JP6641397B2 - 核酸酵素基質 - Google Patents
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Description
本出願は、2011年9月9日出願の豪州仮特許出願第2011903686号(その全内容が相互参照により本明細書に組み込まれる)に基づく優先権を主張する。
(式中、
rRは、プリンリボヌクレオチドであり、
rYは、ピリミジンリボヌクレオチドであり、
N1〜N15のそれぞれは、ヌクレオチドであり、
N5〜N13のうち6個以上は、シトシンヌクレオチドであり、かつ
N9〜N15のうち3個未満は、グアニンヌクレオチドがある)
を含む。
(i)多成分核酸酵素(MNAザイム)、ここで、前記部分は、前記MNAザイムの少なくとも1つの基質アームに結合する、または
(ii)DNAザイム
である。
(a)2つ以上のオリゴヌクレオチドパートザイムを提供することと、ただし、少なくとも第1のオリゴヌクレオチドパートザイムおよび第2のオリゴヌクレオチドパートザイムは、前記標的の存在下で自己集合して少なくとも第1の触媒活性多成分核酸酵素(MNAザイム)を形成する、
(b)第1または第2の態様の単離されたポリヌクレオチド基質を提供することと、ただし、前記ポリヌクレオチド基質は、前記第1のMNAザイムによる修飾が可能であり、前記MNAザイムによる前記ポリヌクレオチド基質の修飾は、検出可能作用を提供する、
(c)(1)前記少なくとも第1のMNAザイムの自己集合と、
(2)前記少なくとも第1のMNAザイムの触媒活性と、
を可能にする条件下で、前記2つ以上のオリゴヌクレオチドパートザイムと前記標的を推定上含有するサンプルとを接触させることと、
(d)前記検出可能作用を検出することと、
を含む、少なくとも1つの標的の存在を検出する方法を提供する。
(a)異なる標的の存在下で自己集合して第2の触媒活性MNAザイムを形成可能な2つ以上の追加のオリゴヌクレオチドパートザイムと、
(b)少なくとも1つの追加のポリヌクレオチド基質と、
を提供することをさらに含む。ただし、前記追加のポリヌクレオチド基質は、前記異なる標的の存在下で前記第2のMNAザイムによる修飾が可能である。
前記MNAザイムは、少なくとも2つ以上のオリゴヌクレオチドパートザイムを含み、少なくとも第1のオリゴヌクレオチドパートザイムおよび第2のオリゴヌクレオチドパートザイムは、MNAザイム集合促進剤の存在下で自己集合して触媒活性多成分核酸酵素(MNAザイム)を形成し、前記少なくとも第1および前記第2のオリゴヌクレオチドパートザイムのそれぞれは、基質アーム部分と、触媒コア部分と、センサーアーム部分と、を含み、
自己集合すると、前記第1および第2のオリゴヌクレオチドパートザイムのセンサーアーム部分は、MNAザイムのセンサーアームとして作用し、第1および第2のオリゴヌクレオチドパートザイムの基質アーム部分は、MNAザイムの基質アームとして作用し、第1および第2のオリゴヌクレオチドパートザイムの触媒コア部分は、MNAザイムの触媒コアとして作用し、
MNAザイムのセンサーアームは、第1および第2のオリゴヌクレオチドパートザイムを近接して維持してそれらのそれぞれの触媒コア部分の会合によりMNAザイムの触媒コアを形成するように、前記MNAザイム集合促進剤と相互作用し、前記触媒コアは、前記ポリヌクレオチド基質の修飾が可能であり、前記MNAザイムの前記基質アームは、前記MNAザイムの前記触媒コアが前記ポリヌクレオチド基質を修飾できるように、前記ポリヌクレオチド基質に結合する。
本明細書では、以下に示される意味を有するものとする特定の用語が用いられる。
レポーター基質は、溶解状態で遊離しうるか、またはたとえば、表面もしくは他の分子に結合(または「テザー連結」)されうる。レポーター基質は、たとえば、フルオロフォア(クエンチャーなどの1つ以上の追加成分を含むかまたは含まない)、放射性標識、ビオチン(たとえばビオチン化)、または化学発光標識を含めて、多種多様な手段のいずれかにより標識可能である。
ここではおよび本明細書全体を通じて、以下の略号が用いられる。
MNAザイム:多成分核酸酵素またはマルチパータイト核酸酵素、
DNAザイム:デオキシリボ核酸酵素、
リボザイム:リボ核酸酵素、
パートザイム:オリゴヌクレオチドを含有する部分酵素、
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応、
qPCR:リアルタイム定量PCR、
NF−H2O:ヌクレアーゼフリー水、
LNA:ロックド核酸、
F:フルオロフォア、
Q:クエンチャー、
N=A、C、T/U、G、またはそれらの任意のアナログ、
N’=Nに相補的なまたはNに塩基対合可能な任意のヌクレオチド、
(N)x:任意の数のN、
(N’)x:任意の数のN’、
W:AまたはT、
R:A、G、またはAA、
rN:任意のリボヌクレオチド、
(rN)x:任意の数のrN、
rR:AまたはGのリボヌクレオチド、
rY:CまたはUのリボヌクレオチド、
M:AまたはC、
H:A、C、またはT/U、
D:G、A、またはT/U、
JOEまたは6−JOE:6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシフルオレセイン、
FAMまたは6−FAM:6−カルボキシフルオレセイン、
BHQ1:Black Hole Quencher(登録商標)1
BHQ2:Black Hole Quencher(登録商標)2
IB:Iowa Black(登録商標)FQ
IBR:Iowa Black(登録商標)RQ
shRNA:低分子ヘアピンRNA
siRNA:低分子干渉RNA
mRNA:メッセンジャーRNA
tRNA:トランスファーRNA
snoRNA:低分子核小体RNA
stRNA:低分子一時的RNA
smRNA:低分子変調RNA
プレマイクロRNA:前駆体microRNA
プリマイクロRNA:初期マイクロRNA
UV:紫外
最初に、本明細書に提供される図面および実施例は、本発明およびその種々の実施形態を限定するものではなく例示するものであることを理解すべきである。
本発明は、触媒核酸酵素に対するポリヌクレオチド基質を提供する。本発明はまた、同一のまたは識別可能な標的特異性を有するさまざまな核酸(たとえばMNAザイム)による触媒修飾の能力が増大されたメンバーを含む基質ファミリーを提供する。
本発明に係るポリヌクレオチド基質は、基質を認識/修飾する触媒核酸を利用する任意の数の潜在用途に使用されうる。
開始MNAザイム(Mt)は、本発明に係る(第1の)ポリヌクレオチド基質(S1)を切断して、第1の集合促進剤成分(S1f)を形成し、これは、第1のカスケードMNAザイム(カスケードMNAザイムMc1)の形成を誘導する。この例では、第1のカスケードMNAザイム(Mc1)は、2つのパートザイムと、F1、F2、およびS1fと称される3つの集合促進剤成分と、を含む。Mc1は、追加の基質(S2)を切断可能であるので、追加の集合促進剤成分(S2f)を遊離し、これは、第2のカスケードMNAザイム(カスケードMNAザイムMc2)の形成を誘導する。この例では、第2のカスケードMNAザイム(Mc2)は、2つのパートザイムと、F3、F4、およびS2fと称される3つの集合促進剤成分と、を含む。次いで、Mc2は、第1の基質(S1)をさらに切断可能であるので、第1の集合促進剤成分(S1f)がさらに形成される。これは、さらなる第1のカスケードMNAザイム(Mc1)の形成をもたらすことにより、増幅カスケードを形成する。活性MNAザイム集合を促進するために3つの集合促進剤成分が必要とされることが図4に示されていることは、当業者であればわかるであろう。多かれ少なかれ、類似のスキーマで集合促進剤成分を利用可能である。
特定の実施形態では、検出可能作用は、蛍光シグナルである。
また、本発明に係る1つ以上のポリヌクレオチド基質を含むキットも、本明細書に提供される。
MNAザイムqPCRとして参照されるPCRなどのvitro標的増幅方法を用いてリアルタイムで標的核酸の増幅をモニターするために、MNAザイムを使用することが可能である。さらに、フルオロフォアとクエンチャーとの対で標識されたMNAザイム基質を用いたqPCR中のリアルタイムモニタリングでは、反応の対数期にわたり任意のレベルの蛍光の閾値ラインを配置して、Ct(サイクル閾値)として知られうる値を生成可能な曲線が作成される。より低いCt値を生じる反応は、そのような反応がより速く閾値サイクルに達するので、特異的基質のより効率的な切断の指標となる。この実施例では、増幅および検出は、PCR増幅およびMNAザイム媒介検出が単一のチューブ内で同時に行われる一工程プロセスで実施される。発生されたCt値により測定される、閾値蛍光に達するのに要する時間量は、ユニバーサル基質の配列による影響を受けることもある。
すでに公知のユニバーサル基質(表4)および新規なユニバーサル基質(表5)の切断効率をリアルタイムで測定すべく行った実験では、パートザイムオリゴヌクレオチドAおよびBはすべて、ヒトRPLPO遺伝子の同一の配列に相補的なセンサーアームを用いて設計した。AおよびBのパートザイムの配列は、以下では5’→3’方向に列挙されている。下線付き塩基は、それらのマッチ基質にハイブリダイズする。「−P」は、オリゴヌクレオチドの3’リン酸化を表す。
配列番号1 パートザイムA RPLPOA/2−P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGGAAACCTT
配列番号2 パートザイムB RPLPOB/2−P::
TGCCCAGGGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
配列番号3 パートザイムA RPLPOA/3−P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGGTTGTGCTG
配列番号4 パートザイムB RPLPOB/3−P::
CGGTTGGTGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
配列番号5 パートザイムA RPLPOA/6−P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGGCGTGAT
配列番号6 パートザイムB RPLPOB/6−P::
CTGGGAGGAAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
配列番号7 パートザイムA RPLPOA/7−P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGTGCCATGTTAA
配列番号8 パートザイムB RPLPOB/7−P::
TATCACAGCCAAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
配列番号9 パートザイムA RPLPOA/44−P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGGAGACCTG
配列番号10 パートザイムB RPLPOB/44−P::
TCACTATAGGGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
配列番号11 パートザイムA RPLPOA/45−P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGGGACCCGT
配列番号12 パートザイムB RPLPOB/45−P::
TTCCAAAGGAGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
配列番号13 パートザイムA RPLPOA/46−P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAAGGTGCGGT
配列番号14 パートザイムB RPLPOB/46−P::
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
配列番号15 パートザイムA RPLPOA/49−P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGCCAAGTTTA
配列番号16 パートザイムA RPLPOA/55−P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGGTGCGGT
配列番号17 パートザイムA RPLPOA/60−P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGTGGTTGGC
配列番号18 パートザイムB RPLPOB/60−P::
GTCGTGTTGGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
この実施例で試験したレポーター基質は、以下では5’→3’方向の配列で示されている。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。本実施例では、Sub60以外の基質は、5’末端を6−FAM部分で、3’末端をクエンチャー部分で、末端標識した。クエンチャー分子は、Black Hole Quencher1(以下の基質名では「B」により表される)またはIowa Black(登録商標)FQ(以下の基質名では「IB」により表される)のいずれかであった。Sub60は、5’末端をクエンチャー部分で、3’末端をFAM部分で、末端標識した(FAM蛍光をクエンチすることが知られている「G」である5’末端塩基に基づく)。基質の切断は、450〜490nmの励起(CFX96(BioRad)に基づくFAM励起波長領域)を用いて510〜530nm(CFX96(BioRad)に基づくFAM発光波長範囲)でモニターした。
配列番号21 Sub2−FIB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
配列番号22 Sub3−FB:
CAGCACAACCguCACCAACCG
配列番号23 Sub6−FIB:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
配列番号24 Sub7−FB:
TTAACATGGCACguTGGCTGTGATA
配列番号25 Sub44−FIB:
CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGA
配列番号26 Sub45−FIB:
ACGGGTCCCguCTCCTTTGGAA
配列番号27 Sub46−FIB:
ACCGCACCTguCCCCAGCTC
配列番号28 Sub49−FB:
TAAACTTGGCTCguTGGCTGTGATA
配列番号29 Sub55−FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
配列番号30 Sub60−IBF:
GCCAACCACguCCAACACGAC
この実施例のための標的PCRアンプリコンは、以下に列挙したオリゴヌクレオチドPCRプライマーを用いて、ヒトゲノムDNAのin vitro PCR増幅により、産生した。プライマー配列は、5’→3’方向に書かれている。
配列番号31 フォワードプライマー 5RPLPO:
CCCATTCTATCATCAACGGGTA
配列番号32 リバースプライマー 3RPLPO:
GCCCACTGTGGTCCTGGTG
この実施例のための標的配列は、K562細胞から抽出したヒトゲノムDNAのin vitro PCR増幅により産生したRPLPO遺伝子のPCRアンプリコンであった。
標的配列のリアルタイムPCR増幅および検出は、25μLの全反応空間内で行った。反応はすべて、CFX96 Real−Time PCR Detection System(Bio−Rad)で行った。サイクルパラメーターは、95℃で10分間、95℃で15秒間と60℃で30秒間とを10サイクル(後者の温度に対しては1サイクルあたり−1℃)、95℃で15秒間と52℃で60秒間とを40サイクル(52℃の工程でデータを収集した)であった。表6のように、基質およびその関連パートザイムを用いて反応を構成した。反応条件の各セットは、二重試験方式で行われ、80nMの5RPLPOおよび400nMの3RPLPO、各200nMのパートザイムAおよびパートザイムB、200nMの基質、8mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位のRiboSafe RNアーゼ阻害剤(Bioline)、1×Immobuffer(Bioline)、2単位のImmolase(Bioline)、およびゲノムDNA鋳型(50ng)または無DNA標的(ヌクレアーゼフリーH2O(NF−H2O))のいずれかを含有していた。個別の反応を構成して、そのマッチパートザイムにより各基質を試験した。同一のPCRプライマーをすべての反応に使用した。また、パートザイムはすべて、同一の標的感知部分を有していた。したがって、反応効率に差があれば、基質の切断効率の差に帰属しうるであろう。
ヒトゲノムDNAを含有するそれぞれ異なる基質の各MNAザイムqPCR反応では、ヒトゲノムDNAからのRPLPOのリアルタイム検出で経時的に蛍光の増加を示した。すべての基質で、無DNA標的対照の蛍光は、DNA標的含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性MNAザイムの標的依存集合の後でユニバーサル基質の1つが切断されたことに起因することが実証される。
PCRなどのvitro標的増幅方法を用いてリアルタイムで標的核酸の増幅をモニターするために、MNAザイムを使用することが可能である。さらに、フルオロフォアとクエンチャーとの対で標識されたMNAザイム基質を用いたqPCR中のリアルタイムモニタリングでは、反応の対数期にわたり任意のレベルの蛍光の閾値ラインを配置して、Ct(サイクル閾値)として知られうる値を生成可能な曲線が作成される。より低いCt値を生じる反応は、そのような反応がより速く閾値サイクルに達するので、特異的基質のより効率的な切断の指標となる。この実施例では、増幅および検出は、PCR増幅およびMNAザイム媒介検出が単一のチューブ内で同時に行われる一工程プロセスで実施される。他の反応条件がすべての同一である場合、Ct値は、ユニバーサル基質の配列による影響を受けることもある。当技術分野で使用されるMNAザイムqPCRのアニーリング/検出温度は、50〜54℃である。この温度は、当技術分野で公知のユニバーサル基質が、効率的に切断される温度に課される限定条件を有し、シリーズ1のユニバーサル基質では54℃が上限であるという事実により決定された。より高い温度でアニールするプライマーおよびパートザイムを設計するうえでより大きい柔軟が可能になるように、より高い温度で切断されるユニバーサル基質の必要性が存在する。プライマーおよびパートザイムに対するこの設計柔軟性は、特異的検出のためにより高い反応温度ひいてはより高いTmを有するパートザイムおよびプライマーを必要とする、配列中に高パーセントのG塩基およびC塩基を有する対象の遺伝子標的など、多くの用途にきわめて有益でありうる。
シリーズ1、2、および3のユニバーサル基質の切断効率をリアルタイムで測定すべく行った実験では、パートザイムオリゴヌクレオチドAおよびBはすべて、ヒトTFRC遺伝子の同一の配列に相補的なセンサーアームを用いて設計した。AおよびBのパートザイムの配列は、以下では5’→3’方向に列挙されている。下線付き塩基は、それらのマッチユニバーサル基質にハイブリダイズする。「−P」は、オリゴヌクレオチドの3’リン酸化を表す。
配列番号34 パートザイムA TFRCA/2−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAAACCTT
配列番号35 パートザイムB TFRCB/2−P:
TGCCCAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号36 パートザイムA TFRCA/3−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGTTGTGCTG
配列番号37 パートザイムB TFRCB/3−P:
CGGTTGGTGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号38 パートザイムA TFRCA/6−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGCGTGAT
配列番号39 パートザイムB TFRCB/6−P:
CTGGGAGGAAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号40 パートザイムA TFRCA/44−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAGACCTG
配列番号41 パートザイムB TFRCB/44−P:
TCACTATAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号42 パートザイムA TFRCA/45−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGACCCGT
配列番号43 パートザイムB TFRCB/45−P:
TTCCAAAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号44 パートザイムA TFRCA/46−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAAGGTGCGGT
配列番号45 パートザイムB TFRCB/46−P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号46 パートザイムA TFRCA/55−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGT
配列番号48 パートザイムA TFRCA/60−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGTGGTTGGC
配列番号49 パートザイムB TFRCB/60−P:
GTCGTGTTGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号50 パートザイムA TFRCA/61−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGTCGAG
配列番号51 パートザイムB TFRCB/61−P:
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号52 パートザイムA TFRCA/65−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTCGAGA
配列番号55 パートザイムB TFRCB/72−P:
CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号56 パートザイムA TFRCA/73−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGACGCCA
配列番号57 パートザイムB TFRCB/73−P:
CACGAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号58 パートザイムA TFRCA/74−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGTGAT
配列番号59 パートザイムB TFRCB/74−P:
CTGGGAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号60 パートザイムA TFRCA/75−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAGGGTCA
配列番号61 パートザイムB TFRCB/75−P:
TAGTGGGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号62 パートザイムA TFRCA/77−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGAGGAG
配列番号63 パートザイムB TFRCB/77−P:
AGGAGGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号64 パートザイムA TFRCA/79−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGAGGA
配列番号65 パートザイムB TFRCB/79−P:
GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号66 パートザイムA TFRCA/80−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGCGGTT
配列番号67 パートザイムB TFRCB/80−P:
GGTTCACGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号68 パートザイムB TFRCB/82−P:
TGGACGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号69 パートザイムA TFRCA/83−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGCGGA
配列番号70 パートザイムB TFRCB/83−P:
GTTGCAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号71 パートザイムA TFRCA/90−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGTCGAG
この実施例のレポーター基質は、以下では5’→3’方向の配列で示されている。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。本実施例では、基質は、5’末端を6−FAM部分(以下の基質名では「F」により表される)で、3’末端をIowa Black(登録商標)FQクエンチャー部分(以下の基質名で「IB」により表される)で、末端標識した。Sub60の配列は、5’末端に「T」を含むように修飾することにより、6−FAMで5’末端標識できるようにした。パートザイムAの基質結合配列には変更を加えなかったので、切断効率は、5’末端に追加の「T」が欠如している実施例1のSub60配列と同等である。基質の切断は、450〜490nmの励起(CFX96(BioRad)に基づくFAM励起波長領域)を用いて510〜530nm(CFX96(BioRad)に基づくFAM発光波長範囲)でモニターした。
配列番号21 Sub2−FIB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
配列番号22 Sub3−FIB:
CAGCACAACCguCACCAACCG
配列番号23 Sub6−FIB:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
配列番号25 Sub44−FIB:
CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGA
配列番号26 Sub45−FIB:
ACGGGTCCCguCTCCTTTGGAA
配列番号27 Sub46−FIB:
ACCGCACCTguCCCCAGCTC
配列番号29 Sub55−FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
配列番号72 Sub60T−FIB:
TGCCAACCACguCCAACACGAC
配列番号73 Sub61−FIB:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
配列番号74 Sub65−FIB:
TCTCGACCTCguCTCCACGCCA
配列番号75 Sub72−FIB:
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
配列番号76 Sub73−FIB:
TGGCGTCCCCguCCCCTCGTG
配列番号77 Sub74−FIB:
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
配列番号78 Sub75−FIB:
TGACCCTCCTCguCTCCCCACTA
配列番号79 Sub77−FIB:
CTCCTCCCTCguCCCTCCTCCT
配列番号80 Sub79−FIB:
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
配列番号81 Sub80−FIB:
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
配列番号82 Sub82−FIB:
CTCCTCCCTCguCCCTCGTCCA
配列番号83 Sub83−FIB:
TCCGCTCCCCguCCCCTGCAAC
配列番号84 Sub84−FIB:
ACCGCACCTCguCTCCTCCCAG
配列番号85 Sub85−FIB:
ACCGCACCTCguCCCCTCCCAG
配列番号86 Sub86−FIB:
ATCACGCCTCguCCCCAGCTC
配列番号87 Sub87−FIB:
ATCACTCCCCguCCCCAGCTC
配列番号88 Sub88−FIB:
CTCCTCCCTCguCCCCAGCTC
配列番号89 Sub89−FIB:
ACCGCACCTCguCCCTCCTCCT
配列番号90 Sub90−FIB:
CTCGACCCTCguCCCTCGTCCA
この実施例の標的配列は、以下に列挙したオリゴヌクレオチドPCRプライマーを用いて、IM9細胞系から抽出されたヒトゲノムDNA(Promega)のin vitro増幅により産生された、TFRC遺伝子のPCRアンプリコンであった。プライマー配列中のボールド体の配列は、遺伝子標的に対するプライマーの特異性に影響を及ぼすことのなくプライマーのTmを増大させるユニバーサルタグ(U1またはU2)に対応する。このタグは、PCR反応の増幅効率を改善する。プライマー配列は、5’→3’方向に列挙されている。
配列番号91 フォワードプライマー 5TFRC_U1:
GCTAAAACAATAACTCAGAACTTACG
配列番号92 リバースプライマー 3TFRC_U2:
CAGCTTTCTGAGGTTACCATCCTA
標的配列のリアルタイムPCR増幅および検出は、25μLの全反応空間内で行った。反応はすべて、CFX96 Real−Time PCR Detection System(Bio−Rad)で行った。表8のように、基質およびその関連パートザイムを用いて反応を構成した。サイクルパラメーターは、95℃で2分間、95℃で15秒間と58℃で60秒間とを50サイクル(58℃の工程でデータを収集した)。反応条件の各セットは、二重試験方式で行われ、40nMの5TFRC_U1、200nMの3TFRC_U2、各200nMのパートザイムAおよびパートザイムB、200nMの基質、8mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位のRiboSafe RNアーゼ阻害剤(Bioline)、1×Immobuffer(Bioline)、2単位のMyTaqHS(商標)DNAポリメラーゼ(Bioline)、およびゲノムDNA鋳型(50ng)または無標的(NF−H2O)のいずれかを含有していた。
ヒトゲノムDNAを含有する各MNAザイムqPCR反応では、ヒトゲノムDNAからのTFRCのリアルタイム検出で経時的に蛍光の増加を示した。すべての反応で、無DNA標的対照の蛍光は、DNA標的含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性MNAザイムの標的依存集合の後でユニバーサルレポーター基質の1つが切断されたことに起因することが実証される。
シリーズ1および2の基質の性能に基づく基質の切断効率についての研究は、第3ラウンドのシリーズ3の基質設計を支援するガイドラインの開発につながる。これらのガイドラインは、限定されるものではないが、(i)リボヌクレオチドを取り囲む10個の塩基(N4〜N13)中に7個以上のシトシンヌクレオチド、(ii)リボヌクレオチドに直接隣接した塩基(N8およびN9)がシトシンである、(iii)基質の全含有率が>64%ピリミジンを有する、および(iv)オリゴヌクレオチドの全Tmが66℃以上である(後者のガイドラインは、基質切断の反応温度が50℃超である場合のみ適用可能である)を含んでいた。
直接標的検出を用いてシリーズ1、2、および3のユニバーサル基質の切断効率を測定すべく行った実験では、パートザイムオリゴヌクレオチドAおよびBはすべて、ヒトTFRC遺伝子の同一の配列に相補的なセンサーアームを用いて設計した。AおよびBのパートザイムの配列は、以下では5’→3’方向に列挙されている。下線付き塩基は、基質にハイブリダイズする。「−P」は、オリゴヌクレオチドの3’リン酸化を表す。
配列番号34 パートザイムA TFRCA/2−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAAACCTT
配列番号35 パートザイムB TFRCB/2−P:
TGCCCAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号36 パートザイムA TFRCA/3−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGTTGTGCTG
配列番号37 パートザイムB TFRCB/3−P:
CGGTTGGTGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号38 パートザイムA TFRCA/6−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGCGTGAT
配列番号39 パートザイムB TFRCB/6−P:
CTGGGAGGAAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号40 パートザイムA TFRCA/44−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAGACCTG
配列番号41 パートザイムB TFRCB/44−P:
TCACTATAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号42 パートザイムA TFRCA/45−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGACCCGT
配列番号43 パートザイムB TFRCB/45−P:
TTCCAAAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号44 パートザイムA TFRCA/46−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAAGGTGCGGT
配列番号45 パートザイムB TFRCB/46−P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号93 パートザイムA TFRCA/49−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGCCAAGTTTA
配列番号94 パートザイムB TFRCB/49−P:
TATCACAGCCAAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号46 パートザイムA TFRCA/55−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGT
配列番号48 パートザイムA TFRCA/60−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGTGGTTGGC
配列番号49 パートザイムB TFRCB/60−P:
GTCGTGTTGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号50 パートザイムA TFRCA/61−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGTCGAG
配列番号51 パートザイムB TFRCB/61−P:
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号52 パートザイムA TFRCA/65−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTCGAGA
配列番号55 パートザイムB TFRCB/72−P:
CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号56 パートザイムA TFRCA/73−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGACGCCA
配列番号57 パートザイムB TFRCB/73−P:
CACGAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号58 パートザイムA TFRCA/74−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGTGAT
配列番号59 パートザイムB TFRCB/74−P:
CTGGGAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号60 パートザイムA TFRCA/75−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAGGGTCA
配列番号61 パートザイムB TFRCB/75−P:
TAGTGGGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号62 パートザイムA TFRCA/77−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGAGGAG
配列番号63 パートザイムB TFRCB/77−P:
AGGAGGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号64 パートザイムA TFRCA/79−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGAGGA
配列番号65 パートザイムB TFRCB/79−P:
GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号66 パートザイムA TFRCA/80−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGCGGTT
配列番号67 パートザイムB TFRCB/80−P:
GGTTCACGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号68 パートザイムB TFRCB/82−P:
TGGACGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号69 パートザイムA TFRCA/83−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGCGGA
配列番号70 パートザイムB TFRCB/83−P:
GTTGCAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号71 パートザイムA TFRCA/90−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGTCGAG
この実施例のレポーター基質は、以下では5’→3’方向の配列で示されている。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。本実施例では、基質は、5’末端を6−FAM部分(以下の基質名では「F」により表される)で、3’末端をIowa Black(登録商標)FQクエンチャー部分(以下の基質名で「IB」により表される)で、末端標識した。基質の切断は、450〜490nmの励起(CFX96(BioRad)に基づくFAM励起波長領域)を用いて510〜530nm(CFX96(BioRad)に基づくFAM発光波長範囲)でモニターした。
配列番号21 Sub2−FIB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
配列番号22 Sub3−FIB:
CAGCACAACCguCACCAACCG
配列番号23 Sub6−FIB:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
配列番号25 Sub44−FIB:
CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGA
配列番号26 Sub45−FIB:
ACGGGTCCCguCTCCTTTGGAA
配列番号27 Sub46−FIB:
ACCGCACCTguCCCCAGCTC
配列番号28 Sub49−FB:
TAAACTTGGCTCguTGGCTGTGATA
配列番号29 Sub55−FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
配列番号72 Sub60T−FIB:
TGCCAACCACguCCAACACGAC
配列番号73 Sub61−FIB:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
配列番号74 Sub65−FIB:
TCTCGACCTCguCTCCACGCCA
配列番号75 Sub72−FIB:
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
配列番号76 Sub73−FIB:
TGGCGTCCCCguCCCCTCGTG
配列番号77 Sub74−FIB:
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
配列番号78 Sub75−FIB:
TGACCCTCCTCguCTCCCCACTA
配列番号79 Sub77−FIB:
CTCCTCCCTCguCCCTCCTCCT
配列番号80 Sub79−FIB:
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
配列番号81 Sub80−FIB:
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
配列番号82 Sub82−FIB:
CTCCTCCCTCguCCCTCGTCCA
配列番号83 Sub83−FIB:
TCCGCTCCCCguCCCCTGCAAC
配列番号84 Sub84−FIB:
ACCGCACCTCguCTCCTCCCAG
配列番号85 Sub85−FIB:
ACCGCACCTCguCCCCTCCCAG
配列番号86 Sub86−FIB:
ATCACGCCTCguCCCCAGCTC
配列番号87 Sub87−FIB:
ATCACTCCCCguCCCCAGCTC
配列番号88 Sub88−FIB:
CTCCTCCCTCguCCCCAGCTC
配列番号89 Sub89−FIB:
ACCGCACCTCguCCCTCCTCCT
配列番号90 Sub90−FIB:
CTCGACCCTCguCCCTCGTCCA
この実施例の標的配列は、以下の5’→3’方向の配列を有する合成オリゴヌクレオチドAF−TFRCであった。この標的配列は、TFRC遺伝子のセクションと同一の配列を有する。
配列番号95 集合促進剤 AF−TFRC:
AGTCTGTTTTCCAGTCAGAGGGACAGTCTCCTTCCATATTCC
触媒活性MNAザイムによるレポーター基質の切断により引き起こされる蛍光シグナルの増加により、標的配列の検出を測定した。すべての反応の全体積は、25μLであり、すべての反応をCFX96(商標)Real−Time PCR Detection Systems(BioRad)で行い、パートザイムと基質との各組合せ(表10)を52℃、54℃、56℃、58℃、および60℃で試験した。各反応の蛍光は、最初の50サイクルでは1秒後に読み取るようにプログラムし、その後、その次の50サイクルでは25秒後に読み取るようにプログラムした。すべての反応は、1×PCR緩衝液II(Applied Biosystems)、10mMのMgCl2、0.2μMのパートザイムAおよびB、ならびに0.2μMの基質を含有していた(表10のように組み合わせて試験した)。各反応は、10nM標的配列(AF−TFRC)または無鋳型対照(NF−H2O)のいずれかを用いた「試験」として二重試験方式で行った。
各ユニバーサル基質を用いた各反応は、合成鋳型AF−TFRC(TFRC遺伝子の部分に対応する標的配列)を含有する反応で経時的に蛍光の増加を示した。すべての基質で、無鋳型対照の蛍光は、標的配列含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性MNAザイムの標的依存集合の後でユニバーサルレポーター基質が切断されたことに起因することが実証される。
PCRなどのvitro標的増幅方法を用いてリアルタイムで標的核酸の増幅をモニターするために、MNAザイムを使用することが可能である。さらに、フルオロフォアとクエンチャーとの対で標識されたMNAザイム基質を用いてqPCR時にリアルタイムモニターすることにより、Ct値およびスティープネス(反応速度)により反応効率を示唆しうる曲線が作成される。この実施例では、増幅および検出は、PCR増幅およびMNAザイム媒介検出が単一のチューブ内で同時に行われる一工程プロセスで実施される。52℃や58℃(データを収集する温度)などのさまざまなアニーリング温度でのシグナル生成速度(反応曲線のCtおよびスティープネスにより測定される)は、ユニバーサル基質の配列により影響を受けることもがある。
リアルタイムPCRでユニバーサル基質の切断効率を測定すべく行った実験では、ヒトCYP2C9、TP53、B2M、HMBS、RPL13a、またはTFRC遺伝子に相補的なセンサーアームを用いて、パートザイムオリゴヌクレオチドAおよびBを設計した。AおよびBのパートザイムの配列は、以下では5’→3’方向に列挙されている。下線付き塩基は、基質にハイブリダイズする。「−P」は、オリゴヌクレオチドの3’リン酸化を表す。
配列番号96 パートザイムA CYP2C9A/3−P:
GGGAAGAGGAGCATTGAGGAACAACGAGGTTGTGCTG
配列番号97 パートザイムB CYP2C9B/3−P:
CGGTTGGTGAGGCTAGCTCCGTGTTCAAGAGGAAGC
配列番号98 パートザイムA CYP2C9A/61−P:
GGGAAGAGGAGCATTGAGGAACAACGAGGGGTCGAG
配列番号99 パートザイムB CYP2C9B/61−P:
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCCGTGTTCAAGAGGAAGC
配列番号100 パートザイムA TP53A/6−P:
GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGAGGCGTGAT
配列番号101 パートザイムB TP53B/6−P:
CTGGGAGGAAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG
配列番号103 パートザイムB TP53B/72−P:
CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG
配列番号104 パートザイムA TP53A/74−P:
GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGGGGAGTGAT
配列番号105 パートザイムB TP53B/74−P:
CTGGGAGGGGAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG
配列番号106 パートザイムA TP53A/79−P:
GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGGGGAGAGGA
配列番号107 パートザイムB TP53B/79−P:
GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG
配列番号108 パートザイムA B2MA/60−P:
ATTCAGGTTTACTCACGTCATCACAACGAGTGGTTGGC
配列番号109 パートザイムB B2MB/60−P:
GTCGTGTTGGAGGCTAGCTCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAA
配列番号110 パートザイムA B2MA/61−P
ATTCAGGTTTACTCACGTCATCACAACGAGGGGTCGAG
配列番号111 パートザイムB B2MB/61−P
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAA
配列番号112 パートザイムA B2MA/79−P
ATTCAGGTTTACTCACGTCATCACAACGAGGGGAGAGGA
配列番号113 パートザイムB B2MB/79−P
GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAA
配列番号114 パートザイムA HMBSA/49−P:
GCCATGTCTGGTAACGGCAAACAACGAGAGCCAAGTTTA
配列番号115 パートザイムB HMBSB/49−P:
TATCACAGCCAAGGCTAGCTTGCGGCTGCAACGGCGGTG
配列番号116 パートザイムA HMBSA/75−P:
GCCATGTCTGGTAACGGCAAACAACGAGAGGAGGGTCA
配列番号117 パートザイムB HMBSB/75−P:
TAGTGGGGAGAGGCTAGCTTGCGGCTGCAACGGCGGTG
配列番号34 パートザイムA TFRCA/2−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAAACCTT
配列番号35 パートザイムB TFRCB/2−P:
TGCCCAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号38 パートザイムA TFRCA/72−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGCGTGAT
配列番号55 パートザイムB TFRCB/72−P:
CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号66 パートザイムA TFRCA/80−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGCGGTT
配列番号67 パートザイムB TFRCB/80−P:
GGTTCACGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号118 パートザイムA RPL13aA/55−P
TTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGTGCGGT
配列番号119 パートザイムB RPL13aB/55−P
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
配列番号120 パートザイムA RPL13aA/80−P
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGGCGGTT
配列番号121 パートザイムB RPL13aB/80−P
GGTTCACGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
配列番号122 パートザイムA RPL13aA/88−P
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGGAGGAG
本実施例では、基質は、5’末端をフルオロフォアで標識し、3’末端をクエンチャー部分で標識した。表12は、基質−フルオロフォア/クエンチャーの組合せを示している。いくつかの基質は、1つ超の特定のフルオロフォア/クエンチャーの組合せで試験した。種々の発光波長および励起波長で基質の切断をモニターした(表12)。
配列番号21 Sub2:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
配列番号22 Sub3:
CAGCACAACCguCACCAACCG
配列番号23 Sub6:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
配列番号28 Sub49:
TAAACTTGGCTCguTGGCTGTGATA
配列番号29 Sub55:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
配列番号30 Sub60:
GCCAACCACguCCAACACGAC
配列番号73 Sub61:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
配列番号75 Sub72:
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
配列番号77 Sub74:
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
配列番号78 Sub75:
TGACCCTCCTCguCTCCCCACTA
配列番号80 Sub79:
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
配列番号81 Sub80:
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
配列番号88 Sub88:
CTCCTCCCTCguCCCCAGCTC
IM9細胞系から抽出したヒトゲノムDNA(Promega)を標的遺伝子のin vitro増幅用の鋳型として使用した。以下に列挙したオリゴヌクレオチドPCRプライマーを用いてqPCRによりアンプリコンを産生した。プライマー配列は、5’→3’方向に列挙されている。プライマー配列中のボールド体の配列は、遺伝子標的に対するプライマーの特異性に影響を及ぼすことのなくプライマーのTmを増大させるユニバーサルタグ(U1、U2、またはU3)に対応する。このタグは、PCR反応の増幅効率を改善する。
配列番号91 フォワードプライマー 5TFRC_U1
GCTAAAACAATAACTCAGAACTTACG
配列番号92 リバースプライマー 3TFRC_U2
CAGCTTTCTGAGGTTACCATCCTA
配列番号123 フォワードプライマー 5B2M_U1
GCTAATCTTTTCCCGATATTCCTCAG
配列番号124 リバースプライマー 3B2M_U2
CAGCCCAGACACATAGCAATTCAG
配列番号125 フォワードプライマー 5TP53_U3
CTAACTTACTGCCTCTTGCTTCTC
配列番号126 リバースプライマー 3TP53_U2
CAGCTCTGTGCGCCGGTCTCTC
配列番号127 フォワードプライマー 5RPL13a_U3
CTAAACCGGAAGAAGAAACAGCTCA
配列番号128 リバースプライマー 3RPL13a_U2
CAGGAGGAATTAACAGTCTTTATTGG
配列番号129 フォワードプライマー 5CYP2C9_U3
CTAACCTCATGACGCTGCGGAA
配列番号130 リバースプライマー 3CYP2C9_U2
CAGATATGGAGTAGGGTCACCCA
配列番号131 フォワードプライマー 5HMBS_U3
CTAAACCCACACACAGCCTACTTTC
配列番号132 リバースプライマー 3HMBS_U2
CAGAGCCCAAAGTGTGCTGGTCA
標的配列のリアルタイムPCR増幅および検出は、25μLの全反応空間内で行った。反応はすべて、CFX96 Real−Time PCR Detection System(Bio−Rad)で行った。表13のように、基質およびその関連パートザイムを用いて反応を構成した。サイクルパラメーターは、
1)95℃で2分間、95℃で15秒間と52℃で60秒間とを50サイクル(52℃の工程でデータを収集した)、または
2)95℃で2分間、95℃で15秒間と58℃で60秒間とを50サイクル(58℃の工程でデータを収集した)
のいずれかであった。
ヒトゲノムDNAを含有する各MNAザイムqPCR反応は、52℃および58℃の両方のアニーリング温度で、遺伝子CYP2C9、TP53、B2M、HMBS、RPL13a、およびTFRCのリアルタイム検出で、経時的な蛍光の増加を示した(図7)。すべてのユニバーサル基質で、無DNA標的対照の蛍光は、DNA標的含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性MNAザイムの標的依存集合の後でユニバーサルレポーター基質の1つが切断されたことに起因することが実証される。
10−23DNAザイムは、基質配列に直接結合してそれを修飾可能な単分子構造である。10−23DNAザイムは、in vitro診断用途に有用である。触媒領域の類似性に起因して、10−23DNAザイムは、10−23DNAザイムベースのMNAザイムにより切断可能な基質に結合してそれを切断することが可能である。MNAザイムと異なり、DNAザイムは、活性コアを形成するための標的配列を必要としないので、10−23DNAザイムによる基質の結合および後続の切断は、標的配列により影響されず、分離した触媒コアを利用しない。シリーズ1のユニバーサル基質(Sub2、Sub3、およびSub6)、シリーズ2のユニバーサル基質(Sub44、Sub45、Sub49、Sub55、およびSub60T)、およびシリーズ3の基質(Sub61、Sub72、Sub73、Sub74、Sub75、Sub77、Sub79、Sub80、Sub84、Sub85、Sub86、Sub87、Sub88、およびSub89)を切断するマッチ10−23DNAザイムの能力を測定することにより、本発明の設計ガイドラインが、温度範囲にわたり高活性を有してロバストに10−23DNAザイムにより切断可能な基質の開発をもたらすかを決定した。
以上に記載されたならびに表4および5に列挙された基質に相補的なセンサーアームを用いて、一連の10−23DNAザイムを設計した。DNAザイムの配列は、以下では5’→3’方向に列挙されており、下線付き塩基は、基質にハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、触媒コアを形成する。以下のいくつかのDNAザイム配列は、まさしく5’および3’末端に追加のGを含有する(たとえば、Dz55)。これらの追加された塩基は、基質にハイブリダイズせず、DNAザイムが基質を切断する効率に影響を及ぼさない。
配列番号133 DNAザイム Dz2
TGCCCAGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGAAACCTT
配列番号134 DNAザイム Dz3
CGGTTGGTGAGGCTAGCTACAACGAGGTTGTGCTG
配列番号135 DNAザイム Dz6
CTGGGAGGAAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTGAT
配列番号136 DNAザイム Dz44
TCACTATAGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGAGACCTG
配列番号137 DNAザイム Dz45
TTCCAAAGGAGAGGCTAGCTACAACGAGGGACCCGT
配列番号138 DNAザイム Dz49
TATCACAGCCAAGGCTAGCTACAACGAGAGCCAAGTTTA
配列番号139 DNAザイム Dz55
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
配列番号140 DNAザイム Dz60
GTCGTGTTGGAGGCTAGCTACAACGAGTGGTTGGC
配列番号141 DNAザイム Dz61
GTGGCGTGGAGAGGCTAGCTACAACGAGGGGTCGAGG
配列番号142 DNAザイム Dz72
GCTGGGAGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTGATG
配列番号143 DNAザイム Dz73
GCACGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGACGCCAG
配列番号144 DNAザイム Dz74
GCTGGGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGTGATG
配列番号145 DNAザイム Dz75
GTAGTGGGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGAGGGTCAG
配列番号146 DNAザイム Dz77
GAGGAGGAGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGGAGGAGG
配列番号147 DNAザイム Dz79
GGGTTGAAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGAGGAG
配列番号148 DNAザイム Dz80
GGGTTCACGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGGCGGTTGG
配列番号149 DNAザイム Dz84
GCTGGGAGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
配列番号150 DNAザイム Dz85
GCTGGGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
配列番号151 DNAザイム Dz86
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTGATG
配列番号152 DNAザイム Dz87
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGTGATG
配列番号153 DNAザイム Dz88
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGGAGGAGG
配列番号154 DNAザイム Dz89
GAGGAGGAGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
本実施例では、基質は、5’末端を6−FAM部分(以下の基質名では「F」により表される)で、3’末端をIowa Black(登録商標)FQクエンチャー部分(以下の基質名で「IB」により表される)で、末端標識した。基質の切断は、450〜490nmの励起(CFX96(BioRad)に基づくFAM励起波長領域)を用いて510〜530nm(CFX96(BioRad)に基づくFAM発光波長範囲)でモニターした。この実施例のレポーター基質は、以下では5’→3’方向の配列で示されている。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
配列番号21 Sub2−FIB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
配列番号22 Sub3−FIB:
CAGCACAACCguCACCAACCG
配列番号23 Sub6−FIB:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
配列番号25 Sub44−FIB:
CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGA
配列番号26 Sub45−FIB:
ACGGGTCCCguCTCCTTTGGAA
配列番号28 Sub49−FB:
TAAACTTGGCTCguTGGCTGTGATA
配列番号29 Sub55−FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
配列番号72 Sub60T−FIB:
TGCCAACCACguCCAACACGAC
配列番号73 Sub61−FIB:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
配列番号75 Sub72−FIB:
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
配列番号76 Sub73−FB:
TGGCGTCCCCguCCCCTCGTG
配列番号77 Sub74−FIB:
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
配列番号78 Sub75−FIB:
TGACCCTCCTCguCTCCCCACTA
配列番号79 Sub77−FB:
CTCCTCCCTCguCCCTCCTCCT
配列番号80 Sub79−FIB:
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
配列番号81 Sub80−FIB:
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
配列番号84 Sub84−FIB:
ACCGCACCTCguCTCCTCCCAG
配列番号85 Sub85−FIB:
ACCGCACCTCguCCCCTCCCAG
配列番号86 Sub86−FIB:
ATCACGCCTCguCCCCAGCTC
配列番号87 Sub87−FIB:
ATCACTCCCCguCCCCAGCTC
配列番号88 Sub88−FIB:
CTCCTCCCTCguCCCCAGCTC
配列番号89 Sub89−FIB:
ACCGCACCTCguCCCTCCTCCT
マッチDNAザイムによる結合および後続の切断により引き起こされる蛍光シグナルの増加により、基質の切断を測定した。マッチDNAザイムによる各基質の切断を測定すべく、個別の反応を構成した(表15のようなオリゴヌクレオチド)。反応は、25μLの全体積中に1×PCR緩衝液II(Applied Biosystems)、10mMのMgCl2、200nMの基質、およびNF−H2Oを含有するものであった。各反応は、「試験」(1nM DNAザイム添加)反応または「対照」(NF−H2O添加)反応のいずれかとして二重試験方式で行った。反応は、50、52、54、56、58、および60℃で、CFX96(商標)Real−Time PCR Detection System(BioRad)を用いて行った。各反応の蛍光は、最初の50サイクルでは1秒後に読み取るようにプログラムし、その後、その次の50サイクルでは25秒後に読み取るようにプログラムした。
マッチ基質と共にDNAザイムを含有する各試験反応は、経時的に蛍光の増加を示した。水のみの対照反応(DNAザイム無添加)の蛍光の増加はなかった。このことから、DNAザイム含有反応で生じた蛍光の増加は、DNAザイムによる結合および後続のレポーター基質の触媒切断によるものであることが実証される。
MNAザイムは、PCRのような、in vitro標的増幅方法を用いて、標的核酸の増幅をリアルタイムで観察するのに使われ得る。増幅と検出はPCR増幅およびMNAザイム媒介検出が単一のチューブ内で同時に行われる一工程プロセスで実施される。個々の標的に特異的な標的センサーアームを有するパートザイムを用いて、単一の反応槽内で複数の標的を増幅および検出することが可能である。第1の標的を検出するためのパートザイムは、第1の基質に結合してそれを切断し、第2の標的を検出するためのパートザイムは、第2の基質に結合してそれを切断するであろう。標的の検出を特異的なものとするために、反応ミックス中の任意の他の基質を切断するように設計されたパートザイムによる基質の非特異的切断を存在させることはできない。
非相補的パートザイムによる非特異的切断に関して試験すべく行った実験では、ヒトRPL13a遺伝子に相補的な標的センサーアームと以上で考察したユニバーサル基質のそれぞれに相補的な基質センサーアームとを有するパートザイムオリゴヌクレオチドAおよびBを設計した。AおよびBのパートザイムの配列は、以下では5’→3’方向に列挙されている。下線付き塩基は、基質にハイブリダイズする。「−P」は、オリゴヌクレオチドの3’リン酸化を表す。
配列番号155 パートザイムA RPL13aA/44−P:
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGAGACCTG
配列番号156 パートザイムB RPL13aB/44−P::
TCACTATAGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
配列番号118 パートザイムA RPL13aA/55−P
TTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGTGCGGT
配列番号119 パートザイムB RPL13aB/55−P
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
配列番号157 パートザイムA RPL13aA/72−P:
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGCGTGAT
配列番号158 パートザイムB RPL13aB/72−P::
CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
配列番号159 パートザイムA RPL13aA/74−P:
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGGGGAGTGAT
配列番号160 パートザイムB RPL13aB/74−P::
CTGGGAGGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
本実施例では、基質は、5’末端を6−FAM部分(以下の基質名では「F」により表される)で、3’末端をIowa Black(登録商標)FQクエンチャー部分(以下の基質名で「IB」により表される)で、末端標識した。485nm(FAM励起波長)の励起を用いて530nm(FAM発光波長)で基質の切断をモニターした。この実施例のレポーター基質は、以下では5’→3’方向の配列で示されている。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
配列番号25 Sub44−FB:
CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGA
配列番号29 Sub55−FB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
配列番号73 Sub61−FB:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
配列番号74 Sub65−FB:
TCTCGACCTCguCTCCACGCCA
配列番号75 Sub72−FB:
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
配列番号77 Sub74−FB:
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
この実施例の標的配列は、以下に列挙したオリゴヌクレオチドPCRプライマーを用いて、IM9細胞系から抽出されたヒトゲノムDNA(Promega)のin vitro PCR増幅により産生された、RPL13a遺伝子のPCRアンプリコンであった。この実施例のレポーター基質は、以下では5’→3’方向の配列で示されている。
配列番号161 フォワードプライマー 5RPL13a:
ACCGGAAGAAGAAACAGCTCA
配列番号162 リバースプライマー 3RPL13a:
GAGGAATTAACAGTCTTTATTGG
標的配列のリアルタイムPCR増幅および検出は、25μLの全反応空間内で行った。すべての反応をMx3005P QPCRシステム(Stratagene)で行った。
サイクルパラメーターは、95℃で2分間、95℃で15秒間と52℃で60秒間とを40サイクル(52℃でデータを収集した)。表16の基質およびパートザイムを用いて反応を構成した。反応条件の各セットは、二重試験方式で試験され、40nMの5RPL13aおよび200nMの3RPL13a、200nMのパートザイムA、200nMのパートザイムB、200nMの基質、8mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位、RNasin(Promega)、1×Immobuffer(Bioline)、2単位のMyTaqHS(商標)DNAポリメラーゼ(Bioline)、およびゲノムDNA鋳型(50ng)または無標的(NF−H2O)のいずれかを含有していた。
ユニバーサル基質に十分に相補的な基質センサーアームを有するパートザイムと共にゲノムDNAおよびユニバーサル基質を含有するすべての反応で、蛍光の増加が見られた(すなわち、特異的切断を試験する反応)。無DNA標的対照の蛍光は、特異的切断を試験する反応での蛍光よりも少なかったことから、特異的切断を試験する反応での蛍光の増加は、触媒活性MNAザイムの標的依存集合の後で十分に相補的なユニバーサルレポーター基質が切断されたことに起因することが実証される。
10−23DNAザイムは、基質配列に直接結合してそれを修飾可能な単分子構造である。MNAザイムと異なり、10−23DNAザイムは、活性コアを形成するための標的配列を必要としないので、10−23DNAザイムによる基質の結合および後続の切断は、標的配列により影響されず、分離した触媒コアを有していない。
非相補的DNAザイムによる非特異的切断を試験すべく行った実験で使用した10−23DNAザイムは、以下では5’→3’方向に列挙されており、下線付き塩基は、基質にハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、触媒コアを形成する。以下のいくつかのDNAザイム配列は、まさしく5’および3’末端に追加のGを含有する。これらの追加された塩基は、基質配列にハイブリダイズせず、DNAザイムが基質を切断する効率に影響を及ぼさない。
配列番号139 DNAザイム Dz55
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
配列番号141 DNAザイム Dz61
GTGGCGTGGAGAGGCTAGCTACAACGAGGGGTCGAGG
配列番号142 DNAザイム Dz72
GCTGGGAGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTGATG
配列番号144 DNAザイム Dz74
GCTGGGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGTGATG
配列番号145 DNAザイム Dz75
GTAGTGGGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGAGGGTCAG
配列番号147 DNAザイム Dz79
GGGTTGAAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGAGGAG
配列番号148 DNAザイム Dz80
GGGTTCACGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGGCGGTTGG
配列番号150 DNAザイム Dz85
GCTGGGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
本実施例では、基質は、5’末端を6−FAM部分(以下の基質名では「F」により表される)で、3’末端をIowa Black(登録商標)FQクエンチャー部分(以下の基質名で「IB」により表される)で、末端標識した。基質の切断は、450〜490nmの励起(CFX96(BioRad)に基づくFAM励起波長領域)を用いて510〜530nm(CFX96(BioRad)に基づくFAM発光波長範囲)でモニターした。この実施例のレポーター基質は、以下では5’→3’方向の配列で示されている。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
配列番号29 Sub55−FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
配列番号73 Sub61−FIB:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
配列番号75 Sub72−FIB:
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
配列番号77 Sub74−FIB:
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
配列番号78 Sub75−FIB:
TGACCCTCCTCguCTCCCCACTA
配列番号80 Sub79−FIB:
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
配列番号81 Sub80−FIB:
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
配列番号85 Sub85−FIB:
ACCGCACCTCguCCCCTCCCAG
DNAザイムによる基質の結合および後続の修飾により引き起こされる蛍光シグナルをモニターすることにより、ユニバーサル基質の切断を測定した。DNAザイムによるユニバーサル基質の切断は、フルオロフォアとクエンチャーとの分離を引き起こして蛍光の増加をもたらすであろう。表17にまとめられている反応はすべて、25μLの全体積中に1×PCR緩衝液II(Applied Biosystems)、10mMのMgCl2、200nMの基質、およびNF−H2Oを含有するものであった。各反応は、「試験」(10nM DNAザイム添加)反応または「対照」(NF−H2O添加)反応のいずれかとして二重試験方式で行った。反応は、52および58℃で、CFX96(商標)Real−Time PCR Detection System(BioRad)を用いて行った。各反応の蛍光は、最初の50サイクルでは1秒後に読み取るようにプログラムし、その後、その次の50サイクルでは25秒後に読み取るようにプログラムした。
DNAザイムとその十分に相補的な基質とを含有する各「試験」反応では、蛍光の増加が見られた。DNAザイムを含有していなかったいずれの反応(DNAザイム無添加)でも、蛍光の増加はなかった。このことから、DNAザイム含有「試験」反応で生じた蛍光の増加は、DNAザイムによる結合および後続のレポーター基質の触媒切断によるものであることが実証される。
規格化は、各平均データ点を同一の基質を含有する反応の最初の読取り後の無DNAザイム反応の平均値で割り算することにより行った(たとえば、Sub61の試験反応の平均データをSub61の無DNAザイム反応の1サイクル目の平均蛍光(最初の8秒間後)で割り算し、Sub61の無DNAザイム対照反応の平均蛍光を無DNAザイム対照反応の1サイクル目の平均蛍光で割り算した)。次いで、これらの規格化データを用いて、10分間の時点での試験規格化蛍光を10分間の時点での無DNAザイム規格化蛍光で割り算することにより、10分間の時点でのシグナル対ノイズ比を計算した。このシグナル対ノイズの計算は、各温度で行った。次いで、シグナル対ノイズ比を棒グラフ上にプロットして、試験した種々の温度で各DNAザイムによる各ユニバーサル基質の切断効率を比較した(図10(i)および(ii))。
qPCRなどのin vitro標的増幅方法を用いて、リアルタイムで複数の標的を同時に増幅および検出することが可能である。さらに、複数のユニークMNAザイムを含む1つの多重化反応により、リアルタイムで標的の増幅を同時にモニターすることが可能である。1つの標的に特異的なセンサーアームと、一連のユニバーサル基質のユニークメンバーに特異的な基質アームと、を用いて、各MNAザイムを設計することが可能である。一連のユニバーサル基質のそれぞれが異なるフルオロフォアで標識されるのであれば、各標的を個別に検出することが可能である。複数の標的の増幅および検出は、PCR増幅およびMNAザイム媒介検出が単一のチューブ内で同時に行われる一工程プロセスで実施される。リアルタイムモニタリングでは、曲線の形状(スティープネスおよびプラトーに達する速度)により反応効率を表しうる増幅曲線を作成する。
各標的に対するパートザイムAおよびBの配列を5’→3’方向に以下に列挙する。各標的に対して、最初のシリーズ1のユニバーサル基質の1つおよびシリーズ3からの新規な改善された基質の1つと共に使用するように、パートザイムを設計した。次の配列では、下線付き塩基は、基質にハイブリダイズする。「−P」は、オリゴヌクレオチドの3’リン酸化を表す。
配列番号157 パートザイムA RPL13aA/6−P
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGCGTGAT
配列番号163 パートザイムB RPL13aB/6−P
CTGGGAGGAAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
配列番号120 パートザイムA RPL13aA/80−P
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGGCGGTT
配列番号121 パートザイムB RPL13aB/80−P
GGTTCACGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
配列番号96 パートザイムA CYP2C9A/3−P
GGGAAGAGGAGCATTGAGGAACAACGAGGTTGTGCTG
配列番号97 パートザイムB CYP2C9B/3−P
CGGTTGGTGAGGCTAGCTCCGTGTTCAAGAGGAAGC
配列番号98 パートザイムA CYP2C9A/61−P
GGGAAGAGGAGCATTGAGGAACAACGAGGGGTCGAG
配列番号99 パートザイムB CYP2C9B/61−P
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCCGTGTTCAAGAGGAAGC
配列番号164 パートザイムA TP53A/4−P
GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGTGCGCCATG
配列番号165 パートザイムB TP53B/4−P
TACTTCTCCCAAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG
配列番号106 パートザイムA TP53A/79−P:
GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGGGGAGAGGA
配列番号107 パートザイムB TP53B/79−P::
GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG
配列番号34 パートザイムA TFRCA/2−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAAACCTT
配列番号35 パートザイムB TFRCB/2−P::
TGCCCAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号58 パートザイムA TFRCA/74−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGTGAT
配列番号59 パートザイムB TFRCB/74−P::
CTGGGAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号166 パートザイムA HPRTA/7つのP
CTGAATAGAAATAGTGATAGATCACAACGAGTGCCATGTTAA
配列番号167 パートザイムB HPRTB/7つのP
TATCACAGCCAAGGCTAGCTCATTCCTATGACTGTAGATTTTA
配列番号168 パートザイムA HPRTA/55のP
CTGAATAGAAATAGTGATAGATCACAACGAGAGGTGCGGT
配列番号169 パートザイムB HPRTB/55のP
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCATTCCTATGACTGTAGATTTTA
この実施例では、各多重方式で、5つの異なるユニバーサル基質を1つの反応チャンバー内で一緒に使用した。各多重方式で、各ユニバーサル基質を5つの異なるフルオロフォアの1つで標識した。本実施例では、基質は、5’末端をフルオロフォアで標識し、3’末端をクエンチャー部分で標識した(表19)。種々の発光波長および励起波長で基質の切断をモニターした(表19)。
配列番号21 Sub2−Q705B2:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
配列番号22 Sub3−FIB:
CAGCACAACCguCACCAACCG
配列番号23 Sub6−Q670B2:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
配列番号24 Sub7−JB:
TTAACATGGCACguTGGCTGTGATA
配列番号171 Sub4−TRB2:
CATGGCGCACguTGGGAGAAGTA
配列番号73 Sub61−FIB:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
配列番号77 Sub−74Q705B2:
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
配列番号80 Sub−79TRIBR:
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
配列番号81 Sub−80Q670B2:
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
配列番号29 Sub−55HIB:
IM9細胞系から抽出されたヒトDNA(Promega)のin vitro増幅により、5つの遺伝子すべてに対して標的PCRアンプリコンを作製した。以下に5’→3’方向に列挙したオリゴヌクレオチドPCRプライマーを用いて、アンプリコンを作製した。ボールド体の配列は、遺伝子標的に対するプライマーの特異性に影響を及ぼすことのなくプライマーのTmを増大させるユニバーサルタグ(U1、U2、またはU3)に対応する。このタグは、PCR反応の増幅効率を改善する。
配列番号91 フォワードプライマー 5TFRC_U1
GCTAAAACAATAACTCAGAACTTACG
配列番号92 リバースプライマー 3TFRC_U2
CAGCTTTCTGAGGTTACCATCCTA
配列番号125 フォワードプライマー 5TP53_U3
CTAACTTACTGCCTCTTGCTTCTC
配列番号126 リバースプライマー 3TP53_U2
CAGCTCTGTGCGCCGGTCTCTC
配列番号127 フォワードプライマー 5RPL13a_U3
CTAAACCGGAAGAAGAAACAGCTCA
配列番号128 リバースプライマー 3RPL13a_U2
CAGGAGGAATTAACAGTCTTTATTGG
配列番号129 フォワードプライマー 5CYP2C9_U3
CTAACCTCATGACGCTGCGGAA
配列番号130 リバースプライマー 3CYP2C9_U2
CAGATATGGAGTAGGGTCACCCA
配列番号176 フォワードプライマー 5HPRT_U3
CTAACTTTGCTGACCTGCTGGATTA
配列番号177 リバースプライマー 3HPRT_U2
CAGCAATAGCTCTTCAGTCTGATAA
標的配列のリアルタイムPCR増幅および検出は、25μLの全反応空間内で行った。反応はすべて、CFX96 Real−Time PCR Detection System(Bio−Rad)で行った。サイクルパラメーターは、1)95℃で2分間、95℃で15秒間と52℃で60秒間とを40サイクル、または2)95℃で2分間の、95℃で15秒間と58℃で60秒間とを40サイクルのいずれかであった。52℃または58℃の工程のいずれかで、蛍光データを収集した。各多重反応は、二重試験方式で行われ、10mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位のRibosafe RNアーゼ阻害剤(Bioline)、1×Immobuffer(Bioline)、2単位のMyTaqHS(Bioline)を含んでいた。パートザイム、プライマー、および基質が何であるか、ならびにそれらのそれぞれの濃度は、表20に列挙されている。反応は、DNA鋳型(100ngもしくは391pg)または無標的対照(NF−H20)のいずれかを含有していた。
ヒトゲノムDNAを含有する各多重反応は、遺伝子CYP2C9、TP53、HPRT、RPL13a、およびTFRCのリアルタイム検出で経時的に蛍光の増加を示した。すべての反応で、無DNA標的対照の蛍光は、DNA標的含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性MNAザイムの標的依存集合の後でユニバーサル基質の1つが切断されたことに起因することが実証される。
設計ガイドラインの新規なセットを用いて、10−23DNAザイムまたは10−23DNAザイムベースのMNAザイムと併用すべく、高活性基質の新しいシリーズを発明した。
表21に記載のSub55およびその誘導体の触媒活性の速度を測定するために行った実験では、ヒトTFRC遺伝子に相補的標的センサーアームを用いてパートザイムオリゴヌクレオチドAおよびBを設計した。AおよびBのパートザイムの配列は、以下では5’→3’方向に列挙されている。下線付き塩基は、基質にハイブリダイズする。「−P」は、オリゴヌクレオチドの3’リン酸化を表す。
配列番号179 パートザイムA TFRCA/55(18)−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCG
配列番号180 パートザイムB TFRCB/55(18)−P:
AGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号181 パートザイムA TFRCA/55(16)−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGC
配列番号182 パートザイムB TFRCB/55(16)−P:
GCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号183 パートザイムA TFRCA/55(23A)−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGTT
配列番号184 パートザイムB TFRCB/55(23A)−P:
TGAGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号185 パートザイムB TFRCA/55(23C)−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGTG
配列番号186 パートザイムB TFRCB/55(23C)−P:
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
配列番号46 パートザイムA TFRCA/55−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGT
配列番号45 パートザイムB TFRCB/55−P:
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
本実施例では、5’末端をQuasar670部分で、3’末端をBHQ2部分で、末端標識した。635nm(Quasar670励起波長)の励起を用いて665nm(Quasar670発光波長)で基質の切断をモニターした。この実施例で試験したレポーター基質は、以下では5’→3’方向の配列で示されている。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。
配列番号29 Sub55−Q670B2:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
配列番号172 Sub55(16)−Q670B2:
GCACCTCguCCCCAGC
配列番号173 Sub55(18)−Q670B2:
CGCACCTCguCCCCAGCT
配列番号174 Sub55(23A)−Q670B2:
AACCGCACCTCguCCCCAGCTCA
配列番号175 Sub55(23C)−Q670B2:
CACCGCACCTCguCCCCAGCTCC
この実施例の標的配列は、以下に列挙したオリゴヌクレオチドPCRプライマーを用いて、IM9細胞系から抽出されたヒトゲノムDNA(Promega)のin vitro増幅により産生されたPCRアンプリコンであった。プライマー配列は、5’→3’方向に列挙されている。
配列番号187 フォワードプライマー 5TFRC:
AACAATAACTCAGAACTTACG
配列番号188 リバースプライマー 3TFRC:
CTTTCTGAGGTTACCATCCTA
標的配列のリアルタイム増幅および検出は、25μLの全反応空間内で行った。すべての反応をMx3005P QPCRシステム(Stratagene/Agilent)で行った。サイクルパラメーターは、アニーリング温度により変化させ(次のように下線を付す)、以下のいずれかであった。
1)95℃で10分間、95℃で15秒間と55℃で30秒間とを5サイクル、95℃で15秒間と50℃で60秒間とを50サイクル、または
2)95℃で10分間、95℃で15秒間と55℃で30秒間とを5サイクル、95℃で15秒間と52℃で60秒間とを50サイクル、または
3)95℃で10分間、95℃で15秒間と55℃で30秒間とを5サイクル、95℃で15秒間と55℃で60秒間とを50サイクル、または
4)95℃で10分間、95℃で15秒間と55℃で30秒間とを5サイクル、95℃で15秒間と60℃で60秒間とを50サイクル。
すべての蛍光データをアニーリング温度で収集した。表22のように、基質およびその関連パートザイムを用いて反応を構成した。反応条件の各セットは、二重試験方式で行われ、40nMの5TFRC、200nMの3TFRC、各200nMのパートザイムAおよびパートザイムB、200nMの基質、8mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位のRnasin(Promega)、1×Immobuffer(Bioline)、1単位のImmolase(Bioline)、およびゲノムDNA鋳型(100ng)または無標的(NF−H2O)のいずれかを含有していた。個別の反応を構成して、そのマッチパートザイムにより各基質を試験した。同一のPCRプライマーをすべての反応に使用した。また、パートザイムはすべて、同一の標的感知部分を有していた。したがって、種々の温度で、反応効率に差があれば、基質の切断効率の差に帰属しうるであろう。
ヒトゲノムDNAを含有する各反応は、Sub55および種々の誘導体を用いたTFRC遺伝子のリアルタイム検出で経時的に蛍光の増加を示した。無DNA標的対照の蛍光は、DNA標的含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性MNAザイムの標的依存集合の後でユニバーサル基質の1つが切断されたことに起因することが実証される。
PCRなどのvitro標的増幅方法を用いてリアルタイムで標的核酸の増幅をモニターするために、MNAザイムを使用することが可能である。さらに、フルオロフォアとクエンチャーとの対で標識されたMNAザイム基質を用いたqPCR中のリアルタイムモニタリングでは、反応の対数期にわたり任意のレベルの蛍光の閾値ラインを配置して、Ct(サイクル閾値)として知られうる値を生成可能な曲線が作成される。より低いCt値を生じる反応は、そのような反応がより速く閾値サイクルに達するので、特異的基質のより効率的な切断の指標となる。この実施例では、増幅および検出は、PCR増幅およびMNAザイム媒介検出が単一のチューブ内で同時に行われる一工程プロセスで実施される。他の反応条件がすべての同一である場合、Ct値は、ユニバーサル基質の配列による影響を受けることもある。当技術分野で使用されるMNAザイムqPCRのアニーリング/検出温度は、50〜54℃である。この温度は、当技術分野で公知のユニバーサル基質が、効率的に切断される温度に課される限定条件を有し、シリーズ1のユニバーサル基質では54℃が上限であるという事実により決定された。より高い温度でアニールするプライマーおよびパートザイムを設計するうえでより大きい柔軟が可能になるように、より高い温度で切断されるユニバーサル基質の必要性が存在する。プライマーおよびパートザイムに対するこの設計柔軟性は、特異的検出のためにより高い反応温度ひいてはより高いTmを有するパートザイムおよびプライマーを必要とする、配列中に高パーセントのG塩基およびC塩基を有する対象の遺伝子標的など、多くの用途にきわめて有益でありうる。
シリーズ2およびシリーズ3のユニバーサル基質の切断効率をリアルタイムで測定すべく行った実験では、パートザイムオリゴヌクレオチドAおよびBはすべて、ヒトTFRC遺伝子の同一の配列に相補的なセンサーアームを用いて設計した。AおよびBのパートザイムの配列は、以下では5’→3’方向に列挙されている。下線付き塩基は、それらのマッチユニバーサル基質にハイブリダイズする。「−P」は、オリゴヌクレオチドの3’リン酸化を表す。
配列番号47 パートザイムA TFRCA/59−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAAGGGAGGAGG
配列番号62 パートザイムA TFRCA/77−P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGAGGAG
配列番号63 パートザイムB TFRCB/77−P:
AGGAGGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
この実施例のレポーター基質は、以下では5’→3’方向の配列で示されている。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。本実施例では、基質は、5’末端を6−FAM部分(以下の基質名では「F」により表される)で、3’末端をIowa Black(登録商標)FQクエンチャー部分(以下の基質名で「IB」により表される)で、末端標識した。基質の切断は、485nmの励起(Mx3005P(Stratagene)に基づくFAM励起波長領域)を用いて530nm(Mx3005P(Stratagene)に基づくFAM発光波長範囲)でモニターした。
配列番号33 Sub59−FIB:
CCTCCTCCCTguCCCTCCTCCT
配列番号79 Sub77−FIB:
CTCCTCCCTCguCCCTCCTCCT
この実施例の標的配列は、以下に列挙したオリゴヌクレオチドPCRプライマーを用いて、IM9細胞系(Promega)から抽出されたヒトゲノムDNAのin vitro増幅により産生された、TFRC遺伝子のPCRアンプリコンであった。プライマー配列は、5’→3’方向に列挙されている。
配列番号187 フォワードプライマー 5TFRC:
AACAATAACTCAGAACTTACG
配列番号188 リバースプライマー 3TFRC:
CTTTCTGAGGTTACCATCCTA
標的配列のリアルタイムPCR増幅および検出は、25μLの全反応空間内で行った。すべての反応をMx3005P QPCRシステム(Stratagene)で行った。表24のように、基質およびその関連パートザイムを用いて反応を構成した。サイクルパラメーターは、95℃で2分間、95℃で15秒間と58℃で60秒間とを40サイクル(58℃の工程でデータを収集した)。反応条件の各セットは、二重試験方式で行われ、40nMの5TFRC、200nMの3TFRC、各200nMのパートザイムAおよびパートザイムB、200nMの基質、8mMのMgCl2、200μMの各dNTP、10単位のRNasin(Promega)、1×Immobuffer(Bioline)、2単位のMyTaqHS(商標)DNAポリメラーゼ(Bioline)、およびゲノムDNA鋳型(50ng)または無標的(NF−H2O)のいずれかを含有していた。
ヒトゲノムDNAを含有する各MNAザイムqPCR反応では、ヒトゲノムDNAからのTFRCのリアルタイム検出で経時的に蛍光の増加を示した。すべての反応で、無DNA標的対照の蛍光は、DNA標的含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性MNAザイムの標的依存集合の後でユニバーサルレポーター基質の1つが切断されたことに起因することが実証される。
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Claims (14)
- 配列N1−N2−N3−N4−N5−N6−N7−N8−rR−rY−N9−N10−N11−N12−N13−N14−N15
(式中、
rRは、プリンリボヌクレオチドであり、
rYは、ウラシルであり、
N1〜N15のそれぞれは、ヌクレオチドであり、
N5〜N13のうち6個以上は、シトシンヌクレオチドであり、
N9は、シトシンヌクレオチドであり、かつ
N9〜N15のうち3個未満は、グアニンヌクレオチドである)
を含む、10−23DNAザイムまたは10−23DNAザイムに基づくMNAザイムに対する単離されたポリヌクレオチド基質であって、
配列番号29、30、72〜74、76〜85、87〜90、または172〜175のいずれか1つにより定義される配列を含む、またはその配列からなる、単離されたポリヌクレオチド基質。 - N5〜N13のうち7個以上が、シトシンヌクレオチドであり、かつ前記ポリヌクレオチド基質が、配列番号29、73、76〜80、82〜83、85、87〜90、または172〜175のいずれか1つにより定義される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。
- N 5 〜N 13 のうち8個が、シトシンヌクレオチドであり、かつ前記ポリヌクレオチド基質が、配列番号76、77、80、83または87のいずれか1つにより定義される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。
- N4〜N13のうち7個以上が、シトシンヌクレオチドであり、かつ前記ポリヌクレオチド基質が、配列番号29、73、76〜83、85、87〜90、または172〜175のいずれか1つにより定義される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。
- N8が、シトシンヌクレオチドであり、N9が、シトシンヌクレオチドであり、かつ前記ポリヌクレオチド基質が、配列番号73、76、77、79、83、または87のいずれか1つにより定義される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。
- N9〜N15のうち1または0個が、グアニンヌクレオチドであり、かつ前記ポリヌクレオチド基質が、配列番号29、30、72〜74、77〜79、81〜85、87〜90、174、または175のいずれか1つにより定義される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。
- N1〜N15のうち11個、12個、または12個超が、ピリミジンヌクレオチドであり、かつ前記ポリヌクレオチド基質が、いずれか1つの配列番号29、72〜74、76〜85、87〜90、174、または175により定義される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。
- 前記プリンリボヌクレオチドがグアニンである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。
- 前記ポリヌクレオチド基質を検出するための検出可能標識をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。
- (a)2つ以上のオリゴヌクレオチドパートザイムを提供する工程であって、少なくとも第1のオリゴヌクレオチドパートザイムおよび第2のオリゴヌクレオチドパートザイムが、標的の存在下で自己集合して少なくとも第1の触媒活性多成分核酸酵素(MNAザイム)を形成する、工程、
(b)請求項1〜9のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド基質を提供する工程であって、前記ポリヌクレオチド基質が、前記第1のMNAザイムによる修飾が可能であり、前記MNAザイムによる前記ポリヌクレオチド基質の修飾が、検出可能作用を提供する、工程、
(c)(1)前記少なくとも第1のMNAザイムの自己集合と、
(2)前記少なくとも第1のMNAザイムの触媒活性と、
を可能にする条件下で、前記2つ以上のオリゴヌクレオチドパートザイムと前記標的を推定上含有するサンプルとを接触させる工程、
(d)前記検出可能作用を検出する工程
を含む、少なくとも1つの標的の存在を検出する方法であって、前記検出可能作用が、前記基質の切断である、方法。 - 前記第1および第2のオリゴヌクレオチドパートザイムが、
配列番号9および配列番号10、配列番号11および配列番号12、配列番号13および配列番号14、配列番号16および配列番号14、配列番号17および配列番号18、配列番号40および配列番号41、配列番号42および配列番号43、配列番号44および配列番号45、配列番号46および配列番号45、配列番号47および配列番号63、配列番号48および配列番号49、配列番号50および配列番号51、配列番号52および配列番号51、配列番号38および配列番号55、配列番号56および配列番号57、配列番号58および配列番号59、配列番号60および配列番号61、配列番号62および配列番号63、配列番号64および配列番号65、配列番号66および配列番号67、配列番号62および配列番号68、配列番号69および配列番号70、配列番号46および配列番号55、配列番号46および配列番号59、配列番号38および配列番号45、配列番号58および配列番号45、配列番号62および配列番号45、配列番号46および配列番号63、配列番号71および配列番号68、配列番号98および配列番号99、配列番号100および配列番号103、配列番号104および配列番号105、配列番号106および配列番号107、配列番号108および配列番号109、配列番号110および配列番号111、配列番号112および配列番号113、配列番号116および配列番号117、配列番号118および配列番号119、配列番号120および配列番号121、配列番号122および配列番号119、配列番号155および配列番号156、配列番号157および配列番号158、配列番号159および配列番号160、配列番号168および配列番号169、配列番号179および配列番号180、配列番号181および配列番号182、配列番号183および配列番号184、または配列番号185および配列番号186
により定義されるそれぞれの配列を含む、請求項10に記載の方法。 - 工程(d)での前記検出が、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴法、質量分析法、NMR法、電子スピン共鳴法、偏光蛍光分光法、円二色性法、免疫アッセイ法、クロマトグラフィー法、放射測定法、電気化学的方法、測光法、シンチグラフィー法、電子的方法、UV、可視光、もしくは赤外の分光法、酵素法、またはそれらの任意の組合せの使用を含む、請求項10または11に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド基質と、切断によって前記ポリヌクレオチド基質を触媒修飾することができる触媒核酸酵素を含むキット。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド基質に結合された固体担体を含む集合体。
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