物(i1、i1a、i2、i2a、i2b、i3、i4、i5、i5a、i6、i7、i8、i9、i10或i11)。在以下序列中，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列插入物，粗体形式的碱基与靶序列杂交，粗体且加下划线的碱基表示当与G12S模板相比时不同的野生型变体碱基，并且斜体形式的碱基表示与靶标错配的碱基。L表示呈环形式的US并且P表示呈平面形式的US。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：65    反向引物：3rcKRAS
TATTAAAAGGTACTGGTGGAGTA
SEQ ID NO：257    正向PASS引物：5rcG12_i1L
CACAATCAGT
SEQ ID NO：258    正向PASS引物：5rcG12_i1P
CACAATCAGT
SEQ ID NO：259    正向PASS引物：5rcG12_i1aL
CACAATGATG
SEQ ID NO：260    正向PASS引物：5rcG12_i1aP
CACAATGATG
SEQ ID NO：261    正向PASS引物：5rcG12_i2L
AGACATACTA
SEQ ID NO：262    正向PASS引物：5rcG12_i2P
AGACATACTA
SEQ ID NO：263    正向PASS引物：5rcG12_i2aL
AGACAGTTAC
SEQ ID NO：264    正向PASS引物：5rcG12_i2aP
AGACAGTTAC
SEQ ID NO：265    正向PASS引物：5rcG12_i2bL
AGAGTCATTC
SEQ ID NO：266    正向PASS引物：5rcG12_i2bP
AGAGTCATTC
SEQ ID NO：267    正向PASS引物：5rcG12_i3L
CGTTGGCTAC
SEQ ID NO：268    正向PASS引物：5rcG12_i3P
CGTTGGCTAC
SEQ ID NO：269    正向PASS引物：5rcG12_i4L
TCAATACCAT
SEQ ID NO：270    正向PASS引物：5rcG12_i4P
TCAATACCAT
SEQ ID NO：271    正向PASS引物：5rcG12_i5L
GATTCGAGAA
SEQ ID NO：272    正向PASS引物：5rcG12_i5P
GATTCGAGAA
SEQ ID NO：273    正向PASS引物：5rcG12_i5aL
GATTCGAGTT
SEQ ID NO：274    正向PASS引物：5rcG12_i5aP
GATTCGAGTT
SEQ ID NO：275    正向PASS引物：5rcG12_i6L
GTTACCTGAA
SEQ ID NO：276    正向PASS引物：5rcG12_i6P
GTTACCTGAA
SEQ ID NO：277    正向PASS引物：5rcG12_i7L
CATTAGTGCC
SEQ ID NO：278    正向PASS引物：5rcG12_i7P
CATTAGTGCC
SEQ ID NO：279    正向PASS引物：5rcG12_i8L
CATTGACAGA
SEQ ID NO：280    正向PASS引物：5rcG12_i8P
CATTGACAGA
SEQ ID NO：281    正向PASS引物：5rcG12_i9L
CGAAAGCGAC
SEQ ID NO：282    正向PASS引物：5rcG12_i9P
CGAAAGCGAC
SEQ ID NO：283    正向PASS引物：5rcG12_i10L
CGTCTCATCA
SEQ ID NO：284    正向PASS引物：5rcG12_i10P
CGTCTCATCA
SEQ ID NO：285    正向PASS引物：5rcG12_i11L
GGATTAGATC
SEQ ID NO：286    正向PASS引物：5rcG12_i11P
GGATTAGATC
20.4.靶序列
从IM9细胞系提取的人gDNA用作体外扩增野生型KRAS基因的模板并且从A549细胞系提取的人gDNA用作含有纯合点突变G12S的阴性对照。
20.5.反应组成：靶序列的扩增和检测
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和64℃60秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃15秒和54℃50秒的40次循环(在54℃收集数据)。所有反应重复进行两次并且包括40nM正向引物和100nM部分酶A(如表35中所概括)、200nM反向引物(3rcKRAS)、200nM部分酶B(rcG12_2B/55-P)、200nM底物(Sub55-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及作为测试的IM9gDNA模板(35ng)、作为阴性对照的A549gDNA模板(35ng)或无靶标(NFH2O)。
表35：正向PASS引物与部分酶A组合
20.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
含有不同US插入物的PASS引物用于产生用以实时检测KRAS野生型(G12)的扩增子。这一反应显示当所使用的靶序列是经由PCR扩增的测试人gDNA(K562)时荧光随时间推移而增加。无模板对照的荧光低于含有DNA靶标的反应中的荧光。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于随后裂解报道底物的催化活性MNA酶的靶标依赖性组装。
在含有包含US、i1、i1a、i2、i2a、i2b、i3、i4、i5、i5a、i6、i7、i8、i9、i10或i11的野生型G12PASS引物(平面和环)的反应中，“测试”DNA(K562)的Ct值指示K562中的野生型KRAS等位基因的成功扩增和检测。“阴性对照”(G12S)的信号达到如表36中所示的阈值Ct值，从而指示当使用变体等位基因时产生一些背景信号，并且野生型与变体G12S之间的ΔCt值可受插入到PASS引物中的独特序列的组成影响。
用于测试样品的环PASS引物测定的Ct显示非常小的变化，其中Ct在18.6至21.3的范围，然而阴性对照具有在29.7至37.3范围内的Ct，从而指示US可影响反应的特异性(表36)。对于环PASS引物来说，当使用US i7时测试与阴性对照之间计算的最大ΔCt是18.5，在其之后是US i3和i9，两者均具有ΔCt＞15。其它US插入物的ΔCt都非常类似。
用于测试样品的平面PASS引物测定的Ct显示非常小的变化，其中Ct在17.9至20.9的范围，然而阴性对照具有在26.1至33.9范围内的Ct，从而指示US可影响反应的特异性(表36)。对于平面PASS引物来说，当使用US i6时测试与阴性对照之间计算的最大ΔCt是11.8。其它US插入物的所有其它ΔCt非常类似，在彼此的2.3Ct内。
表36：用于野生型和突变体测定的PASS引物与部分酶A组合的Ct值
^由于实验误差仅一个复制起作用。
总之，所有十五种US适合用于分析野生型靶序列。结果中存在差异，其中在环PASS引物测定中观察到比平面PASS引物测定中稍微更大的变化性(由所获得的Ct值的更大范围证明)。然而，所述实验证明多种不同的独特插入物序列可用于扩增和检测同一靶标并且筛选以便发现最佳PASS引物/US插入物组合可帮助改进反应的特异性。
实施例21：比较均与MNA酶组合以便检测序列中的单碱基变化的PASS引物反应与组合正向PASS引物与反向挤压PASS引物的一种反应的特异性
在靶向被称为G12V和G12S的KRAS的密码子12中的点突变的测定中研究了含有USI或USJ的PASS引物的特异性。这一实施例研究了检测变体菌株G12V和G12S并且区别这些变体与野生型和其它KRAS G12/G13变体的能力。
在这个实施例中，将反向标准引物与使用反向挤压PASS引物进行比较，两者均与正向PASS引物或正向挤压PASS引物(仅G12S)和MNA酶读出组合。与标准反向引物相比，反向挤压PASS引物的3’S2区与部分酶感应区更靠近地结合并且从靶序列环出43个碱基，从而导致与用标准反向引物的160bp相比100bp的扩增子大小。
将含有标准反向引物的测定与含有反向挤压PASS引物的那些测定进行比较，两者均在具有荧光读出的qPCR中与正向PASS引物和MNA酶检测组合以便确定正向PASS引物是否可与反向挤压PASS引物组合并且另外PASS引物是否可相对于区别变体序列与野生型和/或其它变体的能力影响反应的特异性。
21.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向变体G12S或G12V的KRAS基因和/或经由PASS引物引入的任何cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交，粗体且加下划线的碱基表示在USJ的任一侧的两个碱基，加下划线的碱基与cUS插入物杂交并且粗体且斜体形式的碱基表示变体碱基(G12S或G12V)，并且加下划线且斜体形式的碱基表示另外的错配碱基。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：18    部分酶B KRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：161    部分酶A：G12S_gi2A/55-P
ACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：162    部分酶A：G12S_LT10A/55-P
ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：24    部分酶A G12V_LMi2A/55-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
21.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列按5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：25    底物Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
21.3.用于扩增KRAS DNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行人gDNA的体外扩增。在以下序列中，粗体形式的碱基与靶序列杂交，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的USI，粗体且斜体的碱基是变体碱基，粗体且加下划线的碱基是USJ，并且斜体且加下划线的碱基表示与两个靶标错配的另外碱基。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：26    反向引物3KRAS：
GGTCCTCCACCAGTAATATGC
SEQ ID NO：166    正向PASS引物5G12S_gi2平面：
AGACATACTA
SEQ ID NO：170    正向挤压PASS引物5G12S_LT10：
SEQ ID NO：87    正向PASS引物5G12V_LM4i2平面：
AGACATACTA
SEQ ID NO：171    反向挤压PASS引物3Kras_LT43
21.4.靶序列
从A549细胞系提取的人gDNA用作体外扩增点突变G12S的模板并且从SW480细胞系提取的人gDNA用作体外扩增点突变G12V的模板。从细胞系IM9(野生型)和SW480(G12V)提取的人gDNA用作KRAS变体G12S的阴性对照模板，并且从细胞系IM9(野生型)和A549(G12S)提取的人gDNA用作KRAS变体G12V的阴性对照模板。
21.5.反应组成：靶序列的扩增和检测
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和64℃60秒的10次循环(每个循环减1℃)、95℃15秒和54℃50秒的50次循环(在54℃步骤收集数据)。所有反应重复进行两次并且包括40nM正向引物、100nM部分酶A和200nM反向引物(组合在表37中列出)。所有反应还包括200nM部分酶B(KRAS_B/55-P)、200nM底物(Sub55-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及用作KRAS G12S靶标的阳性对照的35ng A549gDNA模板和用作阴性对照的35ng SW480(G12V)和IM9(WT)，35ng SW480gDNA模板用作KRAS G12V靶标的阳性对照并且35ng IM9(WT)和A549(G12S)用作阴性对照，并且另外对照不包含靶标(NF H2O)。
表37：用于变体测定的正向引物、反向引物和部分酶A组合
21.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
扩增和检测的结果总结在以下表38中。
表38：PASS引物与部分酶组合的Ct值
注意：当对于阴性对照样品来说未产生Ct时，50的最终Ct用于产生ΔCt并且放置在前面的大于符号(＞)指示ΔCt将预期高于这一值。
Ct值(表38)指示所有引物组合可有效地扩增靶基因。当将G12S正向PASS引物与标准反向引物组合和与反向挤压PASS引物组合进行比较时，对于两者来说阳性样品的Ct类似，然而当测试阴性对照样品时，反向挤压PASS引物展示更大特异性，其中ΔCt增加约5(表38)。当与标准反向引物一起使用时，采用正向挤压PASS引物的G12S测定展示良好的扩增和特异性。将它与反向挤压PASS引物组合证明有效的扩增和高特异性，从而给出类似的Ct和ΔCt(表38)。
当将G12V正向PASS引物与标准反向引物组合与当与反向挤压PASS引物组合时的结果相比较时，对于两者来说阳性样品的Ct类似，然而当测试阴性对照样品时，反向挤压PASS引物展示更大特异性，其中ΔCt增加大于11(表38)。
这个实施例证明将正向PASS引物与反向PASS引物组合而不影响扩增效率将是可行的。此外，将正向PASS引物与反向PASS引物组合还可改进反应的特异性。
实施例22：比较在不同位置中具有锗配碱基的PASS引物与MNA酶组合检测序列中的单碱基变化的特异性
在靶向被称为G12V的KRAS的密码子12中的点突变的测定中研究了在不同位置处含有不同类型的错配碱基的PASS引物的特异性。所述实施例研究了检测变体菌株G12V和区别它与野生型的能力。
设计3(图7)平面和环PASS引物用于扩增G12V序列。错配碱基位于从S2的3’端位置2、3或4处并且是C:C、A:C、A:G、G:A、A:A或C:A错配。将PASS引物与MNA酶qPCR组合，其中MNA酶包含第一部分酶，所述第一部分酶与独特序列的补体(cUS)以及含有变体(突变体)碱基和错配碱基的补体的扩增的靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶相邻地结合在扩增的目标靶序列内。
将具有不同错配组合的PASS引物进行比较以便研究对特异性的作用。
22.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向G12V序列和经由PASS引物引入的任何错配和cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列插入物(i2)。粗体和斜体形式的碱基表示变体(突变体)碱基并且加下划线且斜体形式的碱基表示另外的错配碱基。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：18      部分酶B KRAS_B/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：24      部分酶A G12V_LMi2A/55-P：
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：287     部分酶A G12V_g3i2A/55-P
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：288     部分酶A G12V_a3i2A/55-P
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：289     部分酶A G12V_c2i2A/55-P
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：290     部分酶A G12V_a2i2A/55-P
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：291     部分酶A G12V_a4i2A/55-P
AGACATACTA ACAACGAGAGGTGCGGT
22.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列按5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：25     底物Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
22.3.用于扩增KRAS DNA的PCR引物
使用以下所列出的寡核苷酸PCR引物进行人gDNA的体外扩增。在以下序列中，粗体形式的碱基与靶序列杂交，加下划线的碱基是相对于起始模板错配的独特序列，粗体且斜体形式的碱基是变体碱基，并且斜体且加下划线的碱基表示与两个靶标错配的另外碱基。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：26      反向引物3KRAS：
SEQ ID NO：50      正向PASS引物5G12V_LM3i2L环
AGACATACTA
SEQ ID NO：292     正向PASS引物5G12V_g3i2环
AGACATACTA
SEQ ID NO：293     正向PASS引物5G12V_a3i2环
AGACATACTA
SEQ ID NO：294     正向PASS引物5G12V_c2i2环
AGACATACTA
SEQ ID NO：295     正向PASS引物5G12V_a2i2环
AGACATACTA
SEQ ID NO：296     正向PASS引物5G12V_a4i2环
AGACATACTA
SEQ ID NO：87      正向PASS引物5G12V_LM4i2平面：
AGACATACTA
SEQ ID NO：297     正向PASS引物5G12V_g3i2平面
AGACATACTA
SEQ ID NO：298     正向PASS引物5G12V_a3i2平面
AGACATACTA
SEQ ID NO：299     正向PASS引物5G12V_c2i2平面
AGACATACTA
SEQ ID NO：300     正向PASS引物5G12V_a2i2平面
AGACATACTA
SEQ ID NO：301     正向PASS引物5G12V_a4i2平面
AGACATACTA
22.4.靶序列
从SW480细胞系提取的人gDNA用作体外扩增点突变G12V的模板。从细胞系IM9(野生型)提取的人gDNA用作KRAS变体G12V的阴性对照模板。
22.5.反应组成：靶序列的扩增和定量
靶序列的实时扩增和定量在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃5秒和60℃20秒的10次循环(每个循环减0.6℃)、95℃5秒和54℃20秒的50次循环(在54℃步骤收集数据)。所有反应重复进行两次并且包括40nM正向引物和100nM部分酶A(表39中所概括)、200nM反向引物(3KRAS)、200nM部分酶B(KRAS_B/55-P)、200nM底物(Sub55-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及作为测试模板的SW480gDNA(35ng)、作为阴性对照模板的K562 gDNA(35ng)或无靶标(NFH2O)。
表39：用于变体测定的正向引物与部分酶A组合
22.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
在不同位置处含有不同错配碱基的PASS引物用于产生用以实时检测KRAS变体G12V的扩增子。这一反应显示当所使用的靶序列是经由PCR扩增的测试人gDNA(SW480)时荧光随时间推移而增加。无模板对照的荧光低于含有DNA靶标的反应中的荧光。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于随后裂解报道底物的催化活性MNA酶的靶标依赖性组装。
在含有在位置3处具有错配碱基的PASS引物的反应中，与具有24.2/23.9(环/平面)的Ct的A:A错配相比，C:A错配对于测试反应产生22.7/22.5(环/平面)的更早Ct(表40)。C:A错配还比A:A错配更具特异性，其中测试与阴性对照之间的ΔCt是15.4/14.2(环/平面)对比对于A:A错配来说12.6/14.0(环/平面)(表40)。
在位置3处具有G:A错配的PASS引物不能区别测试与阴性对照模板，其中对于环设计和平面设计两者来说ΔCt为负值(表40)。此外，对通过使“G”而不是“C”或“A”插入位置3处形成的PASS引物序列的进一步分析显示S2的3’端处的前3个碱基可与野生型模板结合，其中在3’端1个碱基处S2区将结合在变体模板中，这种结合足够强以至于PASS引物不再对变体具有特异性。这是应在每次设计PASS引物时进行研究并且将对任何测试和阴性对照模板针对可能由于所选择的错配碱基引起的任何可能的错误引发进行检查的重要特征。
在从S2的3’端位置2处包括错配碱基的PASS引物证明增加的特异性，其中ΔCt在15.0至＞24.0的范围(表40)。然而，将错配放置在位置2处比在位置3处更不稳定，因为测试反应的Ct值也增加。在位置2处的C:C错配比C:A更不稳定，使Ct增加至32.1/31.7(环/平面)，并且还比位置3错配增加多出几乎10Ct(表40)。A:C错配似乎不太不稳定，对于环PASS引物和平面PASS引物两者来说仅使Ct增加至约25，其仅多于位置3处的最佳错配3Ct。注意在位置2处含有A:C错配的PASS引物是其中呈环形式的US展示优于呈平面形式的US的优点的唯一设计，其中与平面的15.0相比，ΔCt为＞24.3(表40)。
与在位置3处具有错配相比，在位置4处具有错配的PASS引物也展示良好特异性，其中ΔCt为13.1/14.4(环/平面)(表40)。
这个实施例证明错配碱基可位于PASS引物的S2区中的不同位置处并且仍维持有效性，并且错配的类型可进行定制以避免任何可能的错误引发或二级结构。
表40：G12V PASS对比WE-ARMS引物的Ct值
注意：当对于阴性对照样品来说未产生Ct时，50的最终Ct用于产生ΔCt并且放置在前面的大于符号(＞)指示ΔCt将预期高于这一值。
实施例23：在模型系统中研究不同引物与部分酶A设计组合的用途
在这个实施例中，TFRC基因组用作用于测试如图14中所描述的引物和部分酶A设计的不同组合的模型系统。
更具体地说，对以下情形进行了测试：(i)将标准正向引物与结合在所述正向引物的下游的标准MNA酶(图14(i A))或含有结合在所述正向引物的下游的挤压Pass部分酶A的MNA酶(Figure 14(i B))组合，(ii)将标准正向引物与结合在与所述正向引物重叠的区中的标准MNA酶(图14(iiA))或含有结合在与所述正向引物重叠的区中的挤压Pass部分酶A的标准MNA酶(图14(ii B))组合，或(iii)含有标签的正向引物与结合在与所述正向引物重叠的区中的标准MNA酶(图14(iiiA))或含有结合在与所述正向引物的标记的部分重叠的区中的标记的挤压Pass部分酶A的MNA酶(图14(iii C))。
将正向引物与部分酶A的不同组合与PCR扩增组合以实时读出以便确定它们是否与TFRC基因的扩增和检测相容。
23.1.部分酶寡核苷酸
设计了部分酶，所述部分酶是a)完全匹配的“标准”部分酶，其中感应臂与靶序列完全且连续互补，或b)挤压PASS部分酶，其中部分酶A与靶扩增子中的非连续序列伸展段互补，以使得扩增子的一部分在部分酶的感应臂中的USJ处环出。在一些序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交，小写碱基表示在USJ的任一侧的第一个碱基，并且加下划线的碱基与通过标记的正向引物插入到扩增子中的互补标签序列结合。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：145     部分酶B TFRC_2B/84-P：
TGGACGAGGGAGGCTAGCT
SEQ ID NO：146    部分酶A TFRC_2A/84-P：
ACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO：302     挤压PASS部分酶A TFRC_2(54)pp10A/84-P：
ACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO：303     挤压PASS部分酶A TFRC_2tagppA/84-P：
TCGTTACCTAGTCTAAGc ACAACGAGAGGGTCGAG
23.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。通过在450-490nm(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发和在510-530nm(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)发射，实时监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列按5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO：158     底物Sub84-FIB：
CTCGACCCTCguCCCTCGTCCA
23.3.靶序列和用于扩增TFRC的PCR引物
用于这一实施例的靶序列是从IM9细胞系(Promega)提取的人基因组DNA中的TFRC基因。寡核苷酸PCR引物在以下列出。在引物序列的5’端处的粗体形式的序列对应于未在靶基因序列中发现的标签(T1、T2或T3)。T1和T2用于增加引物的Tm而不影响引物对基因靶标的特异性。T3是用于将一段标签序列伸展段引入到扩增子的5’端中的较长标签。引物序列以5’至3’的顺序列出。
SEQ ID NO：304     反向引物3TFRC_2T2：
CTTTCTGAGGTTACCATCCTA
SEQ ID NO：160     正向引物5TFRC_T1：
CTGGGCAAGGAACAATAACTC
SEQ ID NO：305     正向引物5TFRC_3
AGAACTTACGCCTGCTTTCTGATTCTAGGAATATGGAAGGAG
SEQ ID NO:306     正向引物5TFRC_3T3
CTGATTCTAGGAATATGGAAGGAG
23.4.反应组成：靶序列的扩增
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和55℃30秒的5次循环、95℃15秒和52℃60秒的50次循环(在52℃步骤收集数据)。每组反应条件重复两次进行测试并且包括40nM正向引物和100nM部分酶A(如表41中所概括)、200nM部分酶B(TFRC_2B/84-P)、200nM反向引物(3TFRC_2T2)、200nM底物(Sub84-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及IM9 gDNA(50ng或50pg)或无靶标(NF H2O)。
表41：部分酶A与正向引物组合
23.5.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
无模板对照反应的最终荧光低于含有DNA靶标的反应中的荧光。这证明在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于催化活性MNA酶的靶标依赖性组装和报道底物的随后裂解。
在标准部分酶A上游使用标准引物(反应i A)导致检测TFRC基因，其中对于50ng和50pg来说Ct值分别是15.2和26(表42)。
表42：MNA酶qPCR的Ct值
使用挤压PASS部分酶A(反应i B)类似地检测到TFRC基因(表42)，其中有效检测50pg的靶标。
当与使用上游引物相比时，使用与标准部分酶A重叠的标准正向引物(反应ii A)导致对于50ng的模板来说更迟的Ct值(26.5)并且不能检测50pg的模板(表42)，其由于在部分酶的5’端与引物的3’端重叠时对于结合的竞争而降低了反应的效率。然而，相比之下，在用这种相同引物扩增之后使用挤压PASS部分酶A(反应ii B)检测导致比对于ii A反应来说更早的Ct值，从而指示反应ii B设计由于结合竞争的减少而是有利的。
与重叠的标准正向引物(反应ii A)相比，使用与标准部分酶A重叠的标记的标准正向引物(反应iii A)改进Ct值(表42)。当与标记的挤压PASS部分酶A组合使用时，反应(iii C)与当使用上游引物和标准部分酶A(反应i A)时表现类似，并且与使用上游引物和挤压PASS部分酶A(反应i B)表现相同(表42)。
总之，使用包含挤压PASS部分酶和重叠的正向引物的MNA酶检测靶序列可通过向正向引物和部分酶A添加标签序列来改进。这在例如需要扩增具有同源性区和变异性区的两个靶标时具有应用。挤压PASS部分酶与标签引物可被设计成与靶标的同源区结合并且使用标签以使得挤压PASS部分酶“跳过”可变区。所述实施例证明使用图14中所示的所有或任何设计的可行性并且测定的具体应用可影响设计的选择。
实施例24：研究含有由反义DNA酶组成的US插入物的PASS引物的用途。
已经示出了PASS引物，所述PASS引物包含与靶序列非互补的US并且因此提供独特序列用于在PCR过程中插入到扩增子中时由部分酶结合。还有可能使用US来将功能性序列插入到扩增子中，如DNA酶、适体或组装易化子。
在这个实施例中，PASS引物的US被设计成包含为DNA酶的无活性、反义形式同时仍与靶序列非互补的序列。在PCR过程中扩增之后，活性、有义DNA酶被插入到扩增子中并且可裂解底物以便实时产生信号(图15图片(ii))。将这与标准PASS引物相比，其中US不具有功能并且与靶序列非互补(图15图片(i))。将两种PASS引物与MNA酶qPCR组合，其中MNA酶包含与独特序列的补体(cUS)以及扩增的靶序列互补的第一部分酶。第二部分酶与第一部分酶在扩增的目标靶序列上相邻地结合。活性MNA酶然后将裂解底物1(Sub 1)，从而产生可实时监测的信号。将第二底物2(Sub 2)添加至两个反应，以使得在使用标准PASS部分酶时，底物2保持未裂解并且不产生信号(图15图片(i))。然而，在使用含有反义DNA酶的PASS引物时，在扩增之后活性DNA酶形成并且可裂解底物2，从而产生可实时监测的信号(图15图片(ii))。底物2可用与底物1不同的荧光团标记以便可区别两种信号，或底物2可用与底物1相同的荧光团标记，从而增强所产生的信号并且可能地降低Ct值。
将标准PASS引物与功能性PASS引物进行比较并且与PCR扩增组合以实时读出，以便确定它们是否与ROCK1基因的扩增和检测相容。此外，将另外底物添加至qPCR混合物以便确定活性DNA酶是否可被插入到扩增子中以及其对信号强度的作用。
24.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成特异性地靶向ROCK1基因加经由PASS引物引入的任何cUS。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交并且加下划线的碱基与独特序列的补体结合。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：307     部分酶B ROCK1_B/2-P
TGCCCAGGGAGGCTAGC
SEQ ID NO：308     部分酶A ROCK1_i13A/2-P
CCA ACAACGAGAGGAAACCTT
24.2.报道底物
在当前实施例中，将Sub2和Sub84底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。将Sub84底物在5’端用Quasar 670部分(在以下底物的名称中由“Q6”指示)进行端标记并且在3’端用Black Hole2部分(在以下底物的名称中由“B2”指示)进行端标记。在620-650nm之间(CFX96(BioRad)的Quasar 670激发波长范围)进行激发，在675-690nm之间(CFX96(BioRad)的Quasar 670发射波长范围)监测底物的裂解。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列以5’至3’的顺序。
SEQ ID NO：94      底物Sub2-FIB：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
SEQ ID NO:158     底物Sub84-FIB：
CTCGACCCTCguCCCTCGTCCA
SEQ ID NO：158     底物Sub84-Q6B2：
CTCGACCCTCguCCCTCGTCCA
24.3.靶序列和用于扩增TFRC的PCR引物
用于这一实施例的靶序列是从IM9细胞系(Promega)提取的人基因组DNA中的ROCK1基因。在以下序列中，粗体形式的碱基与目标靶序列杂交，加下划线的碱基是独特序列并且加下划线且斜体形式的碱基是包含反义DNA酶的独特序列。寡核苷酸PCR引物在以下列出。引物序列以5’至3’的顺序列出。
SEQ ID NO：309     反向引物3ROCK1：
SEQ ID NO:310     正向PASS引物5ROCK1_i13平面：
CATAGTGCCA
SEQ ID NO：311     正向PASS引物5ROCK1_i13asDz84P：
24.4.反应组成：靶序列的扩增
靶序列的实时扩增和检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是95℃2分钟、95℃15秒和61℃60秒的10次循环(-1℃/循环)、95℃15秒和52℃50秒的40次循环(在52℃步骤收集数据)。每组反应条件重复两次进行测试并且包括40nM正向引物和200nM另外底物，如表43中所概括。所有反应包括100nM部分酶A(ROCK1_i13A/2-P)、200nM部分酶B(ROCK1_B/2-P)以及200nM反向底物(3ROCK1)、200nM底物(Sub2-FIB)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP、10单位RiboSafe RNA酶抑制剂(Bioline)、1×ImmoBuffer(Bioline)、2单位的MyTaqTM HS DNA聚合酶(Bioline)以及IM9 gDNA模板(50pg)或无靶标(NF H2O)。
表43：PASS引物与底物组合
24.5.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
在含有包含标准或功能性US的ROCK1 PASS引物的反应中，50pg gDNA(IM9)的Ct值指示成功扩增和检测(表44)。
含有标准PASS引物与裂解Sub2-FIB的MNA酶的测定可比较地表现，无论另外底物Sub84用FAM还是Quasar 670(Q670)标记，其中对于50pg来说Ct是约24(表44)。当使用功能性PASS引物(其将活性DNA酶并入到扩增子中)时，Sub2-FIB的MNA酶裂解和Sub84-Q670的DNA酶裂解均产生约25的Ct(表44)。使用均用FAM标记的Sub2和Sub84、从而产生底物的MNA酶和DNA酶裂解的单一曲线导致约23的Ct。
这证明DNA酶可被插入到扩增子中而不影响MNA酶反应的效率并且组合MNA酶与DNA酶信号可改进所获得的Ct值。
虽然这个实施例使用PASS引物来将DNA酶并入到扩增子中，但对于本领域技术人员来说显而易见的是PASS引物还可用于将其它功能性序列并入到扩增子中，如适体、部分酶或另外的MNA酶组装易化子。
表44：MNA酶qPCR的Ct值
实施例25：使用单一PASS引物和单一MNA酶检测多种肠道病毒RNA。
肠道病毒属是一组超过60种密切相关、但独特的病毒。检测任何肠道病毒的存在是脑膜炎的治疗计划中的关键步骤。因而，积极寻求可有效地检测尽可能多的肠道病毒的简单廉价的测试。在此描述PASS引物的使用，所述引物被设计成在其5’端(S1)和3’端(S2)与所有肠道病毒中发现的共用序列结合，但通过在S1与S2之间添加独特序列(US)来跳过每种肠道病毒中的68bp可变区(如图6和图12(ii)中所描述)。PASS引物被设计成扩增所有已知的肠道病毒RNA并且将把US的补体引入到扩增子中替代可变序列。单一MNA酶然后用于通过靶向US和共用(保守的)肠道病毒序列的补体来检测任何扩增的肠道病毒序列(如图6和图12(ii)中所描述)。
在这个实施例中证明被设计成在qPCR中扩增肠道病毒71和脊髓灰质炎病毒3两者并且与MNA酶检测组合的PASS引物的用途，其中两种病毒都可用包含第一部分酶的相同MNA酶检测，所述第一部分酶与US插入物的补体(cUS)以及肠道病毒71和脊髓灰质炎病毒3两者的扩增的共同靶序列结合。第二部分酶与第一部分酶相邻地结合，从而与扩增的目标靶序列杂交。将这与被设计成在qPCR中扩增肠道病毒71和脊髓灰质炎病毒3两者并且与MNA酶检测组合的标准引物的用途进行比较，其中每种病毒需要包含第一部分酶和第二部分酶的独特MNA酶，所述第一部分酶特异性得靶向每种病毒并且所述第二部分酶可用于两者并且与所述第一部分酶相邻地结合，从而与扩增的目标靶序列杂交。
25.1.部分酶寡核苷酸
部分酶被设计成检测(i)肠道病毒71RNA、(ii)脊髓灰质炎病毒3RNA或(iii)所有肠道病毒RNA(通过将可变序列转换成扩增子中的US，通过使用PASS引物)。粗体形式的碱基指示对于两种病毒靶标具有特异性的序列，斜体形式的碱基指示共同肠道病毒序列，加下划线的碱基表示US。“-P”指示寡核苷酸的3’磷酸化。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：312     部分酶A(i)Ent71_A/55-P
ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：313     部分酶A(ii)Polio3_A/55-P
ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO:314     部分酶A(iii)Ent_i14A/55-P
CTCCATTACT ACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO:315     部分酶B Ent_B/55-P
GAGCTGGGGAGGCTAGCT
25.2.报道底物
在当前实施例中，将底物在5’端用6-FAM部分(在以下底物的名称中由“F”指示)进行端标记并且在3’端用IowaFQ淬灭剂部分(在以下底物的名称中由“IB”指示)进行端标记。在450-490nm之间(CFX96(BioRad)的FAM激发波长范围)进行激发，在510-530nm之间(CFX96(BioRad)的FAM发射波长范围)监测底物的裂解。用于这一实施例的报道底物在以下示出，其中序列按5’至3’的顺序。小写碱基表示RNA并且大写碱基表示DNA。
SEQ ID NO:25   底物Sub55-FIB
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
25.3.用于肠道病毒RNA的PCR引物。
标准引物和PASS引物被设计成与所有肠道病毒RNA物种中的共同序列结合。在以下序列中，粗体形式的碱基与两种肠道病毒物种所共同的序列杂交，而加下划线的碱基表示与肠道病毒RNA的可变区错配的独特序列。斜体形式的碱基指示不是靶序列的一部分的短标签序列(T1或T2)，其被添加以便增加引物的Tm。所有序列以5’至3’的顺序书写。
SEQ ID NO：316    正向引物5Ent_T1
SEQ ID NO：317    正向PASS引物5Ent_i14
CTCCATTACT
SEQ ID NO：318    反向引物3Ent_T2
25.4.模板
从Viricell获得提取的肠道病毒71RNA。从Asuragen获得脊髓灰质炎病毒3RNA作为噬菌体涂覆的RNA(Armored RNA)。通过在75℃下加热3分钟来从噬菌体释放脊髓灰质炎病毒3RNA。
25.5.反应组成
靶序列的逆转录和实时扩增以及检测在25μL的总反应体积中进行。反应在CFX96TM实时PCR检测系统(BioRad)中进行。循环参数是48℃20分钟、95℃2分钟、95℃15秒和55℃30秒的5次循环、95℃15秒和54℃60秒的40次循环(在54℃步骤收集数据)。每组反应条件重复两次进行测试并且包括40nM正向引物和200nM部分酶A(i)或(ii)或100nM部分酶A(iii)，如表45中所概括。所有反应包括200nM底物(Sub55-FIB)、反向引物(3Ent_T2)以及部分酶B(Ent_B/55-P)、8mM MgCl2、200μM的每种dNTP和含有SensiFASTTM探针无ROX一步混合物的1×SensiFASTTM探针无ROX一步试剂盒(Bioline)、RiboSafe RNA酶抑制剂、逆转录酶(按照制造商说明书使用)。所使用的模板是肠道病毒71(1000和100个拷贝)或脊髓灰质炎病毒3RNA模板(1000和100个拷贝)或无靶标对照(NF H2O)。
表45：正向引物与部分酶A组合
25.6.结果：靶标的扩增和报道底物的裂解
PASS引物检测肠道病毒71模板(反应(3a))和脊髓灰质炎病毒3模板(反应(3b))，其中所产生的信号处于非常类似的Ct值，从而指示PASS引物能够以类似效率检测多种肠道病毒(表46)。此外，PASS系统以与其等效标准引物和匹配部分酶的组合(反应(1)和(2))类似的效率检测对应病毒，即使在存在低拷贝数目(100个拷贝)的情况下(表46)，从而指示所述PASS引物系统对物种特异性完全匹配的系统具有类似的灵敏度。
表46：MNA酶qPCR的Ct值
所述实验证明PASS引物可用于以与完全匹配的标准引物类似的效率特异性地且灵敏地扩增扩增变体但相关的序列。此外，这种PASS引物允许在病毒家族的不同物种之间可变的序列的较大区的环出。在这个实施例中，被PASS引物跳过的区是几乎70个碱基长并且在肠道病毒71RNA与脊髓灰质炎病毒3RNA之间是高度可变的。
关于本说明书的实施例中使用的部分酶/MNA酶的另外注释
在以上实施例中提及的MNA酶包含通过互补碱基配对在靶序列上彼此相邻杂交的第一部分酶组分和第二部分酶组分。当这类MNA酶用于涉及产生靶多核苷酸序列的拷贝的应用(其中DNA聚合酶与引物结合使用以便产生扩增子)(例如PCR)中时，优选的是修饰部分酶的3’端以便防止在与靶多核苷酸或其扩增子杂交的情况下DNA聚合酶延伸部分酶。这种延伸可产生扩增产物，所述扩增产物使反应组分隔绝远离(i)从PCR引物扩增和(ii)使用MNA酶部分酶检测。
可以多种方式修饰寡核苷酸以便防止通过DNA聚合酶延伸。在以上实施例中，部分酶已经进行3’磷酸化以用于在qPCR中使用。然而，本领域技术人员将认识到可使用其它修饰。例如，已在本领域中使用以下修饰来防止寡核苷酸通过DNA聚合酶延伸：寡核苷酸的3’端核苷酸的3’磷酸化(核苷酸的核糖或2-脱氧核糖的的3’碳的磷酸化)；使用“双脱氧”核苷酸(2’，3’双脱氧核苷酸)作为寡核苷酸的3’端核苷酸；将C3-间隔基(3’丙基)添加至寡核苷酸的3’端核苷酸；在寡核苷酸中的末端核苷酸与倒数第二位核苷酸之间使用3’3’键联(“反转”末端核苷酸)。本领域的技术人员将了解任何这些方法可用于防止部分酶在扩增方法如PCR过程中的延伸。此外，本领域的技术人员还将承认到当靶序列不进行扩增而直接通过MNA酶检测时，那么以上实施例中使用的任何部分酶可在无3’修饰的情况下使用，因为将不存在部分酶延伸的风险。

Claims (117)

1.一种用于确定样品中靶多核苷酸的存在或不存在的方法，所述方法包括：
提供引物寡核苷酸，所述引物寡核苷酸包含
第一引物组分，所述第一引物组分终止于所述寡核苷酸的5’端并且能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸的链的第一部分杂交，以及
第二引物组分，所述第二引物组分终止于所述寡核苷酸的3’端并且能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链的第二部分杂交；
使潜在包含所述靶多核苷酸的样品与所述引物寡核苷酸在适合于所述第一引物组分和所述第二引物组分与所述靶多核苷酸链杂交的条件下相接触，以便由此形成双链的双链体，其中所述双链体的中间区段的至少一条链包含至少四个核苷酸的序列，所述至少四个核苷酸的序列由于所述中间区段的相对链中不存在与所述至少四个核苷酸的序列共有碱基对互补性的核苷酸序列而保持与所述中间区段的所述相对链未杂交；
使所述样品与能够使用所述靶多核苷酸链作为模板的聚合酶相接触以便延伸所述双链体的所述引物寡核苷酸的长度并且由此产生包含位于第一端组分与第二端组分中间的内部组分的扩增子，其中
所述扩增子的所述第一端组分能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链的所述第一部分杂交，
所述扩增子的所述第二端组分能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链的所述第二部分杂交，以及
所述扩增子的所述第一端组分和所述第二端组分与所述靶多核苷酸链的所述杂交使所述扩增子的所述内部组分定位成与所述靶多核苷酸链中、位于所述靶多核苷酸链的所述第一部分与所述第二部分之间的中间核苷酸序列相对，所述中间核苷酸序列不与所述内部组分共有碱基对互补性；以及
检测是否产生所述扩增子，其中检测到所述扩增子指示所述样品中存在所述靶多核苷酸，并且未能检测到所述扩增子指示所述样品中不存在所述靶多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括检测所述扩增子的所述内部组分或与所述扩增子的所述内部组分互补的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在所述通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链杂交时，所述第一引物组分的熔解温度大于所述第二引物组分的熔解温度。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述双链的双链体的所述中间区段的所述至少一条链包含保持与所述双链体的所述相对链未杂交的至少五个、至少六个、至少七个或至少8个核苷酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述引物寡核苷酸包含位于所述第一引物组分与所述第二引物组分之间的第三引物组分，其中所述第三引物组分由以下核苷酸序列组成：
其不与所述靶多核苷酸链中的所述中间核苷酸序列共有碱基对互补性，并且
与所述扩增子的所述内部组分中的核苷酸序列一致。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第三引物组分部分或完全位于所述引物寡核苷酸的3’一半中。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述第三引物组分和所述中间核苷酸序列中的核苷酸的数目相等。
8.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述第三引物组分中的核苷酸的数目超过所述中间核苷酸序列中的核苷酸的数目。
9.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述第三引物组分中的核苷酸的数目小于所述中间核苷酸序列中的核苷酸的数目。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第三引物组分中的核苷酸的数目是介于1与200个核苷酸、1与150个核苷酸、1与100个核苷酸、1与75个核苷酸、1与50个核苷酸、1与25个核苷酸、5与200个核苷酸、5与150个核苷酸、5与100个核苷酸、5与100个核苷酸、5与75个核苷酸、5与50个核苷酸、5与25个核苷酸、10与200个核苷酸、10与150个核苷酸、10与100个核苷酸、10与100个核苷酸、10与75个核苷酸、10与50个核苷酸、或10与25个核苷酸之间，小于所述靶多核苷酸中位于与所述第一引物组分和所述第二引物组分杂交的所述靶多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一引物组分中的核苷酸的数目超过所述第二引物组分中的核苷酸的数目。
12.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述双链的双链体的所述中间区段的所述至少一条链是所述靶多核苷酸链的组分。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述靶多核苷酸链的所述组分由所述中间核苷酸序列组成。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述第一引物组分和所述第二引物组分通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链的分开的不连续的组分杂交，从而使所述不连续的组分并置并且在所述靶多核苷酸链中形成包含未杂交的核苷酸的环部分。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述引物寡核苷酸的所有核苷酸通过互补碱基配对与所述靶寡核苷酸链杂交。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述靶多核苷酸的所述环部分包含介于1与200个之间的核苷酸、1与150个之间的核苷酸、1与100个之间的核苷酸、1与75个之间的核苷酸、1与50个之间的核苷酸、1与25个之间的核苷酸、5与200个之间的核苷酸、5与150个之间的核苷酸、5与100个之间的核苷酸、5与100个之间的核苷酸、5与75个之间的核苷酸、5与50个之间的核苷酸、5与25个之间的核苷酸、10与200个之间的核苷酸、10与150个之间的核苷酸、10与100个之间的核苷酸、10与100个之间的核苷酸、10与75个之间的核苷酸、10与50个之间的核苷酸、或10与25个之间的核苷酸。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述接触包括
接触第二引物寡核苷酸，所述第二引物寡核苷酸与为所述第一靶多核苷酸链的补体的第二靶多核苷酸链共有碱基对互补性，以及
使用所述第二靶多核苷酸链作为模板，使用聚合酶来延伸所述第二引物寡多核苷酸的长度并且由此产生第二扩增子。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述检测包括检测所述第二扩增子。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用以下各项中的任何一个或多个：聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中
所述靶多核苷酸链包含在所述靶多核苷酸的群体的两个或更多个单独成员之间变化的多态区，
所述第一引物组分和所述第二引物组分各自能够由于以下而与所述群体的多个成员杂交：所述第一引物组件与所述靶多核苷酸链的定位在所述多态区上游的组分共有序列互补性，并且所述第二引物组件与所述靶多核苷酸链的定位在所述多态区下游的组分共有序列互补性，以及
当所述第一引物组分和所述第二引物组分与所述靶多核苷酸杂交时，所述多态区保持与所述引物寡核苷酸未杂交。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述多态区包含一个或多个核苷酸的缺失，以使得所述多态区的长度在所述靶多核苷酸的所述群体的所述两个或更多个单独成员之间不同。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述多态区包含一个或多个核苷酸的取代，以使得所述多态区核苷酸序列在所述靶多核苷酸的所述群体的所述两个或更多个单独成员之间不同。
23.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中
所述靶多核苷酸链包含单核苷酸多态性(SNP)和/或点突变；
所述扩增子包含
(i)与所述SNP互补的核苷酸，和/或
(ii)与所述点突变互补的核苷酸；
以及
所述第一或所述第二引物组分能够通过互补碱基配对与以上(i)和/或(ii)杂交。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第二引物组分包含与所述SNP互补的所述核苷酸，或与所述点突变互补的所述核苷酸，所述核苷酸位于
所述第二引物组分的所述3’末端处，
所述第二引物组分的所述3’末端上游一个、两个、三个、四个、五个或多于五个核苷酸处，
所述第二引物组分的所述3’末端处，其中所述第二引物组分还包含与所述靶多核苷酸非互补的核苷酸，所述核苷酸位于所述3’末端上游两个、三个、四个、五个、六个或多于六个核苷酸处，或
所述第二引物组分的所述3’末端上游一个、两个、三个、四个、五个或多于五个核苷酸处，其中所述第二引物组分还包含与所述靶标非互补的另一核苷酸，并且所述另一核苷酸位于与所述SNP或所述点突变互补的所述核苷酸的3’或5’。
25.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中
所述靶多核苷酸链包含在所述靶多核苷酸的群体的至少两个单独成员之间不同的多态区，
所述多态区包含一个或多个核苷酸的缺失，以使得所述多态区在所述靶多核苷酸的所述群体的所述两个或更多个单独成员之间不同，以及
所述第一引物组分或所述第二引物组分能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸链中的所述多态区杂交，其中所述多态区存在于仅一个子组的群体成员的所述靶多核苷酸链中。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述检测是否产生所述扩增子包括测量由与双链DNA结合的染料和/或扩增子序列特异性探针提供的信号。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述与双链DNA结合的染料为SYBR绿。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述序列特异性探针为分子信标、小沟结合物(MGB)探针或探针。
29.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述检测包括使用包含至少两个或更多个部分酶组分寡核苷酸的多组分核酸酶(MNA酶)，其中至少第一部分酶组分和第二部分酶组分在存在所述扩增子的情况下自组装以便形成催化活性的MNA酶，其中所述第一部分酶组分和第二部分酶组分各自包含底物臂部分、催化核心部分以及感应臂部分；
其中在自组装时，所述第一部分酶组分和所述第二部分酶组分的所述感应臂部分充当所述MNA酶的感应臂，所述第一部分酶组分和所述第二部分酶组分的所述底物臂部分充当所述MNA酶的底物臂，并且所述第一部分酶组分和所述第二部分酶组分的所述催化核心部分充当所述MNA酶的催化核心；
并且其中所述MNA酶的所述感应臂通过互补碱基配对与所述扩增子中的一些或全部杂交，以便将所述第一部分酶组分和所述第二部分酶组分维持靠近以用于缔合其对应的催化核心部分，以便形成所述MNA酶的所述催化核心，所述催化核心能够修饰至少一种底物，并且其中所述MNA酶的所述底物臂接合底物以使得所述MNA酶的所述催化核心可修饰所述底物并且由此提供可检测作用。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述MNA酶的第一和/或第二感应臂与包含以下各项或由以下各项组成的核苷酸序列互补或大体上互补：
所述扩增子的所述内部组分或其组分，或
与所述扩增子的所述内部组分或其组分互补的核苷酸序列。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述MNA酶的所述第一和/或所述第二感应臂另外与所述扩增子中包含以下各项或由以下各项组成的核苷酸序列互补：
所述扩增子的所述第一端组分和/或所述第二端组分或其组分，或
与所述扩增子的所述第一端组分和/或所述第二端组分或其组分互补的核苷酸序列。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述MNA酶的第一和/或第二感应臂与以下各项互补或大体上互补：
所述扩增子中不包含以下各项或不由以下各项组成的核苷酸序列：所述扩增子的所述内部组分或其组分，或
与所述扩增子中不包含以下各项或不由以下各项组成的核苷酸序列互补的核苷酸序列：所述扩增子的所述内部组分或其组分。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述MNA酶的所述第一和/或所述第二感应臂包含与以下各项互补的核苷酸：
所述靶多核苷酸链中存在的单核苷酸多态性(SNP)和/或点突变，或
与所述靶多核苷酸链中存在的所述SNP互补的核苷酸，和/或与所述点突变互补的核苷酸。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中
所述靶多核苷酸链包含在所述靶多核苷酸的群体的两个或更多个单独成员之间不同的多态区，以及
所述MNA酶的所述第一和/或所述第二感应臂另外与所述扩增子中包含以下各项或由以下各项组成的核苷酸序列互补：
所述群体的给定成员的所述多态区或其组分，或
与所述群体的给定成员的所述多态区或其组分互补的核苷酸序列。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述多态区包含核苷酸的一个或多个缺失、插入和/或取代，以使得所述多态区的序列在所述群体的所述单独成员之间变化。
36.根据权利要求29所述的方法，其中所述MNA酶的感应臂包含以下各项或由以下各项组成：第一感应臂组分、第二感应臂组分以及第三感应臂组分，其中
所述第一感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子杂交；
所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子杂交；以及
所述第三感应臂组分位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间并且在所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分与所述扩增子杂交时不能通过互补碱基配对与所述扩增子杂交。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目等于或超过所述扩增子中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述扩增子的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目小于所述扩增子中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述扩增子的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目是介于1与50个核苷酸、1与40个核苷酸、1与30个核苷酸、1与20个核苷酸、1与10个核苷酸、5与50个核苷酸、5与40个核苷酸、5与30个核苷酸、5与20个核苷酸、5与10个核苷酸、10与50个核苷酸、10与40个核苷酸、10与30个核苷酸、或10与20个核苷酸之间，小于所述扩增子中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述扩增子的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
40.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的分开的不连续的组分杂交，从而使所述不连续的组分并置并且在所述扩增子中形成包含未杂交的核苷酸的环部分。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述扩增子的所述环部分包含介于1与50个之间的核苷酸、1与40个之间的核苷酸、1与30个之间的核苷酸、1与20个之间的核苷酸、1与10个之间的核苷酸、1与5个之间的核苷酸、5与50个之间的核苷酸、5与40个之间的核苷酸、5与30个之间的核苷酸、5与20个之间的核苷酸、5与10个之间的核苷酸、10与50个之间的核苷酸、10与40个之间的核苷酸、10与30个之间的核苷酸、或10与20个之间的核苷酸。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述扩增子的所述环部分包含扩增子的所述内部组分。
43.根据权利要求5至11中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸链包含在所述靶多核苷酸的群体的两个或更多个单独成员之间不同的多态区，以及：
所述提供包括提供多种形式的所述引物寡核苷酸，其中所述引物寡核苷酸的不同形式与以下各项共有碱基对互补性：
不同形式的所述多态区，或，
所述靶多核苷酸链的邻近或大体上邻近一种或多种形式的所述多态区的一部分；
所述与所述引物寡核苷酸相接触包括使潜在包含所述靶多核苷酸群体的一个或多个成员的样品与所述多种形式的所述引物寡核苷酸在适合于杂交的条件下相接触；以及
其中所述多种形式的所述引物寡核苷酸各自包含所述第三引物组分，所述第三引物组分位于所述第一引物组分与所述第二引物组分之间并且由不与所述靶多核苷酸链中的所述中间核苷酸序列共有碱基对互补性的核苷酸序列组成。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述检测包括使用包含第一感应臂组分、第二感应臂组分以及第三感应臂组分的MNA酶，其中
所述第一感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的所述内部组分、并且任选地与所述扩增子的所述第一端组分杂交；以及
所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的所述第二端组分杂交；以及
所述第三感应臂组分位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间并且在所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分与所述扩增子杂交时不能通过互补碱基配对与所述多态区或与所述多态区互补的核苷酸序列杂交。
45.根据权利要求44所述的方法，其中
多种形式的包含所述多态区的所述扩增子通过所述样品与聚合酶的所述接触来产生，其中所述扩增子的所述每种形式的所述多态区不同；以及
所述感应臂包含以下各项或由以下各项组成：第一感应臂组分、第二感应臂组分和第三感应臂组分，所述第三感应臂组分不与所述扩增子中包含所述多态区或由其组成的核苷酸序列互补，其中
所述第一感应臂组分能够在所述多态区的上游通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子杂交，
所述第二感应臂组分能够在所述多态区的下游通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子杂交，
所述第三感应臂组分位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间，并且不能通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子的所述多态区杂交。
46.根据权利要求43所述的方法，其中
多种形式的包含所述多态区的所述扩增子通过所述样品与聚合酶的所述接触来产生，其中所述形式的所述扩增子的所述多态区不同；以及
所述感应臂包含第一感应臂组分和第二感应臂组分或由其组成，其中
所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分通过互补碱基配对与任何给定形式的所述扩增子的分开的不连续的组分杂交，从而使所述不连续的组分并置并且在所述扩增子中形成包含未杂交的核苷酸的环部分，以及
所述环部分的所述未杂交的核苷酸包含所述扩增子的所述多态区。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的方法，其中所述多态区包含核苷酸插入、缺失和/或取代中的任何一种或多种，以使得所述靶多核苷酸群体的所述两个或更多个单独成员可不同。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述引物寡核苷酸和/或所述靶多核苷酸和/或所述扩增子包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合或由其组成。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸和/或所述扩增子是基因组DNA、互补DNA(cDNA)或RNA。
50.根据权利要求1至29、32、36至41、43或46中任一项所述的方法，其中所述引物寡核苷酸包含与功能活性的催化性核酸互补的核苷酸序列。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述扩增子包含所述功能活性的催化性核酸，并且所述检测是否产生所述扩增子包括检测所述扩增子中存在的所述功能活性的催化性核酸的催化活性。
52.根据权利要求50或权利要求51所述的方法，其中所述功能活性的催化性核酸是DNA酶或核酶。
53.根据权利要求51或权利要求52所述的方法，其中所述检测所述扩增子中存在的所述功能活性的催化性核酸的催化活性包括使所述扩增子与所述功能活性的催化性核酸的底物相接触。
54.一种分离的引物或部分酶寡核苷酸，其包含
第一组分，所述第一组分终止于所述寡核苷酸的5’端并且能够通过互补碱基配对与第二多核苷酸的第一部分杂交，
第二组分，所述第二组分终止于所述寡核苷酸的3’端并且能够通过互补碱基配对与所述第二多核苷酸的第二部分杂交，以及
位于所述第一组分与所述第二组分之间的第三组分，所述第三组分包含当所述第一组分和所述第二组分与所述第二多核苷酸杂交时不与所述第二多核苷酸中的相对核苷酸序列共有碱基对互补性的至少四个核苷酸的序列；
其中所述第三组分部分或完全位于所述寡核苷酸的3’一半。
55.根据权利要求54所述的寡核苷酸，其中所述第三组分包含不与所述第二多核苷酸中的所述相对核苷酸序列共有碱基对互补性的至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个核苷酸的序列。
56.根据权利要求54或权利要求55所述的寡核苷酸，其中所述第一组分中的核苷酸的数目：
小于所述第三组分中的核苷酸的数目；或
多于所述第三组分中的核苷酸的数目。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含DNA、互补DNA(cDNA)、RNA或其任何组合。
58.根据权利要求54至57中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是部分酶感应臂的组分。
59.根据权利要求54至58中任一项所述的寡核苷酸在根据权利要求1至53中任一项所述的方法中的用途。
60.一种分离的双链核酸双链体，其包含通过互补碱基配对与第二多核苷酸杂交的如权利要求54至58中任一项所述的寡核苷酸，其中
所述寡核苷酸的第一组分终止于所述寡核苷酸的5’端并且通过互补碱基配对与第二多核苷酸的第一部分杂交，
所述寡核苷酸的第二组分终止于所述寡核苷酸的3’端并且通过互补碱基配对与所述第二多核苷酸的第二部分杂交，以及
所述寡核苷酸的第三组分位于所述第一组分与所述第二组分之间并且包含不与所述第二多核苷酸中的相对核苷酸序列共有碱基对互补性的至少两个核苷酸的序列；以及
所述寡核苷酸的所述第三组分部分或完全位于所述寡核苷酸的3’一半。
61.根据权利要求60所述的双链核酸双链体，其中所述第三组分中的核苷酸的数目等于所述第二多核苷酸中位于与所述第一组分和所述第二组分杂交的所述第二多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
62.根据权利要求61所述的双链核酸双链体，其中所述第三组分中的核苷酸的数目超过所述第二多核苷酸中位于与所述第一组分和所述第二组分杂交的所述第二多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
63.根据权利要求61所述的双链核酸双链体，其中所述第三组分中的核苷酸的数目小于所述第二多核苷酸中位于与所述第一组分和所述第二组分杂交的所述第二多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
64.根据权利要求61所述的双链核酸双链体，其中所述第三中的核苷酸的数目是介于1与200个核苷酸、1与150个核苷酸、1与100个核苷酸、1与75个核苷酸、1与50个核苷酸、1与25个核苷酸、5与200个核苷酸、5与150个核苷酸、5与100个核苷酸、5与100个核苷酸、5与75个核苷酸、5与50个核苷酸、5与25个核苷酸、10与200个核苷酸、10与150个核苷酸、10与100个核苷酸、10与100个核苷酸、10与75个核苷酸、10与50个核苷酸、或10与25个核苷酸之间，小于所述第二多核苷酸中位于与所述第一组分和所述第二组分杂交的所述第二多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
65.根据权利要求60至64中任一项所述的双链核酸双链体，其中所述寡核苷酸和/或所述第二多核苷酸是基因组DNA、互补DNA(cDNA)或RNA。
66.一种包含感应臂的多组分核酸酶(MNA酶)，所述感应臂包含第一感应臂组分和第二感应臂组分或由其组成，其中
所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与组装易化子多核苷酸杂交，以便由此形成双链的双链体，其中所述双链体的中间组分的至少一条链包含保持与所述双链体的相对链未杂交的至少两个核苷酸。
67.根据权利要求66所述的MNA酶，其中所述感应臂包含以下各项或由以下各项组成：第一感应臂组分、第二感应臂组分和位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间的第三感应臂组分，其中在所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分与所述组装易化子多核苷酸的所述杂交时，所述第三感应臂组分由于不存在与所述组装易化子多核苷酸的碱基对互补性而不能与所述组装易化子多核苷酸杂交。
68.根据权利要求67所述的MNA酶，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目等于或超过所述组装易化子多核苷酸中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述组装易化子多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
69.根据权利要求67所述的MNA酶，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目小于所述组装易化子多核苷酸中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述组装易化子多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
70.根据权利要求69所述的MNA酶，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目是介于1与200个核苷酸、1与150个核苷酸、1与100个核苷酸、1与75个核苷酸、以及50个核苷酸、1与25个核苷酸、5与200个核苷酸、5与150个核苷酸、5与100个核苷酸、5与100个核苷酸、5与75个核苷酸、5与50个核苷酸、5与25个核苷酸、10与200个核苷酸、10与150个核苷酸、10与100个核苷酸、10与100个核苷酸、10与75个核苷酸、10与50个核苷酸、或10与25个核苷酸之间，小于所述组装易化子多核苷酸中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述组装易化子多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
71.根据权利要求66所述的MNA酶，其中所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述组装易化子多核苷酸的分开的不连续的组分杂交，从而使所述不连续的组分并置并且在所述组装易化子多核苷酸中形成包含未杂交的核苷酸的环部分。
72.根据权利要求71所述的MNA酶，其中所述组装易化子多核苷酸的所述环部分包含介于1与50个之间的核苷酸、1与40个之间的核苷酸、1与30个之间的核苷酸、1与20个之间的核苷酸、1与10个之间的核苷酸、1与5个之间的核苷酸、5与50个之间的核苷酸、5与40个之间的核苷酸、5与30个之间的核苷酸、5与20个之间的核苷酸、5与10个之间的核苷酸、10与50个之间的核苷酸、10与40个之间的核苷酸、10与30个之间的核苷酸、或10与20个之间的核苷酸。
73.根据66至72中任一项所述的MNA酶，其中所述组装易化子多核苷酸是用于通过所述MNA酶检测的靶多核苷酸。
74.一种核酸复合物，其包含通过互补碱基配对与所述组装易化子多核苷酸杂交的如权利要求66至73中任一项所述的MNA酶。
75.根据权利要求66至73中任一项所述的MNA酶用于检测样品中靶多核苷酸的存在或不存在的用途，其中所述多核苷酸靶标是所述组装易化子。
76.一种用于确定样品中靶多核苷酸的存在或不存在的方法，所述方法包括：
提供能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸杂交的引物寡核苷酸，
使潜在包含所述靶多核苷酸的样品与所述引物寡核苷酸在适合于所述引物寡核苷酸与所述靶多核苷酸通过互补碱基配对杂交的条件下相接触，以便由此形成双链的双链体，
使所述样品与能够使用所述靶多核苷酸作为模板的聚合酶相接触以便延伸所述双链体的所述引物寡核苷酸的长度并且由此产生扩增子，以及
使用根据权利要求66所述的MNA酶来检测是否产生所述扩增子，其中检测到所述扩增子指示所述样品中存在所述靶多核苷酸，并且未能检测到所述扩增子指示所述样品中不存在所述靶多核苷酸。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述第一感应臂组分包含与以下各项共有碱基对互补性的核苷酸序列：
(i)所述扩增子或其组分，或
(ii)与所述扩增子或其组分互补的核苷酸序列；
并且所述检测包括检测所述第一感应臂组分是否通过互补碱基配对与以上的(i)或(ii)杂交。
78.根据权利要求76所述的方法，其中
所述靶多核苷酸包含在所述靶多核苷酸的群体的两个或更多个单独成员之间变化的多态区
提供一系列所述引物寡核苷酸，所述引物寡核苷酸各自能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸群体的至少一个所述靶多核苷酸杂交，其中每个所述引物寡核苷酸与仅存在于所述靶多核苷酸群体的所述成员中的一些中的特定形式的所述多态区共有碱基对互补性；以及
每个所述引物寡核苷酸包含在所述样品与聚合酶的所述接触之后并入到所述扩增子的群体中的每个中的一致的标签部分核苷酸序列，其中所述扩增子群体的每个所述成员包含仅存在于所述扩增子群体的所述成员中的一些中的多态区；
并且其中所述检测包括确定所述MNA酶的所述第一感应臂是否通过互补碱基配对与所述扩增子群体的成员的所述标签部分杂交。
79.一种用于确定样品中靶多核苷酸的存在或不存在的方法，其中所述靶多核苷酸包含在所述靶多核苷酸的群体的两个或更多个单独成员之间变化的多态区，所述方法包括：
提供能够通过互补碱基配对与所述靶多核苷酸杂交的引物寡核苷酸，其中所述引物寡核苷酸与仅存在于所述群体的所述成员中的一些中的特定形式的所述多态区或与所述靶多核苷酸的邻近或大体上邻近所述特定形式的所述多态区的一部分共有碱基对互补性；
使潜在包含所述靶多核苷酸的样品与所述引物寡核苷酸在适合于所述引物寡核苷酸与所述靶多核苷酸通过互补碱基配对杂交的条件下相接触，以便由此形成双链的双链体，
使所述样品与能够使用所述靶多核苷酸作为模板的聚合酶相接触以便延伸所述双链体的所述引物寡核苷酸的长度并且由此产生包含所述特定形式的所述多态区的扩增子；以及
使用根据权利要求66所述的MNA酶来检测是否产生所述扩增子，其中检测到所述扩增子指示所述样品中存在所述靶多核苷酸，并且未能检测到所述扩增子指示所述样品中不存在所述靶多核苷酸。
80.根据权利要求76至79中任一项所述的方法，其包括使用以下各项中的任何一个或多个来产生所述扩增子的拷贝：聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
81.根据权利要求79或80所述的方法，其中
所述提供包括提供多种形式的所述引物寡核苷酸，其中不同形式的所述引物寡核苷酸与不同形式的所述多态区或所述靶多核苷酸的邻近或大体上邻近一种或多种形式的所述多态区的一部分共有碱基对互补性；
所述与所述引物寡核苷酸相接触包括使潜在包含所述靶多核苷酸群体的一个或多个成员的样品与所述多种形式的所述引物寡核苷酸在所述适合于杂交的条件下相接触；以及
所述检测包括使用所述MNA酶检测是否产生包含不同多态区的多种形式的所述扩增子。
82.根据权利要求79至81中任一项所述的方法，其中多种形式的所述扩增子是通过所述样品与聚合酶的所述接触产生，其中所述形式的所述扩增子的所述多态区不同；以及
所述MNA酶的所述感应臂包含以下各项或由以下各项组成：第一感应臂组分和包含与所述扩增子的不同部分互补的核苷酸序列的第二感应臂组分以及位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间的第三感应臂组分，其中
所述第一感应臂组分能够在所述多态区的上游通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子杂交，
所述第二感应臂组分能够在所述多态区的下游通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子杂交，
所述第三感应臂组分位于所述第一感应臂组分与所述第二感应臂组分之间，并且由于所述第三感应臂组分中不存在与任何所述形式的所述扩增子的所述多态区共有碱基对互补性的核苷酸序列而不能通过互补碱基配对与任何所述形式的所述扩增子的所述多态区杂交。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目等于或超过包含所述多态区的所述扩增子中的未杂交的核苷酸的数目。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目小于包含所述多态区的所述扩增子中的未杂交的核苷酸的数目。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述第三感应臂组分中的核苷酸的数目是介于1与50个核苷酸、1与40个核苷酸、1与30个核苷酸、1与20个核苷酸、1与10个核苷酸、5与50个核苷酸、5与40个核苷酸、5与30个核苷酸、5与20个核苷酸、5与10个核苷酸、10与50个核苷酸、10与40个核苷酸、10与30个核苷酸、或10与20个核苷酸之间，小于所述组装易化子多核苷酸中位于与所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分杂交的所述组装易化子多核苷酸的部分之间的未杂交的核苷酸的数目。
86.根据权利要求79或权利要求80所述的方法，其中
多种形式的包含所述多态区的所述扩增子通过所述样品与聚合酶的所述接触来产生，其中所述形式的所述扩增子的所述多态区不同；以及
所述感应臂包含以下各项或由以下各项组成：第一感应臂组分和第二感应臂组分，其中
所述第一感应臂组分和所述第二感应臂组分通过互补碱基配对与任何给定形式的所述扩增子的分开的不连续的组分杂交，从而使所述不连续的组分并置并且在所述扩增子中形成包含未杂交的核苷酸的环部分，以及
所述扩增子中的所述未杂交的核苷酸包含所述多态区。
87.根据权利要求86所述的方法，其中在所述靶多核苷酸中包含未杂交的核苷酸的所述环部分包含介于1与200个之间的核苷酸、1与150个之间的核苷酸、1与100个之间的核苷酸、1与75个之间的核苷酸、以及50个核苷酸、1与25个之间的核苷酸、5与200个之间的核苷酸、5与150个之间的核苷酸、5与100个之间的核苷酸、5与100个之间的核苷酸、5与75个之间的核苷酸、5与50个之间的核苷酸、5与25个之间的核苷酸、10与200个之间的核苷酸、10与150个之间的核苷酸、10与100个之间的核苷酸、10与100个之间的核苷酸、10与75个之间的核苷酸、10与50个之间的核苷酸、或10与25个之间的核苷酸之间。
88.根据权利要求81至87中任一项所述的方法，其进一步包括使用酶促反应来提供所述靶多核苷酸中的一个或多个的扩增的拷贝。
89.根据权利要求88所述的方法，其包括使用第二寡核苷酸来扩增所述多核苷酸中的一个或多个，所述第二寡核苷酸与所述新生多核苷酸的与所述引物寡核苷酸不同的组分大体上互补。
90.根据权利要求78至89中任一项所述的方法，其中所述多态区包含核苷酸插入、缺失和/或取代中的任何一种或多种，以使得所述靶多核苷酸群体的所述单独成员可不同。
91.根据权利要求76至90中任一项所述的方法，其中所述引物寡核苷酸和/或所述靶多核苷酸和/或所述扩增子和/或所述MNA酶包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合或由其组成。
92.根据权利要求76至91中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸和/或所述扩增子是基因组DNA、互补DNA(cDNA)或RNA。
93.根据权利要求29至42或76至92中任一项所述的方法，其中所述MNA酶能够修饰包含可检测部分和淬灭剂部分的底物，其中可检测作用是由所述底物通过所述MNA酶的裂解提供，所述MNA酶使所述可检测部分和所述淬灭剂部分分开，从而指示所述样品中所述靶多核苷酸的存在。
94.根据权利要求93所述的方法，其进一步包括放大在所述底物通过所述MNA酶修饰时产生的所述可检测作用。
95.根据权利要求29至42或76至93中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸来自细菌、病毒、真菌/酵母、原生生物或线虫。
96.根据权利要求29至42或76至93中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸来自肠道病毒。
97.根据权利要求1至53或76至96中任一项所述的方法，其中所述方法在体外或离体进行。
98.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中
所述样品包含靶多核苷酸的群体；
所述靶多核苷酸链包含在所述靶多核苷酸的所述群体的至少两个单独成员之间变化的多态区；
所述提供包括提供两种形式的所述引物寡核苷酸，其中
第一所述形式的所述引物寡核苷酸的所述第一或所述第二引物组分与所述靶多核苷酸群体的第一成员的所述靶多核苷酸链的所述多态区共有碱基对互补性，
第二所述形式的所述引物寡核苷酸的所述第一或所述第二引物组分与所述靶多核苷酸群体的第二成员的所述靶多核苷酸链的所述多态区共有碱基对互补性，
所述靶多核苷酸群体的所述第一成员和所述第二成员的所述多态区在核苷酸序列方面不同，以及
所述第一形式和所述第二形式的所述引物寡核苷酸的所述第三组分在核苷酸序列方面不同；
所述样品的所述接触包括使所述样品与所述第一形式和所述第二形式的所述引物寡核苷酸相接触；以及
所述样品与所述聚合酶的所述接触产生所述扩增子的群体，其中
所述扩增子群体的第一成员包含与所述靶多核苷酸群体的所述第一成员的所述多态区共有序列互补性的端组分，
所述扩增子群体的第二成员包含与所述靶多核苷酸群体的所述第二成员的所述多态区共有序列互补性的端组分，以及
所述扩增子群体的所述第一成员和所述第二成员的所述内部组分的所述核苷酸序列不同。
99.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中
所述样品包含靶多核苷酸的群体；
所述靶多核苷酸链包含在所述靶多核苷酸的所述群体的至少两个单独成员之间变化的多态区；
所述提供包括提供两种形式的所述引物寡核苷酸，其中
第一所述形式的所述引物寡核苷酸的所述第一或所述第二引物组分与所述靶多核苷酸群体的第一成员的所述靶多核苷酸链的所述多态区共有碱基对互补性，
第二所述形式的所述引物寡核苷酸的所述第一或所述第二引物组分与所述靶多核苷酸群体的第二成员的所述靶多核苷酸链的所述多态区共有碱基对互补性，
所述靶多核苷酸群体的所述第一成员和所述第二成员的所述多态区在核苷酸序列方面不同，
通过所述第一所述形式的所述引物寡核苷酸杂交的所述靶多核苷酸链的所述不连续的组分之间的核苷酸的数目不同于通过所述第二所述形式的所述引物寡核苷酸杂交的所述靶多核苷酸链的所述不连续的组分之间的核苷酸的数目，以及
通过所述第一形式的所述引物寡核苷酸与所述靶多核苷酸链的所述杂交形成的所述环部分的所述核苷酸序列不同于通过所述第二形式的所述引物寡核苷酸与所述靶多核苷酸链的所述杂交形成的所述环部分的所述核苷酸序列；
所述样品的所述接触包括使所述样品与所述第一形式和所述第二形式的所述引物寡核苷酸相接触；以及
所述样品与所述聚合酶的所述接触产生所述扩增子的群体，其中
所述扩增子群体的第一成员包含与所述靶多核苷酸群体的所述第一成员的所述多态区共有序列互补性的端组分，
所述扩增子群体的第二成员包含与所述靶多核苷酸群体的所述第二成员的所述多态区共有序列互补性的端组分，以及
所述扩增子群体的所述第一成员和所述第二成员的所述内部组分的所述核苷酸序列不同。
100.根据权利要求98或权利要求99所述的方法，其中所述多态区包含核苷酸的一个或多个缺失、插入和/或取代，以使得所述多态区的所述序列在所述靶多核苷酸群体的所述第一成员与所述第二成员之间变化。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述多态区包含SNP和/或点突变。
102.根据权利要求100所述的方法，其中所述多态区在所述靶多核苷酸群体的所述第一成员与所述第二成员之间在长度上变化。
103.根据权利要求98至102中任一项所述的方法，其中所述检测是否产生所述扩增子包括测量由与双链DNA结合的染料和/或扩增子序列特异性探针提供的信号。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述与双链DNA结合的染料为SYBR绿。
105.根据权利要求98至104中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用以下各项中的任何一个或多个：聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
106.根据权利要求103至105中任一项所述的方法，其中所述检测包括使用熔解曲线分析来监测所述扩增子群体的所述第一成员和所述第二成员的所述产生。
107.根据权利要求98至106中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸和/或所述扩增子是基因组DNA、互补DNA(cDNA)或RNA。
108.根据权利要求75所述的用途，其中所述MNA酶能够修饰包含可检测部分和淬灭剂部分的底物，其中可检测作用是由所述底物通过所述MNA酶的裂解提供，所述MNA酶使所述可检测部分和所述淬灭剂部分开，从而指示所述样品中所述靶多核苷酸的存在。
109.根据权利要求75所述的用途，其进一步包括放大在所述底物通过所述MNA酶修饰时产生的所述可检测作用。
110.根据权利要求54至58中任一项所述的分离的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所述第三组分包含以下各项或由以下各项组成：如SEQ ID NO 182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195或196中的任一项所定义的核苷酸序列或所述序列中的任一项的补体。
111.一种试剂盒，其包含根据权利要求54至58或110中任一项所述的寡核苷酸。
112.一种试剂盒，其包含根据权利要求60至65中任一项所述的双链核酸双链体。
113.一种试剂盒，其包含根据权利要求66至73中任一项所述的MNA酶。
114.一种试剂盒，其包含根据权利要求74所述的核酸复合物。
115.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的所述内部组分、并且任选地与所述扩增子的所述第一端组分杂交；以及
所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的所述第二端组分杂交。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述第一感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的所述内部组分和所述扩增子的所述第一端组分杂交；以及
所述第二感应臂组分能够通过互补碱基配对与所述扩增子的所述第二端组分杂交。
117.根据权利要求50所述的方法，其中所述引物寡核苷酸的所述第三组分包含与功能活性的催化性核酸互补的核苷酸序列。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104845967A (zh) * 2015-04-15 2015-08-19 苏州新海生物科技有限公司 寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用
CN106460044A (zh) * 2014-04-25 2017-02-22 DNAe集团控股有限公司 测序方法
CN107614697A (zh) * 2015-02-26 2018-01-19 奥斯瑞根公司 用于提高突变评估准确性的方法和装置
CN109097468A (zh) * 2018-08-14 2018-12-28 南通市第人民医院 Opcml基因启动子甲基化水平的检测试剂盒及其应用
CN110452988A (zh) * 2019-08-27 2019-11-15 武汉友芝友医疗科技股份有限公司 检测esr1基因突变的引物组、试剂、试剂盒和方法
CN111247252A (zh) * 2017-08-18 2020-06-05 Lgc基因组学有限公司 用于检测核酸分子的方法和试剂盒
CN112823212A (zh) * 2018-08-09 2021-05-18 斯皮德斯私人有限公司 核酸的多重检测

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX349801B (es) * 2011-09-09 2017-08-14 Speedx Pty Ltd Sustratos de enzimas de ácido nucleico.
CA2863808C (en) 2012-02-20 2020-07-21 Speedx Pty Ltd Methods and oligonucleotides for amplifying and/or detecting nucleic acids
AU2013202354A1 (en) * 2012-06-18 2014-01-16 Speedx Pty Ltd Target detection and signal amplification
SG11201506146TA (en) 2013-02-07 2015-09-29 Univ Rutgers Highly selective nucleic acid amplification primers
CN103540660B (zh) * 2013-10-10 2015-10-28 中国人民解放军疾病预防控制所 基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒
KR101631114B1 (ko) * 2014-06-13 2016-06-16 서울대학교산학협력단 육종감별을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 육종 감별 방법
US20170335382A1 (en) * 2014-11-10 2017-11-23 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Isothermal Amplification Assay for the Detection of Short Nucleic Acid Sequences
AU2016296594B2 (en) * 2015-07-17 2020-07-09 Luminex Corporation Methods and compositions for catalytic assays
US11614403B2 (en) 2017-08-10 2023-03-28 Fox Biosystems Nv Nucleic acid enzyme sensor
KR101987388B1 (ko) * 2017-10-19 2019-06-12 경상대학교산학협력단 분자비콘을 포함하는 비브리오균의 등온비색 검출용 조성물 및 이의 용도
CN107966438B (zh) * 2017-10-27 2020-11-24 中国农业大学 一种基于锌的功能核酸的耐高盐传感器及其应用
WO2019150414A1 (ja) * 2018-01-30 2019-08-08 学校法人 慶應義塾 核酸の検出方法
WO2022090521A1 (en) 2020-10-29 2022-05-05 Biocartis Nv Generic cartridge and method for multiplex nucleic acid detection
CN112662804B (zh) * 2021-01-25 2022-05-10 中国水稻研究所 一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的引物组、试剂盒及方法
EP4288557A1 (en) * 2021-02-02 2023-12-13 RhoDx, Inc. Synthetic polynucleotides and methods for selectively amplifying alleles
CN112852934B (zh) * 2021-04-16 2022-02-18 武汉友芝友医疗科技股份有限公司 检测基因甲基化的引物、试剂和试剂盒
GB202405402D0 (en) * 2021-10-20 2024-05-29 Tataa Biocenter Ab Methods and compositions for detection of mutant nucleic acid sequences

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011001496A1 (ja) * 2009-06-29 2011-01-06 株式会社 東芝 検体解析方法およびそれに用いるアッセイキット

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040121374A1 (en) * 2002-10-02 2004-06-24 Yoshihide Iwaki Method for detecting single nucleotide polymorphisms
KR20100099333A (ko) * 2005-03-05 2010-09-10 주식회사 씨젠 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한 방법 및 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드
JP5665272B2 (ja) * 2005-10-07 2015-02-04 スピーデクス ピーティーワイ リミテッド 多成分核酸酵素およびそれらの使用方法
KR20090098960A (ko) 2006-10-06 2009-09-18 존슨 앤드 존슨 리서치 피티와이 리미티드 분자 스위치 및 이의 이용 방법
AU2008235256B2 (en) * 2007-04-05 2014-05-15 Speedx Pty Ltd Nucleic acid enzymes and complexes and methods for their use
JP2010035532A (ja) * 2008-08-08 2010-02-18 Canon Inc アレル特異的ｐｃｒ法
JP5115825B2 (ja) * 2009-11-06 2013-01-09 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 イグサ品種「ひのみどり」の識別マーカー
WO2011078441A1 (en) * 2009-12-21 2011-06-30 Seegene, Inc. Tsg primer target detection
EP2450443B1 (en) * 2010-01-21 2016-05-11 ARKRAY, Inc. Target sequence amplification method, polymorphism detection method, and reagents for use in the methods
CA2863808C (en) 2012-02-20 2020-07-21 Speedx Pty Ltd Methods and oligonucleotides for amplifying and/or detecting nucleic acids

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011001496A1 (ja) * 2009-06-29 2011-01-06 株式会社 東芝 検体解析方法およびそれに用いるアッセイキット

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EDELHEIT O.: ""Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies."", 《BMC BIOTECHNOL.》 *
LIU H.: ""An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol."", 《BMC BIOTECHNOL.》 *
NAKAMURA N.: ""Development of multisample detection system using a tag insertion primer and an electrochemical DNA chip."", 《ANAL BIOCHEM.》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106460044A (zh) * 2014-04-25 2017-02-22 DNAe集团控股有限公司 测序方法
CN106460044B (zh) * 2014-04-25 2021-03-19 DNAe集团控股有限公司 测序方法
CN107614697A (zh) * 2015-02-26 2018-01-19 奥斯瑞根公司 用于提高突变评估准确性的方法和装置
CN104845967A (zh) * 2015-04-15 2015-08-19 苏州新海生物科技有限公司 寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用
CN111247252A (zh) * 2017-08-18 2020-06-05 Lgc基因组学有限公司 用于检测核酸分子的方法和试剂盒
CN112823212A (zh) * 2018-08-09 2021-05-18 斯皮德斯私人有限公司 核酸的多重检测
CN109097468A (zh) * 2018-08-14 2018-12-28 南通市第人民医院 Opcml基因启动子甲基化水平的检测试剂盒及其应用
CN110452988A (zh) * 2019-08-27 2019-11-15 武汉友芝友医疗科技股份有限公司 检测esr1基因突变的引物组、试剂、试剂盒和方法

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