KR102085119B1 - 핵산의 검출 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개질된 올리고뉴클레오티드 및 핵산의 검출에서의 그들의 사용 방법을 제공한다. 올리고뉴클레오티드 및 방법은 표적 핵산 서열에서의 유전자 변이 영역의 증폭 및/또는 검출에 특히 응용된다.

Description

핵산의 검출 {DETECTION OF NUCLEIC ACIDS}
본 출원은 2012년 2월 20일자로 출원된 호주 가특허 출원 제2012900624호 및 2012년 5월 29일자로 출원된 호주 가특허 출원 제2012902218호로부터의 우선권을 주장하며, 이들의 전체 내용은 상호 참조에 의해 포함된다.
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 개질된 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산의 검출에서의 그들의 사용 방법을 제공한다. 올리고뉴클레오티드 및 방법은 표적 핵산 서열에서의 유전자 변이 영역의 증폭 및/또는 검출에 특히 응용된다.
다양한 유전성 질환 및 후천성 질환이 점 돌연변이, 결실 및 삽입과 같은 유전자 변이와 연계된다. 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism)과 같은 유전자 변이는 약물에 대한 반응의 예측 및 질환 위험 및 중증도의 예후 인자(prognostic indication)의 제공에 있어서 유익한 정보를 줄 수 있다. 일부 유전자 변이는 질환의 존재와 직접 연계되는 반면에, 다른 것들은 질환 위험 및/또는 예후와 상관관계를 가진다. 단일 유전자 내의 돌연변이로부터 유발되는 500개 초과의 인간 유전성 질환이 존재한다. 이들은 낭성 섬유증, 근육 퇴행위축, α1-항트립신 결핍, 페닐케톤뇨증, 겸형 적혈구 빈혈증 또는 소질, 및 다양한 다른 혈색소병증을 포함한다. 추가로, 죽상경화성 심장병과 같은 몇몇 통상의 다유전자 병태에 대한 증가된 감수성을 가진 개인은 특정 DNA 서열 다형성의 유전과의 연계를 가지는 것으로 나타났다. 암은 세포 증식 또는 분화에 관련된 유전자 내의 유전자 손상의 축적으로 인해 발생하는 것으로 생각된다.
병원체 내부의 유전적 다양성은 연계된 질환의 중증도 및 치료적 중재의 성질에서 역할을 담당할 수 있다. 예에는 (i) 결핵과 같은 박테리아의 약물 저항성 균주와 연계된 돌연변이 (ii) 특이적 뉴클레오티드와 연계되는 HIV와 같은 바이러스에서의 요법 유도성 저항성, 및 (iii) 치료적 반응을 예고하는 HCV 내의 특이적 서열이 포함된다.
질환 위험의 평가, 질환의 진단, 환자의 예후 또는 요법에 대한 반응의 예측을 위해, 그리고 환자의 경과 관찰을 위해, 병원에서 유전자 분석이 일상화되고 있다. 이러한 유전자 시험의 도입은, 유전자 변이를 식별하기 위한 단순하고 저렴하며 신속한 어세이의 개발에 의존한다.
시험관내 핵산 증폭 방법은 유전학 및 질환 진단에서 광범위하게 응용된다. 이러한 방법은 중합효소 연쇄반응(PCR: polymerase chain reaction), 가닥 치환 증폭(SDA: strand displacement amplification), 헬리카제 의존형 증폭(HDA: helicase dependent amplification), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA: Recombinase Polymerase Amplification), 고리-매개 등온 증폭(LAMP: 루프-mediated isothermal amplification), 회전환 증폭(RCA: rolling circle amplification), 전사-매개 증폭(TMA: transcription-mediated amplification), 자기-지속적 서열 복제(3SR: self-sustained sequence replication), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA: nucleic acid sequence based amplification), 또는 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction)을 포함한다. 각각의 이들 표적 증폭 전략은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용을 필요로 한다. 증폭 과정은 앰플리콘의 지수적 증폭을 유발하며, 이는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 그들의 5' 말단에 포함하고, 프라이머 사이에 위치하는 서열의 새로 합성된 복제물을 함유한다.
PCR이 관련된 작은 유전자 변이의 검출을 위해 통상적으로 사용되는 방법은 고해상도 융해 곡선 분석 및 분자 비콘(Molecular Beacon)의 사용을 포함한다. 융해 곡선 및 분자 비콘은 개체군의 대부분을 대표하는 서열의 검출에 적합한 방법이지만, 암에 관련된 획득 돌연변이, 희귀/신종 바이러스 균주의 유전형 분석 또는 약물 감수성 박테리아의 배경 내에서의 약물 저항성 박테리아의 동정의 경우와 같이 비-돌연변이화 DNA의 큰 배경 내에서 돌연변이를 검출해야 하는 상황에는 이들이 적합하지 않다.
예로서, PCR은 극히 다용도로 사용할 수 있으며 기본 프로토콜의 여러 변형이 개발되어 왔다. PCR에 사용되는 프라이머는 표적 서열에 완벽하게 일치할 수도 있고 그들이 불일치 및/또는 개질 염기를 함유할 수도 있다. 프라이머의 5' 단부에 있는 부가적인 태그 서열은 PCR 앰플리콘의 포획을 용이하게 할 수 있고 표지된 프라이머의 포함은 검출을 용이하게 할 수 있다. 비-표적 관련 서열(비-상보성 태그 서열)을 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 부분 내로 도입한 다른 프로토콜은, 클로닝을 위한 제한 부위를 도입하기 위하여, 또는 원래의 표적에 관련되지 않는 공통 프라이머를 동반하는 제2 라운드의 증폭을 위한 앰플리콘을 태그하기 위하여 이를 실행하였다. 주어진 프라이머의 5' 절반은 초기 표적에 하이브리드화되지 않는 염기의 삽입을 용인할 수 있는 것으로 당업계에 공지되어 있으나, 프라이머의 3' 부분이 불일치 염기의 존재에 대해 훨씬 덜 순응적이라는 것 또한 주지되어 있다.
이러한 관찰결과는 대립유전자 특이적 PCR(AS-PCR: Allele Specific PCR)로도 공지된 증폭 불응성 돌연변이 시스템(ARMS: Amplification Refractory Mutation System)(Newton et al 1989 Nucleic Acids Research 17:2503-2516)을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 개발을 유발하였다. ARMS 프라이머는 단일 염기 다형성(SNP)과 같은 작은 유전자 변이의 식별을 촉진한다. 이러한 능력은, 불일치 3' 잔기를 가진 올리고뉴클레오티드가 완전히 일치하는 서열에 비교하여 프라이머로서 효율적으로 작용하지 않을 것이라는 사실을 기반으로 한다. 곽(Kwok) 등은 이러한 식별이 완전하지 않았으며 불일치에 관련된 DNA 염기에 의존한다는 것을 입증하였다(Kwok, et al. 1990 Nucleic Acids Research 18: 999-10005). 프라이머의 3' 단부 상에 하나의 불일치를 가진, 프라이머와 템플레이트 사이의 이중 불일치는, 대립유전자들을 효과적으로 식별하는 ARMS 프라이머의 증가된 능력을 제공한다(Kwok, et al. 1990 Nucleic Acids Research 18: 999-10005). ARMS 프라이머는 3' 불일치의 강도가 제2 불일치의 강도에 의해 균형을 이루도록 잘 디자인되어야 한다. 이는 또한, 불일치 프라이머가 그들의 표적에 어닐링되는 효율에 영향을 미치는 PCR의 어닐링 온도를 신중하게 선택함으로써 균형을 이룬다. ARMS 어세이의 디자인은 어려울 수 있으며, 모든 프라이머가 효과적으로 식별하는 반응 조건(예를 들어, 온도)의 개발은 지루한 일이다.
범용 염기(universal base)는 이웃하는 염기-쌍 상호작용을 현저하게 불안정화시키거나 개질된 올리고뉴클레오티드의 예상되는 작용성 생화학적 유용성을 방해하지 않으면서 4개의 정상적 염기를 대체하는 능력을 나타낸다. 범용 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 DNA 서열분석 또는 PCR을 위한 프라이머로서 작용할 것임이 당업계에 주지되어 있다. 가장 통상적으로 사용되는 축퇴 개질 염기는 데옥시이노신이며, 이는 동일한 친화도를 동반하지는 않지만(I-C >I-A>I-T~I-G>I-I) 4개의 천연 뉴클레오티드 모두와 유동 염기 대합이 가능하기 때문에 "범용" 염기의 역할을 한다. 그러므로, 이노신은 프라이머 및 탐침의 소정 염기 위치에서 축퇴성을 필요로 하는 모호한 서열의 증폭과 같은 응용에서의 PCR에 광범위하게 사용되어 왔다.
제WO 2006/092941호에는 PCR로부터 특이적 증폭을 증진하기 위한 3개의 상이한 Tm 부분으로 구성된 이중 특이성 올리고뉴클레오티드(DSO: dual specificity oligonucleotide)의 용도가 기재되어 있다. 이중 특이성 올리고뉴클레오티드는 3개 영역의 서열로 구성된다. DSO의 5' 부분은 표적-특이적이며 높은 Tm을 가진다. DSO의 중간 부분은 표준 DNA 염기 중 어느 것도 아닌(즉, G, A, T 또는 C가 아님) 2 내지 10개의 "범용" 염기로 구성된 분리 부분이다. DSO의 3' 부분은 표적-특이적이다. DSO는 올리고뉴클레오티드의 5' 및 3' 부분 내부의 불일치를 용인할 수 있으므로, 작은 유전자 변이를 효과적으로 식별하기 위하여 프라이머로서 DSO를 사용하는 것은 프라이머 어닐링에 있어서 엄격한 조건을 필요로 한다. 중간 부분의 범용 염기는 4개의 관용적인 DNA 염기 모두와 비-특이적 염기 대합이 가능하다. 그러므로, 프라이머 어닐링 중에 범용 부분이 결합하지 않을 수 있도록 온도를 설정할 수 있지만, 이들 DSO 프라이머는 프라이머의 전체 길이를 따라 초기 표적에 결합할 수 있다(염기가 불일치하지 않고 범용이기 때문임). 그러나 일단 복제되면, 앰플리콘은 범용 염기의 위치 반대쪽에 변종 서열을 함유할 것이므로, 범용 염기의 존재는 DSO 프라이머를 사용하여 생성시킨 앰플리콘 내로 임의의 특이적 고유 서열을 도입하지 않는다.
서열의 증폭, 검출 및 분석을 위해 개발된 상대적으로 많은 수의 기술에도 불구하고, 유전자 변이를 식별하기 위한 더 신속하고, 정확하고 저렴한 어세이에 대한 실질적인 필요성이 존재한다. 다양성이 유익한 정보를 주지 않으며 증폭을 복잡하게 하는 경우에 유전적 다양성의 영역을 포함하는 서열의 증폭을 개선하는 방법에 대한 필요성 또한 존재한다. 추가로, 특히 작은 유전자 변이(예를 들어, 단일 염기 다형성 - SNP)를 검출하는 경우, 복합 체제로 하나 초과의 표적을 분석하기 위해 용량을 증가시키는 더 양호한 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은, 앰플리콘 내로 특이적 고유 서열을 도입할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공함으로써 상기 언급된 필요성 중 적어도 하나를 충족시킨다. 본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오티드에 의해 앰플리콘 내로 도입된 고유 서열을 사용하여, 그렇지 않았다면 작은 유전자 변이(예를 들어, SNP) 만을 포함했을 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드 내에 더 큰 다양성 영역을 제공함으로써 더 용이한 식별을 가능하게 할 수 있다. 대안적으로, 표적 서열 내의 유전적 다양성이 유익한 정보를 주지 않고/않거나 증폭을 어렵게 하는 경우, 본 명세서에 많이 제공된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 앰플리콘 내의 그들 가변 영역을 고유 서열로 대체함으로써 관련 서열의 증폭 및 검출의 효능을 개선할 수 있다.
본 발명은 적어도 부분적으로 하기의 구체예 1 내지 구체예 118에 관한 것이다:
구체예 1. 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에서 종결되며 상보적 염기 대합에 의해 표적 폴리뉴클레오티드의 가닥의 제1 부분에 하이브리드화될 수 있는 제1 프라이머 구성요소, 및
올리고뉴클레오티드의 3' 단부에서 종결되며 상보적 염기 대합에 의해 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 제2 부분에 하이브리드화될 수 있는 제2 프라이머 구성요소를 포함하는 프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계;
제1 프라이머 구성요소 및 제2 프라이머 구성요소와 표적 폴리뉴클레오티드 가닥과의 하이브리드화에 적합한 조건 하에, 표적 폴리뉴클레오티드를 잠재적으로 포함하는 샘플을 프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 이중-가닥 이중체를 형성시키며, 여기서 이중체의 중간 섹션의 적어도 하나의 가닥은 적어도 4개의 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하는 중간 섹션의 대향 가닥 내의 뉴클레오티드 서열의 부재로 인하여 중간 섹션의 대향 가닥에 하이브리드화되지 않은 채 남아 있는 적어도 4개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단계;
표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 템플레이트로서 사용하여 이중체의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장할 수 있는 중합효소와 샘플을 접촉시킴으로써 제1 및 제2 단부 구성요소의 중간에 있는 내부 구성요소를 포함하는 앰플리콘을 생성시키며, 여기서
앰플리콘의 제1 단부 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상기 제1 부분에 상보적 염기 대합에 의해 하이브리드화될 수 있고,
앰플리콘의 제2 단부 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상기 제2 부분에 상보적 염기 대합에 의해 하이브리드화될 수 있으며,
앰플리콘의 제1 및 제2 단부 구성요소의 표적 폴리뉴클레오티드 가닥에 대한 상기 하이브리드화는, 내부 구성요소와 염기쌍 상보성을 공유하지 않는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 제1 및 제2 부분 사이에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 중간 뉴클레오티드 서열에 대향하도록 앰플리콘의 내부 구성요소를 위치시키는 단계; 및
앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하며, 여기서 앰플리콘의 검출은 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내고, 앰플리콘의 검출 실패는 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 부재를 나타내는 단계를 포함하는, 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
구체예 2. 구체예 1에 있어서, 상기 검출이 앰플리콘의 내부 구성요소 또는 앰플리콘의 내부 구성요소에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 3. 구체예 1 또는 구체예 2에 있어서, 상보적 염기 대합에 의한 표적 폴리뉴클레오티드 가닥에 대한 상기 하이브리드화시에 제1 프라이머 구성요소의 융해 온도가 제2 프라이머 구성요소의 융해 온도보다 더 큰 방법.
구체예 4. 구체예 1 내지 구체예 3 중 어느 한 구체예에 있어서, 이중-가닥 이중체의 중간 섹션의 적어도 하나의 가닥이 이중체의 대향 가닥에 하이브리드화되지 않은 채 남아 있는 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개의 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
구체예 5. 구체예 1 내지 구체예 4 중 어느 한 구체예에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티드가 제1 프라이머 구성요소와 제2 프라이머 구성요소 사이에 위치하는 제3 프라이머 구성요소를 포함하며, 여기서 제3 프라이머 구성요소는,
표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 상기 중간 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하지 않고,
앰플리콘의 내부 구성요소 내의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열로 구성되는 방법.
구체예 6. 구체예 5에 있어서, 제3 프라이머 구성요소가 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 절반 내에 부분적으로, 또는 완전히 위치하는 방법.
구체예 7. 구체예 5 또는 구체예 6에 있어서, 제3 프라이머 구성요소 및 중간 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 수가 동일한 방법.
구체예 8. 구체예 5 또는 구체예 6에 있어서, 제3 프라이머 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 상기 중간 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 수를 초과하는 방법.
구체예 9. 구체예 5 또는 구체예 6에 있어서, 제3 프라이머 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 상기 중간 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 수 미만인 방법.
구체예 10. 구체예 9에 있어서, 제3 프라이머 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 1 내지 200 뉴클레오티드, 1 내지 150 뉴클레오티드, 1 내지 100 뉴클레오티드, 1 내지 75 뉴클레오티드, 1 내지 50 뉴클레오티드, 1 내지 25 뉴클레오티드, 5 내지 200 뉴클레오티드, 5 내지 150 뉴클레오티드, 5 내지 100 뉴클레오티드, 5 내지 100 뉴클레오티드, 5 내지 75 뉴클레오티드, 5 내지 50 뉴클레오티드, 5 내지 25 뉴클레오티드, 10 내지 200 뉴클레오티드, 10 내지 150 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 75 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드 또는 10 내지 25 뉴클레오티드 만큼 제1 프라이머 구성요소 및 제2 프라이머 구성요소에 하이브리드화된 표적 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수 미만인 방법.
구체예 11. 구체예 1 내지 구체예 10 중 어느 한 구체예에 있어서, 제1 프라이머 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 제2 프라이머 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수를 초과하는 방법.
구체예 12. 구체예 1 내지 구체예 4 중 어느 한 구체예에 있어서, 이중-가닥 이중체의 중간 섹션의 상기 적어도 하나의 가닥이 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 구성요소인 방법.
구체예 13. 구체예 12에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 구성요소가 상기 중간 뉴클레오티드 서열로 구성되는 방법.
구체예 14. 구체예 12 또는 구체예 13에 있어서, 제1 프라이머 구성요소 및 제2 프라이머 구성요소가 상보적 염기 대합에 의해 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 분리된 불연속(non-contiguous) 구성요소에 하이브리드화됨으로써, 불연속 구성요소를 병치하고 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 루프 부분을 생성시키는 방법.
구체예 15. 구체예 12 내지 구체예 14 중 어느 한 구체예에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 상보적 염기 대합에 의해 표적 올리고뉴클레오티드 가닥에 하이브리드화되는 방법.
구체예 16. 구체예 14 또는 구체예 15에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 루프 부분이 1 내지 200 뉴클레오티드, 1 내지 150 뉴클레오티드, 1 내지 100 뉴클레오티드, 1 내지 75 뉴클레오티드, 1 내지 50 뉴클레오티드 1 내지 25 뉴클레오티드, 5 내지 200 뉴클레오티드, 5 내지 150 뉴클레오티드, 5 내지 100 뉴클레오티드, 5 내지 100 뉴클레오티드, 5 내지 75 뉴클레오티드, 5 내지 50 뉴클레오티드 5 내지 25 뉴클레오티드, 10 내지 200 뉴클레오티드, 10 내지 150 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 75 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드, 또는 10 내지 25 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
구체예 17. 구체예 1 내지 구체예 16 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 접촉시키는 단계가,
상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상보체인 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥과 염기쌍 상보성을 공유하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드에 접촉시키는 단계, 및
중합효소를 사용하여 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 템플레이트로서 사용하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장함으로써 제2 앰플리콘을 생성시키는 단계를 포함하는 방법.
구체예 18. 구체예 17에 있어서, 상기 검출하는 단계가 제2 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 19. 구체예 1 내지 구체예 17 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 방법이 중합효소 연쇄반응(PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 고리-매개 등온 증폭(LAMP), 회전환 증폭(RCA), 전사-매개 증폭(TMA), 자기-지속적 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 또는 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 중 임의의 하나 이상의 사용을 포함하는 방법.
구체예 20. 구체예 1 내지 구체예 19 중 어느 한 구체예에 있어서,
표적 폴리뉴클레오티드 가닥이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 2개 이상의 개별적인 구성원 사이에서 변동되는 다형성 영역을 포함하고,
다형성 영역의 업스트림에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 구성요소와 서열 상보성을 공유하는 제1 프라이머 구성요소 및 다형성 영역의 다운스트림에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 구성요소와 서열 상보성을 공유하는 제2 프라이머 구성요소에 의해, 제1 프라이머 구성요소 및 제2 프라이머 구성요소가 각각 개체군의 다중 구성원에 하이브리드화될 수 있으며,
제1 프라이머 구성요소 및 제2 프라이머 구성요소가 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되는 경우에 다형성 영역이 프라이머 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화되지 않은 채 남아 있는 방법.
구체예 21. 구체예 20에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 상기 개체군의 2개 이상의 개별적인 구성원 사이에 다형성 영역의 길이가 상이하도록 다형성 영역이 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 방법.
구체예 22. 구체예 20 또는 구체예　21에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 상기 개체군의 2개 이상의 개별적인 구성원 사이에 다형성 영역 뉴클레오티드 서열이 상이하도록 다형성 영역이 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환을 포함하는 방법.
구체예 23. 구체예 1 내지 구체예 19 중 어느 한 구체예에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 가닥이 단일 염기 다형성(SNP) 및/또는 점 돌연변이를 포함하고;
앰플리콘이
(i) SNP에 상보적인 뉴클레오티드, 및/또는
(ii) 점 돌연변이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하며;
제1 또는 제2 프라이머 구성요소가 상보적 염기 대합에 의해 상기 (i) 및/또는 (ii)에 하이브리드화될 수 있는 방법.
구체예 24. 구체예 23에 있어서, 제2 프라이머 구성요소가,
제2 프라이머 구성요소의 3' 말단에 위치하거나,
제2 프라이머 구성요소의 3' 말단의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 5개 초과의 뉴클레오티드 업스트림에 위치하거나,
제2 프라이머 구성요소가 3' 말단의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 6개 초과의 뉴클레오티드 업스트림에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드에 비-상보적인 뉴클레오티드 또한 포함하는 경우에 제2 프라이머 구성요소의 3' 말단에 위치하거나,
제2 프라이머 구성요소가 표적 폴리뉴클레오티드에 비-상보적인 추가의 뉴클레오티드 또한 포함하고 상기 추가의 뉴클레오티드가 SNP 또는 점 돌연변이에 상보적인 상기 뉴클레오티드의 3' 또는 5'에 위치하는 경우에 제2 프라이머 구성요소의 3' 말단의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 5개 초과의 뉴클레오티드 업스트림에 위치하는, SNP에 상보적인 뉴클레오티드, 또는 점 돌연변이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
구체예 25. 구체예 1 내지 구체예 19 중 어느 한 구체예에 있어서,
표적 폴리뉴클레오티드 가닥이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 적어도 2개의 개별적인 구성원 사이에 상이한 다형성 영역을 포함하고,
표적 폴리뉴클레오티드의 상기 개체군의 2개 이상의 개별적인 구성원 사이에 다형성 영역이 상이하도록 다형성 영역이 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하며,
제1 프라이머 구성요소 또는 제2 프라이머 구성요소가 상보적 염기 대합에 의해 상기 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 다형성 영역에 하이브리드화될 수 있고, 여기서 다형성 영역은 개체군 구성원의 서브세트 만의 표적 폴리뉴클레오티드 가닥에 존재하는 방법.
구체예 26. 구체예 1 내지 구체예 25 중 어느 한 구체예에 있어서, 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 상기 단계가 이중-가닥 DNA 및/또는 앰플리콘 서열 특이적-탐침에 결합하는 염료에 의해 제공되는 신호를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 27. 구체예 26에 있어서, 이중 가닥 DNA에 결합하는 염료가 SYBR 그린(SYBR Green)인 방법.
구체예 28. 구체예 26에 있어서, 서열 특이적 탐침이 분자 비콘, 마이너 그루브 결합제(MGB: minor groove binder) 탐침, 또는 TaqMan® 탐침인 방법.
구체예 29. 구체예 1 내지 구체예 25 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 검출하는 단계가 적어도 2개 이상의 파트자임(partzyme) 구성요소 올리고뉴클레오티드를 포함하는 다중-구성요소 핵산 효소(MNAzyme: multi-component nucleic acid enzyme)의 사용을 포함하며, 여기서 적어도 제1 파트자임 구성요소 및 제2 파트자임 구성요소가 앰플리콘의 존재 하에 자가-조립되어 촉매적으로 활성인 MNAzyme을 형성하고, 여기서 제1 및 제2 파트자임 구성요소 각각은 기질 팔 부분(기질 arm portion), 촉매 코어 부분(catalytic core portion), 및 센서 팔 부분(sensor arm portion)을 포함하며;
여기서 자가-조립시에, 제1 및 제2 파트자임 구성요소의 센서 팔 부분은 MNAzyme의 센서 팔로서 작용하고, 제1 및 제2 파트자임 구성요소의 기질 팔 부분은 MNAzyme의 기질 팔로서 작용하며, 제1 및 제2 파트자임 구성요소의 촉매 코어 부분은 MNAzyme의 촉매 코어로서 작용하고;
여기서 제1 및 제2 파트자임 구성요소가 그들 각각의 촉매 코어 부분의 연계를 위해 근접하여 유지되어 MNAzyme의 촉매 코어를 형성하도록 MNAzyme의 센서 팔은 상보적 염기 대합에 의해 앰플리콘의 일부 또는 전부와 하이브리드화되며, 촉매 코어는 적어도 하나의 기질을 개질할 수 있고, 여기서 MNAzyme의 촉매 코어가 기질을 개질함으로써 검출가능한 효과를 제공할 수 있도록 MNAzyme의 기질 팔은 기질과 맞물리는 방법.
구체예 30. 구체예 29에 있어서, 상기 MNAzyme의 제1 및/또는 제2 센서 팔이,
앰플리콘의 내부 구성요소 또는 그의 구성요소, 또는
앰플리콘의 내부 구성요소 또는 그의 구성요소에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 뉴클레오티드 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 방법.
구체예 31. 구체예 30에 있어서, 상기 MNAzyme의 제1 및/또는 제2 센서 팔이,
앰플리콘의 제1 단부 구성요소 및/또는 제2 단부 구성요소, 또는 그의 구성요소, 또는
앰플리콘의 제1 단부 구성요소 및/또는 제2 단부 구성요소, 또는 그의 구성요소에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 앰플리콘 내의 뉴클레오티드 서열에 부가적으로 상보적인 방법.
구체예 32. 구체예 29에 있어서, 상기 MNAzyme의 제1 및/또는 제2 센서 팔이,
앰플리콘의 내부 구성요소, 또는 그의 구성요소를 포함하거나 이로 구성되지 않는 앰플리콘 내의 뉴클레오티드 서열, 또는
앰플리콘의 내부 구성요소 또는 그의 구성요소를 포함하거나 이로 구성되지 않는 앰플리콘 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 방법.
구체예 33. 구체예 29 내지 구체예 32 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 MNAzyme의 제1 및/또는 제2 센서 팔이,
표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 존재하는 단일 염기 다형성(SNP), 및/또는 점 돌연변이, 또는
표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 존재하는 SNP에 상보적인 뉴클레오티드, 및/또는 점 돌연변이에 상보적인 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
구체예 34. 구체예 29 내지 구체예 33 중 어느 한 구체예에 있어서,
표적 폴리뉴클레오티드 가닥이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 2개 이상의 개별적인 구성원 사이에 상이한 다형성 영역을 포함하고,
상기 MNAzyme의 제1 및/또는 제2 센서 팔이,
개체군의 주어진 구성원의 다형성 영역, 또는 그의 구성요소, 또는
개체군의 주어진 구성원의 다형성 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 구성요소를 포함하거나 이로 구성된 앰플리콘 내의 뉴클레오티드 서열에 부가적으로 상보적인 방법.
구체예 35. 구체예 34에 있어서, 다형성 영역의 서열이 개체군의 개별적인 구성원 사이에서 변동되도록, 다형성 영역이 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함하는 방법.
구체예 36. 구체예 29에 있어서, MNAzyme의 센서 팔이 제1 센서 팔 구성요소, 제2 센서 팔 구성요소, 및 제3 센서 팔 구성요소를 포함하거나 이로 구성되며, 여기서
제1 센서 팔 구성요소는 상보적 염기 대합에 의해 앰플리콘에 하이브리드화될 수 있고;
제2 센서 팔 구성요소는 상보적 염기 대합에 의해 앰플리콘에 하이브리드화될 수 있으며;
제3 센서 팔 구성요소는 제1 센서 팔 구성요소와 제2 센서 팔 구성요소 사이에 위치하고 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소가 앰플리콘에 하이브리드화되는 경우에 상보적 염기 대합에 의해 앰플리콘에 하이브리드화될 수 없는 방법.
구체예 37. 구체예 36에 있어서, 제3 센서 팔 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가, 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소에 하이브리드화된 앰플리콘의 부분들 사이에 위치하는 앰플리콘 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수와 동일하거나 이를 초과하는 방법.
구체예 38. 구체예 36에 있어서, 제3 센서 팔 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가, 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소에 하이브리드화된 앰플리콘의 부분들 사이에 위치하는 앰플리콘 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수 미만인 방법.
구체예 39. 구체예 38에 있어서, 제3 센서 팔 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 1 내지 50 뉴클레오티드, 1 내지 40 뉴클레오티드, 1 내지 30 뉴클레오티드, 1 내지 20 뉴클레오티드, 1 내지 10 뉴클레오티드, 5 내지 50 뉴클레오티드, 5 내지 40 뉴클레오티드, 5 내지 30 뉴클레오티드, 5 내지 20 뉴클레오티드, 5 내지 10 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드, 10 내지 40 뉴클레오티드, 10 내지 30 뉴클레오티드, 또는 10 내지 20 뉴클레오티드 만큼 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소에 하이브리드화된 앰플리콘의 부분들 사이에 위치하는 앰플리콘 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수 미만인 방법.
구체예 40. 구체예 29에 있어서, 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소가 상보적 염기 대합에 의해 앰플리콘의 분리된 불연속 구성요소에 하이브리드화될 수 있으며, 이에 의해 불연속 구성요소를 병치하고 앰플리콘 내에 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 루프 부분을 생성시키는 방법.
구체예 41. 구체예 40에 있어서, 앰플리콘의 루프 부분이 1 내지 50 뉴클레오티드, 1 내지 40 뉴클레오티드, 1 내지 30 뉴클레오티드, 1 내지 20 뉴클레오티드, 1 내지 10 뉴클레오티드, 1 내지 5 뉴클레오티드, 5 내지 50 뉴클레오티드, 5 내지 40 뉴클레오티드, 5 내지 30 뉴클레오티드, 5 내지 20 뉴클레오티드, 5 내지 10 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드, 10 내지 40 뉴클레오티드, 10 내지 30 뉴클레오티드, 또는 10 내지 20 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
구체예 42. 구체예 40 또는 구체예 41에 있어서, 앰플리콘의 루프 부분이 앰플리콘의 상기 내부 구성요소를 포함하는 방법.
구체예 43. 구체예 5 내지 구체예 11 중 어느 한 구체예에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 가닥이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 2개 이상의 개별적인 구성원 사이에 상이한 다형성 영역을 포함하고:
상기 제공하는 단계가 다중 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 상이한 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드는,
상이한 형태의 다형성 영역, 또는
하나 이상의 형태의 다형성 영역에 인접하거나 실질적으로 인접한 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 부분과 염기쌍 상보성을 공유하고;
프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 상기 단계는 하이브리드화에 적합한 조건 하에 표적 폴리뉴클레오티드 개체군의 하나 이상의 구성원을 잠재적으로 포함하는 샘플을 상기 다중 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하며;
여기서 각각의 다중 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드는, 제1 프라이머 구성요소와 제2 프라이머 구성요소 사이에 위치하며 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 상기 중간 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하지 않는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 상기 제3 프라이머 구성요소를 포함하는 방법.
구체예 44. 구체예 43에 있어서, 상기 검출하는 단계가 제1 센서 팔 구성요소, 제2 센서 팔 구성요소, 및 제3 센서 팔 구성요소를 포함하는 MNAzyme을 사용하는 단계를 포함하며, 여기서
제1 센서 팔 구성요소는 상보적 염기 대합에 의해 앰플리콘의 내부 구성요소에, 그리고 임의로 앰플리콘의 제1 단부 구성요소에 하이브리드화될 수 있고;
제2 센서 팔 구성요소는 상보적 염기 대합에 의해 앰플리콘의 제2 단부 구성요소에 하이브리드화될 수 있으며;
제3 센서 팔 구성요소는 제1 센서 팔 구성요소와 제2 센서 팔 구성요소 사이에 위치하고, 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소가 앰플리콘에 하이브리드화되는 경우에 상보적 염기 대합에 의해 상기 다형성 영역 또는 상기 다형성 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화될 수 없는 방법.
구체예 45. 구체예 44에 있어서,
다형성 영역을 포함하는 다중 형태의 앰플리콘이 샘플을 중합효소와 접촉시키는 상기 단계에 의해 생성되며, 여기서 상기 각각의 형태의 앰플리콘의 다형성 영역은 상이하고;
센서 팔이 제1 센서 팔 구성요소, 제2 센서 팔 구성요소, 및 다형성 영역을 포함하거나 이로 구성된 앰플리콘 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적이지 않은 제3 센서 팔 구성요소를 포함하거나 이로 구성되며, 여기서
제1 센서 팔 구성요소는 다형성 영역의 업스트림에서 상보적 염기 대합에 의해 임의의 상기 형태의 앰플리콘에 하이브리드화될 수 있고,
제2 센서 팔 구성요소는 다형성 영역의 다운스트림에서 상보적 염기 대합에 의해 임의의 상기 형태의 앰플리콘에 하이브리드화될 수 있으며,
제3 센서 팔 구성요소는 제1 센서 팔 구성요소와 제2 센서 팔 구성요소 사이에 위치하고, 임의의 상기 형태의 앰플리콘의 다형성 영역에 상보적 염기 대합에 의해 하이브리드화될 수 없는 방법.
구체예 46. 구체예 43에 있어서,
다형성 영역을 포함하는 다중 형태의 앰플리콘이 샘플을 중합효소와 접촉시키는 상기 단계에 의해 생성되며, 여기서 상기 형태의 앰플리콘의 다형성 영역은 상이하고;
센서 팔이 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소를 포함하거나 이로 구성되며, 여기서
제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소는 상보적 염기 대합에 의해 임의의 주어진 형태의 상기 앰플리콘의 분리된 불연속 구성요소에 하이브리드화됨으로써, 불연속 구성요소를 병치하고 앰플리콘 내에 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 루프 부분을 생성시키며,
루프 부분의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드는 앰플리콘의 다형성 영역을 포함하는 방법.
구체예 47. 구체예 43 내지 구체예 46 중 어느 한 구체예에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 상기 2개 이상의 개별적인 구성원이 상이할 수 있도록, 다형성 영역이 뉴클레오티드 삽입, 결실 및/또는 치환 중 임의의 하나 이상을 포함하는 방법.
구체예 48. 구체예 1 내지 구체예 47 중 어느 한 구체예에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티드 및/또는 표적 폴리뉴클레오티드 및/또는 앰플리콘이 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 그의 조합을 포함하거나 이로 구성되는 방법.
구체예 49. 구체예 1 내지 구체예 48 중 어느 한 구체예에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 및/또는 앰플리콘이 게놈 DNA, 상보적 DNA(cDNA), 또는 RNA인 방법.
구체예 50. 구체예 1 내지 구체예 29, 구체예 32, 구체예 36 내지 구체예 41, 구체예 43 또는 구체예 46 중 어느 한 구체예에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티드가 작용적으로 활성인 촉매 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
구체예 51. 구체예 50에 있어서, 상기 앰플리콘이 상기 작용적으로 활성인 촉매 핵산을 포함하고, 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 상기 단계가 앰플리콘 내에 존재하는 상기 작용적으로 활성인 촉매 핵산의 촉매 활성을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 52. 구체예 50 또는 구체예 51에 있어서, 작용적으로 활성인 촉매 핵산이 DNAzyme 또는 리보자임인 방법.
구체예 53. 구체예 51 또는 구체예 52에 있어서, 앰플리콘 내에 존재하는 상기 작용적으로 활성인 촉매 핵산의 촉매 활성을 검출하는 상기 단계가 앰플리콘을 상기 작용적으로 활성인 촉매 핵산의 기질과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
구체예 54. 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에서 종결되며 상보적 염기 대합에 의해 제2 폴리뉴클레오티드의 제1 부분에 하이브리드화될 수 있는 제1 구성요소,
올리고뉴클레오티드의 3' 단부에서 종결되며 상보적 염기 대합에 의해 제2 폴리뉴클레오티드의 제2 부분에 하이브리드화될 수 있는 제2 구성요소, 및
제1 및 제2 구성요소가 제2 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되는 경우에 제2 폴리뉴클레오티드 내의 대향 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하지 않는 적어도 4개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 제1 및 제2 구성요소 사이에 위치하는 제3 구성요소를 포함하며;
여기서 제3 구성요소는 올리고뉴클레오티드의 3' 절반 내에 부분적으로, 또는 완전히 위치하는, 단리된 프라이머 또는 파트자임 올리고뉴클레오티드.
구체예 55. 구체예 54에 있어서, 제3 구성요소가 제2 폴리뉴클레오티드 내의 대향 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하지 않는 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
구체예 56. 구체예 54 또는 구체예 55에 있어서, 제1 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가,
제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수 미만이거나;
제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수를 초과하는 올리고뉴클레오티드.
구체예 57. 구체예 54 내지 구체예 56 중 어느 한 구체예에 있어서, DNA, 상보적 DNA(cDNA), RNA, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
구체예 58. 구체예 54 내지 구체예 57 중 어느 한 구체예에 있어서, 파트자임 센서 팔의 구성요소인 올리고뉴클레오티드.
구체예 59. 구체예 54 내지 구체예 58 중 어느 한 구체예에 따른 올리고뉴클레오티드의, 구체예 1 내지 구체예 53 중 어느 한 구체예에 따른 방법에서의 용도.
구체예 60. 상보적 염기 대합에 의해 제2 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화된, 구체예 54 내지 구체예 58 중 어느 한 구체예의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서
올리고뉴클레오티드의 제1 구성요소는 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에서 종결되고 상보적 염기 대합에 의해 제2 폴리뉴클레오티드의 제1 부분에 하이브리드화되며,
올리고뉴클레오티드의 제2 구성요소는 올리고뉴클레오티드의 3' 단부에서 종결되고 상보적 염기 대합에 의해 제2 폴리뉴클레오티드의 제2 부분에 하이브리드화되며,
올리고뉴클레오티드의 제3 구성요소는 상기 제1 및 제2 구성요소 사이에 위치하고 제2 폴리뉴클레오티드 내의 대향 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하지 않는 적어도 2개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하며;
올리고뉴클레오티드의 제3 구성요소는 올리고뉴클레오티드의 3' 절반 내에 부분적으로, 또는 완전히 위치하는, 단리된 이중 가닥 핵산 이중체.
구체예 61. 구체예 60에 있어서, 상기 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 상기 제1 및 제2 구성요소에 하이브리드화된 제2 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 제2 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수와 동일한 이중 가닥 핵산 이중체.
구체예 62. 구체예 61에 있어서, 상기 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 상기 제1 및 제2 구성요소에 하이브리드화된 제2 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 제2 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수를 초과하는 이중 가닥 핵산 이중체.
구체예 63. 구체예 61에 있어서, 상기 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 상기 제1 및 제2 구성요소에 하이브리드화된 제2 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 제2 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수 미만인 이중 가닥 핵산 이중체.
구체예 64. 구체예 61에 있어서, 상기 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 1 내지 200 뉴클레오티드, 1 내지 150 뉴클레오티드, 1 내지 100 뉴클레오티드, 1 내지 75 뉴클레오티드, 1 내지 50 뉴클레오티드, 1 내지 25 뉴클레오티드, 5 내지 200 뉴클레오티드, 5 내지 150 뉴클레오티드, 5 내지 100 뉴클레오티드, 5 내지 100 뉴클레오티드, 5 내지 75 뉴클레오티드, 5 내지 50 뉴클레오티드, 5 내지 25 뉴클레오티드, 10 내지 200 뉴클레오티드, 10 내지 150 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 75 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드, 또는 10 내지 25 뉴클레오티드 만큼 상기 제1 및 제2 구성요소에 하이브리드화된 제2 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 제2 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수 미만인 이중 가닥 핵산 이중체.
구체예 65. 구체예 60 내지 구체예 64 중 어느 한 구체예에 있어서, 올리고뉴클레오티드 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA, 상보적 DNA(cDNA), 또는 RNA인 이중 가닥 핵산 이중체.
구체예 66. 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소를 포함하거나 이로 구성되는 센서 팔을 포함하며, 여기서
제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소는 상보적 염기 대합에 의해 조립 촉진자(assembly facilitator) 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되어 이중-가닥 이중체를 형성할 수 있고, 여기서 이중체의 중간 구성요소의 적어도 하나의 가닥은 이중체의 대향 가닥에 하이브리드화되지 않은 채 남아 있는 적어도 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 다중-구성요소 핵산 효소(MNAzyme).
구체예 67. 구체예 66에 있어서, 센서 팔이 제1 센서 팔 구성요소, 제2 센서 팔 구성요소, 및 제1 센서 팔 구성요소와 제2 센서 팔 구성요소 사이에 위치하는 제3 센서 팔 구성요소를 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소가 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화될 때, 제3 센서 팔 구성요소는 상기 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드와의 염기쌍 상보성의 부재로 인하여 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화될 수 없는 MNAzyme.
구체예 68. 구체예 67에 있어서, 제3 센서 팔 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소에 하이브리드화되는 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수와 동일하거나 이를 초과하는 MNAzyme.
구체예 69. 구체예 67에 있어서, 제3 센서 팔 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소에 하이브리드화되는 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수 미만인 MNAzyme.
구체예 70. 구체예 69에 있어서, 제3 센서 팔 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 1 내지 200 뉴클레오티드, 1 내지 150 뉴클레오티드, 1 내지 100 뉴클레오티드, 1 내지 75 뉴클레오티드, 1 내지 50 뉴클레오티드, 1 내지 25 뉴클레오티드, 5 내지 200 뉴클레오티드, 5 내지 150 뉴클레오티드, 5 내지 100 뉴클레오티드, 5 내지 100 뉴클레오티드, 5 내지 75 뉴클레오티드, 5 내지 50 뉴클레오티드, 5 내지 25 뉴클레오티드, 10 내지 200 뉴클레오티드, 10 내지 150 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 75 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드, 또는 10 내지 25 뉴클레오티드 만큼 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소에 하이브리드화되는 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수 미만인 MNAzyme.
구체예 71. 구체예 66에 있어서, 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소가 상보적 염기 대합에 의해 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드의 분리된 불연속 구성요소에 하이브리드화될 수 있으며, 이에 의해 불연속 구성요소를 병치하고 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드 내에 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 루프 부분을 생성시키는 MNAzyme.
구체예 72. 구체예 71에 있어서, 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드의 루프 부분이 1 내지 50 뉴클레오티드, 1 내지 40 뉴클레오티드, 1 내지 30 뉴클레오티드, 1 내지 20 뉴클레오티드, 1 내지 10 뉴클레오티드, 1 내지 5 뉴클레오티드, 5 내지 50 뉴클레오티드, 5 내지 40 뉴클레오티드, 5 내지 30 뉴클레오티드 5 내지 20 뉴클레오티드, 5 내지 10 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드, 10 내지 40 뉴클레오티드, 10 내지 30 뉴클레오티드, 또는 10 내지 20 뉴클레오티드를 포함하는 MNAzyme.
구체예 73. 구체예 66 내지 구체예 72 중 어느 한 구체예에 있어서, 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드가 MNAzyme에 의해 검출하기 위한 표적 폴리뉴클레오티드인 MNAzyme.
구체예 74. 상보적 염기 대합에 의해 상기 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되는, 구체예 66 내지 구체예 73 중 어느 한 구체예의 MNAzyme을 포함하는 핵산 복합체.
구체예 75. 폴리뉴클레오티드 표적이 상기 조립 촉진자인, 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 검출하기 위한, 구체예 66 내지 구체예 73 중 어느 한 구체예에 따른 MNAzyme의 용도.
구체예 76. 상보적 염기 대합에 의해 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화될 수 있는 프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계;
상보적 염기 대합에 의한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 표적 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화에 적합한 조건 하에 표적 폴리뉴클레오티드를 잠재적으로 포함하는 샘플을 프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 이중-가닥 이중체를 형성시키는 단계,
표적 폴리뉴클레오티드를 템플레이트로서 사용하여 이중체의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장할 수 있는 중합효소와 샘플을 접촉시킴으로써 앰플리콘을 생성시키는 단계, 및
구체예 66에 따른 MNAzyme을 사용하여 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하며, 여기서 앰플리콘의 검출은 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내고, 앰플리콘의 검출 실패는 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 부재를 나타내는 단계를 포함하는, 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
구체예 77. 구체예 76에 있어서, 상기 제1 센서 팔 구성요소가,
(i) 앰플리콘 또는 그의 구성요소, 또는
(ii) 앰플리콘 또는 그의 구성요소에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
상기 검출하는 단계가, 상기 제1 센서 팔 구성요소가 상보적 염기 대합에 의해 상기 (i) 또는 (ii)에 하이브리드화되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 78. 구체예 76에 있어서,
표적 폴리뉴클레오티드가 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 2개 이상의 개별적인 구성원 사이에서 변동되는 다형성 영역을 포함하고,
상보적 염기 대합에 의해 표적 폴리뉴클레오티드 개체군의 적어도 하나의 상기 표적 폴리뉴클레오티드에 각각 하이브리드화될 수 있는 일련의 프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 각각의 상기 프라이머 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드 개체군의 상기 구성원 중 일부에만 존재하는 다형성 영역의 특이적 형태와 염기쌍 상보성을 공유하고;
각각의 상기 프라이머 올리고뉴클레오티드가, 샘플을 중합효소와 접촉시키는 상기 단계 후에 상기 앰플리콘의 각각의 개체군 내로 혼입되는 동일한 태그 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 앰플리콘 개체군의 각각의 상기 구성원은 앰플리콘 개체군의 상기 구성원 중 일부에만 존재하는 다형성 영역을 포함하고;
여기서 상기 검출하는 단계는 MNAzyme의 상기 제1 센서 팔이 앰플리콘 개체군의 구성원의 상기 태그 부분과 상보적 염기 대합에 의해 하이브리드화되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 79. 상보적 염기 대합에 의해 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화될 수 있는 프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 프라이머 올리고뉴클레오티드는 개체군의 상기 구성원 중 일부에만 존재하는 다형성 영역의 특이적 형태, 또는 다형성 영역의 특이적 형태에 인접하거나 실질적으로 인접한 표적 폴리뉴클레오티드의 부분과 염기쌍 상보성을 공유하는 단계;
상보적 염기 대합에 의한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 표적 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화에 적합한 조건 하에 표적 폴리뉴클레오티드를 잠재적으로 포함하는 샘플을 프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 이중-가닥 이중체를 형성시키는 단계;
표적 폴리뉴클레오티드를 템플레이트로서 사용하여 이중체의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장할 수 있는 중합효소와 샘플을 접촉시킴으로써 다형성 영역의 특이적 형태를 포함하는 앰플리콘을 생성시키는 단계; 및
구체예 66에 따른 MNAzyme을 사용하여 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하며, 여기서 앰플리콘의 검출은 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내고, 앰플리콘의 검출 실패는 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 부재를 나타내는 단계를 포함하며, 표적 폴리뉴클레오티드가 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 2개 이상의 개별적인 구성원 사이에서 변동되는 다형성 영역을 포함하는, 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
구체예 80. 구체예 76 내지 구체예 79 중 어느 한 구체예에 있어서, 중합효소 연쇄반응(PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 고리-매개 등온 증폭(LAMP), 회전환 증폭(RCA), 전사-매개 증폭(TMA), 자기-지속적 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 또는 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 중 임의의 하나 이상을 사용하여 상기 앰플리콘의 복제물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법.
구체예 81. 구체예 79 또는 구체예 80에 있어서,
상기 제공하는 단계가 다중 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 상이한 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드는, 상이한 형태의 다형성 영역, 또는 하나 이상의 형태의 다형성 영역에 인접하거나 실질적으로 인접한 표적 폴리뉴클레오티드의 부분과 염기쌍 상보성을 공유하고;
프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 상기 단계가 하이브리드화에 적합한 상기 조건 하에 표적 폴리뉴클레오티드 개체군의 하나 이상의 구성원을 잠재적으로 포함하는 샘플을 다중 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하며;
상기 검출하는 단계가 상기 MNAyme를 사용하여 상이한 다형성 영역을 포함하는 다중 형태의 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 82. 구체예 79 내지 구체예 81 중 어느 한 구체예에 있어서, 다중 형태의 앰플리콘이 샘플을 중합 효소와 접촉시키는 상기 단계에 의해 생성되며, 여기서 상기 형태의 앰플리콘의 다형성 영역은 상이하고;
MNAzyme의 센서 팔이 앰플리콘의 상이한 부분에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소, 및 제1 센서 팔 구성요소와 제2 센서 팔 구성요소 사이에 위치하는 제3 센서 팔 구성요소를 포함하거나 이로 구성되며, 여기서
제1 센서 팔 구성요소는 다형성 영역의 업스트림에서 상보적 염기 대합에 의해 임의의 상기 형태의 앰플리콘에 하이브리드화될 수 있고,
제2 센서 팔 구성요소는 다형성 영역의 다운스트림에서 상보적 염기 대합에 의해 임의의 상기 형태의 앰플리콘에 하이브리드화될 수 있으며,
제3 센서 팔 구성요소는 제1 센서 팔 구성요소와 제2 센서 팔 구성요소 사이에 위치하고, 임의의 상기 형태의 앰플리콘의 다형성 영역과 염기쌍 상보성을 공유하는 제3 센서 팔 구성요소 내의 뉴클레오티드 서열의 부재로 인해 임의의 상기 형태의 앰플리콘의 다형성 영역에 상보적 염기 대합에 의해 하이브리드화될 수 없는 방법.
구체예 83. 구체예 82에 있어서, 제3 센서 팔 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 다형성 영역을 포함하는 앰플리콘 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수와 동일하거나 이를 초과하는 방법.
구체예 84. 구체예 82에 있어서, 제3 센서 팔 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 다형성 영역을 포함하는 앰플리콘 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수 미만인 방법.
구체예 85. 구체예 84에 있어서, 제3 센서 팔 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 1 내지 50 뉴클레오티드, 1 내지 40 뉴클레오티드, 1 내지 30 뉴클레오티드, 1 내지 20 뉴클레오티드, 1 내지 10 뉴클레오티드, 5 내지 50 뉴클레오티드, 5 내지 40 뉴클레오티드, 5 내지 30 뉴클레오티드, 5 내지 20 뉴클레오티드, 5 내지 10 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드, 10 내지 40 뉴클레오티드, 10 내지 30 뉴클레오티드, 또는 10 내지 20 뉴클레오티드 만큼 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소에 하이브리드화된 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 조립 촉진자 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수 미만인 방법.
구체예 86. 구체예 79 또는 구체예 80에 있어서,
다형성 영역을 포함하는 다중 형태의 앰플리콘이 샘플을 중합효소와 접촉시키는 상기 단계에 의해 생성되며, 여기서 상기 형태의 앰플리콘의 다형성 영역은 상이하고;
센서 팔이 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소를 포함하거나 이로 구성되며, 여기서
제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소는 상보적 염기 대합에 의해 임의의 주어진 형태의 상기 앰플리콘의 분리된 불연속 구성요소에 하이브리드화됨으로써, 불연속 구성요소를 병치하고 앰플리콘 내에 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 루프 부분을 생성시키며,
앰플리콘 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드는 다형성 영역을 포함하는 방법.
구체예 87. 구체예 86에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 루프 부분이 1 내지 200 뉴클레오티드, 1 내지 150 뉴클레오티드, 1 내지 100 뉴클레오티드, 1 내지 75 뉴클레오티드, 1 내지 50 뉴클레오티드, 1 내지 25 뉴클레오티드, 5 내지 200 뉴클레오티드, 5 내지 150 뉴클레오티드, 5 내지 100 뉴클레오티드, 5 내지 100 뉴클레오티드, 5 내지 75 뉴클레오티드, 5 내지 50 뉴클레오티드, 5 내지 25 뉴클레오티드, 10 내지 200 뉴클레오티드, 10 내지 150 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 75 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드, 또는 10 내지 25 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
구체예 88. 구체예 81 내지 구체예 87 중 어느 한 구체예에 있어서, 효소 반응을 사용하여 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭된 복제물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구체예 89. 구체예 88에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티드보다 표적 폴리뉴클레오티드의 상이한 구성요소에 실질적으로 상보적인 제2 올리고뉴클레오티드를 사용하여 하나 이상의 초기(nascent) 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 포함하는 방법.
구체예 90. 구체예 78 내지 89 중 어느 한 구체예에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 상기 개별적인 구성원이 상이할 수 있도록, 다형성 영역이 뉴클레오티드 삽입, 결실 및/또는 치환 중 임의의 하나 이상을 포함하는 방법.
구체예 91. 구체예 76 내지 구체예 90 중 어느 한 구체예에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티드 및/또는 표적 폴리뉴클레오티드 및/또는 앰플리콘 및/또는 MNAzyme이 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 그의 조합을 포함하거나 이로 구성되는 방법.
구체예 92. 구체예 76 내지 구체예 91 중 어느 한 구체예에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 및/또는 앰플리콘이 게놈 DNA, 상보적 DNA(cDNA), 또는 RNA인 방법.
구체예 93. 구체예 29 내지 구체예 42 또는 구체예 76 내지 구체예 92 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 MNAyme이 검출가능한 부분 및 퀀처(quencher) 부분을 포함하는 기질을 개질할 수 있으며, 여기서 상기 검출가능한 부분 및 퀀처 부분을 분리하는 MNAzyme에 의한 기질의 분해에 의해 검출가능한 효과가 제공됨으로써 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내는 방법.
구체예 94. 구체예 93에 있어서, MNAzyme에 의해 기질이 개질될 때 생성되는 검출가능한 효과를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구체예 95. 구체예 29 내지 구체예 42 또는 구체예 76 내지 구체예 93 중 어느 한 구체예에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 박테리아, 바이러스, 진균/효모, 원생생물 또는 선충으로부터 유래하는 방법.
구체예 96. 구체예 29 내지 구체예 42 또는 구체예 76 내지 구체예 93 중 어느 한 구체예에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 엔테로바이러스로부터 유래하는 방법.
구체예 97. 구체예 1 내지 구체예 53 또는 구체예 76 내지 구체예 96 중 어느 한 구체예에 있어서, 시험관내 또는 생체외에서 수행되는 방법.
구체예 98. 구체예 5 내지 구체예 10 중 어느 한 구체예에 있어서,
샘플이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군을 포함하며;
표적 폴리뉴클레오티드 가닥이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 적어도 2개의 개별적인 구성원 사이에서 변동되는 다형성 영역을 포함하고;
상기 제공하는 단계가 2개 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서
상기 제1 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 제1 또는 제2 프라이머 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 제1 구성원의 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 다형성 영역과 염기쌍 상보성을 공유하고,
상기 제2 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 제1 또는 제2 프라이머 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 제2 구성원의 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 다형성 영역과 염기쌍 상보성을 공유하며,
표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 상기 제1 및 제2 구성원의 다형성 영역은 뉴클레오티드 서열에 있어서 상이하고,
제1 및 제2 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 제3 구성요소는 뉴클레오티드 서열에 있어서 상이하며;
샘플을 접촉시키는 상기 단계가 샘플을 제1 및 제2 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하고;
샘플을 중합효소와 접촉시키는 상기 단계가 상기 앰플리콘의 개체군을 생성시키며, 여기서
상기 앰플리콘의 개체군의 제1 구성원은 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 제1 구성원의 상기 다형성 영역과 서열 상보성을 공유하는 단부 구성요소를 포함하고,
상기 앰플리콘의 개체군의 제2 구성원은 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 제2 구성원의 상기 다형성 영역과 서열 상보성을 공유하는 단부 구성요소를 포함하며,
상기 앰플리콘의 개체군의 상기 제1 및 제2 구성원의 내부 구성요소의 뉴클레오티드 서열은 상이한 방법.
구체예 99. 구체예 14 내지 구체예 16 중 어느 한 구체예에 있어서,
샘플이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군을 포함하고;
표적 폴리뉴클레오티드 가닥이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 적어도 2개의 개별적인 구성원 사이에서 변동되는 다형성 영역을 포함하며;
상기 제공하는 단계가 2개 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서
상기 제1 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 제1 또는 제2 프라이머 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 제1 구성원의 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 다형성 영역과 염기쌍 상보성을 공유하고,
상기 제2 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 제1 또는 제2 프라이머 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 제2 구성원의 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 다형성 영역과 염기쌍 상보성을 공유하며,
표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 상기 제1 및 제2 구성원의 다형성 영역은 뉴클레오티드 서열에 있어서 상이하고,
상기 제1 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드에 의해 하이브리드화되는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상기 불연속 구성요소 사이의 뉴클레오티드의 수는 상기 제2 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드에 의해 하이브리드화되는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상기 불연속 구성요소 사이의 뉴클레오티드의 수와 상이하며,
표적 폴리뉴클레오티드 가닥에 대한 제1 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 상기 하이브리드화에 의해 생성되는 루프 부분의 뉴클레오티드 서열은 표적 폴리뉴클레오티드 가닥에 대한 제2 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 상기 하이브리드화에 의해 생성되는 루프 부분의 뉴클레오티드 서열과 상이하고;
샘플을 접촉시키는 상기 단계가 샘플을 제1 및 제2 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하며;
샘플을 중합효소와 접촉시키는 상기 단계가 상기 앰플리콘의 개체군을 생성시키고, 여기서
상기 앰플리콘의 개체군의 제1 구성원은 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 제1 구성원의 상기 다형성 영역과 서열 상보성을 공유하는 단부 구성요소를 포함하며,
상기 앰플리콘의 개체군의 제2 구성원은 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 제2 구성원의 상기 다형성 영역과 서열 상보성을 공유하는 단부 구성요소를 포함하고,
상기 앰플리콘의 개체군의 상기 제1 및 제2 구성원의 내부 구성요소의 뉴클레오티드 서열은 상이한 방법.
구체예 100. 구체예 98 또는 구체예 99에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 개체군의 제1 및 제2 구성원 사이에서 다형성 영역의 서열이 변동되도록, 다형성 영역이 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함하는 방법.
구체예 101. 구체예 100에 있어서, 다형성 영역이 SNP 및/또는 점 돌연변이를 포함하는 방법.
구체예 102. 구체예 100에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 개체군의 제1 및 제2 구성원 사이에서 다형성 영역의 길이가 변동되는 방법.
구체예 103. 구체예 98 내지 구체예 102 중 어느 한 구체예에 있어서, 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 상기 단계가 이중-가닥 DNA 및/또는 앰플리콘 서열 특이적-탐침에 결합하는 염료에 의해 제공되는 신호를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 104. 구체예 103에 있어서, 이중-가닥 DNA에 결합하는 염료가 SYBR 그린인 방법.
구체예 105. 구체예 98 내지 구체예 104 중 어느 한 구체예에 있어서, 중합효소 연쇄반응(PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 고리-매개 등온 증폭(LAMP), 회전환 증폭(RCA), 전사-매개 증폭(TMA), 자기-지속적 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 또는 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 중 임의의 하나 이상의 사용을 포함하는 방법.
구체예 106. 구체예 103 내지 구체예 105 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 검출하는 단계가 융해 곡선 분석을 사용하여 앰플리콘의 개체군의 상기 제1 및 제2 구성원의 상기 생성을 모니터링하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 107. 구체예 98 내지 구체예 106 중 어느 한 구체예에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 및/또는 앰플리콘이 게놈 DNA, 상보적 DNA(cDNA), 또는 RNA인 방법.
구체예 108. 구체예 75에 있어서, 상기 MNAyme이 검출가능한 부분 및 퀀처 부분을 포함하는 기질을 개질할 수 있으며, 여기서 상기 검출가능한 부분 및 퀀처 부분을 분리하는 MNAzyme에 의한 기질의 분해에 의해 검출가능한 효과가 제공됨으로써 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내는 용도.
구체예 109. 구체예 75에 있어서, MNAzyme에 의해 기질이 개질될 때 생성되는 검출가능한 효과를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 용도.
구체예 110. 구체예 54 내지 구체예 58 중 어느 한 구체예에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 제3 구성요소가 서열 번호 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195 또는 196 중 임의의 하나, 또는 상기 서열 중 임의의 하나의 상보체에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 단리된 올리고뉴클레오티드.
구체예 111. 구체예 54 내지 구체예 58, 구체예 110 또는 구체예 110 중 어느 한 구체예에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.
구체예 112. 구체예 60 내지 65 중 어느 한 구체예에 따른 이중 가닥 핵산 이중체를 포함하는 키트.
구체예 113. 구체예 66 내지 구체예 73 중 어느 한 구체예에 따른 MNAzyme을 포함하는 키트.
구체예 114. 구체예 74에 따른 핵산 복합체를 포함하는 키트.
구체예 115. 구체예 36에 있어서, 제1 센서 팔 구성요소가 상보적 염기 대합에 의해 앰플리콘의 내부 구성요소, 및 임의로 앰플리콘의 제1 단부 구성요소에 하이브리드화될 수 있고;
제2 센서 팔 구성요소가 상보적 염기 대합에 의해 앰플리콘의 제2 단부 구성요소에 하이브리드화될 수 있는 방법.
구체예 116. 구체예 115에 있어서, 제1 센서 팔 구성요소가 상보적 염기 대합에 의해 앰플리콘의 내부 구성요소 및 앰플리콘의 제1 단부 구성요소에 하이브리드화될 수 있고;
제2 센서 팔 구성요소가 상보적 염기 대합에 의해 앰플리콘의 제2 단부 구성요소에 하이브리드화될 수 있는 방법.
구체예 117. 구체예 50에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티드의 제3 구성요소가 작용적으로 활성인 촉매 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
본 발명은 또한, 적어도 부분적으로 하기의 구체예 1 내지 구체예 33에 관한 것이다:
구체예 1. 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에서 종결되며 상보적 염기 대합에 의해 표적 폴리뉴클레오티드의 가닥의 제1 부분에 하이브리드화될 수 있는 제1 프라이머 구성요소, 및
올리고뉴클레오티드의 3' 단부에서 종결되며 상보적 염기 대합에 의해 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 제2 부분에 하이브리드화될 수 있는 제2 프라이머 구성요소를 포함하는 프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계;
제1 프라이머 구성요소 및 제2 프라이머 구성요소의 표적 폴리뉴클레오티드 가닥과의 하이브리드화에 적합한 조건 하에, 표적 폴리뉴클레오티드를 잠재적으로 포함하는 샘플을 프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 이중-가닥 이중체를 형성시키며, 여기서 이중체의 중간 섹션의 적어도 하나의 가닥은 적어도 4개의 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하는 중간 섹션의 대향 가닥 내의 뉴클레오티드 서열의 부재로 인하여 중간 섹션의 대향 가닥에 하이브리드화되지 않은 채 남아 있는 적어도 4개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단계;
표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 템플레이트로서 사용하여 이중체의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장할 수 있는 중합효소와 샘플을 접촉시킴으로써 제1 및 제2 단부 구성요소의 중간에 있는 내부 구성요소를 포함하는 앰플리콘을 생성시키며, 여기서
앰플리콘의 제1 단부 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상기 제1 부분에 상보적 염기 대합에 의해 하이브리드화될 수 있고,
앰플리콘의 제2 단부 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상기 제2 부분에 상보적 염기 대합에 의해 하이브리드화될 수 있으며,
앰플리콘의 제1 및 제2 단부 구성요소의 표적 폴리뉴클레오티드 가닥에 대한 상기 하이브리드화는, 내부 구성요소와 염기쌍 상보성을 공유하지 않는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 제1 및 제2 부분 사이에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 중간 뉴클레오티드 서열에 대향하도록 앰플리콘의 내부 구성요소를 위치시키는 단계; 및
앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하며, 여기서 앰플리콘의 검출은 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내고, 앰플리콘의 검출 실패는 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 부재를 나타내는 단계를 포함하는,
(i) 커스틴 랫트 육종 바이러스 종양유전자 동족체(KRAS: Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 야생형 유전자;
(ii) G12V 또는 G12S 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 커스틴 랫트 육종 바이러스 종양유전자 동족체(KRAS) 유전자; 또는
(iii) 엔테로바이러스의 구성요소인 표적 폴리뉴클레오티드의 샘플 내의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
구체예 2. 구체예 1에 있어서,
표적 폴리뉴클레오티드가 G12V 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 커스틴 랫트 육종 바이러스 종양유전자 동족체(KRAS) 유전자의 구성요소이고,
프라이머 올리고뉴클레오티드가 제1 프라이머 구성요소와 제2 프라이머 구성요소 사이에 위치하는 제3 프라이머 구성요소를 포함하며, 여기서
제3 프라이머 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 상기 중간 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하지 않고, 앰플리콘의 내부 구성요소 내의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열로 구성되고,
프라이머 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 50, 59, 60, 61, 62, 172, 173, 174, 175, 176, 292, 297, 293, 298, 294, 299, 295, 300, 296, 301, 66, 87, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 99 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 방법.
구체예 3. 구체예 2에 있어서,
상보적 염기 대합에 의한 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드와 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 하이브리드화에 적합한 조건 하에, 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상보체인 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥과 염기쌍 상보성을 공유하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드에 샘플을 접촉시키는 단계, 및
중합효소를 사용하여 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 템플레이트로서 사용하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장함으로써 제2 앰플리콘을 생성시키며, 여기서
(i) 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 50, 59, 60, 61, 62, 172, 173, 174, 175, 176, 292, 297, 293, 298, 294, 299, 295, 300, 296 또는 301 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 26에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되거나;
(ii) 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 66 또는 87에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 65에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되거나;
(iii) 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 70 내지 79 또는 99 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 69에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되거나;
(iv) 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 87에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 26 또는 171에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 단계를 포함하는 방법.
구체예 4. 구체예 1에 있어서,
표적 폴리뉴클레오티드가 G12V 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 커스틴 랫트 육종 바이러스 종양유전자 동족체(KRAS) 유전자의 구성요소이고,
제1 프라이머 구성요소 및 제2 프라이머 구성요소가 상보적 염기 대합에 의해 하이브리드화되어 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 불연속 구성요소를 분리함으로써, 불연속 구성요소를 병치하고 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 루프 부분을 생성시키며;
프라이머 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 177, 178 또는 171 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 방법.
구체예 5. 구체예 4에 있어서,
상보적 염기 대합에 의한 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드와 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 하이브리드화에 적합한 조건 하에, 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상보체인 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥과 염기쌍 상보성을 공유하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드에 샘플을 접촉시키는 단계, 및
중합효소를 사용하여 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 템플레이트로서 사용하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장함으로써 제2 앰플리콘을 생성시키며, 여기서
(i) 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 177 또는 178에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 26에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되거나;
(ii) 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 171에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 87에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 단계를 포함하는 방법.
구체예 6. 구체예 3 또는 구체예 5에 있어서, 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 상기 단계가 제1 및 제2 파트자임을 사용하는 단계를 포함하며, 여기서
(i) 제1 파트자임은 서열 번호 22, 24, 23, 47, 53, 54, 64, 164, 165, 287, 288, 289, 290, 또는 291 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하고, 제2 파트자임은 서열 번호 18에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나,
(ii) 제1 파트자임은 서열 번호 64, 24, 67, 68 또는 88 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하고, 제2 파트자임은 서열 번호 63에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나;
(iii) 제1 파트자임은 서열 번호 24에 정의된 바와 같은 서열을 포함하고, 제2 파트자임은 서열 번호 18에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
구체예 7. 구체예 1에 있어서,
표적 폴리뉴클레오티드가 G12S 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 커스틴 랫트 육종 바이러스 종양유전자 동족체(KRAS) 유전자의 구성요소이고,
프라이머 올리고뉴클레오티드가 제1 프라이머 구성요소와 제2 프라이머 구성요소 사이에 위치하는 제3 프라이머 구성요소를 포함하며, 여기서
제3 프라이머 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 상기 중간 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하지 않고, 앰플리콘의 내부 구성요소 내의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열로 구성되고,
프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 166 내지 169 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 방법.
구체예 8. 구체예 7에 있어서,
상보적 염기 대합에 의한 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드와 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 하이브리드화에 적합한 조건 하에, 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상보체인 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥과 염기쌍 상보성을 공유하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드에 샘플을 접촉시키는 단계, 및
중합효소를 사용하여 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 템플레이트로서 사용하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장함으로써 제2 앰플리콘을 생성시키며, 여기서
(i) 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 166 내지 169 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 26에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되거나;
(ii) 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 166에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 171에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 단계를 포함하는 방법.
구체예 9. 구체예 1에 있어서
표적 폴리뉴클레오티드가 G12S 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 커스틴 랫트 육종 바이러스 종양유전자 동족체(KRAS) 유전자의 구성요소이고,
제1 프라이머 구성요소 및 제2 프라이머 구성요소가 상보적 염기 대합에 의해 하이브리드화되어 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 불연속 구성요소를 분리함으로써, 불연속 구성요소를 병치하고 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 루프 부분을 생성시키며;
프라이머 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 170 또는 171에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 방법.
구체예 10. 구체예 9에 있어서,
상보적 염기 대합에 의한 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드와 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 하이브리드화에 적합한 조건 하에, 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상보체인 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥과 염기쌍 상보성을 공유하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드에 샘플을 접촉시키는 단계, 및
중합효소를 사용하여 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 템플레이트로서 사용하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장함으로써 제2 앰플리콘을 생성시키며, 여기서
(i) 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 170에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 26 또는 171에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되거나;
(ii) 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 171에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 166 또는 170에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 단계를 포함하는 방법.
구체예 11. 구체예 8 또는 구체예 10에 있어서, 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 상기 단계가 제1 및 제2 파트자임을 사용하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 파트자임은 서열 번호 161 또는 162에 정의된 바와 같은 서열을 포함하고, 제2 파트자임은 서열 번호 18에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
구체예 12. 구체예 1에 있어서,
표적 폴리뉴클레오티드가 엔테로바이러스 유전자의 구성요소이고,
프라이머 올리고뉴클레오티드가 제1 프라이머 구성요소와 제2 프라이머 구성요소 사이에 위치하는 제3 프라이머 구성요소를 포함하며, 여기서
제3 프라이머 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 상기 중간 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하지 않고, 앰플리콘의 내부 구성요소 내의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열로 구성되고,
프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 317에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 방법.
구체예 13. 구체예 12에 있어서,
상보적 염기 대합에 의한 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드와 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 하이브리드화에 적합한 조건 하에, 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상보체인 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥과 염기쌍 상보성을 공유하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드에 샘플을 접촉시키는 단계, 및
중합효소를 사용하여 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 템플레이트로서 사용하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장함으로써 제2 앰플리콘을 생성시키며, 여기서 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 317에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 318에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 단계를 포함하는 방법.
구체예 14. 구체예 13에 있어서, 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 상기 단계가 제1 및 제2 파트자임을 사용하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 파트자임은 서열 번호 314에 정의된 바와 같은 서열을 포함하고, 제2 파트자임은 서열 번호 315에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
구체예 15. 상보적 염기 대합에 의해 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화될 수 있는 프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 프라이머 올리고뉴클레오티드는 개체군의 상기 구성원 중 일부에만 존재하는 다형성 영역의 특이적 형태, 또는 다형성 영역의 특이적 형태에 인접하거나 실질적으로 인접한 표적 폴리뉴클레오티드의 부분과 염기쌍 상보성을 공유하는 단계;
상보적 염기 대합에 의한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 표적 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화에 적합한 조건 하에 표적 폴리뉴클레오티드를 잠재적으로 포함하는 샘플을 프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 이중-가닥 이중체를 형성시키는 단계;
표적 폴리뉴클레오티드를 템플레이트로서 사용하여 이중체의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장할 수 있는 중합효소와 샘플을 접촉시킴으로써 다형성 영역의 특이적 형태를 포함하는 앰플리콘을 생성시키는 단계; 및
다중-구성요소 핵산 효소(MNAzyme)를 사용하여 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하며, 여기서
MNAzyme의 센서 팔은 앰플리콘의 상이한 부분에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소, 및 제1 센서 팔 구성요소와 제2 센서 팔 구성요소 사이에 위치하는 제3 센서 팔 구성요소를 포함하거나 이로 구성되며, 여기서
제1 센서 팔 구성요소는 다형성 영역의 업스트림에서 상보적 염기 대합에 의해 임의의 상기 형태의 앰플리콘에 하이브리드화될 수 있고,
제2 센서 팔 구성요소는 다형성 영역의 다운스트림에서 상보적 염기 대합에 의해 임의의 상기 형태의 앰플리콘에 하이브리드화될 수 있으며,
제3 센서 팔 구성요소는 제1 센서 팔 구성요소와 제2 센서 팔 구성요소 사이에 위치하고, 임의의 상기 형태의 앰플리콘의 다형성 영역과 염기쌍 상보성을 공유하는 제3 센서 팔 구성요소 내의 뉴클레오티드 서열의 부재로 인해 임의의 상기 형태의 앰플리콘의 다형성 영역에 상보적 염기 대합에 의해 하이브리드화될 수 없는 단계를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 2개 이상의 개별적인 구성원 사이에서 변동되는 다형성 영역을 포함하며 표피 성장 인자 수용체(EGFR: epidermal growth factor receptor) 유전자의 구성요소인 표적 폴리뉴클레오티드의 샘플 내의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
구체예 16. 구체예 15에 있어서, 상기 센서 팔의 제1 센서 팔 구성요소가 서열 번호 120, 127, 128 또는 129 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 방법.
구체예 17. 구체예 16에 있어서, 상기 MNAzyme이 상보적 염기 대합에 의해 임의의 상기 형태의 앰플리콘에 하이브리드화될 수 있는 제2 센서 팔을 포함하며,
(i) 센서 팔은 서열 번호 120에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 센서 팔은 서열 번호 119에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되거나;
(ii) 센서 팔은 서열 번호 127, 128 또는 129 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 센서 팔은 서열 번호 119에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 방법.
구체예 18. 구체예 17에 있어서,
센서 팔이 서열 번호 128 또는 129에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 센서 팔이 서열 번호 119에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되며,
프라이머 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 131에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 방법.
구체예 19. 구체예 18에 있어서,
상보적 염기 대합에 의한 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드와 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 하이브리드화에 적합한 조건 하에, 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상보체인 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥과 염기쌍 상보성을 공유하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드에 샘플을 접촉시키는 단계, 및
중합효소를 사용하여 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 템플레이트로서 사용하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장함으로써 제2 앰플리콘을 생성시키며, 여기서 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 131에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 122에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 단계를 포함하는 방법.
구체예 20. 구체예 17에 있어서,
상보적 염기 대합에 의한 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드와 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 하이브리드화에 적합한 조건 하에, 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상보체인 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥과 염기쌍 상보성을 공유하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드에 샘플을 접촉시키는 단계, 및
중합효소를 사용하여 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 템플레이트로서 사용하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장함으로써 제2 앰플리콘을 생성시키며, 여기서 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 122에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 123 내지 126 또는 130 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 단계를 포함하는 방법.
구체예 21. 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에서 종결되며 상보적 염기 대합에 의해 제2 폴리뉴클레오티드의 제1 부분에 하이브리드화될 수 있는 제1 구성요소,
올리고뉴클레오티드의 3' 단부에서 종결되며 상보적 염기 대합에 의해 제2 폴리뉴클레오티드의 제2 부분에 하이브리드화될 수 있는 제2 구성요소, 및
제1 및 제2 구성요소가 제2 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되는 경우에 제2 폴리뉴클레오티드 내의 대향 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하지 않는 적어도 4개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 제1 및 제2 구성요소 사이에 위치하는 제3 구성요소를 포함하며;
여기서 제3 구성요소는 올리고뉴클레오티드의 3' 절반 내에 부분적으로, 또는 완전히 위치하고,
올리고뉴클레오티드는 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 50, 59, 60, 61, 62, 172, 173, 174, 175, 176, 292, 297, 293, 298, 294, 299, 295, 300, 296, 301, 66, 87, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 99, 166 내지 171, 317, 120, 127, 128, 129 또는 131 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 단리된 프라이머 또는 파트자임 올리고뉴클레오티드.
구체예 22. 구체예 21에 있어서, 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 50, 59, 60, 61, 62, 172, 173, 174, 175, 176, 292, 297, 293, 298, 294, 299, 295, 300, 296, 301, 66, 87, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 99, 166 내지 171, 317 또는 131 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 프라이머 올리고뉴클레오티드.
구체예 23. 구체예 21에 있어서, 서열 번호 120, 127, 128 또는 129 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 파트자임 올리고뉴클레오티드.
구체예 24. 서열 번호 177, 178, 170 또는 171 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 단리된 프라이머 올리고뉴클레오티드.
구체예 25. 구체예 21 내지 구체예 24 중 어느 한 구체예에 따른 하나 이상의 단리된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.
구체예 26. 구체예 25에 있어서,
(i) 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 50, 59, 60, 61, 62, 172, 173, 174, 175, 176, 292, 297, 293, 298, 294, 299, 295, 300, 296 또는 301 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 26에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드;
(ii) 서열 번호 66 또는 87 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 65에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드;
(iii) 서열 번호 70 내지 79 또는 99 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 69에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드;
(iv) 서열 번호 87에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 26 또는 171에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드;
(v) 서열 번호 177 또는 178에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 26에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드;
(vi) 서열 번호 171에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 87에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드;
(vii) 서열 번호 166 내지 169 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 26에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드;
(viii) 서열 번호 166에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 171에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드;
(ix) 서열 번호 170에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 26 또는 171에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드;
(x) 서열 번호 171에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 166 또는 170에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드;
(xi) 서열 번호 317에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 318에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드;
(xii) 서열 번호 120, 127, 128 또는 129 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제1 파트자임 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 119에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제2 센서 팔 파트자임 올리고뉴클레오티드; 또는
(xiii) 서열 번호 131에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 122에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.
구체예 27. 구체예 26에 있어서,
(i) 서열 번호 22, 24, 23, 47, 53, 54, 64, 164, 165, 287, 288, 289, 290 또는 291 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제1 파트자임, 및 서열 번호 18에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제2 파트자임;
(ii) 서열 번호 64, 24, 67, 68 또는 88 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제1 파트자임, 및 서열 번호 63에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제2 파트자임;
(iii) 서열 번호 24에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제1 파트자임, 및 서열 번호 18에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제2 파트자임;
(iv) 서열 번호 161 또는 162에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제1 파트자임 및 서열 번호 18에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제2 파트자임;
(v) 서열 번호 314에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제1 파트자임 및 서열 번호 315에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제2 파트자임;
(vi) 서열 번호 122에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 123 내지 126 또는 130에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드; 또는
(vii) 서열 번호 128 또는 129에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제1 파트자임 및 서열 번호 119에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 제2 파트자임을 추가로 포함하는 키트.
구체예 28. 구체예 23에 따른 파트자임 올리고뉴클레오티드를 포함하는 MNAzyme.
구체예 29. 구체예 1에 있어서,
표적 폴리뉴클레오티드가 커스틴 랫트 육종 바이러스 종양유전자 동족체(KRAS) 야생형 유전자의 구성요소이고,
프라이머 올리고뉴클레오티드가 제1 프라이머 구성요소와 제2 프라이머 구성요소 사이에 위치하는 제3 프라이머 구성요소를 포함하며, 여기서
제3 프라이머 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 상기 중간 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하지 않고, 앰플리콘의 내부 구성요소 내의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열로 구성되고,
프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 49, 33, 34, 55, 56, 57, 58, 83, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285 또는 286 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 방법.
구체예 30. 구체예 29에 있어서,
상보적 염기 대합에 의한 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드와 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 하이브리드화에 적합한 조건 하에, 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상보체인 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥과 염기쌍 상보성을 공유하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드에 샘플을 접촉시키는 단계, 및
중합효소를 사용하여 제2 표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 템플레이트로서 사용하는 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장함으로써 제2 앰플리콘을 생성시키며, 여기서
(i) 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 49, 33, 34, 55, 56, 57 또는 58 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 26에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되거나;
(ii) 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 83에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 69에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되거나;
(iii) 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285 또는 286 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 65에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 단계를 포함하는 방법.
구체예 31. 구체예 30에 있어서, 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 상기 단계가 제1 및 제2 파트자임을 사용하는 단계를 포함하며, 여기서
(i) 제1 파트자임은 서열 번호 19 내지 21, 51 또는 52 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하고, 제2 파트자임은 서열 번호 18에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나;
(ii) 제1 파트자임은 서열 번호 80에 정의된 바와 같은 서열을 포함하고, 제2 파트자임은 서열 번호 63에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나;
(iii) 제1 파트자임은 서열 번호 242 내지 256 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하고, 제2 파트자임은 서열 번호 241에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
구체예 32. 서열 번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 49, 33, 34, 55, 56, 57, 58, 83, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285 또는 286 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 단리된 프라이머 올리고뉴클레오티드.
구체예 33. 구체예 32에 따른 하나 이상의 단리된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.
본 발명은 또한, 적어도 부분적으로 하기의 구체예 1 내지 구체예 40에 관한 것이다:
구체예 1. 표적 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 제1 구성요소 및 표적 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 비-상보적인 제2 구성요소를 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계;
제1 올리고뉴클레오티드와 표적 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화에 적합한 조건 하에 표적 폴리뉴클레오티드를 제1 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 및 효소 반응을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜 제1 올리고뉴클레오티드의 제2 구성요소를 포함하는 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭된 복제물을 생성시키는 단계; 및
표적 폴리뉴클레오티드의 증폭된 복제물을 검출하는 단계를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법.
구체예 2. 구체예 1에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드의 상기 제2 구성요소가 표적 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 제1 올리고뉴클레오티드의 제1 및 제3 구성요소 사이에 위치하는 방법.
구체예 3. 구체예 2에 있어서, 제1 및 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 제2 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수 미만인 방법.
구체예 4. 구체예 2에 있어서, 제1 및 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 제2 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수와 동일한 방법.
구체예 5. 구체예 2에 있어서, 제1 및 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 제2 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수를 초과하는 방법.
구체예 6. 구체예 1 내지 구체예 3 중 어느 한 구체예에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드 표적에 결합할 때 제2 구성요소가 루프를 형성하는 방법.
구체예 7. 구체예 1 내지 구체예 6 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 검출하는 단계가 증폭된 복제물 내에서 올리고뉴클레오티드의 제2 부분을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 8. 구체예 1 내지 구체예 6 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 검출하는 단계가 증폭된 복제물 내에서 제1 올리고뉴클레오티드의 제2 부분에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 9. 구체예 1 내지 구체예 8 중 어느 한 구체예에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계가 제1 올리고뉴클레오티드보다 표적 폴리뉴클레오티드의 상이한 구성요소에 실질적으로 상보적인 제2 올리고뉴클레오티드를 사용하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 10. 구체예 1 내지 구체예 9 중 어느 한 구체예에 있어서, 효소 반응이 중합효소 연쇄반응(PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 고리-매개 등온 증폭(LAMP), 회전환 증폭(RCA), 전사-매개 증폭(TMA), 자기-지속적 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 또는 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 중 임의의 하나 이상인 방법.
구체예 11. 구체예 1 내지 구체예 10 중 어느 한 구체예에 있어서, 효소 반응이 중합효소 연쇄반응(PCR)인 방법.
구체예 12. 구체예 1 내지 구체예 11 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 검출하는 단계가 적어도 2개 이상의 파트자임 구성요소를 포함하는 MNAzyme의 사용을 포함하며, 여기서 적어도 제1 파트자임 구성요소 및 제2 파트자임 구성요소가 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭된 복제물의 존재 하에 자가-조립되어 촉매적으로 활성인 다중-구성요소 핵산 효소(MNAzyme)를 형성하고, 여기서 제1 및 제2 파트자임 구성요소 각각은 기질 팔 부분(기질 arm portion), 촉매 코어 부분(catalytic core portion), 및 센서 팔 부분(sensor arm portion)을 포함하며;
여기서 자가-조립시에, 제1 및 제2 파트자임 구성요소의 센서 팔 부분은 MNAzyme의 센서 팔로서 작용하고, 제1 및 제2 파트자임 구성요소의 기질 팔 부분은 MNAzyme의 기질 팔로서 작용하며, 제1 및 제2 파트자임 구성요소의 촉매 코어 부분은 MNAzyme의 촉매 코어로서 작용하고;
여기서 제1 및 제2 파트자임 구성요소가 그들 각각의 촉매 코어 부분의 연계를 위해 근접하여 유지되어 MNAzyme의 촉매 코어를 형성하도록 MNAzyme의 센서 팔은 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭된 복제물과 상호작용하며, 촉매 코어는 적어도 하나의 기질을 개질할 수 있고, 여기서 MNAzyme의 촉매 코어가 기질을 개질함으로써 검출가능한 효과를 제공할 수 있도록 MNAzyme의 기질 팔은 기질과 맞물리는 방법.
구체예 13. 구체예 12에 있어서, 상기 MNAzyme의 제1 센서 팔이
(i) 제1 올리고뉴클레오티드의 제2 부분, 또는 그의 구성요소; 및
(ii) 표적 폴리뉴클레오티드의 부분을 포함하는 증폭된 복제물 내의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 방법.
구체예 14. 구체예 12에 있어서, 상기 MNAzyme의 제1 센서 팔이
(i) 제1 올리고뉴클레오티드의 제2 부분, 또는 그의 구성요소에 상보적인 뉴클레오티드 서열; 및
(ii) 표적 폴리뉴클레오티드의 부분을 포함하는 증폭된 복제물 내의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 방법.
구체예 15. 구체예 1 내지 구체예 14 중 어느 한 구체예에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 단일 염기 다형성(SNP) 또는 점 돌연변이를 포함하는 방법.
구체예 16. 구체예 15에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드가 SNP 또는 점 돌연변이에 상보적인 상기 제2 구성요소에 대해 3'에 위치하는 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
구체예 17. 구체예 15 또는 구체예 16에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 제2 구성요소에 대해 3'인 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드 표적에 상보적이지 않은 방법.
구체예 18. 구체예 2 내지 구체예 17 중 어느 한 구체예에 있어서,
폴리뉴클레오티드 표적이 폴리뉴클레오티드 표적을 포함하는 주어진 종의 개체 사이에서 변동되는 다형성 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
제1 올리고뉴클레오티드의 제1 구성요소가 다형성 뉴클레오티드 서열의 5'에 있는 폴리뉴클레오티드 표적에 결합하고;
제1 올리고뉴클레오티드의 제3 구성요소가 다형성 뉴클레오티드 서열의 3'에 있는 폴리뉴클레오티드 표적에 결합하며;
제1 올리고뉴클레오티드의 제2 구성요소가 다형성 뉴클레오티드 서열에 비-상보적인 방법.
구체예 19. 구체예 12 내지 구체예 18 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 기질이 검출가능한 부분 및 퀀처 부분을 포함하며, 여기서 상기 검출가능한 부분 및 퀀처 부분을 분리하는 MNAzyme에 의한 기질의 분해에 의해 검출가능한 효과가 제공되는 방법.
구체예 20. 구체예 12 내지 구체예 19 중 어느 한 구체예에 있어서, MNAzyme에 의해 기질이 개질될 때 생성되는 검출가능한 효과를 다단계로 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구체예 21. 구체예 1 내지 구체예 20 중 어느 한 구체예에 있어서, 서열이 제1 표적 폴리뉴클레오티드와 상이한 제2 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구체예 22. 구체예 21에 있어서,
제2 표적 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 제1 구성요소 및 제2 표적 올리고뉴클레오티드에 실질적으로 비-상보적인 제2 구성요소를 포함하는 부가적인 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계;
부가적인 올리고뉴클레오티드와 제2 표적 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화에 적합한 조건 하에 제2 표적 폴리펩티드를 부가적인 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 및 제2 효소 반응을 사용하여 제2 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜 부가적인 올리고뉴클레오티드의 제2 구성요소를 포함하는 상기 제2 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭된 복제물을 생성시키는 단계; 및
제2 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭된 복제물을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
구체예 23. 구체예 22에 있어서, 부가적인 올리고뉴클레오티드의 상기 제2 구성요소가 표적 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 제1 올리고뉴클레오티드의 제1 및 제3 구성요소 사이에 위치하는 방법.
구체예 24. 구체예 23에 있어서, 부가적인 올리고뉴클레오티드의 제1 및 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가
(i) 제2 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수 미만이가나;
(ii) 제2 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수와 동일하거나;
(iii) 제2 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수를 초과하는 방법.
구체예 25. 구체예 22 내지 구체예 24 중 어느 한 구체예에 있어서, 부가적인 올리고뉴클레오티드가 제2 폴리뉴클레오티드 표적에 결합할 때 부가적인 올리고뉴클레오티드의 제2 구성요소가 루프를 형성하는 방법.
구체예 26. 구체예 22 내지 구체예 25 중 어느 한 구체예에 있어서, 제2 효소 반응이 중합효소 연쇄반응(PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 고리-매개 등온 증폭(LAMP), 회전환 증폭(RCA), 전사-매개 증폭(TMA), 자기-지속적 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 또는 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 중 임의의 하나 이상인 방법.
구체예 27. 구체예 21 내지 구체예 26 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 표적의 검출이 동시에 수행되는 방법.
구체예 28. 구체예 21 내지 구체예 26 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 표적의 검출이 순차적으로 수행되는 방법.
구체예 29. 구체예 1 내지 구체예 28 중 어느 한 구체예에 있어서, 시험관내 또는 생체외에서 수행되는 방법.
구체예 30. 구체예 1 내지 구체예 29 중 어느 한 구체예에 있어서, 제1 또는 제2 표적 폴리뉴클레오티드가 DNA, RNA 또는 cDNA인 방법.
구체예 31. 3개의 구성요소를 포함하며, 여기서
올리고뉴클레오티드의 제1 및 제3 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드의 상이한 구성요소에 실질적으로 상보적이고;
제1 및 제3 구성요소 사이에 위치하는 올리고뉴클레오티드의 제2 구성요소는 표적 폴리펩티드에 비-상보적인 올리고뉴클레오티드.
구체예 32. 구체예 31에 있어서, 제2 구성요소의 길이가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 뉴클레오티드를 초과하는 올리고뉴클레오티드.
구체예 33. 구체예 31 또는 구체예 32에 있어서, 제1 구성요소의 길이가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 뉴클레오티드를 초과하는 올리고뉴클레오티드.
구체예 34. 구체예 31 내지 구체예 33 중 어느 한 구체예에 있어서, 제3 구성요소의 길이가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 뉴클레오티드를 초과하는 올리고뉴클레오티드.
구체예 35. 구체예 31 내지 구체예 33 중 어느 한 구체예에 있어서, 제1 및 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 제2 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수 미만인 올리고뉴클레오티드.
구체예 36. 구체예 31 내지 구체예 33 중 어느 한 구체예에 있어서, 제1 및 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 제2 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수와 동일한 올리고뉴클레오티드.
구체예 37. 구체예 31 내지 구체예 33 중 어느 한 구체예에 있어서, 제1 및 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 제2 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수를 초과하는 올리고뉴클레오티드.
구체예 38. 구체예 31 내지 구체예 35 중 어느 한 구체예에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드 표적에 결합할 때 제2 구성요소가 루프를 형성하는 올리고뉴클레오티드.
구체예 39. 구체예 31 내지 구체예 38 중 어느 한 구체예에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 DNA, RNA 또는 cDNA인 올리고뉴클레오티드.
구체예 40. 구체예 1 내지 구체예 30 중 어느 한 구체예에 따른 방법에서 구체예 31 내지 구체예 39 중 어느 한 구체예에 따른 올리고뉴클레오티드의 용도.
하기 개시된 바와 같은 첨부 도면 1 내지 16을 참조하여, 단지 예로서, 본 발명의 바람직한 구체예가 이하 기재될 것이다.
도 1: MNAzyme 판독(readout)을 동반하는 폴리뉴클레오티드 보조 서열 전환(PASS: Polynucleotide Assisted Sequence Switching) 프라이머: 관심의 대상인 표적 서열에 상보적이지 않은 고유 서열(US: unique sequence)의 부분을 함유하는 PASS 프라이머를 포함하는 예시적인 PASS PCR 전략을 설명한다. 고유 서열(US)은 PASS 프라이머 내의 2개의 서열(S1 및 S2) 사이에 있으며, 이들 양자 모두는 대체로 표적에 상보적이다. S1은 표적에 상보적이고 US에 대해 5'에 있는 PASS 프라이머의 영역이다. S2은 대체로 표적에 상보적이고 US에 대해 3'에 있는 PASS 프라이머의 영역이다. PASS 프라이머는 표적 서열에 결합할 경우에 상이한 입체배좌(conformation)를 생성시키도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, S1 및 S2의 결합 부위 사이의 표적 서열(표적-갭) 내의 염기의 수가 US 내의 염기의 수 미만인 경우, PASS 프라이머가 표적에 결합할 때 US는 "루프"를 형성해낼 것이다(패널 (i)). S1 및 S2의 결합 부위 사이의 표적 내의 염기의 수가 US 내의 염기의 수와 동일한 경우, US는 루프를 형성해내지 않고 "평면" 비-상보적 영역을 형성한다(패널 (ii)). 다른 구체예에서, S1 및 S2의 결합 부위 사이의 표적 서열 내의 염기의 수는 US 내의 염기의 수를 초과할 수 있으며, 이러한 시나리오에서 PASS 프라이머가 표적 서열에 결합할 때 표적 서열은 루프를 형성해낼 것이다. PCR의 연속하는 라운드를 통해 US는 PCR 앰플리콘의 하나의 가닥 내로 혼입되고 US의 상보체(cUS)는 PCR 앰플리콘의 대향 가닥 내로 혼입된다. US의 루프(패널 (i)) 또는 평면 영역(패널 (ii))을 가진 PASS 프라이머에 의해 생성되는 앰플리콘은 여러 전략에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 이 도면은 MNAzyme을 사용하는 검출을 나타낸다(패널 (iii)).
PASS 프라이머를 MNAzyme qPCR과 조합하는 경우, MNAzyme은 설명된 바와 같이 고유 서열의 상보체(cUS), 또는 대안적으로 고유 서열에 결합하는 파트자임을 포함할 수 있으며, 반면에 다른 파트자임은 관심의 대상인 증폭된 표적 서열 상에 인접하여 결합한다. 파트자임 구성요소로부터의 활성 MNAzyme의 형성은 형광단 및 퀀처로 표지된 범용 탐침의 분해를 유발하여 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 생성시킬 수 있다.
도 2: 단일 염기 다형성(SNP) 및/또는 획득 점 돌연변이를 식별하도록 디자인된 PASS 프라이머: PASS 프라이머는 SNP 또는 점 돌연변이와 같은 단일 염기 변화의 식별을 증진하도록 디자인될 수 있다. 한 구체예에서는, 루프를 형성한 PASS 프라이머(패널 (i)) 또는 평면 PASS 프라이머(패널 (ii))의 S2를 사용하여 SNP 또는 점 돌연변이를 표적화하고 특이적으로 결합할 수 있다.
PASS 프라이머의 S2 내의 SNP 또는 점 돌연변이에 일치하는 염기는 프라이머의 3' 말단에 위치하거나, S2 내부의 다른 위치에 놓일 수 있다(패널 (i) 및 (ii)의 상단). 추가로, 관심의 대상인 표적과 S2 사이에 부가적인 염기가 불일치되어 SNP의 더 양호한 식별을 지원할 수 있다(패널 (i) 및 (ii)의 하단).
도 3: 복합 MNAzyme 판독을 동반하여 단일 염기 변화를 식별하기 위한 PASS 프라이머의 사용: PASS 프라이머는 SNP 또는 돌연변이와 같은 변종 서열 사이의 식별을 증진하도록 디자인될 수 있다. 이는 복합 MNAzyme qPCR 반응 중에 수행될 수 있다. 단일 염기만 변동되는 2개의 서열 사이의 식별 및 그의 검출이 이 도면에 설명되어 있으며, 변종 1은 좌측 패널에 원으로 표기되고 변종 2는 우측 패널에 삼각형으로 표기되어 있다. PASS 프라이머 1의 S2는 변종 1에 특이적으로 일치하고, PASS 프라이머 1의 US는 루프 포맷(루프 1) 내의 제1 비-표적 고유 서열 1(US1)이다. PASS 프라이머 2의 S2는 변종 2에 특이적으로 일치하고, PASS 프라이머 2의 US는 루프 포맷(루프 2) 내의 제2 비-표적 고유 서열(US2)이다. 이들 PASS 프라이머의 사용은, (a) 변종 염기 및 (b) PASS 프라이머를 통해 혼입된 US 양자 모두가 상이한 각각의 변종에 대한 앰플리콘을 생성시킨다.
생성된 앰플리콘의 검출은 MNAzyme에 의해 매개될 수 있다. 예를 들어, 변종 1 및 US1의 상보체 양자 모두에 특이적인 서열로 구성된 파트자임 센서 팔을 디자인함으로써, 변종 1 앰플리콘을 검출하도록 MNAzyme 1을 디자인할 수 있다. 변종 1을 가진 앰플리콘의 존재 하에서만 형광단 1로 표지된 범용 탐침 1(Sub 1)을 분해하도록 MNAzyme 1을 디자인할 수 있다. 변종 2 및 US2의 상보체 양자 모두에 특이적인 서열로 구성된 파트자임 센서 팔을 디자인함으로써, 변종 2 앰플리콘을 검출하도록 MNAzyme 2를 디자인할 수 있다. 변종 2를 가진 앰플리콘의 존재 하에서만 형광단 2로 표지된 범용 탐침 2(Sub 2)를 분해하도록 MNAzyme 2를 디자인할 수 있다.
이러한 전략에서는, 변종 1 및 2 양자 모두의 실시간 검출, 식별 및 정량화가 하나의 반응 튜브 내에서 동시에 일어날 수 있을 것이다.
도 4: PASS 프라이머와 MNAzyme qPCR의 조합: MNAzyme 판독을 동반하는 qPCR에 PASS 프라이머를 조합하였다. 본 실시예에서는 또한 PASS 프라이머일 수 있는 정방향 프라이머를, 파트자임 접합부에 대하여 상이한 위치에 위치시켰다. 정방향/PASS 프라이머의 3' 단부를 (i) 파트자임 접합부로부터 5 염기에, (ii) 파트자임 접합부로부터 3 염기에, 또는 (iii) 파트자임 접합부에 위치시켰다.
qPCR 반응에서, MNAzyme은 PASS 프라이머에 의해 생성된 3개의 시나리오(i 내지 iii) 각각을 표적화하도록 디자인되었다. 각각의 시나리오에 대해 루프가 형성된 US(흑색 삼각형 - 시험 1) 또는 평면 US(백색 정사각형 - 시험 2)를 가진 PASS 프라이머를 일치하는 MNAzyme을 가진 표준(비-PASS) 프라이머(흑색 원 - 양성 대조군) 또는 US를 검출하도록 디자인된 파트자임과 조합된 표준(비-PASS) 프라이머(십자표 - 음성 대조군)와 비교하였다.
도 5: 고도 가변 서열을 스킵하기 위한 PASS 프라이머의 사용: PASS 프라이머의 사용을 통해 앰플리콘 내로 혼입된 US는 또한, 검출하고자 하는 보존된 서열 사이에 존재하는 유익한 정보를 주지 않는 유전자 변이의 영역을 스킵하기 위해 사용될 수 있다. PASS 프라이머는 S1 및 S2가 2개의 보존된 비-인접 표적 서열에 상보적이도록 디자인될 수 있다. S1 및 S2에 하이브리드화되는 영역들 사이의 표적 서열 내의 갭(표적-갭)은 검출하고자 하는 3개의 변종 사이의 서열의 상이점을 함유할 것이다. PASS 프라이머의 US는 동일한 수의 S1과 S2 사이의 표적-갭 내의 뉴클레오티드를 함유하도록 디자인될 수 있다. US는 3개의 변종 모두에 불일치할 수 있다. US의 상보체에 하이브리드화되어 단일 탐침을 분해하는 파트자임 센서 팔을 가진 단일 MNAzyme을 디자인하여 변종 1, 2 및/또는 3을 검출할 수 있을 것이다.
도 6: 고도 가변 서열의 루프를 형성해내기 위한 PASS 프라이머의 사용: PASS 프라이머의 사용을 통해 앰플리콘 내로 혼입된 US는 또한, 검출하고자 하는 보존된 서열 사이에 존재하는 유익한 정보를 주지 않는 유전자 변이의 영역을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 표적 루프 PASS 프라이머는, PASS 프라이머의 US가 S1과 S2 사이의 표적-갭 내의 것들보다 더 적은 뉴클레오티드를 함유하도록 디자인될 수 있다. 표적 루프 PASS 프라이머를 사용하는 변종 1로부터의 DNA의 증폭은 표적-갭 내의 변종 서열을 PASS 프라이머의 US 내의 더 적은 수의 뉴클레오티드로 대체할 것이다. US의 상보체에 하이브리드화되어 단일 탐침을 분해하는 파트자임 센서 팔을 가진 단일 MNAzyme을 디자인하여 PASS 프라이머로부터 생성되는 임의의 앰플리콘을 검출할 수 있을 것이다.
도 7: 단일 염기 다형성(SNP) 및/또는 획득 점 돌연변이를 식별하기 위해 사용되는 PASS 프라이머의 디자인: SNP 또는 점 돌연변이와 같은 단일 염기 변화를 식별하기 위한 PASS 프라이머를 디자인할 수 있다. 한 구체예에서, 루프를 형성하거나 평면인 PASS 프라이머의 S2를 사용하여 SNP 또는 점 돌연변이를 표적화하고 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, PASS 프라이머의 S2 내의 SNP 또는 점 돌연변이에 일치하는 염기는 프라이머의 3' 말단에(디자인 1), 3' 단부로부터 3 염기에(디자인 2), 3' 단부로부터 3 염기에 삽입된 불일치 염기를 동반하여 프라이머의 3' 말단에(디자인 3), 또는 3' 단부로부터 5 염기에 삽입된 불일치 염기를 동반하여 3' 단부로부터 3 염기에(디자인 4)에 위치할 수 있다. MNAzyme을 위한 파트자임 A 표적 센서 팔은 각각의 PASS 프라이머 디자인에 일치하도록 디자인되는 반면에 파트자임 B는 모든 디자인에 대해 일정하다.
도 8: MNAzyme qPCR 판독을 동반하여 변종 균주를 검출하기 위한 PASS 파트자임의 사용: 관심의 대상인 표적 서열은 변종 염기의 스트링을 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 변종은 다른 것과 상이할 수 있다(예를 들어, 변종 1(V1), 변종 2(V2) 및 변종 3(V3) 서열). 각각의 변종 서열, V1, V2 및 V3에 대해 특이적이고 각각에 대한 앰플리콘을 생성시키도록 프라이머 세트를 디자인할 수 있다. PASS 파트자임의 사용은 변종 균주 사이의 식별 없이 실시간으로 서열을 검출하는 전략을 제공한다. 이는 MNAzyme qPCR의 사용을 포함하며, 여기서 MNAzyme은 PASS 파트자임을 포함할 수 있다. PASS 파트자임은 관심의 대상인 표적 서열(들)/앰플리콘(들)에 상보적이지 않은 고유 서열(US)의 부분을 함유한다. US는 대체로 표적에 상보적인 2개의 상보적 표적 특이적 영역 사이의 PASS 파트자임 센서 팔 내부에 함유된다. 파트자임 내의 US는 변종 염기를 함유하는 V1, V2 및 V3 내의 변종 영역과 정렬된다.
PASS 파트자임 내부의 US는 활성 MNAzyme의 형성에 영향을 미치지 않으므로, 임의의 변종 또는 그의 조합의 존재는 형광단 및 퀀처로 표지된 범용 탐침의 분해를 유발하여 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 생성시킬 수 있다.
도 9: MNAzyme qPCR 판독을 동반하여 변종 균주를 검출하기 위한 PASS 프라이머와 PASS 파트자임의 사용: 관심의 대상인 표적 서열은 변종 염기의 스트링을 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 변종은 다른 것과 상이할 수 있다(예를 들어, 변종 1(V1), 변종 2(V2) 및 변종 3(V3) 서열). 각각의 변종 서열, V1, V2 및 V3에 대해 특이적이나, 동일한 US(US1)를 함유하여 변종 염기 뿐 아니라 동일한 US에 상보적인 서열(cUS1)을 여전히 함유하는 각각에 대한 앰플리콘을 생성시키도록 PASS 프라이머 세트를 디자인할 수 있다. PASS 파트자임의 사용은 변종 균주 사이의 식별 없이 실시간으로 서열을 검출하는 전략을 제공한다. 이는 MNAzyme qPCR의 사용을 포함하며, 여기서 MNAzyme은 제1 PASS 파트자임 및 관심의 대상인 증폭된 표적 서열 상에 인접하여 결합하는 완전히 일치하는 "표준" 파트자임을 포함할 수 있다. 제1 PASS 파트자임 센서 팔은 (i) 모든 변종 앰플리콘의 보존된 서열에 완전히 일치하는 영역, (ii) 임의의 변종 앰플리콘에 상보적이지 않으며 변종 앰플리콘 사이에 상이한 영역에 정렬되는 고유 서열(US2), 및 (iii) 변종-특이적 PASS 프라이머 세트(모두 cUS1을 함유함)를 사용하여 생성시킨 모든 앰플리콘 내의 cUS1에 결합하는, US1을 함유하는 영역을 함유한다. 이러한 MNAzyme은 모든 변종을 인식하고 결합할 수 있다.
PASS 파트자임 내부의 US 서열은 활성 MNAzyme의 형성에 영향을 미치지 않으므로, 임의의 변종 서열 또는 그의 조합의 존재는 형광단 및 퀀처로 표지된 범용 탐침의 분해를 유발하여 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 생성시킬 수 있다.
도 10: MNAzyme qPCR 판독을 동반하여 변종 결실 균주를 검출하기 위한 PASS 파트자임의 사용: 관심의 대상인 변종 표적 서열은, 상이한 영역이 결실된 야생형 서열로부터 유도될 수 있다(패널 i, 결실 1 및 결실 2). 각각의 결실 변종 서열에 대해 특이적이고 각각에 대한 앰플리콘을 생성시키도록 프라이머 세트를 디자인할 수 있다. PASS 파트자임의 사용은 특이적 결실 사이의 필수적 식별 없이 실시간으로 서열을 검출하는 전략을 제공한다. 이는 MNAzyme qPCR을 사용하여 달성할 수 있으며, 여기서 MNAzyme은 제1 PASS 파트자임 및 관심의 대상인 증폭된 표적 서열 상에 인접하여 결합하는 완전히 일치하는("표준") 제2 파트자임을 포함할 수 있다. 제1 PASS 파트자임은 증폭된 표적 서열에 상보적이지 않은 서열의 영역(고유 서열(US)로 표기됨)을 함유하며, 이는 모든 변종을 검출하기 위해 하나의 MNAzyme을 사용할 수 있도록 결실 앰플리콘 사이에서 영역이 변동되는 곳에 정렬되도록 디자인된다(패널 ii). PASS 파트자임 내에 존재하는 US는 "평면" 형태이거나(패널 ii (a))(PASS 파트자임 내의 비-상보적 염기의 수가 증폭된 표적 서열 내의 결합되지 않은 염기의 수와 일치하는 경우); "루프를 형성"하거나(패널 ii (b))(파트자임 내의 비-상보적 염기의 수가 증폭된 표적 서열보다 더 크고 파트자임 서열이 팽출되거나 루프를 형성해내는 경우); 대안적으로 파트자임 내의 비-상보적 염기의 수가 증폭된 표적 서열보다 더 적고 표적 서열이 루프를 형성해낼 수 있다.
PASS 파트자임 내부의 US는 활성 MNAzyme의 형성에 영향을 미치지 않으므로, 형광단 및 퀀처로 표지된 범용 탐침이 분해되어 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 생성시킬 수 있다.
도 11: MNAzyme qPCR 판독을 동반하여 변종 균주를 검출하기 위한 PASS 프라이머와 PASS 파트자임의 사용: 관심의 대상인 변종 표적 서열은, 상이한 영역이 결실된 야생형 서열로부터 유래될 수 있다(패널 (i), 결실 1 및 결실 2). 각각의 결실 변종 서열, 결실 1 및 결실 2에 대해 특이적이나, 동일한 US(US1)를 함유하여 결실-특이적 변종 염기와 더불어 동일한 US에 상보적인 서열(cUS1)을 함유하는 각각의 결실에 대한 앰플리콘을 형성시킬 수 있도록 PASS 프라이머 세트를 디자인할 수 있다. 변종 균주 사이의 식별 없이 실시간으로 앰플리콘을 검출하기 위한 예시적인 전략은, PASS 프라이머와 함께 PASS 파트자임을 사용할 수 있다. 이는 MNAzyme qPCR의 사용을 포함할 수 있으며, 여기서 MNAzyme은 제1 PASS 파트자임 및 관심의 대상인 증폭된 표적 서열 상에 인접하여 결합하는 완전히 일치하는("표준") 제2 파트자임을 포함할 수 있다. 모든 변종을 검출하기 위해 하나의 MNAzyme을 사용할 수 있도록, PASS 파트자임은 증폭된 표적 서열에 상보적이지 않은 서열의 영역(고유 서열(US2)로 표기됨)(이는 결실 앰플리콘 사이에서 서열이 변동되는 곳에 정렬되도록 디자인됨) 및 US1에 상응하는 다른 영역을 함유한다(패널 (ii)). PASS 파트자임 내에 존재하는 US2는 평면 형태이거나(PASS 파트자임 내의 비-상보적 염기의 수가 증폭된 표적 서열 내의 결합되지 않은 염기의 수와 일치하는 경우) 루프를 형성할 수 있다(PASS 파트자임 내의 비-상보적 염기의 수가 증폭된 표적 서열보다 더 크거나 적고 서열이 팽출되거나 루프를 형성해내는 경우(패널 (ii))).
PASS 파트자임 내부의 US는 활성 MNAzyme의 형성에 영향을 미치지 않으므로, 형광단 및 퀀처로 표지된 범용 탐침이 분해되어 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 생성시킬 수 있다.
도 12: 상이한 길이의 표적 서열을 루프로 형성해내기 위한 표적 루프 PASS 프라이머 또는 핀치(Pinch) PASS 프라이머의 사용: PASS 프라이머, 표적 루프 PASS 프라이머 또는 핀치 PASS 프라이머의 사용을 통해 앰플리콘 내로 혼입된 고유 서열 삽입체(USI: Unique Sequence Insert) 또는 고유 서열 접합부(USJ: Unique Sequence Junction)는 또한, 검출하고자 하는 보존된 서열 사이에 존재하는 유익한 정보를 주지 않는 유전자 변이와 같은 서열의 영역을 제거하기 위해 사용할 수 있다.
PASS 프라이머는, (i) PASS 프라이머의 USI가 cS1과 cS2 사이에 위치하는 표적 서열 내의 뉴클레오티드보다 더 적은 뉴클레오티드를 함유하도록 하는 표적 루프 PASS 프라이머 또는 (ii) cS1과 cS2 사이에 위치하는 표적 서열을 루프로 형성해내는 핀치 PASS 프라이머의 USJ로서 디자인될 수 있다. 루프로 형성되어 나온 표적 서열의 길이는, 예를 들어 10 염기, 20 염기, 40 염기, 60 염기, 100 염기 또는 200 염기일 수 있으며(i 또는 ii), 이는 예를 들어, 루프 아래에 2개의 결합하지 않은 염기를 함유할 수 있는(iii) 원래의 루프 PASS 프라이머와 다시 비교할 수 있다.
표적 루프 PASS 프라이머 또는 핀치 PASS 프라이머를 사용하는 DNA의 증폭은 루프로 형성되어 나온 표적 서열을 각각 표적 루프 PASS 프라이머 또는 핀치 PASS 프라이머의 USI 또는 USJ 내의 더 적은 수의 뉴클레오티드로 대체할 것이다. USI 또는 USJ의 상보체에 하이브리드화되어 리포터 탐침을 분해하는 파트자임 센서 팔을 가진 MNAzyme을 디자인하여 PASS 프라이머 또는 핀치 PASS 프라이머로부터 생성되는 임의의 앰플리콘을 검출할 수 있을 것이다.
도 13: 상이한 길이의 표적 서열을 루프로 형성해내기 위한 PASS 파트자임 또는 핀치 PASS 파트자임의 사용: (i) 평면 PASS 파트자임의 USI가 cS1과 cS2 사이에 위치하는 표적 서열 내의 것들과 동일한 수의 뉴클레오티드를 함유하거나(예를 들어, 5, 10 또는 15 염기일 수 있음), (ii) 루프 PASS 파트자임의 USI가 cS1과 cS2 사이에 위치하는 표적 서열 내의 것들보다 더 많거나 더 적은 뉴클레오티드를 함유할 수 있거나(예를 들어, USI는 5, 10 또는 15 염기일 수 있음), (iii) 핀치 PASS 파트자임의 USJ가 cS1과 cS2 사이에 위치하는 표적 서열 중 예를 들어, 5, 10, 15, 20 또는 40 염기를 루프로 형성해낼 수 있도록 PASS 파트자임을 디자인할 수 있다.
PASS 파트자임은 MNAzyme qPCR에 사용될 수 있으며, 여기서 MNAzyme은 제1 PASS 파트자임 또는 핀치 PASS 파트자임 및 관심의 대상인 증폭된 표적 서열 상에 인접하여 결합하는 완전히 일치하는 ("표준") 파트자임을 포함할 수 있다. PASS 파트자임 내부의 USI 또는 USJ 서열은 활성 MNAzyme의 형성에 영향을 미치지 않으므로, 형광단 및 퀀처로 표지된 범용 탐침이 분해되어 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 생성시킬 수 있다.
도 14: 게놈 내의 가변 영역의 생략 또는 선택을 위한 프라이머 및 파트자임 A 조합의 선택. 핀치 PASS 파트자임의 개발은 MNAzyme에 의해 검출될 서열의 선택에 있어서의 유연성을 가능하게 하며, 이는 표적 서열이 가변 영역을 함유하는 경우에 이점이 될 수 있다. 다수의 상이한 프라이머 및 MNAzyme 시나리오를 채용할 수 있다. 전략은, (i) (i a) 가변 영역을 표적화하는 다운스트림 표준 MNAzyme(여기서 다중 변종을 검출하기 위하여 각각의 변종에 대해 상이한 파트자임 A(Pz A)를 디자인할 수 있으나 공통의 파트자임 B(Pz B)와 함께 사용할 수 있음); 또는 (i b) 가변 영역을 그의 고유 서열 접합부(USJ)에서 핀치해내는 핀치 PASS 파트자임 A와 함께 사용될 수 있는, 야생형을 포함하는 모든 변종을 검출하는 업스트림 공통 정방향 프라이머를 포함하여, 단일 MNAzyme으로 모든 변종의 검출을 가능하게 한다. "X"는 변종 염기를 나타내고 "0"은 변종 염기의 상보체를 나타낸다. 다른 시나리오에서는, (ii) MNAzyme과 중첩되는 변종 특이적인 정방향 프라이머를 사용하여 야생형 서열에 비해 변종을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 표준 MNAzyme과 조합하는 경우(ii a), 특이적 변종의 검출이 가능하나, 다중 변종의 검출은 변종마다 특이적 프라이머 및 파트자임 A 세트를 필요로 한다(공통의 Pz B와 함께). 대안적으로, 임의의 변종의 존재의 검출은 핀치 PASS 파트자임 A와 조합된 각각의 가변 영역을 증폭시키는 특이적 프라이머의 사용에 의해 달성될 수 있으며(ii b), 이는 가변 영역을 그의 고유 서열 접합부(USJ)에서 핀치해내어, 단일 MNAzyme으로 모든 변종의 검출을 가능하게 한다. 대안적으로, (iii) MNAzyme과 중첩되는 변종 특이적인 정방향 프라이머를 사용하여 변종 서열을 선택적으로 증폭시킬 수 있으며, 각각의 변종 특이적 프라이머는 그의 5' 단부 상에 비-표적 관련 태그 서열을 함유할 수 있으며, 이는 각각의 변종에 대한 앰플리콘 내로 혼입된다. 이는 앰플리콘의 동일한 가닥에 대한 결합에 있어서 MNAzyme과 프라이머 사이의 경쟁을 감소시키고 복합 반응에서 프라이머들 사이의 경쟁을 감소시킨다. 파트자임 A가 그의 고유 서열 접합부(USJ)에서 가변 영역을 핀치해 내고 앰플리콘 내의 태그 서열의 상보체(c-태그)에 결합함으로써, 정방향 프라이머와 파트자임 A 사이의 임의의 결합 경쟁을 감소시키고 단일 MNAzyme으로 모든 변종의 검출을 가능하게 하도록, 이러한 태깅된 프라이머를 (iii a) 특이적 변종을 검출하기 위한 표준 MNAzyme(각각의 Pz A는 게놈 내의 상이한 가변 영역을 검출하도록 디자인됨) 또는 (iii c) 태깅된 핀치 PASS 파트자임 A와 조합할 수 있다.
도 15: 안티센스 DNAzyme으로 구성된 US를 함유하는 PASS 프라이머. PASS 프라이머의 사용을 통해 앰플리콘 내로 혼입된 고유 서열을 사용하여, 또한 작용성 서열을 앰플리콘 내로 삽입할 수 있다. 고유 서열이 여전히 표적 서열에 비-상보적이면서 DNAzyme의 비활성 안티센스 형태로 구성되도록 PASS 프라이머를 디자인할 수 있다. PCR 중에 증폭될 때 촉매적으로 활성인 센스 DNAzyme이 앰플리콘 내로 삽입되고 기질을 분해하여 실시간으로 신호를 생성시킬 수 있다(도 15 패널 (ii)). 이에 비교하여, 표준 PASS 프라이머는 촉매 잠재력이 없고 표적 서열에 비-상보적인 US를 가질 수 있다(도 15 패널 (i)). MNAzyme이 증폭된 표적 서열 뿐 아니라 고유 서열의 상보체(cUS)에 결합하는 제1 파트자임을 포함하도록, PASS 프라이머를 MNAzyme qPCR과 조합할 수 있다. 제2 파트자임은 관심의 대상인 앰플리콘 상에서 제1 파트자임에 인접하여 결합할 수 있다. 그 후에 활성 MNAzyme은 기질 1(Sub 1)을 분해하여 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 생성시킬 것이다. 제2 기질 2(Sub 2)를 양자 모두의 반응에 첨가할 수 있으나, 표준 PASS 파트자임을 사용하는 경우에 기질 2는 분해되지 않은 채 남아 신호를 생성시키지 않을 것이다(도 15 패널 (i)). 그러나 US로서 DNAzyme의 안티센스를 함유하는 PASS 프라이머를 사용하는 경우, 증폭은 기질 2를 분해하여 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 생성시키는 활성 DNAzyme의 형성을 유발한다(도 15 패널 (ii)). 기질 1과는 상이한 형광단으로 기질 2를 표지하여 2개의 신호가 구별될 수 있도록 하거나, 대안적으로 기질 1과 동일한 형광단으로 기질 2를 표지하여 생성되는 신호를 증진하고 Ct 값을 감소시킬 수 있다.
도 16: 다중-구성요소 핵산(MNAzyme)의 예시적 디자인을 도시하는 다이어그램. 예시적인 개시로서, MNAzyme은 2개의 올리고뉴클레오티드 구성요소(파트자임 A 및 파트자임 B)로 구성되며, 이는 조립 촉진자, 예를 들어 표적 DNA 또는 RNA의 존재 하에 자가 조립된다. 조립 촉진자의 존재 하에 2개의 파트자임이 조립되는 경우, 기질을 개질(예를 들어, 분해 또는 결찰)할 수 있는 촉매적으로 활성인 MNAzyme이 형성된다. 2개의 구성요소 파트자임은 (i) 조립 촉진자에 결합하는 센서 팔, (ii) 기질에 결합하는 기질 팔, 및 (iii) 부분적 촉매 코어 서열을 가진다. 조립 촉진자 분자(예를 들어, 표적 핵산 서열)의 존재는 고도로 특이적인 방식으로 파트자임 구성요소의 조립을 지시하는 "입력" 신호를 제공한다. 일부 구체예에서 조립 촉진자는, 예를 들어, 시험 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 서열일 수 있다. 다른 구체예에서 조립 촉진자는, 예를 들어, 검출가능한 실체 또는 이벤트의 존재 하에 파트자임 구성요소의 자가-조립을 지시하는 환경 내에 포함된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 조립된 MNAzyme에 의한 기질(기질 탐침, 리포터 탐침 또는 리포터 기질)의 개질은 검출되고/되거나 정량화될 수 있는 "검출가능한 효과"를 제공할 수 있다. 예를 들어, 기질이 형광단(F) 및 퀀처(Q)로 이중 표지되는 경우, 활성 MNAzyme에 의한 기질의 분해는 형광단과 퀀처를 분리하여 이에 따른 형광의 증가를 유발한다.
정의
문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 본 출원에 사용되는 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 복수 언급을 포함한다. 예를 들어, 구문 "폴리뉴클레오티드"는 복수의 폴리뉴클레오티드들 또한 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "포함하는"은 "포괄하는"을 의미한다. 단어 "포함하는"의 변형, 예를 들어, "포함하다" 및 "포함한다"는 상응하게 변동된 의미를 가진다. 따라서, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열을 "포함하는" 폴리뉴클레오티드는 그 뉴클레오티드 서열로 배타적으로 구성되거나 하나 이상의 부가적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "복수"는 하나 초과를 의미한다. 소정의 특정 측면 또는 구체예에서, 복수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 또는 그 이상, 및 그 안에서 유도가능한 임의의 정수, 및 그 안에서 유도가능한 임의의 범위를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "대상"은 소, 말, 양, 영장류, 조류 및 설치류 종을 포함하는, 경제적, 사회적 또는 연구상의 중요성을 가진 임의의 동물을 포함한다. 그러므로 "대상"은, 예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유류와 같은 포유류일 수 있다. 박테리아, 바이러스, 진균/효모, 원생생물 및 선충을 포함하나 이로 제한되지 않는 미생물 대상 또한 포함된다. 본 발명에 따른 "대상"은 프리온과 같은 감염원 또한 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 각각 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 이루어진 중합체를 지칭하며 호환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, "폴리펩티드"는 전체 길이 단백질 또는 전체 길이 단백질의 부분을 구성할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 호환적으로 사용될 수 있으며, DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, RNA, 메틸화 RNA, microRNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pre-microRNA 및 pri-microRNA, 다른 비-코딩 RNA, 리보솜 RNA, 그의 유도체, 그의 앰플리콘 또는 그의 임의의 조합을 포함하나 이로 제한되지 않는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기, 또는 그의 유사체, 유도체, 변종, 단편 또는 조합의 단일- 또는 이중-가닥 중합체를 지칭한다. 비-제한적인 예를 들어, 핵산의 공급원은 합성, 포유류, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균(archael) 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산" "올리고뉴클레오티드"는, 달리 표시되지 않는 한, 임의의 명시된 서열 뿐 아니라 그에 상보적인 서열에 대한 언급을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 DNA 또는 DNA-함유 핵산 분자, 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자의 세그먼트, 또는 그의 조합을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드의 예는 핵산 표적; 기질, 예를 들어, MNAzyme에 의해 개질될 수 있는 것들; PCR과 같은 방법에 의한 시험관내 표적 증폭에 사용되는 것들과 같은 프라이머; 및 MNAzyme의 구성요소를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는, 달리 표시되지 않는 한, 임의의 명시된 서열 뿐 아니라 그에 상보적인 서열에 대한 언급을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 4-아세틸사이티딘, 5-(카복시하이드록시메틸)우리딘, 2'-O-메틸사이티딘, 5-카복시메틸아미노메틸 티오우리딘, 디하이드로우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, 베타 D-갈락토실큐오신, 2'-O-메틸구아노신, 이노신, N6-이소펜텐일아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸사이티딘, 5-메틸사이티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 베타 D-만노실메틸우리딘, 5-메톡시카보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜텐일아데노신, N-((9-베타-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, N-((9-베타-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸-카바모일)트레오닌, 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우리딘-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우리딘, 큐오신, 2-티오사이티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 와이부토신, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘, 베타 D-아라비노실 우리딘, 베타 D-아라비노실 티미딘을 포함하는 그룹을 포함하나 이로 제한되지 않는 적어도 하나의 첨가 또는 치환을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "상보적인", "상보성", "일치하다" 및 "일치하는"은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기-대합 또는 유동 염기 대합을 통해 서로에 하이브리드화되는 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 그의 조합)의 능력을 지칭한다. 아데닌(A) 염기와 우라실(U) 염기 사이, 아데닌(A) 염기와 티민(T) 염기 사이, 사이토신(C) 염기와 구아닌(G) 염기 사이의 왓슨-크릭 염기-대합을 통해 결합이 형성될 수 있다. 유동 염기쌍은 폴리뉴클레오티드 이중체 내의 2개의 뉴클레오티드 사이의 비-왓슨-크릭 염기 대합(예를 들어, 구아닌-우라실, 이노신-우라실, 이노신-아데닌 및 이노신-사이토신)이다. "상보적인" 것으로 지칭되거나 서로의 "상보체"인 뉴클레오티드는 그들 각각의 염기 사이의 왓슨-크릭 염기 대합 또는 유동 염기 대합에 의해 함께 하이브리드화되는 능력을 가진 뉴클레오티드이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "비-상보적인", "상보적이지 않은", "불일치하다" 및 "불일치하는"은 그들 각각의 염기 사이의 왓슨-크릭 염기 대합 또는 유동 염기 대합에 의해 함께 하이브리드화되는 능력이 결여된 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 그의 조합)를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 "효소"는 화학 반응(예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 증폭, 폴리뉴클레오티드의 분해 등)을 촉매할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 "앰플리콘"은 PCR, RT-PCR, SDA, HDA, RPA, LAMP, RCA, TMA, 3SR 또는 NASBA를 포함하나 이로 제한되지 않는 천연 또는 인공 핵산 증폭 또는 복제 이벤트의 산물인 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA, 또는 그의 조합)을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "핵산 효소", "촉매 핵산", "촉매 활성을 가진 핵산", 및 "촉매 핵산 효소"는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며, DNA 또는 DNA-함유 분자 또는 복합체, 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자 또는 복합체, 또는 그의 조합(즉, DNA-RNA 하이브리드 분자 또는 복합체)을 의미할 것이고, 이는 적어도 하나의 기질을 인식하고 적어도 하나의 기질의 개질(예를 들어, 결찰 또는 분해)을 촉매할 수 있다. 촉매 핵산 내의 뉴클레오티드 잔기는 염기 A, C, G, T 및 U 뿐 아니라 그의 유도체 및 유사체를 포함할 수 있다. 상기 용어는 단일 DNA 또는 DNA-함유 분자("DNA 효소", "데옥시리보자임" 또는 "DNAzyme"으로도 당업계에 공지됨) 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자("리보자임"으로도 당업계에 공지됨) 또는 DNA-RNA 하이브리드 분자인 그의 조합을 포함할 수 있으며, 적어도 하나의 기질을 인식하고 적어도 하나의 기질의 개질(예를 들어, 결찰 또는 분해)을 촉매할 수 있는 단-분자 핵산 효소를 포함한다. 상기 용어는 DNA 또는 DNA-함유 복합체 또는 RNA 또는 RNA-함유 복합체 또는 DNA-RNA 하이브리드 복합체인 그의 조합을 포함하며, 적어도 하나의 기질을 인식하고 적어도 하나의 기질의 개질(예를 들어, 결찰 또는 분해)을 촉매할 수 있는 핵산 효소를 포함한다. 용어 "핵산 효소", "촉매 핵산", "촉매 활성을 가진 핵산" 및 "촉매 핵산 효소"는 그들의 의미 내에 MNAzyme을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "MNAzyme" 및 "다중-구성요소 핵산 효소"는 본 명세서에 사용되는 바와 같이 동일한 의미를 가지며, MNAzyme 조립 촉진자(예를 들어, 표적)의 존재 하에서만 기질을 촉매적으로 개질할 수 있는 활성 핵산 효소를 형성하는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 서열(예를 들어, 파트자임)을 지칭한다. MNAzyme은 기질의 분해, 기질의 결찰 및 기질 또는 기질들의 다른 효소적 개질을 포함하는 다양한 반응을 촉매할 수 있다. 분해 활성을 가진 파트자임 A 및 파트자임 B를 포함하는 예시적인 MNAzyme이 도 16에 도시되어 있다. 엔도뉴클레아제 또는 분해 활성을 가진 MNAzyme은 "MNAzyme 분해자(MNAzyme cleaver)"로도 공지되어 있다. 도 16을 참조하면, 파트자임 A 및 B는 각각 왓슨-크릭 염기 대합을 통해 조립 촉진자(예를 들어, 표적 DNA 또는 RNA 서열)에 결합한다. MNAzyme은 파트자임 A 및 B의 센서 팔이 조립 촉진자 상에서 서로에 인접하여 하이브리드화될 경우에만 형성된다. MNAzyme의 기질 팔은 기질과 맞물리며, 그의 개질(예를 들어, 분해)은 파트자임 A 및 B의 촉매 도메인의 상호작용에 의해 형성되는 MNAzyme의 촉매 코어에 의해 촉매된다. DNA/RNA 키메라 리포터 기질의 분해가 도면에 예시되어 있다. MNAzyme은 형광단과 퀀처 염료 쌍 사이에서 기질을 분해함으로써 신호를 생성시킬 수 있다. 용어 "다중-구성요소 핵산 효소" 및 "MNAzyme"은 2개의 분자로 구성된 이분(bipartite) 구조, 또는 3개의 핵산 분자로 구성된 삼분(tripartite) 구조, 또는 기타 다분(multipartite) 구조, 예를 들어, 4개 이상의 핵산 분자에 의해 형성된 것들을 포함한다.
용어 "MNAzyme" 및 "다중-구성요소 핵산 효소"는, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, PCT 특허 공개 번호 제WO/2007/041774호, 제WO/2008/040095호, 제WO2008/122084호, 및 관련 미국 특허 공개 번호 제2007-0231810호, 제2010-0136536호 및 제2011-0143338호(이들 문서 각각의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨) 중 임의의 하나 이상에 개시된 것들을 포함하는 모든 공지의 MNAzyme 및 개질된 MNAzyme을 포괄한다는 것이 이해될 것이다. 용어 "MNAzyme" 및 "다중-구성요소 핵산 효소"가 포괄하는 MNAzyme 및 개질된 MNAzyme의 비-제한적인 예는 분해 촉매 활성을 가진 MNAzyme(본 명세서에 예시된 바와 같음), 하나 이상의 조립 저해제를 포함하는 해체되거나 부분적으로 조립된 MNAzyme, 하나 이상의 압타머를 포함하는 MNAzyme("apta-MNAzyme"), 하나 이상의 축약형 센서 팔 및 임의로 하나 이상의 안정화 올리고뉴클레오티드를 포함하는 MNAzyme, 하나 이상의 활성 저해제를 포함하는 MNAzyme, 다중-구성요소 핵산 비활성 전구효소(MNAi: multi-component nucleic acid inactive proenzyme), 및 리가제 촉매 활성을 가진 MNAzyme("MNAzyme 리가제")을 포함하며, 이들 각각은 제WO/2007/041774호, 제WO/2008/040095호, 제WO2008/122084호, 제US 2007-0231810호, 제US 2010-0136536호, 및/또는 제US 2011-0143338호 중 하나 이상에 상세하게 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "파트자임", "구성요소 파트자임" 및 "파트자임 구성요소"는 DNA-함유 또는 RNA-함유 또는 DNA-RNA-함유 올리고뉴클레오티드를 지칭하며, 본 명세서에 정의된 바와 같은 MNAzyme 조립 촉진자의 존재하에서만, 이들 중 2개 이상이 함께 "MNAzyme"을 형성할 수 있다. 소정의 바람직한 구체예에서는, 하나 이상의, 바람직하게는 적어도 2개의 구성요소 파트자임이 하기 3개의 영역 또는 도메인을 포함할 수 있다: 개질을 촉매하는 촉매 코어의 부분을 형성하는 "촉매" 도메인; 조립 촉진자에 연계되고/되거나 결합할 수 있는 "센서 팔" 도메인; 및 기질에 연계되고/되거나 결합할 수 있는 "기질 팔" 도메인. 파트자임은 압타머를 포함하나 이로 제한되지 않는 적어도 하나의 부가적인 구성요소를 포함할 수 있으며, 본 명세서에서 "apta-파트자임"으로 지칭된다. 파트자임은 축약형 센서 팔을 가진 파트자임 구성요소, 및 조립 촉진자 또는 기질과의 상호작용에 의해 MNAzyme 구조를 안정화시키는 안정화 팔 구성요소를 포함하나 이로 제한되지 않는 다중 구성요소를 포함할 수 있다.
용어 폴리뉴클레오티드 보조 서열 전환(PASS) 올리고뉴클레오티드는, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 관심의 대상인 핵산 표적에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 5' 구성요소, 핵산 표적 서열에 존재하지 않는 뉴클레오티드의 "고유 서열"(본 명세서에서 "US"로도 지칭됨)을 포함하는 중앙 구성요소, 및 관심의 대상인 핵산 표적에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 3' 구성요소를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. PASS 올리고뉴클레오티드는 프라이머(본 명세서에서 "PASS 프라이머"로 지칭됨)의 형태로 제공될 수 있다. PASS 올리고뉴클레오티드는 부분적 촉매 도메인 및 기질 팔 도메인을 추가로 포함할 수 있는 파트자임(본 명세서에서 "PASS 파트자임"으로 지칭됨)의 센서 팔 구성요소일 수 있다.
용어 "고유 서열 삽입체" 및 "USI" 및 "고유 삽입체 서열" 및 "US 삽입체"는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며 동일한 의미를 가진다. 용어 "고유 서열 삽입체"는, 더 큰 폴리뉴클레오티드가 상보적 염기 대합을 통해 표적 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화될 때 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적이지 않은, 더 큰 폴리뉴클레오티드(예를 들어, PASS 올리고뉴클레오티드) 내부의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "고유 서열 접합부" 및 "USJ" 및 "US 접합부"는 2개의 구성요소 뉴클레오티드 서열을 조합함으로써 형성된 고유 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 각각의 구성요소는 개재 서열에 의해 분리된 표적 폴리뉴클레오티드의 상이한 부분에 상보적이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "고유 서열"은 "고유 서열 삽입체" 또는 "고유 서열 접합부"를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "조립 촉진자 분자", "조립 촉진자", "MNAzyme 조립 촉진자 분자", 및 "MNAzyme 조립 촉진자"는 MNAzyme의 센서 팔과의 상호작용에 의해 촉매적으로 활성인 MNAzyme을 형성하기 위해 구성요소 파트자임의 자가-조립을 촉진할 수 있는 실체를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 조립 촉진자는 분해, 리가제 또는 다른 촉매 활성을 가진 MNAzyme의 조립을 촉진할 수 있다. 바람직한 구체예에서는 MNAzyme의 자가-조립을 위해 조립 촉진자를 필요로 한다. 조립 촉진자는 하나의 분자로 구성되거나, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 "파트자임"의 센서 팔과 대합하거나 결합할 수 있는 2개 이상의 "조립 촉진자 구성요소"로 구성될 수 있다. 조립 촉진자는 MNAzyme의 센서 팔/들과 서열 상보성을 공유하지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드 구성요소/들을 포함할 수 있다. 조립 촉진자는 표적일 수 있다. 표적은 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, RNA, 메틸화 RNA, microRNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pre-microRNA 및 pri-microRNA, 기타 비-코딩 RNA, 리보솜 RNA, 그의 유도체, 앰플리콘, 또는 그의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 핵산일 수 있다. 핵산은 증폭될 수 있다. 증폭은 PCR, RT-PCR, SDA, HDA, RPA, LAMP, RCA, TMA, 3SR, NASBA 또는 리가제 연쇄 반응 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "검출가능한 효과"는 기질/들의 개질이 일어난 표시로서 검출되거나 정량화될 수 있는 효과이다. 효과의 크기는 조립 촉진자(예를 들어, 표적)와 같은 입력의 양을 나타낼 수 있다. 검출가능한 효과는 형광 분광법, 표면 플라스몬 공명, 질량 분석법, NMR, 전자 스핀 공명, 편광 형광 분광법(polarization fluorescence spectroscopy), 원편광 이색성, 면역측정법, 크로마토그래피, 방사선측정법, 광도측정법, 섬광조영술, 전자적 방법, 전기화학적 방법, UV, 가시광 또는 적외선 분광법, 효소적 방법, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드 기질" 및 "기질"은, 촉매 핵산 효소를 포함하는 효소에 의해 인식되거나, 작용을 받거나, 개질될 수 있는, DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, RNA, 메틸화 RNA, microRNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pre-microRNA 및 pri-microRNA, 기타 비-코딩 RNA, 리보솜 RNA, 그의 유도체, 그의 앰플리콘 또는 그의 임의의 조합(데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 염기의 혼합 중합체를 포함함)을 포함하나 이로 제한되지 않는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 임의의 단일-가닥 또는 이중-가닥 중합체, 또는 그의 유사체, 유도체, 변종, 단편 또는 조합을 포함한다. "폴리뉴클레오티드 기질" 또는 "기질"은 분해 또는 결찰을 포함하나 이로 제한되지 않는 다양한 효소 활성에 의해 개질될 수 있다. "폴리뉴클레오티드 기질" 또는 "기질"의 개질은 효소의 촉매 활성을 모니터링하기 위한 "검출가능한 효과"를 제공할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "리포터 기질"은 촉매되는 반응과 관련된 기질의 소멸 또는 산물의 출현의 측정을 용이하게 하도록 특별히 개조된 기질이다. 리포터 기질은 용액 중에 유리되거나, 예를 들어, 표면 또는 다른 분자에 결합(또는 고정)될 수 있다. 리포터 기질은, 예를 들어, 형광단(퀀처와 같은 하나 이상의 부가적인 구성요소를 동반하거나 동반하지 않음), 방사성 표지, 바이오틴 (예를 들어 바이오틴화) 또는 화학발광성 표지를 포함하는 임의의 매우 다양한 수단에 의해 표지될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "공통 기질" 또는 "범용 기질"은, 복수의 MNAzyme(이들 각각은 상이한 조립 촉진자를 인식할 수 있음)에 의해 인식되거나 촉매적으로 작용을 받는 기질, 예를 들어, 리포터 기질이다. 이러한 기질의 사용은, 구조적으로 관련된 MNAzyme(이들 모두는 범용 기질을 인식함)을 사용하는 매우 다양한 조립 촉진자의 검출, 동정 또는 정량화를 위한 별도의 어세이의 개발을 용이하게 한다. 이들 범용 기질은 하나 이상의 표지로 각각 독립적으로 표지될 수 있다. 바람직한 구체예에서는, MNAzyme을 사용하여 다양한 조립 촉진자를 독립적으로, 또는 동시에 검출하기 위한 편리한 시스템의 창출을 가능하게 하기 위하여, 독립적으로 검출가능한 표지를 사용하여 하나 이상의 범용 기질을 표지한다. 일부 구체예에서는, MNAzyme에 의해 분해되는 기질을, MNAzyme 또는 DNAzyme 리가제를 사용하여 재구성, 및 따라서 재순환시킬 수 있을 것이다. 일부 구체예에서는, MNAzyme에 의해 분해되거나 결찰되는 기질(들)을 부가적인 MNAzyme(들) 또는 DNAzyme(들)의 구성요소 또는 조절자로서 추가로 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "탐침"은 표적 핵산의 검출을 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 탐침의 비-제한적인 예는 TaqMan 탐침; 분자 비콘 탐침; 핵산 효소에 의한 촉매적 개질이 가능한 핵산 효소 기질을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "공통 탐침" 및 "범용 탐침"은 복수의 비-동일 핵산 효소에 의해 촉매적으로 개질됨으로써 하나 이상의 표적 핵산의 검출을 용이하게 할 수 있는 탐침을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "공통 탐침" 및 "범용 탐침"은 "범용 기질"로도 지칭될 수 있다. 범용 기질은 일부 구체예에서 상이한 위치에서 고체 지지체에 고정되어 기질 배열을 제공할 수 있다. 이러한 구체예에서, 고정된 범용 기질은 모두 동일한 형광단으로 표지될 수 있다. 소정의 경우에, 각각의 범용 기질은 특이적 MNAzyme 조립 촉진자 분자의 존재 하에 형성되는 MNAzyme에 의해서만 분해될 수 있으며, 표면 상의 기질의 위치 설정에 의해 신호를 국소화함으로써 상이한 조립 촉진자의 특이적 검출을 가능하게 할 수 있다.
용어 "산물"은 기질의 효소적 개질의 결과로서 생성되는 새로운 분자 또는 분자들을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "분해 산물"은 효소에 의한 분해 또는 엔도뉴클레아제 활성의 결과로서 생성되는 새로운 분자를 지칭한다. 용어 "결찰 산물"은 효소에 의한 기질의 결찰의 결과로서 생성되는 새로운 분자를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드의 문맥에서 용어 "융해 온도" 및 "Tm"의 사용은, 달리 구체적으로 표시되지 않는 한, Tm = 2 ℃(A+T) + 4 ℃(G+C)인 월레스 법칙(문헌[Wallace et al., (1979) Nucleic Acids Res. 6, 3543] 참조)을 사용하여 계산된 융해 온도(Tm)의 언급인 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "염기"는 용어 "뉴클레오티드"와 동일한 의미를 가지는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "키트"는 물질을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 지칭한다. 이러한 전달 시스템은, 하나의 장소로부터 다른 장소로의 반응 시약의 저장, 수송, 또는 전달을 가능하게 하는 시스템(예를 들어, 적절한 용기 내의 표지, 참조 샘플, 보조 재료(supporting material) 등) 및/또는 보조 재료(예를 들어, 완충액, 어세이를 수행하기 위한 지침서 등)를 포함한다. 예를 들어, 키트는 관련 반응 시약 및/또는 보조 재료가 들어 있는, 박스와 같은 하나 이상의 봉입 용기를 포함할 수 있다. 용어 "키트"는 분할된 키트 및 조합된 키트 양자 모두를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "분할된 키트"는, 각각의 용기에 전체 키트 구성요소의 일부가 들어 있는 2개 이상의 별도의 용기를 포함하는 전달 시스템을 지칭한다. 용기들은 의도된 수령자에게 함께 전달되거나 별도로 전달될 수 있다. 각각의 용기에 전체 키트 구성요소의 일부가 들어 있는 2개 이상의 별도의 용기를 포함하는 임의의 전달 시스템은 용어 "분할된 키트"의 의미 내에 포함된다.
본 명세서에 사용되는 "조합된 키트"는, 반응 어세이의 모든 구성요소가 단일 용기 내에(예를 들어, 각각의 목적하는 구성요소를 수용하는 단일 박스 내에) 들어 있는 전달 시스템을 지칭한다.
인용된 수치 값의 언급에 있어서, 본 명세서에서 용어 "약"의 사용은, 인용된 수치 값 및 인용된 값의 + 또는 - 10% 이내의 수치 값을 포함한다는 것이 이해될 것이다.
수치 값의 범위를 지칭할 때, 본 명세서에서 용어 "내지"의 사용은 범위의 각 종점에서의 수치 값을 포괄한다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 길이가 10 잔기 내지 20 잔기인 폴리펩티드는 길이가 10 잔기인 폴리펩티드 및 길이가 20 잔기인 폴리펩티드를 포함한다.
선행 기술 문헌의 본 명세서의 임의의 기재, 또는 그들 문헌을 기반으로 하거나 그로부터 유도된 본 명세서의 언급이, 그 문헌 또는 유도된 언급이 관련 기술 분야의 통상의 일반 지식의 일부임을 인정하는 것은 아니다.
기재 목적상, 본 명세서에 지칭된 모든 문헌은, 달리 언급되지 않는 한, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
약어
본 명세서에서, 그리고 명세서 전체에 걸쳐 하기의 약어를 사용한다:
MNAzyme: 다중-구성요소 핵산 효소, 또는 다분 핵산 효소
파트자임: 올리고뉴클레오티드를 함유하는 부분적 효소
S1; US의 5'에 위치하는, 서열 1
S2; US의 3'에 위치하는, 서열 2
cS1; US의 3'에 위치하는, 서열 1의 상보체
cS2; US의 5'에 위치하는, 서열 2의 상보체
PASS; 폴리뉴클레오티드 보조 서열 전환
US; 고유 서열
cUS; 고유 서열의 상보체
USI; 고유 서열 삽입체
USJ; 고유 서열 접합부
cUSI; 고유 서열 삽입체의 상보체
cUSJ; 고유 서열 접합부의 상보체
ave; 평균
PCR: 중합효소 연쇄반응
gDNA: 게놈 DNA
rc: 역상보체
NTC: 템플레이트가 없는 대조군
qPCR: 실시간 정량적 PCR
Ct; 역치 주기
R 2 ; 상관 계수
nM; 나노몰 농도
mM; 밀리몰 농도
㎕; 마이크로리터
dNTP; 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트
ARMS: 증폭 불응성 돌연변이 시스템
WE-ARMS: 유동-증진 ARMS
NF-H 2 O: 뉴클레아제가 없는 물
LNA : 잠금 핵산
F: 형광단
Q: 퀀처
N= A, C, T, G, 또는 그의 임의의 유사체
N'= N에 상보적이거나 N과 염기 대합할 수 있는 임의의 뉴클레오티드
(N) x : 임의의 수의 N
(N') x : 임의의 수의 N'
W: A 또는 T
R: A, G 또는 AA
rN: 임의의 리보뉴클레오티드 염기
(rN) x : 임의의 수의 rN
rR: A 또는 G
rY: C 또는 U
M: A 또는 C
H: A, C 또는 T
D: G, A 또는 T
JOE 또는 6-JOE: 6-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신
FAM 또는 6-FAM: 6-카복시플루오레신
BHQ1: 블랙 홀(Black Hole) 퀀처 1
BHQ2: 블랙 홀 퀀처 2
RT-PCR: 역전사 중합효소 연쇄반응
SDA: 가닥 치환 증폭
HDA: 헬리카제 의존형 증폭
RPA: 재조합효소 중합효소 증폭
LAMP: 고리-매개 등온 증폭
RCA: 회전환 증폭
TMA: 전사-매개 증폭
3SR: 자기-지속적 서열 복제
NASBA: 핵산 서열 기반 증폭
IB: 아이오와 블랙(Iowa Black)® FQ
IBR: 아이오와 블랙® RQ
shRNA: 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)
siRNA: 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA)
mRNA: 전령 RNA
tRNA: 운반 RNA
snoRNA: 작은 인 RNA(small nucleolar RNA)
stRNA: 작은 템포랄 RNA(small temporal RNA)
smRNA: 작은 조절 RNA
pre-microRNA: 전구 microRNA(precursor microRNA)
pri-microRNA: 1차 microRNA(primary microRNA)
상세한 설명
하기의 상세한 설명은, 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 본 발명의 예시적인 구체예를 충분히 상세하게 전달한다. 기재된 다양한 구체예의 특징 또는 제한은 본 발명의 다른 구체예 또는 전체로서의 본 발명을 반드시 제한하는 것은 아니다. 그러므로, 하기의 상세한 설명은, 특허청구범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드 보조 서열 전환(PASS) 올리고뉴클레오티드를 제공한다. PASS 올리고뉴클레오티드는 고유 특이적 서열의 앰플리콘 내로의 도입을 용이하게 하기 위해 PASS 프라이머로서 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 의해 앰플리콘 내로 도입된 고유 서열을 사용하여, 주어진 핵산 표적 내의 작은 유전자 변이(예를 들어, SNP)의 검출을 증진하거나, 대안적으로 앰플리콘 내의 가변 서열의 영역을 대체하여 관련 서열의 증폭 및/또는 검출의 효능을 개선할 수 있다. PASS 올리고뉴클레오티드는 PASS 파트자임의 센서 팔 구성요소일 수 있으며, 여기서 PASS 파트자임 센서 팔은 하나의 핵산 표적 또는 핵산 표적의 그룹에 비-상보적인 '고유 서열' 뿐 아니라 핵산 표적의 그룹에 상보적인 서열 양자 모두를 함유한다. 따라서, 일부 구체예에서 PASS 파트자임 센서 팔은, PASS 파트자임 센서 팔과 하이브리드화될 수 없는 구성요소에 의해서만 서로 상이한 다중의 상이한 핵산 표적과 하이브리드화될 수 있다. 이어서, PASS 파트자임은 핵산 표적의 상이한 구성요소에 상보적인 센서 팔을 포함하는 다른 제2 파트자임과 상호작용하여 유사한 효율로 다중의 상이한 핵산 서열을 검출할 수 있는 MNAzyme을 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 소정의 구체예는 핵산의 검출에 유용한 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 키트 또한 제공된다.
본 발명의 다른 구체예는 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 방법을 사용하여 주어진 표적 핵산 내의 유전자 다형성을 검출하거나, 대안적으로 표적 서열의 바람직하지 않은 영역(들)을 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터의 고유 서열로 대체함으로써 그들 영역(들)이 앰플리콘 내로 혼입되는 것을 방지할 수 있다. 본 방법은 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, PASS 프라이머)를 사용하여 표적 서열을 증폭시키는 단계, 및 생성된 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 앰플리콘은 증폭되는 표적 서열에 대해 이질적인 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 유도된 고유 서열 삽입체 또는 접합부를 포함할 수 있다. 대안적으로 본 방법은 올리고뉴클레오티드 프라이머로 표적 서열을 증폭시키는 단계 및/또는 PASS 파트자임(들)을 포함하는 MNAzyme을 사용하여 표적 서열을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
PASS 올리고뉴클레오티드
본 발명의 PASS 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드 내에 존재하는 서열에 비-상보적인 고유 서열(US)을 포함한다. US는 고유 서열 삽입체(USI) 또는 고유 서열 접합부(USJ)의 형태로 제공될 수 있다. PASS 올리고뉴클레오티드는 중합효소-기반의 효소 반응을 위한 프라이머(PASS 프라이머)로 사용하고/하거나 파트자임(PASS 파트자임)의 센서 팔 구성요소 및/또는 기질 팔 구성요소로서 포함될 수 있다.
일부 구체예에서 PASS 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 구성요소를 포함할 수 있다. 하나의 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적이거나 실질적으로 상보적일 수 있는 반면에, 다른 구성요소는 그 표적 올리고뉴클레오티드에 비-상보적이거나 실질적으로 비-상보적일 수 있다.
일부 구체예에서 PASS 올리고뉴클레오티드는 3개의 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 제1 및 제2 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적이거나 실질적으로 상보적일 수 있는 반면에, 제3 구성요소는 동일한 표적 폴리뉴클레오티드에 비-상보적이거나 실질적으로 비-상보적일 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 제1 및 제2 구성요소는 표적 올리고뉴클레오티드의 상이한 부분에 상보적이거나 실질적으로 상보적일 수 있다. 표적에 비-상보적인 올리고뉴클레오티드의 제3 구성요소는 올리고뉴클레오티드의 제1 및 제2 구성요소 사이에 위치할 수 있다.
일부 구체예에서, 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수는, 제1 및 제2 구성요소에 하이브리드화되는 표적 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수와 동일할 수 있다. 이러한 특징을 가진 PASS 올리고뉴클레오티드를 본 명세서에서는 평면 PASS 올리고뉴클레오티드로도 지칭한다.
다른 구체예에서, 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수는 제1 및 제2 구성요소에 하이브리드화되는 표적 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수를 초과한다. 이러한 경우, PASS 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드는 루프 구조를 형성할 수 있다. 이러한 특징을 가진 PASS 올리고뉴클레오티드를 본 명세서에서는 루프 PASS 올리고뉴클레오티드로도 지칭한다.
또 다른 구체예에서, 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수는 제1 및 제2 구성요소에 하이브리드화되는 표적 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수 미만이다. 이러한 특징을 가진 PASS 올리고뉴클레오티드를 본 명세서에서는 표적 루프 PASS 올리고뉴클레오티드로도 지칭한다.
예를 들어, 제3 구성요소는 제1 및 제2 구성요소에 하이브리드화되는 표적 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수보다 1 내지 300 뉴클레오티드, 1 내지 250 뉴클레오티드, 1 내지 200 뉴클레오티드, 1 내지 150 뉴클레오티드, 1 내지 100 뉴클레오티드, 1 내지 75 뉴클레오티드, 1 내지 50 뉴클레오티드, 1 내지 25 뉴클레오티드, 5 내지 300 뉴클레오티드, 5 내지 250 뉴클레오티드, 5 내지 200 뉴클레오티드, 5 내지 150 뉴클레오티드, 5 내지 100 뉴클레오티드, 5 내지 75 뉴클레오티드, 5 내지 50 뉴클레오티드, 5 내지 25 뉴클레오티드, 10 내지 300 뉴클레오티드, 10 내지 250 뉴클레오티드, 10 내지 200 뉴클레오티드, 10 내지 150 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 75 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드, 또는 10 내지 25 뉴클레오티드 만큼 더 적은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 제1 및 제2 구성요소 사이에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드는 루프 구조를 형성할 수 있다. 루프 구조는 1 내지 300 뉴클레오티드, 1 내지 250 뉴클레오티드, 1 내지 200 뉴클레오티드, 1 내지 150 뉴클레오티드, 1 내지 100 뉴클레오티드, 1 내지 75 뉴클레오티드, 1 내지 50 뉴클레오티드, 1 내지 25 뉴클레오티드, 5 내지 300 뉴클레오티드, 5 내지 250 뉴클레오티드, 5 내지 200 뉴클레오티드, 5 내지 150 뉴클레오티드, 5 내지 100 뉴클레오티드, 5 내지 75 뉴클레오티드, 5 내지 50 뉴클레오티드 5 내지 25 뉴클레오티드, 10 내지 300 뉴클레오티드, 10 내지 250 뉴클레오티드, 10 내지 200 뉴클레오티드, 10 내지 150 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 75 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드, 또는 10 내지 25 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 루프 구조는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 100 또는 200 뉴클레오티드를 포함할 수 있다(도 12).
일부 구체예에서, 제1 구성요소는 PASS 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에서 종결될 수 있고, 제2 구성요소는 PASS 올리고뉴클레오티드의 3' 단부에서 종결될 수 있다. 5' 구성요소는 3' 구성요소보다 더 짧을 수 있다. 다른 구체예에서는, 5' 구성요소가 3' 구성요소보다 더 길 수 있다. 다른 구체예에서는, 중앙 구성요소가 5' 구성요소 및/또는 3' 구성요소보다 더 짧을 수 있다. 또 다른 구체예에서는, 중앙 구성요소가 5' 구성요소 및/또는 3' 구성요소보다 더 길 수 있다.
PASS 올리고뉴클레오티드는 5' 구성요소의 5' 및/또는 3' 구성요소의 3'에 위치할 수 있는 부가적인 비-상보적 서열을 추가로 포함할 수 있다.
단지 비-제한적인 예로서, PASS 올리고뉴클레오티드의 5' 구성요소, 3' 구성요소 및/또는 중앙 구성요소의 길이는 75 뉴클레오티드 미만, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 17, 55, 13, 10, 9, 8, 7, 6 뉴클레오티드 미만, 또는 5 뉴클레오티드 미만일 수 있다. 예를 들어, 중앙 구성요소의 길이는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 뉴클레오티드/들일 수 있다. 대안적인 구체예에서, PASS 올리고뉴클레오티드는 제1 및 제2 구성요소를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 표적 폴리뉴클레오티드의 구별된 부분에 상보적이거나 실질적으로 상보적이다. 표적 폴리뉴클레오티드의 구별된 부분은 개재 뉴클레오티드/들에 의해 분리된다. 따라서, 상보적 염기 대합에 의해 PASS 올리고뉴클레오티드가 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화될 때, 표적 폴리뉴클레오티드의 불연속 뉴클레오티드가 병치되어 USJ를 형성한다. 표적 폴리뉴클레오티드 내의 공간적으로 분리된 뉴클레오티드 서열 구성요소를 함께 모으는 것은 표적 폴리뉴클레오티드 내에 루프 구조를 형성시킬 수 있다. 이러한 특징을 가진 PASS 올리고뉴클레오티드를 본 명세서에서는 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드로도 지칭한다. 표적 폴리뉴클레오티드 내의 루프 구조는 1 내지 100 뉴클레오티드, 1 내지 75 뉴클레오티드, 1 내지 50 뉴클레오티드, 1 내지 25 뉴클레오티드, 5 내지 100 뉴클레오티드, 5 내지 75 뉴클레오티드, 5 내지 50 뉴클레오티드, 5 내지 25 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 75 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드, 또는 10 내지 25 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 루프 구조는 10, 20, 30, 40, 50 또는 60 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 PASS 올리고뉴클레오티드는 파트자임의 구성요소일 수 있다(PASS 파트자임). 예를 들어, PASS 파트자임의 센서 및/또는 기질 팔/들은 PASS 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 따라서, PASS 파트자임은 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되고, 표적 폴리뉴클레오티드의 인접한 부분에 하이브리드화될 수 있는 제2 파트자임과 조합되어, 기질을 개질하여 검출가능한 이벤트를 제공할 수 있는 MNAzyme으로 조립될 수 있다.
본 발명의 PASS 파트자임은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 평면 PASS 올리고뉴클레오티드, 루프 PASS 올리고뉴클레오티드, 표적 루프 PASS 올리고뉴클레오티드, 또는 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 센서 팔 및/또는 기질 팔을 포함할 수 있다.
표적 루프 PASS 올리고뉴클레오티드 또는 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 센서 팔 및/또는 기질 팔을 포함하는 PASS 파트자임은 센서 팔 및/또는 기질 팔에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드 내에 루프 구조의 형성을 유발할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드 내의 루프 구조는 1 내지 60 뉴클레오티드, 1 내지 50 뉴클레오티드, 1 내지 40 뉴클레오티드, 1 내지 30 뉴클레오티드, 1 내지 20 뉴클레오티드, 1 내지 10 뉴클레오티드, 5 내지 60 뉴클레오티드, 5 내지 50 뉴클레오티드, 5 내지 40 뉴클레오티드, 5 내지 30 뉴클레오티드, 5 내지 20 뉴클레오티드, 5 내지 10 뉴클레오티드, 10 내지 60 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드, 10 내지 40 뉴클레오티드, 10 내지 30 뉴클레오티드, 또는 10 내지 20 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드 내의 루프 구조는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60 뉴클레오티드를 포함할 수 있다(도 13).
본 명세서에서 다른 뉴클레오티드 서열에 "실질적으로 상보적인" 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 뉴클레오티드 이상의 영역에 걸쳐 제1 서열이 제2 서열의 상보체와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일함을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 다른 뉴클레오티드 서열에 "상보적인" 뉴클레오티드 서열은, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 뉴클레오티드 이상의 영역에 걸쳐 제1 서열이 제2 서열의 상보체와 100% 동일함을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 다른 뉴클레오티드 서열에 "실질적으로 비-상보적인" 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 뉴클레오티드 이상의 영역에 걸쳐 제1 서열이 제2 서열의 상보체와 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 미만으로 동일함을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 다른 뉴클레오티드 서열에 "비-상보적인" 뉴클레오티드 서열은, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 뉴클레오티드 이상의 영역에 걸쳐 제1 서열이 제2 서열의 상보체와 0% 동일함을 의미할 수 있다.
본 명세서에 제공된 PASS 올리고뉴클레오티드는 목적하는 응용에 따라 임의의 적합한 길이를 가질 수 있다. 단지 비-제한적인 예로서, 올리고뉴클레오티드의 길이는 100 뉴클레오티드 미만, 75 뉴클레오티드 미만, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 17, 55, 13, 10, 9, 8, 7, 6 뉴클레오티드 미만, 또는 5 뉴클레오티드 미만일 수 있다.
PASS 올리고뉴클레오티드가 결합할 수 있는 표적 핵산(즉, 폴리뉴클레오티드)의 비-제한적인 예는 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, 상보적 DNA(cDNA), RNA, 메틸화 RNA, microRNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pre-microRNA 및 pri-microRNA, 다른 비-코딩 RNA, 리보솜 RNA, 그의 유도체, 그의 앰플리콘, 또는 그의 임의의 조합(데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 염기의 혼합 중합체를 포함함)을 포함한다.
따라서, 본 명세서에 제공된 PASS 올리고뉴클레오티드는 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, 상보적 DNA(cDNA), RNA, 메틸화 RNA, microRNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pre-microRNA 및 pri-microRNA, 다른 비-코딩 RNA, 리보솜 RNA, 그의 유도체, 그의 앰플리콘, 또는 그의 임의의 조합(데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 염기의 혼합 중합체를 포함함)을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
소정의 구체예에서, 본 발명의 PASS 올리고뉴클레오티드는 핵산의 표적 서열의 증폭에 프라이머로 사용될 수 있다.
도 1에 나타낸 구체예를 참조하면, PASS 프라이머는 3개의 영역을 포함할 수 있다. 프라이머의 5' 구성요소(S1)는 관심의 대상인 핵산 표적에 실질적으로 상보적인 서열을 함유하고, 프라이머의 중간 구성요소는 비-표적 특이적 고유 서열(US)이며, 프라이머의 3' 구성요소(S2)는 관심의 대상인 핵산 표적에 실질적으로 상보적인 서열을 함유한다. S2가 S1보다 표적 서열의 더 5' 쪽으로 결합하도록 S1 및 S2를 디자인할 수 있다. 패널 (i)에 나타낸 바와 같이, PASS 프라이머가 표적에 결합할 때 US가 루프를 형성하도록, S1 및 S2가 결합하는 표적의 영역들 사이의 갭 내의 뉴클레오티드의 수는 US 내의 염기의 수 미만일 수 있다(도 1, 패널 (i)). 대안적으로, 도 1 패널 (ii)에 나타낸 바와 같이, S1 및 S2에 의해 결합되는 표적 서열 사이에 갭이 존재할 수 있다. US는 S1과 S2 사이의 갭과 동일한 수의 뉴클레오티드(도 1, 패널 (ii)), 그보다 더 적은 뉴클레오티드, 또는 더 많은 뉴클레오티드(도 1, 패널 (i))를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, S1의 융해 온도("Tm")는 S2의 Tm보다 더 높다.
따라서, 소정의 구체예에서 PASS 올리고뉴클레오티드는 3개의 영역, 즉, (i) 표적 핵산의 제1 구성요소에 상보적이거나 실질적으로 상보적이고 표적에 어닐링될 수 있는 3' 영역(S2)보다 더 높은 Tm을 가진 5' 영역(S1); (ii) 표적에 상보적이거나 실질적으로 상보적이며 S1보다 더 낮은 Tm을 가질 수 있는 3' 영역(S2); 및 (iii) 표적에 비-상보적이거나 실질적으로 비-상보적인 고유 서열(US)을 포함하는 S1과 S2 사이에 위치하는 개재 영역(US).
일반적으로, PASS 프라이머를 사용하여 관심의 대상인 서열을 증폭하는 경우, 생성되는 앰플리콘 내로 US가 혼입된다(도 1, 패널 (i), (ii) 및 (iii)). US 또는 US의 상보체에 결합하도록 디자인된 분자 비콘 또는 MNAzyme 파트자임을 사용하는 앰플리콘의 검출을 지원하기 위한 것과 같은 다양한 목적을 위해 US를 디자인할 수 있다(도 1, 패널 (iii)). MNAzyme 파트자임 또는 분자 비콘은 PASS 프라이머의 3' 단부로부터 증폭되는 표적 서열에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다.
PASS 프라이머의 특이적이고 비-제한적인 예는 서열 번호 10, 11, 13, 14, 16 또는 17 중 임의의 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 것들을 포함한다.
PASS 올리고뉴클레오티드의 예시적인 응용
- PASS 프라이머를 이용하는 표적 증폭
본 발명의 PASS 올리고뉴클레오티드를 프라이머(PASS 프라이머)로 사용하여 표적 핵산 서열을 증폭하고 생성되는 앰플리콘 내로 고유 서열(US)을 혼입시킬 수 있다. PASS 프라이머를 응용할 수 있는 증폭 기술과 관련하여 특정 제한은 존재하지 않는다. PASS 올리고뉴클레오티드를 이용하는 다양한 반응에 의해 생성된 앰플리콘은 임의의 공지 기술을 사용하여 검출할 수 있다. 비-제한적인 예는 이중-가닥 DNA에 결합하는 염료(예를 들어, SYBR 그린)에 의해 제공되는 신호를 사용하는 검출 기술, 및/또는 앰플리콘 서열 특이적-탐침(예를 들어, 분자 비콘, 마이너 그루브 결합제(MGB) 탐침, TaqMan® 탐침)을 사용하는 것들을 포함한다.
일반적으로, 핵산 증폭 기술은 효소(예를 들어, 중합효소)를 이용하여 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 특이적으로 결합되는 표적 핵산의 복제물을 생성시킨다. PASS 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있는 증폭 기술의 비-제한적인 예는 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 헬리카제 의존형 증폭(HDA), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA), 고리-매개 등온 증폭(LAMP), 회전환 증폭(RCA), 전사-매개 증폭(TMA), 자기-지속적 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 중 하나 이상을 포함한다.
본 명세서에 기재된 PASS 올리고뉴클레오티드로부터의 US를 앰플리콘 내로 도입하는 것은 단일 염기 다형성 또는 획득 점 돌연변이와 같은 단일 염기 상이점의 더 양호한 식별을 지원할 수 있다. 예를 들어, SNP 또는 돌연변이(예를 들어, 점 돌연변이)와 같은 변종 서열 사이의 식별을 증진하도록 PASS 프라이머를 디자인할 수 있다.
도 2를 참조하면, SNP 또는 점 돌연변이와 같은 단일 염기 변화의 식별을 증진하도록 PASS 프라이머를 디자인할 수 있다. 예를 들어, 루프 PASS 프라이머(도 2 패널 (i)) 또는 평면 PASS 프라이머(도 2 패널 (ii))의 3' 구성요소(S2)를 사용하여 SNP 또는 점 돌연변이를 표적화하고 특이적으로 결합할 수 있다. PASS 프라이머의 S2 내의 SNP 또는 점 돌연변이에 일치하는 염기는 프라이머의 3' 말단에 위치하거나(도 2 패널 (i) 및 (ii)의 상단), 예를 들어, 프라이머의 3' 말단의 5'으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 5 초과의 염기와 같은, S2 내부의 다른 위치에 위치할 수 있다. 추가로, SNP의 더 양호한 식별을 지원하기 위하여, S2와 관심의 대상인 표적 서열 사이에 부가적인 염기가 불일치할 수 있다(도 2 패널 (i) 및 (ii)의 하단). 예를 들어, S2와 표적 서열 사이에 1, 2 또는 3 염기가 불일치할 수 있다. 불일치하는 염기 또는 염기들은, 예를 들어, 프라이머의 3' 말단의 5'으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 5 초과의 염기에 위치할 수 있다.
복수의 표적 폴리뉴클레오티드가 관련된 복합 반응 중에 변종 서열(예를 들어, SNP 또는 돌연변이) 사이의 식별을 증진하도록 PASS 프라이머를 디자인할 수 있다. 이들 구체예에서는, 상이한 표적 폴리뉴클레오티드의 검출을 위해 상이한 표적 폴리뉴클레오티드 결합 특이성을 포함하는 2개 이상의 PASS 프라이머를 사용할 수 있다. 상이한 폴리뉴클레오티드 표적으로부터 유도된 앰플리콘을 구별하기 위해, 하나의 폴리뉴클레오티드에 대한 특이성을 가진 제1 PASS 프라이머의 중앙 구성요소(US)는 다른 상이한 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 특이성을 가진 제2 PASS 프라이머의 중앙 구성요소(US)와 상이할 수 있다.
단일 염기에 의해서만 변동되는 2개의 서열 사이의 식별 및 그의 검출이 도 3에 설명되어 있다. 변종 1은 좌측 패널에 원으로 표기되고, 변종 2는 우측 패널에 삼각형으로 표기되어 있다. PASS 프라이머 1의 S2는 변종 1에 특이적으로 일치하고, PASS 프라이머 1의 US는 루프 포맷(루프 1) 내의 제1 US(US1)이다. PASS 프라이머 2의 S2는 변종 2에 특이적으로 일치하고, PASS 프라이머 2의 US는 루프 포맷(루프 2) 내의 제2 US(US2)이다. PCR에서의 이들 PASS 프라이머의 사용은 서열에 있어서 (a) 변종 염기 및 (b) PASS 프라이머를 통해 혼입되는 US 양자 모두가 상이한 각각의 변종에 대한 앰플리콘을 생성시킨다. 상이한 앰플리콘은 임의의 적합한 수단을 사용하여 검출할 수 있다. 도 3에 나타낸 구체예에서는, 복합 MNAzyme qPCR 반응을 사용하여 검출을 달성할 수 있을 것이다.
검출하고자 하는 보존된 표적 서열 사이에 존재하는 유익한 정보를 주지 않는 유전자 변이의 영역을 "스킵"하거나 제거하는 목적을 위해, PASS 프라이머로부터의 고유 서열(US)을 앰플리콘 내로 혼입시킬 수 있다. 이는, 예를 들어, 보존된 영역이 서열의 가변 영역에 의해 분리된 단일 바이러스 또는 박테리아의 다중 균주의 검출을 용이하게 할 수 있다. 이러한 구체예에서는, 상이한 폴리뉴클레오티드 표적으로부터 유도된 앰플리콘들을 구별하는 것이 필요하지 않을 수 있으며, 이 경우에 상이한 PASS 프라이머의 중앙 구성요소(US)는 동일할 수 있다. 대안적으로, 앰플리콘의 공급원들을 구별하기 위하여, 상이한 PASS 프라이머로부터의 중앙 구성요소(US)의 서열은 상이할 수 있다.
단지 비-한정적인 예로서, 특정 요법에 대한 반응을 예측하는 SNP(SNP-1)는 치료적 반응에 대한 유익한 정보를 제공하지 않는 SNP(SNP-2)의 바로 다운스트림에 있을 수 있다. SNP-1에 대한 ARMS 프라이머의 디자인은 SNP-2에 대한 다중 대립유전자의 존재에 의해 복잡해질 것이다. SNP-1에 대한 유익한 정보를 주는 대립유전자에 특이적인 S2를 사용하여 PASS 프라이머를 디자인할 수 있을 것이다. S1 및 S2가 그들 사이에 하이브리드화되지 않은 표적 서열을 남기도록 표적에 대해 PASS 프라이머가 디자인될 것이다. 이러한 하이브리드화되지 않은 표적 서열은 SNP-2를 함유할 것이다. PASS 프라이머로 증폭시키는 중에, PASS 프라이머 내의 고유 서열(US)이 SNP-2의 서열을 대체하여, 이 관련 없는 변이를 반응으로부터 제거할 것이다. SNP-1의 상이한 대립유전자 사이의 식별은 2개의 PASS 프라이머를 사용하여 달성할 수 있을 것이다. SNP의 대립유전자 1은 대립유전자 1에 특이적으로 일치하는 S2, 및 US1을 함유하는 PASS 프라이머 1에 의해 증폭될 것이다. PASS 프라이머 2는 SNP의 대립유전자 2를 증폭시킬 것이다. PASS 프라이머 2는 대립유전자 2에 특이적으로 일치하는 S2 및 US2(US1과는 상이한 서열)를 함유할 것이다. PCR에서의 이들 PASS 프라이머의 사용은, 서열에 있어서 (a) 변종 염기 및 (b) PASS 프라이머를 통해 혼입되는 US 양자 모두가 상이한 각각의 변종에 대한 앰플리콘을 생성시킬 것이다(그러나 SNP-2의 변종은 없음). 도 3에 기재된 바와 같은 MNAzyme(MNAzyme 1 및 MNAzyme 2 참조)을 사용하여 PASS 프라이머 1 및 PASS 프라이머 2로부터의 앰플리콘을 검출할 수 있을 것이다.
도 5 및 6에 나타낸 구체예를 구체적으로 참조하면, S1 및 S2가 2개의 보존된 비-인접 표적 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적이도록 PASS 프라이머를 디자인할 수 있다(도 5, PASS 프라이머). S1 및 S2에 하이브리드화되는 영역들 사이의 표적 서열 내의 갭(표적-갭)은, 검출하고자 하는 3개의 변종 사이의 서열의 상이점을 함유할 수 있다. 변종은 바이러스 또는 박테리아 균주일 수 있다. PASS 프라이머의 US가 S1과 S2 사이의 표적-갭 내의 뉴클레오티드와 동일한 수를 함유하도록 디자인되거나(도 5), PASS 프라이머의 US가 S1과 S2 사이의 표적-갭 내의 것들보다 더 적은 뉴클레오티드를 함유하도록 디자인될 수 있다(도 6).
도 5의 변종 1, 2 및 3으로부터의 DNA를 도 5 의 PASS 프라이머로 증폭하는 것은 표적-갭 내의 변이에 무관하게 정확히 동일한 서열을 가진 앰플리콘을 생성시킬 수 있다. PASS 프라이머로부터의 US는 S1과 S2 사이의 표적-갭 내의 유전자 변이를 대체할 수 있다. 따라서, 생성된 모든 앰플리콘을 검출하는 방법은, 상이한 표적 폴리뉴클레오티드로부터 증폭되는 앰플리콘에 무관하게, 단일 US의 검출에 의존할 수 있다. 예를 들어, 도 5에 나타낸 바와 같이, US의 상보체(cUS, 도 5)에 하이브리드화되고 단일 탐침을 분해하는 파트자임 센서 팔을 가진 MNAzyme을 디자인하여, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아의 변종 1, 2 및 3을 검출할 수 있다.
도 6을 구체적으로 참조하면, 나타낸 표적 루프 PASS 프라이머를 사용하여 변종 1로부터의 DNA를 증폭하는 것은 표적-갭 내의 변종 서열을 PASS 프라이머의 US 내의 더 적은 수의 뉴클레오티드로 대체할 것이다. 이 동일한 표적-갭 영역 내에 변이를 가진 바이러스 또는 박테리아의 다른 균주들도 이러한 PASS 프라이머를 사용하여 효과적으로 증폭될 것이다. 생성되는 앰플리콘은, 표적-갭의 서열에 무관하게 모두 동일한 서열을 가질 것이다. US의 상보체(cUS, 도 6)에 하이브리드화되고 단일 탐침을 분해하는 파트자임 센서 팔을 가진 단일 MNAzyme을 디자인하여, PASS 프라이머로부터 생성되는 임의의 앰플리콘을 검출할 수 있을 것이다.
상기의 PASS 올리고뉴클레오티드/프라이머의 응용은 단지 비-제한적인 예시의 목적으로 제공된 것임을, 당업자는 용이하게 이해할 것이다. 개시된 PASS 올리고뉴클레오티드/프라이머는 임의의 프라이머-기반의 핵산 증폭 기술에 사용할 수 있으며, 본 발명은 구체적으로 기재된 이들 구체예로 그렇게 제한되지 않는다.
- PASS 프라이머를 사용하여 생성시킨 앰플리콘의 검출
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 PASS 프라이머는 임의의 폴리뉴클레오티드 증폭 기술에 이용될 수 있으며, 그의 비-제한적인 예는 PCR, RT-PCR, SDA, HDA, RPA, LAMP, RCA, TMA, 3SR 또는 NASBA를 포함한다.
PASS 프라이머를 이용하는 기술에 의해 생성된 앰플리콘은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 검출할 수 있다.
비-제한적인 예는 표지된 탐침의 사용, 프라이머 내로의 검출가능한 표지의 혼입, 촉매 핵산의 사용 등을 포함한다.
예를 들어, 제1 PASS 프라이머의 고유 서열(US1)의 Tm과 제2 PASS 프라이머로부터의 고유 서열(US2)의 Tm 사이의 차이가 앰플리콘의 융해 온도에 더 큰 차이를 제공하는 (융해 곡선 분석을 동반하는 SYBR 그린)에 의해 앰플리콘을 검출할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 분자 비콘을 사용할 수 있으며, 여기서 분자 비콘은 US1 또는 US2를 포괄하도록 디자인된다. 부가적으로 또는 대안적으로, MNAzyme을 사용하여 앰플리콘을 검출할 수 있다.
소정의 구체예에서는, 앰플리콘 내로 혼입되는 PASS 프라이머의 중앙 구성요소(US), 또는 US의 구성요소를 검출하도록, 이용되는 검출 방법을 디자인할 수 있다. 이는 구별된 폴리뉴클레오티드로부터 유도된 앰플리콘의 검출을 목표로 하는 복합 어세이에 특히 유리할 수 있다. 예를 들어, SNP 및 다른 돌연변이와 같은 구별된 표적 폴리뉴클레오티드 내의 작은 유전자 변이 사이의 더 용이한 식별을 가능하게 할 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 앰플리콘 내로 혼입된 PASS 프라이머의 5' (S1) 및/또는 3' (S2) 구성요소를 검출하도록, 이용되는 검출 방법을 디자인할 수 있다.
서열-특이적 기술(예를 들어, 앰플리콘 내로 혼입된 PASS 올리고뉴클레오티드의 중앙 구성요소의 특이적 서열을 기반으로 하는 기술)을 사용하여 앰플리콘을 검출하는 것이 다수의 응용에서 바람직할 수 있지만, 다른 기술들도 고려된다. 예를 들어, 상이한 표적 폴리뉴클레오티드로부터 유도된 앰플리콘을 구별하는 목적으로 증폭이 실행되지 않는 구체예에서는, 그의 크기에 의해 생성된 앰플리콘을 검출하는 것으로 아주 충분할 수 있다. 이는, 예를 들어, 검출하고자 하는 보존된 표적 서열 사이에 존재하는 유익한 정보를 주지 않는 유전자 변이의 영역을 제거하는 단계를 증폭이 포함하는 경우일 수 있다.
MNAzyme을 이용하고 PCR, RT-PCR, SDA, HDA, RPA, TMA, LAMP, RCA, 3SR 및 NASBA와 같은 기술을 사용하여, PASS 프라이머를 사용하여 생성시킨 앰플리콘을 검출할 수 있다. MNAzyme은 하나 이상의 PASS 파트자임(들)을 포함할 수 있다. MNAzyme은 조립된 다중-구성요소 핵산 효소이며, 예를 들어, PASS 프라이머를 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열로부터 생성시킨 앰플리콘과 같은 검출하고자 하는 표적일 수 있는 조립 촉진자의 존재 하에서만 촉매적으로 활성이다. MNAzyme은 다중 파트-효소, 또는 파트자임으로 구성되며, 이는 하나 이상의 조립 촉진자의 존재 하에 자가-조립되어 기질을 촉매적으로 개질하는 활성 MNAzyme을 형성한다(도 16). 기질 및 조립 촉진자(표적)는 별도의 핵산 분자이다. 파트자임은 (i) 조립 촉진자(예를 들어, 표적 핵산)에 결합하는 센서 팔; (ii) 기질에 결합하는 기질 팔, 및 (iii) 조립시에 조합되어 완전한 촉매 코어를 제공하는 부분적 촉매 코어 서열을 포함하는 다중 도메인을 가진다. 예를 들어, 상이한 표적 핵산 서열을 포함하는 광범위한 조립 촉진자를 인식하도록 MNAzyme을 디자인할 수 있다. 조립 촉진자의 존재에 반응하여, MNAzyme은 그들의 기질을 개질한다. 이러한 기질 개질은 신호 생성에 연결될 수 있으므로, MNAzyme은 효소적으로 증폭된 출력 신호를 생성시킬 수 있다. 조립 촉진자는 생물학적 샘플 또는 환경적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산(예를 들어, PASS 프라이머를 사용하여 폴리뉴클레오티드 표적으로부터 생성된 앰플리콘)일 수 있다. 이러한 경우에, MNAzyme 활성에 의한 기질의 개질의 검출은 표적의 존재를 나타낸다. 핵산 기질을 분해할 수 있는 몇몇 MNAzyme이 보고되어 있으며, 핵산 기질을 결찰할 수 있는 부가적인 MNAzyme 또한 당업계에 공지되어 있다. MNAzyme 및 그의 개질된 형태는 당업계에 공지되어 있으며, PCT 특허 공개 번호 제WO/2007/041774호, 제WO/2008/040095호, 제WO2008/122084호, 및 관련 미국 특허 공개 번호 제2007-0231810호, 제2010-0136536호 및 제2011-0143338호(이들 문헌 각각의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 개시되어 있다.
예를 들어, MNAzyme의 센서 팔 중 어느 하나 또는 양자 모두가 PASS 프라이머 또는 그의 구성요소에 상보적이거나 실질적으로 상보적일 수 있다. 소정의 구체예에서, MNAzyme의 하나의 센서 팔은 PASS 프라이머 또는 그의 구성요소의 중앙 구성요소(US)에 상보적이거나 실질적으로 상보적이고, 중앙 구성요소를 포함하는 앰플리콘의 나머지 부분에도 상보적이다. MNAzyme의 제2 센서 팔은 제1 센서 팔에 상보적이지 않고 US를 함유하지 않는 동일한 앰플리콘의 상이한 부분에 상보적이다.
상이한 PASS 프라이머로부터 유도된 상이한 중앙 구성요소(US)를 포함하는 다중의 구별된 앰플리콘의 존재를 검출하도록 디자인된 복합 어세이에 MNAzyme을 사용할 수 있다. 예를 들어, 제1 MNAzyme의 센서 팔 또는 센서 팔들은 제1 폴리뉴클레오티드 표적에 결합하고 그의 증폭을 용이하게 할 수 있는 제1 PASS 프라이머로부터 유도된 제1 중앙 구성요소(US)를 포함하는 제1 앰플리콘에 특이적일 수 있고, 제2 MNAzyme의 센서 팔 또는 센서 팔들은 제1 폴리뉴클레오티드 표적으로부터 구별되는 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드 표적에 결합하고 그의 증폭을 용이하게 할 수 있는 제2 PASS 프라이머로부터 유도된 제2 중앙 구성요소(US)를 포함하는 제2 앰플리콘에 특이적일 수 있다. 이는 구별된 폴리뉴클레오티드 표적으로부터 유도된 구별된 다중 앰플리콘의 단일 어세이에서의 검출을 용이하게 한다. 다른 구별된 폴리뉴클레오티드 표적으로부터 유도된 부가적인 구별된 앰플리콘에 대한 특이성을 가진 부가적인 MNAzyme도 이러한 어세이 내에 혼입될 수 있다는 것을 당업자는 용이하게 이해할 것이다.
단지 비-제한적인 예로서, 변종 1 및 US1의 상보체 양자 모두에 특이적인 서열로 구성된 파트자임 센서 팔을 디자인함으로써 변종 1 앰플리콘을 검출하도록 MNAzyme 1을 디자인할 수 있는 도 3을 참조한다. 변종 1의 앰플리콘의 존재 하에서만 형광단 1로 표지된 범용 탐침 1(Sub 1)을 분해하도록 MNAzyme 1을 디자인할 수 있다. 변종 2 및 US 2의 상보체 양자 모두에 특이적인 서열로 구성된 파트자임 센서 팔을 디자인함으로써 변종 2 앰플리콘을 검출하도록 MNAzyme 2를 디자인할 수 있다. 변종 2를 가진 앰플리콘의 존재 하에서만 형광단 2로 표지된 범용 탐침 2(Sub 2)를 분해하도록 MNAzyme 2를 디자인할 수 있다. 이러한 전략에서는, 변종 1 및 변종 2 양자 모두의 실시간 검출, 식별 및 정량화가 하나의 반응 튜브 내에서 동시에 일어날 수 있다. 도 7은 표적 폴리뉴클레오티드 내의 SNP 또는 점 돌연변이와 같은 변종 염기의 선택적 증폭을 위해 디자인된 PASS 프라이머의 예시적인 디자인을 보여준다. PASS 프라이머에 의해 생성된 앰플리콘이, 예를 들어, MNAzyme에 의해 검출될 수 있다. SNP 또는 점 돌연변이와 같은 단일 염기 변화를 식별하도록 PASS 프라이머를 디자인할 수 있다. 예를 들어, 도 7에서 루프를 형성한 PASS 프라이머 및 평면 PASS 프라이머에 나타낸 바와 같은 S2를 사용하여 SNP 또는 점 돌연변이를 표적화하고 특이적으로 결합할 수 있다. PASS 프라이머의 S2에서 SNP 또는 점 돌연변이에 일치하는 뉴클레오티드는 프라이머의 3' 말단에(디자인 1), 3' 단부로부터 3 뉴클레오티드에(디자인 2), 3' 단부로부터 3 염기에 삽입된 불일치 뉴클레오티드를 동반하는 프라이머의 3' 말단에(디자인 3), 또는 3' 단부로부터 5 염기에 삽입된 불일치 뉴클레오티드를 동반하여 3' 단부로부터 3 뉴클레오티드에(디자인 4) 위치할 수 있다. MNAzyme을 사용하여 PASS 프라이머로 생성시킨 앰플리콘을 검출할 수 있다. 파트자임 A 표적 센서 팔은 각각의 PASS 프라이머 디자인와 일치하는 것으로 나타나고 파트자임 B는 모든 디자인에 있어서 불변인 것으로 나타난다.
도 7에 나타낸 예시적인 디자인에 따라 평면, 루프, 표적 루프 및 핀치 PASS 프라이머를 사용할 수 있음을 당업자는 용이하게 인식할 것이다. S2 구성요소에 나타낸 불일치 뉴클레오티드 및/또는 SNP에 일치하는 뉴클레오티드의 위치가 변동될 수 있음을 당업자는 또한 인식할 것이다. 예를 들어, 각각은 3' 말단에 있거나 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오티드에 있을 수 있다.
- PASS 파트자임을 사용하는 앰플리콘의 검출
PASS 파트자임(들)을 포함하는 MNAzyme을 사용하여 표적 핵산 및 표적 핵산 앰플리콘을 검출할 수 있다. 표적 핵산 앰플리콘은 임의의 적합한 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다. 일부 구체예에서는, PASS 프라이머를 이용하는 기술로 표적 핵산 앰플리콘을 생성시킬 수 있다.
도 8에 나타낸 예시적인 구체예를 참조하면, 관련 변종 서열로부터 유도된 다중 앰플리콘을 검출하도록 PASS 파트자임을 디자인할 수 있다. 단지 비-제한적인 예로서, 관심의 대상인 표적 서열은 상이한 표적에서 상이한 변종 뉴클레오티드의 스트링을 함유할 수 있다(도 8에 변종 1(V1), 변종 2(V2) 및 변종 3(V3) 서열로 도시됨). 각각의 변종 서열 V1, V2 및 V3에 특이적이고 각각에 대한 앰플리콘을 생성시키도록 프라이머 세트를 디자인할 수 있다. PASS 파트자임은 변종 균주 사이의 식별 없이 실시간으로 서열을 검출하기 위한 전략을 제공한다. 이는 MNAzyme qPCR의 사용을 포함하며, 여기서 MNAzyme은 PASS 파트자임을 포함할 수 있다. 예를 들어 PASS 파트자임은 관심의 대상인 표적 서열(들)/앰플리콘(들)에 상보적이지 않은 고유 서열(US)의 부분을 함유할 수 있다. US는 표적에 상보적인 2개의 영역 사이의 PASS 파트자임 센서 팔 내부에 위치할 수 있다. 파트자임 내의 US는 변종 염기를 함유하는 V1, V2 및 V3 내의 변종 영역과 정렬될 수 있다. 이러한 디자인을 가진 단일 PASS 파트자임은 V1, V2 및 V3로부터의 앰플리콘에 동일하거나 유사한 효율로 결합하여 그들의 동시 검출을 가능하게 할 수 있을 것이다.
계속해서 도 8에 나타낸 예시적인 구체예를 참조하면, PASS 파트자임 내부의 US는 활성 MNAzyme의 형성을 방지하지 않으므로 임의의 변종 또는 그의 조합의 존재는 범용 탐침의 분해를 유발하여 검출가능한 이벤트를 제공할 수 있다. 예를 들어, 탐침을 형광단 및 퀀처로 표지하는 경우에 이는 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 생성시킬 수 있다.
도 8에 나타낸 PASS 파트자임의 센서 팔은 앰플리콘의 변종 영역에 대한 상보적 염기 하이브리드화를 방지하도록 각각 디자인된, 본 명세서에 기재된 바와 같은 평면 PASS 올리고뉴클레오티드, 루프 PASS 올리고뉴클레오티드, 표적 루프 PASS 올리고뉴클레오티드, 또는 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성될 수 있음을 당업자는 인식할 것이다.
이제 도 10에 도시된 예시적인 구체예를 참조하면, PASS 파트자임은 MNAzyme qPCR 판독을 동반하여 변종 결실 균주를 검출하도록 디자인될 수 있으며, 여기서 관심의 대상인 변종 표적 서열은 동일하지 않은 결실 영역을 가진 구성원들을 포함하는 야생형 서열의 그룹으로부터 유도될 수 있다(도 10 패널 i, 결실 1 및 결실 2). 각각의 결실 변종 서열에 특이적이고 각각에 대한 앰플리콘을 생성시키도록 프라이머 세트를 디자인할 수 있다. PASS 파트자임의 사용은 특이적 결실 사이의 필수적 식별 없이 실시간으로 서열을 검출하는 전략을 제공한다. 이는 MNAzyme qPCR을 사용하여 달성할 수 있으며, 여기서 MNAzyme은 제1 PASS 파트자임 및 관심의 대상인 증폭된 표적 서열 상에 인접하여 결합하는 완전히 일치하는("표준") 파트자임을 포함할 수 있다. PASS 파트자임은 표적 서열에 상보적이지 않은 서열의 영역(고유 서열(US)로 표기됨)을 포함할 수 있으며, 이는 모든 변종을 검출하기 위해 하나의 MNAzyme을 사용할 수 있도록 결실 앰플리콘 사이에서 영역이 변동되는 곳에 정렬되도록 디자인된다(도 10 패널 ii). PASS 파트자임 내에 존재하는 US는 평면 형태일 수 있으며, 여기서 PASS 파트자임의 센서 팔 내의 비-상보적 염기의 수는 표적 서열 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수와 일치한다(도 10 패널 ii (a)). 대안적으로, PASS 파트자임 센서 팔 내에 존재하는 US는 루프 형태일 수 있으며, 여기서 PASS 파트자임의 센서 팔 내의 비-상보적/하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수는 표적 서열 내의 비-상보적/하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수를 초과한다(도 10 패널 ii (b)).
도 10이 평면 및 루프 PASS 올리고뉴클레오티드의 사용을 도시하지만, 도 10에 나타낸 PASS 파트자임의 센서 팔은 앰플리콘의 가변 결실 영역에 대한 상보적 염기 하이브리드화를 방지하도록 각각 디자인된, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 루프 PASS 올리고뉴클레오티드 또는 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성될 수 있음을 당업자는 인식할 것이다.
단일 PASS 파트자임은 결실 변종 1 및 2의 증폭에 의해 생성된 앰플리콘에 동일하거나 유사한 효율로 결합하여 그들의 동시 검출을 가능하게 할 수 있을 것이다.
PASS 파트자임 내부의 US는 활성 MNAzyme의 형성을 방지하지 않으므로 형광단 및 퀀처로 표지된 범용 탐침이 분해되어 검출가능한 이벤트를 제공할 수 있다. 이는 결국 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 제공할 수 있다.
도 9에 도시된 또 다른 예시적인 구체예에서는, PASS 파트자임과 PASS 프라이머의 조합을 사용하여 표적의 검출을 달성할 수 있다. 관심의 대상인 표적 서열은 변종 뉴클레오티드의 서열을 함유할 수 있으며, 여기서 상이한 표적 내의 변종 뉴클레오티드 서열은 동일하지 않다(예를 들어, 변종 1(V1), 변종 2(V2) 및 변종 3(V3) 서열). 증폭이 (i) 변종 염기 및 (ii) 공통 US에 대한 상보적 서열(cUS1) 및 변종들 사이에서 보존된 서열을 함유하는 각각의 변종에 대한 앰플리콘을 생성시키도록, PASS 프라이머 세트는 각각의 변종 서열, V1, V2 및 V3에 특이적이도록 디자인될 수 있으며, 동일한 US(US1)를 추가로 포함할 수 있다. 이들 PASS 프라이머와 PASS 파트자임의 조합 사용은 변종 균주 사이의 식별 없이 실시간으로 모든 변종 서열을 검출하는 전략을 제공한다. 이는 MNAzyme qPCR의 사용을 포함하며, 여기서 MNAzyme은 제1 PASS 파트자임 및 관심의 대상인 증폭된 표적 서열 상에 인접하여 결합하는 완전히 일치하는 "표준" 파트자임을 포함할 수 있다. 도시된 PASS 파트자임 센서 팔은 (i) 모든 변종 앰플리콘의 보존된 서열에 완전히 일치하는 영역, (ii) 임의의 변종 앰플리콘에 상보적이지 않으며 변종 앰플리콘들 사이에 상이한 영역에 정렬되는 고유 서열(US2), 및 (iii) 변종-특이적 프라이머 세트를 사용하여 생성시킨 모든 앰플리콘(모두 cUS를 포함함)에 결합할 수 있는, US1을 포함하는 영역을 포함한다. 이러한 MNAzyme은 모든 변종을 인식하고 이에 하이브리드화될 수 있다.
각각의 디자인의 단일 PASS 파트자임은 변종 서열의 증폭에 의해 생성된 앰플리콘에 동일하거나 유사한 효율로 결합하여 그들의 동시 검출을 가능하게 할 수 있을 것이다. 도 9는 평면 PASS 프라이머의 사용을 도시하지만, 생성되는 표적 서열의 복제물 내에 US를 제공하도록 각각 디자인된, 본 명세서에 기재된 바와 같은 루프 PASS 프라이머, 표적 루프 PASS 프라이머, 또는 핀치 PASS 프라이머로 도 9에 나타낸 PASS 프라이머를 치환할 수 있음을, 당업자는 인식할 것이다. 도 9는 평면 PASS 파트자임 입체배좌를 도시하지만, US2가 앰플리콘의 가변 서열에 비-상보적인 루프 또는 표적 루프 PASS 올리고뉴클레오티드를 포함하는 균등한 버전, 또는 대안적으로 센서 팔을 위한 앰플리콘 내의 이용가능한 결합 영역으로서 가변 서열의 제거를 용이하게 하는 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드 센서 팔로 센서 팔을 치환할 수 있음을, 당업자는 또한 인식할 것이다.
각각의 PASS 파트자임 내부의 복수의 US는 활성 MNAzyme의 형성을 방지하지 않으므로 임의의 변종 또는 그의 조합의 존재는 범용 탐침의 분해를 유발하여 검출가능한 이벤트를 제공할 수 있다. 예를 들어, 탐침을 형광단 및 퀀처로 표지하는 경우에 이는 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 생성시킬 수 있다.
도 11에 설명된 추가의 구체예에서 PASS 파트자임을 PASS 프라이머와 함께 사용하여 변종 결실을 검출할 수 있다. 관심의 대상인 변종 표적 서열은 상이한 영역이 결실된 야생형 서열로부터 유도될 수 있다(도 11 패널 i, 결실 1 및 결실 2). 각각의 결실 변종 서열, 결실 1 및 결실 2에 특이적이나, 동일한 US(US1)를 추가로 포함할 수 있도록 PASS 프라이머 세트를 디자인하여, 결실-특이적 변종 염기 뿐 아니라 동일한 US에 대한 상보체 서열(cUS1) 및 보존된 공통 표적 서열을 함유하는 각각의 결실에 대한 앰플리콘을 생성시킬 수 있다. 변종 결실들 사이의 식별 없이 실시간으로 앰플리콘을 검출하기 위한 예시적인 전략은, PASS 프라이머와 함께 PASS 파트자임을 사용한다. 이는 MNAzyme qPCR의 사용을 포함할 수 있으며, 여기서 MNAzyme은 제1 PASS 파트자임 및 관심의 대상인 증폭된 표적 서열 상에 인접하여 결합하는 완전히 일치하는("표준") 파트자임을 포함할 수 있다. PASS 파트자임은 (i) 결실 앰플리콘 사이에서 서열이 변동되는 곳에 정렬되도록 디자인된 고유 서열(US2)로 표기되는, 증폭된 표적 서열에 상보적이지 않은 서열의 영역(패널 ii); (ii) 모든 변종을 검출하기 위해 하나의 MNAzyme을 사용할 수 있도록, US1에 상응하는 다른 영역(패널 ii) 및 (iii) 모든 결실 앰플리콘에서 보존된 공통 상보적 서열을 포함할 수 있다. PASS 파트자임 내에 존재하는 US2는 평면 형태일 수 있으며, 여기서 PASS 파트자임 내의 비-상보적인 염기의 수는 표적 서열 내의 결합하지 않은 염기의 수와 일치한다. 대안적으로, PASS 파트자임 내에 존재하는 US2는 루프를 형성하는 입체배좌일 수 있으며, 여기서 파트자임 내의 비-상보적 염기의 수는 표적 서열 내의 수를 초과하여, 서열이 팽출되거나 루프를 형성해내는 것을 유발한다(패널 ii). 각각의 디자인의 단일 PASS 파트자임은 결실 변종의 증폭에 의해 생성된 앰플리콘에 동일하거나 유사한 효율로 결합하여 그들의 동시 검출을 가능하게 할 수 있을 것이다.
도 11은 루프 PASS 프라이머의 사용을 도시하지만, 생성되는 표적 서열의 복제물 내에 US를 제공하도록 각각 디자인된, 본 명세서에 기재된 바와 같은 평면 PASS 프라이머, 표적 루프 PASS 프라이머 또는 핀치 PASS 프라이머로 도 11에 나타낸 PASS 프라이머를 치환할 수 있음을, 당업자는 인식할 것이다. 도 11은 평면 및 루프 PASS 파트자임 입체배좌를 도시하지만, US2가 앰플리콘의 가변 결실 서열에 비-상보적인 표적 루프 PASS 올리고뉴클레오티드를 포함하는 균등한 버전, 또는 대안적으로 센서 팔을 위한 앰플리콘 내의 이용가능한 결합 영역으로서 가변 결실 서열의 제거를 용이하게 하는 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드 센서 팔로 센서 팔을 치환할 수 있음을, 당업자는 또한 인식할 것이다.
PASS 파트자임 내부의 US는 활성 MNAzyme의 형성에 영향을 미치지 않으므로, 형광단 및 퀀처로 표지된 범용 탐침이 분해되어 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 생성시킬 수 있다.
이제 도 14를 참조하면, 하나 이상의 프라이머를 사용하는 표적 서열의 증폭은 프라이머(들) 및 표적 서열을 포함하는 표적 서열 앰플리콘을 제공할 수 있다. 이러한 경우, 앰플리콘을 검출하도록 MNAzyme을 디자인할 수 있다. MNAzyme은 도 14b 및 14c에 나타낸 바와 같은 PASS 파트자임을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 14 (i), 14a (i) 및 14b (i)에 나타낸 바와 같이, 파트자임 구성요소(들) 중 어느 하나 또는 양자 모두의 센서 팔이 염기쌍 상보성에 의해 프라이머 서열 또는 프라이머 서열에 상보적인 서열을 포함하지 않는 앰플리콘의 영역(예를 들어, 각각의 말단이 분리된 프라이머 서열을 포함하거나, 각각의 말단이 분리된 프라이머 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 앰플리콘의 2개의 말단 사이의 영역에서)에 하이브리드화되도록 MNAzyme을 디자인할 수 있다. 대안적으로, 파트자임 구성요소(들) 중 어느 하나 또는 양자 모두의 센서 팔이 프라이머 서열 또는 프라이머 서열에 상보적인 서열을 포함하는 앰플리콘의 영역에 하이브리드화되도록 MNAzyme을 디자인할 수 있다(도 14 (ii)/(iii), 14a (ii)/(iii), 14b (ii) 및 14c (iii)). 이러한 경우, 프라이머 서열에 하이브리드화되는 센서 팔은 PASS 파트자임의 구성요소일 수 있다. 예를 들어, 도 14b (i)/(ii) 및 14c (iii)에 나타낸 바와 같이, 핀치 PASS 파트자임을 사용하여 프라이머 서열의 부분 및 임의로 프라이머 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 있는 앰플리콘의 부가적인 서열이 루프를 형성해내는 것을 유발할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열 앰플리콘은 태그 서열을 포함하는 프라이머(들)를 포함할 수 있다(도 14 (iii), 14a (iii), 14c (iii)). 파트자임 구성요소(들) 중 어느 하나 또는 양자 모두의 센서 팔이 태그 서열 또는 태그 서열에 상보적인 서열을 포함하는 앰플리콘의 영역에 하이브리드화되도록 MNAzyme을 디자인할 수 있다. 이러한 경우, 프라이머 서열에 하이브리드화되는 센서 팔은 PASS 파트자임의 구성요소일 수 있다. 예를 들어, 도 14c (iii)에 나타낸 바와 같이, 핀치 PASS 파트자임을 사용하여 프라이머 서열의 부분 및 임의로 부가적인 태그 서열 및 임의로 프라이머 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 있는 앰플리콘의 서열이 루프를 형성해내는 것을 유발할 수 있다. 본 명세서에 기재된 예시적인 방법에 따라 평면, 루프, 표적 루프 및 핀치 PASS 파트자임을 사용할 수 있음을, 당업자는 용이하게 인식할 것이다.
- PASS 파트자임을 사용하는 증폭되지 않은 표적 핵산의 검출
중합효소-기반의 증폭 기술을 사용하여 사전에 증폭되지 않은 핵산을 검출하기 위하여 본 발명의 PASS 파트자임을 사용할 수 있다.
예를 들어, 변종 표적 서열을 검출하도록 PASS 파트자임을 디자인할 수 있다. 단지 비-제한적인 예로서, 관심의 대상인 표적 서열은 상이한 표적에서 상이한 변종 영역을 함유할 수 있다. 가변 영역은 뉴클레오티드 치환(들), 삽입(들) 및/또는 결실(들)을 포함할 수 있다. PASS 파트자임은 표적 서열 중 어느 것에도 상보적이지 않은 고유 서열(US)의 부분을 포함할 수 있거나, 적어도 주어진 변종 표적 서열의 개체군 내부의 가변 영역 중 어느 것도 포함하지 않는다. US는 하나 이상의 표적 서열에 각각 상보적인 PASS 파트자임 센서 팔의 2개의 영역 사이에 위치할 수 있다. 상보적 영역 중 하나는 표적(들)의 변종 영역의 3'에 상보적 염기 대합함으로써 표적 서열(들)에 하이브리드화될 수 있는 반면에, 다른 하나는 표적(들) 내의 가변 영역의 5'에 상보적 염기 대합함으로써 동일한 표적 서열(들)에 하이브리드화될 수 있다. 이러한 방식으로, 가변 영역을 포함하는 표적(들)에 대한 PASS 파트자임의 하이브리드화는 US가 하이브리드화되지 않고 남아 있을 수 있는 변종 영역과 US를 정렬시킬 수 있다. 따라서 이러한 디자인을 가진 단일 PASS 파트자임은 다중의 상이한 표적에 동일하거나 유사한 효율로 결합하여 그들의 동시 검출을 가능하게 할 수 있을 것이다. 일반적으로, PASS 파트자임에 의해 하이브리드화되는 표적 서열의 부분에 바로 인접한 표적 서열의 부분에 상보적인 센서 팔을 포함함으로써, 기질을 개질하여 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 촉매적으로 활성인 MNAzyme의 조립을 용이하게 하는 제2 파트자임의 첨가에 의해 검출을 용이하게 할 수 있다. PASS 파트자임의 센서 팔은 표적 서열의 변종 영역에 대한 상보적 염기 하이브리드화를 방지하도록 각각 디자인된, 본 명세서에 기재된 바와 같은 평면 PASS 올리고뉴클레오티드, 루프 PASS 올리고뉴클레오티드, 표적 루프 PASS 올리고뉴클레오티드, 또는 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성될 수 있음을 당업자는 인식할 것이다.
- 앰플리콘 내로 작용성 핵산을 혼입시키기 위한 PASS 올리고뉴클레오티드의 사용
앰플리콘 내로 작용성 서열을 혼입시키기 위해 PASS 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. US 또는 UJS를 앰플리콘 내로 혼입시키는 PASS 올리고뉴클레오티드(예를 들어, PASS 프라이머)에 의해 작용성 서열이 형성될 수 있으며, 여기서 새로운 US에 상보적인 서열, 또는 UJS에 의해 형성된 새로운 서열은 작용성 능력을 가진다. 예를 들어, 혼입되는 서열은 DNAzyme 또는 리보자임의 서열일 수 있다.
이제 도 15 및 특히 도 15 패널 (ii)를 참조하면, US를 포함하는 PASS 프라이머를 사용하여 표적 핵산(예를 들어, 게놈 DNA)을 증폭시킬 수 있으며, 그렇게 해서 US를 앰플리콘 내로 혼입시킬 수 있다. PASS 프라이머의 US는 작용성 핵산의 비활성 안티센스 형태를 포함할 수 있다. 표적 핵산을 증폭시킬 때, 촉매적으로 활성인, 작용성 핵산의 센스 형태가 앰플리콘 내로 삽입된다. US를 통해 생성된 앰플리콘 내로 작용성 핵산을 혼입시키는 결과를 달성하기 위해, 평면, 루프, 및 표적 루프 PASS 프라이머를 사용할 수 있음을 당업자는 용이하게 인식할 것이다. 대안적인 구체예에서는, 핀치 PASS 프라이머를 사용하여 앰플리콘 내에 UJS를 생성시킬 수 있으며, 그렇게 해서 앰플리콘 내부에 작용성 핵산을 생성시킬 수 있다.
도 15 패널 (ii)의 예시적인 구체예에 나타낸 바와 같이, 촉매 핵산(이 경우에는 DNAzyme)의 비활성 안티센스 형태를 포함하는 US를 사용하여 US의 작용적으로 활성인 센스 형태를 포함하는 앰플리콘을 생성시킨다. 앰플리콘 내에 존재하는 촉매 핵산의 작용적으로 활성인 센스 형태는 기질을 분해하여 검출가능한 신호를 생성시킴으로써 그렇게 생성된 앰플리콘의 존재를 알려줄 수 있다. 도 15 패널 (ii)의 최하단부에 나타낸 바와 같이, MNAzyme을 임의로 사용하여 작용성 촉매 핵산(이 경우에는 DNAzyme)을 포함하는 앰플리콘의 검출을 지원할 수 있다. 예를 들어, 상보적 염기 대합에 의해 작용성 촉매 핵산에 대한 기질에 인접하거나 실질적으로 인접하여 하이브리드화될 수 있는 제1 파트자임 뿐 아니라 앰플리콘의 부분을 포함하는 MNAzyme을 사용할 수 있다. MNAzyme의 제2 파트자임 구성요소는 제1 파트자임에 인접한 앰플리콘(다시 상보적 염기 대합에 의함)에 하이브리드화되어 앰플리콘 내에 존재하는 촉매 핵산과 동일하거나 상이한 기질을 분해할 수 있는 촉매적으로 활성인 MNAzyme의 조립을 용이하게 함으로써, 앰플리콘의 존재를 나타내는 부가적인 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있다.
- 진단적 응용
본 명세서에 기재된 방법에 따라 진단적 목적 및/또는 예단적(prognostic) 목적을 위해 PASS 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 진단적 방법 및/또는 예단적 방법은 생체외 또는 시험관내에서 수행될 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법을 반드시 진단적 목적 및/또는 예단적 목적을 위해 사용할 필요는 없으므로, 진단적 응용 또는 예단적 응용이 아닌 응용 또한 고려된다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 대상 내의 감염을 진단할 수 있다. 예를 들어, 본 방법을 사용하여 대상 내의 박테리아, 바이러스, 진균/효모, 원생생물 및/또는 선충에 의한 감염을 진단할 수 있다. 한 구체예에서, 바이러스는 엔테로바이러스일 수 있다. 대상은, 소, 말, 양, 영장류, 조류 및 설치류 종일 수 있다. 예를 들어, 대상은 인간, 개, 고양이, 말, 양, 염소 또는 암소와 같은 포유류일 수 있다. 대상은 감염으로부터 발생하는 질환으로 고통을 받을 수 있다. 예를 들어, 대상은 엔테로바이러스 감염으로부터 발생하는 수막염을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 소정의 구체예에서 수막염을 진단하기 위해 사용될 수 있다.
샘플에 대해 본 발명의 방법을 수행할 수 있다. 샘플은 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 환경적 공급원으로부터, 산업적 공급원으로부터, 또는 화학적 합성에 의해 샘플을 얻을 수 있다.
본 명세서에서 고려되는 바와 같은 "샘플"은, 예를 들어, 정제, 희석, 또는 임의의 다른 구성요소 또는 구성요소들의 첨가에 의해 그의 원래의 상태로부터 개질된 샘플을 포함하는 것이 이해될 것이다.
진단적 방법 및/또는 예단적 방법을 포함하나 이로 제한되지 않는 본 발명의 방법은 생물학적 샘플에 대해 수행될 수 있다. 생물학적 샘플은 대상으로부터 채취될 수 있다. 저장된 생물학적 샘플 또한 사용할 수 있다. 적합한 생물학적 샘플의 비-제한적인 예는 전혈 또는 그의 구성요소(예를 들어, 혈구, 혈장, 혈청), 소변, 타액, 림프, 담즙, 객담, 누액, 뇌척수액, 기관지 폐포 세척액, 활액, 정액, 복수 종양 유체(ascitic tumour fluid), 모유 및 고름을 포함한다.
키트
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 하나 이상의 약제를 포함하는 키트를 제공한다. 전형적으로, 본 발명의 방법을 실행하기 위한 키트는 본 방법을 실행하기 위해 필요한 모든 시약을 함유한다.
일부 구체예에서, 키트는 적절한 조립 촉진자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 PASS 프라이머를 포함하는 앰플리콘)의 존재 하에 MNAzyme을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 적어도 제1 및 제2 파트자임을 포함하는 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 구성요소, 및 기질을 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 파트자임, 및 기질의 MNAzyme으로의 자가-조립은 시험 샘플 내에 존재하는 조립 촉진자(예를 들어, 앰플리콘)의 연계를 필요로 한다. 따라서, 이러한 구체예에서는, 하나 이상의 표적 앰플리콘의 존재를 결정하기 위하여 제1 및 제2 파트자임, 및 기질을 시험 샘플에 적용할 수 있다.
일반적으로, 키트는 적어도 하나의 본 명세서에 제공된 PASS 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 그러므로 키트는, 예를 들어, 평면 PASS 올리고뉴클레오티드, 루프 PASS 올리고뉴클레오티드, 표적 루프 PASS 올리고뉴클레오티드 및/또는 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드와 같은 PASS 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 키트는, 예를 들어, 평면 PASS 프라이머, 루프 PASS 프라이머, 표적 루프 PASS 프라이머 및/또는 핀치 PASS 프라이머와 같은 PASS 프라이머를 포함할 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 PASS 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 평면 PASS 올리고뉴클레오티드, 루프 PASS 올리고뉴클레오티드, 표적 루프 PASS 올리고뉴클레오티드 또는 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드)를 포함하거나 이로 구성된 기질 팔 및/또는 센서 팔을 포함하는 PASS 파트자임을 포함할 수 있다. 동일한 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하고, 기질을 개질하여 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 촉매적으로 활성인 MNAzyme의 조립을 용이하게 하는 것과 관련하여, 키트는 PASS 파트자임을 보충하도록 디자인된 표준 파트자임을 추가로 포함할 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 키트는 또한, PCR 또는 다른 핵산 증폭 기술과 같은 본 발명의 방법의 수행에 있어서의 필요에 따라, 다른 시약, 세척 시약, 효소 및/또는 다른 시약을 포함할 것이다.
키트는 본 명세서에 정의된 바와 같은 분할된 키트 또는 조합된 키트일 수 있다.
분할된 키트는 별도의 용기에 담긴 시약을 포함하며, 작은 유리 용기, 플라스틱 용기, 또는 플라스틱 또는 종이의 스트립을 포함할 수 있다. 이러한 용기는 샘플 및 시약의 교차-오염을 방지하는 가운데 한 구획으로부터 다른 구획으로 시약의 효율적인 이전을 가능하게 할 수 있으며, 한 구획으로부터 다른 구획으로 각각의 용기의 약제 또는 용액을 정량적 방식으로 첨가하는 것을 가능하게 할 수 있다. 이러한 키트는 또한, 시험 샘플을 수용할 용기, 어세이에 사용되는 시약을 함유하는 용기, 세척 시약을 함유하는 용기, 및 검출 시약을 함유하는 용기를 포함할 수 있다.
조합된 키트는 반응 어세이의 모든 구성요소를 단일 용기 내에 포함한다(예를 들어, 각각의 목적하는 구성요소가 담긴 단일 박스 내에).
본 발명의 키트는 또한, 키트 구성요소를 사용하여 적절한 방법을 수행하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 예를 들어, 실시간 PCR 기계를 포함하나 이로 제한되지 않는 자동화 분석 장비 및 시스템과 함께 본 발명의 키트 및 방법을 사용할 수 있다.
상이한 표적의 증폭, 검출, 동정 또는 정량화에 응용하기 위해서는, 본 발명의 단일 키트가 응용가능할 수도 있고, 또는 대안적으로, 예를 들어, 각각의 표적에 특이적인 시약을 함유하는 상이한 키트가 필요할 수도 있다. 본 발명의 방법 및 키트는, 임의의 실체를 검출하거나, 동정하거나, 정량화하는 것이 바람직한 임의의 상황에 응용할 수 있다.
광범위하게 기재된 본 발명의 사상 또는 범위로부터 이탈하지 않으면서 특이적 구체예에 개시된 바와 같이 본 발명에 다수의 변이 및/또는 개질이 이루어질 수 있음을 당업자는 인정할 것이다. 그러므로 본 구체예는 모든 면에서 설명적이며 한정적이 아닌 것으로 간주되어야 한다.
실시예
이하의 특정 실시예들을 참조하여 본 발명을 상세히 설명할 것이지만, 이들이 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: PASS 프라이머를 통해 앰플리콘(amplicons) 내로 삽입된 서열을 검출하기 위한 MNA자임(MNAzymes)의 사용
PASS PCR 전략은, 관심 있는 표적 서열(target sequence)에 대해 상보적(complementary)이지 않은 고유 서열(unique sequence)을 포함하는 영역을 갖는 프라이머에 관계된다. PASS 프라이머 내에 존재하는 고유 서열(US)은 PASS 프라이머가 표적에 결합할 때 루프 아웃되거나(looped out) 또는 편평(planar)할 수 있다(도 1).
본 실시예에서, PASS 프라이머는 MNA자임 qPCR과 조합되며, 이에 의하여 MNA자임은, 고유 서열의 상보체(cUS) 및 증폭된 관심 표적 서열에 결합하는 제1 파트자임을 포함하며, 이 때 제2 파트자임은 제1 파트자임에 인접하여 증폭된 관심 표적 서열에 결합한다. 관심 표적 서열상에서 파트자임 B에 바로 인접하여 파트자임 A가 결합하는 지점을 파트자임 접합부(junction)라 한다. 파트자임 구성요소들로부터 활성 MNA자임이 형성된 결과, 형광체(fluorophore) 및 퀀쳐(quencher) 염료 쌍으로 표지된 범용 프로브(universal probe)가 절단(cleavage)되며, 실시간으로 모니터링될 수 있는 신호가 생성된다.
PASS 프라이머의 S2 도메인(도 1)과 상보적 파트자임 서열 간 중첩의 다양한 시나리오들이 CCB 유전자의 검출과 양립가능(compatible)한지 여부를 결정하기 위하여 프라이머들과 파트자임들이 디자인되었다. 그 결과, 파트자임 접합부로부터 5 염기 떨어지거나, 3 염기 떨어지거나, 또는 파트자임 접합부에서 결합하는 PASS 프라이머의 3' 말단이 되었다. PASS 프라이머와 비-PASS "표준" 프라이머들은 각 시나리오를 위하여 디자인되었다.
1.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임들은 CCB 유전자 및/또는 PASS 프라이머를 거쳐 앰플리콘 내에 도입된 임의의 cUS를 특정적으로 표적화하도록 디자인되었다. 하기 서열들에서, 볼드체의 염기들이 관심 표적 서열과 하이브리드화되며, 밑줄친 염기들은 cUS와 하이브리드화되고 그 US, 즉 insert 2(i2)를 포함한다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'으로 기재되었다.
SEQ ID NO: 1 파트자임 A CCBA/72-P:
ATGGTCATCTCCAGAGCCCAACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO: 2 파트자임 B CCBB/72-P:
CTGGGAGGAGAGGCTAGCTGGTCCATGGCTTCTGGGTA
SEQ ID NO: 3 파트자임 A CCB_1i2A/72-P:
AGACATACTA CTCCAGAGCCCAACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO: 4 파트자임 A CCB_2i2A/72-P:
AGACATACTA CCAGAGCCCAACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO: 5 파트자임 A CCB_3i2A/72-P:
ATG AGACATACTA GAGCCCAACAACGAGAGGCGTGAT
1.2. 리포터 기질
본 실시예의 리포터 기질을 5'에서 3'으로 기재된 서열로 아래에 나타내었다. 본 실시예에서 기질은, 5' 말단에서는 FAM 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "F"로 표시됨)로, 3' 말단에서는 Iowa Black® FQ 퀀쳐 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "IB"로 표시됨)로 말단 표지되었다. 기질의 절단은 485nm(FAM 여기 파장)에서의 여기로 530nm(FAM 방출 파장)에서 모니터링되었다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
SEQ ID NO: 6 기질 Sub72-FIB:
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
1.3. CCB DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
본 실시예의 표적 서열은 하기 열거된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머들을 사용한 인간 게놈 DNA(gDNA)의 시험관내(in vitro) 증폭에 의하여 생성되었다. 표적에 대한 프라이머의 결합 상에서 US들이 루프 아웃 하도록 디자인된 PASS 프라이머들을 "루프"라 부른다. 표적에 대한 프라이머의 결합 상에서 US들이 루프 아웃 하지 않는 PASS 프라이머들을 "평면(planar)"이라 부른다. 모든 서열들은 5'에서 3'으로 기재되었다. 이하의 서열들에서 밑줄친 염기들이 US이다.
SEQ ID NO: 7 역방향 프라이머 3CCB:
CTCAGGAATTTCCCAGCTAC
SEQ ID NO: 8 정방향 프라이머 5CCB:
GTCTCAGTTCTTCTTGGATG
SEQ ID NO: 9 정방향 프라이머 5CCB_1:
CTTGGATGGTCATCTCCAGA
SEQ ID NO: 10 정방향 PASS 프라이머 5CCB_1i2루프:
AGTTCTTCTTGGATGGTCATAGACATACTACTCCAGA
SEQ ID NO: 11 정방향 PASS 프라이머 5CCB_1i2평면
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTAGACATACTACTCCAGA
SEQ ID NO: 12 정방향 프라이머 5CCB_2:
GGATGGTCATCTCCAGAGC
SEQ ID NO: 13 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2루프:
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO: 14 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2평면:
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO: 15 정방향 프라이머 5CCB_3:
TGGTCATCTCCAGAGCCCA
SEQ ID NO: 16 정방향 PASS 프라이머 5CCB_3i2루프:
CTTCTTGGATGGTCATCTCCAAGACATACTAGAGCCCA
SEQ ID NO: 17 정방향 PASS 프라이머 5CCB_3i2평면:
GTCTCAGTTCTTCTTGGATGAGACATACTAGAGCCCA
1.4. 표적 서열
IM9 세포주(Promega)으로부터 추출된 인간 gDNA가 CCB 유전자의 증폭용 템플레이트으로 사용되었다.
1.5. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭 및 검출
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출기 25μL의 총 반응 부피에서 실행되었다. 반응은 Mx3005p(Stratagene)에서 수행되었다. 사이클 매개변수는, 95℃에서 2분, 95℃에서 15초 및 55℃에서 30초의 5 사이클, 95℃에서 15초 및 52℃에서 60초의 40 사이클이었다(데이터는 52℃ 단계에서 수집되었다). 모든 반응은 2회 반복 실시되었고, 40nM의 정방향(정방향) 프라이머, 100nM의 파트자임 A(표 1에 열거된 조합들), 200nM의 역방향(reverse) 프라이머(3CCB), 200nM의 파트자임 B(CCBB/72-P), 200nM의 기질(Sub72-FIB), 8mM의 MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNAse 억제제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaqTM HS DNA 중합효소(Bioline)를 포함하였고, gDNA 템플레이트(50ng) 또는 무표적(뉴클레아제-무함유 H2O(NF H2O)) 중 어느 하나를 포함하였다.
정방향 프라이머 및 파트자임 A 조합
반응 종류 내용 정방향 프라이머 파트자임 A
(i) 정방향 프라이머의 3' 말단이 파트자임 접합부로부터 5 염기 떨어짐
1_양성 대조군 일치하는 파트자임 A를 갖는 표준(비-PASS 프라이머) 5CCB_1 CCBA/72-P
1_음성 대조군 US 함유 파트자임 A를 갖는 표준(비-PASS 프라이머) 5CCB_1 CCB_1i2A/72-P
1_테스트 1 루프 일치하는 파트자임 A를 갖는 루프 PASS 프라이머 5CCB_1i2루프
1_테스트 2 평면 일치하는 파트자임 A를 갖는 평면 PASS 프라이머 5CCB_1i2평면
(ii) 정방향 프라이머의 3' 말단이 파트자임 접합부로부터 3 염기 떨어짐
2_양성 대조군 일치하는 파트자임 A를 갖는 표준(비-PASS 프라이머) 5CCB_2 CCBA/72-P
2_음성 대조군 US 함유 파트자임 A를 갖는 표준(비-PASS 프라이머) 5CCB_2 CCB_2i2A/72-P
2_테스트 1 루프 일치하는 파트자임 A를 갖는 루프 PASS 프라이머 5CCB_2i2루프
2_테스트 2 평면 일치하는 파트자임 A를 갖는 평면 PASS 프라이머 5CCB_2i2평면
(iii) 정방향 프라이머의 3' 말단이 파트자임 접합부에 위치함
3_양성 대조군 일치하는 파트자임 A를 갖는 표준(비-PASS 프라이머) 5CCB_3 CCBA/72-P
3_음성 대조군 US 함유 파트자임 A를 갖는 표준(비-PASS 프라이머) 5CCB_3 CCB_3i2A/72-P
3_테스트 1 루프 일치하는 파트자임 A를 갖는 루프 PASS 프라이머 5CCB_3i2루프
3_테스트 2 평면 일치하는 파트자임 A를 갖는 평면 PASS 프라이머 5CCB_3i2평면
1.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 절단
양성 대조군 "표준" 정방향 프라이머(비-PASS 프라이머, 즉, US를 함유하지 않음)를 사용하여, 관심 표적 서열에만 결합한 MNA자임에 의한 CCB의 실시간 검출 및 정량화를 위한 앰플리콘을 생산하였다. 이 반응은, 사용된 표적 서열이 PCR을 거쳐 증폭된 인간 gDNA일 때 형광의 경시적 증가를 보여주었다(도 4(i)-(iii), 양성 대조군). DNA 표적이 없는 대조군의 형광은 DNA 표적을 함유한 반응보다 낮았으며, 반응 동안 증가하지 않았다. 이는, 표적-함유 반응에서 생성된 형광의 증가가, 그 때 리포터 기질을 절단한 촉매 활성 MNA자임의 표적 의존성 조립에 기인함을 예증한다.
정방향 프라이머가 PASS 프라이머였고 파트자임 A가 cUS 및 표적 특이적 서열 양자 모두에 결합되었을 때, 형광의 증가가 경시적으로 관찰되었다다(도 4(i)-(iii), 테스트 1 및 테스트 2). 또한, 그 신호는, 루프 및 평면 타입의 PASS 프라이머 양자 모두를 함유하는 반응에 대한 양성 대조군에 유사하였다. 표준 비-PASS 및 루프 PASS 프라이머 대비 평면 PASS 프라이머를 사용하였을 때, 파트자임 접합부에서 PASS 프라이머가 출발한 반응에서 관찰된 신호 생성에 미세한 지연이 있었다(도 4(ii), 테스트 2 평면).
비-PASS 정방향 프라이머(즉, 정상 프라이머) 및 US와 표적 특이적 서열 모두를 함유하는 파트자임 A를 포함하는 음성 대조군 반응의 형광은 테스트 1, 테스트 2 및 양성 대조군 반응보다 낮았으며, 도 4의 패널 (i) 및 (iii)에 나타낸 반응에서의 한계값(threshold)을 넘지 않았다. 그러나, 도 4의 패널 (ii)에 나타낸 반응에서의 음성 대조군은 한계값 위에서 형광의 미세한 증가를 보였다. 이는 예기치 않은 것이었는데, 왜냐하면 파트자임 팔(arm) 내의 US와 이 디자인을 위하여 증폭된 CCB 표적 서열 사이에는 일부 상동성(homology)이 있고, 이 상동성은, 비록 비효율적이긴 하지만, MNA자임이 형성되기에 충분하도록 파트자임 팔을 안정화시킬 수 있기 때문이다.
파트자임 A와 PASS 프라이머의 S2 도메인 사이의 중첩에 대한 모든 시나리오는 테스트 1 및 테스트 2에 대하여 보여진 강한 신호를 나타내며 잘 유지(tolerated)되었다(도 4(i)-(iii)).
이 결과들은, US가 PASS 프라이머를 통하여(루프 또는 평면 PASS 타입 프라이머에 의하여) PCR 앰플리콘 내로 삽입될 수 있고, 이 앰플리콘들은 이어서 MNA자임으로 검출될 수 있으며, PASS 프라이머의 S2와 파트자임 A 사이의 중첩이 잘 유지됨을 나타낸다.
실시예 2: 서열 내 단일염기 변화를 검출하기 위한, MNA자임과 조합된 PASS 프라이머의 사용
PASS 프라이머는 단일 염기에 의하여 달라지는 두 서열을 구별하도록 디자인될 수 있으며, 표적-특이적 3' 말단(S2)이 변종(variant) 염기를 포함하며(도 2의 (i) 및 (ii) 상부), 그 변종 염기의 5'에 위치한 불일치(mismatch) 염기를 또한 포함할 수 있다(도 2의 (i) 및 (ii) 하부). 나아가, US는 각 변종에 대하여 다른 수준의 선택성 및 특이성을 부가하면서 달라질 수 있다(도 3).
본 실시예에서, G12V로 지칭되는 코돈(codon) 12 내의 KRAS 점 돌연변이(point mutation)가 야생형(wild type) KRAS 서열인 G12에 대하여 분석(assay)된다. 코돈 12 상의 야생형(G12; GGT)에 대한 변종 염기는 위치 2의 G이고, 돌연변이(G12V; GTT)에 대한 변종 염기는 코돈 12의 위치 2의 T이다. 루프 또는 평면 US를 포함하는 PASS 프라이머가 G12V 또는 G12 서열에 대하여 특이적이 되도록 디자인되었다. 변종 염기는 S2 내에서 3' 말단에(도 7, 디자인 1), 또는 3' 말단으로부터 3 염기 떨어져서(도 7, 디자인 2) 위치하였다. 디자인 1 및 2는 디자인 3 및 4와 각각 비교되는데, 이들 역시 변종 염기의 5'에서 2 염기 떨어져 삽입된 불일치(M)를 가졌다(도 7, 디자인 3 및 디자인 4). 변종(US2) 대비 야생형(US1)을 위하여 상이한 US가 PASS 프라이머 내에 삽입된다.
PASS 프라이머는 MNA자임 qPCR과 조합되며, 이에 의하여 MNA자임은, 고유 서열의 상보체(cUS)에, 또한 각 변종 염기(야생형 또는 돌연변이, 불일치 포함 또는 불포함)를 위하여 재단된 증폭된 표적 서열에 결합하는 제1 파트자임을 포함한다(도 7). 제2 파트자임은 제1 파트자임에 인접하여 증폭된 관심 표적 서열상에 결합한다.
KRAS의 변종 염기들, 야생형 G12 또는 점 돌연변이 G12V에 대하여 다양한 시나리오들이 특이적인지 여부를 결정하기 위하여 PASS 프라이머들과 파트자임들이 디자인되었다.
2.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임들은 야생형 G12 또는 KRAS 유전자의 돌연변이 G12V 대립형(alleles) 및 이에 더하여 PASS 프라이머를 거쳐 도입된 임의의 cUS를 특정적으로 표적화하도록 디자인되었다. 하기 서열들에서, 볼드체의 염기들이 관심 표적 서열과 하이브리드화되며, 밑줄친 염기들은 출발 템플레이트에 대하여 불일치된 고유 서열들(야생형 insert i1 및 변종 insert i2)이다. 일부 파트자임 A들은 더 긴(L) 3' 표적 특이적 영역을 가진다. 이탤릭 볼드체의 염기들은 변종 염기들을 나타내고, 밑줄친 이탤릭체 염기들은 추가의 불일치된 염기들을 나타낸다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'으로 기재되었다.
SEQ ID NO: 18 파트자임 B KRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCGTAGGCAAGAGTGCCTT
SEQ ID NO: 19 파트자임 A G12_i1A/55-P:
CACAATCAGT GAGCTG G TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 20 파트자임 A G12_Mi1A/55-P:
CACAATCAGT GAGC A G G TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 21 파트자임 A G12_LMi1A/55-P:
CACAATCAGT TGGAGC A G G TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 22 파트자임 A G12V_i2A/55-P:
AGACATACTA GAGCTG T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 23 파트자임 A G12V_Mi2A/55-P:
AGACATACTA GAGC C G T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 24 파트자임 A G12V_LMi2A/55-P:
AGACATACTA TGGAGC C G T TGACAACGAGAGGTGCGGT
2.2. 리포터 기질
본 실시예에서 기질은, 5' 말단에서는 6-FAM 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "F"로 표시됨)로, 3' 말단에서는 Iowa Black®FQ 퀀쳐 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "IB"로 표시됨)로 말단 표지되었다. 기질의 절단은 450-490nm(CFX96(BioRad) 상에서의 FAM 여기 파장 범위) 사이에서의 여기로 510-530nm(CFX96(BioRad) 상에서의 FAM 방출 파장 범위) 사이에서 모니터링되었다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다. 본 실시예의 리포터 기질을 5'에서 3'으로 기재된 서열로 아래에 나타내었다.
SEQ ID NO: 25 기질 Sub55-FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
2.3. KRAS DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
인간 gDNA 내의 KRAS 유전자의 시험관내(in vitro) 증폭이, 하기 열거된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머들을 사용하여 수행되었다. 야생형에 특이적인 정방향 프라이머는 고유 서열(US) insert 1(i1)을 포함하고, 돌연변이에 특이적인 정방향 프라이머는 고유 서열(US) insert 2(i2)를 포함하도록, PASS 프라이머들이 디자인되었다. 일부 정방향 프라이머들은 더 긴(L) 3' 표적 특이적 영역을 가진다. 하기 서열들에서, 볼드체의 염기들이 표적 서열과 하이브리드화되고, 밑줄친 염기들은 출발 템플레이트에 대하여 불일치된 고유 서열들이며, 굵고 밑줄친 염기들은 변종 염기이고, 이탤릭체 염기들은 두 표적 모두에 불일치된 추가의 염기(M)를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'으로 기재되었다.
SEQ ID NO: 26 역방향 프라이머 3KRAS:
GGTCCTGCACCAGTAATATGC
SEQ ID NO: 27 정방향 PASS 프라이머 5G12_1i1루프:
ATATAAACTTGTGGTAGTTG CACAATCAGT GAGCTG G
SEQ ID NO: 28 정방향 PASS 프라이머 5G12_1i1평면:
GAAAATGACTGAATATAAACTT CACAATCAGT GAGCTG G
SEQ ID NO: 29 정방향 PASS 프라이머 5G12_2i1루프:
ATATAAACTTGTGGTAGTTG CACAATCAGT GAGCTG G TG
SEQ ID NO: 30 정방향 PASS 프라이머 5G12_2i1평면:
GAAAATGACTGAATATAAACTT CACAATCAGT GAGCTG G TG
SEQ ID NO: 31 정방향 PASS 프라이머 5G12_LM3i1루프:
TGATATAAACTTGTGGTAGT CACAATCAGT TGGAGC A G G
SEQ ID NO: 32 정방향 PASS 프라이머 5G12_LM3i1평면:
CTGAAAATGACTGAATATAAAC CACAATCAGT TGGAGC A G G
SEQ ID NO: 33 정방향 PASS 프라이머 5G12_M4i1루프:
ATATAAACTTGTGGTAGTTG CACAATCAGT GAGC A G G TG
SEQ ID NO: 34 정방향 PASS 프라이머 5G12_M4i1평면:
GAAAATGACTGAATATAAACTT CACAATCAGT GAGC A G G TG
SEQ ID NO: 35 정방향 PASS 프라이머 5G12V_1i2루프:
ATATAAACTTGTGGTAGTTG AGACATACTA GAGCTG T
SEQ ID NO: 36 정방향 PASS 프라이머 5G12V_1i2평면:
GAAAATGACTGAATATAAACTT AGACATACTA GAGCTG T
SEQ ID NO: 37 정방향 PASS 프라이머 5G12V_2i2루프:
ATATAAACTTGTGGTAGTTG AGACATACTA GAGCTG T TG
SEQ ID NO: 38 정방향 PASS 프라이머 5G12V_2i2평면:
GAAAATGACTGAATATAAACTT AGACATACTA GAGCTG T TG
SEQ ID NO: 39 정방향 PASS 프라이머 5G12V_LM3i2루프:
TGATATAAACTTGTGGTAGT AGACATACTA TGGAGC C G T
SEQ ID NO: 40 정방향 PASS 프라이머 5G12V_LM3i2평면:
CTGAAAATGACTGAATATAAAC AGACATACTA TGGAGC C G T
SEQ ID NO: 41 정방향 PASS 프라이머 5G12V_M4i2루프:
ATATAAACTTGTGGTAGTTG AGACATACTA GAGC C G T TG
SEQ ID NO: 42 정방향 PASS 프라이머 5G12V_M4i2평면:
GAAAATGACTGAATATAAACTT AGACATACTA GAGC C G T TG
2.4. 표적 서열
K562 세포주로부터 추출된 인간 gDNA가 야생형 KRAS 유전자의 시험관내 증폭용 템플레이트으로 사용되었고, SW620 세포주로부터 추출된 gDNA가 점 돌연변이 G12V를 함유하는 KRAS의 시험관내 증폭용으로 사용되었다.
2.5. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭 및 검출
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출기 25μL의 총 반응 부피에서 실행되었다. 반응은 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 수행되었다. 사이클 매개변수는, 95℃에서 2분, 95℃에서 15초 및 64℃에서 60초의 10 사이클(사이클당 -1℃), 95℃에서 15초 및 54℃에서 50초의 40 사이클이었다(데이터는 54℃에서 수집되었다). 모든 반응은 2회 반복 실시되었고, 40nM의 정방향 프라이머, 100nM의 파트자임 A(표 2에 열거된 조합들), 200nM의 역방향 프라이머(3KRAS), 200nM의 파트자임 B(KRAS_B/55-P), 200nM의 기질(Sub55-FIB), 8mM의 MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNAse 억제제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaqTM HS DNA 중합효소(Bioline)를 포함하였고, K562 또는 SW620 gDNA 템플레이트(50ng), 또는 무표적(NF H2O) 중 어느 하나를 포함하였다.
Figure 112014085559157-pct00001
2.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 절단
G12 및 cUS1에 대하여, 또는 G12V 및 cUS2에 대하여 특이적인 정방향 프라이머 및 파트자임 A가 특정 KRAS 대립형을 증폭 및 검출하였으며, 그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같은 한계(threshold) Ct 값들에 도달한 경시적 형광 발광의 증가를 얻었다. 야생형 G12 프라이머/파트자임 디자인 1(평면 및 루프), 디자인 3(평면 및 루프), 및 디자인 4(평면)를 포함하는 반응에서, "테스트" DNA(K562)에 대한 Ct 값들은 K562 내의 야생형 KRAS 대립형의 성공적인 증폭 및 검출을 나타내었던 반면, 음성 대조군(SW620)에 대한 신호의 부족은 돌연변이 대립형이 이들 시스템에서는 검출되지 않았음을 나타낸다. 이들 시스템은 gDNA 내의 야생형 및 돌연변이 KRAS 사이의 완전한 구별을 가능하게 한다. 야생형 G12 프라이머/파트자임 디자인 2(평면 및 루프), 및 디자인 4(루프)를 포함하는 반응에서, "테스트" DNA(K562)에 대한 Ct 값들은 K562 내의 야생형 KRAS 대립형의 성공적인 증폭 및 검출을 나타내었다. 음성 대조군(SW620)에 대한 신호는 표 3에 나타낸 바와 같은 한계 Ct 값들에 도달하였으며, 이는 돌연변이 템플레이트가 사용되었을 때 일부 백그라운드 신호가 생성되었음을 나타내었지만, ΔCt 값들이 충분히 높아서 야생형 및 돌연변이 서열의 명확한 구별을 가능하게 하였다.
G12V 프라이머/파트자임 디자인 3(루프)을 포함하는 반응에서, "테스트" DNA(SW620)에 대한 Ct 값들은 SW620 내의 돌연변이 KRAS 대립형의 성공적인 증폭 및 검출을 나타내었던 반면, 음성 대조군(K562)에 대한 신호의 부족은 야생형 대립형이 이 시스템에서는 검출되지 않았음을 나타낸다. 이 시스템은 gDNA 내의 돌연변이 및 야생형 KRAS 사이의 완전한 구별을 가능하게 하였다. 돌연변이 G12V 프라이머/파트자임 디자인 1, 2 및 4(평면 및 루프) 및 디자인 3(평면)을 포함하는 반응에서, "테스트" DNA(SW620)에 대한 Ct 값들은 SW620 내의 돌연변이 KRAS 대립형의 성공적인 증폭 및 검출을 나타내었다. 음성 대조군(K562)에 대한 신호는 표 3에 나타낸 바와 같은 한계 Ct 값들에 도달하였으며, 이는 야생형 템플레이트가 사용되었을 때 일부 백그라운드 신호가 생성되었음을 나타내었지만, ΔCt 값들이 충분히 높아서 돌연변이 및 야생형 서열의 명확한 구별을 가능하게 하였다.
모든 시스템에서, gDNA가 없는 템플레이트 없음 대조군에서는 증폭이 관찰되지 않았다.
이 결과들은, US가 PASS 프라이머를 통하여(루프 또는 평면 PASS 타입 프라이머에 의하여) PCR 앰플리콘 내로 삽입될 수 있고, 이 앰플리콘들은 이어서 MNA자임으로 검출될 수 있음을 나타낸다. 파트자임들은, 변종 염기를 포함하고 삽입된 고유 서열을 동반하는 앰플리콘들을 특정적으로 검출한다.
Figure 112014085559157-pct00002
N.B. 음성 대조군 샘플에 대하여 Ct가 생성되지 않았을 때에는 50의 최종 Ct를 사용하여 ΔCt를 생성하였으며, 그 앞에 "초과" 부호(>)를 두어 ΔCt가 이 값 보다 높았을 것으로 예측되었음을 나타내었다.
실시예 3: 서열 내 단일염기 변화를 검출하기 위한, MNA자임과 모두 조합된 PASS 프라이머와 워블-인핸스드(wobble-enhanced) ARMS 프라이머의 특이성 비교
본 실시예에서, G12V로 지칭되는 코돈 12 내의 KRAS 점 돌연변이가 야생형 KRAS 서열인 G12에 대하여 분석된다. 평면 PASS 프라이머가 G12V 또는 G12 서열에 대하여 특이적이 되도록 디자인되었다. 변종 염기(야생형에 대해서는 G, 돌연변이에 대해서는 T)는 3' 표적 특이적 영역(S2) 내의 3' 말단에 위치하였고, 불일치는 변종 염기의 5'에서 2 염기 떨어져 삽입되었다(도 7, 디자인 3). 야생형(US1) 및 돌연변이(US2) 서열들을 위하여, 상이한 US가 PASS 프라이머 내에 포함된다. 이 PASS 프라이머들을 워블-인핸스드 ARMS(WE-ARMS) 프라이머들과 비교하였으며(Hamfjord et al, (2011), "Wobble-enhanced ARMS Method for Detection of KRAS and BRAF Mutations", Diagn Mol Pathol; 20:158-165), 이에 의하여 프라이머들이 G12V 또는 G12에 대하여 서열-특이적이 되도록, 또한, 단일 염기에 의해 차이나는 KRAS 서열들 간의 구별을 돕고자 양자 대립형 모두에 대하여 도입된 불일치를 포함하도록 디자인되었다. 본 실시예에서 사용된 WE-ARMS 프라이머들에 있어서, 변종(돌연변이 또는 야생형) 염기는 3' 말단에 위치하였고, 불일치는 변종 염기의 5'에서 2 염기 떨어져 삽입되었다.
PASS 프라이머는 MNA자임 qPCR과 조합되며, 이에 의하여 MNA자임은, 고유 서열의 상보체(cUS), 변종 염기(야생형 또는 돌연변이) 및 불일치된 염기, 및 증폭된 표적 서열에 결합하는 제1 파트자임을 포함한다. 제2 파트자임은 제1 파트자임에 인접하여 결합하며, 증폭된 관심 표적 서열에 하이브리드화한다. WE-ARMS 프라이머들은 MNA자임과 조합되며, 이에 의하여 제1 파트자임은, 증폭된 표적 서열, 및 변종 염기(야생형 또는 돌연변이) 및 불일치된 염기의 상보체에 결합한다. 제2 파트자임은 제1 파트자임에 인접하여 결합하며, 증폭된 관심 표적 서열에 하이브리드화한다.
표적 G12 및 G12V 사이의 단일 염기 변화를 구별하는 능력에 대하여 PASS 프라이머들과 WE-ARMS 프라이머들이 비교되었다.
3.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임들은, G12 또는 G12V 서열, 및 프라이머를 거쳐 도입된 임의의 불일치와 PASS 프라이머를 거쳐 도입된 임의의 cUS를 특정적으로 표적화하도록 디자인되었다. 하기 서열들에서, 볼드체의 염기들이 관심 표적 서열과 하이브리드화되며, 밑줄친 염기들은 출발 템플레이트에 대하여 불일치된 고유 서열들(야생형 insert i1 및 변종 insert i2)이다. 일부 파트자임 A들은 더 긴(L) 3' 표적 특이적 영역을 가진다. 이탤릭 볼드체의 염기들은 변종 염기들(야생형 또는 돌연변이)을 나타내고, 밑줄친 이탤릭체 염기들은 추가의 불일치된 염기들을 나타낸다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'으로 기재되었다.
SEQ ID NO: 18 파트자임 B KRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCGTAGGCAAGAGTGCCTT
SEQ ID NO: 21 파트자임 A G12_LMi1A/55-P:
CACAATCAGT TGGAGC A G G TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 24 파트자임 A G12V_LMi2A/55-P:
AGACATACTA TGGAGC C G T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 43 파트자임 A G12_MA/55-P:
TGGTAGTTGGAGC A G G TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 44 파트자임 A G12V_MA/55-P:
TGTGGTAGTTGGAGC C G T TGACAACGAGAGGTGCGGT
3.2. 리포터 기질
본 실시예에서 기질은, 5' 말단에서는 6-FAM 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "F"로 표시됨)로, 3' 말단에서는 Iowa Black®FQ 퀀쳐 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "IB"로 표시됨)로 말단 표지되었다. 기질의 절단은 450-490nm(CFX96(BioRad) 상에서의 FAM 여기 파장 범위) 사이에서의 여기로 510-530nm(CFX96(BioRad) 상에서의 FAM 방출 파장 범위) 사이에서 모니터링되었다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다. 본 실시예의 리포터 기질을 5'에서 3'으로 기재된 서열로 아래에 나타내었다.
SEQ ID NO: 25 기질 Sub55-FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
3.3. KRAS DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
인간 gDNA의 시험관내(in vitro) 증폭이, 하기 열거된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머들을 사용하여 수행되었다. G12 특이적인 정방향 프라이머는 US insert 1(i1)을 포함하고, G12V 특이적인 정방향 프라이머는 US insert 2(i2)를 포함하도록, PASS 프라이머들이 디자인되었다. 일부 정방향 프라이머들은 더 긴(L) 표적 특이적 영역을 가진다. 하기 서열들에서, 볼드체의 염기들이 표적 서열과 하이브리드화되고, 밑줄친 염기들은 출발 템플레이트에 대하여 불일치된 고유 서열들이며, 굵고 밑줄친 염기들은 변종 염기이고, 이탤릭체 염기들은 두 표적 모두에 불일치된 추가의 염기(M)를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'으로 기재되었다.
SEQ ID NO: 26 역방향 프라이머 3KRAS:
GGTCCTGCACCAGTAATATGC
SEQ ID NO: 32 정방향 PASS 프라이머 5G12_LM3i1평면:
CTGAAAATGACTGAATATAAAC CACAATCAGT TGGAGC A G G
SEQ ID NO: 40 정방향 PASS 프라이머 5G12V_LM3i2평면:
CTGAAAATGACTGAATATAAAC AGACATACTA TGGAGC C G T
SEQ ID NO: 45 정방향 WE-ARMS 프라이머 5G12_M:
TTGTGGTAGTTGGAGC A G G
SEQ ID NO: 46 정방향 WE-ARMS 프라이머 5G12V_M:
CTTGTGGTAGTTGGAGC C G T
3.4. 표적 서열
K562 세포주로부터 추출된 인간 gDNA가 야생형 유전자의 시험관내 증폭용 템플레이트으로 사용되었고, SW620 세포주로부터 추출된 gDNA가 점 돌연변이 G12V의 시험관내 증폭용으로 사용되었다.
3.5. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭 및 검출
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출이 25μL의 총 반응 부피에서 실행되었다. 반응은 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 수행되었다. 사이클 매개변수는, 95℃에서 2분, 95℃에서 15초 및 64℃에서 60초의 10 사이클(사이클당 -1℃), 95℃에서 15초 및 54℃에서 50초의 40 사이클이었다(데이터는 54℃ 단계에서 수집되었다). 모든 반응은 2회 반복 실시되었고, 40nM의 정방향 프라이머, 100nM의 파트자임 A(표 4에 열거된 조합들), 200nM의 역방향 프라이머(3KRAS), 200nM의 파트자임 B(KRAS_B/55-P), 200nM의 기질(Sub55-FIB), 8mM의 MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNAse 억제제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaqTM HS DNA 중합효소(Bioline)를 포함하였고, K562 또는 SW620 gDNA 템플레이트(50ng), 또는 무표적(NF H2O) 중 어느 하나를 포함하였다.
야생형 및 변종에 대한 프라이머/파트자임 조합
디자인 정방향 프라이머 파트자임 A 템플레이트 반응 종류
G12
디자인3
변종야생형 염기
말단;
불일치 2 염기
변형의 5 		5G12_LM3i1평면 G12_LMi1A/55-P K562 테스트
SW620 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
WE-ARMS
변종야생형 염기
말단;
불일치 2 염기
변형의 5 		5G12_M G12_MA/55-P K562 테스트
SW620 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
교차 반응성 대조군
변종파트자임 A를 가진 야생형 PASS 프라이머		 5G12_LM3i1 평면 G12V_LMi2A/55-P K562 테스트
SW620 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
G12V
디자인 3
변종 (돌연변이) 염기
말단;
불일치 2 염기
변형의 5 		5G12V_LM3i2평면 G12V_LMi2A/55-P SW620 테스트
K562 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
WE-ARMS
변종 (돌연변이) 염기
말단;
불일치 2 염기
변형의 5 		5G12V_M G12V_MA/55-P SW620 테스트
K562 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
교차 반응성 대조군
야생형 파트자임 A를 가진 변종PASS 프라이머 		5G12V_LM3i2평면 G12_LMi1A/55-P SW620 테스트
K562 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
3.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 절단
프라이머-특이적 파트자임을 이용한 검출에 따른 PASS 프라이머 및 WE-ARMS 프라이머를 이용한 증폭의 결과는 표 5에 나타내었다.
표적 디자인 인서트 US 반응형 Ct(평균) ΔCt
G12 PASS 디자인 3
말단에서의 야생형 변종 염기
변종의 불일치 2 염기 5'		 평면 시험군 22.3 >17.7
음성 대조군 Ct 없음
템플레이트 없음
WE-ARMS
말단에서의 야생형 변종 염기
변종의 불일치 2 염기 5'		 n/a 시험군 28.3 >11.7
음성 대조군 Ct 없음
템플레이트 없음
교차 반응성
G12 파트자임을 가진G12V PASS 프라이머		 평면 시험군 Ct 없음 n/a
음성 대조군
템플레이트 없음
G12V PASS 디자인 3
말단에서의 야생형 변종 염기
변종의 불일치 2 염기 5'		 평면 시험군 24.0 15.4
음성 대조군 39.4^
템플레이트 없음 Ct 없음
WE-ARMS
말단에서의 야생형 변종 염기
변종의 불일치 2 염기 5'		 n/a 시험군 21.6 14.8
음성 대조군 36.4
템플레이트 없음 Ct 없음
교차 반응성
G12 파트자임을 가진 G12V PASS 프라이머 		평면 시험군 Ct 없음 n/a
^ 2 반복실험군 중 단 하나만이 신호를 생성시켰으므로, 최종 사이클 값 40이 Ct 값 평균을 구하는데 사용되었다.
N.B. 음성 대조군 샘플에서 Ct 없음이 발생된 경우, 50의 최종 Ct가 ΔCt를 생성시키기 위해 사용되었고 앞에 위치한 부등호 (>)는 ΔCt 가 이 수치보다 더 높을 것으로 예상된다는 것을 의미한다.
야생형 변종에 일치된 PASS 프라이머는 K562 DNA 시험에서 G12 대립형질을 증폭시켰고 이는 야생형 증폭절 및 US1에 일치된 파트자임 A를 포함하는 MNA자임에 의해 검출되었다. 이 야생형 PASS 프라이머/파트자임 계는 야생형 대립형질에 특이적이었고, 음성 대조군 템플레이트 (SW620)가 사용될 때에는 어떠한 신호도 생성되지 않았다. 돌연변이 변종 및 US2에 특이적인 파트자임 A이 야생형 PASS 프라이머와 결합되어 사용될 경우 어떠한 교차 반응성도 보이지 않았다.
야생형 변종에 일치된 WE-ARMS 프라이머는 K562 DNA 시험에서 G12 대립형질을 증폭시켰고 이는 야생형 증폭절에 일치된 파트자임 A를 포함하는 MNA자임에 의해 검출되었다. 이 야생형 ARMS 프라이머/파트자임 계는 야생형 대립형질에 특이적이었고 음성 대조군 템플레이트 (SW620) 가 사용될 때에는 어떠한 신호도 생성되지 않았다.
돌연변이 변종에 일치된 PASS 프라이머는 SW620 DNA 시험에서 G12V 대립형질을 증폭시켰고 이는 돌연변이 증폭절 및 US2에 일치된 파트자임에 의해 검출되었다. 이 돌연변이 PASS 프라이머/파트자임 계는 돌연변이 대립형질을 우선적으로 증폭시키고 검출했으며, 신호는 음성 대조군 템플레이트 (K562)가 사용되었을 때에만 반응에서 늦게 생성되었다. 돌연변이 SW620 및 야생형 K562 DNA 간의 Ct 차이는 15 사이클을 초과했는데 (표 5), 이는 PASS 프라이머 및 일치하는 파트자임 A가 돌연변이 및 야생형 대립형질 간의 식별을 허용함을 입증하는 것이다. 돌연변이 변종 및 US1에 특이적인 파트자임이 야생형 PASS 프라이머와 결합되어 사용될 경우 어떠한 교차 반응성도 보이지 않았다.
돌연변이 변종에 일치된 WE-ARMS 프라이머는 SW620 DNA 시험에서 G12V 대립형질을 증폭시켰고, 이는 돌연변이 증폭절에 일치된 파트자임에 의해 검출되었다. 이 돌연변이 WE-ARMS 프라이머/파트자임 계는 돌연변이 대립형질 및 신호를 우선적으로 증폭시키고 검출했으며, 신호는 음성 대조군 템플레이트 (K562)가 사용되었을 때에만 반응에서 늦게 생성되었다. 돌연변이 SW620 및 야생형 K562 DNA 간의 Ct 차이는 14 사이클을 초과했는데 (표 5), 이는 ARMS 프라이머 및 일치하는 파트자임이 돌연변이 및 야생형 대립형질 간의 식별을 허용함을 입증하는 것이다.
템플레이트 없음 (DNA 없음)이 추가된 경우 어떠한 프라이머/파트자임 쌍을 이용한 증폭도 검출되지 않았다.
이 실시예의 데이터는 기술분야에 잘 알려진 단일 염기 변화 (ARMS)의 검출을 위한 대안적 기술에 비해 동등 또는 우월한 방식으로 실행하는 PASS 프라이머의 수용력을 입증한다.
실시예 4: 서열에서의 단일 염기 변화를 검출하기 위해 MNA자임에 모두 결합된 PASS 프라이머 대 워블-상승된 ARMS (WE-ARMS) 프라이머의 감수성 비교
이 실시예에서, G12V로 언급되는 코돈 12에서의 KRAS 점 돌연변이는 야생형 KRAS 템플레이트의 백그라운드에서 G12V 템플레이트의 연속희석을 사용하여 분석된다. 야생형 백그라운드에서의 1 대 10, 100 및 1000의 희석이 시험되었다.
디자인 3 (도 7) 평면 PASS 프라이머가 G12V 서열의 증폭을 위해 사용된다. 이는 G12V WE-ARMS 프라이머와 비교되었다. PASS 프라이머가 MNA자임 qPCR와 결합되는데 MNA자임은 변종 (돌연변이) 염기 및 불일치된 염기의 보체를 포함하는 증폭된 표적 서열 뿐 아니라 고유한 서열 (cUS)의 보체와 결합하는 제1 파트자임을 포함한다. 제2 파트자임은 관심있는 증폭된 표적 서열 내의 제1 파트자임에 인접해 결합한다. WE-ARMS 프라이머는 MNA자임과 결합하는데 제1 파트자임은 변종 (돌연변이) 염기 및 불일치된 염기의 보체를 포함하는 증폭된 표적 서열에 결합된다. 제2 파트자임은 관심있는 증폭된 표적 서열내 제1 파트자임과 인접하여 결합한다.
PASS 프라이머는 각각 전략의 효과, 선형성 및 감수성을 연구하기 위해 WE-ARMS 프라이머와 비교되었다.
4.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임은 PASS 프라이머의 경우에 있어 cUS 뿐 아니라 프라이머를 통해 도입된 G12V 서열 및 어떠한 불일치를 특이적으로 표적으로 하도록 디자인되었다. 하기의 서열에 있어서 굵게 표시된 염기는 관심있는 표적 서열과 이종교배하며 밑줄 그은 염기는 출발 템플레이트와 관련하여 불일치된 US (인서트 i2)이다. 어떠한 파트자임 A의 것은 더 긴 (L) 표적 특이적 부분을 가진다. 굵은 이탤릭체의 염기는 변종 (돌연변이) 염기를 나타내고 이탤릭체로 밑줄 그은 염기는 추가의 불일치된 염기를 나타낸다. "-P" 는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5' 에서 3'으로 기재된다.
SEQ ID NO: 18 파트자임 B KRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCGTAGGCAAGAGTGCCTT
SEQ ID NO: 24 파트자임 A G12V_LMi2A/55-P:
AGACATACTA TGGAGC C G T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 44 파트자임 A G12V_MA/55-P:
TGTGGTAGTTGGAGC C G T TGACAACGAGAGGTGCGGT
4.2. 리포터 기질
본 실시예에서, 기질은 5' 말단에서 6-FAM 모이어티로 말단이 표지되었고 (하기의 기질의 명칭의 "F"로 표식됨) 3' 말단에서 Iowa Black® FQ 퀀처 (quencher) 모이어티로 말단이 표지되었다 (하기의 기질의 명칭의 “IB”로 표식됨). 기질의 분할이 510-530 nm (CFX96 (BioRad)에서 FAM 방출 파장 범위) 사이에서 450-490 nm 사이 (CFX96 (BioRad)에서 FAM 여기 파장 범위)의 여기상태에서 모니터링되었다. 밑의 경우의 염기는 RNA를 나타내고 위의 경우의 염기는 DNA를 나타낸다. 본 실시예를 위한 리포터 기질은 5' 내지 3'의 서열로 하기에 나타내었다.
SEQ ID NO: 25 기질 Sub55-FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
4.3. KRAS DNA 증폭을 위한 PCR 프라이머
인간 gDNA의 시험관내 증폭은 하기에 리스트된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 이용하여 수행되었다. 하기의 서열에 있어서 굵게 표시된 염기는 관심있는 표적 서열과 이종교배하며 밑줄 그은 염기는 출발 템플레이트와 관련하여 불일치된 US (인서트 i2)이고, 볼드체의 염기는 변종 염기이며, 이탤릭체의 염기는 양 표적에 불일치 (M)된 추가의 염기를 나타낸다. 모든 서열은 5' 에서 3'으로 기재된다.
SEQ ID NO: 26 역방향 프라이머 3KRAS:
GGTCCTGCACCAGTAATATGC
SEQ ID NO: 40 정방향 PASS 프라이머 5G12V_LM3i2평면:
CTGAAAATGACTGAATATAAAC AGACATACTA TGGAGC C G T
SEQ ID NO: 46 정방향 WE-ARMS 프라이머 5G12V_M:
CTTGTGGTAGTTGGAGC C G T
4.4. 표적 서열
SW620 세포주에서 추출된 인간 gDNA는 점 돌연변이 G12V의 시험관내 증폭을 위한 템플레이트로 사용되었다. 표준 검정선은 K562 세포주에서 추출된 야생형 gDNA의 연속적 백그라운드에서 SW620 gDNA를 연속 희석함에 의해 작성되었다.
4.5. 반응 요소: 표적 서열의 증폭 및 정량
표적 서열의 실시간 증폭 및 정량이 25 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 반응은 CFX96™ 실시간 PCR 검출계 (BioRad)에서 실행했다. 사이클 파라미터는 2분간 95℃, 15초 간 95℃의 10 사이클, 그리고 60 초간 64℃ (사이클 당 -1℃), 15초 간 95℃의 40 사이클, 그리고 50 초간 54℃이었다 (데이터는 54℃ 단계에서 수집됨). 모든 반응은 중복하여 실시되었으며 40 nM 정방향 프라이머 및 100 nM 파트자임 A (표 6에 나타난 조합), 200 nM 역방향 프라이머 (3KRAS), 200 nM 파트자임 B (KRAS_B/55-P), 200 nM 기질 (Sub55-FIB), 8 mM MgCl2, 각 dNTP 200 μM, 10 단위 RiboSafe RNAase 억제제 (Bioline), 1x ImmoBuffer (Bioline), MyTaq™ HS DNA 중합효소 (Bioline) 2 단위 및 SW620 gDNA 템플레이트 (50 ng), K562 gDNA 템플레이트 (50 ng), K562 gDNA 템플레이트 (50 ng) 또는 무 (無) 표적 (NF H2O)의 연속 백그라운드에서 1 대 10, 1 대 100, 또는 1 대 1000으로 희석된 SW620 gDNA 템플레이트 (50 ng)를 포함했다.
변종 분석과 조합된 프라이머/파트자임
디자인 정방향 프라이머 파트자임 A
PASS 프라이머 5G12V_LM3i2평면 G12V_LMi2A/55-P
WE-ARMS 프라이머 5G12V_M G12V_MA/55-P
4.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 분할
PASS 및 WE-ARMS 정방향 프라이머는 KRAS 점 돌연변이 (G12V)의 실시간 검출 및 정량을 위한 증폭절을 생성하는데 사용되었다. MNA자임은 돌연변이 서열을 검출하는 데 사용되는 특이 PASS 또는 ARMS 프라이머에 특이적이도록 디자인되었다. 이 반응은, 반응이 G12V에 특이적인 표적 서열 (표 7)을 포함할 때 시간에 따른 형광의 증가를 나타냈다.
G12V 돌연변이를 포함하는 SW620 gDNA 템플레이트는 야생형 (G12) 서열을 포함하는 K562 템플레이트 백그라운드에 10배 연속 희석되었다. gDNA의 연속 희석은 PASS 또는 WE-ARMS 정방향 프라이머에 의해 증폭되었다. gDNA 농도의 로그값을 역치 사이클 (Ct)에 대해 작도하여 PASS 및 WE-ARMS 프라이머 모두를 위한 표준 검정선이 생성되어 결과적으로 선형 플롯을 얻었다. 각 희석 시리즈의 평균 Ct 값은 표 7에 나타내었다. 각 표적에 대한 상관 계수 (R2) 및 반응계수 또한 표 7에 나타내었다. 양 프라이머의 선형성은 PASS 프라이머가 WE-ARMS 프라이머 (78%)에 비해 더 높은 계수 (103%)를 가지는 것으로 비교된다. 최적의 계수는 90 에서 110% 사이의 범위에 위치한다.
양 프라이머 세트 모두 G12 백그라운드에서 1 대 1000으로 희석될 때 G12V 서열을 검출할 수 있었다. PASS 프라이머가 1 대 1000으로 희석된 Ct 뒤의 4.8 Ct였던 신호를 생성하는 반면 WE-ARMS 프라이머를 위해 음성 대조군 K562 템플레이트의 신호는 1 대 1000으로 희석된 샘플의 Ct 뒤에서 단지 1.3 Cts이었는데 이는 이 ARMS 계에서 관찰할 때보다 G12V 돌연변이 DNA를 위한 이 PASS 프라이머/파트자임 계의 더 큰 특이성을 의미한다.
템플레이트 없는 대조군의 형광은 반응동안 증가하지 않았다. 이는 표적-포함 반응에 의해 생성된 형광의 증가가 분할된 리포터 기질보다는 촉매적인 활성이 있는 MNA자임의 표적 의존성 조립 때문이라는 것을 시사한다.
G12V PASS 대 WE-ARMS 프라이머의 Ct 값
템플레이트 PASS 프라이머 WE-ARMS 프라이머
Ct (평균) 50 ng SW620 24.7 22.2
1/10 28.2 26.6
1/100 31.2 30.9
1/1000 34.6 34.1
50 ng K562 39.4^ 35.4
NTC Ct 없음 Ct 없음
DCt 50 ng SW620 대 K562 14.7 13.2
1/1000 대 K562 4.8 1.3
표준선 효율 103% 78%
선형성 (R2) 0.990 0.993
^ 2 반복실험군 중 단 하나만이 신호를 생성시켰으므로, 최종 사이클 값 40이 Ct 값 평균을 구하는데 사용되었다.
실시예 5: 각 서열에서 단일 염기 변화를 식별하기 위한 MNA자임 검출과 결합된 PASS 프라이머를 이용한 KRAS 코돈 12의 멀티플렉스 야생형 및 돌연변이 대립형질
G12V로 언급되는 코돈 12에서의 KRAS 점 돌연면이는 야생형 (G12)과 단 하나의 뉴클레오티드가 다르다. 이 실시예는 멀티플렉스 반응에서의 야생형G12 및 돌연변이 G12V 대립형질의 검출과 조합된다. 분석을 위한 템플레이트는 G12 템플레이트 (K562 DNA) 백그라운드에서의 G12V 템플레이트 (SW480 DNA)의 1 대 10, 100 및 1000의 연속 희석 또는 G12V 템플레이트 (SW480 DNA) 백그라운드에서의 G12 템플레이트 (K562 DNA) 1 대 10, 100 및 1000의 연속 희석을 포함한다.
디자인 3 (도 7)에 기초한 평면 PASS 프라이머 염기는 G12 서열의 특이적 증폭에 사용되었으며 디자인 3 (도 7)에 기초한 루프 PASS 프라이머 염기는 G12V 서열의 특이적 증폭에 사용되었다. 다른 US가 야생형 (US1) 대 돌연변이 (US2)를 위해 PASS 프라이머에 인서트되었다. PASS 프라이머는 MNA자임 qPCR과 조합되는데 G12 증폭절의 검출을 위한 MNA자임은 증폭된 표적 서열 뿐 아니라 고유 서열 1 (cUS1), 야생형 변종 염기 및 불일치된 염기의 보체에 결합하는 제1 파트자임을 포함한다. G12V 증폭절의 검출을 위한 MNA자임은 증폭된 표적 서열 뿐 아니라 고유 서열 2 (cUS2), 야생형 변종 염기 및 불일치된 염기의 보체에 결합하는 제1 파트자임을 포함한다. 두 “제1 파트자임”은 따로따로 야생형 및 돌연변이 증폭절의 축적의 모니터링을 가능하게 하도록 다른 형광단으로 표지된 다른 부분 기질 서열에 결합한다. 제2 파트자임은 관심있는 증폭된 표적 서열 내의 제1 파트자임에 인접해 결합하는데; 이 파트자임은 양쪽을 위한 동일 부분기질 서열에 결합하는 G12 및 G12V MNA자임 모두에 대해 동일하다.
야생형 (G12) 및 돌연변이 (G12V) 서열의 동시적 증폭 및 검출을 결합하는 멀티플렉스 반응에 있어 PASS 프라이머의 사용은 각각의 분석의 감수성 및 특이성에 대한 효과 여부를 알아내기 위해 연구되었다.
5.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임은 G12V 또는 G12 서열 및 PASS 프라이머를 통해 도입된 어떠한 불일치 및 cUS를 특이적으로 표적으로 하도록 디자인되었다. 하기의 서열에 있어서 굵게 표시된 염기는 관심있는 표적 서열과 이종교배하며 밑줄 그은 염기는 출발 템플레이트와 관련하여 불일치된 고유 서열이다. 굵은 이탤릭체의 염기는 변종 (돌연변이) 또는 야생형 염기를 나타내고 이탤릭체로 밑줄 그은 염기는 추가의 불일치된 염기를 나타낸다. "-P" 는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5' 에서 3'으로 기재된다.
SEQ ID NO: 18 파트자임 B KRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCGTAGGCAAGAGTGCCTT
SEQ ID NO: 21 파트자임 A G12_LMi1A/55-P:
CACAATCAGT TGGAGC A G G TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 47 파트자임 A G12V_LMi2A/6-P:
AGACATACTA TGGAGC C G T TGACAACGAGAGGCGTGAT
5.2. 리포터 기질
이 실시예를 위한 리포터 기질이 하기와 같이 5' 에서 3'으로 기재된 서열로 나타나있다. 본 실시예에서, Sub55는 5'말단 (아래의 기질의 명칭에 “Q670”로 나타남) 에서 Quasar 670 모이어티로 말단이 표지되었고 3'말단 (아래의 기질의 명칭에 “B2”로 나타남)에서 Black Hole Quencher® 2 모이어티로 말단이 표지되었으며, Sub55-Q670B2로 지정되었다. Sub55-Q670B2의 분할은 675-690 nm (CFX96 (BioRad)상에서 Quasar 670 방출 파장 범위) 사이에서 620-650 nm 사이 (CFX96 (BioRad)에서 Quasar 670 여기 파장 범위)의 여기상태에서 모니터링되었다. Sub6_55는 5'말단 (아래의 기질의 명칭에 “F”로 나타남) 에서 FAM 모이어티로 말단이 표지되었고 3'말단 (아래의 기질의 명칭에 “IB”로 나타남)에서 Iowa Black® FQ quencher 모이어티로 말단이 표지되었으며, Sub6_55-FIB로 지정되었다. Sub6_55-FIB의 분할은 510-530 nm (CFX96 (BioRad)상에서 FAM 방출 파장 범위) 사이에서 450-490 nm사이 (CFX96 (BioRad)에서 FAM 여기 파장 범위)의 여기상태에서 모니터링되었다. 이 기질들은 양쪽 모두 (RNA 염기의 3')에게 통상적인 하나의 팔 (arm)을 가지며 이는 양쪽 MNA자임 모두에 통상적인 파트자임에 결합한다. 제2 기질 팔 (RNA 염기의 5')은 야생형 또는 돌연변이 PASS 프라이머에 의한 증폭에서 유래되는 서열을 검출하는 파트자임에 특이적으로 결합한다. 밑의 경우의 염기는 RNA를 나타내고 위의 경우의 염기는 DNA를 나타낸다. 본 실시예의 리포터 기질은 5' 에서 3'의 방향으로 서열과 함께 하기에 나타나있다.
SEQ ID NO: 25 기질 Sub55-Q670B2:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO: 48 기질 Sub6_55-FIB:
ATCACGCCTCguCCCCAGCTC
5.3. KRAS DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
본 실시예를 위한 표적 서열이 하기에 리스트된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 이용한 인간 gDNA의 시험관내 증폭에 의하여 생성되었다. 하기의 서열에 있어서 굵게 표시된 염기는 표적 서열과 이종교배하며, 밑줄 그은 염기는 출발 템플레이트와 관련하여 불일치된 고유 서열 (G12 인세트 i1 및 G12V 인서트 i2)이고, 볼드체로 밑줄 그은 염기는 두 표적 모두에 불일치된 (M) 추가 염기를 나타낸다. 모든 서열은 5' 에서 3'으로 기재된다.
SEQ ID NO: 26 역방향 프라이머 3KRAS:
GGTCCTGCACCAGTAATATGC
SEQ ID NO: 49 정방향 PASS 프라이머 5G12_LM3i1L평면:
CTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC CACAATCAGT TGGAGC A G G
SEQ ID NO: 50 정방향 PASS 프라이머 5G12V_LM3i2L루프:
GACTGAATATAAACTTGTGGTAGT AGACATACTA TGGAGC C G T
5.4. 표적 서열
K562 세포주에서 추출된 인간 gDNA는 야생형 KRAS G12의 시험관내 증폭을 위한템플레이트로 사용되었다. 야생형 gDNA, SW620의 연속적 백그라운드에서 K562를 연속희석하여 표준 검정선이 작성되었다. SW620 세포주에서 추출된 인간 gDNA는 점 돌연변이 G12V의 시험관내 증폭을 위한 템플레이트로 사용되었다. 야생형 gDNA, K562의 연속적 백그라운드에서 SW620 gDNA를 연속희석하여 표준 검정선이 작성되었다.
5.5. 반응 요소: 멀티플렉스 증폭 및 표적 서열의 정량
표적 서열의 실시간 증폭 및 정량은 25 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 반응은 CFX96™ 실시간 PCR 검출계 (BioRad)에서 실행되었다. 사이클 파라미터는 2분간 95℃, 15초 간 95℃의 10 사이클, 그리고 60 초간 64℃ (사이클 당 -1℃), 15초 간 95℃의 50 사이클, 그리고 50 초간 54℃이었다 (데이터는 54℃ 단계에서 수집됨). 반응은 중복하여 실시했으며 40 nM 정방향 프라이머 A (5G12_LM3i1L 평면 및 5G12V_LM3i2L 루프), 100 nM 각 파트자임 A (G12_LMi1A/55-P 및 G12V_LMi2A/6-P), 및 200 nM 각 기질 (Sub6_55-FIB 및 Sub55-Q670B2)을 포함했다. 400 nM 역방향 프라이머 (3KRAS) 뿐 아니라, 400 nM 파트자임 B (KRAS_B/55-P), 8 mM MgCl2, 200 μM 각 dNTP, 10 단위 RiboSafe RNAase 억제제 (Bioline), 1x ImmoBuffer (Bioline), 2 단위 MyTaq™ HS DNA 중합효소 (Bioline) 그리고 SW480 또는 K562 gDNA 템플레이트 (50 ng), K562 gDNA 템플레이트 (50 ng)의 연속된 백그라운드에서 1 대 10, 1 대 100, 또는 1 대 1000으로 희석된 SW620 gDNA 템플레이트 또는 SW480 gDNA 템플레이트 또는 무 (無) 표적 (NF H2O)의 연속된 백그라운드에서 1 대 10, 1 대 100, 또는 1 대 1000으로 희석된 K562 gDNA 템플레이트를 포함했다.
5.6. 결과: 표적의 멀티플렉스 증폭 및 리포터 기질의 분할
G12 및 G12V의 증폭 및 검출은 대립형질의 각각에 특이적인 PASS 프라이머 및 파트자임 A를 이용하여 동시에 일어났다. DNA 샘플은 K562 (G12) 백그라운드 내 SW480 (G12V) 또는 SW480 (G12V) 백그라운드 내 K562 (G12)로서 10배 연속 희석되었다. 표 8에 나타난 Ct 값은 2회 반복 (n=2) 또는 4회 반복 (n=4) 반응 결과의 평균이다.
G12 또는 G12V를 위한 양 PASS 프라이머 세트는 다른 템플레이트의 백그라운드에서 1 내 1000으로 희석될 때 특이적 서열을 검출하는 데 민감했다. 멀티플렉스 분석은 음성 대조군 반응에 의해 생성된 신호 없음과 함께 야생형 및 변종 모두에 대해 높게 특이적이었다 (단 G12V (SW480) 또는 G12 (K562) 에 특이적인 템플레이트가 각각 존재할 때 (표 8)).
템플레이트 없는 대조군의 형광은 DNA 표적-포함 반응에서 시험된 모든 조합에 대해 더 낮았으며, 반응을 통해 증가하지 않았다. 이는 표적-포함 반응에 의해 생성된 형광의 증가가 분할된 리포터 기질보다는 촉매적인 활성이 있는 MNA자임의 표적 의존성 조립 때문이라는 것을 시사한다.
야생형 (G12) 및 변종 (G12V) PASS 프라이머 멀티플렉스의 Ct 값
템플레이트 G12
(Q670)		 G12V
(FAM)
G12 백그라운드에 희석된 G12V 템플레이트 1/10 (SW480/K562) (n=2) 21.1 27.9
1/100 (SW480/K562) (n=2) 20.9 33.9
1/1000 (SW480/K562) (n=2) 20.8 40.1
G12V 백그라운드에 희석된 G12 템플레이트 1/10 (K562/SW480) (n=2) 24.7 22.4
1/100 (K562/SW480) (n=2) 29.3 22.2
1/1000 (K562/SW480) (n=2) 36.8 22.1
대조군 반응 50 ng K562 (n=4) 20.8 Ct 없음
50 ng SW620 (n=4) Ct 없음 22.5
NTC (n=4) Ct 없음 Ct 없음
이 실시예는 멀티플렉스 반응에서의 멀티플 고유 서열을 입증한다. 이는 결과적으로 원래 템플레이트가 단일 염기의 차이를 단지 포함함에도 불구하고 파트자임 A에 결합된 부위에 있어 매우 다른 서열을 포함하는 증폭절의 생성을 야기한다. PASS 프라이머/일치하는 파트자임 전략은 상기 전략이 밀접하게 관련된 표적으로부터의 증폭절의 서열에서의 차이를 크게 증가시키므로 더 큰 멀티플렉스를 허용한다.
실시예 6: PASS 프라이머 및 조합의 다른 고유 서열 인서트 대 서열에서의 단일 염기 변화를 검출하기 위한 MNA자임과의 비교
PASS 프라이머는 단일 염기가 다른 두 서열 간을 식별하도록 디자인될 수 있어 표적-특이적 3' 말단 (S2)가 변종 염기 (도 2 (i) 및 (ii) 상부)를 포함하게 된다. 또한 US는 민감성 및 특이성 (도 3)의 다른 레벨을 부가하는 각 변종에 따라 다를 수 있다.
이 실시예에서, 세개의 다른 고유 서열은 G12V로 언급되는 코돈 12의 KRAS 점 돌연변이 및 G12인 야생형 KRAS 서열을 위한 PASS 프라이머에 인서트되었다. 루프 또는 평면 형성의 US를 포함하는 PASS 프라이머는 G12V 또는 G12 서열에 특이적이도록 디자인되었고, 특이적 프라이머는 또한 US 인서트, i1, i2, i3 또는 i3a를 포함했다. 돌연변이 및 야생형을 위한 염기는 3' 말단에서 S2에 위치하였다 (표 7 디자인 1).
PASS 프라이머는 MNA자임 qPCR과 조합되는데 MNA자임은 각 변종 염기 (야생형 또는 돌연변이)를 위해 맞춤된 증폭된 표적 서열 뿐 아니라 고유 서열 (cUS)의 보체와 결합하는 제1 파트자임을 포함한다. 제2 파트자임은 관심 표적 서열의 제1 파트자임에 인접하여 결합한다.
PASS 프라이머 및 파트자임은 각각의 US에 있어 다양한 시나리오가 KRAS 야생형 G12 또는 점 돌연변이 G12V을 위한 반응 효율성 및 특이성을 향상시키는지를 알아내기 위해 디자인되었다.
6.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임은 KRAS 유전자 플러스 PASS 프라이머를 통해 도입된 어떠한 cUS의 야생형 G12 또는 돌연변이 G12V 대립형질을 특이적으로 표적으로 하도록 디자인되었다. 하기의 서열에 있어서 굵게 표시된 염기는 관심있는 표적 서열에 이종교배하며 밑줄 친 염기는 출발 템플레이트와 관련하여 불일치된 고유 시퀀스 (인서트 i1, i2 또는 i3)이다. 볼드 및 이탤릭체의 염기는 변종 염기를 나타낸다. "-P" 는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5' 에서 3'으로 기재된다.
SEQ ID NO: 18 파트자임 B KRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCGTAGGCAAGAGTGCCTT
SEQ ID NO: 19 파트자임 A G12_i1A/55-P:
CACAATCAGT GAGCTG G TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 51 파트자임 A G12_i2A/55-P:
AGACATACTA GAGCTG G TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 52 파트자임 A G12_i3A/55-P:
CGTTGGCTAC GAGCTG G TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 53 파트자임 A G12V_i1A/55-P:
CACAATCAGT GAGCTG T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 22 파트자임 A G12V_i2A/55-P:
AGACATACTA GAGCTG T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 54 파트자임 A G12V_i3A/55-P:
CGTTGGCTAC GAGCTG T TGACAACGAGAGGTGCGGT
6.2. 리포터 기질
본 실시예에서, 기질은 5' 말단 (하기의 기질의 명칭의 "F"로 표식됨)에서 6-FAM 모이어티로 그리고 3' 말단 (하기의 기질의 명칭의 "IB"로 표식됨)에서 Iowa Black® FQ 퀀처 (quencher) 모이어티로 말단이 표지되었다. 기질의 분할은 510-530 nm (CFX96 (BioRad)에서 FAM 방출 파장 범위) 사이에서 450-490 nm 사이 (CFX96 (BioRad)에서 FAM 여기 파장 범위)의 여기상태에서 모니터링되었다. 밑의 경우의 염기는 RNA를 나타내고 위의 경우의 염기는 DNA를 나타낸다. 본 실시예를 위한 리포터 기질은 5' 내지 3'의 서열로 하기에 나타나고 있다.
SEQ ID NO: 25 기질 Sub55-FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
6.3. KRAS DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
인간 gDNA의 KRAS 유전자의 시험관내 증폭은 하기에 리스트된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 이용하여 수행되었다. PASS 프라이머는 야생형에 특이적인 정방향 프라이머가 US 인서트, i1, i2 i3 또는 i3a을 포함하고 돌연변이에 특이적인 정방향 프라이머가 US 인서트, i1, i2 또는 i3을 포함하도록 디자인된다. 하기의 서열에 있어서 굵게 표시된 염기는 관심있는 표적 서열과 이종교배하며 밑줄 그은 염기는 출발 템플레이트와 관련하여 불일치된 고유 서열이고, 볼드체로 밑줄 그은 염기는 변종 염기이다. 모든 서열은 5' 에서 3'으로 기재된다.
SEQ ID NO: 26 역방향 프라이머 3KRAS:
GGTCCTGCACCAGTAATATGC
SEQ ID NO: 27 정방향 PASS 프라이머 5G12_1i1루프:
ATATAAACTTGTGGTAGTTG CACAATCAGT GAGCTG G
SEQ ID NO: 28 정방향 PASS 프라이머 5G12_1i1평면:
GAAAATGACTGAATATAAACTT CACAATCAGT GAGCTG G
SEQ ID NO: 55 정방향 PASS 프라이머 5G12_1i2루프:
ATATAAACTTGTGGTAGTTG AGACATACTA GAGCTG G
SEQ ID NO: 56 정방향 PASS 프라이머 5G12_1i2평면:
GAAAATGACTGAATATAAACTT AGACATACTA GAGCTG G
SEQ ID NO: 57 정방향 PASS 프라이머 5G12_1i3루프:
ATATAAACTTGTGGTAGTTG CGTTGGCTAC GAGCTG G
SEQ ID NO: 58 정방향 PASS 프라이머 5G12_1i3a평면:
GAAAATGACTGAATATAAACTT ACGTTGGCTAC GAGCTG G
SEQ ID NO: 59 정방향 PASS 프라이머 5G12V_1i1루프:
ATATAAACTTGTGGTAGTTG CACAATCAGT GAGCTG T
SEQ ID NO: 60 정방향 PASS 프라이머 5G12V_1i1평면:
GAAAATGACTGAATATAAACTT CACAATCAGT GAGCTG T
SEQ ID NO: 35 정방향 PASS 프라이머 5G12V_1i2루프:
ATATAAACTTGTGGTAGTTG AGACATACTA GAGCTG T
SEQ ID NO: 36 정방향 PASS 프라이머 5G12V_1i2평면:
GAAAATGACTGAATATAAACTT AGACATACTA GAGCTG T
SEQ ID NO: 61 정방향 PASS 프라이머 5G12V_1i3루프:
ATATAAACTTGTGGTAGTTG CGTTGGCTAC GAGCTG T
SEQ ID NO: 62 정방향 PASS 프라이머 5G12V_1i3평면:
GAAAATGACTGAATATAAACTT CGTTGGCTAC GAGCTG T
6.4. 표적 서열
K562 세포주에서 추출된 인간 gDNA이 야생형 KRAS 유전자의 시험관내 증폭을 위한 템플레이트로 사용되었고 SW620 세포주에서 추출된 인간 gDNA이 점 돌연변이 G12V를 포함하는 KRAS의 시험관내 증폭을 위해 사용되었다.
6.5. 반응 요소: 증폭 및 표적 서열의 검출
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출이 총 반응 부피 25 μL에서 수행되었다. 반응은 CFX96™ 실시간 PCR 검출계 (BioRad)에서 실행되었다. 사이클 파라미터는 2분간 95℃, 15초 동안 95℃의 10 사이클, 그리고 60초간 64℃ (사이클 당 -1℃), 15 초간 95℃의 40 사이클 및 50 초간 54℃이었다 (데이터는 54℃ 단계에서 수집됨). 모든 반응은 중복하여 실시했으며 40 nM 정방향 프라이머 및 100 nM 파트자임 A (표 9에 나타난 조합), 200 nM 역방향 프라이머 (3KRAS), 200 nM 파트자임 B (KRAS_B/55-P), 200 nM 기질 (Sub55-FIB), 8 mM MgCl2, 200 μM 각 dNTP, 10 단위 RiboSafeRNAase 억제제 (Bioline), 1x ImmoBuffer (Bioline), 2 단위 MyTaq™ HS DNA 중합효소 (Bioline) 및 K562 또는 SW620 gDNA 템플레이트 (50 ng) 또는 무 표적 (NF H2O)을 포함했다.
야생형 및 돌연변이를 위한 프라이머 및 파트자임 조합
표적 고유 서열 정방향 프라이머 파트자임 A 템플레이트 반응 유형
야생형
G12		 인서트 1 5G12_1i1루프 G12_i1A/55-P K562 시험군
SW620 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
5G12_1i1평면 K562 시험군
SW620 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
인서트 2 5G12_1i2루프 G12_i2A/55-P K562 시험군
SW620 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
5G12_1i2평면 K562 시험군
SW620 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
인서트 3 또는 3a 5G12_1i3루프 G12_i3A/55-P K562 시험군
SW620 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
5G12_1i3a평면 K562 시험군
SW620 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
돌연변이
G12V		 인서트 1 5G12V_1i1루프 G12V_i1A/55-P SW620 시험군
K562 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
5G12V_1i1평면 SW620 시험군
K562 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
인서트 2 5G12V_1i2루프 G12V_i2A/55-P SW620 시험군
K562 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
5G12V_1i2평면 SW620 시험군
K562 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
인서트 3 5G12V_1i3루프 G12V_i3A/55-P SW620 시험군
K562 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
5G12V_1i3평면 SW620 시험군
K562 음성 대조군
H20 템플레이트 없음
6.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 분할
다른 US를 포함하는 PASS 프라이머가 KRAS 야생형 및 점 돌연변이 (G12V)의 실시간 검출을 위한 증폭절을 생성하는 데 사용되었다. 이 반응은 사용된 표적 서열이 PCR로 증폭된 시험군 인간 gDNA (각각 K562 및 SW620)일 때 시간에 따라 형광의 증가를 보였다. 템플레이트 없는 대조군의 형광은 DNA 표적-포함 반응에서의 그것보다 더 낮았으며 반응 동안 증가하지 않았다. 이는 표적-포함 반응에서 생성된 형광의 증가가 분할된 리포터 기질보다는 촉매적인 활성이 있는 MNA자임의 표적 의존성 조립 때문이라는 것을 시사한다.
US 인서트, i1, i2, i3 (루프) 또는 i3a (평면)을 포함하는 야생형 G12 PASS 프라이머 (평면 또는 루프)를 포함하는 반응에서 “시험군” DNA (K562)의 Ct 값은 성공적인 K562에서의 야생형 KRAS 대립형질의 증폭 및 검출을 시사했는데, 음성 대조군 (SW620)의 신호 결여는 돌연변이 대립형질이 이러한 계에서 검출되지 않았음을 시사했다. US 인서트, i3 또는 i3a를 포함하는 PASS 프라이머 분석 (루프 및 평면)은 US 인서트, i1 및 i2 보다 더 낮은 Ct를 가졌다 (표 10).
야생형 및 돌연변이를 위한 PASS 프라이머 및 파트자임 조합의 Ct 값
표적 디자인 US 삽입 반응 유형 Ct (평균) 시험군 ΔCt
야생형G12
인서트 1		 루프 시험군 24.8 n/a
음성 대조군 Ct 없음
템플레이트 없음
평면 시험군 24.1 n/a
음성 대조군 Ct 없음
No 템플레이트
인서트 2 루프 시험군 25.4 n/a
음성 대조군 Ct 없음
템플레이트 없음
평면 시험군 26.6 n/a
음성 대조군 Ct 없음
템플레이트 없음
인서트 3 또는 3a 루프 시험군 22.7 n/a
음성 대조군 Ct 없음
템플레이트 없음
평면 시험군 23.7 n/a
음성 대조군 Ct 없음
템플레이트 없음
돌연변이G12V
인서트 1		 루프 시험군 21.5 12.6
음성 대조군 34.1
템플레이트 없음 Ct 없음
평면 시험군 21.5 11.2
음성 대조군 32.7
템플레이트 없음 Ct 없음
인서트 2 루프 시험군 22.7 13.5
음성 대조군 36.2
템플레이트 없음 Ct 없음
평면 시험군 22.5 13.9
음성 대조군 36.4
템플레이트 없음 Ct 없음
인서트 3 루프 시험군 20.8 12.7
음성 대조군 33.5
템플레이트 없음 Ct 없음
평면 시험군 21.0 12.8
음성 대조군 33.8
템플레이트 없음 Ct 없음
US 인서트인 i1, i2 또는 i3를 포함하는 G12V PASS 프라이머(평면형(평면) 또는 고리형(루프))를 포함하는 반응에 있어서, "테스트" DNA (SW620)에 대한 Ct 값은 SW620에서 돌연변이 KRAS 대립형질의 성공적인 증폭 및 검출을 나타낸다. 야생형 템플레이트(wild type template)이 사용되었을 때 어떤 백그라운드 신호(background signal)가 만들어졌음을 나타내는 표 10에서 보여지는 바와 같이, 음성 대조군 (K562)에 대한 신호는 역치 Ct값에 도달하였다. 그러나, △Ct 값은 돌연변이 서열과 야생형 서열의 명백한 차이를 허용할 수 있을 정도로 충분히 높았다. US 인서트 i3를 포함하는 PASS 프라이머 분석 (고리형 및 평면형)은 US 인서트 i1 및 i2에 비해 약간 낮은 Ct 값들을 가졌으나(표 10), △Ct 값은 US 인서트 i2와 함께 더 큰 값을 나타내었다.
대체로, 3개의 US 인서트들은 모두 야생형 서열과 돌연변이 KRAS 표적 서열의 분석에 적합하였다. 야생형의 분석에서 더 큰 범위의 Ct 값들이 얻어지는 것으로 보아 돌연변이보다 약간 더 다양성이 관찰되는 결과상의 차이가 있었다. 양쪽 모두의 분석에서 US 인서트 i2의 편입이 보다 높은 Ct 값을 야기한 반면, US 인서트 i3의 편입은 보다 낮은 Ct 값을 야기하였다. 그러나, 실험은 여러 가지 다른 종류의 특이 인서트 서열이 동일한 표적 또는 다른 표적에 대한 증폭 및 검출에 사용될 수 있음을 보여준다. 그와 같이, 특이 서열은 또한 다양한 종류의 분석적 검정에 투입될 수 있으므로 범용 특이 서열(universal unique sequences)로서 고려될 수 있다.
실시예 7: 상보 가닥의 증폭을 위해 디자인된 PASS 프라이머의 민감도 및 특이도와 KRAS의 표준 및 빠른 열순환 조건 하에서 역상보 가닥을 증폭하기 위해 디자인된 PASS 프라이머를 이용하여 얻어진 민감도 및 특이도의 비교
이전 실시예에서, G12V로 언급되는 코돈 12에서의 KRAS 점 돌연변이를 특이적으로 증폭하기 위해 디자인된 PASS 프라이머는 상보 가닥을 표적으로 하였다. 이것은 PASS 프라이머의 마지막 서열이 티민(T)으로 끝나고, 야생형 KRAS 서열과 T:C 염기쌍 오류(mismatch)를 갖게 되는 것을 야기하였다. 만약 PASS 프라이머가 역방향 가닥을 표적으로 하도록 디자인된다면, PASS 프라이머는 A로 끝나면서 야생형에 대한 오류를 A:G로 변경할 것이다.
본 실시예에서, G12V의 상보 가닥을 증폭하는 분석은 이전 실시예에서 건장하고 특이적으로 작용하는 것을 보여준 PASS 프라이머(5G12V_LM3i2평면형, SEQ ID NO. 40)를 사용하였고, 이는 G12V의 역상보 가닥(rcG12V)(5rcG12V_LM3i1고리형, SEQ ID No. 66)을 증폭하는 것으로서 rcG12V의 증폭을 위한 건장하고 민감한 PASS 프라이머를 제공하는 분석과 비교된다. PASS 프라이머는 MNA자임(MNAzyme) qPCR과 결합하는데, MNA자임은 변종(돌연변이) 염기 및 염기쌍 오류가 발생된 염기의 보체를 포함하는 증폭된 표적 서열뿐만 아니라 특이서열의 보체(complement) (cUS)와 결합하는 첫번째 파트자임을 포함한다. 두번째 파트자임은 흥미를 끄는 증폭된 표적 서열 내에서 첫번째 파트자임에 인접하여 결합한다. 나아가 빠른 열순환 프로토콜은 특이도에 대한 영향을 평가하는 이전 실험에서 사용되어 온 표준 프로토콜과 비교된다.
상보 또는 역상보 가닥은, 모두 디자인 3(도 7)의 포맷이 인서트되었는데, 이들의 증폭을 위한 PASS 프라이머는 각 계획의 효율성, 선형성(linearity) 및 민감도를 연구하기 위해 2개의 열순환 조건을 이용하여 비교되었다.
7.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임은 G12V의 보체 또는 역보체(rc)와 염기쌍 오류와 PASS 프라이머에 의해 도입된 cUS를 특이적으로 표적으로 하도록 디자인되었다. 다음의 서열에서, 볼드체의 염기들은 관심의 대상이 되는 표적 서열과 함께 잡종화하며, 밑줄로 표시된 염기들은 시작 템플레이트(starting template)에 대해 염기쌍 오류가 일어난 특이 서열들(G12V 인서트 i2 및 rcG12V 인서트 i1)이다. 파트자임 A는 더 긴(L) 표적 특이 영역을 갖는다. 이탤릭체 볼드체의 염기들은 변종 (돌연변이) 염기를 나타내고, 밑줄 및 이탤릭체의 염기들은 추가로 염기쌍 오류가 발생된 염기들을 나타낸다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 가리킨다. 모든 서열들은 5'에서 3'로 기재되었다.
SEQ ID NO: 18 파트자임 B KRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCGTAGGCAAGAGTGCCTT
SEQ ID NO: 24 파트자임 A G12V_LMi2A/55-P:
AGACATACTA TGGAGC C G T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 63 파트자임 B rcKRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCTCCAACTACCACAAGTTT
SEQ ID NO: 64 파트자임 A rcG12V_LMi1A/55-P:
ACAATCAGT CCTACGC G A A CAACAACGAGAGGTGCGGT
7.2. 리포터 기질
본 실시예에서, 기질은 5'말단에서 6-FAM 부위로 말단 표지되고(하기 기질의 명칭에서 "F"로 표시됨), 3'말단에서 아이오와 블랙®FQ (Iowa Black®FQ) 퀀처 부위로 말단 표지되었다(하기 기질의 명칭에서 "IB"로 표시됨). 기질의 분열(cleavage)은 510-530 nm 사이(CFX96 (BioRad사)에서 FAM 방출 파장 범위)에서 관측되었고, 기질의 여기(excitation)이 450-490 nm 사이(CFX96 (BioRad사)에서 FAM 여기 파장 범위)에서 관측되었다. 본 실시예를 위한 리포터 기질은 하기에서 보여지는 5'에서 3'까지의 서열과 같다. 소문자의 염기는 RNA를 나타내고, 대문자의 염기는 DNA를 나타낸다.
SEQ ID NO: 25 기질 Sub55-FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
7.3. KRAS DNA 증폭을 위한 PCR 프라이머
하기에 기재된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 이용하여 인간 gDNA의 생체외 증폭이 수행되었다. 하기의 서열에서, 볼드체의 염기는 표적 서열과 잡종화하고, 밑줄로 표시된 염기들은 시작 템플레이트에 대해 염기쌍 오류가 일어난 특이 서열들(G12V 인서트 i2 및 rcG12V 인서트 i1)이고, 밑줄친 볼드체의 염기들은 변종 염기를 나타내고, 이탤릭체의 염기들은 표적들 모두에 염기쌍 오류가 발생된(M) 추가적인 염기들을 나타낸다. 모든 서열들은 5'에서 3'로 기재되었다.
SEQ ID NO: 26 역방향 프라이머 3KRAS_3:
GGTCCTGCACCAGTAATATGC
SEQ ID NO: 87 정방향 PASS 프라이머 5G12V_LM4i2평면형:
CTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC AGACATACTA TGGAGC C G T
SEQ ID NO: 65 역방향 프라이머 3rcKRAS:
TATTAAAAGGTACTGGTGGAGTA
SEQ ID NO: 66 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_LM3i1고리형:
CTGTATCGTCAAGGCACTCTT CACAATCAGT CCTACGC G A A
7.4. 표적 서열
SW480 세포주로부터 추출된 인간 gDNA가 점 돌연변이 G12V의 생체외 증폭의 템플레이트로 사용되었다. K562 세포주로부터 추출된 야생형 gDNA을 일정한 배경(constant background)으로 하여 연속으로 SW480을 희석함으로써 검량선이 작성되었다. 세포주 Calu1, A549, MDA-MB231 및 HCT116로부터 추출된 인간 gDNA가 다른 KRAS 변종인 G12C, G12S, G13D 및 G13D에 대한 음성 대조군 템플레이트로 각각 사용되었다.
7.5. 반응 요소: 표적서열의 증폭 및 정량
총 반응 부피를 25 ㎕로 하여 표적 서열의 실시간 증폭 및 정량이 수행되었다. 반응은 CFX96TM 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad사)에서 수행되었다. 다음 둘 중 하나를 순환변수(cycling parameters)로 하였다;
1) "표준" 열순환; 95℃에서 2분간 놓아 두는 단계, 95℃에서 15초 둔 후 64℃에서 60초간 놓아 두는 단계를 10사이클(사이클당 1℃씩 감소), 95℃에서 15초간 둔 후 54℃에서 50초간 놓아 두는 단계를 40사이클(54℃ 단계에서 자료 수집) 또는
2) "빠른" 열순환; 95℃에서 2분간 놓아 두는 단계, 95℃에서 5초 둔 후 64℃에서 20초간 놓아 두는 단계를 10사이클(사이클당 1℃씩 감소), 95℃에서 15초간 둔 후 54℃에서 20초간 놓아 두는 단계를 40사이클(54℃ 단계에서 자료 수집).
반응은 표 11의 프라이머 및 파트자임으로 구성되었다. 각각의 반응 조건 세트는 2번 실험되었고, 40 nM의 정방향 프라이머, 200 nM의 역방향 프라이머, 100 nM의 파트자임 A, 200 nM의 파트자임 B, 200 nM의 기질(Sub55-FIB), 8 mM의 MgCl2, 각 dNTP 200 μM, 10 단위의 리보세이프 RNase 억제제(RiboSafe RNase inhibitor)(Bioline사), 1x ImmoBuffer(Bioline사), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(polymerase)(Bioline사) 및 SW480 gDNA 템플레이트(35 ng)이나 K562 gDNA 템플레이트 또는 음성 대조군인 K562, Calu1, A549, MDA-MB231 및 HCT-116(35 ng)의 gDNA를 일정한 배경으로 하여 10분의 1, 100분의 1, 또는 1000분의 1로 희석된 SW480 gDNA 템플레이트 또는 표적이 없는 것(NF H2O) 중 하나를 포함하였다.
변종 분석을 위한 프라이머/파트자임의 조합
분석 파트자임 A 파트자임 B 프라이머
G12V G12V_LMi2A/55-P KRAS_B/55-P 5G12V_LM4i2평면형 및 3KRAS
rcG12V rcG12V_LMi1A/55-P rcKRAS_B/55-P 5rcG12V_LM3i1고리형 및 3rcKRAS
7.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 분열
모든 반응에서 템플레이트가 없는 대조군(control)의 형광은 DNA 표적을 포함하는 반응보다 낮은 정도를 나타냈다. 이것은 표적을 포함하는 반응에서 생성된 형광의 증가가 범용(universal) 리포터 기질을 쪼개는 촉매반응적으로 활성화된 MNA자임의 표적에 의존적인 조합에 기인하는 것을 보여준다.
상보 가닥 또는 역상보 가닥의 둘 중 어느 하나를 증폭하기 위해 디자인된 정방향 PASS 프라이머는 KRAS 점 돌연변이 G12V의 실시간 검출 및 정량을 위한 증폭절을 생산하는 데 사용되었다. MNA자임은 상보 또는 역상보 가닥 중 어느 하나 및 돌연변이 서열을 검출하기 위해 사용된 특정 PASS 프라이머에 의해 도입된 관련 US에 특이적이도록 디자인되었다. 이 반응은 G12V에 특이적인 표적 서열을 포함하는 반응에서 시간에 대한 형광의 증가를 보여주었다(표 12).
G12V 대 rcG12V PASS 프라이머 분석에 대한 Ct 값
G12V rcG12V
템플레이트 Ct(평균) SW480 (G12V)로부터의 △Ct Ct(평균) SW480 (G12V)로부터의 △Ct
표준 열순환
SW480 (G12V) 23.1 20.3
10분의 1 26.1 23.7
100분의 1 29.3 27.2
1000분의 1 32.4 30.9
K562 (WT) 35.7 12.6 39.7 19.4
NTC Ct값 없음 Ct값 없음 -
Calu1 (G12C) 34.3 11.3 48.5^ 28.2
A549 (G12S) 37.7 14.6 Ct값 없음 -
MB231 (G13D) 40.8 17.8 42.9 ^ 22.6
HCT116 (G13D) 37.7 14.7 Ct값 없음
효율성 109% 91.4%
선형성 0.999 0.992
빠른 열순환
SW480 (G12V) 25.1 22.8
10분의 1 28.2 26.3
100분의 1 31.4 29.5
1000분의 1 34.9 24.5
K562 (WT) 39.6 14.5 45.4 22.6
NTC Ct값 없음 - Ct값 없음 -
Calu1 (G12C) 38.2 13.1 Ct값 없음 -
A549 (G12S) 41.4 16.3 Ct값 없음 -
MB231 (G13D) 43.9 18.8 Ct값 없음 -
HCT116 (G13D) 42.1 16.9 48.1^ 25.3
효율성 103% 85%
선형성 0.997 0.989
^ 2개의 복제 중 오직 하나만이 신호를 제조함; Ct값은 평균을 내지 않음.
G12V에 특이적인 SW480 DNA 템플레이트는 야생형 K562 템플레이트를 배경으로 연속적으로 10배로 희석되었다. DNA의 연속적인 희석액은 보체 또는 역보체 정방향 PASS 프라이머 중 어느 하나에 의해 증폭되었다. 두 프라이머 세트는 모두 야생형 템플레이트를 배경으로 1000분의 1로 희석되었을 때 G12V를 검출할 수 있었다. 결과적으로 선형 플롯(plot)을 야기하는 역치 사이클에 대한 DNA 농도의 로그를 플로팅하는 것에 의해 두 PASS 프라이머에 대한 표준 곡선(standard curve)이 생성되었고, 각 희석액의 Ct값은 표 12에서 보여지는 바와 같다. 표에서 보여지는 Ct값은 똑같은 반응(duplicate reactions)에서 얻은 결과의 평균값이다. 또한, 상관계수(R2), 및 각 표적에 대한 반응 효율성은 표 12에 나타내었다.
표준 열순환 조건 하에서, 탑 스탠다드(top standard)(35 ng)와 음성 대조군인 야생형(K562), G12C(Calu1), G12S(A549) 및 G13D(MDA-MB231 및 HCT116)의 신호 사이의 상보 가닥에 대해 디자인된 PASS 프라이머에 대한 Ct값의 차이(△Ct)는 역상보 가닥(rcG12V)에 대해 디자인된 PASS 프라이머의 Ct값의 차이보다 작았다. 또한 rcG12V 분석에 대한 일부 음성 대조군은 Ct 값이 나오지 않았다(표 12). 이것은 rcG12V PASS 프라이머 분석이 이러한 실험적 조건 하에서 보다 더 특이적일 수 있다는 것을 나타낸다.
G12V 및 rcG12V 분석 모두에서 표준 열순환 조건과 비교되는 빠른 열순환 조건 하에서 Ct값이 생성되었을 때, 보다 짧은 사이클링 시간이 이러한 실험적 조건들 하에서 양쪽의 반응의 특이도를 향상시킴을 나타내는 △Ct의 증가가 있다(표 12). 그러나, rcG12V 분석에서 보다 빠른 사이클링 시간은 효율성 및 반응의 선형성을 감소시켰다(표 12).
G12V의 증폭 및 검출을 위한 보체 및 역보체 PASS 프라이머 분석은 표준 및 빠른 열순환 양쪽에서 모두 배경이 되는 1000 야생형(~10,000 복사체(copies)) 분의 1 G12V(~10 복사체) 이하를 검출하는 좋은 민감도를 나타내었다. 대체로, rcG12V 분석은 G12V 분석보다 좀 더 특이적이었다. 좀더 빠른 사이클링 시간은 선형성과 효율성에 영향을 주지 않고 G12V 분석의 특이도를 증가시킨 반면, 사이클링 시간을 줄이는 것은 rcG12V 반응의 선형성 및 효율성을 감소시켰다.
본 실시예는 단일 염기 변화에 대한 분석의 특이도가 PASS 프라이머가 결합하고 증폭시킨 가닥에 의해 영향을 받는다는 것을 보여준다. 또한 사이클링 시간과 같은 실험 조건의 변화는 반응의 특이도를 향상시키는 데 사용될 수 있다.
실시예 8: PASS 프라이머의 고리형으로 된 특이 서열 하에서 표적 서열 내에 결합되지 않은 염기들의 수에 대한 영향 조사
본 실시예에서, rcG12V로 언급되는 코돈 12에서의 KRAS 점 돌연변이의 역상보 가닥은 S1 및 S2(이전 실시예에서 S1 및 S2 사이에는 염기 간격이 없거나 하나만 있었다) 사이에서 고리의 표적 서열 내에 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 결합되지 않은 염기 간격(base gap)을 포함하도록 디자인된 고리형 PASS 프라이머를 테스트하기 위해 사용되었다. rcG12V에 대한 2개의 다른 디자인이 사용되었는데, (i) 변종 염기 “A”가 3'말단에 있는 3' 표적 특이 영역(S2)에 존재하고, S2는 녹는점(Tm)이 26℃이고, 염기쌍 오류는 인서트된 변종 염기의 2개의 염기 5'이었으며(도 7, 디자인 3), (ii) 변종 염기 “A”가 3' 표적 특이 영역(S2)에 존재하고, 3' 말단에서 유래된 3개의 염기들과 S2는 녹는점(Tm)이 20℃이고, 염기쌍 오류는 인서트된 변종 염기의 2개의 염기 5'이었다(도 7, 디자인 4).
PASS 프라이머는 MNA자임(MNAzyme) qPCR과 결합하는데, MNA자임은 증폭된 표적 서열의 보체뿐만 아니라 특이서열의 보체(complement)(cUS), 변종 염기 및 염기쌍 오류가 발생된 염기의 보체와 결합하는 첫번째 파트자임을 포함한다. 두번째 파트자임은 흥미를 끄는 증폭된 표적 서열에 잡종화하면서, 첫번째 파트자임에 인접하여 결합한다.
표적 서열에 결합되어 있을 때 S1과 S2 사이에서 다른 사이즈의 간격을 갖는 PASS 프라이머들은, 표적 G12와 G12V 사이에서 단일 염기 변화를 식별하는 능력으로 비교된다.
8.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임들은 G12V 서열의 역보체의 증폭절과 어떠한 염기쌍 오류와 PASS 프라이머를 경유하여 도입된 cUS를 특이적으로 표적으로 하도록 디자인되었다. 다음의 서열에서, 볼드체의 염기들은 관심의 대상이 되는 표적 서열과 함께 잡종화하며, 밑줄로 표시된 염기들은 시작 템플레이트에 대해 염기쌍 오류가 일어난 특이 서열들이다. 이탤릭체 볼드체의 염기들은 변종 염기를 나타내고, 밑줄 및 이탤릭체의 염기들은 추가로 염기쌍 오류가 발생된 염기들을 나타낸다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 가리킨다. 모든 서열들은 5'에서 3'로 기재되었다.
SEQ ID NO: 63 파트자임 B rcKRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCTCCAACTACCACAAGTTT
SEQ ID NO: 67 파트자임 A rcG12V_M3i2A/55-P:
AGACATACTA CTACG A CA A CAACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 68 파트자임 A rcG12V_M4i2A/55-P:
AGACATACTA GC A A A CAACAACGAGAGGTGCGGT
8.2. 리포터 기질
본 실시예에서, 기질은 5'말단에서 6-FAM 부위로 말단 표지되고(하기 기질의 명칭에서 "F"로 표시됨), 3'말단에서 아이오와 블랙®FQ (Iowa Black®FQ) 퀀처 부위로 말단 표지되었다(하기 기질의 명칭에서 "IB"로 표시됨). 기질의 분열은 510-530 nm 사이(CFX96 (BioRad사)에서 FAM 방출 파장 범위)에서 관측되었고, 기질의 여기가 450-490 nm 사이(CFX96 (BioRad사)에서 FAM 여기 파장 범위)에서 관측되었다. 소문자의 염기는 RNA를 나타내고, 대문자의 염기는 DNA를 나타낸다. 본 실시예를 위한 리포터 기질은 하기에서 보여지는 5'에서 3'까지의 서열과 같다.
SEQ ID NO: 25 기질 Sub55-FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
8.3. KRAS DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
하기에 기재된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 이용하여 인간 gDNA의 생체외 증폭이 수행되었다. PASS 프라이머는 G12V 특이 정방향 프라이머가 US(인서트 i2)를 포함하도록 디자인되었다. 하기의 서열에서, 볼드체의 염기는 표적 서열과 잡종화하고, 밑줄로 표시된 염기들은 시작 템플레이트에 대해 염기쌍 오류가 일어난 특이 서열들이고, 밑줄친 볼드체의 염기들은 변종 염기를 나타내고, 이탤릭체의 염기들은 추가로 염기쌍 오류가 발생된 염기(M)이고, 고리형이라는 문자 뒤의 괄호 안에 있는 숫자는 S1과 S2 사이에서 표적 서열 내에 결합되지 않은 염기들의 수를 나타낸다. 모든 서열들은 5'에서 3'로 기재되었다.
SEQ ID NO: 69 역방향 프라이머 3rcKRAS_2:
TACGATACACGTCTGCAGTCA
SEQ ID NO: 70 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_M3i2고리형(1):
TGTATCGTCAAGGCACTCTTG AGACATACTA CTACG A CA A
SEQ ID NO: 71 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_M3i2고리형(2):
CTGTATCGTCAAGGCACTCTT AGACATACTA CTACG A CA A
SEQ ID NO: 72 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_M3i2고리형(3):
GCTGTATCGTCAAGGCACTCT AGACATACTA CTACG A CA A
SEQ ID NO: 73 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_M3i2고리형(4):
GCTGTATCGTCAAGGCACTC AGACATACTA CTACG A CA A
SEQ ID NO: 74 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_M4i2고리형(0):
GTCAAGGCACTCTTGCCTAC AGACATACTA GC A A A CA
SEQ ID NO: 75 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_M4i2고리형(1):
CGTCAAGGCACTCTTGCCTA AGACATACTA GC A A A CA
SEQ ID NO: 76 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_M4i2고리형(2):
TCGTCAAGGCACTCTTGCCT AGACATACTA GC A A A CA
SEQ ID NO: 77 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_M4i2고리형(3):
ATCGTCAAGGCACTCTTGCC AGACATACTA GC A A A CA
SEQ ID NO: 78 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_M4i2고리형(4):
GTATCGTCAAGGCACTCTTGC AGACATACTA GC A A A CA
SEQ ID NO: 79 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_M4i2고리형(5):
TGTATCGTCAAGGCACTCTTG AGACATACTA GC A A A CA
8.4. 표적 서열
K562 세포주로부터 추출된 인간 gDNA가 야생형 유전자의 생체외 증폭의 템플레이트로 사용되었고, SW620 세포주로부터 추출된 인간 gDNA가 점 돌연변이 G12V의 생체외 증폭에 사용되었다.
8.5. 반응 요소: 표적 서열의 증폭 및 검출
총 반응 부피를 25 ㎕로 하여 표적 서열의 실시간 증폭 및 검출이 수행되었다. 반응은 CFX96TM 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad사)에서 수행되었다. 순환변수는 95℃에서 2분간 놓아 두는 단계, 95℃에서 15초 둔 후 64℃에서 60초간 두는 단계를 10사이클(사이클당 1℃씩 감소), 95℃에서 15초간 둔 후 54℃에서 50초간 놓아 두는 단계를 40사이클(54℃ 단계에서 자료 수집)로 하였다. 모든 반응은 2번 수행되었고, 40 nM의 정방향 프라이머와 100 nM의 파트자임 A(표 13에서 서술된 조합들), 200 nM의 역방향 프라이머(3rcKRAS_2), 200 nM의 파트자임 B(rcKRAS_B/55-P), 200 nM의 기질(Sub55-FIB), 8 mM의 MgCl2, 각 dNTP 200 μM, 10 단위의 리보세이프 RNase 억제제(RiboSafe RNase inhibitor)(Bioline사), 1x ImmoBuffer(Bioline사), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(polymerase)(Bioline사) 및 K562 또는 SW620 gDNA 템플레이트(50 ng)이나 표적이 없는 것(NF H2O) 중 하나를 포함하였다.
변종 분석을 위한 프라이머/파트자임의 조합
디자인 정방향 프라이머 파트자임 A 템플레이트 반응 종류
디자인 3 말단에서의 변종(돌연변이) 염기;
변종의 염기쌍 오류 2 염기 5'		 5rcG12V_M3i2고리형(1) rcG12V_M3i2A/55-P SW620 테스트
5rcG12V_M3i2고리형(2) K562 음성 대조군
5rcG12V_M3i2고리형(3)
H20 템플레이트 없음
5rcG12V_M3i2고리형(4)
디자인 4
3' 말단에서 유래된 변종(돌연변이) 염기 3번째 염기;
변종의 염기쌍 오류 2 염기 5'		 5rcG12V_M4i2고리형(0) rcG12V_M4i2A/55-P SW620 테스트
5rcG12V_M4i2고리형(1)
5rcG12V_M4i2고리형(2) K562 음성 대조군
5rcG12V_M4i2고리형(3)
5rcG12V_M4i2고리형(4) H20 템플레이트 없음
5rcG12V_M4i2고리형(5)
8.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 분열
프라이머-특이적 파트자임들을 이용한 검출에 잇따르는 PASS 프라이머를 이용한 증폭의 결과를 표 14에 나타내었다.
Figure 112014085559157-pct00003
^ 2개의 복제 중 오직 하나만이 신호를 제조함; Ct값은 평균을 내지 않음.
모든 조합에서 돌연변이 변종에 부합(match)된 PASS 프라이머가 테스트 SW620 DNA 내의 G12V 대립형질을 증폭하였고, 이것은 돌연변이와 US2에 부합된 파트자임에 의해 검출되었다. 템플레이트(DNA)가 첨가되지 않았을 때 어떠한 프라이머/파트자임 쌍(pair)을 사용하더라도 증폭이 검출되지 않았다. 이러한 돌연변이 PASS 프라이머/파트자임 시스템은 우선적으로 돌연변이 대립형질을 증폭 및 검출하였고, 음성 대조군 템플레이트(K562)이 사용되었을 때 오직 하나의 조합만이 신호를 제조하였다(표 14).
26℃의 Tm을 가지며 디자인 3(도 7)을 기반으로 한 PASS 프라이머는 표적 서열에 결합되지 않은 다른 염기 간격(1에서 4까지)이 비교되는 PASS 프라이머의 고리형 영역 하에 위치하였을 때 G12V 표적 서열의 증폭에 있어서 거의 차이를 보이지 않았다(표 14).
20℃의 Tm을 가지며 디자인 4(도 7)를 기반으로 한 PASS 프라이머는 PASS 프라이머의 고리형 영역 하에 3, 4, 또는 5 염기간격이 발생하였을 때 개선된 Ct 값을 나타내었다. 그러나, 비록 △Ct 값이 12.9일지라도, 이것은 또한 음성 대조군(야생형)의 반응에 대해 검출된 신호를 야기하였다. 이것은 보다 긴 S2 영역과 더 높은 Tm을 갖는 PASS 프라이머가 고리형 영역 하에서 S1과 S2 사이에서 표적 서열에 결합되지 않은 염기 간격의 수에 거의 영향을 받지 않는 반면; 보다 짧은 S2 영역을 갖는 PASS 프라이머가 고리형 영역 하에서 S1과 S2 사이에서 표적 서열에 결합되지 않은 더 많은 수의 염기 간격들의 존재로부터 이익을 얻음을 나타내는 것일 수 있다.
대체로 이전 실험들과 결합된 이번 실험은 디자인의 유연성이 있을 수 있고, 고리형 PASS 프라이머가 프라이머의 S1 및 S2 영역의 보체 사이에 존재하는 표적이 되는 영역에서 결합되지 않은 많은 수의 염기들과 함께 작용될 수 있음을 보여준다.
실시예 9: 서열 내의 단일 염기 변화 검출을 위해 디자인된 분석 내에서 PASS 프라이머와 WE-ARMS 프라이머의 두 종류 모두가 MNA자임과 결합되었을 때 WE-ARMS 프라이머에 대한 PASS 프라이머의 교차반응도(cross reactivity)의 비교
WE-ARMS 프라이머를 이용한 변종(돌연변이) 서열의 증폭은 돌연변이 염기와 염기쌍 오류가 발생된 추가된 염기에 의해 야생형 서열과 구별되는 증폭절을 제조한다. 이와 비교하여, PASS 프라이머를 이용한 변종(돌연변이) 서열의 증폭은 돌연변이 염기와 염기쌍 오류가 발생된 추가된 염기에 의해 야생형 서열뿐만 아니라 인서트된 US와도 구별되는 증폭절을 제조한다. PASS 프라이머에 의해 생성된 증폭절에 대해 파트자임 A가 또한 원본의 야생형 서열과 다른 US를 포함하는 반면, WE-ARMS 프라이머에 의해 증폭된 돌연변이 증폭절이 MNA자임에 의해 실시간으로 검출될 때 파트자임 A는 단지 돌연변이와 염기쌍 오류가 발생된 염기에 의해 야생형 서열과 구별된다. 나아가 만약 같은 용기(same well) 내에서 야생형을 증폭하고 검출하는 것이 또한 바람직하다면, 보다 큰 서열의 다양성을 만들고 돌연변이와 야생형 증폭절 간의 차이를 식별하는 MNA자임의 능력을 향상시키는, 돌연변이와 비교되는 다른 US가 사용될 수 있다.
본 실시예에서, WE-ARMS 및 PASS 프라이머 시스템은 돌연변이에 특이적인 프라이머가 야생형에 특이적인 파트자임 A와 혼합되었을 때 및 그와 반대인 경우의 교차반응도를 위해 실험되었다. 이것은 rcG12V로 언급되는 코돈 12에서의 KRAS 점 돌연변이의 역보체 및 rcG12로 언급되는 야생형 KRAS 서열의 역보체의 증폭을 포함한다. PASS 프라이머는 rcG12V 또는 rcG12 서열 중 어느 하나에 특이적이도록 디자인되었다. 돌연변이에 대한 변종 염기는 3' 말단에 있는 3' 표적 특이 영역(S2)에 위치하였고, 염기쌍 오류가 발생된 염기는 3' 말단에서 유래된 인서트된 4개의 염기이었다. 야생형에 대한 변종 염기는 염기쌍 오류가 발생된 3' 말단에서 유래된 인서트된 5개의 염기와 함께 3' 말단에서 유래된 3개의 염기가 위치하였다. 야생형(인서트 i4)과 돌연변이(인서트 i1)에 대한 PASS 프라이머에는 다른 US가 포함된다. 이러한 PASS 프라이머는 워블(wobble)-강화 ARMS(WE-ARMS) 프라이머와 비교되었는데(Hamfjord 외, (2011), "Wobble-enhanced ARMS Method for Detection of KRAS and BRAF Mutations", Diagn Mol Pathol; 20:158-165 참조), 프라이머들은 rcG12V 또는 rcG12에 대해 서열-특이적이고 두 형질에 대해 유도된 염기쌍 오류를 포함하여 단일 염기에 의해 차별되는 KRAS 서열들간의 차이를 식별하게 하도록 디자인되었다. 본 실시예에서 사용된 WE-ARMS 프라이머에 대해, 변종(돌연변이 또는 야생형) 염기는 3' 말단에 위치하고 염기쌍 오류는 3' 말단에서 유래된 인서트된 5개 염기들이다.
PASS 프라이머는 MNA자임 qPCR과 결합하는데, MNA자임은 증폭된 표적 서열의 보체뿐만 아니라 특이서열의 보체(complement)(cUS), 변종 염기(야생형 또는 돌연변이) 및 염기쌍 오류가 발생된 염기의 보체와 결합하는 첫번째 파트자임을 포함한다. 두번째 파트자임은 흥미를 끄는 증폭된 표적 서열에 잡종화하면서, 첫번째 파트자임에 인접하여 결합한다. WE-ARMS 프라이머는 MNA자임들과 결합하며, 첫번째 파트자임은 변종 염기(야생형 또는 돌연변이) 및 염기쌍 오류가 발생된 염기의 보체를 포함하는 증폭된 표적 서열과 결합한다. 두번째 파트자임은 관심의 대상이 되는 증폭된 표적 서열에 잡종화하면서, 첫번째 파트자임에 인접하여 결합한다.
PASS 프라이머는 파트자임들과 잘못 부합된(mis-matched) 경우의 교차 반응하는 능력에 대해 WE-ARMS 프라이머와 비교되었다.
9.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임들은 rcG12 또는 rcG12V 서열과 프라이머를 경유하여 도입된 염기쌍 오류와 PASS 프라이머를 경유하여 도입된 cUS를 특이적으로 표적으로 하도록 디자인되었다. 다음의 서열에서, 볼드체의 염기들은 관심의 대상이 되는 표적 서열과 함께 잡종화하며, 밑줄로 표시된 염기들은 시작 템플레이트에 대해 염기쌍 오류가 일어난 특이 서열들(야생형 인서트 i4 및 변종 인서트 i1)이다. 몇몇의 파트자임 A들은 보다 긴(L) 3' 표적 특이 영역을 갖는다. 이탤릭체 볼드체의 염기들은 변종 염기(야생형 또는 돌연변이)를 나타내고, 밑줄 및 이탤릭체의 염기들은 추가로 염기쌍 오류가 발생된 염기들을 나타낸다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 가리킨다. 모든 서열들은 5'에서 3'로 기재되었다.
SEQ ID NO: 63 파트자임 B rcKRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCTCCAACTACCACAAGTTT
SEQ ID NO: 80 파트자임 A rcG12_LMi4A/55-P:
TCAATACCAT TACGC G A C CAACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 88 파트자임 A rcG12V_LMa4i1A/55-P:
ACAATCAGT CCTACG A CA A CAACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 81 파트자임 A rcG12_MA/55-P:
TCTTGCCTACGC G A C CAACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 82 파트자임 A rcG12V_MA/55-P:
CTCTTGCCTACGC A A A CAACAACGAGAGGTGCGGT
9.2. 리포터 기질
본 실시예에서, 기질은 5'말단에서 6-FAM 부위로 말단 표지되고(하기 기질의 명칭에서 "F"로 표시됨), 3'말단에서 아이오와 블랙®FQ (Iowa Black®FQ) 퀀처 부위로 말단 표지되었다(하기 기질의 명칭에서 "IB"로 표시됨). 기질의 분열은 510-530 nm 사이(CFX96 (BioRad사)에서 FAM 방출 파장 범위)에서 관측되었고, 기질의 여기가 450-490 nm 사이(CFX96 (BioRad사)에서 FAM 여기 파장 범위)에서 관측되었다. 소문자의 염기는 RNA를 나타내고, 대문자의 염기는 DNA를 나타낸다. 본 실시예를 위한 리포터 기질은 하기에서 보여지는 5'에서 3'까지의 서열과 같다.
SEQ ID NO: 25 기질 Sub55-FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
9.3. KRAS DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
하기에 기재된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 이용하여 인간 gDNA의 생체외 증폭이 수행되었다. PASS 프라이머는 rcG12 특이적 정방향 프라이머가 US 인서트인 i4를 포함하고, rcG12V 특이적 정방향 프라이머가 US 인서트인 i1을 포함하도록 디자인되었다. 몇몇의 정방향 프라이머는 보다 긴(L) 표적 특이 영역을 갖는다. 하기의 서열에서, 볼드체의 염기는 표적 서열과 잡종화하고, 밑줄로 표시된 염기들은 시작 템플레이트에 대해 염기쌍 오류가 일어난 특이 서열들이고, 밑줄친 볼드체의 염기들은 변종 염기를 나타내고, 이탤릭체의 염기들은 표적들 양쪽 모두에 대해 추가로 염기쌍 오류가 발생된 염기(M)이다. 모든 서열들은 5'에서 3'로 기재되었다.
SEQ ID NO: 69 역방향 프라이머 3rcKRAS_2:
TACGATACACGTCTGCAGTCA
SEQ ID NO: 83 정방향 PASS 프라이머 5rcG12_LM4i4고리형:
TGTATCGTCAAGGCACTCTTG TCAATACCAT TACGC G A C CA
SEQ ID NO: 99 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_LM3a4i1고리형:
CTGTATCGTCAAGGCACTCTT CACAATCAGT CCTACG ACA A
SEQ ID NO: 84 정방향 WE-ARMS 프라이머 5rcG12_M:
GCACTCTTGCCTACGC G A C
SEQ ID NO: 85 정방향 WE-ARMS 프라이머 5rcG12V_M:
GGCACTCTTGCCTACGC A A A
9.4. 표적 서열
K562 세포주로부터 추출된 인간 gDNA가 야생형 유전자의 생체외 증폭의 템플레이트로 사용되었고, SW480 세포주로부터 추출된 인간 gDNA가 점 돌연변이 G12V의 생체외 증폭에 사용되었다.
9.5. 반응 요소: 표적 서열의 증폭 및 검출
총 반응 부피를 25 ㎕로 하여 표적 서열의 실시간 증폭 및 검출이 수행되었다. 반응은 CFX96TM 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad사)에서 수행되었다. 순환변수는 95℃에서 2분간 놓아 두는 단계, 95℃에서 5초 둔 후 64℃에서 20초간 놓아 두는 단계를 10사이클(사이클당 1℃씩 감소), 95℃에서 5초간 둔 후 54℃에서 20초간 놓아 두는 단계를 40사이클(54℃ 단계에서 자료 수집)로 하였다. 모든 반응은 2번 수행되었고, 40 nM의 정방향 프라이머와 100 nM의 파트자임 A(표 15에서 서술된 조합들), 200 nM의 역방향 프라이머(3rcKRAS_2), 200 nM의 파트자임 B(rcKRAS_B/55-P), 200 nM의 기질(Sub55-FIB), 8 mM의 MgCl2, 각 dNTP 200 μM, 10 단위의 리보세이프 RNase 억제제(RiboSafe RNase inhibitor)(Bioline사), 1x ImmoBuffer(Bioline사), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(polymerase)(Bioline사) 및 K562 또는 SW480 gDNA 템플레이트(50 ng)이나 표적이 없는 것(NF H2O) 중 하나를 포함하였다.
야생형 및 변종에 대한 프라이머/파트자임의 조합
시스템 디자인 올리고 구성
(Oligo Format)
(프라이머/파트자임) 		정방향 프라이머 파트자임 A
PASS rcG12 디자인 4
3' 말단에서 유래된 변종 야생형 2 염기; 변종의 염기쌍 오류 2 염기 5'		 염기쌍 부합
(G12/G12)		 5rcG12_LM4i4
고리형		 rcG12_LMi4A/55-P
염기쌍 오류
(G12/G12V) 		5rcG12_LM4i4
고리형		 rcG12V_LMa4i1A/55-P
rcG12V 디자인 3
말단에서 변종 돌연변이 염기; 변종의 염기쌍 오류 2 염기 5'		 염기쌍 부합 (G12V/G12V) 5rcG12V_LM3a4i1고리형 rcG12V_LMa4i1A/55-P
염기쌍 오류
(G12V/G12)		 5rcG12V_LM3a4i1고리형 rcG12_LMi4A/55-P
WE-ARMS rcG12 WE-ARMS
말단에서 변종 야생형 염기; 변종의 염기쌍 오류 2 염기 5'		 염기쌍 부합 (G12/G12) 5rcG12_M rcG12_MA/55-P
염기쌍 오류
(G12/G12V)		 5rcG12_M rcG12V_MA/55-P
rcG12V WE-ARMS
말단에서 변종 돌연변이 염기; 변종의 염기쌍 오류 2 염기 5'		 염기쌍 부합 (G12V/G12V) 5rcG12V_M rcG12V_MA/55-P
염기쌍 오류
(G12V/G12)		 5rcG12V_M rcG12_MA/55-P
9.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 분열
프라이머-특이적 파트자임 또는 염기쌍 오류가 발생된 파트자임 중 어느 하나를 이용한 검출에 잇따르는 PASS 프라이머 및 WE-ARMS 프라이머를 이용한 증폭의 결과를 표 16에 나타내었다.
G12 및 G12V 조합들에 대한 Ct 값
시스템 디자인 올리고 구성
(Oligo Format) (프라이머/파트자임) 		반응 종류 Ct (평균)
rcG12 PASS 염기쌍 부합 (G12/G12) 테스트 (K562) 22.2
음성 대조군 (SW480) 34.2
염기쌍 오류
(G12/G12V)		 테스트 (K562) Ct값 없음
음성 대조군 (SW480)
WE_ARMS 염기쌍 부합 (G12/G12) 테스트 (K562) 22.0
음성 대조군 (SW480) 44.5
염기쌍 오류
(G12/G12V)		 테스트 (K562) 25.6
음성 대조군 (SW480) 45.0^
rcG12V PASS 염기쌍 부합 (G12V/G12V) 테스트 (SW480) 22.0
음성 대조군 (K562) Ct값 없음
염기쌍 오류
(G12V/G12)		 테스트 (SW480) Ct값 없음
음성 대조군 (K562)
WE_ARMS 염기쌍 부합 (G12V/G12V) 테스트 (SW480) 24.3
음성 대조군 (K562) Ct값 없음
염기쌍 오류
(G12V/G12)		 테스트 (SW480) 33.4
음성 대조군 (K562) Ct값 없음
^ 오직 하나의 복제만이 신호를 제조함; Ct값은 평균을 내지 않음.
야생형의 역방향 상보 가닥에 일치되는 PASS 프라이머가 테스트(K562) DNA의 rcG12 대립유전자를 증폭하였고, 이것이 야생형 및 US 인서트 i4에 일치되는 파트자임에 의해서 검출되었다. 역방향 상보 야생형 PASS 프라이머/파트자임 시스템이 야생형 대립유전자를 우선적으로 증폭하고 검출하였으며, 신호는 음성 대조군 템플레이트(SW480)가 이들 실험 조건하에서 사용되었을 때 반응의 후반에 발생되었다. 야생형(K562)의 것과 돌연변이(SW480) DNA에서 발생한 것 간의 Ct 차이는 12 사이클이였고(표 16), PASS 프라이머 및 일치되는 파트자임이 돌연변이와 야생형 대립유전자 간의 구별을 허용한다는 것을 증명하였다. 변종 돌연변이 및 US 인서트 i1에 특이적인 불일치된 파트자임이 야생형 PASS 프라이머와 함께 사용되었을 때 교차 반응은 보이지 않았다(표 16).
야생형에 일치되는 WE-ARMS 프라이머가 테스트(K562) DNA의 rcG12 대립유전자를 증폭하였고, 이것이 야생형에 일치되는 파트자임에 의해서 검출되었다. 이 야생형 ARMS 프라이머/파트자임 시스템은 야생형 대립유전자에 특이적이었고, 음성 대조군 템플레이트(SW480)이 사용되었을 때 늦은 신호가 발생하였다. 야생형(K562)의 것과 돌연변이(SW480) DNA에서 발생한 것 간의 Ct 차이는 22 사이클보다 컸다(표 16). 변종 돌연변이에 특이적인 불일치된 파트자임이 야생형 WE-ARMS 프라이머와 함께 사용되었을 때 교차 반응이 보였다. 불일치된 반응을 위한 Ct가 일치된 것과 유사하다는 것은 변종 돌연변이에 특이적으로 디자인된 파트자임이 반응 조건하에서 WE-ARMS 프라이머에 의해서 발생한 돌연변이 앰플리콘과 야생형 간을 구별할 수 없다는 것을 나타내었다(표 16).
돌연변이 변종의 역방향 상보 가닥에 일치되는 PASS 프라이머가 테스트(SW480) DNA의 rcG12V 대립유전자를 증폭하였고, 이것이 돌연변이 및 US 인서트 i1에 일치되는 파트자임에 의해서 검출되었다. 이 돌연변이 PASS 프라이머/파트자임 시스템이 돌연변이 대립유전자를 특이적으로 검출하였고, 음성 대조군 템플레이트(K562)이 사용되었을 때 신호는 발생하지 않았다. 야생형 및 US 인서트 i4에 특이적인 파트자임이 돌연변이 PASS 프라이머와 함께 사용되었을 때 교차 반응은 보이지 않았다(표 16).
돌연변이 변종의 역방향 상보에 일치되는 WE-ARMS 프라이머가 테스트(SW480) DNA 내의 rcG12V 대립유전자를 증폭하였고, 이것이 돌연변이에 일치되는 파트자임에 의해서 검출되었다. 이 돌연변이 WE-ARMS 프라이머/파트자임 시스템이 돌연변이 대립유전자를 특이적으로 검출하였고, 음성 대조군 템플레이트(K562)이 분석되었을 때 신호는 발생하지 않았다. 야생형에 특이적인 불일치된 파트자임이 야생형 WE-ARMS 프라이머와 함께 사용되었을 때 교차 반응이 보였다. 불일치된 반응을 위한 Ct는 일치된 것에 ~9 Ct가 늦었고, 변종 돌연변이에 특이적으로 디자인된 파트자임이 반응 조건하에서 WE-ARMS 프라이머에 의해서 발생한 돌연변이 앰플리콘과 야생형 간을 구별하는 능력이 열등하다는 것을 나타내었다(표 16).
템플레이트가 첨가되지 않았을 때(DNA 없음), 임의의 프라이머/파트자임 쌍(pair)을 사용하여도 증폭은 검출되지 않았다.
본 실시예의 데이터는 PASS 프라이머가 단일 염기 변화 검출을 위한 다른 기술인 당 분야에 주지된 WE-ARMS 보다 우월하게 수행할 수 있는 능력이 있다는 것을 증명한다. 게다가, PASS 프라이머에 의한 US의 앰프리콘으로의 도입은, 멀티플렉스 qPCR에서 발생할 수도 있는 시나리오인 파트자임이 2개의 밀접하게 관련된 서열간을 구별하기 위할 때 특이성의 추가된 수준을 제공할 수 있다. PASS 프라이머는 추가의, 고유 서열을 앰플리콘으로 도입하는 것을 허용한다. 다른 고유 서열이 야생형 및 돌연변이 변종 앰플리콘에 도입되었다. 이 추가의 서열은 차이점을 강화하고, 대안의(alternate) 앰플리콘에 대한 파트자임의 교차 반응성을 방지하는데, 예를 들면 야생형 PASS 앰플리콘은 돌연변이 PASS 앰플리콘에 일치하는되는 파트자임에 의해서 검출되지 않고 역 또한 마찬가지이다. 이것은 어세이가 멀티플렉스 반응에서 조합이 가능하게 하고, 변종과 야생형이 확인될 수 있게 한다. 그에 반해서, 야생형 및 돌연변이 WE-ARMS 앰플리콘과 이들의 완전히 일치되는 파트자임간의 단지 두 염기의 작은 차이는 파트자임의 대안의 앰플리콘에 대한 교차 반응을 막는데 불충분하고, 예를 들면 야생형 WE-ARMS 앰플리콘은 돌연변이 WE-ARMS 앰플리콘에 일치되는 파트자임에 의해서 검출되고 역 또한 마찬가지이다. 따라서 이들은 멀티플렉스 반응에서 조합될 수 없다.
실시예 10: PASS 프라이머의 S2 영역의 길이가 표적 서열의 증폭에 미치는 영향
PASS 프라이머 내에는 다중(multiple) 영역이 있고, S1은 PASS 프라이머를 관심이 있는 표적 서열에 고정(anchor)되도록 디자인된 US의 5'이고, S2는 PASS 프라이머의 개시 부분을 제공하는 고유 서열이며, US는 S1과 S2 사이에 위치한다. 본 실시예에서 US는 고유 서열의 영역을 앰프리콘 내로 삽입한다(도 1). 모든 영역은 그들의 서열을 길게 하거나 짧게 함으로써 특정 적용에 맞춤이 될 수 있다.
본 실시예에서, PASS 프라이머의 S2 영역의 길이가 CCB 유전자의 증폭에 미치는 영향이 qPCR에서 판독(readout)을 위한 MNA자임(MNAzyme) 검출와 조합되었을 때 조사되었다. PASS 프라이머 및 파트자임은 PASS 프라이머의 S2 도메인의 길이의 다양한 시나리오가 CCB 유전자의 증폭 및 검출와 양립될 수 있는지를 결정하기 위해 디자인되었다. PASS 프라이머의 S2 도메인의 길이(루프 또는 평면 US 포함)는 3' 말단으로부터 변경되어 3, 4, 5, 6 또는 7 염기 길이이거나 5' 말단으로부터 변경되어 5, 6 또는 7 염기 길이였다.
10.1 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임이 CCB 유전자에 특이적으로 표적되도록 디자인되었고, cUS가 PASS 프라이머를 통해서 도입되었다. 다음의 서열에서 볼드체로 된 염기는 관심이 있는 표적 서열에 하이브리드화되었고, 밑줄친 염기는 cUS에 하이브리드화되었다. "-P" 표시는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화(phosphorylation)를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3' 방향으로 기재되었다.
서열번호: 86 파트자임 B CCBB/2-P:
TGCCCAGGGAGGCTAGCTGGTCCATGGCTTCTGGGTA
서열번호: 89 파트자임 A CCB_2i2A/2-P:
AGACATACTA CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
서열번호: 90 파트자임 A CCB_2i2L5_6A/2-P:
C AGACATACTA CAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
서열번호: 91 파트자임 A CCB_2i2L5_5A/2-P:
CC AGACATACTA AGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
서열번호: 92 파트자임 A CCB_2i2P5_6A/2-P:
A AGACATACTA CAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
서열번호: 93 파트자임 A CCB_2i2P5_5A/2-P:
AT AGACATACTA AGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
10.2 리포터 기질
본 실시예에서, 기질은 5' 말단에서 6-FAM 부위(하기 기질의 명칭에서 "F"로 표시)로, 3' 말단에서 Iowa Black® FQ 퀀처(quencher) 부위(하기 기질의 명칭에서 "IB"로 표시)로 말단 표지하였다. 기질의 절단은 530 nm(FAM 방출 파장)에서 485 nm(FAM 여기 파장)에서의 여기로 모니터하였다. 본 실시예를 위한 리포터 기질을 다음의 5'에서 3' 방향의 서열로 보여준다. 소문자 염기는 RNA를, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
서열번호: 94 기질 Sub2-FIB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
10.3 CCB DNA의 증폭을 위한 표적 서열 및 PCR 프라이머
본 실시예를 위한 표적 서열은 IM9 세포주(Promega)에서 추출한 인간 gDNA 내의 CCB 유전자이다. 올리고뉴클레오티드 PASS 프라이머를 다음에 나열한다. 다음의 서열에서 밑줄 친 염기는 US 인서트 i2이다. 모든 서열은 5'에서 3' 방향으로 기재하였다.
서열번호: 7 역방향 프라이머 3CCB:
CTCAGGAATTTCCCAGCTAC
서열번호: 13 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2루프:
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCAGAGC
서열번호: 95 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2루프3_6:
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCAGAG
서열번호: 96 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2루프3_5:
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCAGA
서열번호: 97 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2루프3_4:
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCAG
서열번호: 98 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2루프3_3:
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCA
서열번호: 14 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2평면:
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAGAGC
서열번호: 100 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2평면3_6:
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAGAG
서열번호: 101 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2평면3_5:
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAGA
서열번호: 102 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2평면3_4:
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAG
서열번호: 103 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2평면3_3:
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCA
서열번호: 104 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2루프5_6:
CTTCTTGGATGGTCATCTCAGACATACTACAGAGC
서열번호: 105 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2루프5_5:
TTCTTGGATGGTCATCTCCAGACATACTAAGAGC
서열번호: 106 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2평면5_6:
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAAGACATACTACAGAGC
서열번호: 107 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2평면5_5:
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGATAGACATACTAAGAGC
10.4 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭 및 검출
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출이 25 ㎕의 총 반응 부피에서 수행되었다. 반응은 Mx3005p(Stratagene)에서 수행되었다. 사이클 변수는 95℃에서 2분, 95℃에서 15초 및 55℃에서 30초의 5 사이클, 95℃에서 15초 및 52℃에서 60초의 40 사이클(데이터는 52℃ 단계에서 수집)이었다. 모든 반응은 2회 반복 수행되었고, 40 nM 정방향 프라이머 및 200 nM 파트자임 A(표 17에 조합이 나열), 200 nM 역방향 프라이머(3CCB), 200 nM 파트자임 B(CCBB/2-P), 200 nM 기질(Sub2-FIB), 8 mM MgCl2, 200 μM의 각각의 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNAase 억제제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(Bioline) 및 gDNA 템플레이트(50 ng) 또는 표적 없음(NF H2O) 중 하나를 포함하였다.
정방향 PASS 프라이머 및 파트자임 A 조합
디자인 크기 (bp) S2 PASS 프라이머 파트자임 A
Original 루프 7 5CCB_2i2루프 CCB_2i2A/2-P
Original 평면 7 5CCB_2i2평면
3' 말단으로부터 PASS 프라이머의 S2 환원
모든 프라이머를 위해 일치된 파트자임 A		 6 5CCB_2i2루프3_6
5 5CCB_2i2루프3_5
4 5CCB_2i2루프3_4
3 5CCB_2i2루프3_3
6 5CCB_2i2평면3_6
5 5CCB_2i2평면3_5
4 5CCB_2i2평면3_4
3 5CCB_2i2평면3_3
5' 말단으로부터 PASS 프라이머의 S2 환원
모든 프라이머를 위해 일치된 파트자임 A		 6 5CCB_2i2루프5_6 CCB_2i2L5_6A/2-P
5 5CCB_2i2루프5_5 CCB_2i2L5_5A/2-P
6 5CCB_2i2평면5_6 CCB_2i2P5_6A/2-P
5 5CCB_2i2평면5_5 CCB_2i2P5_5A/2-P
대조군
Original 루프, 불일치된 파트자임 A 7 5CCB_2i2루프 CCB_2i2L5_6A/2-P
CCB_2i2L5_5A/2-P
Original 평면, 불일치된 파트자임 A 7 5CCB_2i2평면 CCB_2i2P5_6A/2-P
CCB_2i2P5_5A/2-P
5' 말단으로부터 PASS 프라이머의 S2 환원
모든 프라이머를 위해 불일치된 파트자임 A		 6 5CCB_2i2루프5_6 CCB_2i2A/2-P
5 5CCB_2i2루프5_5
6 5CCB_2i2루프5_6
5 5CCB_2i2루프5_5
10.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 절단
CCB, 및 cUS 및 증폭된 표적 특이적 서열에 모두 결합된 파트자임의 실시간 검출 및 정량을 위한 앰플리콘을 생산하기 위하여 PASS 프라이머를 사용하였다. 이 반응은 사용된 표적 서열이 qPCR을 통해 증폭된 인간 gDNA일 때 시간에 따라 형광의 증가를 보여주었다. DNA가 없는 표적 대조군의 형광은 DNA 표적-함유 반응의 것보다 낮았고, 반응 동안 증가하지 않았다. 이것은 표적-함유 반응에서 생산된 형광의 증가는 촉매적으로 활성화된 MNA자임의 표적 의존적 조립과 그 다음 리포터 기질을 절단하는 것에 기인한다는 것을 증명하였다.
PASS 프라이머 및 파트자임 조합을 위한 Ct 값
디자인 파트자임 A PASS 프라이머 S2 크기 Ct (ave)
오리지널로부터 DCt
루프 일치된 오리지널 - 7 bp 21.5
3' 말단 - 6 bp 26.7 5.2
3' 말단 - 5 bp 30.2 8.7
3' 말단 - 4 bp No Ct -
3' 말단 - 3 bp No Ct -
5' 말단 - 6 bp 24.0 2.5
5' 말단 - 5 bp No Ct -
앰플리콘으로부터 1 염기 루프 아웃 (5_6) 오리지널 - 7 bp 22.6 1.1
앰플리콘으로부터 2 염기 루프 아웃 (5_5) 오리지널 - 7 bp 26.8 5.3
파트자임으로부터 1 염기 루프 아웃 (7) 5' 말단 - 6 bp 24.6 3.1
파트자임으로부터 2 염기 루프 아웃 (7) 5' 말단 - 5 bp No Ct -
평면 일치된 오리지널 - 7 bp 21.3
3' 말단 - 6 bp 21.8 0.5
3' 말단 - 5 bp 22.5 1.3
3' 말단 - 4 bp 23.1 1.8
3' 말단 - 3 bp 25.6 4.3
5' 말단 - 6 bp 21.6 0.3
5' 말단 - 5 bp 22.7 1.4
앰플리콘으로부터 1 염기 루프 아웃 (5_6) 오리지널 - 7 bp 22.2 0.9
앰플리콘으로부터 2 염기 루프 아웃 (5_5) 오리지널 - 7 bp 27.6 6.3
파트자임으로부터 1 염기 루프 아웃 (7) 5' 말단 - 6 bp 22.4 1.1
파트자임으로부터 2 염기 루프 아웃 (7) 5' 말단 - 5 bp 27.7 6.4
루프된(루프ed) US를 포함하는 정방향 PASS 프라이머의 S2 영역이 길이가 3' 말단으로부터 7에서 6 및 5 염기로 길이가 감소하였을 때, 짧아진 프라이머도 여전히 검출이능한 신호를 생산하였으나 Ct는 각각 5.2 및 8.7 증가하였다(표 18). S2의 3' 말단으로부터 임의의 추가 감소는 테스트된 반응 조건하에서 검출이능한 신호를 발생하지 않았다. 루프 PASS 프라이머의 S2 영역이 5'말단으로부터 7 염기에서 6 염기로 감소하였을 때, Ct는 2.5 증가하였으나 추가의 길이 감소는 테스트된 반응 조건하에서 검출이능한 신호를 발생하지는 않았다.
평면(평면)의 US를 포함하는 정방향 PASS 프라이머의 S2 영역이 3' 말단으로부터 7에서 6 및 5 염기로 길이가 감소하였을 때, 모든 프라이머가 여전히 검출이능한 신호를 생산하였고 Ct 값에는 거의 영향이 없었다(표 18). S2의 3' 말단으로부터 4 및 3 염기로의 추가 감소는 여전히 검출이능한 신호를 발생하였으나, Ct는 각각 1.8 및 4.3이 증가하였다(표 18). 평면 PASS 프라이머의 S2 영역이 5' 말단으로부터 7 염기에서 6 및 5 염기로 감소하였을 때, Ct 값에 상당한 영향은 없이 검출이능한 신호가 여전히 발생하였다(표 18).
대조군으로서, 짧아진 PASS 프라이머에 특이적인 파트자임이 더 긴 PASS 프라이머와 조합되었고 역 또한 마찬가지이었다. 이것은 염기가 앰프리콘 또는 파트자임으로부터 루프 아웃되는 결과를 보였다. 루프 및 평면 PASS 프라이머 모두에서, 오직 하나의 염기가 앰플리콘 또는 파트자임으로부터 루프 아웃되었을 때, Ct에는 단지 ~1의 작은 증가만이 있었으나 예외적으로 파트자임으로부터 1 염기가 루프 아웃된 루프 PASS 프라이머에서는 이들 실험 조건하에서 3.1 증가된 Ct를 가졌다. 추가로, 2 염기의 루프 아웃된 영역을 포함하는 파트자임 또는 앰플리콘의 경우는 Ct가 ~5 내지 6이 증가하였고, 예외적으로 파트자임이 루프 아웃된 루프 PASS 프라이머는 이들 실험 조건하에서 검출이능한 신호를 발생하지 않았다.
전체적으로, 평면 형태의 US를 포함하는 PASS 프라이머의 경우 S2 영역이 반응의 효율(Ct 값)에 지나친 영향이 없이 4 염기까지 감소가 가능하였다. 그러나 루프 형태의 US를 포함하는 PASS 프라이머의 경우는 S2 영역에서 심지어 1 염기만의 감소도 Ct 값에 상당한 영향을 주었다. 루프 PASS 프라이머의 경우 루프 영역하에서 S1과 S2 사이에 갭(gap)이 없어서 반응의 엄격함(stringency)을 증가시킬 수 있다는 것을 주목할 만하다.
이 실험에서의 관찰은 루프 또는 평면 포맷을 따르는 PASS 프라이머의 영역의 디자인에 상당한 유연성이 있다는 것을 증명한다. 임의의 영역을 위한 최적의 길이는 표적 서열; 특정 적용; 및 완충용액, 염 농도, 반응 온도, 사이클 시간 및 다른 인자들을 포함하나 이에 한정되지 않는 반응 조건;에 달려있다.
실시예 11: PASS 프라이머 내에 포함되는 US 인서트의 길이 다양성에 대한 조사
본 실시예에서, PASS 프라이머 내의 US 인서트의 길이가 증폭 효율에 대한 영향을 결정하는 지를 조사하였다. 이전의 실시예에서, US1의 길이는 10 염기였다.
PASS 프라이머는 8, 9, 10, 12 또는 13 염기 길이의 루프 US, 또는 10, 12, 13, 17, 22 또는 29 염기 길이의 평면 US를 포함하도록 디자인되었다. 각 PASS 프라이머가 qPCR 내의 판독을 탐지하는 MNA자임과 조합되어 PASS 프라이머 내의 US 인서트의 길이의 다양한 시나리오가 CCB 유전자의 증폭 및 검출와 양립가능한지를 결정하였다.
11.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임이 CCB 유전자에 특이적으로 표적되도록 디자인되었고, cUS가 PASS 프라이머를 통해서 도입되었다. 다음의 서열에서 볼드체로 된 염기는 관심이 있는 표적 서열에 하이브리드화되었고, 밑줄친 염기는 cUS에 하이브리드화되었다. "-P" 표시는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3' 방향으로 기재되었다.
서열번호: 86 파트자임 B CCBB/2-P:
TGCCCAGGGAGGCTAGCTGGTCCATGGCTTCTGGGTA
서열번호: 89 파트자임 A CCB_2i2A/2-P:
AGACATACTA CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
11.2. 리포터 기질
본 실시예에서, 기질은 5' 말단에서 6-FAM 부위(하기 기질의 명칭에서 "F"로 표시)로, 3' 말단에서 Iowa Black® FQ 퀀처(quencher) 부위(하기 기질의 명칭에서 "IB"로 표시)로 말단 표지하였다. 기질의 절단은 530 nm(FAM 방출 파장)에서 485 nm(FAM 여기 파장)에서의 여기로 모니터하였다. 본 실시예를 위한 리포터 기질을 다음의 5'에서 3' 방향의 서열로 보여준다. 소문자 염기는 RNA를, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
서열번호: 94 기질 Sub2-FIB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
11.3. 표적 서열 및 CCB DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
본 실시예를 위한 표적 서열은 IM9 세포주(Promega)에서 추출한 인간 gDNA 내의 CCB 유전자이다. 올리고뉴클레오티드 PASS 프라이머를 다음에 나열한다. 다음의 서열에서 밑줄 친 염기는 US 인서트가다. 모든 서열은 5'에서 3' 방향으로 기재하였다.
서열번호: 7 역방향 프라이머 3CCB:
CTCAGGAATTTCCCAGCTAC
서열번호: 13 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2루프:
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCAGAGC
서열번호: 108 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2(-1)루프_US9:
TTCTTCTTGGATGGTCATCTGACATACTACCAGAGC
서열번호: 109 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2(-2)루프_US8:
TTCTTCTTGGATGGTCATCTACATACTACCAGAGC
서열번호: 110 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2(+2)루프_US12:
TTCTTCTTGGATGGTCATCTAAAGACATACTACCAGAGC
서열번호: 111 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2(+3)루프_US13:
TTCTTCTTGGATGGTCATCTCAAAGACATACTACCAGAGC
서열번호: 14 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2평면:
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAGAGC
서열번호: 112 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2(+2)평면_US12:
TCTCTTGTCTCAGTTCTTCTTAAAGACATACTACCAGAGC
서열번호: 113 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2(+3)평면_US13:
GTCTCTTGTCTCAGTTCTTCTCAAAGACATACTACCAGAGC
서열번호: 114 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2(+7)평면_US17:
CTCAAGTCTCTTGTCTCAGTTCCCGACAAAGACATACTACCAGAGC
서열번호: 115 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2(+12)평면_US22:
GGCTCTCAAGTCTCTTGTCTCCAAGTCCGACAAAGACATACTACCAGAGC
서열번호: 116 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2(+19)평면_US29:
TCTGGGGGCTCTCAAGTCTCCATGACACAAGTCCGACAAAGACATACTACCAGAGC
11.4. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭 및 검출
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출이 25 ㎕의 총 반응 부피에서 수행되었다. 반응은 Mx3005p(Stratagene)에서 수행되었다. 사이클 변수는 95℃에서 2분, 95℃에서 15초 및 55℃에서 30초의 5 사이클, 95℃에서 15초 및 52℃에서 60초의 40 사이클(데이터는 52℃ 단계에서 수집)이었다. 반응은 2회 반복 수행되었고, 40 nM 정방향 PASS 프라이머 및 200 nM 파트자임 A(CCB_2i2A/2-P), 200 nM 역방향 프라이머(3CCB), 200 nM 파트자임 B(CCBB/2-P), 200 nM 기질(Sub2-FIB), 8 mM MgCl2, 200 μM의 각각의 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNAase 억제제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(Bioline) 및 gDNA 템플레이트(50 ng) 또는 표적 없음(NF H2O) 중 하나를 포함하였다.
11.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 절단
cUS 및 증폭된 표적 특이적 서열 모두에 상보적인 파트자임을 통한 검출로 CCB의 실시간 검출을 위한 앰플리콘을 생산하기 위하여 PASS 프라이머가 사용되었다. 이 반응은 사용된 표적 서열이 qPCR을 통해 증폭된 인간 gDNA일 때 시간에 따라 형광의 증가를 보여주었다. DNA가 없는 표적 대조군의 형광은 DNA 표적-함유 반응의 것보다 낮았고, 반응 동안 증가하지 않았다. 이것은 표적-함유 반응에서 생산된 형광의 증가는 촉매적으로 활성화된 MNA자임의 표적 의존적 조립과 그 다음 리포터 기질을 절단하는 것에 기인한다는 것을 증명하였다.
다른 PASS 프라이머를 위한 Ct 값
디자인 반응 유형 크기 US bp Ct (Ave) 오리지널로부터 DCt
루프 Original 10 21.5
US - 2 bp 8 21.5 0
US - 1 bp 9 21.5 0
US +2 bp 12 21.8 0.3
US +3 bp 13 23.0 1.5
평면 Original 10 21.4
US +2 bp 12 21.2 -0.2
US +3 bp 13 21.4 0
US +7 bp 17 22.0 0.6
US +12 bp 22 22.1 0.7
US +19 bp 30 22.6 1.2
정방향 PASS 프라이머가 루프된 US를 포함하는 경우, US의 길이가 9 및 8 염기로 감소하였을 때 Ct 값에는 영향이 없었고, 검출이능한 신호는 10 염기의 US 인서트를 포함하는 오리지널 PASS 프라이머에서 관찰된 것과 유사하였다(표 19). 유사하게, 본 실험 조건하에서 US의 12 염기로의 증가는 Ct 값에 영향이 없었으나, US가 13 염기로 증가하였을 때에는 Ct 값이 약간 증가하였다(표 19).
정방향 PASS 프라이머가 평면 US를 포함하는 경우에는, US가 최고 22 염기까지 증가하는 것이 Ct 값에 최소의 영향을 주었다(표 19). US가 29 염기로 증가한 것은 본 실험 조건하에서 Ct 값이 1.2 증가하였고, 표적 서열의 증폭에 약간의 영향을 주었다(표 19).
본 실시예에서 US가 루프 또는 평면 형태인 모든 US 크기를 테스트하기 위해서 동일한 MNA자임이 사용되었다는 것이 주목할 만하다. 이것은 각기 다른 MNA자임에서 직면할 수도 있는 가변성(variability)을 배제할 수 있고, 결과(outcome)가 순전히 PASS 프라이머의 증폭 효율만을 반영한다는 결과가 된다.
이 실험에서의 관찰은 루프 또는 평면 포맷을 따르는 PASS 프라이머 내의 US 인서트의 길이 디자인에 상당한 유연성이 있다는 것을 증명한다.
실시예 12: 관련된 앰플리콘 내의 변종 서열을 건너뛰기 위한 PASS 파트자임의 사용
MNA자임 qPCR 반응에서 PASS 파트자임이 변종-특이적 프라이머와 조합되었다. PASS 프라이머와 유사한 방식으로, PASS 파트자임 또한 시작 템플레이트 표적 서열에 대하여 불일치된 영역을 포함하도록 디자인될 수 있다(도 10). 본 실시예에서, 프라이머는 결실(deletion) 변종 서열만을 특이적으로 증폭하고 야생형 서열은 증폭하지 않도록 디자인되었고, MNA자임은 제1 PASS 파트자임 및 관심 있는 증폭된 표적 서열에 인접하여 결합하는 제2 완전히 일치된 "표준(standard)" 파트자임을 포함한다. PASS 파트자임은 표적 서열, 고유 서열(US)에 상보적이지 않고, 앰플리콘 내에 포함되는 변종 서열에 정렬하도록 디자인된 서열의 영역을 포함하고, 그 결과 하나의 MNA자임이 모든 변종의 검출에 사용될 수 있다. PASS 파트자임 내에 존재하는 US는 PASS 파트자임 내의 상보적이지 않은 염기의 수가 표적 서열 내의 결합되지 않은 염기의 수와 일치되는 경우 평면 형태일 수 있다(도 10, 패널 ii(a)). 다르게는, PASS 파트자임 내에 존재하는 US는 PASS 파트자임 내의 상보적이지 않은 염기의 수가 표적 서열보다 크거나 적을 경우 루프될 수 있고, 서열이 튀어나오거나(bulge) 루프 아웃된다(도 10, 패널 ii(b)). 파트자임 구성요소로부터 활성 MNA자임의 형성은 형광단(fluorophore) 및 소광자 염료 쌍으로 표지된 유니버설 프로브(universal probe)가 절단되게 하여 실시간으로 모니터될 수 있는 신호를 발생한다.
본 실시예에서, 특이적 프라이머는 4개의 EGFR 엑손(exon) 19 결실 변종, c.2236-2250del15 (v4), c.2239-2248>C (v13), c.2239-2253del15 (v15) 또는 c.2240-2257del18 (v20) 각각을 증폭하도록 디자인되었다. 각각의 변종 서열은 다른 길이의 결실된 서열을 포함하여 각각이 특이적 5' 프라이머가 필요한 가변적인 표적을 만들고, 이것은 다양한 결실 연결부(junction)에 걸쳐지도록 디자인되었다. PASS 파트자임 A는 PASS 파트자임의 US 영역이 결실 앰플리콘의 변이 영역과 정렬할 수 있도록 디자인되었기 때문에 4개의 변종 앰플리콘 모두를 검출할 수 있도록 디자인되었다. PASS 파트자임 A는 v13과 평면 형태를 형성하였고, 변종 v4, v15 및v20과 루프 형태를 형성하였다. 증폭된 변종은 PASS 파트자임 A 및 "표준" 파트자임 B, 또는 모든 변종 앰플리콘 또는 만약 발생할 경우 야생형 템플레이트로부터 잘못된 시작(mispriming)의 결과물인 임의의 앰플리콘의 중앙에 완전히 보존된(conserved) 영역에 상보적인 완전히 일치된 표준 파트자임 A 및 B로 어세이하였다. 이것은 PASS 파트자임 내의 US의 MNA자임이 변종 서열을 검출하는 특이성에 대한 영향을 증명하기 위한 대조군으로 사용된다.
12.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임이, 센서 팔(sensor arm)이 표적 서열에 완전히 상보적인 완전히 일치된 "표준" 파트자임이거나, 앰플리콘(US)에 상보적이지 않은 서열의 영역이 앰플리콘에 상보적인 두 영역 사이의 센서 팔에 삽입된 "PASS" 파트자임이도록 디자인되었다. 다음의 서열에서 볼드체로 된 염기는 관심이 있는 표적 서열에 하이브리드화되었고, 밑줄친 염기는 4개의 모든 표적 서열에 대하여 불일치된 고유 서열(US)이다. "-P" 표시는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3' 방향으로 기재되었다.
서열번호: 117 파트자임 B EGFR_1B/56-P:
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTG
서열번호: 118 파트자임 A EGFR_1A/56-P:
GAAAGCCAACAAGGAAATCCTACAACGAGGGGTCGAG
서열번호: 119 파트자임 B EGFR_2B/56-P:
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCAACAAGGAAATCCTCGATGTGA
서열번호: 120 PASS 파트자임 A EGFR_2US15A/56-P:
AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAA CTCTAGCTGTAGCAT GAAAGCACAAC
GAGGGGTCGAG
12.2. 리포터 기질
본 실시예에서, 기질은 5' 말단에서 6-FAM 부위(하기 기질의 명칭에서 "F"로 표시)로, 3' 말단에서 Iowa Black® FQ 퀀처 부위(하기 기질의 명칭에서 "IB"로 표시)로 말단 표지하였다. 기질의 절단은 510-530 nm(CFX96(BioRad) 상에서 FAM 방출 파장) 사이에서 450-490 nm(CFX96(BioRad) 상에서 FAM 여기 파장)에서의 여기로 모니터하였다. 본 실시예를 위한 리포터 기질을 다음의 5'에서 3' 방향의 서열로 보여준다. 소문자 염기는 RNA를, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
서열번호: 121 기질 Sub56-FIB:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
12.3. EGFR DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
플라스미드 DNA의 시험관내 증폭을 다음에 열거한 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 사용하여 수행하였다. 다음의 서열에서 밑줄 친 염기는 야생형에 대한 변종 염기이다. 정방향 프라이머는 결실 특이적이고, 역방향 프라이머는 모든 것에 일정하다. 모든 서열은 5'에서 3' 방향으로 기재하였다.
서열번호: 122 역방향 프라이머 3EGFR:
GCCTGAGGTTCAGAGCCATGG
서열번호: 123 정방향 프라이머 5EGFRv4:
TTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGAC
서열번호: 124 정방향 프라이머 5EGFRv13:
ATTCCCGTCGCTATCAAGGAACC
서열번호: 125 정방향 프라이머 5EGFRv15:
TCCCGTCGCTATCAAGGAATCTC
서열번호: 126 정방향 프라이머 5EGFRv20:
TCCCGTCGCTATCAAGGAATCGA
12.4. 표적 서열
EGFR 유전자의 엑손 19의 영역에 상응하는 서열을 포함하는 DNA 플라스미드가 템플레이트(IDT)으로 사용되었다. 플라스미드는 야생형 서열, 또는 EGFR 엑손 19 결실 변종, c.2236-2250del15 (v4), c.2239-2248>C (v13), c.2239-2253del15 (v15) 또는 c.2240-2257del18 (v20)에 상응하는 서열을 포함하였다. 플라스미드는 사용하기 전에 제조자의 지시에 따라 제한효소 EcoR1(Thermo Scientific)으로 절단하여 선형화하였다.
IM9 세포주로부터 추출한 게놈 DNA를 인간 야생형 EGFR DNA를 나타내는 대조군 DNA 샘플로서 사용하였다.
12.5. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출이 25 ㎕의 총 반응 부피에서 수행되었다. 반응은 CFX96TM 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 수행되었다. 사이클 변수는 95℃에서 2분, 95℃에서 15초 및 61℃에서 60초(사이클마다 1℃씩 감소)의 10 사이클, 95℃에서 15초 및 52℃에서 60초의 40 사이클(데이터는 52℃ 단계에서 수집)이었다. 반응은 2회 반복 수행되었고, 표 20에서 개요를 서술한 것처럼 40 nM 검출-특이적 정방향 프라이머, 100 nM 파트자임 A 및 200 nM 파트자임 B을 포함하였다. 모든 반응은 또한 200 nM 역방향 프라이머(3EGFR), 200 nM 기질(Sub56-FIB), 8 mM MgCl2, 200 μM의 각각의 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNAase 억제제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(Bioline) 및 v4를 위한 플라스미드 DNA 템플레이트(104 카피) 또는 v13(104 카피) 또는 v15(104 카피) 또는 v20(104 카피); 또는 야생형(WT)(104 카피), 또는 IM9 gDNA(35 ng) 또는 IM9 gDNA 템플레이트(100 ng) 또는 표적 없음(NF H2O)의 일정한 백그라운드 100 내에 ~1로 희석된 v4, v13, v15 또는 v20 플라스미드 템플레이트 중 하나를 포함하였다.
변종 어세이를 위한 정방향 프라이머, 파트자임 및 템플레이트 조합
디자인 정방향 프라이머 파트자임 템플레이트 반응 유형
EGFR v4
2236-2250del15 		5EGFRv4
 PASS

EGFR_2B/56-P &
EGFR_2US15A/56-P		 v4 플라스미드 테스트
v4 플라스미드 (1/100) 테스트
WT 플라스미드 음성 대조군
IM9 음성 대조군
NF H20 템플레이트 없음
Standard

EGFR_1B/56-P &
EGFR_1A/56-P		 v4 플라스미드 테스트
v4 플라스미드 (1/100) 테스트
WT 플라스미드 음성 대조군
IM9 음성 대조군
NF H20 템플레이트 없음
EGFR v13
2239-2248>C		 5EGFRv13 PASS

EGFR_2B/56-P &
EGFR_2US15A/56-P		 v13 플라스미드 테스트
v13 플라스미드 (1/100) 테스트
WT 플라스미드 음성 대조군
IM9 음성 대조군
NF H20 템플레이트 없음
Standard

EGFR_1B/56-P &
EGFR_1A/56-P		 v13 플라스미드 테스트
v13 플라스미드 (1/100) 테스트
WT 플라스미드 음성 대조군
IM9 음성 대조군
NF H20 템플레이트 없음
EGFR v15
2239-2253del15 		5EGFRv15 PASS

EGFR_2B/56-P &
EGFR_2US15A/56-P		 v15 플라스미드 테스트
v15 플라스미드 (1/100) 테스트
WT 플라스미드 음성 대조군
IM9 음성 대조군
NF H20 템플레이트 없음
Standard

EGFR_1B/56-P &
EGFR_1A/56-P		 v15 플라스미드 테스트
v15 플라스미드 (1/100) 테스트
WT 플라스미드 음성 대조군
IM9 음성 대조군
NF H20 템플레이트 없음
EGFR
v20 2240-2257del18		 5EGFRv20 PASS

EGFR_2B/56-P &
EGFR_2US15A/56-P		 v20 플라스미드 테스트
v20 플라스미드 (1/100) 테스트
WT 플라스미드 음성 대조군
IM9 음성 대조군
NF H20 템플레이트 없음
Standard

EGFR_1B/56-P &
EGFR_1A/56-P		 v20 플라스미드 테스트
v20 플라스미드 (1/100) 테스트
WT 플라스미드 음성 대조군
IM9 음성 대조군
NF H20 템플레이트 없음
12.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 분해
모든 반응에 있어서, 템플레이트가 없는 대조군의 형광은 DNA 표적-함유 반응에서보다 더 낮았다. 이는 표적-함유 반응에서 생성되는 형광의 증가가, 이후에 범용 리포터 기질을 분해한 촉매적으로 활성인 MNAzyme의 표적 의존성 조립으로 인한 것임을 입증한다.
결실-특이적 정방향 프라이머를 사용하여 EGFR 결실 변종의 실시간 검출을 위한 앰플리콘을 생성시켰다. ΔCt는 프라이머/파트자임 A 조합의 특이성의 척도로 사용되었으며, 이는 결실 앰플리콘에 대한 것과 야생형 템플레이트의 배경 증폭으로부터의 것 사이의 Ct의 차이로서 계산된다. 결실 v4 및 v15를 증폭시키도록 디자인된 프라이머는 모든 반응에서 9.6 이상의 ΔCt를 동반하여 결실에 대한 높은 특이성을 나타냈다. 반면에 v20 결실에 특이적이도록 디자인된 프라이머는 비-특이적으로 거동하였으며, v20 및 야생형 서열 양자 모두를 증폭시켰다. v13에 특이적이도록 디자인된 프라이머는 표준 파트자임을 사용하는 경우에 야생형 플라스미드 및 IM9 gDNA에 대해 각각 6.6 및 4.8의 ΔCt를 생성시켰다.
v4 및 v15 PASS 파트자임 어세이의 경우, gDNA(IM9) 템플레이트를 단독으로 사용했을 때 신호가 생성되지 않았으며, WT 플라스미드는 변종 템플레이트 후에 ΔCt > 15 Ct를 생성시켰다. v20의 경우에는 WT 플라스미드 및 IM9 gDNA가 각각 4.6 및 5.5의 ΔCt를 생성시켰고, v13의 경우에는 WT 플라스미드 및 IM9 gDNA가 각각 10.3 및 10.2의 ΔCt를 생성시켰다(표 21).
결실-특이적 프라이머 및 범용 MNAzyme을 사용하여 수행한 MNAzyme qPCR에 대한 Ct 값
디자인 파트자임 A의 유형 템플레이트 반응 유형 Ct(Ave) ΔCt
EGFR
v4 		PASS
v4 플라스미드 시험 22.6
v4 플라스미드 (1/100) 시험 31.8 -
WT 플라스미드 음성 대조군 38.4 15.8
IM9 음성 대조군 Ct 없음 > 17.4
NF H20 템플레이트 없음 Ct 없음
표준
 V4 시험 17.2
V4 플라스미드 (1/100) 시험 23.9 -
WT 음성 대조군 26.8 9.6
IM9 음성 대조군 27.6 10.4
NF H20 템플레이트 없음 Ct 없음
EGFR
v13		 PASS
 v13 플라스미드 시험 20.1
v13 플라스미드 (1/100) 시험 26.9 -
WT 플라스미드 음성 대조군 30.3 10.3
IM9 음성 대조군 30.4 10.2
NF H20 템플레이트 없음 Ct 없음
표준
 v13 플라스미드 시험 18.2
v13 플라스미드 (1/100) 시험 22.4 -
WT 플라스미드 음성 대조군 24.6 6.6
IM9 음성 대조군 23.0 4.8
NF H20 템플레이트 없음 Ct 없음
EGFR
v15		 PASS
 v15 플라스미드 시험 20.6
v15 플라스미드 (1/100) 시험 28.2 -
WT 플라스미드 음성 대조군 35.6 15
IM9 음성 대조군 Ct 없음 >19.4
NF H20 템플레이트 없음 Ct 없음
표준
 v15 플라스미드 시험 18.0
v15 플라스미드 (1/100) 시험 24.4 -
WT 플라스미드 음성 대조군 32.1 14.1
IM9 음성 대조군 36.2 18.3
NF H20 템플레이트 없음 Ct 없음
EGFR
v20		 PASS
 v20 플라스미드 시험 20.1
v20 플라스미드 (1/100) 시험 25.1
WT 플라스미드 음성 대조군 24.7 4.6
IM9 음성 대조군 25.7 5.5
NF H20 템플레이트 없음 Ct 없음
표준
 v20 플라스미드 시험 18.7
v20 플라스미드 (1/100) 시험 19.5
WT 플라스미드 음성 대조군 18.5 -0.2
IM9 음성 대조군 19.3 1.0
NF H20 템플레이트 없음 Ct 없음
N.B. 음성 대조군 샘플에 대해 Ct가 생성되지 않은 경우에는 50의 최종 Ct를 사용하여 ΔCt를 생성시켰으며 초과 기호(>)를 앞에 위치시켜 ΔCt가 이 값보다 더 높은 것으로 예상될 것임을 표시하였음.
변종 템플레이트를 1/100로 희석한 경우에 v4, v13, 및 v15 어세이는 PASS의 경우 및 어느 정도로는 표준 파트자임 어세이의 경우 양자 모두에 있어서, 비-특이적 야생형 배경 신호로부터 결실 앰플리콘을 검출하고 식별할 수 있었다.
종합하면, 앰플리콘의 검출을 위해 표준 파트자임을 사용하는 반응은 ΔCt를 생성시켰으며, 이는 PASS 파트자임 어세이에 의해 생성된 것보다 더 작았다(표 21). 이는 PASS 파트자임의 사용이 표준 파트자임을 사용하는 것에 비해 반응의 특이성을 크게 개선한다는 것을 입증한다. 추가로, 동일한 PASS 파트자임이, 그것이 루프 형태의 앰플리콘에 결합했든(V4, v15, 및 v20) 평면 형태의 앰플리콘에 결합했든(v13), 결실된 서열에 무관하게 4개의 변종 모두를 검출할 수 있었다. 본 어세이에서 MNAzyme은, 4개의 결실 변종 모두에 상보적인 2개의 영역, 및 앰플리콘 사이에서 변종인 영역에서 4개 모두에 불일치하는 하나의 영역(US 삽입체)을 가진 센서 팔을 가진 하나의 파트자임을 사용했다. 그러므로 이러한 파트자임은 유사한 효율로 4개의 앰플리콘 모두에 결합함으로써 하나의 MNAzyme으로 4개의 변종 모두를 동시에 검출하는 것을 가능하게 할 것으로 예상될 것이다.
실시예 13: 앰플리콘 내의 변종 서열을 스킵하고 변종과 야생형 서열 사이의 식별을 개선하기 위한 PASS 파트자임과 PASS 프라이머의 조합
다른 PASS PCR 전략은 관련 앰플리콘을 분석할 때 반응 효율 및 특이성을 추가로 개선하기 위하여 PASS 파트자임과 PASS 프라이머의 조합을 포함한다. 이러한 전략은 (i) EGFR 엑손 19 내의 결실 변종에 특이적인 S2, (ii) 모든 EGFR 서열에 공통인 S1 영역 및 (iii) 표적 서열에 상보적이지 않은 S1과 S2 사이에 위치하는 제1 US 삽입체(US1)(도 11, 패널 (i))로 디자인된 PASS 프라이머를 포함한다. 본 전략 또한 PASS 파트자임 A를 포함하는 MNAzyme을 가진다. PASS 파트자임 A의 표적 센서 팔은 (i) US1(PASS 프라이머로부터 생성된 모든 앰플리콘에 일치함), (ii) 제2 US 삽입체 US2(PASS 프라이머로부터 생성된 모든 앰플리콘에 불일치함) 및 (iii) 표적의 시작 서열에 상보적인 영역을 포함하는 몇몇 도메인을 함유한다. PASS 파트자임의 US2 영역은 증폭된 표적 서열에 상보적이지 않으며, 상이한 결실의 존재로 인해 서열이 변동되는 곳에서 US2가 앰플리콘 상에 정렬되도록 디자인된다. PASS 파트자임은 그것이 표적 앰플리콘에 결합할 때 평면 입체배좌 또는 루프를 형성해내는 입체배좌를 형성할 수 있다(도 11, 패널 (ii)).
본 실시예에서는 EGFR 엑손 19 결실 c.2235-2249del15(v2)를 증폭시키기 위하여, 완전히 일치하는 "표준" 결실-특이적 프라이머 및 결실-특이적 PASS 프라이머를 디자인하였다. (i) 평면 US2 또는 루프를 형성해내는 US2를 형성하나 US1이 결여된 PASS 파트자임을 함유하는 MNAzyme(표준 프라이머와 함께 사용하기 위함) 또는 (ii) 평면 형태 또는 루프 형태인, US1 및 US2 양자 모두를 혼입시키는 PASS 파트자임을 함유하는 MNAzyme(PASS 프라이머와 함께 사용하기 위함)을 이용하여, 증폭된 결실 변종을 각각 실시간으로 어세이하였다.
13.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
(i) 센서 팔이 앰플리콘에 완전히 상보적인 표준 파트자임, (ii) 대체(alternate) US2 삽입체(US15 또는 US9로 표기됨; 즉, 표적 앰플리콘에 상보적이지 않은 서열의 영역)만을 함유하는 PASS 파트자임, 또는 (iii) US2(US15 또는 US9) 및 US1(i4)(PASS 프라이머에 의해 앰플리콘 내로 삽입된 cUS1에 결합함)을 함유하는 PASS 파트자임인 파트자임을 디자인하였다. 부가적으로, 앰플리콘의 프라이머 영역과 중첩되지 않은 영역 내에서 가변 영역(변종 및 야생형)의 외부에 있는 모든 앰플리콘에 결합하도록 표준 파트자임을 디자인하였다. 변종 결실-특이적 프라이머로 증폭시킬 때, EGFR 엑손 19 내의 가변 영역을 가로질러 모든 결실 변종 앰플리콘에 결합하도록 PASS 파트자임을 디자인하였다. 하기의 서열에서, 볼드체의 염기는 관심의 대상인 표적 서열과 혼성화되고, 밑줄 친 염기는 템플레이트에 대해 불일치하는 제2 고유 서열 삽입체(US2)이다. 밑줄 친 이탤릭체의 영역은 PASS 프라이머에 의해 앰플리콘 내로 혼입된 US1(i4)을 나타낸다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'으로부터 3'으로 기재되었다.
서열 번호 118 파트자임 B EGFR_1A/56-P:
GAAAGCCAACAAGGAAATCCTACAACGAGGGGTCGAG
서열 번호 117 파트자임 B EGFR_1B/56-P:
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTG
서열 번호 119 파트자임 B EGFR_2B/56-P:
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCAACAAGGAAATCCTCGATGTGA
서열 번호 120 PASS 파트자임 A EGFR_2US15A/56-P:
AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAA CTCTAGCTGTAGCAT GAAAGCACAACGAGGGGTCGAG
서열 번호 127 PASS 파트자임 A EGFR_2US9A/56-P:
AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAA CTGTAGCAT GAAAGCACAACGAGGGGTCGAG
서열 번호 128 PASS 파트자임 A EGFR_2i4US9A/56-P:
CCGTC TCAATACCAT GCTATCAA CTGTAGCAT GAAAGCACAACGAGGGGTCGAG
서열 번호 129 PASS 파트자임 A EGFR_2i4US15A/56-P:
CCGTC TCAATACCAT GCTATCAA CTCTAGCTGTAGCAT GAAAGCACAACGAGGGGTCGAG
13.2. 리포터 기질
본 실시예에서는, 5' 단부에서 6-FAM 부위로(하기 기질의 명칭에서 "F"로 표시함), 그리고 3' 단부에서 아이오와 블랙® FQ 켄처 부위로(하기 기질의 명칭에서 "IB"로 표시함) 기질을 단부 표지하였다. 450 내지 490 nm(CFX96(BioRad)에서의 FAM 여기 파장 범위)의 여기를 동반하여 510 내지 530 nm(CFX96(BioRad)에서의 FAM 방출 파장 범위)에서 기질의 분해를 모니터링하였다. 본 실시예를 위한 리포터 기질은 5'으로부터 3'으로의 서열로 하기에 나타낸다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
서열 번호 121 기질 Sub56-FIB:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
13.3. EGFR DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
하기 열거된 결실-특이적 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 사용하여 플라스미드 DNA의 시험관내 증폭을 수행하였다. 하기의 서열에서 밑줄 친 염기는 변종 염기이고, 밑줄 친 이탤릭체의 염기는 US1(i4)을 나타낸다. 모든 서열은 5'으로부터 3'으로 기재되었다.
서열 번호 122 역방향 프라이머 3EGFR:
GCCTGAGGTTCAGAGCCATGG
서열 번호 130 정방향 프라이머 5EGFRv2:
AGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAA
서열 번호 131 정방향 PASS 프라이머 5EGFRv2_i4:
GAAAGTTAAAATTCCCGTC TCAATACCAT GCTATCAAAA
13.4. 표적 서열
EGFR 유전자의 엑손 19의 영역에 상응하는 서열을 함유하는 DNA 플라스미드를 템플레이트(IDT)로 사용하였다. 플라스미드는 야생형 서열 또는 EGFR 결실 변종 v2에 상응하는 서열을 함유하였다. 제조자 지침에 따라 제한 효소 EcoR1(Thermo Scientific)으로 분해함으로써 사용 전에 플라스미드를 선형화하였다. IM9 세포주로부터 추출된 게놈 DNA를 인간 야생형 EGFR DNA를 대표하는 대조군 DNA 샘플로 사용하였다.
13.5. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 25 ㎕의 총 반응 부피에서 수행하였다. CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 반응을 수행하였다. 주기 파라미터는 2 분 동안 95 ℃, 10 주기의 15 초 동안 95 ℃ 및 60 초 동안 61 ℃(-1 ℃/주기), 40 주기의 15 초 동안 95 ℃ 및 60 초 동안 52 ℃였다(52 ℃ 단계에서 데이터를 수집함). 각 세트의 반응 조건은 이중실험으로 시험하였으며, 표 22에 약술한 바와 같은, 40 nM의 정방향 결실-특이적 프라이머, 100 nM의 파트자임 A, 및 200 nM의 파트자임 B를 함유하였다. 모든 반응은 200 nM의 역방향 프라이머(3EGFR), 200 nM의 기질(Sub56-FIB), 8 mM의 MgCl2, 200 μM의 각각의 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNase 저해제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(Bioline)를 함유하였으며, v2에 대한 플라스미드 DNA 템플레이트(104 복제물), IM9 gDNA 템플레이트(35 ng) 또는 야생형 플라스미드(WT)(104 복제물)의 일정한 배경에 ~ 1/100 희석한 v2 플라스미드(102 복제물) 템플레이트, 또는 IM9 gDNA(35 ng)를 함유하거나, 템플레이트를 함유하지 않았다(NF H2O).
변종 어세이를 위한 프라이머, 파트자임, 및 템플레이트 조합
반응 정방향 프라이머 파트자임 템플레이트 반응 유형
표준 프라이머/ 표준 MNAzyme
US 없음		 5EGFRv2 EGFR_1A/56-P EGFR_1B/56-P v2 플라스미드 시험
v2 플라스미드 (1/100) 시험
WT 플라스미드 음성 대조군
IM9 음성 대조군
NF H20 템플레이트 없음
표준 프라이머 /루프를 형성한 PASS 파트자임 A
US2만 있음 		EGFR_2US15A/56-P EGFR_2B/56-P v2 플라스미드 시험
v2 플라스미드 (1/100) 시험
WT 플라스미드 음성 대조군
IM9 음성 대조군
NF H20 템플레이트 없음
표준 프라이머 /평면 PASS 파트자임 A
US2만 있음		 EGFR_2US9A/56-P EGFR_2B/56-P v2 플라스미드 시험
v2 플라스미드 (1/100) 시험
WT 플라스미드 음성 대조군
IM9 음성 대조군
NF H20 템플레이트 없음
PASS 프라이머/ 루프를 형성한 PASS 파트자임 A
US1 및 US2		 5EGFRv2_i4 EGFR_2i4US15A/56-P EGFR_2B/56-P v2 플라스미드 시험
v2 플라스미드 (1/100) 시험
WT 플라스미드 음성 대조군
IM9 음성 대조군
NF H20 템플레이트 없음
PASS 프라이머/ 평면 PASS 파트자임 A
US1 및 US2		 EGFR_2i4US9A/56-P EGFR_2B/56-P v2 플라스미드 시험
v2 플라스미드 (1/100) 시험
WT 플라스미드 음성 대조군
IM9 음성 대조군
NF H20 템플레이트 없음
13.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 분해
모든 반응에 있어서, 템플레이트가 없는 대조군의 형광은 DNA 표적-함유 반응에서보다 더 낮았다. 이는 표적-함유 반응에서 생성되는 형광의 증가가, 이후에 범용 리포터 기질을 분해한 촉매적으로 활성인 MNAzyme의 표적 의존성 조립으로 인한 것임을 입증한다.
PASS 파트자임을 함유하는 MNAzyme과 프라이머의 모든 조합은, 표준 프라이머 및 표준 MNAzyme을 함유하는 어세이에 비교할 때 더 큰 특이성을 유발하였다(표 23). v2의 완전히 일치하는 "표준" 검출에 있어서 ΔCt는 6 내지 7 Ct의 범위였으며, 야생형 신호는 1/100 희석된 샘플 뒤로 ~ 1 내지 2 Ct에 불과하였다.
변종 특이적 프라이머 및 범용 MNAzyme을 사용하여 수행한 MNAzyme qPCR에 대한 Ct 값
정방향 프라이머 파트자임 A 템플레이트 반응 유형 Ct(Ave) ΔCt
표준 표준
v2 플라스미드 시험 16.6
v2 플라스미드 (1/100) 시험 21.9 -
WT 플라스미드 음성 대조군 23.7 7.1
IM9 음성 대조군 22.7 6.1
NF H20 템플레이트 없음 Ct 없음
루프를 형성하는 PASS (US2)
 v2 플라스미드 시험 25.3
v2 플라스미드 (1/100) 시험 35.0 -
WT 플라스미드 음성 대조군 Ct 없음 >14.7
IM9 음성 대조군 Ct 없음 >14.7
NF H20 템플레이트 없음 Ct 없음
평면 PASS (US2)
 v2 플라스미드 시험 23.3
v2 플라스미드 (1/100) 시험 31.8 -
WT 플라스미드 음성 대조군 37.9 14.6
IM9 음성 대조군 37.6 14.3
NF H20 템플레이트 없음 Ct 없음
PASS
(US1)		 루프를 형성하는 PASS (US2 및 US1)
v2 플라스미드 시험 19.0
v2 플라스미드 (1/100) 시험 26.3 -
WT 플라스미드 음성 대조군 36.4 17.4
IM9 음성 대조군 35.8 16.8
NF H20 템플레이트 없음 Ct 없음
평면 PASS (US2 및 US1)
 v2 플라스미드 시험 18.2
v2 플라스미드 (1/100) 시험 25.2 -
WT 플라스미드 음성 대조군 36.0 17.8
IM9 음성 대조군 35.9 17.7
NF H20 템플레이트 없음 Ct 없음
N.B. 음성 대조군 샘플에 대해 Ct가 생성되지 않은 경우에는 50의 최종 Ct를 사용하여 ΔCt를 생성시켰으며 초과 기호(>)를 앞에 위치시켜 ΔCt가 이 값보다 더 높은 것으로 예상될 것임을 표시하였음.
표적 서열과 루프를 형성하는 정렬을 형성하는 PASS 파트자임(Ct 25.3)에 비교하여, 표적 서열과 평면 정렬을 형성하는 US2만을 함유하는 PASS 파트자임으로 구성된 MNAzyme 및 표준 프라이머의 조합은 표적 v2를 더 일찍(Ct 23.3) 검출하였다. 야생형 템플레이트(플라스미드 및 gDNA)로 어세이하는 경우, 루프 및 평면 PASS 파트자임 양자 모두가 유사한 고특이성을 나타냈다(~ 14.5의 ΔCt)(표 23). 변종 템플레이트를 1/100 희석한 경우에 US2만을 함유하는 PASS 파트자임 및 표준 프라이머를 함유하는 v2 어세이는 그것을 검출하고 ~ 5 내지 6의 ΔCt로 야생형의 비-특이적 증폭으로부터 신호를 식별할 수 있었다(표 23).
표적 서열과 평면 정렬을 형성하는 US2 및 US1을 함유하는 PASS 파트자임으로 구성된 MNAzyme과 PASS 프라이머의 조합은, 표적 서열과 루프를 형성하는 정렬을 형성하는 PASS 파트자임(Ct 19.0)에 비교하여, 표적 v2를 약간 더 일찍(Ct 18.2) 검출하였다. 야생형 템플레이트(플라스미드 및 gDNA)로 어세이하는 경우, 평면 PASS 파트자임을 함유하는 어세이는 루프를 형성하는 PASS 파트자임에 비교하여 약간 더 높은 특이성을 나타냈다. 변종 템플레이트를 1/100 희석했을 경우에 US2 및 US1를 함유하는 PASS 파트자임 및 PASS 프라이머를 함유하는 v2 어세이는 ~ 10의 ΔCt로 야생형의 비-특이적 증폭으로부터 신호를 검출하고 식별하였다.
PASS 파트자임을 함유하는 PASS PCR 전략에 PASS 프라이머를 첨가하는 것은 더 이른 Ct로 반응의 효율을 개선했고 더 큰 ΔCt로 반응의 특이성을 개선했다. 본 실험은, 고도로 특이적이고 효율적인 어세이에서의 관련 서열의 분석을 위해 PASS 프라이머를 PASS 파트자임과 조합하는 능력을 입증한다. 본 실시예에서, 불완전하지만 동일한 변종 서열과의 상보성을 가진 단일 PASS 파트자임과 함께 결실-특이적 PASS 프라이머를 사용하는 것은 결실 앰플리콘들을 실시간으로 동시에 검출하는 것을 가능하게 했다.
실시예 14: PASS 파트자임을 포함하는 MNAzyme 및 PASS 프라이머를 함유하는 PASS qPCR 전략의 감도 시험
본 실시예에서는, 야생형 템플레이트의 배경 내의 v2 템플레이트의 연속 희석을 사용하여, v2로 지칭되는 엑손 19 내의 EGFR 결실 변종을 어세이한다. 야생형 템플레이트의 배경 내의 v2의 1/10, 1/100, 및 1/1000 희석을 시험하였다.
US1(i4)을 함유하는 평면 형태의 PASS 프라이머를 v2 서열의 특이적 증폭에 사용한다. PASS 프라이머를 MNAzyme qPCR과 조합하며, 여기서 MNAzyme은 증폭된 표적 서열 뿐 아니라 고유 서열의 상보체(cUS1)에 결합하는 제1 PASS 파트자임을 포함하며, 변종 서열이 있는 곳에서 US2가 앰플리콘 상에 정렬되도록 디자인된 증폭된 표적 서열에 상보적이지 않은 서열의 영역(US2) 또한 함유한다. 제2 파트자임은 관심의 대상인 증폭된 표적 서열 내부의 제1 파트자임에 인접하여 결합한다.
전략의 효율, 선형도, 및 감도에 대해 PASS qPCR을 시험하였다.
14.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
센서 팔이 앰플리콘에 완전히 상보적인 표준 파트자임, 또는 US2(US9로 표기됨) 및 US1 삽입체 i4(이는 PASS 프라이머에 의해 앰플리콘 내로 삽입된 cUS1에 결합함)를 함유하는 PASS 파트자임이 되도록 파트자임을 디자인하였다. 하기의 서열에서, 볼드체의 염기는 관심의 대상인 표적 서열과 혼성화되고, 밑줄 친 염기는 템플레이트에 대해 불일치하는 고유 서열(US2)이다. 밑줄 친 이탤릭체의 영역은 US1(i4)을 나타낸다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'으로부터 3'으로 기재되었다.
서열 번호 119 파트자임 B EGFR_2B/56-P:
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCAACAAGGAAATCCTCGATGTGA
서열 번호 128 PASS 파트자임 A EGFR_2i4US9A/56-P:
CCGTC TCAATACCAT GCTATCAA CTGTAGCAT GAAAGCACAACGAGGGGTCGAG
14.2. 리포터 기질
본 실시예에서는, 5' 단부에서 6-FAM 부위로(하기 기질의 명칭에서 "F"로 표시함), 그리고 3' 단부에서 아이오와 블랙® FQ 켄처 부위로(하기 기질의 명칭에서 "IB"로 표시함) 기질을 단부 표지하였다. 450 내지 490 nm(CFX96(BioRad)에서의 FAM 여기 파장 범위)의 여기를 동반하여 510 내지 530 nm(CFX96(BioRad)에서의 FAM 방출 파장 범위)에서 기질의 분해를 모니터링하였다. 본 실시예를 위한 리포터 기질은 5'으로부터 3'으로의 서열로 하기에 나타낸다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
서열 번호 121 기질 Sub56-FIB:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
14.3. EGFR DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
하기 열거된 결실-특이적 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 사용하여 플라스미드 DNA의 시험관내 증폭을 수행하였다. 하기의 서열에서 밑줄 친 염기는 변종 염기(야생형 서열에 대하여)이고 밑줄 친 이탤릭체의 염기는 US1(i4)을 나타낸다. 모든 서열은 5'으로부터 3'으로 기재되었다.
서열 번호 122 역방향 프라이머 3EGFR:
GCCTGAGGTTCAGAGCCATGG
서열 번호 131 정방향 PASS 프라이머 5EGFRv2_i4:
GAAAGTTAAAATTCCCGTC TCAATACCAT GCTATCAAAA
14.4. 표적 서열
EGFR 유전자의 엑손 19의 영역에 상응하는 서열을 함유하는 DNA 플라스미드를 템플레이트(IDT)로 사용하였다. 플라스미드는 야생형 서열 또는 EGFR 결실 변종 v2에 상응하는 서열을 함유하였다. 제조자 지침에 따라 제한 효소 EcoR1(Thermo Scientific)으로 분해함으로써 사용 전에 플라스미드를 선형화하였다. IM9 세포주로부터 추출된 게놈 DNA를 인간 야생형 EGFR gDNA를 대표하는 대조군 DNA 샘플로 사용하였다.
14.5. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 25 ㎕의 총 반응 부피에서 수행하였다. CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 반응을 수행하였다. 주기 파라미터는 2 분 동안 95 ℃, 10 주기의 15 초 동안 95 ℃ 및 60 초 동안 61 ℃(-1 ℃/주기), 40 주기의 15 초 동안 95 ℃ 및 60 초 동안 52 ℃였다(52 ℃ 단계에서 데이터를 수집함). 각 세트의 반응 조건은 이중실험으로 시험하였으며, 40 nM의 정방향 프라이머(5EGFRv2_i4), 100 nM의 파트자임 A(EGFR_2i4US9A/56-P), 200 nM의 파트자임 B(EGFR_2B/56-P), 200 nM의 역방향 프라이머(3EGFR), 200 nM의 기질(Sub56-FIB), 8 mM의 MgCl2, 200 μM의 각각의 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNase 저해제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(Bioline)를 함유하였으며, v2에 대한 플라스미드 DNA 템플레이트(104 복제물), WT에 대한 플라스미드 DNA 템플레이트(104 복제물), IM9 gDNA 템플레이트(35 ng), IM9 gDNA 템플레이트(35 ng)의 일정한 배경에 1/10, 1/100, 또는 1/1000 희석한 v2에 대한 플라스미드 DNA 템플레이트(104 복제물)를 함유하거나, 표적을 함유하지 않았다(NF H2O).
14.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 분해
PASS 전략을 사용하여 EGFR 결실 변종(v2)의 실시간 검출 및 정량화를 위한 앰플리콘을 생성시켰다. 반응이 v2에 특이적인 표적 서열을 함유하는 경우에 이 반응은 시간 경과에 따른 형광의 증가를 나타냈다(표 23).
Figure 112014085559157-pct00004

v2 결실에 특이적인 플라스미드 DNA 템플레이트를 야생형(IM9) 템플레이트의 배경에 연속하여 10-배 희석하였다. DNA 농도의 로그를 역치 주기(Ct)에 대해 플로팅함으로써 생성된 표준 곡선은, 92%의 효율 및 0.994의 R2를 가진 선형 플롯을 생성시켰다. 각각의 희석의 Ct를 표 23에 나타낸다. 표에 나타낸 Ct 값은 이중실험한 반응에 대한 결과의 평균이다.
PASS 어세이는 야생형의 배경에 1/1000 희석했을 때 v2 서열을 검출할 수 있었다. 음성 대조군 야생형 템플레이트로부터의 신호는 동일한 복제물 수의 변종 템플레이트로부터의 신호 뒤로 ~ 15.7 Ct였다.
템플레이트가 없는 대조군의 형광은 반응 중에 증가하지 않았다. 이는 표적-함유 반응에서 생성되는 형광의 증가가, 이후에 리포터 기질을 분해한 촉매적으로 활성인 MNAzyme의 표적 의존성 조립으로 인한 것임을 입증한다.
PASS 프라이머를 PASS 파트자임과 조합하는, 도 11에 설명된 바와 같은 PASS 전략이 변종 서열의 검출에 있어서 고도로 효율적이고, 특이적이며, 민감하다는 것을 입증한다.
실시예 15: 상이한 길이의 표적 서열을 루프로 형성해낼 수 있는 PASS 프라이머 및 핀치 PASS 프라이머
본 실시예에서는, PASS 프라이머의 S1 및 S2 영역에 상보적인 표적 서열 사이에 위치하는 표적 특이적 영역의 크기를 2개 표적 염기(원래의 루프 PASS 프라이머)(도 12 (iii))로부터 20, 40, 60, 100, 및 200개 표적 염기(표적 루프 PASS 프라이머)(도 12 (i))로 크기에 있어서 증가시켰다. 이를 실행하기 위해, PASS 프라이머의 3' 및 5' 표적 특이적 영역에 상보적인 서열 사이의 표적 서열의 루프를 형성해내는 비-상보적 개재 서열의 크기가 증가하도록, PASS 프라이머의 S1 영역을 더 5' 쪽으로 이동시켰다.
핀치 PASS 올리고뉴클레오티드 내의 US는 그 자체로서 비-상보적 서열의 삽입체가 아니라, 표적의 2개의 불연속 서열을 병치함으로써 생성시킨 고유 서열 접합부(USJ)를 포함한다. 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드에서 서열 S1 및 S2는 표적에 상보적이며 개재 서열에 의해 분리된 2개의 영역에 결합한다. 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드가 표적에 혼성화될 때 개재 표적 서열이 루프를 형성해내어 상보적 표적 영역을 매우 근접시킴으로써 USJ를 함유하는 앰플리콘을 생성시킨다. 본 실시예에서는, S1 및 S2 영역에 상보적인 표적 서열 사이에 위치하는 변동되는 크기의 개재 표적 영역을 가진 핀치 PASS 프라이머를 시험하였다. 루프를 형성해내는 비-상보적 개재 서열의 크기는 10, 20, 60, 및 100 표적 염기의 범위였다(도 12 (ii)).
본 실시예에서는, 루프 PASS 프라이머, 표적 루프 PASS 프라이머, 및 핀치 PASS 프라이머를 사용하여 CCB 유전자의 영역을 증폭시키고 각각의 것을 qPCR에서의 판독을 위한 MNAzyme 검출과 조합하여, 상이한 PASS 프라이머 유형에 의한 표적 루프 형성의 다양한 시나리오가 유전자의 증폭 및 검출과 상용성인지 여부를 결정하였다.
15.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
PASS 프라이머를 통해 도입된 CCB 유전자 및/또는 임의의 cUS를 특이적으로 표적화하도록 파트자임을 디자인하였다. 하기의 서열에서 볼드체의 염기는 관심의 대상인 표적 서열과 혼성화되고, 볼드체의 밑줄 친 염기는 USJ의 양쪽 2개 염기를 나타내며, 밑줄 친 염기는 cUS 삽입체에 혼성화된다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'으로부터 3'으로 기재되었다.
서열 번호 86 파트자임 B CCBB/2-P:
TGCCCAGGGAGGCTAGCTGGTCCATGGCTTCTGGGTA
서열 번호 89 파트자임 A CCB_2i2A/2-P:
AGACATACTA CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
서열 번호 132 파트자임 A CCB_2LT1(10)A/2-P:
TTCTTCTTG GC CAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
서열 번호 133 파트자임 A: CCB_2LT1(20)A4/2-P
CTTGTCTCA GC CAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
서열 번호 134 파트자임 A CCB_2LT1(60)A/2-P:
GATGTGCTA TC CAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
서열 번호 135 파트자임 A: CCB_2LT1(100)A/2-P
GTGAGTTGA TC CAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
15.2. 리포터 기질
본 실시예에서는, 5' 단부에서 6-FAM 부위로(하기 기질의 명칭에서 "F"로 표시함), 그리고 3' 단부에서 아이오와 블랙® FQ 켄처 부위로(하기 기질의 명칭에서 "IB"로 표시함) 기질을 단부 표지하였다. 485 nm(FAM 여기 파장)의 여기를 동반하여 530 nm(FAM 방출 파장)에서 기질의 분해를 모니터링하였다. 본 실시예를 위한 리포터 기질은 5'으로부터 3'으로의 서열로 하기에 나타낸다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
서열 번호 94 기질 Sub2-FIB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
15.3. CCB DNA의 증폭을 위한 표적 서열 및 PCR 프라이머
본 실시예를 위한 표적 서열은 IM9 세포주(Promega)로부터 추출된 인간 gDNA 내의 CCB 유전자였다. 올리고뉴클레오티드 PASS 프라이머는 하기에 열거되어 있다. 하기의 서열에서 볼드체의 염기는 관심의 대상인 표적 서열과 혼성화되고, 볼드체의 밑줄 친 염기는 USJ의 양쪽 2개 염기를 나타내며, 밑줄 친 염기는 USI이다. 모든 서열은 5'으로부터 3'으로 기재되었다.
서열 번호 7 역방향 프라이머 3CCB:
CTCAGGAATTTCCCAGCTAC
서열 번호 13 정방향 PASS 프라이머 5CCB_2i2루프:
TTCTTCTTGGATGGTCATCT AGACATACTA CCAGAGC
서열 번호 136 정방향 PASS 프라이머 5CCB_LTi2(20) :
CTCTGGGGGCTCTCAAGTCT AGACATACTA CCAGAGC
서열 번호 137 정방향 PASS 프라이머 5CCB_LTi2(40):
GGGTAGAAGTCTCTGGGGGC AGACATACTA CCAGAGC
서열 번호 138 정방향 PASS 프라이머 5CCB_LTi2(60):
TGACGGTGTTGGGATGTGCTAT AGACATACTA CCAGAGC
서열 번호 139 정방향 PASS 프라이머 5CCB_LTi2(100):
GGTTTAACTGCAGGTGAGTTGAT AGACATACTA CCAGAGC
서열 번호 140 정방향 PASS 프라이머 5CCB_LTi2(200):
AGCATCGTATTTGGAAGAAGAGG AGACATACTA CCAGAGC
서열 번호 141 정방향 핀치 PASS 프라이머 5CCB_LT1(10):
CTTGTCTCAGTTCTTCTTG GC CAGAGC
서열 번호 142 정방향 핀치 PASS 프라이머 5CCB_LT1(20):
GCTCTCAAGTCTCTTGTCTCA GC CAGAGC
서열 번호 143 정방향 핀치 PASS 프라이머 5CCB_LT1(60):
TGACGGTGTTGGGATGTGCTA TC CAGAGC
서열 번호 144 정방향 핀치 PASS 프라이머 5CCB_LT1(100):
GGTTTAACTGCAGGTGAGTTGA TC CAGAGC
15.4. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭 및 검출
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 25 ㎕의 총 반응 부피에서 수행하였다. CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 반응을 수행하였다. 주기 파라미터는 2 분 동안 95 ℃, 5 주기의 15 초 동안 95 ℃ 및 30 초 동안 55 ℃, 50 주기의 15 초 동안 95 ℃ 및 50 초 동안 52 ℃였다(52 ℃ 단계에서 데이터를 수집함). 모든 반응은 이중실험으로 실험하였으며, 40 nM의 정방향 PASS 프라이머, 200 nM의 파트자임 A(그 조합은 표 24에 열거됨), 200 nM의 역방향 프라이머(3CCB), 200 nM의 파트자임 B(CCBB/2-P), 200 nM의 기질(Sub2-FIB), 8 mM의 MgCl2, 200 μM의 각각의 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNase 저해제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(Bioline)를 함유하였고, gDNA 템플레이트(50 ng)를 함유하거나 표적을 함유하지 않았다(NF H2O).
PASS 프라이머 및 파트자임 A 조합
프라이머 디자인 파트자임 A PASS 프라이머 프라이머 영역 S1 및 S2에 혼성화되지 않는 표적 내의 염기의 수 US 유형 디자인 명칭 (및 도 12와 관련된 번호)
루프 PASS 프라이머 USI CCB_2i2A/2-P 5CCB_2i2루프 2 USI 루프/2 (iii)
USI를 가진 표적 루프 PASS 프라이머 5CCB_LTi2(20) 20 USI 루프/20 (i)
5CCB_LTi2(40) 40 USI 루프/40 (i)
5CCB_LTi2(60) 60 USI 루프/60 (i)
5CCB_LTi2(100) 100 USI 루프/100 (i)
5CCB_LTi2(200) 200 USI 루프/200 (i)
USJ를 가진 핀치 PASS 프라이머 CCB_2LT1(10)A/2-P 5CCB_LT1(10) 10 USJ 핀치/10 (ii)
CCB_2LT1(20)A/2-P 5CCB_LT1(20) 20 USJ 핀치/20 (ii)
CCB_2LT1(60)A/2-P 5CCB_LT1(60) 60 USJ 핀치/60 (ii)
CCB_2LT1(100)A/2-P 5CCB_LT1(100) 100 USJ 핀치/100 (ii)
15.5. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 분해
증폭 및 검출의 결과를 하기의 표 25에 요약한다.
PASS 프라이머 및 파트자임 A 조합에 대한 Ct 값
디자인 디자인 명칭 50ng Ct(Ave) 루프/2로부터의 ΔCt
USI를 가진 루프 PASS 프라이머(프라이머가 루프를 형성해냄) 루프/2 15.6 -
USI를 가진 표적 루프 PASS 프라이머(표적이 루프를 형성해냄) 루프/20 17.0 1.4
루프/40 18.1 2.5
루프/60 20.0 4.4
루프/100 22.9 7.3
루프/200 26.2 10.6
USJ를 가진 핀치 PASS 프라이머(표적이 루프를 형성해냄) 핀치/10 16.1 0.5
핀치/20 16.3 0.7
핀치/60 20.3 4.7
핀치/100 26.7 11.1
Ct값은 루프 또는 핀치(Pinch) 디자인을 갖는 PASS 프라이머가 모두 표적 유전자를 효과적으로 증폭할 수 있음을 나타내고 있다(표 25). 루프/2 디자인을 20 (루프/20)에서 40 (루프/40) 내지 60 (루프/60) 내지 100 (루프/100), 이후 200 (루프/200)까지 범위의 표적 루프 PASS 프라이머와 결합하지 않은 표적 서열의 길이를 갖는 표적 루프 디자인과 비교했을 때, Ct값들은 각각 1.4, 2.5, 4.4, 7.3 및 10.6 증가하였다(표 25). 이것은 프라이머에 하이브리드하지 않는 표적의 긴 서열 스트레치의 존재에도 불구하고 프라이머가 표적에 결합하고 그로부터 연장할 수 있음을 나타낸다.
루프/2 디자인을 10 (핀치/10), 20 (핀치/40), 60 (핀치/60) 또는 100 (핀치/100) 염기들의 S1과 S2 사이에 결합되지 않은 서열을 갖는 핀치 PASS 프라이머 디자인과 비교할 때 Ct는 각각 0.5, 0.7, 4.7 및 11.1 증가하였다(표 25). 이것은 핀치 프라이머가 프라이머와 하이브리드하지 않는 표적의 긴 서열 스트레치의 존재에도 불구하고 표적에 결합하고 그로부터 연장할 수 있음을 입증하고 있다. 핀치/60 (vi) 및 루프/60 (iv)에 대한 Ct값들이 매우 유사하여, cS1과 cS2 사이에 적어도 60 염기의 하이브리드되지 않은 표적을 갖는 핀치 PASS 프라이머와 표적 루프가 비슷하게 효과적으로 작용할 수 있음을 나타내고 있다.
본 실시예는 표적의 서열을 "점프"할 수 있는 PASS 프라이머를 사용할 수 있음을 입증한다. 이것은, 예를 들어 상동성 영역과 가변성 영역을 갖는 두 표적을 증폭하는 것이 바람직할 때 적용한다. PASS 프라이머(핀치 또는 루프)는 가변 영역에 결합하는 것이 아니라 표적의 상동성 영역에 결합하도록 디자인될 수 있다. 프라이머로 결합된 염기의 수가 두 표적에서 동일하게 되기 때문에 이것으로 동등한 효능을 갖는 두 표적을 증폭할 수 있는 하나의 프라이머를 얻을 수 있다.
실시예 16: 상이한 길이의 표적 서열을 루프 아웃하는 핀치 PASS 파트자임 및 PASS 파트자임의 조사
PASS 프라이머 또는 핀치 PASS 프라이머와 유사한 방법으로, PASS 파트자임 또는 핀치 PASS 파트자임도 디자인하여 이것이 파트자임 센서 팔(arm) 또는 표적 서열 또는 이들 모두인지에 대해 서열의 영역을 루프 아웃할 수 있다.
본 실시예에서는, 프라이머가 특별히 TFRC 유전자를 증폭하도록 디자인하였고, MNA자임은 제1 PASS 또는 핀치 PASS 파트자임과, 관심 있는 증폭된 표적 서열에 근접하여 결합하고 있는 제2 완전 일치하는 "표준" 파트자임을 포함한다. PASS 파트자임은 표적 서열에 상보하지 않는 USI 영역을 함유하고, 이것은 관심 있는 표적 서열(cS1 및 cS2)에 상보하는 서열의 두 영역(S1 및 S2) 사이에 위치한다. PASS 파트자임 내에 존재하는 USI는 PASS 파트자임 내 비상보성 염기의 수가 본 실시예에서 5, 10 또는 15 bp인 표적 서열 내의 미결합 염기의 수와 일치되는 경우 플래너(평면) 형태이거나(도 13 (i)), 파트자임 내 비상보성 염기의 수가 본 실시예에서 파트자임이 5, 10 또는 15 bp로 루프 아웃된, 표적 서열 및 서열(파트자임 또는 표적) 벌지(bulge) 또는 루프 아웃의 수보다 크거나 작은 경우 루프될 수 있다(도 13 (ii)). 선택적으로, USI를 함유하지 않지만 그보다 표적 서열(cS1 및 cS2)에 상보하는 서열의 두 영역(S1 및 S2) 사이에서 표적 서열 영역을 루프 아웃하도록 표적에 결합할 때 생성된 USJ를 함유하는 핀치 PASS 파트자임을 사용할 수 있다. 본 실시예에서 핀치 PASS 파트자임으로 루프 아웃된 영역은 5, 10, 15, 20 또는 40 bp 길이이다(도 13 (iii)). 파트자임은 파트자임 구성요소에서 활성 MNA자임의 형성이 형광체와 퀀쳐 염료 쌍으로 표지된 범용 프로브의 절단을 유발하여 실시간 관찰될 수 있는 신호를 생성하도록 디자인되었다.
루프 또는 플래너 PASS 파트자임 또는 핀치 PASS 파트자임의 결합으로 생성된 cS1과 cS2 사이의 비결합 표적의 다양한 시나리오가 TFRC 유전자와 실시간으로 검출이능한 신호를 생성하는 활성 MNA자임의 형성과 양립가능한지를 측정하기 위해 각각의 플래너, 루프 및 핀치 PASS 파트자임을 qPCR에서 판독하기 위한 PCR 증폭과 조합하였다.
16.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
a) 센서 팔들이 완전히 연속적으로 표적 서열에 상보하는 완전 일치하는 "표준" 파트자임, b) 앰플리콘에 상보하지 않는 서열 영역(USI)이 앰플리콘에 상보하는 두 영역 사이의 센서 팔에 삽입된 "PASS" 파트자임 또는 c) 표적 서열의 영역이 앰플리콘에 상보하는 두 영역 사이에서 루프 아웃되어 파트자임의 센서 팔 내에 USJ의 존재를 유발하는 핀치 PASS 파트자임들 중 어느 하나인 파트자임들이 디자인되었다. 하기 서열들에서, 굵게 표시된 염기들이 관심 표적 서열과 하이브리드하며, 밑줄친 굵게 표시된 염기들은 USJ의 양쪽 면의 두 염기들을 나타내며, 밑줄친 염기들은 3개의 표적 서열 모두에 대하여 일치되지 않는 USI이다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'부터 3'으로 기재되었다.
SEQ ID NO: 145 파트자임 B TFRC_2B/84-P:
TGGACGAGGGAGGCTAGCTTCTGACTGGAAAACAGACTCTA
SEQ ID NO: 146 파트자임 A TFRC_2A/84-P:
CTGATTCTAGGAATATGGAAGGAGACTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO: 147 PASS 파트자임 A 평면 TFRC_2P2i15A/84-P:
AGAACTTACGCCTGCTTTCTGATTCTA ATTCACGTCTCATCA ACTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO: 148 PASS 파트자임 A 평면 TFRC_2P2i10A/84-P:
TTACGCCTGCTTTCTGATTCTAGGAAT CGTCTCATCA ACTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO: 149 PASS 파트자임 A 평면 TFRC_2P2i5A/84-P:
CCTGCTTTCTGATTCTAGGAATATGGA CATCA ACTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO: 150 PASS 파트자임 A 루프 TFRC_2L2i15A/84-P:
TTTCTGATTCTAGGAATATGGAAGG ATTCACGTCTCATCA ACTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO: 151 PASS 파트자임 A 루프 TFRC_2L2i10A/84-P:
TTTCTGATTCTAGGAATATGGAAGG CGTCTCATCA ACTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO: 152 PASS 파트자임 A 루프 TFRC_2L2i5A/84-P:
TTTCTGATTCTAGGAATATGGAAGG CATCA ACTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO: 153 Pinch PASS 파트자임 A TFRC_2pp40A/84-P:
CCCTGGGCAAGGAACAATAACTCA GA CTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO: 154 Pinch PASS 파트자임 A TFRC_2pp20A/84-P:
ACTCAGAACTTACGCCTGCTTTCTG AA CTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO: 155 Pinch PASS 파트자임 A TFRC_2pp15A/84-P:
AGAACTTACGCCTGCTTTCTGATTCT AA CTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO: 156 Pinch PASS 파트자임 A TFRC_2pp10A/84-P:
TTACGCCTGCTTTCTGATTCTAGGAA TA CTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO: 157 Pinch PASS 파트자임 A TFRC_2pp5A/84-P:
CCTGCTTTCTGATTCTAGGAATATGG AA CTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
16.2. 리포터 기질
본 실시예에서, 기질은 5' 말단에서는 6-FAM 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "F"로 표시됨)로, 3' 말단에서는 Iowa Black®FQ 퀀쳐 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "IB"로 표시됨)로 말단 표지되었다. 기질의 절단은 450-490 nm(CFX96(BioRad) 상에서의 FAM 여기 파장 범위) 사이에서의 여기로 510-530 nm(CFX96(BioRad) 상에서의 FAM 방출 파장 범위) 사이에서 모니터링되었다. 본 실시예의 리포터 기질을 5'부터 3'으로 기재된 서열로 아래에 나타내었다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
Figure 112014085559157-pct00005

16.3. TFRC의 증폭을 위한 PCR 프라이머 및 표적 서열
본 실시예의 표적 서열은 IM9 세포주(Promega)에서 추출된 인간 게놈 DNA의 TFRC 유전자이다. 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 아래에 기재하였다. 프라이머 서열의 5' 말단에서 굵게 표시된 서열은 유전자 타겟에 대한 프라이머의 특이성에 영향을 주지 않으면서 프라이머의 Tm을 증가하는 tag (T1 또는 T2)에 해당한다. 이러한 tag들은 PCR 반응의 추후 라운드에서 증폭 효능을 개선한다. 프라이머 서열은 5'부터 3'으로 기재되었다.
SEQ ID NO: 159 역방향 프라이머 3TFRC_T2:
CAGCTCTTTCAGCACATTGCTCACA
SEQ ID NO: 160 정방향 프라이머5TFRC_T1:
CTAACTGGGCAAGGAACAATAACTC
16.4. 반응 구성요소: 표적 유전자의 증폭
표적 서열의 실시간 증폭과 검출은 25 μL의 전체 반응부피 중에서 수행되었다. CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 반응을 수행하였다. 사이클링 매개변수는, 95℃에서 2분, 10 사이클의 95℃에서 15초 및 59℃에서 60초 동안(사이클당 -1℃), 50 사이클의 95℃에서 15초 및 50℃에서 50초 동안이었다(데이터는 50℃ 단계에서 수집되었다). 반응조건의 매 세트는 2회 반복 시험되었고, 표 26에 요약한 바와 같이 100 nM의 파트자임 A를 함유하였다. 모든 반응은 40nM의 정방향 프라이머(5TFRC_T1), 200nM의 파트자임 B (TFRC_2B/84-P), 200 nM의 역방향 프라이머(3TFRC_T2), 200 nM의 기질 (Sub84-FIB), 8mM의 MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNAse 억제제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaqTM HS DNA 중합효소(Bioline)를 포함하였고, IM9 gDNA (50 ng 또는 50 pg), 또는 노-타겟(NF H2O) 중 어느 하나를 포함하였다.
Figure 112014085559157-pct00006
16.5. 결과: 타겟의 증폭 및 리포터 기질의 절단
모든 반응에서, 템플레이트가 없는 대조군의 형광은 DNA 표적을 함유하는 반응에서 보다 더 낮았다. 이것은 표적 함유 반응에서 생산된 형광의 증가가 나중에 범용 리포터 기질을 절단하는 촉매적으로 활성인 MNA자임의 표적 의존성 조립 때문인 것을 입증한다.
PASS 파트자임은, 5, 10 또는 15 bp의 고유 서열과 루프하거나 편평하거나 모두 유사하게 작용하여 PASS 파트자임을 함유하지 않는 표준 MNA자임과 비교하여 최대 차이는 50 ng의 템플레이트에 대해 0.6 Ct 및 50 pg의 템플레이트에 대해 0.7 Ct였다(표 27).
Figure 112014085559157-pct00007
5 bp의 앰플리콘을 루핑 아웃하는 핀치 PASS 파트자임은 표준 MNA자임 반응보다 조금 더 나은 정도로 작용하였다. 10, 15 및 20 bp까지 루핑 아웃된 앰플리콘 서열의 크기를 증가시킨 결과, PASS 파트자임을 함유하지 않는 표준 MNA자임과 비교하여 50 ng의 템플레이트에 대해 0.6 Ct 및 50 pg에 대해 0.4 Ct의 최대 증가로 Ct의 최소 이동만을 유발하였다(표 27). 40 bp의 앰플리콘을 루핑 아웃하는 핀치 PASS 파트자임을 표준 MNA자임과 비교했을 때, Ct는 9.1 및 21.8(각각 50 g 및 50 pg) 증가하였다. 이것은 거대 영역 최대 40 bp가 필요하다면 앰플리콘으로부터 루프 아웃될 수 있지만 이것은 이러한 실험조건 하에서 Ct값에 영향을 줄 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
전반적으로, PASS 파트자임을 함유하는 MNA자임 또는 앰플리콘 서열과 충분히 결합하지 않은 핀치 PASS 파트자임을 사용한 표적 서열의 검출은 Ct값과 어세이 감도에 대해 최소한의 영향을 주어 모든 PASS 변종을 표준 MNA자임 어세이와 비슷한 방법으로 50 pg의 템플레이트를 강력하게 검출한다. 이것은 파트자임 센서 팔 중 하나가 연속 표적 서열에 충분히 일치하는되지 않고 이 실험에서 루핑 아웃된 표적 서열이 적어도 최대 40 bp일 수 있을 때 활성 MNA자임 여전히 형성할 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 17: 서열 내 단일염기 변화를 검출하기 위한 MNA자임과 모두 조합된 PASS 프라이머 및 핀치 PASS 프라이머
USI 또는 USJ 중 어느 하나를 함유하는 PASS 프라이머의 특이성을 G12V 및 G12S로 지칭되는 KRAS의 코돈 12에서의 포인트 돌연변이를 표적으로 하는 어세이에서 입증하였다. 본 실시예에서는 변종 G12V 및 G12S를 검출하는 능력과 이들을 야생형과 다른 KRAS G12/G13 변종으로부터 구별하는 능력을 시험하였다.
본 실시예에서, 표적 루프 PASS 프라이머의 S1 및 S2 영역에 상보하는 표적 서열 사이에 위치하는 표적 특이성 영역의 크기는 G12V(도 12(iii))에 대하여는 1에서, 20, 40, 60, 100 및 200까지의 표적 염기 및 G12S (도 12 (i))에 대하여는 10에서, 내지 20, 40 및 60까지의 표적 염기의 크기로 다양하다. 이를 얻기 위해 PASS 프라이머의 S1 영역은 추가로 5' 이동되어 PASS 프라이머의 3' 및 5' 표적 특이적 영역에 상보하는 서열 사이의 표적 서열이 루핑 아웃된 비상보성 매개 표적 서열의 증가한 크기를 갖는다. 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드의 US는 그 자체가 비상보성 서열의 인서트가 아니라 오히려 표적의 두 비인접 서열을 병치하여 생성된 고유 서열 정션(Unique Sequence Junction, USJ)을 포함한다. 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드에서 S1 및 S2 서열은 표적에 상보하고 매개 서열로 분리된 두 영역에 결합한다. 핀치 PASS 올리고뉴클레오티드가 표적에 하이브리드할 때, 매개 표적 서열은 루핑 아웃하여 상보성 표적 영역을 USJ를 함유하는 생성 앰플리콘 가까이에 가져 온다. 본 실시예에서, 핀치 PASS 프라이머는 G12V에 대하여 10 또는 100 표적 염기 그리고 G12S에 대하여 10 표적 염기인 S1 및 S2 영역에 상보하는 표적 서열 사이에 위치한 매개 표적 서열의 크기로 시험하였다(도 12 (ii)).
표적 루프 PASS 프라이머 또는 핀치 PASS 프라이머 각각을 qPCR에서 MNA자임 검출와 조합하여 형광판독으로 표적 루프 PASS 프라이머 또는 핀치 PASS 프라이머에 의한 표적 루핑의 다양한 시나리오가 변종 서열을 야생형 및/또는 다른 변종과 식별하는 능력과 관련하여 반응의 특이성에 영향을 미치는지를 측정하였다.
17.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임은 특별히 변종 G12S 또는 G12V에 대한 KRAS 유전자 및/또는 PASS 프라이머를 통해 삽입된 cUS 인서트를 목표로 하도록 디자인되었다. 이하의 서열에서, 굵게 표시된 염기는 관심 있는 표적 서열과 하이브리드하고, 굵게 표시되고 밑줄친 염기들은 USJ의 양쪽 두 염기들을 나타내며, 밑줄 표시된 염기들은 cUS 인서트와 하이브리드하고 굵게 표시된 이탤릭체의 염기들은 변종 염기(G12S 또는 G12V)를 나타내며 이탤릭체의 밑줄로 표시된 염기들은 추가적인 불일치하는 염기를 나타낸다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'부터 3'으로 기재되었다.
SEQ ID NO: 18 파트자임 B KRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCGTAGGCAAGAGTGCCTT
SEQ ID NO: 161 파트자임 A: G12S_gi2A/55-P:
ACATACTA GTTGGAG G T A GTGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 162 파트자임 A: G12S_LT10A/55-P:
TGAATATA AG TTGGAG G T A GTGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 63 파트자임 B rcKRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCTCCAACTACCACAAGTTT
SEQ ID NO: 64 파트자임 A rcG12V_LMi1A/55-P:
ACAATCAGT CCTACGC G A A CAACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 164 파트자임 A: rcG12V_LT10A/55-P:
ATCGTCA AC CTACGC G A A CAACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 165 파트자임 A: rcG12V_LT100A/55-P:
TGGTCCT GC CTACGC G A A CAACAACGAGAGGTGCGGT
17.2. 리포터 기질
본 실시예에서, 기질은 5' 말단에서는 6-FAM 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "F"로 표시됨)로, 3' 말단에서는 Iowa Black®FQ 퀀쳐 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "IB"로 표시됨)로 말단 표지되었다. 기질의 절단은 450-490 nm(CFX96(BioRad) 상에서의 FAM 여기 파장 범위) 사이에서의 여기로 510-530 nm(CFX96(BioRad) 상에서의 FAM 방출 파장 범위) 사이에서 모니터링되었다. 본 실시예의 리포터 기질을 5'부터 3'으로 기재된 서열로 아래에 나타내었다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
Figure 112014085559157-pct00008

17.3. KRAS DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
인간 gDNA의 시험관 내 증폭을 하기한 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 사용하여 수행하였다. 다음 서열에서, 굵게 표시된 염기는 표적 서열과 하이브리드하고, 밑줄 표시된 염기는 출발 템플레이트과 관련하여 불일치하는 USI(G12S 인서트 i2 및 rcG12V 인서트 i1)이며, 이탤릭체의 굵게 표시된 염기는 변종 염기이며, 굵게 표시되고 밑줄친 염기는 USJ이며 이탤릭체의 밑줄친 염기는 두 표적에 불일치하는 추가 염기를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'으로 기재되었다.
SEQ ID NO: 26 역방향 프라이머 3KRAS:
GGTCCTGCACCAGTAATATGC
SEQ ID NO: 166 정방향 PASS 프라이머 5G12S_gi2평면:
CCTGCTGAAAATGACTGAATATAA AGACATACTA GTTGGAG G T A
SEQ ID NO: 167 정방향 PASS 프라이머 5G12S_LTi2(20):
TATTATAAGGCCTGCTGAAAATGA AGACATACTA GTTGGAG G T A
SEQ ID NO: 168 정방향 PASS 프라이머 5G12S_LTi2(40):
ATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATT AGACATACTA GTTGGAG G T A
SEQ ID NO: 169 정방향 PASS 프라이머 5G12S_LTi2(60):
GTGTGACATGTTCTAATATAGTC AGACATACTA GTTGGAG G T A
SEQ ID NO: 170 정방향 핀치 PASS 프라이머 5G12S_LT10:
CCTGCTGAAAATGACTGAATATA AG TTGGAG G T A
SEQ ID NO: 65 역방향 프라이머 3rcKRAS:
TATTAAAAGGTACTGGTGGAGTA
SEQ ID NO: 66 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_LM3i1루프:
CTGTATCGTCAAGGCACTCTT CACAATCAGT CCTACGC G A A
SEQ ID NO: 172 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_LTi1(20):
CACAAAATGATTCTGAATTAGCT CACAATCAGT CCTACGC G A A
SEQ ID NO: 173 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_LTi1(40):
TTGTTGGATCATATTCGTCCAC CACAATCAGT CCTACGC G A A
SEQ ID NO: 174 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_LTi1(60):
ATATTAAAACAAGATTTACCTCTATT CACAATCAGT CCTACGC G A A
SEQ ID NO: 175 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_LTi1(100):
TATCTGTATCAAAGAATGGTCCTG CACAATCAGT CCTACGC G A A
SEQ ID NO: 176 정방향 PASS 프라이머 5rcG12V_LTi1(200):
TGGTTACATATAACTTGAAACCCAA CACAATCAGT CCTACGC G A A
SEQ ID NO: 177 정방향 핀치 PASS 프라이머 5rcG12V_LT10:
TTCTGAATTAGCTGTATCGTCA AC CTACGC G A A
SEQ ID NO: 178 정방향 핀치 PASS 프라이머 5rcG12V_LT100:
TATCTGTATCAAAGAATGGTCCT GC CTACGC G A A
17.4. 표적 서열
A549 세포 라인에서 추출된 인간 gDNA를 포인트 돌연변인 G12S의 시험관 내 증폭의 템플레이트으로서 사용하였고 SW480 세포 라인에서 추출된 인간 gDNA를 포인트 돌연변인 G12V의 시험관 내 증폭의 템플레이트으로서 사용하였다. IM9(야생형), Calu1(G12C), MDA-MB231(G13D) 및 SW480 (G12V) 세포 라인에서 추출된 인간 gDNA를 KRAS 변종 G12S에 대한 음성 대조군 템플레이트으로서 사용하였고 IM9 및 Calu1 세포주에서 추출된 인간 gDNA를 KRAS 변종 G12V의 음성 대조군 템플레이트으로서 사용하였다.
17.5. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭 및 검출
표적 서열의 실시간 증폭과 검출은 25 μL의 전체 반응부피 중에서 수행되었다. CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 반응을 수행하였다. 사이클링 매개변수는, 95℃에서 2분, 10 사이클의 95℃에서 15초 및 64℃에서 60초 동안, 50 사이클의 95℃에서 15초 및 54℃에서 50초 동안이었다(데이터는 54℃ 단계에서 수집되었다). 반응은 2회 반복 시험되었고, 40nM의 정방향 PASS 프라이머, 100nM의 파트자임 A, 200nM의 역방향 프라이머 및 200nM의 파트자임 B를 함유하였다(조합물을 표 28에 기재하였다). 모든 반응은 200nM의 기질(Sub55-FIB), 8mM의 MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNA아제 억제제(Bioline), 1x ImmoBuffer (Bioline), 2 단위의 MyTaqTM HS DNA 중합효소(Bioline)를 포함하였다. 또한 35ng의 A549 gDNA 템플레이트를 KRAS G12S 표적에 대한 양성 대조군으로 사용하였고 35 ng의 SW480 (G12V), IM9 (WT), Calu1 (G12C) 및 MDA-MB231(MDA) (G13D)를 음성 대조군으로 사용하였으며, 35 ng의 SW480 gDNA 템플레이트를 KRAS G12V 표적에 대한 양성 대조군으로 사용하였고 35 ng의 IM9 (WT)는 음성 대조군으로 사용되었으며 추가 대조군은 표적(NF H2O)을 함유하지 않았다.
Figure 112014085559157-pct00009
17.6. 결과: 타겟의 증폭 및 리포터 기질의 절단
증폭 및 검출 결과를 다음 표 29에 요약하였다.
Figure 112014085559157-pct00010
표 29 - 계속
Figure 112014085559157-pct00011

Ct값(표 29)은 표적 루프 또는 핀치 디자인을 갖는 PASS 프라이머가 표적 유전자를 모두 증폭할 수 있음을 나타내고 있다. G12S 플래너/10 디자인을 PASS 프라이머에 결합하지 않은 표적의 서열 길이가 20 (루프/20)에서 40 (루프/40), 이후 60 (루프/60)으로 증가하는 표적 루프 디자인과 비교할 때 Ct값은 각각 3.0, 6.2 및 7.1 증가하였다. 특이성은 또한 야생형에서 유래한 오프 (off) 표적 신호와 관련하여 가장 특이적 표적 루프를 함유하지 않는, 플래너/10을 갖는 표적 루프의 크기에 의해 영향을 받지만, 루프/20과 루프/40은 다른 변종 서열에 대해 유래한 오프 표적 신호와 관련하여 더 큰 특이성을 나타내었다. 이것은 프라이머가 프라이머에 하이브리드하지 않는 표적의 긴 서열 스트레치의 존재에도 불구하고 표적에 결합하여 연장될 수 있고, 이것이 어세이의 특이성을 더 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
핀치 PASS 프라이머가 G12S (핀치/10)에 대한 10 염기의 S1과 S2 사이 표적에서 결합되지 않은 비상보성 서열과 사용될 때 Ct는 핀치/10에 의한 효율적 프라이밍을 나타내는 원래의 플래너 PASS 프라이머와 비교하여 0.7만큼 증가하였다(표 29). 그러나, 특이성은 핀치 PASS 프라이머에 대해 최상이었고 음성 대조군에 대해 분명한 신호는 없었다. 이것은 핀치 PASS 프라이머가 프라이머에 하이브리드하지 않는 표적의 긴 서열 스트레치의 존재에도 불구하고 표적에 결합하여 연장될 수 있고, 이것이 반응의 특이성을 향상시킬 수 있음을 입증하고 있다.
G12V 루프/1 PASS 프라이머 디자인을 S1과 S2 사이의 표적 루프 PASS 프라이머에 결합하지 않은 표적의 서열 길이가 20 (루프/20)에서 40 (루프/40), 60 (루프/60), 100 (루프/100)으로, 이후 200 (루프/200)으로 증가되는 루프 표적 디자인과 비교할 때 Ct값은 각각 3.0, 7.5, 13, 14.4 및 18.2 증가하였다(표 29). 특이성은 또한 표적 루프의 크기에 의해 영향을 받으며, 가장 특이적 반응은 루프/20, 루프/40 및 루프/60에서 유래하였다. 그러나, 루프/20과 비교하여 양성 반응의 Ct는 루프/40 및 루프/60에서 증가하였다. 루프가 100 또는 200 bp (루프/100 또는 루프/200)일 때 Ct가 크게 증가되었기 때문에 특이성 이점이 상실되었다. 이것은 프라이머가 프라이머에 하이브리드하지 않는 표적의 긴 서열 스트레치의 존재에도 불구하고 표적에 결합하여 연장될 수 있고, 이것이 어세이의 특이성을 더 향상시킬 수 있음을 입증하고 있다.
(10 염기의 S1과 S2 사이에 미결합 서열을 갖는)핀치 PASS 프라이머 G12V (핀치/10)가 사용되면 핀치/10에 의한 효율적인 프라이밍을 표시하는 원래의 루프 PASS 프라이머 (루프/1)와 비교하여 Ct가 0.8 증가하였다(표 29). 특이성도 비슷하였다. 100 bp의 S1과 S2 사이에 미결합 서열을 갖는 핀치 PASS 프라이머가 사용되면 루프/1과 비교하여 특이성의 양호한 수준을 유지하면서 Ct는 14.1 증가하였다(표 29). 이것은 핀치 PASS 프라이머가 프라이머에 하이브리드하지 않는 표적의 긴 서열 스트레치의 존재에도 불구하고 표적에 결합하여 연장될 수 있고, 이것이 반응의 특이성을 향상시킬 수 있음을 입증하고 있다.
본 실시예에서는 표적 내 서열을 통해 "점프"할 수 있는 PASS 프라이머를 사용할 수 있는 것이 입증되었다. 또한 PASS 프라이머의 종류는 그것이 USJ 또는 USI를 함유하는지와 상관없이 변종 서열이 구별되어야 하는 경우 가장 특이적 어세이를 결정하기 위해 선별될 수 있다.
실시예 18: 서열 내의 단일 염기 변화를 검출하기 위한, 대립형질 특이적 MNA자임, 일반적 MNA자임 또는 TaqMan ® 과 조합된 PASS 프라이머 대 워블 (wobble)-강화 ARMS(WE-ARMS) 프라이머 양자의 민감성 비교
본 실시예에서, G12V로 지칭되는 코돈 12 내 KRAS 포인트 돌연변이를 G12V 템플레이트의 연속 희석을 사용하여 야생형 KRAS 템플레이트의 배경에서 어세이하였다. 야생형 배경으로 G12V의 10, 100 및 1000 중 1의 희석물을 시험하였다.
디자인 3 (도 7) 플래너 PASS 프라이머를 G12V 서열의 증폭에 사용하였다. 이것을 G12V WE-ARMS 프라이머와 비교하였다. PASS 프라이머를 대립형질 특이적 MNA자임 qPCR 판독, 일반적 MNA자임 qPCR 판독 또는 TaqMan® 프로브 판독과 조합하였다. 대립형질 특이적 시스템에서 MNA자임 결합 영역은 프라이머 결합 영역(PASS 또는 WE-ARMS 프라이머)과 오버랩하는 반면; 일반적 시스템에서 MNA자임 또는 TaqMan® 프로브는 앰플리콘 안쪽에 위치하여 PASS 또는 WE-ARMS 프라이머에 연관된 서열에 대한 오버랩을 갖지 않는다. PASS 어세이에 있어서, 대립형질 특이적 MNA자임은 변종(돌연변이) 염기와 PASS 프라이머에 의해 도입된 불일치 염기의 보체를 함유하는 증폭된 표적 서열뿐만 아니라 고유 서열(cUS)의 보체와 결합하는 제1 파트자임을 포함한다. 제2 파트자임은 주목되는 증폭된 표적 서열 내의 제1 파트자임에 인접하여 결합한다. 일반적 MNA자임과 TaqMan® 프로브는 모두 변종(돌연변이) 염기의 서열 하부에 결합하고, 이러한 어세이는 돌연변이에 대해 특이성을 제공하는 프라이머에만 의존하는데, 왜냐하면 이들은 야생형과 돌연변이 서열 간의 식별에 고유한 메카니즘을 제공하지 않기 때문이다. WE-ARMS 프라이머를 대립형질 특이적 MNA자임 qPCR 판독, 일반적 MNA자임 qPCR 판독 또는 TaqMan® 프로브 중 하나를 갖는 MNA자임과 조합하였다. 이러한 WE-ARMS 프라이머 어세이에 있어서, 대립형질 특이적 MNA자임은 변종(돌연변이) 염기와 WE-ARMS 프라이머에 의해 도입된 불일치 염기의 보체를 함유하는 증폭된 표적 서열과 결합하는 제1 파트자임을 포함한다. 제2 파트자임은 주목되는 증폭된 표적 서열 내에서 제1 파트자임에 인접하여 결합한다. 일반적 MNA자임 및 TaqMan® 프로브는 모두 변종(돌연변이) 염기의 서열 하부에 결합하며, 이전처럼 야생형과 돌연변이 서열 간의 식별을 위한 추가적인 메카니즘을 제공하지 않는다.
PASS 프라이머를 WE-ARMS 프라이머와 비교하여 각 증폭과 검출 전략의 효율, 일관성 및 감수성을 조사하였다.
18.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
대립형질 특이적 MNA자임은 PASS 프라이머의 경우에 cUS 인서트뿐만 아니라 프라이머에 의해 도입된 불일치와 G12V 서열을 특별히 표적으로 하는 파트자임으로 디자인되었다. 일반적 MNA자임은 변종 염기 또는 프라이머에 의해 도입된 추가적인 불일치와 결합하지 않는, 즉 PASS 프라이머 경우에 이들이 cUS에 결합하지 않는 파트자임으로 디자인되었다. 이하의 서열에서, 굵게 표시된 염기는 관심 있는 표적 서열과 하이브리드하고, 밑줄친 염기들은 US 인서트 (i2)이며, 이것은 출발 템플레이트에 대하여 불일치하는다. 굵게 표시된 이탤릭체의 염기들은 변종(돌연변이) 염기를 나타내며 이탤릭체의 밑줄로 표시된 염기들은 추가적인 불일치하는 염기를 나타낸다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'부터 3'으로 기재되었다.
SEQ ID NO: 18 파트자임 B KRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCGTAGGCAAGAGTGCCTT
SEQ ID NO: 24 PASS 파트자임 A G12V_LMi2A/55-P:
AGACATACTA TGGAGC C G T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 44 파트자임 A G12V_MA/55-P:
TGTGGTAGTTGGAGC C G T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 179 파트자임 A KRAS_5A/55-P: GCTAATTCAGAATCATTTTGTGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 180 파트자임 B KRAS_5B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGACGAATATGATCCAACAATAG
18.2. 리포터 기질
본 실시예에서, 기질은 5' 말단에서는 6-FAM 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "F"로 표시됨)로, 3' 말단에서는 Iowa Black®FQ 퀀쳐 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "IB"로 표시됨)로 말단 표지되었다. 기질의 절단은 450-490 nm(CFX96(BioRad) 상에서의 FAM 여기 파장 범위) 사이에서의 여기로 510-530 nm(CFX96(BioRad) 상에서의 FAM 방출 파장 범위) 사이에서 모니터링되었다. 본 실시예의 리포터 기질을 5'부터 3'으로 기재된 서열로 아래에 나타내었다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
Figure 112014085559157-pct00012
18.3. TaqMan ® 프로브
TaqMan® 프로브를, 변종 염기 또는 프라이머를 통해 도입된 임의의 불일치에 결합되지 않고 PASS 프라이머의 경우 cUS와도 결합하지 않도록 디자인하였다. TaqMan® 프로브를 5' 말단 (하기 프로브 명에서 "F"로 지정)에서 6-FAM 부분 및 3' 말단 (하기 프로브 명에서 "MGB"로 지정)에서 마이너 그루브 결합 부분으로 말단 표지하였다. TaqMan® 프로브의 절단을 510-530 nm (CFX96 (BioRad)에서의 FAM 방출 파장 범위) 사이에서 모니터링하였다 (450-490 nm (CFX96 (BioRad)에서의 FAM 여기 파장 범위) 사이에서 여기). 하기 서열에서 볼드체의 염기는 관심 표적 서열과 하이브리드화한다. 서열은 5'에서 '3로 기재되었다.
SEQ ID NO: 181 TaqMan 프로브 KRAS_5-FMGB:
CAAGAGTGCCTTGACGATAC
18.4. KRAS DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
시험관내 인간 gDNA의 증폭을 후술하는 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 사용하여 수행하였다. 하기 서열에서 볼드체의 염기는 표적 서열과 하이브리드화하고, 밑줄친 염기는 출발 템플레이트에 대해 불일치인 US 인서트 i2이며, 밑줄친 볼드체의 염기는 변종 염기이고, 이탤릭체의 염기는 양 표적에 대해 불일치인 추가 염기 (M)를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 '3로 기재되었다.
SEQ ID NO: 26 역방향 프라이머 3KRAS:
GGTCCTGCACCAGTAATATGC
SEQ ID NO: 87 정방향 PASS 프라이머 5G12V_LM4i2평면:
CTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC AGACATACTA TGGAGC C G T
SEQ ID NO: 46 정방향 WE-ARMS 프라이머 5G12V_M:
CTTGTGGTAGTTGGAGC C G T
18.5. 표적 서열
SW480 세포주로부터 추출한 인간 gDNA를 변종점 돌연변이 G12V를 함유하는 KRAS 유전자의 시험관내 증폭을 위한 템플레이트로 사용하였다. 세포주 K562로부터 추출한 KRAS 야생형 gDNA의 일정한 백그라운드에서 SW480을 일련적으로 희석하여 보정 곡선을 작성하였다.
18.6. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭 및 정량
표적 서열의 실시간 증폭 및 정량을 25 μL의 총 반응 부피로 수행하였다. 반응은 중복 수행하고, CFX96TM 실시간 PCR 검출 시스템 (BioRad)에서 행하였다. 사이클링 파라미터는 95℃에서 2 분, 5 초간 95℃ 및 20 초간 54℃의 60 사이클이었다 (54℃ 단계에서 데이터 수집). MNAzyme 반응은 40 nM 정방향 프라이머, 100 nM 파트자임 A, 및 200 nM 파트자임 B (조합이 표 30에 기술되었다) 뿐만 아니라 400 nM 역방향 프라이머 (3KRAS), 200 nM 기질 (Sub55-FIB) 및 8 mM MgCl2를 함유하였다. TaqMan 반응은 300 nM 정방향 프라이머, 900 nM 역방향 프라이머 (3KRAS), 250 nM TaqMan® 프로브 (KRAS_5-FMGB) 및 4 mM MgCl2를 함유하였다. 모든 반응은 200 μM의 각 dNTP, 10 단위 RiboSafe RNAase 억제제 (Bioline), 1x ImmoBuffer (Bioline), 2 단위 of MyTaqTM HS DNA 중합효소 (Bioline) 및 각각의 SW480 gDNA 템플레이트 (35 ng), K562 gDNA 템플레이트 (35 ng)의 일정한 백그라운드에서 1/10, 1/100 또는 1/1000 희석된 SW480 gDNA 템플레이트, K562 gDNA 템플레이트 (35 ng) 또는 무표적 (NF H2O)을 함유하였다.
변종 어세이를 위한 올리고뉴클레오티드 조합
프라이머 디자인 qPCR 판독 정방향 프라이머 파트자임 A & B TaqMan® 프로브 역방향 프라이머
PASS 대립형질 특이적 MNAzyme 5G12V_LM4i2평면 G12V_LMi2A/55-P & KRAS_B/55-P - 3KRAS
제네릭 MNAzyme KRAS_5A/55-P & KRAS_5B/55-P -
TaqMan® 프로브 - KRAS_5-FMGB
WE_ARMS 대립형질 특이적 MNAzyme 5G12V_M G12V_MA/55-P & KRAS_B/55-P -
제네릭 MNAzyme KRAS_5A/55-P & KRAS_5B/55-P -
TaqMan® 프로브 - KRAS_5-FMGB
18.7. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 절단
PASS 및 WE-ARMS 정방향 프라이머를 KRAS 점 돌연변이 (G12V)의 실시간 검출 및 정량을 위한 앰플리콘 생성에 이용하였다. MNAzymes를 대립형질 특이적이어서 돌연변이 서열을 증폭하는데 사용하기에 특이적인 PASS 또는 WE-ARMS 프라이머의 보체 검출에 적당하도록 디자인되거나; 또는 MNAzymes는 제네릭으로서, MNAzyme로 하이브리화되는 서열이 표적 KRAS 변종의 증폭 또는 오프-표적 야생형으로부터 생성되는 모든 앰플리콘에 존재한다. 유사하게, TaqMan® 프로브는 또한, 모든 KRAS 변종 및 야생형 앰플리콘에 존재하는 서열에 결합하도록 디자인되었다. 이들 반응은 반응이 G12V에 특이적인 표적 서열을 함유하는 경우, 시간 경과에 따라 형광 증가를 나타내었다 (표 31).
G12V에 특이적인 SW480 DNA 템플레이트를 G12를 함유하는 K562 템플레이트의 백그라운드에서 10-배 일련적으로 희석하였다. DNA의 일련의 희석물을 PASS 또는 WE-ARMS 정방향 프라이머로 증폭하고, 대립형질 특이적 MNAzyme, 제네릭 MNAzyme 또는 TaqMan® 프로브를 사용하여 실시간으로 검출하였으며, 각 희석의 Ct는 표 31에 나타내었다. 표에 나타낸 Ct 값은 중복 반응에 대한 결과의 평균이다. △Ct 값은 동일랑의 DNA가 존재하는 경우, 오프-표적 야생형 대조 앰플리콘과 비교한 KRAS 돌연변이 앰플리콘의 검출에 대해 관찰된 사이클수의 차이를 나타낸다.
대립형질 특이적 MNAzyme로의 검출에 대한 Ct 값은 제네릭 MNAzyme 및 TaqMan® 프로브에 비해 다소 높았다 (표 31); 그러나, 이 새로운 디자인은 반응에 더 특이성을 제공하였다. 대립형질 특이적 MNAzyme을 갖는 PASS 프라이머의 사용으로 매우 특이적인 반응이 초래되었으며, 야생형 음성 대조군으로부터 신호는 생성되지 않았다. 제네릭 MNAzyme 및 TaqMan® 프로브가 각각 8.7 및 7.0인데 반해 돌연변이와 야생형간 △Ct 는 16.9로 증가되었기 때문에, 대립형질 특이적 MNAzyme과 WE-ARMS 프라이머의 조합은 또한 반응 특이성을 개선하였다.
제네릭 MNAzyme 또는 TaqMan® 프로브 판독을 WE-ARMS 프라이머 대신 PASS 프라이머에 적용하면 WE-ARMS 프라이머에 비해 △Ct 증가로 특이성을 더 크게 하는 것으로 입증되었다 (표 31). 또, PASS 프라이머의 사용은 야생형으로부터 G12V 서열의 검출 한계를 증가시켰다. WE-ARMS 프라이머 제네릭 MNAzyme의 사용은 Ct 차가 1.2로 명백히 1/100 돌연변이 희석 및 음성 대조군 (K562 - 야생형)을 식별하지 못했다. 이에 반해, PASS 프라이머는 1/100의 검출이 용이하였고, 1/1000 희석과 음성 대조군 간 Ct 차는 1.6이었다. PASS 프라이머를 사용하는 경우 TaqMan® 판독을 지니는 WE-ARMS에 비해 유사 이점이 또한 나타났다. TaqMan® 판독을 지니는 WE-ARMS 프라이머의 사용은 Ct 차가 0.2로 명백히 1/100 및 음성 대조군 (K562 - 야생형)을 식별하지 못한 반면; PASS 프라이머는 1/100의 검출이 용이하였고, 1/1000 희석과 음성 대조군 간 Ct 차는 0.6이었다. 이는 PASS 프라이머의 이점이 PASS 프라이머의 디자인에 고유하고, 월등한 결과가 판독을 위해 사용된 방법과는 무관함을 입증한다 (대립형질 특이적 MNAzymes 대 제네릭 MNAzyme 대 TaMan® 프로브). 본 실험에서 증명된 바와 같이, PASS 프라이머는 또한 TaqMan®과 같은 다른 qPCR 화합물체에 커플링되는 경우 유리하다. 또, PASS 프라이머는 분자 Beacons 또는 Scorpion 프로브와 같은 추가적인 qPCR 화합물체와 조합될 수 있다.
돌연변이 DNA (SW480) 또는 야생형 DNA (K562)의 증폭 또는 K562 DNA에서 SW480의 희석 후 G12V PASS vs. WE-ARMS 프라이머에 대한 Ct 값. 적어도 2 사이클의 △Ct 로 야생형과 구분이 가능한 최저 희석은 각 기술 조합에 대해 밑줄을 그어 나타내었다.
템플레이트 PASS 프라이머 Ct (Ave) WE-ARMS 프라이머 Ct (Ave)
대립형질 특이적 MNAzyme 35 ng SW480 33.0 32.2
1 in 10 37.7 37.6
1 in 100 40.9 42.0
1 in 1000 43.6 50.2
35 ng K562 No Ct 49.1
△Ct
35 ng SW480 대 K562 		- 16.9
제네릭 MNAzyme 35 ng SW480 29.1 28.1
1 in 10 33.7 32.8
1 in 100 37.1 35.6
1 in 1000 39.8 36.4
35 ng K562 41.4 36.8
△Ct
35 ng SW480 대 K562 		12.3 8.7
TaqMan ® 프로브 35 ng SW480 26.4 25.7
1 in 10 31.2 30.1
1 in 100 34.8 32.3
1 in 1000 38.1 32.9
35 ng K562 38.7 32.7
△Ct
35 ng SW480 대 K562 		12.3 7.0
실시예 19: MNAzyme 판독과 조합된 PASS 프라이머에서 상이한 특징 서열 (US) 비교
본 실시예에서는, 15개의 상이한 특징 서열 (US)을 CCB 유전자에 특이적인 PASS 프라이머에 인서팅하였다. 루프 또는 평면 형태로 US 인서트를 함유하는 PASS 프라이머는 US i1, i1a, i2, i2a, i2b, i3, i4, i5, i5a, i6, i7, i8, i9, i10 또는 i11을 함유하였다 (표 32).
PASS 프라이머를 MNAzyme qPCR과 조합하였는데, 여기서 MNAzymes는 CCB에 맞추어진 증폭 표적 서열뿐 아니라 특징 서열 (cUS)의 보체에 결합하는 제1 파트자임이다. 제2 파트자임은 증폭된 관심 표적 서열 상에서 제1 파트자임에 인접하여 결합한다.
PASS 프라이머 및 파트자임을 각 US에 대해 디자인하여 다양한 특징 서열이 유전자의 증폭 및 검출에 적당한지를 조사하였다.
각 US 인서트의 번호 및 서열
인서트 번호 서열 (5'에서 3'로)
i1 (SEQ ID NO: 182) CACAATCAGT
i1a (SEQ ID NO: 183) CACAATGATG
i2 (SEQ ID NO: 184) AGACATACTA
i2a (SEQ ID NO: 185) AGACAGTTAC
i2b (SEQ ID NO: 186) AGAGTCATTC
i3 (SEQ ID NO: 187) CGTTGGCTAC
i4 (SEQ ID NO: 188) TCAATACCAT
i5 (SEQ ID NO: 189) GATTCGAGAA
i5a (SEQ ID NO: 190) GATTCGAGTT
i6 (SEQ ID NO: 191) GTTACCTGAA
i7 (SEQ ID NO: 192) CATTAGTGCC
i8 (SEQ ID NO: 193) CATTGACAGA
i9 (SEQ ID NO: 194) CGAAAGCGAC
i10 (SEQ ID NO: 195) CGTCTCATCA
i11 (SEQ ID NO: 196) GGATTAGATC
19.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임을 CCB 유전자 및 PASS 프라이머를 통해 도입된 임의의 cUS를 특이적으로 표적하도록 디자인하였다. 하기 서열에서 볼드체의 염기는 관심 표적 서열과 하이브리드화하고, 밑줄친 염기는 출발 템플레이트에 대해 불일치인 특징 서열 인서트 (i1, i1a, i2, i2a, i2b, i3, i4, i5, i5a, i6, i7, i8, i9, i10 또는 i11)이다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3-포스포릴화를 가리킨다. 모든 서열은 5'에서 3'로 기재되었다.
SEQ ID NO: 86 파트자임 B CCBB/2-P:
TGCCCAGGGAGGCTAGCTGGTCCATGGCTTCTGGGTA
SEQ ID NO: 197 파트자임 A CCB_2i1A/2-P:
CACAATCAGT CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 198 파트자임 A CCB_2i1aA/2-P:
CACAATGATG CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 89 파트자임 A CCB_2i2A/2-P:
AGACATACTA CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 199 파트자임 A CCB_2i2aA/2-P:
AGACAGTTAC CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 200 파트자임 A CCB_2ibA/2-P:
AGAGTCATTC CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 201 파트자임 A CCB_2i3A/2-P:
GTTGGCTAC CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 202 파트자임 A CCB_2i4A/2-P:
TCAATACCAT CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 203 파트자임 A CCB_2i5A/2-P:
GATTCGAGAA CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 204 파트자임 A CCB_2i5aA/2-P:
GATTCGAGTT CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 205 파트자임 A CCB_2i6A/2-P:
GTTACCTGAA CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 206 파트자임 A CCB_2i7A/2-P:
CATTAGTGCC CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 207 파트자임 A CCB_2i8A/2-P:
CATTGACAGA CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 208 파트자임 A CCB_2i9A/2-P:
GAAAGCGAC CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 209 파트자임 A CCB_2i10A/2-P:
CGTCTCATCA CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 210 파트자임 A CCB_2i11A/2-P:
GGATTAGATC CCAGAGCCCAACAACGAGAGGAAACCTT
19.2. 리포터 기질
본 실시예에서는, 기질을 5' 말단 (하기 프로브 명에서 "F"로 지정)에서 6-FAM 부분 및 3' 말단 (하기 프로브 명에서 "IB"로 지정)에서 Iowa Black® FQ 퀀처 부분으로 말단 표지하였다. 기질의 절단을 510-530 nm (CFX96 (BioRad)에서의 FAM 방출 파장 범위) 사이에서 모니터링하였다 (450-490 nm (CFX96 (BioRad)에서의 FAM 여기 파장 범위) 사이에서 여기). 본 실시예를 위한 리포터 기질을 서열과 함께, 5'에서 3'으로 나타내었다. 소문자는 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
SEQ ID NO: 94 기질 Sub2-FIB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
19.3. CCB DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
인간 gDNA에서 CCB 유전자의 시험관내 증폭을 후술하는 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 사용하여 수행하였다. 정방향 프라이머가 CCB에 대해 특이적이고 US 인서트 (i1, i1a, i2, i2a, i2b, i3, i4, i5, i5a, i6, i7, i8, i9, i10 또는 i11)를 함유하도록 PASS 프라이머를 디자인하였다. 하기 서열에서 밑줄친 염기는 출발 템플레이트에 대해 불일치인 특징 서열 인서트가다. L은 루프 형성에서의 US를 나타내고, P는 평면 형성에서의 US를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'로 기재되었다.
SEQ ID NO: 7 역방향 프라이머 3CCB:
CTCAGGAATTTCCCAGCTAC
SEQ ID NO: 211 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi1:
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCACAATCAGTCCAGAGC
SEQ ID NO: 212 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li1:
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATCACAATCAGTCCAGAGC
SEQ ID NO: 213 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi1a:
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCACAATGATGCCAGAGC
SEQ ID NO: 214 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li1a:
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATCACAATGATGCCAGAGC
SEQ ID NO: 215 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li2:
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO: 216 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi2:
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAGAGC
SEQ ID NO: 217 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi2a:
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACAGTTACCCAGAGC
SEQ ID NO: 218 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li2a:
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATAGACAGTTACCCAGAGC
SEQ ID NO: 219 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi2b:
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGAGTCATTCCCAGAGC
SEQ ID NO: 220 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li2b:
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATAGAGTCATTCCCAGAGC
SEQ ID NO: 221 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi3:
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCGTTGGCTACCCAGAGC
SEQ ID NO: 222 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li3:
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATCGTTGGCTACCCAGAGC
SEQ ID NO: 223 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi4:
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGTCAATACCATCCAGAGC
SEQ ID NO: 224 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li4
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATTCAATACCATCCAGAGC
SEQ ID NO: 225 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi5
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGGATTCGAGAACCAGAGC
SEQ ID NO: 226 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li5
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATGATTCGAGAACCAGAGC
SEQ ID NO: 227 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi5a:
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGGATTCGAGTTCCAGAGC
SEQ ID NO: 228 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li5a:
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATGATTCGAGTTCCAGAGC
SEQ ID NO: 229 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi6:
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGGTTACCTGAACCAGAGC
SEQ ID NO: 230 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li6:
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATGTTACCTGAACCAGAGC
SEQ ID NO: 231 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi7:
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCATTAGTGCCCCAGAGC
SEQ ID NO: 232 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li7:
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATCATTAGTGCCCCAGAGC
SEQ ID NO: 233 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi8:
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCATTGACAGACCAGAGC
SEQ ID NO: 234 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li8:
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATCATTGACAGACCAGAGC
SEQ ID NO: 235 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi9:
CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCGAAAGCGACCCAGAGC
SEQ ID NO: 236 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li9:
TTCTTCTTGGATGGTCATCTCGAAAGCGACCCAGAGC
SEQ ID NO: 237 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi10:
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGCGTCTCATCACCAGAGC
SEQ ID NO: 238 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li10:
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATCGTCTCATCACCAGAGC
SEQ ID NO: 239 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Pi11:
CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGGGATTAGATCCCAGAGC
SEQ ID NO: 240 정방향 PASS 프라이머 5CCB_Li11:
TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATGGATTAGATCCCAGAGC
19.4. 표적 서열
IM9 세포주로부터 추출한 인간 gDNA를 CCB 유전자의 시험관내 증폭을 위한 템플레이트로 사용하였다.
19.5. 표적 서열의 증폭 및 정량
표적 서열의 실시간 증폭 및 정량을 25 μL의 총 반응 부피로 수행하였다. 반응은 CFX96TM 실시간 PCR 검출 시스템 (BioRad)에서 행하였다. 사이클링 파라미터는 95℃에서 2 분, 15 초간 95℃ 및 30 초간 55℃의 5 사이클, 15 초간 95℃ 및 50 초간 52℃의 40 사이클이었다 (52℃에서 데이터 수집). 모든 반응은 중복으로 실행하였고, 40 nM 정방향 프라이머, 200 nM 파트자임 A (표 33에 기술되었다) 뿐만 아니라 200 nM 역방향 프라이머 (3CCB), 200 nM 파트자임 B (CCBB/2-P), 200 nM 기질 (Sub2-FIB), 8 mM MgCl2, 200 μM의 각 dNTP, 10 단위 RiboSafe RNAase 억제제 (Bioline), 1x ImmoBuffer (Bioline), 2 단위의 MyTaqTM HS DNA 중합효소 (Bioline) 및 IM9 gDNA 템플레이트 (50 ng) 또는 무표적 (NF H2O)을 함유하였다.
정방향 PASS 프라이머 및 파트자임 A 조합.
특징 서열 파트자임 A 정방향 PASS 프라이머 PASS 타입
인서트 1 CCB_2i1A/2-P 5CCB_Li1 루프
5CCB_Pi1 평면
인서트 1a CCB_2i1aA/2-P 5CCB_Li1a 루프
5CCB_Pi1a 평면
인서트 2 CCB_2i2A/2-P 5CCB_Li2 루프
5CCB_Pi2 평면
인서트 2a CCB_2i2aA/2-P 5CCB_Li2a 루프
5CCB_Pi2a 평면
인서트 2b CCB_2i2bA/2-P 5CCB_Li2b 루프
5CCB_Pi2b 평면
인서트 3 CCB_2i3A/2-P 5CCB_Li3 루프
5CCB_Pi3 평면
인서트 4 CCB_2i4A/2-P 5CCB_Li4 루프
5CCB_Pi4 평면
인서트 5 CCB_2i5A/2-P 5CCB_Li5 루프
5CCB_Pi5 평면
인서트 5a CCB_2i5aA/2-P 5CCB_Li5a 루프
5CCB_Pi5a 평면
인서트 6 CCB_2i6A/2-P 5CCB_Li6 루프
5CCB_Pi6 평면
인서트 7 CCB_2i7A/2-P 5CCB_Li7 루프
5CCB_Pi7 평면
인서트 8 CCB_2i8A/2-P 5CCB_Li8 루프
5CCB_Pi8 평면
인서트 9 CCB_2i9A/2-P 5CCB_Li9 루프
5CCB_Pi9 평면
인서트 10 CCB_2i10A/2-P 5CCB_Li10 루프
5CCB_Pi10 평면
인서트 11 CCB_2i11A/2-P 5CCB_Li11 루프
5CCB_Pi11 평면
19.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 절단
US, i1, i1a, i2, i2a, i2b, i3, i4, i5, i5a, i6, i7, i8, i9, i10 또는 i11을 포함하는 CCB PASS 프라이머 (평면 및 루프)를 함유한 반응에서, 50 ng gDNA (IM9)에 대한 Ct 값은 성공적인 증폭 및 검출을 나타낸다 (표 34).
루프 PASS 프라이머 어세이의 Cts는 Cts가 21.3 내지 22.9의 범위로 인서트 서열 i1, i1a, i2, i2b, i5, i5a, i6, i7, i8, i10 및 i11에 대한 변동을 거의 나타내지 않았다 (표 34). 다른 루프 PASS 프라이머 i2a, i3, i4, 및 i9는 26.0 내지 30.9의 Cts를 가졌으며 (표 34 (밑줄)), 이는 특징 서열이 이들 반응 조건 하에서 이 표적과 커플링된 경우 증폭 효율에 영향을 미침을 가리킨다. 인서트 i2a, i3, 또는 i4에 대한 특징 서열을 함유하는 루프 PASS 프라이머로부터 생성된 앰플리콘의 2차 구조 분석으로 증폭 효율에 영향을 미칠 수 있는 강력한 헤어핀의 잠재적 형성을 나타내었다.
평면 PASS 프라이머 어세이의 Cts는 Cts가 21.2 내지 22.5의 범위로 인서트 서열 i1, i1a, i2, i2b, i4, i5, i5a, i6, i7, i8, i10 및 i11에 대한 변동을 거의 나타내지 않았다 (표 34). 다른 평면 PASS 프라이머 i2a, i3, 및 i9는 25.0 내지 29.0의 Cts를 가졌으며 (표 34 (밑줄)), 이는 특징 서열이 이들 반응 조건 하에서 이 표적과 커플링된 경우 증폭 효율에 영향을 미침을 가리킨다. 인서트 인서트 i2a 및 i3에 대한 특징 서열을 함유하는 평면 PASS 프라이머로부터 생성된 앰플리콘의 2차 구조 분석으로 증폭 효율에 영향을 미칠 수 있는 강력한 헤어핀의 잠재적 형성을 나타내었다.
종합하면, 15개의 US 인서트중 11개 (루프) 및 12개 (평면)가 CCB 서열 분석에 적합하였다. 그러나, 실험은 각종 상이한 특징적 인서트 서열이 동일한 표적의 증폭 및 검출을 위해 사용될 수 있고, 증폭 효율이 영향을 받은 것으로 나타났다면, 다른 인서트 서열을 시험하여 신호를 개선시킬 수 있음을 입증한다. 이 CCB 앰플리콘과 관련하여 잘 수행되지 않은 US 인서트는 다른 유전자를 표적으로 하는 PASS 시스템에 유용할 수 있다.
CCB 어세이를 위한 PASS 프라이머 및 파트자임 조합의 Ct 값
PASS 디자인 인서트 # IM9 50ng
Ct(Ave)		 PASS 디자인 인서트 # IM9 50ng
Ct(Ave)
루프 1 21.3 평면 1 21.3
1a 22.0 1a 22.0
2 21.9 2 21.9
2a 26.5 2a 27.4
2b 22.4 2b 22.5
3 30.9 3 29.0
4 26.0 4 21.6
5 21.6 5 21.6
5a 21.4 5a 21.2
6 21.4 6 21.7
7 22.0 7 22.2
8 22.9 8 21.7
9 27.2 9 25.0
10 21.3 10 21.2
11 22.0 11 22.5
실시예 20: 서열에서 단일 염기 변화 검출을 위해 MNAzymes과의 조합 및 PASS 프라이머에서 상이한 특징 서열 인서트 비교
단일 염기로 변하는 두 서열을 구분하기 위해 표적-특이적 3' 말단 (S2)이 변종 염기 및 불일치된 염기를 함유하도록 PASS 프라이머를 디자인하였다 (도 2 (i) 및 (ii) 하부). 또, US는 다른 수준의 선택성 및 특이성이 부가되어 각 변종마다 다를 수 있다 (도 3).
본 실시예에서는, 15개의 상이한 특징 서열을 rcG12로 칭해지는 코돈 12에서 역방향 보체 KRAS 야생형 서열에 대한 PASS 프라이머에 인서팅하였다. 루프 또는 평면 형태로 US 인서트를 함유하는 PASS 프라이머는 G12 서열에 특이적이었고, US 인서트 i1, i1a, i2, i2a, i2b, i3, i4, i5, i5a, i6, i7, i8, i9, i10 또는 i11을 함유하였다 (표 32).
PASS 프라이머를 MNAzyme qPCR과 조합하였는데, 여기서 MNAzymes는 야생형 서열 및 불일치된 염기의 보체를 함유하는 증폭된 표적 서열뿐 아니라 특징 서열 (cUS)의 보체에 결합하는 제1 파트자임이다. 제2 파트자임은 증폭된 관심 표적 서열 상에서 제1 파트자임에 인접하여 결합한다.
PASS 프라이머 및 파트자임을 각 US에 대해 디자인하여 다양한 시나리오가 돌연변이 변종 G12S에 비해 KRAS 야생형 G12에 대한 반응 효율 및 특이성을 개선하는지를 조사하였다.
20.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임을 KRAS 유전자의 표적 야생형 rcG12 및 PASS 프라이머를 통해 도입된 임의의 cUS 인서트 및 불일치를 특이적으로 표적하도록 디자인하였다. 하기 서열에서 볼드체의 염기는 관심 표적 서열과 하이브리드화하고, 밑줄친 볼드체의 염기는 G12S 템플레이트와 비교하여 상이한 야생형 변종 염기를 나타내고, 밑줄친 이탤릭체의 염기는 불일치된 염기를 나타내고, 밑줄친 염기는 출발 템플레이트에 대해 불일치인 특징 서열 인서트 (i1, i1a, i2, i2a, i2b, i3, i4, i5, i5a, i6, i7, i8, i9, i10 또는 i11)이다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3-포스포릴화를 가리킨다. 모든 서열은 5'에서 3'로 기재되었다.
SEQ ID NO: 241 파트자임 B: rcG12_2B/55-P
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCTCCAACTACCACAAGTTTATA
SEQ ID NO: 242 파트자임 A: rcG12_2i1A/55-P
CACAATCAGT ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO: 243 파트자임 A: rcG12_2i1aA/55-P
CACAATGATG ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO: 244 파트자임 A: rcG12_2i2A/55-P
AGACATACTA ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO: 245 파트자임 A: rcG12_2i2aA/55-P
AGACAGTTAC ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO: 246 파트자임 A: rcG12_2i2bA/55-P
AGAGTCATTC ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO: 247 파트자임 A: rcG12_2i3A/55-P
GTTGGCTAC ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO: 248 파트자임 A: rcG12_2i4A/55-P
CAATACCAT ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 249 파트자임 A: rcG12_2i5A/55-P
GATTCGAGAA ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO: 250 파트자임 A: rcG12_2i5aA/55-P
GATTCGAGTT ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO: 251 파트자임 A: rcG12_2i6A/55-P
GTTACCTGAA ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO: 252 파트자임 A: rcG12_2i7A/55-P
CATTAGTGCC ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO: 253 파트자임 A: rcG12_2i8A/55-P
CATTGACAGA ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO: 254 파트자임 A: rcG12_2i9A/55-P
GAAAGCGAC ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO: 255 파트자임 A: rcG12_2i10A/55-P
CGTCTCATCA ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
SEQ ID NO: 256 파트자임 A: rcG12_2i11A/55-P
GGATTAGATC ACGCC T C C AGACAACGAGAGGTGCGG
20.2. 리포터 기질
본 실시예에서는, 기질을 5' 말단 (하기 프로브 명에서 "F"로 지정)에서 6-FAM 부분 및 3' 말단 (하기 프로브 명에서 "IB"로 지정)에서 Iowa Black® FQ 퀀처 부분으로 말단 표지하였다. 기질의 절단을 510-530 nm (CFX96 (BioRad)에서의 FAM 방출 파장 범위) 사이에서 모니터링하였다 (450-490 nm (CFX96 (BioRad)에서의 FAM 여기 파장 범위) 사이에서 여기). 본 실시예를 위한 리포터 기질을 서열과 함께, 5'에서 3'으로 나타내었다. 소문자는 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
SEQ ID NO: 25 기질 Sub55-FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
20.3. KRAS DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
인간 gDNA에서 KRAS 유전자의 시험관내 증폭을 후술하는 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 사용하여 수행하였다. 정방향 프라이머가 야생형에 대해 특이적이고 US 인서트 (i1, i1a, i2, i2a, i2b, i3, i4, i5, i5a, i6, i7, i8, i9, i10 또는 i11)를 함유하도록 PASS 프라이머를 디자인하였다. 하기 서열에서 밑줄친 염기는 출발 템플레이트에 대해 불일치인 특징 서열 인서트가고, 볼드체의 염기는 표적 서열과 하이브리드화하고, 밑줄친 볼드체의 염기는 G12S 템플레이트와 비교하여 상이한 야생형 변종 염기를 나타내고, 이탤릭체의 염기는 표적과 불일치인 염기를 나타낸다. L은 루프 형성에서의 US를 나타내고, P는 평면 형성에서의 US를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'로 기재되었다.
SEQ ID NO: 65 역방향 프라이머: 3rcKRAS
TATTAAAAGGTACTGGTGGAGTA
SEQ ID NO: 257 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i1L
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC CACAATCAGT ACGCC T C C
SEQ ID NO: 258 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i1P
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC CACAATCAGT ACGCC T C C
SEQ ID NO: 259 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i1aL
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC CACAATGATG ACGCC T C C
SEQ ID NO: 260 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i1aP
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC CACAATGATG ACGCC T C C
SEQ ID NO: 261 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i2L
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC AGACATACTA ACGCC T C C
SEQ ID NO: 262 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i2P
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC AGACATACTA ACGCC T C C
SEQ ID NO: 263 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i2aL
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC AGACAGTTAC ACGCC T C C
SEQ ID NO: 264 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i2aP
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC AGACAGTTAC ACGCC T C C
SEQ ID NO: 265 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i2bL
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC AGAGTCATTC ACGCC T C C
SEQ ID NO: 266 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i2bP
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC AGAGTCATTC ACGCC T C C
SEQ ID NO: 267 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i3L
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC CGTTGGCTAC ACGCC T C C
SEQ ID NO: 268 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i3P
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC CGTTGGCTAC ACGCC T C C
SEQ ID NO: 269 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i4L
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC TCAATACCAT ACGCC T C C
SEQ ID NO: 270 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i4P
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC TCAATACCAT ACGCC T C C
SEQ ID NO: 271 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i5L
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC GATTCGAGAA ACGCC T C C
SEQ ID NO: 272 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i5P
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC GATTCGAGAA ACGCC T C C
SEQ ID NO: 273 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i5aL
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC GATTCGAGTT ACGCC T C C
SEQ ID NO: 274 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i5aP
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC GATTCGAGTT ACGCC T C C
SEQ ID NO: 275 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i6L
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC GTTACCTGAA ACGCC T C C
SEQ ID NO: 276 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i6P
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC GTTACCTGAA ACGCC T C C
SEQ ID NO: 277 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i7L
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC CATTAGTGCC ACGCC T C C
SEQ ID NO: 278 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i7P
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC CATTAGTGCC ACGCC T C C
SEQ ID NO: 279 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i8L
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC CATTGACAGA ACGCC T C C
SEQ ID NO: 280 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i8P
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC CATTGACAGA ACGCC T C C
SEQ ID NO: 281 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i9L
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC CGAAAGCGAC ACGCC T C C
SEQ ID NO: 282 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i9P
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC CGAAAGCGAC ACGCC T C C
SEQ ID NO: 283 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i10L
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC CGTCTCATCA ACGCC T C C
SEQ ID NO: 284 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i10P
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC CGTCTCATCA ACGCC T C C
SEQ ID NO: 285 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i11L
TGTATCGTCAAGGCACTCTTGC GGATTAGATC ACGCC T C C
SEQ ID NO: 286 정방향 PASS 프라이머: 5rcG12_i11P
TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGC GGATTAGATC ACGCC T C C
20.4. 표적 서열
IM9 세포주로부터 추출한 인간 gDNA를 야생형 KRAS 유전자의 시험관내 증폭을 위한 템플레이트로서 사용하고, A549 세포주로부터 추출한 인간 gDNA를 동형접합 점 돌연변이 G12S를 포함하는 음성 대조군으로서 사용하였다.
20.5. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭 및 검출
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 25 μL의 총 반응 용적으로 실시되었다. 반응은 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 수행되었다. 사이클 변수는 95℃에서 2분, 95℃에서 15초 및 64℃에서 60초(사이클 당 마이너스 1℃)의 10 사이클, 95℃에서 15초 및 54℃에서 50초의 40 사이클(데이터는 54℃에서 수집됨)이었다, 모든 반응은 이중으로 작동되고 40 nM 정방향 프라이머 및 100 nM 파트자임 A(partzyme A )(표 35에서 개괄한 바와 같이), 200 nM 역방향 프라이머(3rcKRAS), 200 nM 파트자임 B(rcG12_2B/55-P), 200 nM 기질(Sub55-FIB), 8 mM MgCl2, 200 μM의 각각의 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNAase 저해제(Bioline), 1x ImmoBuffer (Bioline), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(Bioline), 그리고 테스트에서 IM9 gDNA 템플레이트(35 ng), 음성 대조군에서 A549 gDNA 템플레이트(35 ng), 또는 무표적(NF H2O) 중 하나를 포함하였다.
정방향 PASS 프라이머 및 파트자임 A 조합
고유 서열 파트자임 A 정방향 프라이머 PASS 타입
인서트 1 rcG12_2i1A/55-P 5rcG12_i1L 루프
5rcG12_i1P 평면
인서트 1a rcG12_2i1aA/55-P 5rcG12_i1aL 루프
5rcG12_i1aP 평면
인서트 2 rcG12_2i2A/55-P 5rcG12_i2L 루프
5rcG12_i2P 평면
인서트 2a rcG12_2i2aA/55-P 5rcG12_i2aL 루프
5rcG12_i2aP 평면
인서트 2b rcG12_2i2bA/55-P 5rcG12_i2bL 루프
5rcG12_i2bP 평면
인서트 3 rcG12_2i3A/55-P 5rcG12_i3L 루프
5rcG12_i3P 평면
인서트 4 rcG12_2i4A/55-P 5rcG12_i4L 루프
5rcG12_i4P 평면
인서트 5 rcG12_2i5A/55-P 5rcG12_i5L 루프
5rcG12_i5P 평면
인서트 5a rcG12_2i5aA/55-P 5rcG12_i5aL 루프
5rcG12_i5aP 평면
인서트 6 rcG12_2i6A/55-P 5rcG12_i6L 루프
5rcG12_i6P 평면
인서트 7 rcG12_2i7A/55-P 5rcG12_i7L 루프
5rcG12_i7P 평면
인서트 8 rcG12_2i8A/55-P 5rcG12_i8L 루프
5rcG12_i8P 평면
인서트 9 rcG12_2i9A/55-P 5rcG12_i9L 루프
5rcG12_i9P 평면
인서트 10 rcG12_2i10A/55-P 5rcG12_i10L 루프
5rcG12_i10P 평면
인서트 11 rcG12_2i11A/55-P 5rcG12_i11L 루프
5rcG12_i11P 평면
20.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 절단
다른 US 인서트를 포함하는 PASS 프라이머를 사용하여 KRAS 야생형(G12)의 실시간 검출을 위한 앰플리콘을 생산하였다. 이 반응은 사용된 표적 서열이 PCR을 통하여 증폭된 테스트 인간 gDNA(K562)일 때 시간 경과에 따라 형광 증가를 보였다. 템플레이트가 없는 대조군의 형광은 DNA 표적-포함 반응에서보다 낮았다. 이는 표적-포함 반응에서 생산되는 형광의 증가가 다음에 리포터 기질을 절단하는 효소적으로 활성인 MNA자임의 표적 의존성 조합에 기인하는 것임을 시사한다.
US, i1, i1a, i2, i2a, i2b, i3, i4, i5, i5a, i6, i7, i8, i9, i10 또는 i11을 포함하는 야생형 G12 PASS 프라이머(평면 및 루프)를 포함하는 반응에서, "테스트" DNA(K562)를 위한 Ct 값은 K562에서 야생형 KRAS 대립형질의 검출 및 성공적 증폭을 나타내었다. "음성 대조군"(G12S)을 위한 신호는 표 36에 나타낸 바와 같이 역치 Ct 값에 도달하여, 변이 대립형질이 사용될 때 일부 배경 신호가 생산되는 것, 그리고 야생형과 변이 G125 사이의 ΔCt 값이 PASS 프라이머로 삽입되는 고유 서열의 조성에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 나타낸다.
테스트 샘플을 위한 루프 PASS 프라이머 분석의 Cts는 18.6으로부터 21.3까지 범위의 Cts를 갖는 매우 작은 변이를 보여주었지만, 음성 대조군은 29.7로부터 37.3까지 범위의 Cts를 가져, US는 반응의 특이성에 영향을 줄 수 있음을 나타낸다(표 36). 루프 PASS 프라이머에서는 테스트와 음성 대조군 사이에서 계산된 가장 큰 ΔCt는 US i7이 사용되었을 때의 18.5였고, 다음은 US i3과 i9에 의한 것으로 둘 다 ΔCts>15였다. 다른 US 인서트에서의 ΔCts는 모두 매우 유사하였다.
테스트 샘플을 위한 평면 PASS 프라이머 분석의 Cts는 17.9로부터 20.9까지 범위의 Cts를 갖는 매우 작은 변이를 보여주었지만, 음성 대조군은 26.1로부터 33.9까지 범위의 Cts를 가져, US는 반응의 특이성에 영향을 줄 수 있음을 나타낸다(표 36). 평면 PASS 프라이머에서는 테스트와 음성 대조군 사이에서 계산된 가장 큰 ΔCt는 US i6이 사용되었을 때의 11.8이었다. 다른 US 인서트에서의 다른 ΔCts는 모두 매우 유사하여 각각 2.3 Cts 내에 들어왔다.
야생형 및 변이체 분석에서 PASS 프라이머와 파트자임 A 조합의 Ct 값
디자인 삽입된 US 반응 타입 Ct 테스트 ΔCt

인서트 1 		루프 테스트 18.6 14.0
음성 대조군 32.6
평면 테스트 18.5 8.4
음성 대조군 26.9
인서트 1a 루프 테스트 19.0 11.2
음성 대조군 30.2
평면 테스트 18.4 8.4
음성 대조군 26.8
인서트 2 루프 테스트 19.3 11.1
음성 대조군 30.4
평면 테스트 18.8 9.0
음성 대조군 27.8
인서트 2a 루프 테스트 19.1 11.3
음성 대조군 30.4
평면 테스트 18.8 9.1
음성 대조군 27.9
인서트 2b 루프 테스트 18.8 12.3
음성 대조군 31.1
평면 테스트 19.0 8.8
음성 대조군 27.8
인서트 3 루프 테스트 19.5 15.3
음성 대조군 34.8
평면 테스트 19.5 8.0
음성 대조군 27.5^
인서트 4 루프 테스트 19.0 12.4
음성 대조군 31.4
평면 테스트 18.9 11.1
음성 대조군 30^
인서트 5 루프 테스트 18.6 11.4
음성 대조군 30.0
평면 테스트 19.8 10.5
음성 대조군 30.2
인서트 5a 루프 테스트 18.6 12.6
음성 대조군 30.5
평면 테스트 18.8 9.9
음성 대조군 28.7
인서트 6 루프 테스트 18.6 11.5
음성 대조군 30.1
평면 테스트 22.1 11.8
음성 대조군 33.9
인서트 7 루프 테스트 18.9 18.5
음성 대조군 37.4
평면 테스트 17.9 8.2
음성 대조군 26.1
인서트 8 루프 테스트 21.0 14.1
음성 대조군 35.1
평면 테스트 18.7 9.4
음성 대조군 28.1
인서트 9 루프 테스트 21.3 16.0
음성 대조군 37.3
평면 테스트 18.4 8.6
음성 대조군 27.0
표 35 -계속
Figure 112014085559157-pct00013

^ 실험 오류로 인해 하나의 복제만으로 작업
전체적으로, 모든 15 US는 야생형 표적 서열의 분석에 적절하였다. 얻어진 Ct 값의 더 넓은 범위에 의해 명백하듯이, 평면 PASS 프라이머 분석에서보다 루프 PASS 프라이머 분석에서 약간 더 가변성이 관찰되는 결과에서 차이가 있었다. 그러나, 이 실험은 다양한 다른 고유 인서트 서열이 동일한 표적의 검출 및 증폭에 사용될 수 있고 최적의 PASS 프라이머/US 인서트 조합을 발견하기 위한 스크리닝이 반응의 특이성을 개선하는 데 도움을 줄 수 있음을 시사하였다.
실시예 21: 서열에 있어서 단일 염기 변화를 검출하기 위해 둘 다 MNA자임과 결합된 정방향 PASS 프라이머와 역방향 Pinch PASS 프라이머를 조합하는 PASS 프라이머 반응의 특이성 비교
USI 또는 USJ 중 하나를 포함하는 PASS 프라이머의 특이성을 G12V 및 G12S로 호칭되는 KRAS의 코돈 12에서 점 돌연변이를 표적으로 하는 분석에서 조사하였다. 이 실시예는 변이주 G12V 및 G12S를 검출하고 이들을 야생형 및 다른 KRAS G12/G13 변이체로부터 구별하는 능력을 조사한다.
이 실시예에서, 역방향 표준 프라이머는 역방향 핀치 PASS 프라이머를 사용하여 비교하였는데, 둘 다 정방향 PASS 프라이머 또는 정방향 핀치 PASS 프라이머(G125만) 및 MNA자임 리드아웃과 조합된다. 역방향 핀치 PASS 프라이머의 3' S2 영역은 표준 역방향 프라이머보다 파트자임 검출 영역으로 더 가까이 결합하고 표적 서열로부터 43 염기 루프아웃되어, 표준 역방향 프라이머의 160 bp에 비하여 100 bp의 앰플리콘 크기를 야기한다.
표준 역방향 프라이머를 포함하는 분석은 역방향 핀치 PASS 프라이머를 포함하는 것과 비교하였는데, 이들 둘 다 정방향 PASS 프라이머가 역방향 핀치 PASS 프라이머와 결합할 수 있는지, 그리고 추가의 PASS 프라이머가 변이 서열을 야생형 및/또는 다른 변이체로부터 구별하는 능력에 있어서 반응의 특이성에 영향을 줄 수 있는지 여부를 결정하기 위해 형광 판독기를 구비한 qPCR에서 정방향 PASS 프라이머 및 MNA자임 검출과 조합된다.
21.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임은 변이체 G12S 또는 G12V 및/또는 PASS 프라이머를 통해 도입되는 임의의 cUS를 위해 특이적으로 KRAS 유전자를 표적으로 하도록 디자인되었다. 다음 서열에서 볼드체 염기는 관심 표적 서열과 하이브리드화되고, 볼드체이고 밑줄로 표시된 염기는 USJ의 어느 한쪽의 2 염기를 나타내고, 밑줄친 염기는 cUS 인서트에 하이브리드화되고, 볼드체이면서 이탤릭체로 표시된 염기는 변이체 염기(G12S 또는 G12V)를 나타내고, 밑줄과 이탤릭체로 표시된 염기는 추가의 불일치된 염기를 나타낸다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'로 기재된다.
SEQ ID NO: 18 파트자임 B KRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCGTAGGCAAGAGTGCCTT
SEQ ID NO: 161 파트자임 A: G12S_gi2A/55-P
ACATACTA GTTGGAGGTAGTGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 162 파트자임 A: G12S_LT10A/55-P
TGAATATA AG TTGGAGGTAGTGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 24 파트자임 A G12V_LMi2A/55-P:
AGACATACTA TGGAGC C G T TGACAACGAGAGGTGCGGT
21.2. 리포터 기질
본 실시예에서 기질은, 5' 말단에서는 6-FAM 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "F"로 표시됨)로, 3' 말단에서는 Iowa Black®FQ 퀀쳐 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "IB"로 표시됨)로 말단 표지되었다. 기질의 절단은 450-490 ㎚(CFX96 (BioRad)에서 FAM 여기 파장 범위) 사이의 여기로 510-530 ㎚(CFX96 (BioRad)에서 FAM 방출 파장 범위)에서 모니터링되었다. 본 실시예의 리포터 기질을 5'에서 3'으로 기재된 서열로 아래에 나타낸다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
SEQ ID NO: 25 기질 Sub55-FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
21.3. KRAS DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
하기 열거된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머들을 사용한 인간 gDNA의 시험관내(in vitro) 증폭이 수행되었다. 다음 서열에서 볼드체 염기는 관심 표적 서열과 하이브리드화되고, 밑줄친 염기는 출발 템플레이트에 대하여 불일치된 USI이고, 볼드체이면서 이탤릭체로 표시된 염기는 변종 염기를 나타내고, 볼드체이고 밑줄로 표시된 염기는 USJ이고, 밑줄과 이탤릭체로 표시된 염기는 양쪽 표적에 불일치된 추가의 염기를 나타내다. 모든 서열은 5'에서 3'로 기재된다.
SEQ ID NO: 26 역방향 프라이머 3KRAS:
GGTCCTGCACCAGTAATATGC
SEQ ID NO: 166 정방향 PASS 프라이머 5G12S_gi2평면:
CCTGCTGAAAATGACTGAATATAA AGACATACTA GTTGGAG G T A
SEQ ID NO: 170 정방향 핀치 PASS 프라이머 5G12S_LT10:
CCTGCTGAAAATGACTGAATATA AG TTGGAG G T A
SEQ ID NO: 87 정방향 PASS 프라이머 5G12V_LM4i2평면:
CTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC AGACATACTA TGGAGC C G T
SEQ ID NO: 171 역방향 핀치 PASS 프라이머 3Kras_LT43
TGCATATTAAAACAAGATTTACCTC TG TATCGTC
21.4. 표적 서열
A549 세포주로부터 추출된 인간 gDNA가 점 돌연변이 G12S의 시험관내 증폭용 템플레이트로 사용되고, SW480 세포주로부터 추출된 인간 gDNA가 점 돌연변이 G12V의 시험관내 증폭용 템플레이트로 사용되었다. 세포주 IM9(야생형), 및 SW480(G12V)로부터 추출된 인간 gDNA가 KRAS 변종 G12S를 위한 음성 대조군 템플레이트로 사용되고, 세포주 IM9(야생형) 및 A549(G12S)로부터 추출된 인간 gDNA가 KRAS 변종 G12V를 위한 음성 대조군 템플레이트로 사용되었다.
21.5. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭 및 검출
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출이 25μL의 총 반응 부피에서 실행되었다. 반응은 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 수행되었다. 사이클링 변수는 95℃에서 2분, 95℃에서 15초 및 64℃에서 60초의 10 사이클(사이클 당 마이너스 1℃), 95℃에서 15초 및 54℃에서 50초의 50 사이클이었다(데이터는 54℃ 단계에서 수집되었다). 모든 반응은 2회 반복 실시되었고, 40 nM의 정방향 프라이머, 100 nM의 파트자임 A 및 200 nM의 역방향 프라이머(조합은 표 37에 열거됨)를 포함하였다. 모든 반응은 또한 200 nM의 파트자임 B(KRAS_B/55-P), 200 nM의 기질(Sub55-FIB), 8mM의 MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNAse 억제제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(Bioline), 그리고 KRAS G12V 표적용 양성 대조군으로 사용되는 35 ng의 A549 gDNA 템플레이트 및 음성 대조군으로 사용되는 35 ng의 SW480(G12V) 및 IM9(WT) 중 하나를 포함하였고, 35 ng의 SW480 gDNA 템플레이트는 KRAS G12V 표적용 양성 대조군으로 사용되었고 35 ng의 IM9(WT) 및 A459(G12S)는 음성 대조군으로 사용되고 추가의 대조군은 무표적(NF H2O)을 포함하였다.
변종 분석을 위한 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 파트자임 A 조합
표적 파트자임 A 정방향 프라이머 역방향 프라이머
G12S G12S_gi2A4/55-P PASS (USI)
5G12S_gi2평면		 표준
3KRAS
Pinch PASS
3KRAS_LT43
G12S_LT10A4/55-P PASS (USJ)
5G12S_LT10		 표준
3KRAS
Pinch PASS
3KRAS_LT43
G12V G12V_ LMi2A/55-P PASS (USI)
5G12V_LM4i2평면		 표준
3KRAS
Pinch PASS
3KRAS_LT43
21.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 절단
증폭 및 검출의 결과는 다음 표 38에 요약한다.
PASS 프라이머 및 파트자임 조합을 위한 Ct 값
표적 디자인 역방향
프라이머		 시험 템플레이트 Ct
(평균)		 양성으로부터의
ΔCt
G12S USI을 가진
PASS 프라이머		 표준 양성 G12S (A549) 21.6
음성 WT (IM9) 34.5 12.9
음성 G12V (SW480) 35.5 13.9
핀치 PASS 양성 G12S (A549) 22.1
음성 WT (IM9) 40.2 18.1
음성 G12V (SW480) 40.6 18.5
USJ를 가진
핀치 PASS
프라이머		 표준 양성 G12S (A549) 22.3
음성 WT (IM9) No Ct >27.7
음성 G12V (SW480) No Ct >27.7
핀치 PASS 양성 G12S (A549) 22.8
음성 WT (IM9) No Ct >27.2
음성 G12V (SW480) No Ct >27.2
G12V USI를 가진
PASS 프라이머		 표준 양성 G12V (SW480) 21.3
음성 WT (IM9) 37.1 15.8
음성 G12S (A549) 37.5 16.2
핀치 PASS 양성 G12V (SW480) 22.2
음성 WT (IM9) No Ct >27.8
음성 G12S (A549) No Ct >27.8
N.B. 음성 대조군 샘플에서 Ct가 생산되지 않을 때 ΔCt를 얻기 위해 50의 최종 Ct가 사용되었고, 앞에 놓인 더 큰 표시(>)는 ΔCt가 이 값보다 더 큰 것으로 예상되는 것을 나타낸다.
Ct 값(표 38)은 프라이머들의 모든 조합이 표적 유전자를 효과적으로 증복시킬 수 있음을 나타낸다. 표준 역방향 프라이머와 조합된 G12S 정방향 PASS 프라이머를 역방향 핀치 PASS 프라이머와 조합된 경우와 비교할 때 양성 샘플의 Ct는 양쪽에서 유사하였지만, 음성 대조군 샘플을 시험했을 때 역방향 핀치 PASS 프라이머는 ∼5 만큼 증가된 ΔCt로 더 큰 특이성을 보여주었다(표 38). 정방향 핀치 PASS 프라이머를 채용하는 G12S 분석은 표준 역방향 프라이머와 사용시 양호한 증폭 및 특이성을 나타내었다. 이것을 역방향 핀치 PASS 프라이머와 조합하는 것은 유사한 Ct 및 ΔCt를 보이는 효과적인 증폭 및 높은 특이성을 나타내었다(표 38).
표준 역방향 프라이머와 조합된 G12V 정방향 PASS 프라이머를 역방향 핀치 PASS 프라이머와 조합된 때의 결과와 비교할 때 양성 샘플의 Ct는 양쪽에서 유사하였지만, 음성 대조군 샘플을 시험했을 때 역방향 핀치 PASS 프라이머는 11 보다 크게 증가된 ΔCt로 더 큰 특이성을 보여주었다(표 38).
이 실시예는 증폭 효율에 영향을 주지 않으면서 정방향 PASS 프라이머와 역방향 PASS 프라이머를 조합하는 것이 가능할 것임을 나타낸다. 정방향 PASS 프라이머를 역방향 PASS 프라이머와 추가로 조합하는 것이 반응의 특이성을 개선할 수도 있다.
실시예 22: 서열에서 단일 염기 변화를 검출하기 위하여 NMA자임과 조합된 다른 위치에서의 불일치 염기와 PASS 프라이머의 감응성 비교
다른 위치에서의 다양한 타입의 불일치 염기를 포함하는 PASS 프라이머의 특이성을 G12V로서 호칭되는 KRAS의 코돈 12에서의 점 돌연변이를 표적으로 하는 분석에서 조사하였다. 본 실시예에서는 변종 G12V를 검출하고 이를 야생형으로부터 구별하는 능력을 조사하였다.
디자인 3(도 7) 평면 및 루프 PASS 프라이머를 G12V 서열의 증폭을 위해 사용하였다. 매스일치 염기는 S2의 3' 말단으로부터 2, 3 또는 4 위치에 있고 C:C, A:C, A:G, G:A, A:A 또는 C:A 불일치 중 하나였다. PASS 프라이머는 MNA자임 qPCR과 조합되었으며, 이에 의해 MNA자임은 고유 서열의 상보체(cUS)에 결합하는 제 1 파트자임뿐 아니라 불일치 염기 및 변종(변종) 염기의 상보체를 포함하는 증폭된 표적 서열을 포함한다. 제 2 파트자임은 증폭된 관심 표적 서열 내의 제 1 파트자임에 인접하여 결합한다.
다른 불일치 조합을 갖는 PASS 프라이머를 특이성에 대한 효과를 조사하기 위해 비교하였다.
22.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임은 G12V 서열 및 PASS 프라이머를 통해 도입된 cUS 및 임의의 불일치를 특이적 표적으로 디자인되었다. 다음 서열에서 볼드체 염기는 관심 표적 서열과 하이브리드화되고, 밑줄친 염기는 출발 템플레이트에 대하여 불일치된 고유 서열 인서트(i2)이다. 볼드체이면서 이탤릭체로 표시된 염기는 변종(돌연변이) 염기를 나타내고, 밑줄과 이탤릭체로 표시된 추가의 불일치된 염기를 나타내다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'로 기재된다.
SEQ ID NO: 18 파트자임 B KRAS_B/55-P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGCGTAGGCAAGAGTGCCTT
SEQ ID NO: 24 파트자임 A G12V_LMi2A/55-P:
AGACATACTA TGGAGC C G T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 287 파트자임 A G12V_g3i2A/55-P
AGACATACTA TGGAGC G G T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 288 파트자임 A G12V_a3i2A/55-P
AGACATACTA TGGAGC A G T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 289 파트자임 A G12V_c2i2A/55-P
AGACATACTA TGGAGCT C T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 290 파트자임 A G12V_a2i2A/55-P
AGACATACTA TGGAGCT A T TGACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 291 파트자임 A G12V_a4i2A/55-P
AGACATACTA TGGAG A TG T TGACAACGAGAGGTGCGGT
22.2. 리포터 기질
본 실시예에서 기질은, 5' 말단에서는 6-FAM 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "F"로 표시됨)로, 3' 말단에서는 Iowa Black®FQ 퀀쳐 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "IB"로 표시됨)로 말단 표지되었다. 기질의 절단은 450-490 ㎚(CFX96 (BioRad)에서 FAM 여기 파장 범위) 사이의 여기로 510-530 ㎚(CFX96 (BioRad)에서 FAM 방출 파장 범위)에서 모니터링되었다. 본 실시예의 리포터 기질을 5'에서 3'으로 기재된 서열로 아래에 나타낸다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
SEQ ID NO: 25 기질 Sub55-FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
22.3. KRAS DNA의 증폭을 위한 PCR 프라이머
하기 열거된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머들을 사용한 인간 gDNA의 시험관내(in vitro) 증폭이 수행되었다. 다음 서열에서 볼드체 염기는 관심 표적 서열과 하이브리드화되고, 밑줄친 염기는 출발 템플레이트에 대하여 불일치된 고유 서열이고, 볼드체이면서 이탤릭체로 표시된 염기는 변종 염기이고, 밑줄과 이탤릭체로 표시된 염기는 양쪽 표적에 불일치된 추가의 염기를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'로 기재된다.
SEQ ID NO: 26 역방향 프라이머 3KRAS:
GGTCCTGCACCAGTAATATGC
SEQ ID NO: 50 정방향 PASS 프라이머 5G12V_LM3i2L루프
GACTGAATATAAACTTGTGGTAGT AGACATACTA TGGAGC C GT
SEQ ID NO: 292 정방향 PASS 프라이머 5G12V_g3i2루프
GACTGAATATAAACTTGTGGTAGT AGACATACTA TGGAGC G GT
SEQ ID NO: 293 정방향 PASS 프라이머 5G12V_a3i2루프
GACTGAATATAAACTTGTGGTAGT AGACATACTA TGGAGC A GT
SEQ ID NO: 294 정방향 PASS 프라이머 5G12V_c2i2루프
GACTGAATATAAACTTGTGGTAGT AGACATACTA TGGAGCT C T
SEQ ID NO: 295 정방향 PASS 프라이머 5G12V_a2i2루프
GACTGAATATAAACTTGTGGTAGT AGACATACTA TGGAGCT A T
SEQ ID NO: 296 정방향 PASS 프라이머 5G12V_a4i2루프
GACTGAATATAAACTTGTGGTAGT AGACATACTA TGGAG A TGT
SEQ ID NO: 87 정방향 PASS 프라이머 5G12V_LM4i2평면:
CTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC AGACATACTA TGGAGC C GT
SEQ ID NO: 297 정방향 PASS 프라이머 5G12V_g3i2평면
CTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC AGACATACTA TGGAGC G GT
SEQ ID NO: 29 정방향 PASS 프라이머 5G12V_a3i2평면
CTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC AGACATACTA TGGAGC A GT
SEQ ID NO: 299 정방향 PASS 프라이머 5G12V_c2i2평면
CTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC AGACATACTA TGGAGCT C T
SEQ ID NO: 300 정방향 PASS 프라이머 5G12V_a2i2평면
CTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC AGACATACTA TGGAGCT A T
SEQ ID NO: 301 정방향 PASS 프라이머 5G12V_a4i2평면
CTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC AGACATACTA TGGAG A TGT
22.4. 표적 서열
SW480 세포주로부터 추출된 인간 gDNA가 점 돌연변이 G12V의 시험관내 증폭용 템플레이트로 사용되었다. 세포주 IM9(야생형)로부터 추출된 인간 gDNA가 KRAS 변종 G12V를 위한 음성 대조군 템플레이트로 사용되었다.
22.5. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭 및 정량
표적 서열의 실시간 증폭 및 정량이 25μL의 총 반응 부피에서 실행되었다. 반응은 CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 수행되었다. 사이클링 변수는 95℃에서 2분, 95℃에서 5초 및 60℃에서 20초의 10 사이클(사이클 당 마이너스 0.6℃), 95℃에서 5초 및 60℃에서 20초의 50 사이클이었다(데이터는 54℃ 단계에서 수집되었다). 모든 반응은 2회 반복 실시되었고, 40 nM의 정방향 프라이머, 100 nM의 파트자임 A(표 39에 개괄된), 200 nM의 역방향 프라이머(3KRAS), 200 nM의 파트자임 B(KRAS_B/55-P), 200 nM의 기질(Sub55-FIB), 8mM의 MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNAse 억제제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(Bioline), 그리고 테스트 템플레이트로서 SW480 gDNA(35 ng), 음성 대조군 템플레이트로서 K562 gDNA(35 ng) 또는 무표적(NF H2O)을 포함하였다.
변종 분석을 위한 정방향 프라이머 및 파트자임 A 조합
불일치 위치
(3' 말단으로부터의 염기)		 불일치 타입 파트자임 A 정방향 프라이머
3 C:A G12V_LMi2A/55-P 5G12V_LM3i2L루프
5G12V_LM4i2평면
3 G:A G12V_g3i2A/55-P 5G12V_g3i2루프
5G12V_g3i2평면
3 A:A G12V_a3i2A/55-P 5G12V_a3i2루프
5G12V_a3i2평면
2 C:C G12V_c2i2A/55-P 5G12V_c2i2루프
5G12V_c2i2평면
2 A:C G12V_a2i2A/55-P 5G12V_a2i2루프
5G12V_a2i2평면
4 A:G G12V_a4i2A/55-P 5G12V_a4i2루프
5G12V_a4i2평면
22.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 절단
다른 위치에서 다른 불일치 염기를 포함하는 PASS 프라이머가 KRAS 변종 G12V의 실시간 검출을 위한 앰플리콘을 생산하기 위해 사용되었다. 이 반응은 사용된 표적 서열이 PCR을 통해 증폭된 테스트 인간 gDNA(SW480)일 때 시간 경과에 따라 형광 증가를 보였다. 무 표적 대조군의 형광은 DNA 표적-포함 반응에서보다 더 낮았다. 이는 표적-포함 반응에서 생산되는 형광의 증가가 다음에 리포터 기질을 절단하는 효소적으로 활성인 MNA자임의 표적 의존성 조합에 기인하는 것임을 시사한다.
위치 3에 불일치 염기를 갖는 PASS 프라이머를 포함하는 반응에서, C:A 불일치는 24.2/23.9(루프/평면)의 Ct를 갖는 A:A 불일치와 비교하여 테스트 반응에서 22.7/22.5(루프/평면)의 더 빠른 Ct를 생산한다(표 40). C:A 불일치는 또한 테스트와 음성 대조군 사이의 ΔCt가 15.4/14.2(루프/평면) 대 A:A 불일치의 12.6/14.0(루프/평면)로 A:A 불일치보다 더 특이적이었다(표 40).
위치 3에 G:A 불일치를 갖는 PASS 프라이머는 루프와 평면 디자인에서 음성 ΔCt를 가져 테스트와 음성 대조군 템플레이트 사이에 구분이 될 수 없었다(표 40). "C" 또는 "A"에 대하여 위치 3에 삽입된 "G"를 갖는 것에 의해 생성된 PASS 프라이머 서열의 추가 분석은, S2의 3' 말단에서 최초 3 염기가 변종 템플레이트에서 S2 영역이 결합하는 야생형 템플레이트 1 염기 3'에 결합할 수 있다는 것을 보여주었으며, 이 결합은 PASS 프라이머가 더 이상 변종에 특이적이지 않을 정도로 충분히 강하였다. 이것은 PASS 프라이머를 디자인할 때 매번 조사되어야 하고, 임의의 테스트 및 음성 대조군 템플레이트에서 선택된 불일치 염기에 기인하여 일어날 수 있는 임의의 가능한 미스-프라이밍을 위해 검사될 중요한 특징이다.
S2의 3' 말단으로부터 위치 2에서 불일치 염기를 포함하는 PASS 프라이머는 15.0으로부터 >24.0 범위의 ΔCt를 갖는 증가된 특이성을 나타내었다(표 40). 그러나, 이 불일치를 위치 2에 놓는 것은, 테스트 반응의 Ct 값도 증가하여, 위치 3에서보다 더 불안정하다. 위치 2에서 C:C 불일치는 C:A 보다 더 불안정하여 Ct를 32.1/31.7(루프/평면)로 증가시켰고, 위치 3 불일치 보다 거의 10 Ct 만큼 증가하였다(표 40). A:C 불일치는 덜 불안정하여 루프와 평면 둘 다의 PASS 프라이머에서 Ct를 ∼25까지 증가시켰을 뿐인데, 이는 위치 3에서의 최적 불일치보다 단지 3 Ct 더 큰 것이다. 위치 2에 A:C 불일치를 포함하는 PASS 프라이머에서 중요한 것은 루프 형성 US가 평면의 15.0과 비교하여 >24.3의 ΔCt를 가져 평면 형성 US 보다 유리한 점을 나타내는 유일한 디자인이었다(표 40).
4 위치에서 불일치를 갖는 PASS 프라이머도 13.1/14.4(루프/평면)의 ΔCt를 가져 위치 3에서의 불일치를 갖는 경우와 비교하여 양호한 특이성을 나타내었다.
이 실시예는 불일치 염기가 PASS 프라이머의 S2 영역에서 다양한 위치에 배치될 수 있고 여전히 유효성을 유지한다는 것과 불일치의 타입은 임의의 가능한 미스-프라이밍 또는 2차 구조를 피하도록 제작될 수 있다는 것을 보여준다.
G12V PASS 대 WE-ARMS 프라이머의 Ct 값
불일치 위치 & 불일치 삽입된 US 반응 타입 Ct 테스트로부터의 ΔCt

3 & C:A		 루프 테스트 22.7 15.4
음성 대조군 38.0
평면 테스트 22.5 14.2
음성 대조군 36.6
3 & G:A 루프 테스트 27.8 -1.0
음성 대조군 26.8
평면 테스트 27.0 -0.5
음성 대조군 26.5
3 & A:A 루프 테스트 24.2 12.6
음성 대조군 36.8
평면 테스트 23.9 14.0
음성 대조군 37.8
2 & C:C 루프 테스트 32.1 >17.9
음성 대조군 No Ct
평면 테스트 31.7 >18.3
음성 대조군 No Ct
2 & A:C 루프 테스트 25.8 >24.3
음성 대조군 No Ct
평면 테스트 25.3 15.0
음성 대조군 40.3
4 & A:G 루프 테스트 23.7 13.1
음성 대조군 36.8
평면 테스트 23.0 14.4
음성 대조군 37.4
N.B. 음성 대조군 샘플에서 Ct가 생산되지 않을 때 ΔCt를 얻기 위해 50의 최종 Ct가 사용되었고, 앞에 놓인 더 큰 표시(>)는 ΔCt가 이 값보다 더 큰 것으로 예상되는 것을 나타낸다.
실시예 23: 모델 시스템에서 다른 프라이머 및 파트자임 A 디자인 조합의 사용을 조사
이 실시예에서는, TFRC 게놈이 도 14에 기술된 프라이머와 파트자임 A의 다른 조합을 시험하기 위한 모델 시스템으로서 사용되었다.
보다 구체적으로, 다음 시나리오를 시험하였다, (i) 표준 정방향 프라이머가 정방향 프라이머의 하향 결합 표준 MNA자임(도 14 (i A)) 또는 정방향 프라이머의 하향 결합 Pinch Pass 파트자임 A를 포함하는 MNA자임(도 14 (i B)) 중 하나와 결합하거나, (ii) 표준 정방향 프라이머가 정방향 프라이머와 오버래핑되는 영역에 결합하는 표준 MNA자임(도 14 (ii B)) 또는 정방향 프라이머와 오버래핑되는 영역에 결합하는 Pinch Pass 파트자임 A를 포함하는 MNA자임(도 14 (ii B)) 중 하나와 결합하거나, 또는 (iii) 정방향 프라이머와 오버래핑되는 영역에 결합하는 표준 MNA자임(도 14 (iii A)) 또는 정방향 프라이머와 오버래핑되는 영역에 결합하는 태그된 Pinch Pass 파트자임 A를 포함하는 MNA자임(도 14 (iii C)) 중 하나와 결합되는 태그를 포함하는 정방향 프라이머.
정방향 프라이머와 파트자임 A의 다른 조합은 TFRC 유전자의 증폭 및 검출에 양립가능한지를 결정하기 위해 실시간 리드아웃을 위한 PCR 증폭으로 조합되었다.
23.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임은 a) 센서 팔(sensor arm)이 충분히 연속해서 표적 서열에 상보적인 충분히 일치되는 "표준" 파트자임이거나, 또는 b) 앰플리콘의 일부가 파트자임의 센서 팔에서 USJ에 루프아웃 되도록, 파트자임 A가 표적 앰플리콘에서 서열의 비연속적 스트레치에 상보적인 핀치 PASS 파트자임으로 디자인되었다. 다음 서열에서 볼드체 염기는 관심 표적 서열과 하이브리드화되고, 소문자 염기는 USJ의 어느 한쪽의 최초 염기를 나타내고, 밑줄친 염기는 태그된 정방향 프라이머에 의해 앰플리콘으로 삽입된 상보적 태그 서열에 결합한다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'로 기재된다.
SEQ ID NO: 145 파트자임 B TFRC_2B/84-P:
TGGACGAGGGAGGCTAGCTTCTGACTGGAAAACAGACTCTA
SEQ ID NO: 146 파트자임 A TFRC_2A/84-P:
CTGATTCTAGGAATATGGAAGGAGACTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO: 302 핀치 PASS 파트자임 A TFRC_2(54)pp10A/84-P:
TGCTTTCTGATTCTAGGAAtaCTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
SEQ ID NO: 303 핀치 PASS 파트자임 A TFRC_2tagppA/84-P:
TCGTTACCTAGTCTAAGc aCTGTCCCACAACGAGAGGGTCGAG
23.2. 리포터 기질
본 실시예에서 기질은, 5' 말단에서는 6-FAM 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "F"로 표시됨)로, 3' 말단에서는 Iowa Black®FQ 퀀쳐 모이어티(아래 기질의 명칭에서 "IB"로 표시됨)로 말단 표지되었다. 기질의 절단은 450-490 ㎚(CFX96 (BioRad)에서 FAM 여기 파장 범위)에서의 여기 및 510-530 ㎚(CFX96 (BioRad)에서 FAM 방출 파장 범위)에서의 방출에 의해 실시간으로 모니터링되었다. 본 실시예의 리포터 기질을 5'에서 3'으로 기재된 서열로 아래에 나타낸다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
SEQ ID NO: 158 기질 Sub84-FIB:
CTCGACCCTCguCCCTCGTCCA
23.3. TFRC의 증폭을 위한 표적 서열 및 PCR 프라이머
본 실시예의 표적 서열은 IM9 세포주(Promega)로부터 추출한 인간 게놈 DNA의 TFRC 유전자이다. 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머는 아래 열거된다. 프라이머 서열의 5' 말단에서 볼드체 서열은 표적 유전자 서열에서 발견되지 않는 태그(T1, T2 또는 T3)에 상응한다. T1 및 T2는 유전자 표적에 대한 프라이머의 특이성에 영향을 주지 않으면서 프라이머의 Tm을 증가시키기 위해 사용된다. T3는 앰플리콘의 5' 말단으로 태그 서열의 스트레치를 도입하기 위해 사용되는 더 긴 태그이다. 프라이머 서열은 5'에서 3'로 기재된다.
SEQ ID NO: 304 역방향 프라이머 3TFRC_2T2:
CAGCTTTCTGAGGTTACCATCCTA
SEQ ID NO: 160 정방향 프라이머 5TFRC_T1:
CTAACTGGGCAAGGAACAATAACTC
SEQ ID NO: 305 정방향 프라이머 5TFRC_3
AGAACTTACGCCTGCTTTCTGATTCTAGGAATATGGAAGGAG
SEQ ID NO: 306 정방향 프라이머 5TFRC_3T3
TCGTTACCTAGTCTAAGCCTGATTCTAGGAATATGGAAGGAG
23.4. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 25 ㎕의 총 반응 부피에서 수행하였다. CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 반응을 수행하였다. 주기 파라미터는 2 분 동안 95 ℃, 5 주기의 15 초 동안 95 ℃ 및 30 초 동안 55 ℃, 50 주기의 15 초 동안 95 ℃ 및 60 초 동안 52 ℃였다(52 ℃ 단계에서 데이터를 수집함). 각 세트의 반응 조건은 이중실험으로 시험하였으며, 표 41에 약술한 바와 같은, 40 nM의 정방향 프라이머 및 100 nM의 파트자임 A, 200 nM의 파트자임 B(TFRC_2B/84-P), 200 nM의 역방향 프라이머(3TFRC_2T2), 200 nM의 기질(Sub84-FIB), 8 mM의 MgCl2, 200 μM의 각각의 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNase 저해제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(Bioline)를 함유하였으며, IM9 gDNA(50 ng 또는 50 pg)를 함유하거나 표적을 함유하지 않았다(NF H2O).
파트자임 A 및 정방향 프라이머 조합
정방향 프라이머 디자인 프라이머 명칭 파트자임 A 디자인 파트자임 A 명칭 반응
표준; 파트자임 A의 업스트림 5TFRC_T1 표준 TFRC_2A/84-P (i A)
핀치 PASS; 표적 서열의 10 염기를 루프로 형성해냄 TFRC_2(54)pp10A/84-P (i B)
표준; 파트자임 A와 중첩됨 5TFRC_3 표준 TFRC_2A/84-P (ii A)
핀치 PASS; 표적 서열의 10 염기를 루프로 형성해냄 TFRC_2(54)pp10A/84-P (ii B)
태그를 가진 표준; 파트자임 A와 중첩됨 5TFRC_3T3 표준 TFRC_2A/84-P (iii A)
태깅된 핀치 PASS; 표적의 24 염기를 루프로 형성해냄 TFRC_2tagppA/84-P (iii C)
23.5. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 분해
템플레이트가 없는 대조군 반응의 최종 형광은 DNA 표적-함유 반응의 것보다 더 낮았다. 이는 표적-함유 반응에서 생성된 형광의 증가가 촉매적으로 활성인 MNAzyme의 표적 의존성 조립 및 리포터 기질의 후속 분해에 기인한다는 것을 입증한다.
표준 파트자임 A의 업스트림에 있는 표준 프라이머를 사용하여(반응 i A) 50 ng 및 50 pg에 대해 각각 15.2 및 26의 Ct 값을 가진 TFRC 유전자의 검출을 유발하였다(표 42).
MNAzyme qPCR에 대한 Ct 값
정방향 프라이머 디자인 파트자임 A 디자인 반응 Ct 50 ng IM9 gDNA Ct 50 pg IM9 gDNA
표준; 파트자임 A의 업스트림 표준 (i A) 15.2 26.0
핀치 PASS; 표적 서열의 10 염기를 루프로 형성해냄 (i B) 16.5 27.1
표준; 파트자임 A와 중첩됨 표준 (ii A) 26.5 Ct 없음
핀치 PASS; 표적 서열의 10 염기를 루프로 형성해냄 (ii B) 23.6 43.4
태그를 가진 표준; 파트자임 A와 중첩됨 표준 (iii A) 16.4 33.7
태깅된 핀치 PASS ; 표적의 24 염기를 루프로 형성해냄 (iii C) 16.5 27.1
핀치 PASS 파트자임 A의 사용(반응 i B)은 TFRC 유전자를 유사하게 검출하였으며(표 42), 50 pg의 표적의 효율적인 검출을 동반하였다.
업스트림 프라이머의 사용에 비교할 때, 표준 파트자임 A와 중첩되는 표준 정방향 프라이머의 사용(reaction ii A)은 50 ng의 템플레이트에 대해 훨씬 더 늦은 Ct 값(26.5)을 유발하였고 50 pg의 템플레이트는 검출하지 못하였으며(표 42), 이는 파트자임의 5' 단부가 프라이머의 3' 단부와 중첩될 때 결합에 대한 경쟁으로 인해 반응의 효율을 감소시켰다. 그러나, 그에 비해, 이 동일한 프라이머를 사용하는 증폭 후에 핀치 PASS 파트자임 A를 사용하는 검출(반응 ii B)은 반응 ii A의 경우보다 더 이른 Ct 값을 유발했으며, 이는 결합 경쟁의 감소로 인해 반응 ii B 디자인이 유리함을 나타낸다.
표준 파트자임 A와 중첩된 태깅된 표준 정방향 프라이머의 사용(반응 iii A)은 중첩되는 표준 정방향 프라이머(반응 ii A)에 비교하여 Ct 값을 개선했다(표 42). 태깅된 핀치 PASS 파트자임 A와 조합하여 사용하는 경우에, 반응(iii C)은 표준 파트자임 A와 함께 업스트림 프라이머를 사용하는 경우(반응 i A)와 유사하게 수행되었으며 핀치 PASS 파트자임 A와 함께 업스트림 프라이머를 사용하는 경우(반응 i B)와 동일하였다(표 42).
종합하면, 핀치 PASS 파트자임 및 중첩되는 정방향 프라이머를 함유하는 MNAzyme을 사용하는 표적 서열의 검출은 정방향 프라이머 및 파트자임 A에 태그 서열을 첨가함으로써 개선될 수 있다. 예를 들어, 상동성의 영역 및 다양성의 영역을 가진 2개의 표적을 증폭하는 것을 목적하는 경우에 이를 응용한다. 태그 프라이머를 동반하는 핀치 PASS 파트자임은 표적의 상동 영역에 결합하도록 디자인될 수 있으며, 핀치 PASS 파트자임이 가변 영역을 "점프"하도록 태그를 사용한다. 본 실시예는 도 14에 설명된 디자인 중 임의의 것 또는 전부를 사용하는 것의 실행 가능성을 입증하며, 어세이의 특이적 응용은 디자인의 선택에 영향을 미칠 수 있다.
실시예 24: 안티센스 DNAzyme으로 구성된 US 삽입체를 함유하는 PASS 프라이머의 사용의 조사
PASS 프라이머는 표적 서열에 비-상보적인 US를 함유하므로 PCR 중에 앰플리콘 내로 삽입될 경우에 파트자임이 결합할 고유 서열을 제공하는 것으로 나타났다. US를 사용하여 DNAzyme, 압타머 또는 조립 촉진자와 같은 작용성 서열을 앰플리콘 내로 삽입하는 것 또한 가능하다.
본 실시예에서는, 표적 서열에 여전히 비-상보적이면서도 DNAzyme의 비활성 안티센스 형태인 서열로 구성되도록 PASS 프라이머의 US를 디자인하였다. PCR 중에 증폭될 때, 활성인 센스 DNAzyme이 앰플리콘 내로 삽입되고 기질을 분해하여 실시간으로 신호를 생성시킬 수 있다(도 15 패널 (ii)). US가 작용을 가지지 않았고 표적 서열에 비-상보적이었던 표준 PASS 프라이머(도 15 패널 (i))에 이를 비교하였다. 양자 모두의 PASS 프라이머를 MNAzyme qPCR과 조합하였으며, 여기서 MNAzyme은 고유 서열의 상보체(cUS)와 더불어 증폭된 표적 서열에 결합하는 제1 파트자임을 포함한다. 제2 파트자임은 관심의 대상인 증폭된 표적 서열 상의 제1 파트자임에 인접하여 결합한다. 이어서, 활성 MNAzyme은 기질 1(Sub 1)을 분해하여 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 생성시킨다. 표준 PASS 파트자임을 사용하는 경우에는 기질 2가 분해되지 않은 채 남아 신호를 생성시키지 않도록 양자 모두의 반응에 제2 기질 2(Sub 2)를 첨가하였다(도 15 패널 (i)). 그러나 DNAzyme의 안티센스를 함유하는 PASS 프라이머를 사용하는 경우에는, 증폭시에 활성 DNAzyme이 형성되고 기질 2를 분해하여 실시간으로 모니터링할 수 있는 신호를 생성시킬 수 있다(도 15 패널 (ii)). 기질 2를 기질 1과는 상이한 형광단으로 표지하여 2개의 신호가 구별될 수 있게 하거나, 기질 2를 기질 1과 동일한 형광단으로 표지하여 생성되는 신호를 부스팅하고 가능하게는 Ct 값을 감소시킬 수 있다.
표준 PASS 프라이머와 작용성 PASS 프라이머를 비교하고 실시간 판독을 위한 PCR 증폭과 조합하여, 그들이 ROCK1 유전자의 증폭 및 검출에 상용성인지 여부를 결정하였다. 추가로, qPCR 혼합물에 부가적인 기질을 첨가하여, 활성 DNAzyme이 앰플리콘 내로 삽입될 수 있는지 여부 및 신호 강도에 대한 그의 영향을 결정하였다.
24.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
PASS 프라이머를 통해 도입된 임의의 cUS + ROCK1 유전자를 특이적으로 표적화하도록 파트자임을 디자인하였다. 하기의 서열에서 볼드체의 염기는 관심의 대상인 표적 서열과 하이브리드화되고 밑줄 친 염기는 고유 서열의 상보체에 결합한다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'으로부터 3'으로 기재되었다.
서열 번호 307 파트자임 B ROCK1_B/2-P
TGCCCAGGGAGGCTAGCTCAGCTGTGTCCGATTCTGTC
서열 번호 308 파트자임 A ROCK1_i13A/2-P
CCA CTCTTCCTCAATCTTAACAACGAGAGGAAACCTT
24.2. 리포터 기질
본 실시예에서는, 5' 단부에서 6-FAM 부위로(하기 기질의 명칭에서 "F"로 표시함), 그리고 3' 단부에서 아이오와 블랙® FQ 퀀처 부위로(하기 기질의 명칭에서 "IB"로 표시함) Sub2 및 Sub84 기질을 단부 표지하였다. 450 내지 490 nm(CFX96(BioRad)에서의 FAM 여기 파장 범위)의 여기를 동반하여 510 내지 530 nm(CFX96(BioRad)에서의 FAM 방출 파장 범위)에서 기질의 분해를 모니터링하였다. 5' 단부에서 Quasar 670 부위로(하기 기질의 명칭에서 "Q6"로 표시함), 그리고 3' 단부에서 블랙 홀 퀀처®2 부위로(하기 기질의 명칭에서 "B2"로 표시함) Sub84 기질을 단부 표지하였다. 620 내지 650 nm(CFX96(BioRad)에서의 Quasar 670 여기 파장 범위)의 여기를 동반하여 675 내지 690 nm(CFX96(BioRad)에서의 Quasar 670 방출 파장 범위)에서 기질의 분해를 모니터링하였다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고 대문자 염기는 DNA를 나타낸다. 본 실시예를 위한 리포터 기질은 5'으로부터 3'으로의 서열로 하기에 나타낸다.
서열 번호 94 기질 Sub2-FIB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
서열 번호 158 기질 Sub84-FIB:
CTCGACCCTCguCCCTCGTCCA
서열 번호 158 기질 Sub84-Q6B2:
CTCGACCCTCguCCCTCGTCCA
24.3. TFRC의 증폭을 표적 서열 및 PCR 프라이머
본 실시예의 표적 서열은 IM9 세포주(Promega)로부터 추출한 인간 게놈 DNA 내의 ROCK1 유전자였다. 하기의 서열에서 볼드체의 염기는 관심의 대상인 표적 서열과 하이브리드화되고, 밑줄 친 염기는 고유 서열이며, 밑줄 친 이탤릭체의 염기는 안티센스 DNAzyme으로 구성된 고유 서열이다. 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머는 하기에 열거되어 있다. 프라이머 서열은 5'으로부터 3'으로 열거된다.
서열 번호 309 역방향 프라이머 3ROCK1:
GCCAATGACTTACTTAGGAC
서열 번호 310 정방향 PASS 프라이머 5ROCK1_i13평면:
AACTGACTAATTGACTTGCTCATC CATAGTGCCA CTCTTCCTCAA
서열 번호 311 정방향 PASS 프라이머 5ROCK1_i13asDz84P:
TGCAACTCTCTGTTCAGGGACT CTCGACCCTCTCGTTGTAGCTAGCCTCCCTCGTCCA CTCTTCCTCAA
24.4. 반응 구성요소: 표적 서열의 증폭
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 25 ㎕의 총 반응 부피에서 수행하였다. CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 반응을 수행하였다. 주기 파라미터는 2 분 동안 95 ℃, 10 주기의 15 초 동안 95 ℃ 및 60 초 동안 61 ℃(-1 ℃/주기), 40 주기의 15 초 동안 95 ℃ 및 50 초 동안 52 ℃였다(52 ℃ 단계에서 데이터를 수집함). 각 세트의 반응 조건은 이중실험으로 시험하였으며, 표 43에 약술한 바와 같은, 40 nM의 정방향 프라이머 및 200 nM의 부가적인 기질을 함유하였다. 모든 반응은 100 nM의 파트자임 A(ROCK1_i13A/2-P), 200 nM의 파트자임 B(ROCK1_B/2-P), 및 200 nM의 역방향 프라이머(3ROCK1), 200 nM의 기질(Sub2-FIB), 8 mM의 MgCl2, 200 μM의 각각의 dNTP, 10 단위의 RiboSafe RNase 저해제(Bioline), 1x ImmoBuffer(Bioline), 2 단위의 MyTaq™ HS DNA 중합효소(Bioline)를 함유하였으며, IM9 gDNA(50 pg)를 함유하거나 표적을 함유하지 않았다(NF H2O).
PASS 프라이머 및 기질 조합
PASS 프라이머 디자인 PASS 프라이머 부가적인 기질
파트자임 A를 결합시키기 위한 cUS를 앰플리콘 내로 혼입시킴 5ROCK1_i13평면 Sub84-Q6B2
Sub84-FIB
파트자임 A를 결합시키기 위한 cUS 및 활성 DNAzyme을 앰플리콘 내로 혼입시킴 5ROCK1_i13asDz84L Sub84-Q6B2
Sub84-FIB
24.5. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 분해
표준 또는 작용성 US를 포함하는 ROCK1 PASS 프라이머를 함유하는 반응에서 50 pg gDNA(IM9)에 대한 Ct 값은 성공적인 증폭 및 검출을 나타냈다(표 44).
Sub2-FIB를 분해하는 MNAzyme과 함께 표준 PASS 프라이머를 함유하는 어세이는, 부가적인 기질인 Sub84를 FAM으로 표지했든 Quasar 670(Q670)으로 표지했든, 50 pg에 대해 ~24의 Ct를 동반하여 유사하게 수행되었다(표 44). 활성 DNAzyme을 앰플리콘 내로 혼입시키는 작용성 PASS 프라이머를 사용한 경우, Sub2-FIB의 MNAzyme 분해 및 Sub84-Q670의 DNAzyme 분해는 양자 모두 ~25의 Ct를 생성시켰다(표 44). 기질의 MNAzyme 및 DNAzyme 분해 양자 모두에 대해 단일 곡선을 생성시키는, FAM으로 양자 모두 표지된 Sub2 및 Sub84의 사용은, ~23의 Ct를 생성시켰다.
이는 MNAzyme 반응의 효율에 영향을 미치지 않으면서 DNAzyme을 앰플리콘 내로 삽입할 수 있으며, MNAzyme 및 DNAzyme 신호를 조합하는 것이 얻어지는 Ct 값을 개선할 수 있다는 것을 입증한다.
본 실시예는 DNAzyme을 앰플리콘 내로 혼입시키기 위해 PASS 프라이머를 사용하지만, 압타머, 파트자임 또는 부가적인 MNAzyme 조립 촉진자와 같은 다른 작용성 서열을 앰플리콘 내로 혼입시키기 위해서도 PASS 프라이머를 사용할 수 있다는 것이 당업자에게 자명하다.
MNAzyme qPCR에 대한 Ct 값
PASS 프라이머 디자인 기질 디자인 기질 FAM
50 pg
(Ave Ct) 		Q670
50 pg
(Ave Ct)
파트자임 A를 결합시키기 위한 cUS를 앰플리콘 내로 혼입시킴 MNAzyme FAM 신호 DNAzyme 없음 Sub2-FIB Sub84-Q6B2 24.1 Ct 없음
MNAzyme FAM 신호 DNAzyme 없음 Sub2-FIB Sub84-FIB 24.7 n/a
파트자임 A를 결합시키기 위한 cUS 및 활성 DNAzyme을 앰플리콘 내로 혼입시킴 MNAzyme FAM 신호 DNAzyme Q670 신호 Sub2-FIB Sub84-Q6B2 25.9 25.3
MNAzyme FAM 신호 DNAzyme FAM 신호 Sub2-FIB Sub84-FIB 23.2 n/a
실시예 25: 단일 PASS 프라이머 및 단일 MNAzyme을 사용하는 다중 엔테로바이러스 RNA의 검출
엔테로바이러스 속은 밀접하게 관련되지만 고유한 60 개 초과의 바이러스의 그룹이다. 임의의 엔테로바이러스의 존재를 검출하는 단계는 수막염에 대한 치료 계획에서 결정적인 단계이다. 그러므로, 가능한 한 다수의 엔테로바이러스를 효율적으로 검출할 수 있는 단순하고 저렴한 시험이 활발하게 탐구되고 있다. 본 발명자들은 여기에, 그의 5' 단부(S1) 및 3' 단부(S2)에서 모든 엔테로바이러스에서 발견되는 공통 서열에 결합하지만, S1과 S2 사이에 고유 서열(US)을 첨가함으로써 각각의 엔테로바이러스 내의 68bp 가변 영역을 스킵하도록 디자인된 PASS 프라이머의 용도를 기재한다(도 6 및 도 12 (ii)에 기재된 바와 같음). PASS 프라이머는 모든 공지의 엔테로바이러스 RNA를 증폭시키도록 디자인되며, US의 상보체를 가변 서열 대신에 앰플리콘 내로 도입할 것이다. 이어서, US의 상보체 및 공통(보존된) 엔테로바이러스 서열을 표적화함으로써 단일 MNAzyme을 사용하여 임의의 증폭된 엔테로바이러스 서열을 검출한다(도 6 및 도 12 (ii)에 기재된 바와 같음).
본 실시예에서 본 발명자들은 엔테로바이러스 71 및 폴리오바이러스 3 양자 모두를 증폭시키도록 디자인되고 qPCR에서 MNAzyme 검출과 조합된 PASS 프라이머의 용도를 입증하며, 이에 의해 US 삽입체의 상보체(cUS) 및 엔테로바이러스 71 및 폴리오바이러스 3 양자 모두에 대한 증폭된 공통 표적 서열에 결합하는 제1 파트자임을 포함하는 동일한 MNAzyme으로 양자 모두의 바이러스를 검출할 수 있다. 제2 파트자임은 제1 파트자임에 인접하여 결합하며, 관심의 대상인 증폭된 표적 서열에 하이브리드화된다. 엔테로바이러스 71 및 폴리오바이러스 3 양자 모두를 증폭시키도록 디자인되고 qPCR에서 MNAzyme 검출과 조합된 표준 프라이머의 용도에 이를 비교하였으며, 이에 의해 각각의 바이러스는 각각의 바이러스를 특이적으로 표적화하는 제1 파트자임, 및 양자 모두에 사용할 수 있고 제1 파트자임에 인접하여 결합하며, 관심의 대상인 증폭된 표적 서열에 하이브리드화되는 제2 파트자임을 포함하는 고유 MNAzyme을 필요로 한다.
25.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
(i) 엔테로바이러스 71 RNA (ii) 폴리오 바이러스 3 RNA 또는 (iii) 모든 엔테로바이러스 RNA(PASS 프라이머의 사용을 통해 앰플리콘 내에서 가변 서열을 US로 전환시킴에 의함)를 검출하도록 파트자임을 디자인하였다. 볼드체의 염기는 2개의 바이러스 표적에 특이적인 서열을 나타내고, 이탤릭체의 염기는 공통 엔테로바이러스 서열을 나타내며, 밑줄 친 염기는 US를 나타낸다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 포스포릴화를 나타낸다. 모든 서열은 5'으로부터 3'으로 기재되었다.
서열 번호 312 파트자임 A (i) Ent71_A/55-P
AACTCTGCA GCGGAACCGACTAACAACGAGAGGTGCGGT
서열 번호 313 파트자임 A (ii) Polio3_A/55-P
AAGTCTGTG GCGGAACCGACTAACAACGAGAGGTGCGGT
서열 번호 314 파트자임 A (iii) Ent_i14A/55-P
CTCCATTACT GCGGAACCGACTAACAACGAGAGGTGCGGT
서열 번호 315 파트자임 B Ent_B/55-P
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCTTTGGGTGTCCGTGTTTCCT
25.2. 리포터 기질
본 실시예에서는, 5' 단부에서 6-FAM 부위로(하기 기질의 명칭에서 "F"로 표시함), 그리고 3' 단부에서 아이오와 블랙® FQ 퀀처 부위로(하기 기질의 명칭에서 "IB"로 표시함) 기질을 단부 표지하였다. 450 내지 490 nm(CFX96(BioRad)에서의 FAM 여기 파장 범위)의 여기를 동반하여 510 내지 530 nm(CFX96(BioRad)에서의 FAM 방출 파장 범위)에서 기질의 분해를 모니터링하였다. 본 실시예를 위한 리포터 기질은 5'으로부터 3'으로의 서열로 하기에 나타낸다. 소문자 염기는 RNA를 나타내고 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
서열 번호 25 기질 Sub55-FIB
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
25.3. 엔테로바이러스 RNA에 대한 PCR 프라이머
모든 엔테로바이러스 RNA 종에서 공통 서열에 결합하도록 표준 및 PASS 프라이머를 디자인하였다. 하기의 서열에서, 볼드체의 염기는 양자 모두의 엔테로바이러스 종에 공통인 서열과 하이브리드화되는 반면에, 밑줄 친 염기는 엔테로바이러스 RNA의 가변 영역에 불일치하는 고유 서열을 나타낸다. 이탤릭체로 된 염기는 프라이머의 Tm을 증가시키기 위해 첨가된 표적 서열의 일부가 아닌 짧은 태그 서열(T1 또는 T2)을 나타낸다. 모든 서열은 5'으로부터 3'으로 기재되었다.
서열 번호 316 정방향 프라이머 5Ent_T1
CTAA CCCTGAATGCGGCTAATCC
서열 번호 317 정방향 PASS 프라이머 5Ent_i14
TCCGGCCCCTGAATGCGG CTCCATTACT GCGGAACC
서열 번호 318 역방향 프라이머 3Ent_T2
CAG ATTGTCACCATAAGCAGCCA
25.4. 템플레이트
추출된 엔테로바이러스 71 RNA는 Viricell로부터 얻어졌다. 폴리오바이러스 3 RNA는 Asuragen으로부터 박테리오파지 코팅된 RNA(Armored RNA)로서 얻어졌다. 75 ℃에서 3 분 동안 가열함으로써 박테리오파지로부터 폴리오바이러스 3 RNA를 방출시켰다.
25.5. 반응 구성요소
표적 서열의 역전사 및 실시간 증폭 및 검출은 25 ㎕의 총 반응 부피에서 수행하였다. CFX96™ 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)에서 반응을 수행하였다. 주기 파라미터는 20 분 동안 48 ℃, 2 분 동안 95 ℃, 5 주기의 15 초 동안 95 ℃ 및 30 초 동안 55 ℃, 40 주기의 15 초 동안 95 ℃ 및 60 초 동안 54 ℃였다(54 ℃ 단계에서 데이터를 수집함). 각 세트의 반응 조건은 이중실험으로 시험하였으며, 표 45에 약술한 바와 같은, 40 nM의 정방향 프라이머 및 200 nM의 파트자임 A (i) 또는 (ii) 또는 100 nM의 파트자임 A (iii)을 함유하였다. 모든 반응은 200 nM의 기질(Sub55-FIB), 역방향 프라이머(3Ent_T2) 및 파트자임 B(Ent_B/55-P), 8 mM MgCl2, 200 μM의 각각의 dNTP 및 SensiFAST™ 탐침 No-ROX One-Step Mix를 함유하는 1x SensiFAST™ 탐침 No-ROX One-Step Kit(Bioline), RiboSafe RNAse 저해제, 역전사효소(제조자 지침에 따라 사용함)를 함유하였다. 사용된 템플레이트는 엔테로바이러스 71 (1000 및 100 복제물) 또는 폴리오바이러스 3 RNA 템플레이트(1000 및 100 복제물)였거나 표적이 없는 대조군(NF H2O)이었다.
정방향 프라이머 및 파트자임 A 조합
파트자임 A 표적 파트자임 A 정방향 프라이머 유형 정방향 프라이머 템플레이트 반응
엔테로바이러스 71 (i) Ent71_A/55-P 표준 5Ent_T1 엔테로바이러스 71 (1)
폴리오바이러스 3 (ii) Polio3_A/55-P 표준 5Ent_T1 폴리오바이러스 3 (2)
모든 엔테로바이러스 (iii) Ent_i14A/55-P PASS 5Ent_i14 엔테로바이러스 71 (3a)
폴리오바이러스 3 (3b)
25.6. 결과: 표적의 증폭 및 리포터 기질의 분해
PASS 프라이머는 엔테로바이러스 71 템플레이트(반응 (3a)) 및 폴리오바이러스 3 템플레이트(반응 (3b))를 매우 유사한 Ct 값에서 생성된 신호로 검출하였으며, 이는 PASS 프라이머가 다중 엔테로바이러스 서열을 유사한 효율로 검출할 수 있다는 것을 나타낸다(표 46). 추가로 PASS 시스템은, 심지어 낮은 복제물 수(100 복제물)의 존재 하에서도, 그들의 균등한 표준 프라이머 및 일치하는 파트자임 조합과 유사한 효율로 각각의 바이러스를 검출하였으며(반응 (1) 및 (2))(표 46), 이는 PASS 프라이머 시스템이 종 특이적인 완전히 일치하는 시스템과 유사한 감도를 가졌음을 나타낸다.
MNAzyme qPCR에 대한 Ct 값
파트자임 A 표적 정방향 프라이머 유형 템플레이트 반응 Ct(ave) 1000 복제물 Ct(ave) 100 복제물
엔테로바이러스 71 표준 엔테로바이러스 71 (1) 28.6 31.5
폴리오바이러스 3 표준 폴리오바이러스 3 (2) 28.8 31.5
모든 엔테로바이러스 PASS 엔테로바이러스 71 (3a) 29.2 31.9
폴리오바이러스 3 (3b) 29.5 31.7
본 실험은, PASS 프라이머를 사용하여, 변종이지만 관련된 서열을 완전히 일치하는 표준 프라이머와 유사한 효율로 특이적이고 민감하게 증폭할 수 있음을 입증한다. 추가로 이러한 PASS 프라이머는 바이러스 과(viral family)의 상이한 종 사이에서 가변성인 큰 서열 영역이 루프를 형성해내는 것을 가능하게 했다. 본 실시예에서 PASS 프라이머에 의해 스킵된 영역은 거의 70 염기 길이였으며 엔테로바이러스 71 RNA와 폴리오 바이러스 3 RNA 사이에서 고도로 가변성이었다.
본 명세서의 실시예에 사용된 파트자임/MNAzyme에 관한 부가 사항
상기 실시예에 언급된 MNAzyme은 상보적 염기 대합에 의해 표적 서열 상에서 서로 인접하여 하이브리드화되는 제1 및 제2 파트자임 구성요소를 포함한다. 프라이머와 함께 DNA 중합효소를 사용하여 앰플리콘을 생성시키는, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 복제물을 생성시키는 단계(예를 들어, PCR)를 포함하는 응용에 이러한 MNAzyme을 사용하는 경우, 파트자임의 3' 단부를 개질하여 DNA 중합효소가 파트자임을 연장하는 것(표적 폴리뉴클레오티드 또는 그의 앰플리콘에 하이브리드화되는 경우)을 방지하는 것이 바람직하다. 이러한 연장은 (i) PCR 프라이머로부터의 증폭 및 (ii) MNAzyme 파트자임을 사용하는 검출로부터 반응 구성요소를 격리해내는 증폭 산물을 생성시킬 수 있을 것이다.
DNA 중합효소에 의한 연장을 방지하기 위하여 여러 방법으로 올리고뉴클레오티드를 개질할 수 있다. 상기 실시예에서는 qPCR에 사용하기 위해 파트자임을 3' 포스포릴화하였다. 그러나, 다른 개질을 사용할 수 있음을, 당업자는 인식할 것이다. 예를 들어, 당업계에서는 하기의 개질을 사용하여 DNA 중합효소에 의한 올리고뉴클레오티드의 연장을 방지하였다: 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오티드의 3' 포스포릴화(뉴클레오티드의 리보오스 또는 2-데옥시리보오스 당의 3' 탄소의 포스포릴화); 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오티드로서의 "디데옥시" 뉴클레오티드(2',3' 디데옥시뉴클레오티드)의 사용; 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오티드에 대한 C3-스페이서(3' 프로필 기)의 첨가; 올리고뉴클레오티드 내의 말단 뉴클레오티드와 끝에서 두번째 뉴클레오티드 사이의 3'3' 연결의 사용("역위" 말단 뉴클레오티드). PCR과 같은 증폭 방법 중에 파트자임의 연장을 방지하기 위하여 이들 방법 중 임의의 것을 사용할 수 있음을, 당업자는 인정할 것이다. 추가로, 표적 서열을 증폭시키지 않고 MNAzyme에 의해 직접 검출하고자 하는 경우에는, 파트자임이 연장될 위험이 없을 것이므로 상기 실시예에 사용된 파트자임 중 임의의 것을 3' 개질 없이 사용할 수 있다는 것을, 당업자는 또한 인정할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> SpeeDx Pty Limited <120> Detection of Nucleic Acids <130> P027208C <160> 318 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 1 atggtcatct ccagagccca acaacgagag gcgtgat 37 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 2 ctgggaggag aggctagctg gtccatggct tctgggta 38 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (39)..(39) <400> 3 agacatacta ctccagagcc caacaacgag aggcgtgat 39 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 4 agacatacta ccagagccca acaacgagag gcgtgat 37 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 5 atgagacata ctagagccca acaacgagag gcgtgat 37 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> RNA <222> (11)..(12) <400> 6 atcacgcctc guctcctccc ag 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic <400> 7 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(37)..(37) <400> 18 gagctgggga ggctagctgc gtaggcaaga gtgcctt 37 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 19 cacaatcagt gagctggtga caacgagagg tgcggt 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 20 cacaatcagt gagcaggtga caacgagagg tgcggt 36 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 21 cacaatcagt tggagcaggt gacaacgaga ggtgcggt 38 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 22 agacatacta gagctgttga caacgagagg tgcggt 36 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 23 agacatacta gagccgttga caacgagagg tgcggt 36 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 24 agacatacta tggagccgtt gacaacgaga ggtgcggt 38 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> RNA <222> (11)..(12) <400> 25 accgcacctc guccccagct c 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic <400> 26 ggtcctgcac cagtaatatg c 21 <210> 27 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 27 atataaactt gtggtagttg cacaatcagt gagctgg 37 <210> 28 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 28 gaaaatgact gaatataaac ttcacaatca gtgagctgg 39 <210> 29 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 29 atataaactt gtggtagttg cacaatcagt gagctggtg 39 <210> 30 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 30 gaaaatgact gaatataaac ttcacaatca gtgagctggt g 41 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 31 tgatataaac ttgtggtagt cacaatcagt tggagcagg 39 <210> 32 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 32 ctgaaaatga ctgaatataa accacaatca gttggagcag g 41 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 33 atataaactt gtggtagttg cacaatcagt gagcaggtg 39 <210> 34 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 34 gaaaatgact gaatataaac ttcacaatca gtgagcaggt g 41 <210> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 35 atataaactt gtggtagttg agacatacta gagctgt 37 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 36 gaaaatgact gaatataaac ttagacatac tagagctgt 39 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 37 atataaactt gtggtagttg agacatacta gagctgttg 39 <210> 38 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 38 gaaaatgact gaatataaac ttagacatac tagagctgtt g 41 <210> 39 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 39 tgatataaac ttgtggtagt agacatacta tggagccgt 39 <210> 40 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 40 ctgaaaatga ctgaatataa acagacatac tatggagccg t 41 <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 41 atataaactt gtggtagttg agacatacta gagccgttg 39 <210> 42 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 42 gaaaatgact gaatataaac ttagacatac tagagccgtt g 41 <210> 43 <211> 35 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (43)..(43) <400> 43 tggtagttgg agcaggtgac aacgagaggt gcggt 35 <210> 44 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 44 tgtggtagtt ggagccgttg acaacgagag gtgcggt 37 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Synthetic <400> 45 ttgtggtagt tggagcagg 19 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic <400> 46 cttgtggtag ttggagccgt 20 <210> 47 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 47 agacatacta tggagccgtt gacaacgaga ggcgtgat 38 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> RNA <222> (11)..(12) <400> 48 atcacgcctc guccccagct c 21 <210> 49 <211> 44 <212> DNA <213> Synthetic <400> 49 ctgctgaaaa tgactgaata taaaccacaa tcagttggag cagg 44 <210> 50 <211> 43 <212> DNA <213> Synthetic <400> 50 gactgaatat aaacttgtgg tagtagacat actatggagc cgt 43 <210> 51 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 51 agacatacta gagctggtga caacgagagg tgcggt 36 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 52 cgttggctac gagctggtga caacgagagg tgcggt 36 <210> 53 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 53 cacaatcagt gagctgttga caacgagagg tgcggt 36 <210> 54 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 54 cgttggctac gagctgttga caacgagagg tgcggt 36 <210> 55 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 55 atataaactt gtggtagttg agacatacta gagctgg 37 <210> 56 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 56 gaaaatgact gaatataaac ttagacatac tagagctgg 39 <210> 57 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 57 atataaactt gtggtagttg cgttggctac gagctgg 37 <210> 58 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 58 gaaaatgact gaatataaac ttacgttggc tacgagctgg 40 <210> 59 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 59 atataaactt gtggtagttg cacaatcagt gagctgt 37 <210> 60 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 60 gaaaatgact gaatataaac ttcacaatca gtgagctgt 39 <210> 61 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 61 atataaactt gtggtagttg cgttggctac gagctgt 37 <210> 62 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 62 gaaaatgact gaatataaac ttcgttggct acgagctgt 39 <210> 63 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 63 gagctgggga ggctagctgc tccaactacc acaagttt 38 <210> 64 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 64 acaatcagtc ctacgcgaac aacaacgaga ggtgcggt 38 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Synthetic <400> 65 tattaaaagg tactggtgga gta 23 <210> 66 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 66 ctgtatcgtc aaggcactct tcacaatcag tcctacgcga a 41 <210> 67 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 67 agacatacta ctacgacaac aacaacgaga ggtgcggt 38 <210> 68 <211> 34 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (34)..(34) <400> 68 agacatacta gcaaacaaca acgagaggtg cggt 34 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic <400> 69 tacgatacac gtctgcagtc a 21 <210> 70 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 70 tgtatcgtca aggcactctt gagacatact actacgacaa 40 <210> 71 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 71 ctgtatcgtc aaggcactct tagacatact actacgacaa 40 <210> 72 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 72 gctgtatcgt caaggcactc tagacatact actacgacaa 40 <210> 73 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 73 gctgtatcgt caaggcactc agacatacta ctacgacaa 39 <210> 74 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 74 gtcaaggcac tcttgcctac agacatacta gcaaaca 37 <210> 75 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 75 cgtcaaggca ctcttgccta agacatacta gcaaaca 37 <210> 76 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 76 tcgtcaaggc actcttgcct agacatacta gcaaaca 37 <210> 77 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 77 atcgtcaagg cactcttgcc agacatacta gcaaaca 37 <210> 78 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <400> 78 gtatcgtcaa ggcactcttg cagacatact agcaaaca 38 <210> 79 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <400> 79 tgtatcgtca aggcactctt gagacatact agcaaaca 38 <210> 80 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 80 tcaataccat tacgcgacca acaacgagag gtgcggt 37 <210> 81 <211> 34 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (34)..(34) <400> 81 tcttgcctac gcgaccaaca acgagaggtg cggt 34 <210> 82 <211> 35 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (35)..(35) <400> 82 ctcttgccta cgcaaacaac aacgagaggt gcggt 35 <210> 83 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 83 tgtatcgtca aggcactctt gtcaatacca ttacgcgacc a 41 <210> 84 <211> 19 <212> DNA <213> Synthetic <400> 84 gcactcttgc ctacgcgac 19 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic <400> 85 ggcactcttg cctacgcaaa 20 <210> 86 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 86 tgcccaggga ggctagctgg tccatggctt ctgggta 37 <210> 87 <211> 44 <212> DNA <213> Synthetic <400> 87 ctgctgaaaa tgactgaata taaacagaca tactatggag ccgt 44 <210> 88 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 88 acaatcagtc ctacgacaac aacaacgaga ggtgcggt 38 <210> 89 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 89 agacatacta ccagagccca acaacgagag gaaacctt 38 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tggcgtggag aggctagctc gatgtgagtt tctgctttgc tg 42 <210> 118 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 118 gaaagccaac aaggaaatcc tacaacgagg ggtcgag 37 <210> 119 <211> 42 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (42)..(42) <400> 119 tggcgtggag aggctagctc aacaaggaaa tcctcgatgt ga 42 <210> 120 <211> 62 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (62)..(62) <400> 120 aagttaaaat tcccgtcgct atcaactcta gctgtagcat gaaagcacaa cgaggggtcg ag 62 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> RNA <222> (10)..(11) <400> 121 ctcgaccccg uctccacgcc a 21 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic <400> 122 gcctgaggtt cagagccatg g 21 <210> 123 <211> 25 <212> DNA <213> Synthetic <400> 123 ttaaaattcc cgtcgctatc aagac 25 <210> 124 <211> 23 <212> DNA <213> Synthetic <400> 124 attcccgtcg ctatcaagga acc 23 <210> 125 <211> 23 <212> DNA <213> Synthetic <400> 125 tcccgtcgct atcaaggaat ctc 23 <210> 126 <211> 23 <212> DNA 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ccagagccca acaacgagag gaaacctt 38 <210> 134 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 134 gatgtgctat ccagagccca acaacgagag gaaacctt 38 <210> 135 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 135 gtgagttgat ccagagccca acaacgagag gaaacctt 38 <210> 136 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 136 ctctgggggc tctcaagtct agacatacta ccagagc 37 <210> 137 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 137 gggtagaagt ctctgggggc agacatacta ccagagc 37 <210> 138 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 138 tgacggtgtt gggatgtgct atagacatac taccagagc 39 <210> 139 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 139 ggtttaactg caggtgagtt gatagacata ctaccagagc 40 <210> 140 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> ID 140 agcatcgtat ttggaagaag aggagacata ctaccagagc 40 <210> 141 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic <400> 141 cttgtctcag ttcttcttgg ccagagc 27 <210> 142 <211> 29 <212> DNA <213> Synthetic <400> 142 gctctcaagt ctcttgtctc agccagagc 29 <210> 143 <211> 29 <212> DNA <213> Synthetic <400> 143 tgacggtgtt gggatgtgct atccagagc 29 <210> 144 <211> 30 <212> DNA <213> Synthetic <400> 144 ggtttaactg caggtgagtt gatccagagc 30 <210> 145 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (41)..(41) <400> 145 tggacgaggg aggctagctt ctgactggaa aacagactct a 41 <210> 146 <211> 49 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (49)..(49) <400> 146 ctgattctag gaatatggaa ggagactgtc ccacaacgag agggtcgag 49 <210> 147 <211> 67 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (67)..(67) <400> 147 agaacttacg cctgctttct gattctaatt cacgtctcat caactgtccc acaacgagag ggtcgag 67 <210> 148 <211> 62 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (62)..(62) <400> 148 ttacgcctgc tttctgattc taggaatcgt ctcatcaact gtcccacaac gagagggtcg ag 62 <210> 149 <211> 57 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (57)..(57) <400> 149 cctgctttct gattctagga atatggacat caactgtccc acaacgagag ggtcgag 57 <210> 150 <211> 65 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (65)..(65) <400> 150 tttctgattc taggaatatg gaaggattca cgtctcatca actgtcccac aacgagaggg tcgag 65 <210> 151 <211> 60 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (60)..(60) <400> 151 tttctgattc taggaatatg gaaggcgtct catcaactgt cccacaacga gagggtcgag 60 <210> 152 <211> 55 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (55)..(55) <400> 152 tttctgattc taggaatatg gaaggcatca actgtcccac aacgagaggg tcgag 55 <210> 153 <211> 50 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (50)..(50) <400> 153 ccctgggcaa ggaacaataa ctcagactgt cccacaacga gagggtcgag 50 <210> 154 <211> 51 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (51)..(51) <400> 154 actcagaact tacgcctgct ttctgaactg tcccacaacg agagggtcga g 51 <210> 155 <211> 52 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (52)..(52) <400> 155 agaacttacg cctgctttct gattctaact gtcccacaac 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Synthetic <400> 173 ttgttggatc atattcgtcc accacaatca gtcctacgcg aa 42 <210> 174 <211> 46 <212> DNA <213> Synthetic <400> 174 atattaaaac aagatttacc tctattcaca atcagtccta cgcgaa 46 <210> 175 <211> 44 <212> DNA <213> Synthetic <400> 175 tatctgtatc aaagaatggt cctgcacaat cagtcctacg cgaa 44 <210> 176 <211> 45 <212> DNA <213> Synthetic <400> 176 tggttacata taacttgaaa cccaacacaa tcagtcctac gcgaa 45 <210> 177 <211> 33 <212> DNA <213> Synthetic <400> 177 ttctgaatta gctgtatcgt caacctacgc gaa 33 <210> 178 <211> 34 <212> DNA <213> Synthetic <400> 178 tatctgtatc aaagaatggt cctgcctacg cgaa 34 <210> 179 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (39)..(39) <400> 179 gctaattcag aatcattttg tgacaacgag aggtgcggt 39 <210> 180 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (40)..(40) <400> 180 gagctgggga ggctagctga cgaatatgat ccaacaatag 40 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic <400> 181 caagagtgcc ttgacgatac 20 <210> 182 <211> 10 <212> DNA <213> 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Synthetic <400> 230 tcagttcttc ttggatggtc atgttacctg aaccagagc 39 <210> 231 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 231 ctcttgtctc agttcttctt ggcattagtg ccccagagc 39 <210> 232 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 232 tcagttcttc ttggatggtc atcattagtg ccccagagc 39 <210> 233 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 233 ctcttgtctc agttcttctt ggcattgaca gaccagagc 39 <210> 234 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 234 tcagttcttc ttggatggtc atcattgaca gaccagagc 39 <210> 235 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 235 cttgtctcag ttcttcttgg cgaaagcgac ccagagc 37 <210> 236 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 236 ttcttcttgg atggtcatct cgaaagcgac ccagagc 37 <210> 237 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 237 ctcttgtctc agttcttctt ggcgtctcat caccagagc 39 <210> 238 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 238 tcagttcttc ttggatggtc atcgtctcat caccagagc 39 <210> 239 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 239 ctcttgtctc agttcttctt ggggattaga tcccagagc 39 <210> 240 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <400> 240 tcagttcttc ttggatggtc atggattaga tcccagagc 39 <210> 241 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (40)..(40) <400> 241 gagctgggga ggctagctct ccaactacca caagtttata 40 <210> 242 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 242 cacaatcagt acgcctccag acaacgagag gtgcgg 36 <210> 243 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 243 cacaatgatg acgcctccag acaacgagag gtgcgg 36 <210> 244 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 244 agacatacta acgcctccag acaacgagag gtgcgg 36 <210> 245 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 245 agacagttac acgcctccag acaacgagag gtgcgg 36 <210> 246 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 246 agagtcattc acgcctccag acaacgagag gtgcgg 36 <210> 247 <211> 35 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (35)..(35) <400> 247 gttggctaca cgcctccaga caacgagagg tgcgg 35 <210> 248 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 248 caataccata cgcctccaga caacgagagg tgcggt 36 <210> 249 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 249 gattcgagaa acgcctccag acaacgagag gtgcgg 36 <210> 250 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 250 gattcgagtt acgcctccag acaacgagag gtgcgg 36 <210> 251 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 251 gttacctgaa acgcctccag acaacgagag gtgcgg 36 <210> 252 <<211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 252 cattagtgcc acgcctccag acaacgagag gtgcgg 36 <210> 253 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 253 cattgacaga acgcctccag acaacgagag gtgcgg 36 <210> 254 <211> 35 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (35)..(35) <400> 254 gaaagcgaca cgcctccaga caacgagagg tgcgg 35 <210> 255 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 255 cgtctcatca acgcctccag acaacgagag gtgcgg 36 <210> 256 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 256 ggattagatc acgcctccag acaacgagag gtgcgg 36 <210> 257 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 257 tgtatcgtca aggcactctt gccacaatca gtacgcctcc 40 <210> 258 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 258 tgaattagct gtatcgtcaa ggccacaatc agtacgcctc c 41 <210> 259 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 259 tgtatcgtca aggcactctt gccacaatga tgacgcctcc 40 <210> 260 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 260 tgaattagct gtatcgtcaa ggccacaatg atgacgcctc c 41 <210> 261 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 261 tgtatcgtca aggcactctt gcagacatac taacgcctcc 40 <210> 262 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 262 tgaattagct gtatcgtcaa ggcagacata ctaacgcctc c 41 <210> 263 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 263 tgtatcgtca aggcactctt gcagacagtt acacgcctcc 40 <210> 264 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 264 tgaattagct gtatcgtcaa ggcagacagt tacacgcctc c 41 <210> 265 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 265 tgtatcgtca aggcactctt gcagagtcat tcacgcctcc 40 <210> 266 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 266 tgaattagct gtatcgtcaa ggcagagtca ttcacgcctc c 41 <210> 267 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 267 tgtatcgtca aggcactctt gccgttggct acacgcctcc 40 <210> 268 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 268 tgaattagct gtatcgtcaa ggccgttggc tacacgcctc c 41 <210> 269 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 269 tgtatcgtca aggcactctt gctcaatacc atacgcctcc 40 <210> 270 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 270 tgaattagct gtatcgtcaa ggctcaatac catacgcctc c 41 <210> 271 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 271 tgtatcgtca aggcactctt gcgattcgag aaacgcctcc 40 <210> 272 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 272 tgaattagct gtatcgtcaa ggcgattcga gaaacgcctc c 41 <210> 273 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 273 tgtatcgtca aggcactctt gcgattcgag ttacgcctcc 40 <210> 274 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 274 tgaattagct gtatcgtcaa ggcgattcga gttacgcctc c 41 <210> 275 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 275 tgtatcgtca aggcactctt gcgttacctg aaacgcctcc 40 <210> 276 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 276 tgaattagct gtatcgtcaa ggcgttacct gaaacgcctc c 41 <210> 277 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 277 tgtatcgtca aggcactctt gccattagtg ccacgcctcc 40 <210> 278 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 278 tgaattagct gtatcgtcaa ggccattagt gccacgcctc c 41 <210> 279 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 279 tgtatcgtca aggcactctt gccattgaca gaacgcctcc 40 <210> 280 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 280 tgaattagct gtatcgtcaa ggccattgac agaacgcctc c 41 <210> 281 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 281 tgtatcgtca aggcactctt gccgaaagcg acacgcctcc 40 <210> 282 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 282 tgaattagct gtatcgtcaa ggccgaaagc gacacgcctc c 41 <210> 283 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 283 tgtatcgtca aggcactctt gccgtctcat caacgcctcc 40 <210> 284 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 284 tgaattagct gtatcgtcaa ggccgtctca tcaacgcctc c 41 <210> 285 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 285 tgtatcgtca aggcactctt gcggattaga tcacgcctcc 40 <210> 286 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 286 tgaattagct gtatcgtcaa ggcggattag atcacgcctc c 41 <210> 287 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 287 agacatacta tggagcggtt gacaacgaga ggtgcggt 38 <210> 288 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 288 agacatacta tggagcagtt gacaacgaga ggtgcggt 38 <210> 289 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 289 agacatacta tggagctctt gacaacgaga ggtgcggt 38 <210> 290 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 290 agacatacta tggagctatt gacaacgaga ggtgcggt 38 <210> 291 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 291 agacatacta tggagatgtt gacaacgaga ggtgcggt 38 <210> 292 <211> 43 <212> DNA <213> Synthetic <400> 292 gactgaatat aaacttgtgg tagtagacat actatggagc ggt 43 <210> 293 <211> 43 <212> DNA <213> Synthetic <400> 293 gactgaatat aaacttgtgg tagtagacat actatggagc agt 43 <210> 294 <211> 43 <212> DNA <213> Synthetic <400> 294 gactgaatat aaacttgtgg tagtagacat actatggagc tct 43 <210> 295 <211> 43 <212> DNA <213> Synthetic <400> 295 gactgaatat aaacttgtgg tagtagacat actatggagc tat 43 <210> 296 <211> 43 <212> DNA <213> Synthetic <400> 296 gactgaatat aaacttgtgg tagtagacat actatggaga tgt 43 <210> 297 <211> 44 <212> DNA <213> Synthetic <400> 297 ctgctgaaaa tgactgaata taaacagaca tactatggag cggt 44 <210> 298 <211> 44 <212> DNA <213> Synthetic <400> 298 ctgctgaaaa tgactgaata taaacagaca tactatggag cagt 44 <210> 299 <211> 44 <212> DNA <213> Synthetic <400> 299 ctgctgaaaa tgactgaata taaacagaca tactatggag ctct 44 <210> 300 <211> 44 <212> DNA <213> Synthetic <400> 300 ctgctgaaaa tgactgaata taaacagaca tactatggag ctat 44 <210> 301 <211> 44 <212> DNA <213> Synthetic <400> 301 ctgctgaaaa tgactgaata taaacagaca tactatggag atgt 44 <210> 302 <211> 45 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (45)..(45) <400> 302 tgctttctga ttctaggaat actgtcccac aacgagaggg tcgag 45 <210> 303 <211> 43 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (43)..(43) <400> 303 tcgttaccta gtctaagcac tgtcccacaa cgagagggtc gag 43 <210> 304 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic <400> 304 cagctttctg aggttaccat ccta 24 <210> 305 <211> 42 <212> DNA <213> Synthetic <400> 305 agaacttacg cctgctttct gattctagga atatggaagg ag 42 <210> 306 <211> 42 <212> DNA <213> Synthetic <400> 306 tcgttaccta gtctaagcct gattctagga atatggaagg ag 42 <210> 307 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 307 tgcccaggga ggctagctca gctgtgtccg attctgtc 38 <210> 308 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 308 ccactcttcc tcaatcttaa caacgagagg aaacctt 37 <210> 309 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic <400> 309 gccaatgact tacttaggac 20 <210> 310 <211> 45 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (45)..(45) <400> 310 aactgactaa ttgacttgct catccatagt gccactcttc ctcaa 45 <210> 311 <211> 69 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (69)..(69) <400> 311 tgcaactctc tgttcaggga ctctcgaccc tctcgttgta gctagcctcc ctcgtccact cttcctcaa 69 <210> 312 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (39)..(39) <400> 312 aactctgcag cggaaccgac taacaacgag aggtgcggt 39 <210> 313 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (39)..(39) <400> 313 aagtctgtgg cggaaccgac taacaacgag aggtgcggt 39 <210> 314 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (40)..(40) <400> 314 ctccattact gcggaaccga ctaacaacga gaggtgcggt 40 <210> 315 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (39)..(39) <400> 315 gagctgggga ggctagctct ttgggtgtcc gtgtttcct 39 <210> 316 <211> 23 <212> DNA <213> Synthetic <400> 316 ctaaccctga atgcggctaa tcc 23 <210> 317 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <400> 317 tccggcccct gaatgcggct ccattactgc ggaacc 36 <210> 318 <211> 23 <212> DNA <213> Synthetic <400> 318 cagattgtca ccataagcag cca 23

Claims (117)

  1. 하기 단계를 포함하는 샘플 내 표적 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 결정하는 방법:
    (a) 하기 구성요소를 포함하는 프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    올리고뉴클레오티드의 5' 단부(end)에서 종결되며 상보적 염기쌍 형성(complementary base pairing)에 의해 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 제1 부분에 하이브리드화될 수 있는 제1 프라이머 구성요소, 및
    올리고뉴클레오티드의 3' 단부에서 종결되며 상보적 염기쌍 형성에 의해 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 제2 부분에 하이브리드화될 수 있는 제2 프라이머 구성요소;
    (b) 제1 프라이머 구성요소 및 제2 프라이머 구성요소와 표적 폴리뉴클레오티드 가닥과의 하이브리드화에 적합한 조건하에, 표적 폴리뉴클레오티드를 잠재적으로 포함하는 샘플을 상기 프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 이중-가닥 이중체(duplex)를 형성시키는 단계로서, 여기서 이중체의 중간 섹션의 적어도 하나의 가닥은 중간 섹션의 대향 가닥에 하이브리드화되지 않은 채 남아 있는 적어도 4개의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 상기 적어도 4개의 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하는 중간 섹션의 대향 가닥 내의 뉴클레오티드 서열의 부재로 인한 것인, 단계;
    (c) 표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 템플레이트로서 사용하여 이중체의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 연장할 수 있는 중합효소와 샘플을 접촉시킴으로써 제1 및 제2 단부 구성요소의 중간에 있는 내부 구성요소(internal component)를 포함하는 앰플리콘을 생성시키는 단계로서, 여기서
    앰플리콘의 제1 단부 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상기 제1 부분에 상보적 염기쌍 형성에 의해 하이브리드화될 수 있고,
    앰플리콘의 제2 단부 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 상기 제2 부분에 상보적 염기쌍 형성에 의해 하이브리드화될 수 있으며,
    앰플리콘의 제1 및 제2 단부 구성요소의 표적 폴리뉴클레오티드 가닥에 대한 상기 하이브리드화는, 내부 구성요소와 염기쌍 상보성을 공유하지 않는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 제1 및 제2 부분 사이에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 중간(intermediate) 뉴클레오티드 서열에 대향하도록 앰플리콘의 내부 구성요소를 위치시키는 것인, 단계; 및
    (d) 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 단계로서, 앰플리콘의 검출은 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내고, 앰플리콘의 검출 실패는 샘플 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 부재를 나타내는 것인, 단계.
  2. 제1항에 있어서, 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 단계가 앰플리콘의 내부 구성요소 또는 앰플리콘의 내부 구성요소에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 검출하는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상보적 염기쌍 형성에 의한 표적 폴리뉴클레오티드 가닥에 대한 하이브리드화시에 제1 프라이머 구성요소의 융해 온도가 제2 프라이머 구성요소의 융해 온도보다 더 큰, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 프라이머 올리고뉴클레오티드가 제1 프라이머 구성요소와 제2 프라이머 구성요소 사이에 위치하는 제3 프라이머 구성요소를 포함하며, 여기서 제3 프라이머 구성요소는:
    표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 중간 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하지 않고,
    앰플리콘의 내부 구성요소의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열로 구성되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 제3 프라이머 구성요소가 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 절반 내에 부분적으로 또는 완전히 위치하는, 방법.
  6. 제4항에 있어서, (ⅰ) 제3 프라이머 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수와 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 중간 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 수가 동일하거나; 또는 (ⅱ) 제3 프라이머 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 상기 중간 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 수를 초과하는, 방법.
  7. 제4항에 있어서, 제3 프라이머 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 중간 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 수보다 적은, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    표적 폴리뉴클레오티드 가닥이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 2개 이상의 개별적인 구성원 사이에서 변동되는 다형성 영역을 포함하고,
    다형성 영역의 업스트림에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 구성요소와 서열 상보성을 공유하는 제1 프라이머 구성요소 및 다형성 영역의 다운스트림에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 구성요소와 서열 상보성을 공유하는 제2 프라이머 구성요소에 의해, 제1 프라이머 구성요소 및 제2 프라이머 구성요소가 각각 개체군의 다중 구성원에 하이브리드화될 수 있으며,
    제1 프라이머 구성요소 및 제2 프라이머 구성요소가 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되는 경우에 다형성 영역이 프라이머 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화되지 않은 채 남아 있는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 가닥이 단일 염기 다형성(SNP), 점 돌연변이, 또는 양자 모두를 포함하고;
    앰플리콘이 (ⅰ) SNP에 상보적인 뉴클레오티드, (ⅱ) 점 돌연변이에 상보적인 뉴클레오티드, 또는 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ) 양자 모두를 포함하며; 및
    제1 또는 제2 프라이머 구성요소가 상보적 염기쌍 형성에 의해 상기 (ⅰ), 상기 (ⅱ), 또는 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ) 양자 모두에 하이브리드화될 수 있는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 제2 프라이머 구성요소가 SNP에 상보적인 뉴클레오티드 또는 점 돌연변이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 SNP에 상보적인 뉴클레오티드 또는 점 돌연변이에 상보적인 뉴클레오티드는,
    제2 프라이머 구성요소의 3' 말단에 위치하거나;
    제2 프라이머 구성요소의 3' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 5개 초과의 뉴클레오티드 업스트림에 위치하거나;
    제2 프라이머 구성요소의 3' 말단에 위치하고, 이때 제2 프라이머 구성요소는 3' 말단으로부터 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 6개 초과의 뉴클레오티드 업스트림에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드에 비-상보적인 뉴클레오티드를 또한 포함하며; 또는
    제2 프라이머 구성요소의 3' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 5개 초과의 뉴클레오티드 업스트림에 위치하고, 이때 제2 프라이머 구성요소는 표적에 비-상보적인 추가의 뉴클레오티드를 또한 포함하고, 상기 추가의 뉴클레오티드가 상기 SNP 또는 점 돌연변이에 상보적인 상기 뉴클레오티드의 3' 또는 5'에 위치하는, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    표적 폴리뉴클레오티드 가닥이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 적어도 2개의 개별적인 구성원 사이에 상이한 다형성 영역을 포함하고,
    표적 폴리뉴클레오티드의 상기 개체군의 2개 이상의 개별적인 구성원 사이에 다형성 영역이 상이하도록 다형성 영역이 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하며,
    제1 프라이머 구성요소 또는 제2 프라이머 구성요소가 상보적 염기쌍 형성에 의해 상기 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 다형성 영역에 하이브리드화될 수 있고, 여기서 다형성 영역은 개체군 구성원의 서브세트 만의 표적 폴리뉴클레오티드 가닥에 존재하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 단계가 이중-가닥 DNA, 앰플리콘 서열 특이적-탐침, 또는 양자 모두에 결합하는 염료에 의해 제공되는 신호를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 단계가 적어도 2개 이상의 파트자임(partzyme) 구성요소 올리고뉴클레오티드를 포함하는 다중-구성요소 핵산 효소(MNAzyme: multi-component nucleic acid enzyme)의 사용을 포함하며, 여기서 적어도 제1 파트자임 구성요소 및 제2 파트자임 구성요소는 앰플리콘의 존재시 자가-조립되어 촉매적으로 활성인 MNAzyme을 형성하고, 여기서 제1 및 제2 파트자임 구성요소 각각은 기질 팔 부분(기질 arm portion), 촉매 코어 부분(catalytic core portion), 및 센서 팔 부분(sensor arm portion)을 포함하며;
    여기서 자가-조립시에, 제1 및 제2 파트자임 구성요소의 센서 팔 부분은 MNAzyme의 센서 팔로서 작용하고, 제1 및 제2 파트자임 구성요소의 기질 팔 부분은 MNAzyme의 기질 팔로서 작용하며, 제1 및 제2 파트자임 구성요소의 촉매 코어 부분은 MNAzyme의 촉매 코어로서 작용하고;
    여기서 MNAzyme의 센서 팔은 상보적 염기쌍 형성에 의해 앰플리콘의 일부 또는 전부와 하이브리드화되어 제1 및 제2 파트자임 구성요소가 근접하도록 유지함으로써 그들 각각의 촉매 코어 부분이 연계하여 MNAzyme의 촉매 코어를 형성하며; 상기 촉매 코어는 적어도 하나의 기질을 개질할 수 있고; 여기서 MNAzyme의 기질 팔은 기질과 맞물림으로써(engage) MNAzyme의 촉매 코어가 기질을 개질하여 검출가능한 효과를 제공할 수 있는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, MNAzyme의 제1 센서 팔, 제2 센서 팔, 또는 양자 모두는, 앰플리콘의 내부 구성요소를 포함하거나 이로 구성된 뉴클레오티드 서열에 상보적이거나, 또는 앰플리콘의 내부 구성요소에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 상보적인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, MNAzyme의 제1 센서 팔, 제2 센서 팔, 또는 양자 모두는 하기 서열에 상보적인, 방법:
    - 앰플리콘의 제1 단부 구성요소, 제2 단부 구성요소, 또는 양자 모두를 포함하거나 이로 구성된 앰플리콘 내의 뉴클레오티드 서열; 또는
    - 앰플리콘의 제1 단부 구성요소, 제2 단부 구성요소, 또는 양자 모두에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 앰플리콘 내의 뉴클레오티드 서열.
  16. 제13항에 있어서, MNAzyme의 제1 센서 팔, 제2 센서 팔, 또는 양자 모두는 하기 서열에 상보적인, 방법:
    - 앰플리콘의 내부 구성요소를 포함하거나 이로 구성되지 않는 앰플리콘 내의 뉴클레오티드 서열; 또는
    - 앰플리콘의 내부 구성요소를 포함하거나 이로 구성되지 않는 앰플리콘 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열.
  17. 제13항에 있어서, MNAzyme의 제1 센서 팔, 제2 센서 팔, 또는 양자 모두는, 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 존재하는 단일 염기 다형성(SNP), 점 돌연변이, 또는 양자 모두에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 존재하는 SNP에 상보적인 뉴클레오티드, 점 돌연변이에 상보적인 뉴클레오티드, 또는 양자 모두에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    표적 폴리뉴클레오티드 가닥이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 2개 이상의 개별적인 구성원 사이에 상이한 다형성 영역을 포함하고,
    MNAzyme의 제1 센서 팔, 제2 센서 팔, 또는 양자 모두는, 개체군의 주어진 구성원의 다형성 영역, 또는 그의 구성요소, 또는 개체군의 주어진 구성원의 다형성 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 구성요소를 포함하거나 이로 구성된 앰플리콘 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인, 방법.
  19. 제13항에 있어서, MNAzyme의 센서 팔이 제1 센서 팔 구성요소, 제2 센서 팔 구성요소, 및 제3 센서 팔 구성요소를 포함하거나 이로 구성되며, 여기서
    제1 센서 팔 구성요소는 상보적 염기쌍 형성에 의해 앰플리콘에 하이브리드화될 수 있고;
    제2 센서 팔 구성요소는 상보적 염기쌍 형성에 의해 앰플리콘에 하이브리드화될 수 있으며;
    제3 센서 팔 구성요소는 제1 센서 팔 구성요소와 제2 센서 팔 구성요소 사이에 위치하고 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소가 앰플리콘에 하이브리드화되는 경우에 상보적 염기쌍 형성에 의해 앰플리콘에 하이브리드화될 수 없는, 방법.
  20. 제13항에 있어서, 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소가 상보적 염기쌍 형성에 의해 앰플리콘의 분리된 불연속 구성요소에 하이브리드화될 수 있으며, 이에 의해 불연속 구성요소를 병치(juxtaposing)하고 앰플리콘 내에 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 루프 부분을 생성시키는 방법.
  21. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 가닥이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 2개 이상의 개별적인 구성원 사이에 상이한 다형성 영역을 포함하고:
    프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계가 다중 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 상이한 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드는, 상이한 형태의 다형성 영역, 또는 하나 이상의 형태의 다형성 영역에 인접한 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 부분과 염기쌍 상보성을 공유하고;
    프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계는 하이브리드화에 적합한 조건 하에 표적 폴리뉴클레오티드 개체군의 하나 이상의 구성원을 잠재적으로 포함하는 샘플을 상기 다중 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하며;
    여기서 각각의 다중 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드는, 제1 프라이머 구성요소와 제2 프라이머 구성요소 사이에 위치하며 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 내의 상기 중간 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하지 않는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 상기 제3 프라이머 구성요소를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 단계가 제1 센서 팔 구성요소, 제2 센서 팔 구성요소, 및 제3 센서 팔 구성요소를 포함하는 MNAzyme을 사용하는 단계를 포함하며, 여기서
    제1 센서 팔 구성요소는 상보적 염기쌍 형성에 의해 앰플리콘의 내부 구성요소에 하이브리드화될 수 있고;
    제2 센서 팔 구성요소는 상보적 염기쌍 형성에 의해 앰플리콘의 제2 단부 구성요소에 하이브리드화될 수 있으며;
    제3 센서 팔 구성요소는 제1 센서 팔 구성요소와 제2 센서 팔 구성요소 사이에 위치하고, 제1 센서 팔 구성요소 및 제2 센서 팔 구성요소가 앰플리콘에 하이브리드화되는 경우에 상보적 염기쌍 형성에 의해 상기 다형성 영역 또는 상기 다형성 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화될 수 없는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 제1 센서 팔 구성요소가 상보적 염기쌍 형성에 의해 앰플리콘의 내부 구성요소 및 앰플리콘의 제1 단부 구성요소에 하이브리드화될 수 있는, 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    다형성 영역을 포함하는 다중 형태의 앰플리콘이 샘플을 중합효소와 접촉시키는 단계에 의해 생성되며, 여기서 상기 각각의 형태의 앰플리콘의 다형성 영역은 상이하고;
    센서 팔이 제1 센서 팔 구성요소, 제2 센서 팔 구성요소, 및 다형성 영역을 포함하거나 이로 구성된 앰플리콘 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적이지 않은 제3 센서 팔 구성요소를 포함하거나 이로 구성되며, 여기서
    제1 센서 팔 구성요소는 다형성 영역의 업스트림에서 상보적 염기쌍 형성에 의해 상기 다중 형태의 앰플리콘의 하나 또는 그 이상에 하이브리드화될 수 있고,
    제2 센서 팔 구성요소는 다형성 영역의 다운스트림에서 상보적 염기쌍 형성에 의해 상기 다중 형태의 앰플리콘의 하나 또는 그 이상에 하이브리드화될 수 있으며,
    제3 센서 팔 구성요소는 제1 센서 팔 구성요소와 제2 센서 팔 구성요소 사이에 위치하고, 상기 다중 형태의 앰플리콘의 하나 또는 그 이상의 다형성 영역에 상보적 염기쌍 형성에 의해 하이브리드화될 수 없는, 방법.
  25. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    프라이머 올리고뉴클레오티드가 촉매 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 앰플리콘이 상기 촉매 핵산을 포함하고,
    앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 단계가 앰플리콘 내에 존재하는 상기 촉매 핵산의 촉매 활성을 검출하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 앰플리콘 내에 존재하는 상기 촉매 핵산의 촉매 활성을 검출하는 단계가 앰플리콘을 상기 촉매 핵산의 기질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군을 포함하며;
    표적 폴리뉴클레오티드 가닥이 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 적어도 2개의 개별적인 구성원 사이에서 변동되는 다형성 영역을 포함하고;
    프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계가 2개 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서
    상기 제1 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 제1 또는 제2 프라이머 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 제1 구성원의 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 다형성 영역과 염기쌍 상보성을 공유하고,
    상기 제2 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 제1 또는 제2 프라이머 구성요소는 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 제2 구성원의 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 다형성 영역과 염기쌍 상보성을 공유하고,
    표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 상기 제1 및 제2 구성원의 다형성 영역은 뉴클레오티드 서열에 있어서 상이하고,
    제1 및 제2 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 제3 구성요소는 뉴클레오티드 서열에 있어서 상이하며;
    샘플을 프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계가 샘플을 제1 및 제2 형태의 프라이머 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하고;
    샘플을 중합효소와 접촉시키는 단계가 상기 앰플리콘의 개체군을 생성시키며, 여기서
    상기 앰플리콘의 개체군의 제1 구성원은 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 제1 구성원의 상기 다형성 영역과 서열 상보성을 공유하는 단부 구성요소를 포함하고,
    상기 앰플리콘의 개체군의 제2 구성원은 표적 폴리뉴클레오티드의 개체군의 제2 구성원의 상기 다형성 영역과 서열 상보성을 공유하는 단부 구성요소를 포함하며,
    상기 앰플리콘의 개체군의 상기 제1 및 제2 구성원의 내부 구성요소의 뉴클레오티드 서열은 상이한, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 단계가 이중-가닥 DNA, 앰플리콘 서열 특이적-탐침, 또는 양자 모두에 결합하는 염료에 의해 제공되는 신호를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 앰플리콘이 생성되는지 여부를 검출하는 단계가 융해 곡선 분석을 사용하여 앰플리콘의 개체군의 상기 제1 및 제2 구성원의 상기 생성을 모니터링하는 것을 포함하는, 방법.
  29. 상보적 염기쌍 형성에 의해 제2 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화된 프라이머 또는 파트자임 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단리된 이중 가닥 핵산 이중체로서, 여기서
    올리고뉴클레오티드의 제1 구성요소는 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에서 종결되고 상보적 염기쌍 형성에 의해 제2 폴리뉴클레오티드의 제1 부분에 하이브리드화되고,
    올리고뉴클레오티드의 제2 구성요소는 올리고뉴클레오티드의 3' 단부에서 종결되고 상보적 염기쌍 형성에 의해 제2 폴리뉴클레오티드의 제2 부분에 하이브리드화되며,
    올리고뉴클레오티드의 제3 구성요소는 상기 제1 및 제2 구성요소 사이에 위치하고 제2 폴리뉴클레오티드 내의 대향 뉴클레오티드 서열과 염기쌍 상보성을 공유하지 않는 적어도 4개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하고;
    제2 폴리뉴클레오티드는 상기 제1 및 제2 구성요소에 하이브리드화된 제2 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치한 하나 이상의 비하이브리드화된 뉴클레오티드를 포함하고;
    올리고뉴클레오티드의 제3 구성요소는 올리고뉴클레오티드의 3' 절반 내에 부분적으로 또는 완전히 위치하는, 단리된 이중 가닥 핵산 이중체.
  30. 제29항에 있어서, 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 제1 및 제2 구성요소에 하이브리드화된 제2 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 제2 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수와 동일하거나 이를 초과하는, 이중 가닥 핵산 이중체.
  31. 제29항에 있어서, 제3 구성요소 내의 뉴클레오티드의 수가 제1 및 제2 구성요소에 하이브리드화된 제2 폴리뉴클레오티드의 부분들 사이에 위치하는 제2 폴리뉴클레오티드 내의 하이브리드화되지 않은 뉴클레오티드의 수보다 적은, 이중 가닥 핵산 이중체.
  32. 제29항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 제3 구성요소가 서열번호 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195 또는 196 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 서열 중 어느 하나의 상보체를 포함하거나 이로 구성되는, 단리된 이중 가닥 핵산 이중체.
  33. 제29항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 파트자임인, 단리된 이중 가닥 핵산 이중체.
  34. 제29항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 프라이머인, 단리된 이중 가닥 핵산 이중체.
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