CN103917664B - 核酸酶底物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于催化性核酸酶的核酸底物以及这些底物的使用方法。

Description

核酸酶底物
通过交叉引用的结合
本申请要求于2011年9月9日提交的澳大利亚临时专利申请号2011903686的优先权，将其全部内容通过交叉引用结合在此。
技术领域
本发明总体上涉及核酸酶的领域。更确切地说，本发明涉及用于用于核酸酶的底物以及这些底物的使用方法。
发明背景
在过去的20年中已经发现了多种多样的具有酶或催化活性的核酸分子。RNA酶（“核酶”）是天然存在的，但是可以被工程化为特异性地识别和修饰靶标RNA底物。体外进化技术有利于发现和开发更多的催化性核酸，包括脱氧核糖核酸，通常称为“脱氧核酶”、“DNA酶”或“DNA核酶”。已经发现，体外进化的DNA核酶和/或核酶具有催化广泛的反应的能力，包括核酸的裂解、核酸的连接、卟啉金属化、以及碳-碳键、酯键或酰胺键的形成。
具体地，DNA核酶和核酶已经表征为可在通过沃森-克里克碱基配对进行杂交之后特异性地裂解不同的核酸序列。DNA核酶能够裂解RNA或DNA分子。核酶也能够裂解RNA和DNA靶标序列两者。“10-23”和“8-17”DNA核酶能够裂解核酸底物的特异性RNA磷酸二酯键而生成具有2',3'-环磷酸和5'-羟基基团的反应产物。可以连接2',3'-环磷酸和5'-羟基产物的脱氧核酶（DNA核酶）的实例包括“7Z81”和“7Z48”连接酶。
最近，已经描述了多组分核酸酶（MNA酶），该多组分核酸酶具有在MNA酶组装易化子（例如有待被检测的靶标分子）的存在下从两个或更多个寡核苷酸组分（在此也被称为“部分酶”）进行自组装的能力。
催化性核酸的多样性特性有利于其在许多不同应用中的使用。催化性核酸的成功使用的关键要素是其修饰适当的底物的能力。总的来说，该底物与催化性核酸的杂交臂是基本上互补的，并且在催化作用部位包含一种特异序列或序列基序。在给定的催化性核酸与其底物之间的相互作用的性质决定了该酶是如何高效地接合和/或催化修饰其底物，并且因此是设计任何使用催化性核酸的系统的基本的考虑因素。
催化性核酸在核酸、蛋白质以及小分子的检测中具有体外诊断用途。这些用途通常涉及靶标或信号的放大，从而产生充足的信号，以用于对感兴趣的分析物的稳健检测。
采用催化性核酸的方法需要被充分比率的催化活性修饰的底物，以允许在背景噪声上的有效辨别。不同的方法可能需要使用不同的反应温度，并且因此需要底物在所需温度下被高效修饰（例如被裂解）。这些方法，如使用了MNA酶和DNA核酶的方法，允许在一个单一反应中对很多靶标同时进行多重分析（multiplexed analysis），但是在多个靶标之间进行多重化和辨别取决于合适范围的底物的存在，通常是每个靶标至少一个。本领域已知的可被高效修饰（例如被裂解）的底物的数量当前还不足以用于大规模多重化。
先前在本领域中已知的DNA核酶和MNA酶底物是通过对多种可能的底物进行筛选以便通过经验法确定被最有效地裂解的那些底物而得到的。这种筛选经常使用大量的靶向于对全长mRNA内的理论上可能的裂解位点进行裂解的DNA核酶。这种筛选经常是在生理条件（温度、以及缓冲剂的离子强度、组成和pH值）下进行的。这种对在生理条件下被高效裂解的mRNA序列的发现的偏见是由于此类研究是关注于DNA核酶作为RNA体内表达抑制剂的治疗用途。此类研究提供了一系列繁琐的方案，用于对大量的假定的底物进行经验法测量，以发现新的少数的被高效裂解的底物（参见例如凯恩斯（Cairns）等人，1999《自然生物技术》（Nat Biotech）17:480-486）。这些研究导致了一组有限的用于对被高效裂解的底物进行选择的设计指导方针，并且在许多情况下，这些指导方针关注于DNA核酶的设计而不是底物的设计，因为DNA核酶可被轻易调整，而mRNA不能被轻易调整。由这些研究而产生的一个共同指导方针是，R-Y核糖核苷酸基序在底物的裂解位点处的正合序列对于按下述顺序的裂解效率非常重要：GU≥AU>GC>>>AC。
在体外条件下的全长mRNA的裂解效率不是一种在细胞环境中的裂解效率的绝对量度，因为后者包含核糖核蛋白以及其他不易在体外进行模仿的致混淆因素。
某些过去产生的设计指导方针可用于对一个长mRNA分子内的可被DNA酶和MNA酶在生理条件下高效裂解的的位点进行选择，但是这些指导方针对于哪种底物可被足够高效地裂解进行预测以用于体外诊断应用的能力有限。体外诊断应用需要的条件可以与在本领域中存在的通常被筛选并用于建立有限的底物设计指导方针的生理条件大为不同。
需要一组用于底物序列的指导方针或序列基序，用于以更大的确定性来预测是否一种底物将在适用于体外诊断应用的条件下被MNA酶或DNA核酶高效地裂解。对于具有可利于改进催化性核酸功能的特性的催化性核酸底物还存在着一种需求。这些特性可包括，例如，促进在一系列条件下改进的催化性核酸功能的能力和/或扩大可在多路反应中同时检测的靶标数量的能力。
发明概述
虽然很多人试图建立可一致地生成高效底物序列的一种序列基序或一组设计指导方针，但迄今为止，还没有鉴别出一种高效序列或一组指导方针认。本发明提供了有利于开发新的高效裂解底物的一系列原理。本发明因此提供了具有增强催化性核酸功能的特性的催化性核酸酶底物，由此解决了存在于本领域中的需求。
在第一方面，本发明提供了一种用于催化性核酸酶的分离的多核苷酸底物，所述多核苷酸底物包括序列N1-N2-N3-N4-N5-N6-N7-N8-rR-rY-N9-N10-N11-N12-N13-N14-N15，其中：
rR是嘌呤核糖核苷酸；
rY是嘧啶核糖核苷酸；
N1-N15中的每一个是核苷酸；
N5-N13中的六个或更多个是胞嘧啶核苷酸；并且
N9-N15中少于三个是鸟嘌呤核苷酸。
在第一方面的一个实施例中，多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：25-27、29-30、33、72-90或172-175中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N5-N13中的七个或更多个、或八个或更多个是胞嘧啶核苷酸。
在第一方面的一个实施例中，N5-N13中的七个或更多个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：29、73、76-80、82-83、85-90或172-175中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N5-N13中的八个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：76、77、80、83或87中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N4-N13中的七个或更多个或八个或更多个是胞嘧啶核苷酸。
在第一方面的一个实施例中，N4-N13中的七个或更多个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：27、29、73、76-83、85-90或172-175中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N4-N13中的八个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：76、77、79-80、82-83、87、88或90中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N4-N12中的六个或更多个、七个或更多个或八个或更多个是胞嘧啶核苷酸。
在第一方面的一个实施例中，N4-N12中的七个或更多个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：27、29、73、76、77、79-83、85-88、90或172-175中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N4-N12中的八个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：76、77、80、83、87或88中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N5-N12中的六个或更多个、七个或更多个或八个或更多个是胞嘧啶核苷酸。
在第一方面的一个实施例中，N5-N12中的七个或更多个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：29、73、76、77、80、83、85-88或172-175中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N5-N12中的八个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：76、77、80、83或87中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N1、N2、N8和/或N9中的任何一个或多个是胞嘧啶核苷酸。
在第一方面的一个实施例中，N8和N9是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：25-26、29-30、72-90或172-175中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N9-N15中的两个或一个是鸟嘌呤核苷酸，或者都不是鸟嘌呤核苷酸。
在第一方面的一个实施例中，N9-N15中的一个是鸟嘌呤核苷酸或者都不是鸟嘌呤核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：25-27、29-30、33、72-80、82-90或172-175中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N9-N15都不是鸟嘌呤核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：25、26、30、33、72、75、77-80、84-85或89中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N1-N15中的多于十个、多于十一个、多于十二个或多于十三个是嘧啶核苷酸。
在第一方面的一个实施例中，N1-N15中的十一个、十二个、或多于十二个是嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：25-27、29、33、73-90或173-175中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N1-N15中的十三个或十四个是嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：75、77-80、82-85或88-89中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N1-N14中的多于八个、多于九个、多于十个、或十一个是胞嘧啶核苷酸。
在第一方面的一个实施例中，N1-N14中的十个或十一个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：33、76-80、82-83、85、87、88或89中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，N1-N14中的十一个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：77-79中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
在第一方面的一个实施例中，多核苷酸底物进一步包括一个用于检测该多核苷酸底物的可检测标记。
在第一方面的一个实施例中，多核苷酸底物进一步包括一个可检测部分以及一个猝灭剂部分，其中该可检测部分提供的可检测效应可基于所述催化性核酸酶对多核苷酸底物的修饰而增加或减少。
在第一方面的一个实施例中，嘌呤核糖核苷酸包括鸟嘌呤。
在第一方面的一个实施例中，嘧啶核糖核苷酸包括尿嘧啶。
在第一方面的一个实施例中，多核苷酸底物的与所述催化性核酸酶结合的部分具有的解链温度（Tm）是在50℃与90℃之间、50℃与65℃之间、50℃与60℃之间、52℃与58℃之间、66℃与76℃之间、68℃与76℃之间、64℃与70℃之间、70℃与76℃之间、70℃与75℃之间、72℃与76℃之间、52℃、58℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃或76℃。
在第一方面的一个实施例中，催化性核酸酶是：
（i）一种多组分核酸酶（MNA酶），并且所述部分与所述MNA酶的至少一个底物臂结合；或者
（ii）一种DNA核酶。
在第一方面的一个实施例中，多核苷酸底物能够被MNA酶催化修饰。
在第一方面的一个实施例中，多核苷酸底物能够被DNA核酶催化修饰。
在第一方面的一个实施例中，多核苷酸底物包括一个用于通过以下方法进行检测的可检测标记：荧光光谱法、表面等离子共振法、质谱法、NMR、电子自旋共振、偏振荧光光谱法、圆二色性、免疫测定、层析法、放射性测量、电化学、光度测量、闪烁扫描术、电子法、UV、可见光或红外光谱法、酶法、或它们的任何组合。
在第一方面的一个实施例中，多核苷酸底物包括一个用于由荧光光谱法检测的可检测标记。
在第一方面的一个实施例中，多核苷酸底物包括一个用于由荧光共振能量转移（FRET）光谱法检测的可检测标记。
第二方面中，本发明提供了用于催化性核酸酶的一种分离的多核苷酸底物，所述多核苷酸底物包括由SEQ ID NO：28所定义的序列，或由该序列组成。
在第二方面的一个实施例中，催化性核酸酶是一种MNA酶，该MNA酶包括一对寡核苷酸部分酶，这对部分酶包括SEQ ID NO：15和8、SEQ ID NO：93和94，或SEQ ID NO：114和115，或由其组成。
在第二方面的一个实施例中，催化性核酸酶是一种DNA核酶，该DNA核酶包括一个由SEQ ID NO：138所定义的序列，或由其组成。
在第三方面，本发明提供了一种用于检测至少一个靶标的方法，该方法包括：
（a）提供两种或更多种寡核苷酸部分酶，其中至少第一寡核苷酸部分酶和第二寡核苷酸部分酶在所述靶标的存在下自组装，以形成至少一个第一催化活性多组分核酸酶（MNA酶）；
（b）提供第一或第二方面的分离的多核苷酸底物，其中所述多核苷酸底物能够被所述第一MNA酶修饰，其中通过所述MNA酶对所述多核苷酸底物进行的所述修饰提供了可检测效应；
（c）将所述两个或更多个寡核苷酸部分酶与一个推测含有所述靶标的样品接触，其条件允许：
（1）所述至少第一MNA酶的自组装，以及
（2）所述至少第一MNA酶的催化活性；并且
（d）对所述可检测效应进行检测。
在第三方面的一个实施例中，靶标是MNA酶组装易化子。
在第三方面的一个实施例中，靶标是核酸。
在第三方面的一个实施例中，靶标是通过碱基对互补与所述MNA酶的一个或多个感应臂杂交的核酸。
在第三方面的一个实施例中，该核酸是选自下组，该组由以下各项组成：DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体微小RNA和初级微小RNA、其他非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、扩增子、或它们的任何组合。
在第三方面的一个实施例中，对核酸进行扩增。
在第三方面的一个实施例中，扩增包括以下项中的一个或多个：聚合酶链式反应（PCR）、链置换扩增（SDA）、环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）、转录介导的扩增（TMA）、自动维持序列扩增（3SR）、基于核酸序列的扩增（NASBA）或逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。
在第三方面的一个实施例中，多核苷酸底物与所述MNA酶的底物臂杂交的温度是在50℃与90℃之间、50℃与65℃之间、50℃与60℃之间、52℃与58℃之间、66℃与76℃之间、68℃与76℃之间、64℃与70℃之间、70℃与76℃之间、70℃与75℃之间、72℃与76℃之间、52℃、58℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃或76℃。
在第三方面的一个实施例中，该方法进一步包括提供：
(a)两个或更多个另外的寡核苷酸部分酶，这些寡核苷酸部分酶能够在不同靶标存在下自组装而形成一种第二催化活性MNA酶；以及
(b)至少一种另外的多核苷酸底物；
其中所述另外的多核苷酸底物能够在所述不同的靶标的存在下被所述第二MNA酶修饰。
在第三方面的一个实施例中，这种另外的多核苷酸底物不能被所述第一MNA酶修饰。
在第三方面的一个实施例中，在部分（d）中的检测包括使用荧光光谱法、表面等离子共振法、质谱法、NMR、电子自旋共振、偏振荧光光谱法、圆二色性、免疫测定、层析法、放射性测量、电化学、光度测量、闪烁扫描术、电子法、UV、可见光或红外光谱法、酶法、或它们的任何组合。
在第三方面的一个实施例中，在部分（d）中的检测包括使用荧光光谱法。
在第三方面的一个实施例中，在部分（d）中的检测包括对FRET可检测效应的检测。
在第三方面的一个实施例中，所述MNA酶的催化核心包括DNA或其类似物。
在第四方面中，本发明提供了第一或第二方面的分离的多核苷酸底物作为催化性核酸酶的底物的用途。
在第四方面的一个实施例中，催化性核酸酶是一种多组分核酸酶（MNA酶）。
所述MNA酶包括至少两个或更多个寡核苷酸部分酶，其中至少第一寡核苷酸部分酶与第二寡核苷酸部分酶在MNA酶组装易化子的存在下进行自组装而形成一种催化活性多组分核酸酶（MNA酶），其中所述至少第一和第二寡核苷酸部分酶各自包括一个底物臂部分、一个催化核心部分以及一个感应臂部分；
其中在自组装时，所述第一和第二寡核苷酸部分酶的感应臂部分作为MNA酶的感应臂，第一和第二寡核苷酸部分酶的底物臂部分作为MNA酶的底物臂，并且第一和第二寡核苷酸部分酶的催化核心部分作为MNA酶的催化核心；
并且其中MNA酶的感应臂与所述MNA酶组装易化子相互作用，以使第一和第二寡核苷酸部分酶保持相互靠近，以便其各自催化核心部分的关联，从而形成MNA酶的催化核心，所述催化核心能够对所述多核苷酸底物进行修饰，并且其中所述MNA酶的所述底物臂与所述多核苷酸底物接合，这使得所述MNA酶的催化核心可对所述多核苷酸底物进行修饰。
在第三或第四方面的一个实施例中，所述寡核苷酸部分酶各自的催化核心部分包括DNA或其类似物。
在第四方面的一个实施例中，组装易化子是有待被鉴别、检测或定量的靶标。
在第三或第四方面的一个实施例中，第一和第二寡核苷酸部分酶包括由以下项定义的对应序列：
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45；SEQ IDNO：46和SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：63；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49；SEQID NO：50和SEQ ID NO：51；SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：51；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：55；SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59；SEQ ID NO：60和SEQ IDNO：61；SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63；SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65；SEQ ID NO：66和SEQID NO：67；SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70；SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：55；SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：59；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：63；SEQ IDNO：71和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：99；SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：105；SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：107；SEQ ID NO：108和SEQID NO：109；SEQ ID NO：110和SEQ ID NO：111；SEQ ID NO：112和SEQ ID NO：113；SEQ IDNO：116和SEQ ID NO：117；SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：119；SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：121；SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：119；SEQ ID NO：155和SEQ ID NO：156；SEQ ID NO：157和SEQ ID NO：158；SEQ ID NO：159和SEQ ID NO：160；SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169；SEQID NO：179和SEQ ID NO：180；SEQ ID NO：181和SEQ ID NO：182；SEQ ID NO：183和SEQ IDNO：184或SEQ ID NO：185和SEQ ID NO：186。
在第三或第四方面的一个实施例中，所述寡核苷酸底物和所述第一和第二寡核苷酸部分酶是由如在表6、8、10、13、16、20、22和/或24中列出的序列的组合所定义的。
在第四方面的一个实施例中，催化性核酸酶是一种DNA核酶，并且该DNA核酶和寡核苷酸底物是由如在表15中列出的序列的组合所定义的。
在第四方面的一个实施例中，靶标是可通过碱基对互补与所述MNA酶的一个或多个感应臂杂交的核酸。
在第四方面的一个实施例中，多核苷酸底物与所述催化性核酸酶杂交的温度是在50℃与90℃之间、50℃与65℃之间、50℃与60℃之间、52℃与58℃之间、66℃与76℃之间、68℃与76℃之间、64℃与70℃之间、70℃与76℃之间、70℃与75℃之间、72℃与76℃之间、52℃、58℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃或76℃。
在第五方面中，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括第一或第二方面的分离的多核苷酸底物。
在第五方面的一个实施例中，该试剂盒进一步包括一种能够对所述多核苷酸底物进行催化修饰的催化性核酸酶。
在第五方面的一个实施例中，该催化性核酸酶是一种多组分核酸酶（MNA酶）。
在第六方面中，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括第一或第二方面的分离的多核苷酸底物、以及多种寡核苷酸部分酶，这些寡核苷酸部分酶被设计用于组装能够检测至少一种靶标的多组分核酸酶（MNA酶），其中所述MNA酶能够对多核苷酸底物进行催化修饰。
在第六方面的一个实施例中，所述寡核苷酸底物和所述多种寡核苷酸部分酶是由如表6、8、10、13、16、20、22和/或24中列出的序列的组合所定义的。
在第七方面，本发明提供了一种组装物，该组装物包括一个固体载体，该固体载体与第一或第二方面的多核苷酸底物结合。
在第一或第三至第七方面的一个实施例中，N1-N15中的任何一个或多个是脱氧核糖核苷酸。
在第一或第三至第七方面的一个实施例中，N1-N15中的任何一个或多个是核糖核苷酸。
在第一或第三至第七方面的一个实施例中，所有N1-N15都是脱氧核糖核苷酸。
在第一或第三至第七方面的一个实施例中，所有N1-N15都是核糖核苷酸。
在第一或第三至第七方面的一个实施例中，N1-N15包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的混合物。
在第七方面的一个实施例中，该组装物包括与多个不同的多核苷酸底物结合的多个不同的固体载体。
在第一、第二、第四或第五方面的一个实施例中，催化性核酸酶是一种DNA核酶。
在第一、第二、第四或第五方面的一个实施例中，催化性核酸酶是一种核酶。
在第一、第二、第四或第五方面的一个实施例中，催化性核酸酶是一种多组分核酸酶（MNA酶）。
在上述方面的一个实施例中，催化性核酸酶能够通过裂解修饰多核苷酸底物。
在第一、第二或第五方面的一个实施例中，催化性核酸酶是一种包括第一和第二寡核苷酸部分酶的MNA酶，并且所述寡核苷酸底物与所述第一和第二寡核苷酸部分酶是由如表6、8、10、13、16、20、22和/或24中列出的序列的组合所定义的。
在第一、第二或第五方面的一个实施例中，催化性核酸酶是一种DNA核酶，并且该DNA核酶和寡核苷酸底物是由如表15中列出的序列的组合所定义的。
在第一、第二或第五方面的一个实施例中，多核苷酸底物能够通过互补碱基配对与所述催化性核酸酶进行杂交。
在第四方面的一个实施例中，多核苷酸底物通过互补碱基配对与所述催化性核酸酶进行杂交。
在第三和第四方面的一个实施例中，多核苷酸底物通过互补碱基配对与所述MNA酶进行杂交。
在第一、第二、第五和第六方面的一个实施例中，多核苷酸底物能够通过互补碱基配对与所述MNA酶进行杂交。
在上述方面的一个实施例中，分离的多核苷酸底物的一个部分与所述MNA酶的至少一个底物臂结合。
在上述方面的一个实施例中，多核苷酸底物是一种能够被结合并且被一种以上的不同类型的催化性核酸酶催化修饰的通用底物。
在上述方面的一个实施例中，多核苷酸底物是一种能够被结合并且被一种以上的不同类型的多组分核酸酶（MNA酶）催化修饰的通用底物。
在上述方面的一个实施例中，所述寡核苷酸部分酶、组装易化子或底物中的至少一个包括DNA或其类似物。
在第三和第六方面的一个实施例中，这种修饰是由MNA酶对多核苷酸底物的裂解。
附图简要说明
现在将参照附图仅通过举例的方式对本发明的优选实施例进行描述，其中：
图1是对多组分核酸（MNA酶）的示例性设计进行描绘的图。以示例性披露的方式，MNA酶包括两种寡核苷酸组分（部分酶A和部分酶B），这些组分在组装易化子的存在下进行自组装。当这两种部分酶在组装易化子的存在下进行组装时，形成了一种能够对底物进行修饰（例如裂解或连接）的催化活性MNA酶。这两种组分部分酶具有（i）与组装易化子结合的感应臂，（ii）与底物结合的底物臂，以及（iii）部分催化核心序列。一种组装易化子分子（例如一种靶标核酸序列）的存在提供了“输入”信号，该信号指导以一种适于调节的高度特异性方式进行的部分酶组分的组装。在一些实施例中，组装易化子可以是例如在测试样品中存在的靶标核酸序列。在其他实施例中，组装易化子可以是例如包含在周围环境中的合成寡核苷酸，用以在可检测实体或事件的存在下指导部分酶组分的自组装。由组装的MNA酶对底物进行的修饰可以提供一种可被检测和/或定量的“可检测效应”。例如，当底物被荧光团（F）和猝灭剂（Q）双重标记时，由一种活性MNA酶对这种“报告底物”进行的裂解将荧光团与猝灭剂分离开，导致伴随荧光的增加。
图2提供了使用MNA酶进行靶标检测的方法的示例性应用的流程图。MNA酶可以用于（1）指导方向；（2）对在靶标扩增期间或之后通过例如PCR、SDA、LAMP、RCA、TMA、3SR或NASBA生成的扩增子进行检测；以及（3）启动信号放大级联。
图3提供了对示例性的MNA酶以及一种靶标检测的方法的描绘，该靶标检测的方法使用了将结合至载体上的底物进行裂解的MNA酶。在这个实施例中，只在组装易化子（靶标）的存在下才能形成MNA酶。当MNA酶在荧光团与猝灭剂之间对结合的底物进行裂解时，产生一个信号。如在此所示的，在荧光团F与猝灭剂Q之间的裂解之时，结果是荧光增加。一般而言，该方法可被设计成，在裂解一发生时荧光团F或猝灭剂Q可以保持附接至载体。图（i）：所示的载体只有一种底物类型（底物1）与之结合。图（ii）：有多种底物类型结合在不同的位置上。各底物只能被MNA酶裂解，该MNA酶是在特异性MNA酶组装易化子分子的存在下形成的—在这里，靶标1和2分别促进MNA酶1和MNA酶2的自组装。因此，在这个实例中，MNA酶1只在靶标1的存在下才能自组装，并且只裂解底物1。类似地，MNA酶2只在靶标2的存在下才能自组装，并且只裂解底物2。该信号可通过将该底物置于表面上而被定位，因此允许对不同组装易化子的特异性检测。在图（ii）中的示例性测定需要两种不同的底物序列。
图4显示了将催化性修饰的底物产物用作MNA酶组装易化子组分的示例性测定。在这个策略中，在靶标（T）的存在下形成了一种启动性MNA酶（Mt）。该启动性MNA酶（Mt）将一种第一底物（S1）裂解生成一种第一组装易化子组分（S1f），该组分指导第一级联MNA酶（级联MNA酶Mc1）的形成。在这个实例中，第一级联MNA酶（Mc1）包含两种部分酶和指定为F1、F2和S1f的三种组装易化子组分。Mc1可裂解一种另外的底物（S2），由此释放一种指导第二级联MNA酶（级联MNA酶Mc2）的形成的另外的组装易化子组分（S2f）。在这个实例中，第二级联MNA酶（Mc2）包含两种部分酶和指定为F3、F4和S2f的三种组装易化子组分。然后Mc2可裂解更多的第一底物（S1），由此生成更多的第一组装易化子组分（S1f）。这引起了进一步的第一级联MNA酶（Mc1）的形成，由此形成了一种放大级联。这种示例性测定需要两种不同的底物序列。
图5提供了展示以下内容的图：通过使用一系列不同的用于检测人TFRC基因的通用底物进行MNA酶qPCR而产生的Ct值。在X轴上指示在反应中使用的通用底物的一致性（其中“2”是指Sub2，“3”是指Sub3，等等）。在所有反应中使用相同的引物集和基因组DNA，并且所有的部分酶具有相同的靶标感应区和催化结构域。反应之间的区别只是底物-部分酶感应臂以及荧光标记的通用底物。因此，反应之间的Ct值的区别与通用底物的裂解效率是相关联的。更低的Ct值指示达到荧光阈值水平的更快的循环数，并且因此指示被更为高效裂解的通用底物。
图6提供了展示在等温形式下由MNA酶介导的对一系列通用底物的裂解而得到的信噪比的图。靶标是合成寡核苷酸。从在一系列反应温度下进行的裂解反应的过程中收集的归一化荧光值数据进行计算而得到信噪比。在X轴上指示在反应中使用的通用底物一致性（其中“2”是指Sub2，“3”是指Sub3，等等）。在图6（i）中，不同数据列是指不同反应温度的结果（如在图注中所示的52℃、54℃、56℃和58℃）。图6（i）在Y轴上展示了信噪比。图6（ii）展示了从所有四种测试温度得到的信噪比的平均值的标准偏差，并且不同底纹的列指示不同系列的底物。
图7提供了对通过使用一系列不同的用于检测一系列人类基因的通用底物进行MNA酶qPCR而产生的线性扩增图进行展示的图。将底物和靶标的各组合在以下退火温度下操作：a）52℃或b）58℃。用各基因进行测试的通用底物是由位于各图左上侧的符号来指示的，并且是（i）Sub3和Sub61，带有CYP2C9，（ii）Sub6、Sub72、Sub74和Sub79，带有TP53，（iii）Sub60、Sub61和Sub79，带有B2M，（iv）Sub49和Sub75，带有HMBS，（v）Sub2、Sub72和Sub80，带有TFRC，以及（iv）Sub55、Sub80和Sub88，带有RPL13a。相同的引物集和基因组DNA用于所有使用各不同基因的反应，并且所有部分酶具有相同的与特定基因相匹配的催化结构域和靶标-感应区。反应之间的区别只是底物-部分酶感应臂以及荧光标记的通用底物。因此，相同基因的反应的扩增图的形状和Ct值的区别是与通用底物的裂解效率是相关的。曲线越陡并且Ct值出现的越早，指示达到荧光阈值的循环数越快，并且因此指示被更高效裂解的通用底物。
图8提供了展示在等温形式下由DNA核酶介导的对一系列通用底物的裂解而得到的信噪比的图。从在一系列反应温度下进行的裂解反应的过程中收集的归一化荧光值数据进行计算而得到信噪比。在X轴上指示在反应中使用的通用底物一致性（其中“2”是指Sub2，“3”是指Sub3，等等）。在图8（i）中，不同数据列是指不同反应温度的结果（如在图注中所示的-50℃至60℃），Y轴上是信噪比。在图8（ii）中，数据列是指从所有六种测试温度得到的信噪比的平均值的标准偏差，并且不同底纹的列指示不同系列的底物。
图9提供了展示以下内容的图：使用一系列不同的通用底物（Sub44、Sub55、Sub61、Sub65、Sub72和Sub74）进行的MNA酶qPCR所得的线性扩增图，用以使用一个子集的用于对人RPL13a基因进行检测的部分酶（用底物感应臂来设计为与Sub44、Sub55、Sub72和Sub74互补）来对非特异性裂解活性进行研究。用被设计成与其他底物完全互补的部分酶对来单独地检测每个通用底物，从而确定是否可以检测到信号。用所有底物来测试这些与（i）Sub72、（ii）Sub74、（iii）Sub55和（iv）Sub44互补的部分酶。在图（a）中，表的底行指示在实验中部分酶展现出与其完全互补的底物。表的其他行显示了在各实验中测试的其他底物的序列的比对，在底部底物与其他底物序列之间的差异性由带下划线的灰色字母来指示。在图（b）中，展示了线性扩增图。归一化的荧光值（y轴）是针对循环数（x轴）来描绘的。单独的扩增曲线是在图的右侧进行标记，指示扩增曲线与各底物是相关的。荧光阈值是由x轴上方的水平实线来指示的。在荧光阈值上方的增加的信号指示通用底物的裂解。
图10提供了展示单独地用DNA核酶对各通用底物进行的DNA核酶介导的裂解而得到的信噪比的图，这些DNA核酶被设计成在等温形式下可完全互补地与其他底物结合。归一化的信噪比是由在反应温度（i）52℃或（ii）58℃下收集的归一化荧光值数据计算得来的。在x轴上指示在反应中所用的通用底物的一致性。数据的不同列是指如在图注中所指示的各DNA核酶的裂解的结果，其中Y轴上指示信噪比。
图11展示了两种多重MNA酶qPCR反应由在52℃（图（i））或58℃（图（ii））下的扩增而产生的指数式扩增图，多重反应（Multiplex）1采用系列1的底物（Sub2、Sub3、Sub4、Sub6和Sub7），而多重反应（Multiplex）2采用系列2和3的底物（Sub55、Sub61、Sub74、Sub79和Sub80）。两种多重反应均在一个单一反应容器中对人类基因TFRC、HPRT、TP53、RPL13a和CYP2C9进行测量。对于在两种多重反应形式下测量的各个不同基因，相同的引物组和基因组DNA被在两种温度下采用并且用于所有通用底物，并且所有部分酶具有与特定基因相匹配的相同的催化结构域和靶标-感应区。反应之间的区别只是底物-部分酶感应臂以及荧光标记的通用底物。使用各基因进行测试的通用底物是在各图的左上方指示的。将多重反应1（叉）和多重反应2（圆圈）的扩增图叠加，可对在不同的DNA浓度下的两种多重反应之间进行直接比较，不同的DNA浓度包括100ng（在左侧的叉和圆圈图）和391pg（在右侧的叉和圆圈图）。扩增图的形状的差异是与通用底物的裂解效率相关联的。曲线越陡并且Ct值出现的越早，指示达到荧光阈值的循环数越快，并且因此指示被更为高效裂解的通用底物。
定义
在此使用了某些术语，其含义如下列出。
如在此使用的，单数形式“一种（a）”、“一种（an）”以及“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。例如，术语“一种多核苷酸底物”还包括多种多核苷酸底物。
术语“包括”的含义是“理论上包括，但不是唯一必需的”。此外，单词“包括（comprising）”的变化，如“包括（comprise）”和“包括（comprises）”相应地具有不同的含义。
在此使用的关于所引用的数值的术语“大约（about）”包括所引用的数值以及在引用值的加或减百分之十之内的数值。
在此当指代一个范围的数值时使用的术语“之间（between）”涵盖在该范围的各端点处的数值。例如，一种长度在10个核苷酸与20个核苷酸之间的多核苷酸包含长度是10个核苷酸的多核苷酸以及长度是20个核苷酸的多核苷酸。
术语“多核苷酸”和“核酸”在此可互换使用，并且指的是脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物和/或其类似物、衍生物、变体、片段、或其组合，包括但不限于DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、初级和前体微小RNA、其他非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、其扩增子、或它们的任何组合。通过非限制性举例的方式，核酸的来源可选自下组，该组由以下各项组成：合成的、哺乳动物的、人类的、动物的、植物的、真菌的、细菌的、病毒的、古生菌来源或其任意的组合。
术语“寡核苷酸”典型地是指一种DNA片段或含有DNA的核酸分子、或RNA或含有RNA的分子、或它们的组合。寡核苷酸可由此包括或是由以下各项组成：脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸碱基和/或其类似物、衍生物、变体、片段、或其组合，包括但不限于DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、初级和前体微小RNA、其他非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、其扩增子、或它们的任何组合。寡核苷酸的实例包括核酸靶标；底物，例如可被具有裂解、连接酶或其他酶活性的DNA核酶或MNA酶修饰的底物；引物，如供通过如PCR等方法进行体外靶标扩增使用的引物；以及MNA酶组分，包括但不限于部分酶，和组装易化子。
术语“嘧啶核苷酸”涵盖任何包括一个嘧啶碱的核苷酸，该嘧啶碱包括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。嘧啶核苷酸可包括一个核糖分子（即“嘧啶核糖核苷酸”）或一个脱氧核糖分子（即“嘧啶脱氧核糖核苷酸”）。
术语“嘌呤核苷酸”包含任何包括一个嘌呤碱的核苷酸，该嘌呤碱包括但不限于腺嘌呤和鸟嘌呤。嘌呤核苷酸可包括一个核糖分子（即“嘌呤核糖核苷酸”）或一个脱氧核糖分子（即“嘌呤脱氧核糖核苷酸”）。
术语“核酸酶”、“催化性核酸”、“具有催化活性的核酸”以及“催化性核酸酶”可在此互换使用，并且其含义应是：可与至少一种底物结合并且对该至少一种底物的修饰（如连接或裂解）进行催化的一种DNA或含有DNA的分子或复合物或是一种RNA或含有RNA的分子或复合物、或者是它们的组合（即一种DNA-RNA杂交分子或复合物）。在催化性核酸中的核苷酸残基可包括碱基A、C、G、T和U及其衍生物和类似物。上述术语中包括单分子核酸酶，该单分子核酸酶可包括：可识别至少一种底物并且对该至少一种底物的修饰（如连接或裂解）进行催化的一种单一DNA或含有DNA的分子（在本领域中还称为“DNA酶”、“脱氧核酶”或“DNA核酶”）或一种RNA或含有RNA的分子（在本领域中还称为“RNA酶”或“核酶”）或它们的一种组合（即一种DNA-RNA杂交分子）。上述术语包括核酸酶，该核酸酶包括可识别至少一种底物并且对该至少一种底物的修饰（如连接或裂解）进行催化的一种DNA或含有DNA的复合物或是一种RNA或含有RNA的复合物或它们的一种组合（即一种DNA-RNA杂交复合物）。术语“核酸酶”、“催化性核酸”、“具有催化活性的核酸”和“催化性核酸酶”，其含义中包括MNA酶。
如在此使用的术语“MNA酶”和“多组分核酸酶”具有相同的含义，并且是指两种或更多种寡核苷酸序列（例如部分酶），这些寡核苷酸序列只在MNA酶组装易化子（例如靶标）的存在下才能形成一种能够对底物进行催化性修饰的活性核酸酶。MNA酶可催化一系列的反应，包括底物的裂解、底物的连接、以及一种或多种底物的其他酶法修饰。在图1中描绘出一种示例性的MNA酶，包括具有裂解活性的部分酶A和部分酶B。具有内切核酸酶或裂解活性的MNA酶还可称为“MNA酶裂解剂”。参照图1，部分酶A和B各自通过沃森-克里克碱基配对而结合至组装易化子（例如靶标DNA或RNA序列）。只有当部分酶A和B的感应臂邻近于彼此在组装易化子上杂交时，MNA酶才能形成。MNA酶的底物臂与底物相接合，其修饰（例如裂解）是由MNA酶的催化核心催化的，是通过部分酶A和B的催化结构域的相互作用而形成的。在图中对DNA/RNA嵌合体报告底物的裂解进行了例示。MNA酶在荧光团与猝灭剂染料对之间裂解底物，由此产生信号。术语“多组分核酸酶”和“MNA酶”包括由两个分子组成的二联结构、或由三个核酸分子组成的三联结构、或其他多联结构，例如由四个或更多个核酸分子组成的多联结构。
应理解的是，如在此使用的术语“MNA酶”和“多组分核酸酶”涵盖所有已知的MNA酶以及经修饰的MNA酶，包括在以下任何一个或多个文件中披露的那些MNA酶：PCT专利公开号WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084以及相关的美国专利公开号2007-0231810、2010-0136536和2011-0143338（各文件的内容是通过引用以其全文结合在此的）。被术语“MNA酶”和“多组分核酸酶”涵盖的MNA酶和经修饰的MNA酶的非限制性实例包括：具有裂解催化活性的MNA酶（如在此例示的）、包括一个或多个组装抑制剂的去组装的或部分组装的MNA酶、包括一个或多个适配子的MNA酶（“apta-MNA酶”）、包括一个或多个截短感应臂以及任选的一个或多个稳定化寡核苷酸的MNA酶、包括一个或多个活性抑制剂的MNA酶、多组分核酸失活酶原（MNAi）、以及具有连接酶催化活性的MNA酶（“MNA酶连接酶”），上述各MNA酶在下述一个或多个文件中进行了详细的描述：WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084、US2007-0231810、US2010-0136536和/或US2011-0143338。
如在此使用的，术语“部分酶”、“组分部分酶”、“部分酶组分”、“组分寡核苷酸”、“寡核苷酸组分”和“寡核苷酸部分酶”是指含有DNA的或含有RNA的或含有DNA-RNA的寡核苷酸，其中的两个或更多个只在如在此所定义的MNA酶组装易化子的存在下才能一起形成“MNA酶”。在某些优选实施例中，一种或多种组分部分酶，并且优选地至少两种，可包括三个区或结构域：一个“催化”结构域，形成可对修饰进行催化的催化核心的一部分；一个“感应臂”结构域，可与一种组装易化子关联和/或结合；以及一个“底物臂”结构域，可与一种底物关联和/或结合。这些区或结构域的展示显示在图1中。部分酶可包括至少一种附加组分，包括但不限于适配子，在此称为“apta-部分酶”。部分酶可包括多种组分，包括但不限于，一种具有截短感应臂和稳定臂组分的部分酶组分，稳定臂组分可通过与组装易化子或底物相互作用而稳定MNA酶的结构。
如在此使用的术语“组装易化子分子”、“组装易化子”、“MNA酶组装易化子分子”和“MNA酶组装易化子”指的是一些可通过与MNA酶感应臂相互作用而促进组分部分酶自组装而形成催化活性MNA酶的实体。如在此使用的，组装易化子可促进具有裂解、连接酶或其他酶活性的MNA酶的组装。在优选实施例中，需要组装易化子用于MNA酶的自组装。组装易化子可包括可与一个或多个寡核苷酸“部分酶”的感应臂相配对或结合的一种分子、或两种或更多种“组装易化子组分”。组装易化子可以是一种靶标。靶标可以是一种核酸，该核酸选自下组，该组由以下各项组成：DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体微小RNA和初级微小RNA、其他非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、扩增子、或它们的任何组合。核酸可以被扩增。扩增可以包括以下项中的一个或多个：聚合酶链式反应（PCR）、链置换扩增、环介导等温扩增、滚环扩增、转录介导的扩增、自动维持序列扩增、连接酶链式反应、基于核酸序列的扩增或逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。
“组装易化子组分”是这样一种分子，该分子可用于控制活性MNA酶的组装或促进从失活MNA酶组分到活性MNA酶的转变。
如在此使用的术语“靶标”包括任何天然的或合成的实体、成分或分析物，旨在通过一种使用特定核酸酶（如一种或多种MNA酶）的方法（具有或没有另外的扩增步骤和/或级联）而被检测、鉴别或定量。因此，靶标涵盖最广泛的可检测实体、成分或分析物，对于它们所希望的是灵敏的检测、鉴别和/或定量的方法。一些示例性靶标包括但不限于核酸、蛋白质、多肽、肽、糖蛋白、脂类、脂蛋白、整个生物体、细胞、病毒、细菌、古生菌、酵母、真菌、抗体、代谢产物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或其任何衍生物、部分或组合。还考虑在此使用其他靶标。应该理解，该靶标还可以是一种组装易化子或者组装易化子组分。
“可检测效应”是作为一种或多种底物的修饰已经发生的指征而可被检测或定量的效应。效应的大小可以指示输入物的量，这种输入物例如组装易化子（例如一种靶标）。可通过多种方法对可检测效应进行检测，包括荧光光谱法、表面等离子共振法、质谱法、NMR、电子自旋共振、偏振荧光光谱法、圆二色性、免疫测定、层析法、放射性测量、光度测量、闪烁扫描术、电子法、UV、可见光或红外光谱法、酶法、或它们的任何组合。
如在此使用的术语“多核苷酸底物”和“底物”包括任何脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物或其类似物、衍生物、变体、片段、或其组合，包括但不限于DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、初级和前体微小RNA、其他非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、其扩增子、或它们的任何组合（包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸碱基的混合聚合物），它们可被一种包括催化性核酸酶的酶识别、作用或修饰。“多核苷酸底物”或“底物”可被多种酶活性修饰，这些酶活性包括但不限于裂解或连接。“多核苷酸底物”或“底物”的修饰可为监测酶的催化活性而提供一种“可检测效应”。
如在此使用的“报告底物”是一种特别适用于协助对底物的消失或对催化反应相关产物的出现进行测量的底物。报告底物可在溶液中是游离的或是例如与一个表面或另一种分子结合的（或“连接的”）。报告底物可通过多种手段中的任何一种进行标记，包括例如荧光团（带有或没有一种或多种附加组分，如猝灭剂）、放射活性标记，生物素（例如生物素化）或化学发光标记。
如在此使用的，“一般底物”或“通用底物”是一种例如报告底物的底物，这种底物可被多种MNA酶识别或催化性地作用，各MNA酶可识别不同的组装易化子。此类底物的使用有利于使用均可识别通用底物的结构相关性MNA酶来开发用于多种组装易化子的检测、鉴别或定量的不同测定法。这些通用底物各自可用一种或多种标记单独地进行标记。在优选实施例中，可使用可单独检测的标记来对一个或多个通用底物进行标记，以允许形成一种用于使用MNA酶来独立地或同时地检测多种组装易化子的方便的系统。在一些实施例中，由MNA酶裂解的底物可使用一种MNA酶或DNA核酶连接酶来重建并且由此回收。在一些实施例中，由MNA酶裂解或连接的一种或多种底物可被进一步用作另外的一种或多种MNA酶或一种或多种DNA核酶的组分或调节剂。
在一些实施例中，“通用底物”可被连接到固体载体的不同位置上，以提供一个底物阵列。在此类实施例中，可用相同的荧光团将被连接的通用底物全部标记。在某些情况中，各通用底物仅可以被一种MNA酶裂解，该MNA酶是在特异性MNA酶组装易化子分子的存在下形成，并且信号可通过将底物置于该表面上而定位，因此允许不同组装易化子的特异性检测。
术语“产物”是指作为底物的酶修饰的结果而产生的一种或多种新分子。如在此使用的，术语“裂解产物”是指作为酶的裂解结果或内切核酸酶活性的结果而产生的新分子。术语“连接产物”是指作为由酶对底物的连接的结果而产生的新分子。
如在此使用的，术语“解链温度”和“Tm”在本发明的多核苷酸底物的背景中的使用将被理解成是参考如使用华莱士律计算而得到的解链温度（Tm），借此Tm=2℃（A+T）+4℃（G+C）（见华莱士等人（1979），《核酸研究》（Nucl.Acids Res.）6（11）：3543-3558），除非另外确切指出。
如在此使用的，术语“碱基”将被理解成是涵盖与碱基附接的整个核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
缩写
下述缩写在此使用，并在全部说明书中使用：
MNA酶：多组分核酸酶或多联体核酸酶；
DNA核酶：脱氧核糖核酸酶；
核酶：核糖核酸酶；
部分酶：含有寡核苷酸的部分酶
PCR：聚合酶链式反应；
qPCR：实时定量PCR；
NF-H2O：无核酸酶的水；
LNA：锁核酸；
F：荧光团；
Q：猝灭剂；
N=A、C、T/U、G或其任何类似物；
N’=任何与N互补的或能与N进行碱基配对的核苷酸；
（N）x：任何数量的N；
（N’）x：任何数量的N’；
W：A或T；
R：A、G或AA；
rN：任何核糖核苷酸；
（rN）x：任何数量的rN；
rR：A或G核糖核苷酸；
rY：C或U；核糖核苷酸
M：A或C；
H：A、C或T/U；
D：G、A或T/U；
JOE或6-JOE：6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素；
FAM或6-FAM：6-羧基荧光素。
BHQ1：黑洞（Black Hole）猝灭剂1
BHQ2：黑洞（Black Hole）猝灭剂2
IB：爱荷华黑（Iowa Black）FQ
IBR：爱荷华黑（Iowa Black）RQ
shRNA：短发夹RNA
siRNA：短干扰RNA
mRNA：信使RNA
tRNA：转运RNA
snoRNA：小核仁RNA
stRNA：小时序RNA
smRNA：小分子调节RNA
pre-microRNA：前体微小RNA
pri-microRNA：初级微小RNA
UV：紫外线
示意性实施方案的详细说明
应理解的是，在开始时，在此提供的附图和实例是举例说明，而不是对本发明及其不同的实施例进行限制。
对于具有可利于改进催化性核酸功能的特性的催化性核酸底物存在着一种需求。具体地，许多涉及MNA酶和DNA核酶的应用将显著地获益于新的通用底物家族的提供，且这些通用底物家族具有提高的由具有相同或不同的靶标专一性的不同MNA酶进行催化性修饰的能力。例如，这些底物家族将有利于提高涉及MNA酶的多重测定的效率和/或准确性。另外的通用底物尤其可用在通过将底物连接至固体载体而生成底物阵列的应用中。
本发明提供了用于产生以下通用寡核苷酸底物的一组指导方针：这些通用寡核苷酸底物在一个宽广温度范围内具有被高效催化性修饰（例如裂解）的较高的可能性，在升高的温度下性能得以改进。这些指导方针包括但不限于下述内容的任何一个或多个：（i）在两个中心核糖核苷酸周围的十个碱基中有七个或七个以上胞嘧啶核苷酸；（ii）与这两个中心核糖核苷酸紧紧相邻的碱基是胞嘧啶（N8和N9）；（iii）寡核苷酸底物的嘧啶总含量大于64%；（iv）寡核苷酸底物的总Tm是66℃或更高，适用于由核酸酶对寡核苷酸底物的催化性修饰（例如裂解）高于50℃的条件下；和/或（v）在两个中心核糖核苷酸周围的10个碱基中的较少量的鸟嘌呤核苷酸（例如三个、两个、一个或没有）。
这些指导方针的开发有利于对具有增加催化性核酸功能的特征的催化性核酸酶底物的开发。已经明确，对在由给定核酸酶靶向的底物内的一种或多种核苷酸的催化性修饰，可以由靠近于被催化性修饰的核苷酸的某些特异性核苷酸的存在来加强。
相应地，本发明的某些方面涉及用于催化性核酸酶的多核苷酸底物。多核苷酸底物可以包括由靶向于底物的核酸酶进行催化修饰的一个或多个核苷酸的5'（即上游）和/或3'（即下游）的一系列嘧啶核苷酸。嘧啶核苷酸可以是胞嘧啶核苷酸。
本发明的其他方面涉及如在此所述的作为核酸酶（例如DNA核酶、核酶或MNA酶）的底物的多核苷酸底物的用途。在某些实施例中，这些底物用作MNA酶的底物。在某些实施例中，这些底物用作DNA核酶的底物。
本发明的另外一些方面涉及用于检测靶标分子的方法。这些方法包括对如在此所述的多核苷酸底物进行修饰来提供一种可检测效应。在某些实施例中，这些方法包括使用一种能够检测靶标的MNA酶对多核苷酸底物进行修饰。
本发明的另外一些方面涉及包括如在此所述的一种或多种多核苷酸底物的试剂盒。这些试剂盒可包括一种能够对一种或多种底物进行催化性修饰的核酸酶。在某些实施例中，该核酸酶可以是一种MNA酶。
1.一种或多种催化性核酸酶底物
本发明提供了用于催化性核酸酶的多核苷酸底物。本发明还提供了底物家族，其成员具有提高的由具有相同或不同靶标专一性的不同核酸（例如MNA酶）进行催化修饰的能力。
多核苷酸底物包括至少一个可被催化性核酸酶修饰的序列基序。对于可修饰本发明的多核苷酸底物的催化性核酸酶的特定类型不存在限制。序列基序可包括以下项中的任何一个或多个：至少一种DNA核苷酸、至少一种RNA核苷酸、至少一种DNA核苷酸类似物以及至少一种RNA核苷酸类似物。
合适的序列基序的非限制性实例包括被以下酶识别并修饰的序列基序：DNA核酶（例如10-23DNA核酶；8-17DNA核酶；“7Z81”、“7Z48”和“7Q10”DNA核酶连接酶；“UV1C”胸腺嘧啶二聚体光逆转DNA核酶、“DAB22”碳-碳键形成DNA核酶；及其衍生物）、核酶（例如锤头核酶；同源二聚体核酶、异源二聚体核酶；及其衍生物）、以及MNA酶（参见例如，在PCT专利公开号WO/2007/041774、WO/2008/040095和WO2008/122084以及相关的美国专利公开号2007-0231810、2010-0136536以及2011-0143338中所述的MNA酶；将这些文件各自通过引用以其全文结合于此）。
合适的序列基序的非限制性实例包括下表1中所列出的那些。
表1：示例性催化性基序
催化性酶 底物催化基序
8-17DNA核酶 (N')x (rN)xG(N')x
10-23DNA核酶 (N')x rR rY(N')x
N=A、C、T、G或任何类似物；N'=与N互补的任何核苷酸；(N)x或(N’)x=任何数量的核苷酸；W=A或T；R=A，G或AA；rN=任何核糖核苷酸碱基；(rN)x=任何数量的核糖核苷酸；rR=A或G核糖核苷酸；rY=C或U核糖核苷酸；M=A或C；H=A，C或T；D=G，A或T
已经显示，催化性核酸只能耐受在形成催化核心的区域中的某些修饰（佩罗等人，1990年《自然》（Nature）344（6266）：565-7.；佩罗等人，1991年《生物化学》（Biochemistry）30（16）：4020-5；扎博罗夫斯卡（Zaborowska）等人，2002年，《生物化学杂志》（J Biol Chem）277（43）：240617-22；克鲁兹等人，2004年，《生物化学》（Chem Biol.）一月；11（1）：57-6；西尔弗曼，2004《生物化学》（Chem Biol.）一月；11（1）：7-8）。在表2中列出了对DNA核酶的催化活性负责的序列的实例。
表2：某些活性DNA核酶及其底物的示例性序列
多核苷酸底物可包括多种序列基序。基序可被一种类型的催化性核酸酶识别和修饰。可替代地，在底物内的不同序列基序可被不同类型的催化性核酸酶识别并修饰。
如上文所指出的，本发明的多核苷酸底物包括至少一个能够被催化性核酸酶修饰的序列基序。在一些实施例中，序列基序近侧的核苷酸是嘧啶核苷酸。例如，序列基序之前和/或之后（即跟随）的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸可以是嘧啶核苷酸。任何一个或多个嘧啶核苷酸可以是胞嘧啶核苷酸。
在其他实施例中，一个或多个嘧啶核苷酸直接位于序列基序之前和/或之后（即跟随）（即是连续序列）。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个嘧啶核苷酸的序列可直接位于序列基序之前和/或之后。任何一个或多个嘧啶核苷酸可以是胞嘧啶核苷酸。
在进一步的实施例中，在序列基序5′（即上游）的十个核苷酸之内和/或在3′（即下游）的十个核苷酸之内的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸是嘧啶核苷酸。任何一个或多个嘧啶核苷酸可以是胞嘧啶核苷酸。
在再进一步的实施例中，多核苷酸底物的多于9个、多于10个或多于11个核苷酸可以是胞嘧啶核苷酸。例如，该底物可包括10、11、12、13、14、15个或多于15个核苷酸或由其组成，并且这些核苷酸中的9、10、11个或多于11个可以是胞嘧啶核苷酸。
另外地或可替代地，多核苷酸底物的少于5个、少于4个、少于3个或少于2个核苷酸可以是鸟嘌呤核苷酸。例如，该底物可包括10、11、12、13、14、15个或多于15个核苷酸或由其组成，并且这些核苷酸中的4、3、2、1个可以是鸟嘌呤核苷酸或都不是鸟嘌呤核苷酸。
对于本发明的多核苷酸底物的长度不存在具体的限制。例如，底物的长度可以是小于100、75、50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个核苷酸。例如，底物的长度可以是在5和30个核苷酸之间、10和15个核苷酸之间、10和20个核苷酸之间、10和25个核苷酸之间、10和30个核苷酸之间、16和23个核苷酸之间、16和21个核苷酸之间、16和18个核苷酸之间、18和21个核苷酸之间、18和23个核苷酸之间、或21和23个核苷酸之间。
本发明的多核苷酸底物可以被设计成具有采用华莱士律计算而得的特定的解链温度（Tm），借此Tm=2℃（A+T）+4℃（G+C）（参见华莱士等人（1979）《核酸研究》（Nucl.AcidsRes.）6（11）：3543-3558）。在某些实施例中，该底物可被MNA酶识别并催化修饰，并且被MNA酶的一个或多个部分酶底物臂结合的碱基的Tm可在大约52℃与大约76℃之间、大约55℃与大约75℃之间、大约60℃与大约70℃之间、大约65℃与大约70℃之间、大约64℃与68℃之间、或64℃与70℃之间（采用华莱士律进行计算）。
在其他实施例中，底物可被MNA酶或DNA核酶识别并催化修饰，并且被MNA酶的一个或多个部分酶底物臂结合的碱基的Tm可在68℃和90℃之间、66℃和76℃之间、68℃和76℃之间、64℃和70℃之间、70℃和76℃之间、70℃和75℃之间、之间72℃和76℃之间、52℃、58℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃或76℃。
只通过非限制性举例的方式，本发明的一种多核苷酸底物可以包括由SEQ ID NO：25-27、29-30、72-90或172-175中的任何一个或多个所限定的序列。在某些实施例中，多核苷酸底物可以由SEQ ID NO：25-27、29-30、72-90或172-175中的任何一个或多个所限定的序列组成。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸底物可以包括由SEQ ID NO：28所限定的序列。在其他实施例中，多核苷酸底物可以由SEQ ID NO：28所限定的序列组成。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸底物能够被包括两种寡核苷酸部分酶的MNA酶催化性地修饰。多核苷酸底物和寡核苷酸部分酶的序列可以是在表6、8、10、13、16、20、22和/或24中所示的三种序列（如由SEQ ID NO所描绘的）的任何特定组合。
在其他实施例中，本发明的多核苷酸底物能够被DNA核酶催化性修饰。该多核苷酸底物与该DNA核酶的序列可以是在表15中所示的任何特定对的序列（如由SEQ ID NO所描绘的）。
本发明的多核苷酸底物可包含本领域的技术人员熟知的一种或多种取代物，如类似物、衍生物、被修饰或改变的碱基、核糖核苷酸，糖或磷酸主链的改变、各种缺失、插入、取代、重复或其他修饰，或这些的任何组合。
添加或取代的非限制性实例包括LNA亚磷酰胺、4-乙酰基胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、2'-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基硫代尿苷、二氢尿苷、2'-O-甲基假尿苷、βD-半乳糖辫苷（beta D-galactosylqueosine）、2'-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氨基甲基尿苷、5-甲氧氨甲基-2-硫代尿苷、βD-甘露糖甲基尿苷、5-甲氧羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-核糖呋喃糖基-2-甲硫基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-核糖呋喃糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨基甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-羟乙酸甲酯、尿苷-5-羟乙酸（v）、怀丁氧苷（wybutoxosine）、假尿苷、辫苷（queosine）、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-核糖呋喃糖基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、怀丁苷（wybutosine）、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、βD-阿糖尿苷、以及βD-阿糖胸苷。
衍生物的非限制性实例包括功能相当的核酸或核苷酸，包括任何一起形成的融合分子（例如通过重组手段）或通过后合成加入（例如通过化学手段）。此类融合可包括具有加入其中的或与多肽（例如嘌呤霉素或其他多肽）、小分子（例如补骨脂素）、微载体或纳米载体、或抗体相轭合的RNA或DNA的本发明的寡核苷酸。
类似物的非限制性实例包括具有与DNA或RNA分子或残基相关的物理结构的化合物，并且可以能够与DNA或RNA残基或其类似物形成氢键（即它能够与DNA或RNA残基或其类似物进行退火来形成碱基对），但是这种结合不是有待被涵盖在术语“类似物”之内的所述化合物所需要的。此类类似物可以对与其结构性相关的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸残基具有不同的化学和生物特性。甲基化的、碘化的、溴化的或生物素化的残基是类似物的实例。已经描述的活性DNA核酶含有核苷酸类似物，包括脱氧肌苷、C-5-咪唑脱氧尿苷、3-(氨基丙烯基)-7-脱氮-dATP、2’-O-甲基RNA、2’O-甲基帽。其他类似物还可与DNA核酶和MNA酶的催化活性相容。具有催化活性的核酸的改变，例如通过用一种碱基取代另一种碱基、通过用一种类似物取代一种碱基、或糖组分或磷酸二酯主链的改变，对于本领域的技术人员而言是直截了当的。例如，可在合成期间进行改变，或通过在合成之后对特异性碱基的修饰而进行改变。与如碱基改变或碱基类似物等改变结合的催化性核酸的实证检验允许对改变的序列或特异性类似物对催化活性的影响进行评估。碱基A、C、G、T和U的类似物是本领域已知的，并且其子集在表3中列出。
表3：示例性的核苷酸类似物
本发明的多核苷酸底物可与其他实体结合，例如标记的核酸、纳米颗粒、微粒、蛋白质、抗体、RNA、DNA、核酸类似物、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体、或它们的任何组合。纳米颗粒可以是金纳米颗粒。
本发明的多核苷酸底物可被一种催化性核酸酶催化性地修饰。潜在的催化性修饰的非限制性实例包括核酸的裂解、核酸的连接、核酸的磷酸化作用、核酸加帽、氨基酸的腺苷酰化、辅因子合成、RNA聚合、模板定向聚合、RNA-蛋白质轭合、醛醇缩合反应、醇的氧化反应、乙醛还原、嘌呤和嘧啶核苷酸合成、烃化、酰胺合成、尿素合成、肽键的形成、肽基-RNA合成、酰基迁移、氨酰化、碳酸酯水解、硫代磷酸烷基化、卟啉金属化、碳-碳键的形成、Pd纳米粒子的形成、联苯异构化、酯键的形成、酰胺键的形成、DNA去糖基化、胸腺嘧啶二聚体的光逆转、以及氨基磷酸酯裂解。
在某些应用中，希望能对由本发明的多核苷酸底物的催化性修饰而得到的一种或多种产物进行检测。这可以使用任何数量的本领域中已知的标准技术来实现。
例如，底物可包括可检测部分和猝灭剂部分，其中在由催化性核酸对所述底物进行修饰时，由所述可检测部分提供的可检测效应得以升高或降低。可通过以下方法对可检测效应进行检测：荧光光谱法、表面等离子共振法、质谱法、NMR、电子自旋共振、偏振荧光光谱法、圆二色性、免疫测定、层析法、放射性测量、电化学、光度测量、闪烁扫描术、电子法、UV、可见光或红外光谱法、酶法、或它们的任何组合。
另外地或可替代地，由本发明的多核苷酸底物的催化性修饰所生成的一种或多种产物可以基于以下项被检测：大小（例如通过标准电泳）、核酸测序、荧光共振能量转移、化学发光、电位测定法、质谱分析法、等离子共振、比色法、偏振测定、流式细胞术、扫描测定法、以及DNA测序、或它们的任何组合。
由本发明的多核苷酸底物的催化性修饰而得到的一种或多种核酸产物可被扩增，以便使用例如像聚合酶链式反应（PCR）来辅助检测。
本发明的多核苷酸底物可被催化性核酸酶（例如MNA酶）识别和修饰，这些催化性核酸酶被设计为对不同于有待被该酶修饰的底物的靶标进行检测。相应地，本发明的多核苷酸底物可以是“一般的”或“通用的”底物，可被多种催化性核酸酶（例如多种MNA酶）识别并催化性地作用，各个催化性核酸酶可识别不同的靶标。此类底物的使用有利于使用可识别通用底物的催化性核酸酶来开发用于多种靶标的检测、鉴别或定量的不同测定法。这些通用底物各自可用一种或多种标记独立地进行标记。在某些实施例中，可以使用可独立检测的标记来对一种或多种通用底物进行标记，以允许使用MNA酶对各种各样的靶标进行单独或同时检测。例如，可在一个多重反应中使用一系列通用底物，允许对多个靶标进行同时检测。
本发明的多核苷酸底物可以被设为与一种不溶性的或固体载体结合、附接或连接，以用于不同的应用中（例如酶促级联或任何其他信号转导级联）。该载体可以是不溶性材料，或是一种可保持底物并使其不能在反应混合物主体中自由移动的基质。在本领域中已知此类载体可使包括核酸靶标的底物固定或定位。有技能的读者将会领会到，该载体可选自于多种多样的以多种形式存在的基质、聚合物等等，这些形式包括可方便地用在微量测定法中的珠粒，以及与该反应条件相容的其他材料。在某些优选实施例中，载体可以是一种塑料材料，如塑料珠或晶片，或在其中可进行特定测定的孔或管。在某些实施例中，载体可以是一种微载体或纳米载体。底物与载体的附接可被设计成，使得在催化性核酸（例如MNA酶）对底物修饰（例如裂解）时，被修饰的底物的一部分保持附接至载体，而其他部分则远离保持附接的部分游离而移动进入反应混合物主体中。
2.示例性方法
本发明的多核苷酸底物可用在任何数量的使用了可对底物进行识别/修饰的催化性核酸的潜在应用中。
例如，底物可用在涉及以下酶的应用中：DNA核酶（例如10-23DNA核酶；8-17DNA核酶；“7Z81”、“7Z48”和“7Q10”DNA核酶连接酶；“UV1C”胸腺嘧啶二聚体光逆转DNA核酶、“DAB22”碳-碳键形成DNA核酶；及其衍生物）、核酶（例如锤头核酶；同源二聚体核酶、异源二聚体核酶；及其衍生物）、和/或MNA酶。
在本发明的某些实施例中，底物可以用作MNA酶的底物。MNA酶的特征以及使用MNA酶的多种应用在以下文件中被详细描述：PCT专利公开号WO/2007/041774、WO/2008/040095和WO2008/122084，以及相关的美国专利公开号2007-0231810、2010-0136536和2011-0143338（这些文件各自的内容是通过引用以其全文结合在此的）。
MNA酶能够由两个或更多个寡核苷酸组分（在此还称为部分酶）自组装。在MNA酶自组装易化子的存在下，部分酶寡核苷酸进行自组装而形成一种MNA酶。因此，MNA酶是催化活性核酸酶。在一些实施例中，MNA酶的存在可被检测到，并且指示靶标的存在，因为MNA酶只有在靶标的存在下才能形成，其中靶标包括组装易化子。
在优选实施例中，MNA酶结构是基于一种或多种DNA核酶和/或核酶。更优选的是基于特定DNA核酶结构的那些MNA酶结构。目前优选的结构是基于包括10-23和8-17DNA核酶的DNA核酶。在不同的实施例中，MNA酶包括核糖核苷酸碱基和脱氧核糖核苷酸碱基中的任一者或两者。在更优选的实施例中，MNA酶结构至少部分地是基于DNA核酶的结构。在其他优选实施例中，MNA酶包括至少一些脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。在更优选的实施例中，MNA酶的催化核心包括一个或多个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。在仍更优选的实施例中，在底物的催化中涉及一个或多个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。在其他实施例中，在催化核心中的至少一种脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物改进了催化活性。在又另外的实施例中，对于在MNA酶的催化核心中的至少一种脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物具有严格的要求，以便使得分析可在相对于不含所存在的脱氧核糖核苷酸碱基的可比的MNA酶而言的可测速度下发生。
MNA酶可包含本领域技术人员熟知的一种或多种取代物，如类似物、衍生物、被修饰或改变的碱基、核糖核苷酸，糖或磷酸主链的改变、各种缺失、插入、取代、重复或其他修饰，或这些的任何组合。此类修饰、取代、缺失、插入等等可在感应和/或底物臂中和/或在催化核心部分上进行，这样该分子可保留催化活性。对将底物或组装易化子结合的这些臂的取代和修饰可以是良好耐受的，并且事实上是允许这些分子适应于不同底物/组装易化子的基础。例如，感应臂的修饰将使其适应于不同的组装易化子，而底物臂的修饰将使其适应于不同的底物。
MNA酶可包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者甚至包括两者。包括至少一个、并且更优选全部是脱氧核糖核苷酸组分寡核苷酸的MNA酶是优选的。还优选的是，MNA酶在MNA酶的催化核心内包括至少一个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。甚至更为优选的是其中需要这样一种用于催化活性的碱基的那些实施例。
还可通过改变微环境而控制MNA酶组装和去组装。此类改变的实例包括但不限于温度、二价阳离子类型和浓度、盐浓度、pH、添加剂、以及对于活性MNA酶的组装和/或活性至关重要的关键组分的存在或不存在。相应地，通过调整微环境，可防止去组装的或部分组装的MNA酶在组装易化子的存在下组装成为催化活性MNA酶，由此提供了一种“分子开关”。
在图1中描绘了MNA酶结构的一个基本实例。显示的结构包括部分酶A和部分酶B，其感应臂（i）已经与MNA酶组装易化子分子（例如靶标DNA或RNA）进行了碱基配对。通过与组装易化子相互作用，部分酶A和B可使得部分催化核心（iii）相互靠近，并由此形成一个单一催化核心。MNA酶的底物臂（ii）已经与一种在此描绘的作为报告底物的底物进行相互作用并且进行碱基配对。因此，MNA酶已经自组装，并且此过程是通过MNA酶组装易化子分子的存在来促进的。在没有组装易化子的情况下，不形成MNA酶。本发明的多核苷酸底物的修饰（在这种情况下是裂解）是由MNA酶的催化核心在MNA酶修饰位点（例如由叉（X）所表示的在底物内的裂解位点）催化的。在这个具体实施例中的多核苷酸底物包括一个可检测部分以及一个猝灭剂部分Q，该可检测部分具有一种可检测信号，例如荧光团F，该猝灭剂部分可通过猝灭剂Q的作用而对可检测信号F具有猝灭效应。在MNA酶裂解位点处发生裂解时，可检测信号大幅增加，在这里为可被轻易检测和定量的荧光信号。
图1可进一步被理解为描绘了使用MNA酶来检测靶标的基本方法的实例，该靶标在一些实施例中包括组装易化子。更确切地说，部分酶A和部分酶B显示在图1中，各自包括一个底物臂部分（ii）、一个催化核心部分（iii）以及一个感应臂部分（i）。在靶标的存在下，部分酶A和部分酶B的感应臂部分可开始与靶标（如DNA或RNA序列）的互补部分进行杂交和碱基配对。在以这种方式接触靶标时，MNA酶自组装而形成催化核心，该催化核心可对被底物臂结合的底物进行修饰。优选的是，可通过对催化活性的检测或测量而对MNA酶的存在进行检测。通过底物臂上的互补序列与底物的相互作用，被组装的MNA酶的底物臂可与本发明的多核苷酸底物相接合。一旦底物与底物臂这样接合，催化核心可促进底物的修饰（例如裂解），随后可直接或间接地对其进行测量或检测。
熟练的业内人士将易于领会到，在此所述的这些方法可涉及在MNA酶催化活动之间、之中或之后对靶标进行的扩增。这种靶标扩增在本发明的其中旨在被检测、鉴别或定量的靶标的量具有提供信号的这样的量额（否则信号不能被检测到）的实施例中具有特别的应用。这种扩增可包括以下项中的一种或多种：：聚合酶链式反应（PCR）、链置换扩增（SDA）、环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）、转录介导的扩增（TMA）、自动维持序列扩增（3SR）、基于核酸序列的扩增（NASBA）或逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。
图2提供了使用MNA酶进行靶标检测的方法的示例性应用。策略1对适于对靶标（包括DNA、RNA和蛋白质）进行检测的MNA酶进行了举例说明。如上所述的（见图1的说明），当寡核苷酸识别靶标并与之结合时，形成了一种由两种具有识别靶标和底物的序列的单独的寡核苷酸组成的MNA酶。该底物，例如报告底物，可被MNA酶的催化活性修饰，并且直接地（策略1）、在靶标扩增期间或之后（策略2）、或通过信号级联（策略3）导致了可检测信号的生成。在一些实施例中，靶标和信号扩增同时或先后发生。
图2的策略2对适于在核酸靶标的体外扩增期间或之后的扩增子的累积进行监测的MNA酶的使用进行了举例说明。核酸序列的体外扩增技术是本领域已知的。这些包括由DNA聚合酶介导的技术，如聚合酶链式反应（“PCR”）（参见例如美国专利号4,683,202；美国专利号4,683,195；美国专利号4,800,159；美国专利号4,965,188；美国专利号5,176,995）、链置换扩增（“SDA”）、滚环扩增（“RCA”）、逆转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR）以及环介导等温扩增（“LAMP”）。其他靶标扩增技术是由RNA聚合酶介导的，例如转录介导的扩增（“TMA”）、自动维持序列扩增（“3SR”）和基于核酸序列复制的扩增（“NASBA”）。由PCR、RT-PCR、SDA、RCA和LAMP生成的扩增产物（“扩增子”）是由DNA组成的，而RNA扩增子是由TMA、3SR和NASBA生成的。
进一步参照图2的策略2，对本发明的多核苷酸底物进行识别并修饰的MNA酶可以用于与靶标扩增方法结合，这些方法包括例如前述的PCR、RT-PCR、SDA、RCA、LAMP、TMA、3SR和NASBA。使用不对称的或对称的引物比率通过PCR生成的扩增子的累积可以采用MNA酶来进行监测。本说明书的实例1、2、4、6、8和9证实，PCR扩增子的实时检测采用了可对本发明的不同的多核苷酸底物进行催化性修饰的MNA酶。
再次参照图2的策略2，可根据用于扩增核酸（即DNA或RNA）的方法对靶标核酸进行扩增。优选地，使用体外扩增的标准方法。在扩增过程中产生的扩增子可作为MNA酶的靶标组装易化子。可通过MNA酶对本发明的多核苷酸底物的修饰而检测的MNA酶活性指示靶标的存在。熟练的业内人士将会领会到，可在单一容器中在允许靶标核酸扩增和MNA酶组装的条件下以及催化活性的条件下对这些性质进行测定。另外地或可替代地，可在靶标核酸扩增的时间点之后或在从始至终的时间点上，通过在扩增反应历程结束时或在其过程中将样品移除而进行这些测定。
图2的策略3显示了对一种使用MNA酶通过信号级联的使用来启动信号放大的方法的概述。本说明书的实例3证实了使用可对不同的本发明的多核苷酸底物进行催化性修饰的MNA酶对靶标的等温直接检测，这些MNA酶可用于启动信号级联。
有技能的读者将会领会到，将靶标扩增与催化性核酸活性结合的方法或方案可需要特异性的反应条件（例如在本说明书的实例1、2、4、6、8和9中所述的那些）。优选地，反应条件与聚合酶活性（用于扩增）以及催化性核酸对底物的修饰（用于检测）是相容的。用于确定在高温下并存的催化活性与聚合酶活性的条件（例如在PCR期间）的方案，已经在对DNA核酶的描述中进行了描述。在本领域中已知受以下因素的影响，这些因素包括：DNA核酶臂长、缓冲液、温度、二价离子浓度以及添加剂的效应。DNA酶适用于与体外扩增策略结合使用。例如，通过在扩增中高温暴露，可将它们不可逆地变性。
在某些实施例中，能够被MNA酶识别和修饰的本发明的多核苷酸底物可与一种不溶性的或固体载体结合、附接或连接。例如，参照图3的图（i），对一种使用MNA酶和锚定至载体的本发明的多核苷酸底物对靶标进行检测的示例性方法进行了描述。在这个实施例中，该底物优选是具有一个可检测部分以及一个猝灭剂部分的底物，该可检测部分包括可检测信号，例如荧光团，该猝灭剂部分可在该底物的可检测部分和猝灭剂部分互相靠近例如直到底物被修饰（例如被裂解）时使可检测信号减弱或消失。该底物是与一个载体附接的。优选地，该载体是一种不溶性材料，或是一种可保持底物并使其不能在反应混合物主体中自由移动的基质。底物与载体的附接可被设计成，使得当底物被MNA酶修饰（例如被裂解）时，可检测部分或猝灭剂部分（但不是两者同时）保持与载体的附接，而另一个部分则远离保持附接的部分游离而移动进入反应混合物主体。因此，在一个裂解的实例中，当在裂解时猝灭剂部分与可检测部分分离时，可检测信号大大增加。在图3的图（i）所示的实施例中，包含荧光团的可检测部分在裂解之后保持附接。这有益于使得信号在载体上定位，但是在某些例子中，这个或这些荧光团可释放进入溶液。在一个进一步的其中例如发生了连接的实施例中，猝灭剂可与荧光团连接，由此降低可检测信号。
在某些实施例中，多种通用底物可被连接到固体载体的不同位置上，以提供一个底物阵列。参照图3的图（ii），两种底物可被附接到固体表面的限定位置上。各通用底物可以只被一种MNA酶所裂解，该MNA酶在特异性MNA酶组装易化子分子（如靶标1或靶标2）的存在下形成，并且信号可通过将底物置于该表面上（位置1或位置2）而定位，由此允许不同组装易化子的特异性检测。在此类实施例中，可用相同的荧光团将被连接的通用底物进行全部标记。在其他实施例中，被连接的通用底物可用不同的荧光团进行标记。在图3（ii）中描绘的策略可被延伸而生成通用底物阵列，该底物阵列具有被附接在固体表面的限定位置上的许多不同的通用底物。此类实施例中，在阵列中可用的通用底物的数量增加可通过允许生成更多的复合物阵列来提供优点。此类通用底物阵列可在对靶标分析物的高度多重分析的使用中具有实用性。本发明提供了另外的通用底物，它们具有的特性可增强催化活性功能，这可有利于改进使用MNA酶来进行越来越多的复合物分析的能力。
在某些实施例中，本发明的多核苷酸底物可被MNA酶识别并修饰，以提供一种组装易化子、组装易化子组分或用于第二种不同MNA酶的部分酶。
参照图4，在靶标（T）的存在下可形成启动性MNA酶（Mt）。该启动性MNA酶（Mt）将本发明的（第一）多核苷酸底物（S1）裂解而生成（第一）组装易化子组分（S1f），该组装易化子组分指导第一级联MNA酶（级联MNA酶Mc1）的形成。在这个实例中，第一级联MNA酶（Mc1）包含两种部分酶和指定为F1、F2和S1f的三种组装易化子组分。Mc1可裂解一种另外的底物（S2），由此释放一种另外的组装易化子组分（S2f），该组装易化子组分指导第二级联MNA酶（级联MNA酶Mc2）的形成。在这个实例中，第二级联MNA酶（Mc2）包含两种部分酶和指定为F3、F4和S2f的三种组装易化子组分。然后Mc2可裂解更多的第一底物（S1），由此生成更多的第一组装易化子组分（S1f）。这引起了进一步的第一级联MNA酶（Mc1）的形成，由此形成了一种扩增级联。有技能的读者会认识到，图4显示了促进活性MNA酶组装需要三种组装易化子组分。在类似的方案中可使用更多的或更少的组装易化子组分。
熟练的业内人士将易于理解，可使用多种实验参数来对在此所述的方法进行优化，以便优化对靶标的检测、鉴别和/或定量，和/或催化性核酸（例如MNA酶或DNA核酶）对本发明的多核苷酸底物的催化性修饰。具体的被优化的实验参数以及这种优化的水平将取决于所采用的具体方法以及涉及的具体靶标和/或底物。此类参数包括但不限于时间、温度、盐浓度、洗涤剂、阳离子、以及其他试剂（包括但不限于二甲亚砜（DMSO）），以及核酸的长度、互补性、GC含量以及熔点（Tm）。
在一些实施例中，例如那些涉及序列变异的检测和/或甲基化DNA的检测的方法中，可对实验参数并且优选地包括进行该方法的温度进行优化，从而对MNA酶组分核酸与靶标核酸（该靶标核酸分别包括或不包括序列变异或甲基化核苷酸）之间的结合进行辨别。进行此类方法的温度的范围是大约20℃至大约96℃、大约20℃至大约75℃、20℃至大约60℃或者大约20℃至大约55℃。
在一些实施例中，在这里提供了使用MNA酶和DNA核酶实践这些方法的优化反应。在此类优化反应中，催化活性比未优化反应增加了高达10%、20%或30%。更优选的反应条件将催化活性提高了至少35%或40%，并且优选高达50%或更高。在再更优选的实施例中，优化反应的催化活性提高了多于50%，并且高达66%、75%、或甚至100%。在一个又更优选的实施例中，一种充分优化的反应方法将提供催化活性的100%、200%、甚至300%或更高的增加。与未优化反应条件下实践的方法相比，其他优选的反应条件可将催化活性提高高达1,000%或更高。用于对在此提供的这些方法进行优化的高度优选反应条件是包括某些二价阳离子。大多数核酸酶的催化活性可以按一种浓度依赖性方式被二价阳离子的浓度所影响。优选的优化反应是针对以下项中的一个或多个进行优化：Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和Pb2+。
在一些实施例中，与使用已知底物在相同的测定中在相同的条件下获得的可检测效应相比较，在用核酸酶（例如MNA酶或DNA核酶）的测定中使用本发明的多核苷酸底物可增强由酶对底物的催化性修饰而形成的可检测效应（例如荧光信号的增加或减少）。例如，与已知底物相比，可检测效应可增加多于2%、多于3%、多于4%、多于5%、多于6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、40%、或多于50%。在某些实施例中，这种可检测效应是荧光信号。
在一些实施例中，本发明的这些方法涉及组合使用一种用于MNA酶的多核苷酸底物与一种包括两种寡核苷酸部分酶的MNA酶。多核苷酸底物和寡核苷酸部分酶的序列可以是在表6、8、10、13、16、20、22和/或24中所示的三种序列（如由SEQ ID NO所描绘的）的任何特定组合。
在一些实施例中，本发明的这些方法涉及组合使用一种多核苷酸底物与一种DNA核酶结合。该多核苷酸底物与该DNA核酶的序列可以是在表15中所示的序列（如由SEQ IDNO所描绘的）的任何特定对。
3.试剂盒
在此还提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸底物的试剂盒。
这些试剂盒可包含用于实践在此披露的这些方法的另外的试剂。例如，这些试剂盒可包括能够对底物进行识别并修饰的一个或多个催化性核酸。合适的催化性核酸的非限制性实例包括DNA核酶（例如10-23DNA核酶；8-17DNA核酶；“7Z81”、“7Z48”和“7Q10”DNA核酶连接酶；“UV1C”胸腺嘧啶二聚体光逆转DNA核酶、“DAB22”碳-碳键形成DNA核酶；及其衍生物）、核酶（例如锤头核酶；同源二聚体核酶、异源二聚体核酶；及其衍生物）以及MNA酶。
本发明的试剂盒可以是“分格的”试剂盒。一种分格试剂盒包含任何将试剂放在分离容器中的试剂盒，这些容器例如像小玻璃容器、塑料容器或塑料条或纸。此类容器可允许将试剂高效地从一个分格转移到另一个分格中，同时避免样品与试剂的交叉污染，和/或允许将各容器中的试剂或溶液以定量的方式从一个分格加入到另一个分格中。此类试剂盒还可包括一个接收待测样品的容器、一个包含有待用于测定中的试剂的容器、多个包含清洗试剂的容器、以及多个包含检测试剂的容器。
在某些实施例中，该试剂盒包括一种或多种本发明的多核苷酸底物以及多种寡核苷酸部分酶，这些寡核苷酸部分酶被设计成组装一种能够在靶标的存在下对多核苷酸底物进行识别和催化性修饰的MNA酶。该靶标可用作一种组装易化子，导致寡核苷酸部分酶组装成为一种能够对多核苷酸底物进行识别和修饰的催化活性MNA酶。
在一些实施例中，这些试剂盒包括本发明的多核苷酸底物、以及包括两种寡核苷酸部分酶的MNA酶。多核苷酸底物和寡核苷酸部分酶的序列可以是在表6、8、10、13、16、20、22和/或24中所示的三种序列（如由SEQ ID NO所描绘的）的任何特定组合。
在其他实施例中，这些试剂盒包含一种本发明的多核苷酸底物以及一种DNA核酶。该多核苷酸底物与该DNA核酶的序列可以是在表15中所示的序列（如由SEQ ID NO所描绘的）的任何特定对。
各寡核苷酸部分酶可存在于相同的容器中。可替代地，各寡核苷酸部分酶可存在于单独的容器中。应理解的是，不是针对所有预期用于给定方法中的MNA酶的所有组分都需要必然设在试剂盒中，因为这种/此类组分可以作为级联反应的部分而生成。
在其他实施例中，用于具有例如裂解或连接酶活性的另外的催化性核酸的组分也可形成本发明的试剂盒的一部分。在又另外的实施例中，本发明的试剂盒可包含DNA核酶或其组分。
本发明的试剂盒可包含该试剂盒组分的使用说明，以便进行所希望的方法。
本发明的试剂盒和方法可与包括但不限于实时PCR仪的自动分析设备和系统一起联合使用。
本发明的试剂盒可包含用于进行靶标扩增反应（例如PCR）的另外的试剂，包括例如寡核苷酸引物、缓冲剂、镁离子、聚合酶等等。
本发明的试剂盒可包括一种或多种组装物，这些组装物包含一个或多个固体载体以及一种或多种本发明的多核苷酸底物。一个或多个固体载体可与一种或多种多核苷酸底物结合。在某些实施例中，试剂盒可包括包含了多个不同固体载体的一种或多种组装物。这些多个不同固体载体可与多个不同的本发明的多核苷酸底物结合。
实例
在下述的实例中，对基于一种10-23DNA核酶和多种10-23DNA核酶的MNA酶对通用底物高效裂解的能力进行了测试。所测试的通用底物包括本领域先前已知的一些底物（表4）以及根据本发明的所有设计指导方针或这些设计指导方针的子集设计的新底物（表5）。这些实例证实了稳健性，如由在一系列条件中对根据本发明的所有设计指导方针或这些设计指导方针的子集设计的通用底物的高效裂解所指示的。
表4：在实例中使用的先前已知的通用底物
*大写字母表示DNA，小写字母表示RNA。
表5：在实例中使用的来自本发明的改进的通用底物
*大写字母表示DNA，小写字母表示RNA。
实例1：在退火温度52℃的实时定量PCR（qPCR）中将通用底物与MNA酶一起使用。
MNA酶可被用于使用体外靶标扩增方法对靶标核酸的扩增进行实时监测，这些体外靶标扩增方法如PCR，称为MNA酶qPCR。进一步地，在qPCR过程中使用荧光团-猝灭剂对标记的MNA酶底物而进行的实时监测生成了一个曲线，在该曲线上，荧光的任意水平的阈值线可被放在反应的指数期，产生了一个称为Ct（循环阈值）的值。产生更低Ct值的反应指示特异性底物的更高效的裂解，因为此类反应更快地达到阈值循环。在此实例中，以一步法进行扩增和检测，其中PCR扩增和MNA酶介导的检测同时发生在一个单个试管中。通过所产生的Ct值测量的达到荧光阈值所用的时间量，可受到通用底物的序列的影响。
在此实例中，对先前已知的来自系列1的通用底物（Sub2、Sub3、Sub6和Sub7，见表4）与本发明主题的新的改进的通用底物系列2（Sub44、Sub45、Sub46、Sub49、Sub55和Sub60，见表5）进行比较，以确定系列2的底物在与系列1的底物相同的实时PCR中是否具有相同的、更高的或更低的活性水平。通过在实时PCR过程中针对包含单独底物的每个反应得到的Ct来确定活性水平。
1.1.部分酶寡核苷酸
在这些用于对先前已知的通用底物（表4）和新的通用底物（表5）的裂解效率进行实时测定的实验中，所有部分酶寡核苷酸A和B都被设计成其感应臂与人RPLPO基因的相同序列是互补的。以下从5’到3’列出了部分酶A和B的序列，其中加下划线的碱基与其相匹配的底物进行杂交。“-P”是指寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO：1部分酶A RPLPOA/2-P：
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：2部分酶B RPLPOB/2-P：
TGCCCAGGGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
SEQ ID NO：3部分酶A RPLPOA/3-P：
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGGTTGTGCTG
SEQ ID NO：4部分酶B RPLPOB/3-P：
CGGTTGGTGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
SEQ ID NO：5部分酶A RPLPOA/6-P：
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO：6部分酶B RPLPOB/6-P：
CTGGGAGGAAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
SEQ ID NO：7部分酶A RPLPOA/7-P：
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGTGCCATGTTAA
SEQ ID NO：8部分酶B RPLPOB/7-P：
TATCACAGCCAAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
SEQ ID NO：9部分酶A RPLPOA/44-P：
AAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGGAGACCTG
SEQ ID NO：10部分酶B RPLPOB/44-P：
TCACTATAGGGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
SEQ ID NO：11部分酶A RPLPOA/45-P：
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGGGACCCGT
SEQ ID NO：12部分酶B RPLPOB/45-P：
TTCCAAAGGAGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
SEQ ID NO：13部分酶A RPLPOA/46-P：
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAAGGTGCGGT
SEQ ID NO：14部分酶B RPLPOB/46-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
SEQ ID NO：15部分酶A RPLPOA/49-P：
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGCCAAGTTTA
SEQ ID NO：16部分酶A RPLPOA/55-P：
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：17部分酶A RPLPOA/60-P：
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGTGGTTGGC
SEQ ID NO：18部分酶B RPLPOB/60-P：
GTCGTGTTGGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
1.2.报告底物
以下从5’至3’列出了在这个实例中进行测试的报告底物的序列。小写字母的碱基代表RNA，而大写字母的碱基代表DNA。在当前的实例中，除了Sub60以外的底物在5’端用6-FAM部分进行末端标记，并且在3’端用猝灭剂部分进行末端标记。猝灭剂分子是黑洞（BlackHole）猝灭剂1（在下文底物的名称中由“B”指示）或爱荷华黑FQ（在下文底物的名称中由“IB”指示）。Sub60在5’端用猝灭剂部分进行末端标记，并且在3’端用FAM部分进行末端标记（由于5’末端碱基是“G”，已知可将FAM荧光猝灭）。在510-530nm之间（CFX96（BioRad）上的FAM发射波长范围）对底物的裂解进行监测，并且在450-490nm之间（CFX96（BioRad）上的FAM激发波长范围）激发。
SEQ ID NO：21 Sub2-FIB：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
SEQ ID NO：22 Sub3-FB：
CAGCACAACCguCACCAACCG
SEQ ID NO：23 Sub6-FIB：
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
SEQ ID NO：24 Sub7-FB：
TTAACATGGCACguTGGCTGTGATA
SEQ ID NO：25 Sub44-FIB：
CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGA
SEQ ID NO：26 Sub45-FIB：
ACGGGTCCCguCTCCTTTGGAA
SEQ ID NO：27 Sub46-FIB：
ACCGCACCTguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：28 Sub49-FB：
TAAACTTGGCTCguTGGCTGTGATA
SEQ ID NO：29 Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：30 Sub60-IBF：
GCCAACCACguCCAACACGAC
1.3.用于RPLPO扩增的PCR引物
用于这个实例的靶标PCR扩增子是由采用下面列出的寡核苷酸PCR引物的人基因组DNA的体外PCR扩增而生成的。引物序列是从5’到3’来书写的。
SEQ ID NO：31 正向引物5RPLPO：
CCCATTCTATCATCAACGGGTA
SEQ ID NO：32 反向引物3RPLPO：
GCCCACTGTGGTCCTGGTG
1.4.靶标序列
用于这个实例的靶标序列是一种RPLPO基因的PCR扩增子，是由从K562细胞中提取的人基因组DNA的体外PCR扩增而生成的。
1.5.反应组分：靶标序列的扩增和检测
在25μL的总反应体积中，进行对靶标序列的实时PCR扩增和检测。所有反应是在CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad）中进行的。循环参数是：95℃10分钟，95℃15秒和60℃30秒进行10个循环（后者的温度是每个循环-1℃），95℃15秒和52℃60秒进行40个循环（在52℃步骤收集数据）。用如在表6中的底物及其相关联的部分酶建立反应。各组反应条件重复运行，并且包含80nM的5RPLPO和400nM的3RPLPO、部分酶A和部分酶B各200nM，200nM的底物、8mM MgCl2、各dNTP200μM、10个单位的RiboSafe核糖核酸酶抑制剂（Bioline）、1×Immobuffer（Bioline）、2个单位的Immolase（Bioline）以及基因组DNA模板（50ng）或无DNA的靶标（无核酸酶的H2O（NF-H2O））。建立单独的反应来对各底物及其相匹配的部分酶进行测试。对于所有反应使用相同的PCR引物，并且所有的部分酶具有相同的靶标感应部分。因此，反应效率的任何差异是由底物的裂解效率的差异所引起的。
表6：用于各通用底物的部分酶组合
1.6.结果：靶标的扩增以及报告底物的裂解
包含人基因组DNA的与不同底物发生的各MNA酶qPCR反应显示出荧光随时间而增加，以用于对人基因组DNA的RPLPO的实时检测。对于所有底物，无DNA靶标对照的荧光值低于含有DNA靶标的反应中的荧光值。这证实了，在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于：催化活性MNA酶的靶标依赖性组装，进而裂解通用底物中的一种。
系列1和2的底物都超过了产生Ct值的阈值，如表7中可见。系列1的底物的Ct值的范围是从16.9（Sub6）至18.4（Sub3和Sub7），系列2的底物的Ct值的范围是从17.1（Sub55）至19.2（Sub45）。这指示，系列2的底物是高活性的，并且在测试的反应条件下与系列1的底物是非常可比的。这些结果证明，通常，被最大效率地（即最低Ct）裂解的底物是在底物的核糖核苷酸周围的八个碱基中的嘧啶类数目更多的底物（表7中的带下划线的）。
表7：通用底物的裂解效率（按照基于Ct的裂解效率的顺序列出）
^大写字母表示DNA，小写字母表示RNA。
*这里给出的Tm等于与两种部分酶相结合的碱基的解链温度，使用华莱士律进行计算。当底物与基于10-23DNA核酶的MNA酶结合时，“g”核糖核苷酸保持不结合，因此不会贡献于整体结合的Tm。
～由于实验误差只有一次重复。
实例2：退火温度58℃下进行MNA酶qPCR中的通用底物的使用。
MNA酶可被用于使用体外靶标扩增方法（如PCR）对靶标核酸的扩增进行实时监测。进一步地，在qPCR过程中使用荧光团和猝灭剂对标记的MNA酶底物而进行的实时监测生成了一个曲线，在该曲线上，荧光的任意水平的阈值线可被放在反应的指数期，产生了一个可以称为Ct（循环阈值）的值。产生更低Ct值的反应指示特异性底物的更高效的裂解，因为此类反应更快地达到阈值循环。在此实例中，以一步法进行扩增和检测，其中PCR扩增和MNA酶介导的检测同时发生在一个单个试管中。当所有其他反应条件相同时，通用底物的序列可对Ct值产生影响。本领域中使用的MNA酶qPCR的退火/检测温度是在50℃与54℃之间。这个温度是基于以下事实说明的：本领域已知的通用底物对其被高效裂解的温度有限制，其中54℃对于系列1的通用底物来说是上限。需要在更高温度下裂解的通用底物，以允许在更高温度下退火的引物和部分酶的设计具有更大的灵活性。这种对引物和部分酶的设计灵活性对于许多应用都非常有益，如在其序列中具有高比例G和C碱基的感兴趣的基因靶标需要更高的反应温度并且由此需要具有更高Tm的部分酶和引物以用于特定检测。
对基于系列1和2的底物性能的底物裂解效率的研究，导致有助于设计第三轮底物的指导方针的开发，其结果是系列3的底物。这些指导方针包括但不限于（i）核糖核苷酸周围的十个碱基（N4-N13）中有七个或更多个胞嘧啶核苷酸，（ii）与这些核糖核苷酸紧紧相邻的碱基是胞嘧啶（N8和N9），（iii）底物的总含量具有>64%的嘧啶，以及（iv）寡核苷酸的总Tm是66℃或更高（其中这个后面的指导方针仅适用于底物裂解的反应温度在50℃以上的情况）。
在这个实例中，将系列1的通用底物（Sub2、Sub3和Sub6）与系列2的通用底物（Sub44、Sub45、Sub46、Sub60T和Sub55）以及系列3的底物（Sub61、Sub65、Sub72、Sub73、Sub74、Sub75、Sub77、Sub79、Sub80、Sub82、Sub83、Sub84、Sub85、Sub86、Sub87、Sub88、Sub89和Sub90）进行比较，来比较所有底物在58℃下的实时PCR中的裂解效率，从而确保这些设计指导方针产生的通用底物具有较高的可能性用于升高温度下的MNA酶qPCR。通过对含有不同通用底物的反应的Ct值进行测量来确定裂解效率的水平。
2.1.部分酶寡核苷酸
在这些用于在实时PCR中对系列1、2和3的通用底物的裂解效率进行测量的实验中，所有部分酶寡核苷酸A和B都被设计成其感应臂与人TFRC基因的相同序列是互补的。以下从5’到3’列出了部分酶A和B的序列，其中加下划线的碱基与其相匹配的通用底物进行杂交。“-P”是指寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO：34部分酶A TFRCA/2-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：35部分酶B TFRCB/2-P：
TGCCCAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：36部分酶A TFRCA/3-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGTTGTGCTG
SEQ ID NO：37部分酶B TFRCB/3-P：
CGGTTGGTGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：38部分酶A TFRCA/6-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO：39部分酶B TFRCB/6-P：
CTGGGAGGAAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：40部分酶A TFRCA/44-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAGACCTG
SEQ ID NO：41部分酶B TFRCB/44-P：
TCACTATAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：42部分酶A TFRCA/45-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGACCCGT
SEQ ID NO：43部分酶B TFRCB/45-P：
TTCCAAAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：44部分酶A TFRCA/46-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAAGGTGCGGT
SEQ ID NO：45部分酶B TFRCB/46-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：46部分酶A TFRCA/55-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：48部分酶A TFRCA/60-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGTGGTTGGC
SEQ ID NO：49部分酶B TFRCB/60-P：
GTCGTGTTGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：50部分酶A TFRCA/61-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGTCGAG
SEQ ID NO：51部分酶B TFRCB/61-P：
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：52部分酶A TFRCA/65-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTCGAGA
SEQ ID NO：55部分酶B TFRCB/72-P：
CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：56部分酶A TFRCA/73-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGACGCCA
SEQ ID NO：57部分酶B TFRCB/73-P：
CACGAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：58部分酶A TFRCA/74-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGTGAT
SEQ ID NO：59部分酶B TFRCB/74-P：
CTGGGAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：60部分酶A TFRCA/75-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAGGGTCA
SEQ ID NO：61部分酶B TFRCB/75-P：
TAGTGGGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：62部分酶A TFRCA/77-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGAGGAG
SEQ ID NO：63部分酶B TFRCB/77-P：
AGGAGGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：64部分酶A TFRCA/79-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGAGGA
SEQ ID NO：65部分酶B TFRCB/79-P：
GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：66部分酶A TFRCA/80-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGCGGTT
SEQ ID NO：67部分酶B TFRCB/80-P：
GGTTCACGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：68部分酶B TFRCB/82-P：
TGGACGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：69部分酶A TFRCA/83-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGCGGA
SEQ ID NO：70部分酶B TFRCB/83-P：
GTTGCAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：71部分酶A TFRCA/90-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGTCGAG
2.2.报告底物
以下从5’至3’显示了用于这个实例的报告底物的序列。小写字母的碱基代表RNA，而大写字母的碱基代表DNA。在当前实例中，底物的5’端用6-FAM部分进行末端标记（在下文底物的名称中由“F”指示），并且3’端用爱荷华黑FQ猝灭剂部分进行末端标记（在下文底物的名称中由“IB”指示）。对Sub60的序列进行修饰，从而使得在5’端包含一个“T”，这使得其5’端用6-FAM标记。部分酶A底物结合序列没有改变，并且因此裂解效率与实例1中的在5’端缺乏附加“T”的Sub60序列是可比的。在510-530nm之间（CFX96（BioRad）上的FAM发射波长范围）对底物的裂解进行监测，并且在450-490nm之间（CFX96（BioRad）上的FAM激发波长范围）激发。
SEQ ID NO：21 Sub2-FIB：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
SEQ ID NO：22 Sub3-FIB：
CAGCACAACCguCACCAACCG
SEQ ID NO：23 Sub6-FIB：
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
SEQ ID NO：25 Sub44-FIB：
CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGASEQ ID NO：26 Sub45-FIB：
ACGGGTCCCguCTCCTTTGGAA
SEQ ID NO：27 Sub46-FIB：
ACCGCACCTguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：29 Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：72 Sub60T-FIB：
TGCCAACCACguCCAACACGAC
SEQ ID NO：73 Sub61-FIB：
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO：74 Sub65-FIB：
TCTCGACCTCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO：75 Sub72-FIB：
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
SEQ ID NO：76 Sub73-FIB：
TGGCGTCCCCguCCCCTCGTG
SEQ ID NO：77 Sub74-FIB：
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
SEQ ID NO：78 Sub75-FIB：
TGACCCTCCTCguCTCCCCACTA
SEQ ID NO：79 Sub77-FIB：
CTCCTCCCTCguCCCTCCTCCT
SEQ ID NO：80 Sub79-FIB：
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
SEQ ID NO：81 Sub80-FIB：
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
SEQ ID NO：82 Sub82-FIB：
CTCCTCCCTCguCCCTCGTCCA
SEQ ID NO：83 Sub83-FIB：
TCCGCTCCCCguCCCCTGCAAC
SEQ ID NO：84 Sub84-FIB：
ACCGCACCTCguCTCCTCCCAG
SEQ ID NO：85 Sub85-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCTCCCAG
SEQ ID NO：86 Sub86-FIB：
ATCACGCCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：87 Sub87-FIB：
ATCACTCCCCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：88 Sub88-FIB：
CTCCTCCCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：89 Sub89-FIB：
ACCGCACCTCguCCCTCCTCCT
SEQ ID NO：90 Sub90-FIB：
CTCGACCCTCguCCCTCGTCCA
2.3.用于TFRC扩增的靶标序列和PCR引物
用于此实例的靶标序列是一种TFRC基因的PCR扩增子，是由从IM9细胞系（Promega）中提取的人基因组DNA的体外PCR扩增而生成的，以下列出了扩增中所使用的寡核苷酸PCR引物。引物序列中的粗体表示的序列与通用标签（U1或U2）是相对应的，该通用标签增加了引物的Tm而不会影响引物对基因靶标的特异性。这种标签在PCR反应中提高了扩增效率。引物序列是从5’到3’列出的。
SEQ ID NO：91 正向引物5TFRC_U1：
GCTAAAACAATAACTCAGAACTTACG
SEQ ID NO：92 反向引物3TFRC_U2：
CAGCTTTCTGAGGTTACCATCCTA
2.4.反应组分靶标序列的扩增和定量
进行对靶标序列的实时PCR扩增和检测，总反应体积是25μL。所有反应是在CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad）中进行的。用如在表8中的底物及其相关联的部分酶建立反应。循环参数是：95℃2分钟，95℃15秒和58℃60秒进行50个循环（在58℃步骤收集数据）。各组反应条件重复运行，并且包含40nM的5TFRC_U1和200nM的3TFRC_U2、部分酶A和部分酶B各200nM，200nM的底物、8mM MgCl2、各dNTP200μM的、10个单位的RiboSafe核糖核酸酶抑制剂（Bioline）、1×Immobuffer（Bioline）、2个单位的MyTaqHSTMDNA聚合酶（Bioline）以及基因组DNA模板（50ng）或无靶标（NF-H2O）。
表8：用于各通用底物的部分酶组合
2.5.结果：靶标的扩增以及报告底物的裂解
含有人基因组DNA的各MNA酶qPCR反应显示，荧光随着时间而增加，以用于对来自人基因组DNA的TFRC的实时检测。对于所有反应，无DNA靶标对照组的荧光值低于含有DNA靶标的反应中的荧光值。这证实了，在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于：催化活性MNA酶的靶标依赖性组装，进而对通用报告底物中的一种进行裂解。
对各通用底物的Ct值的比较（图5和表9）显示，系列1的底物（Sub2、Sub3和Sub6）与系列2的底物（Sub44、Sub45、Sub46和Sub60T）都具有>27的Ct值，反之系列2的其他底物和测试的所有系列3的底物（Sub55、Sub61、Sub65、Sub72、Sub73、Sub74、Sub75、Sub77、Sub79、Sub80、Sub82、Sub83、Sub84、Sub85、Sub86、Sub87、Sub88、Sub89和Sub90）具有小于27的Ct值。这指示，后面的系列2的通用底物以及测试的所有系列3的通用底物显示在更高的退火/检测温度下MNA酶裂解反应的效率与先前可用于MNA酶qPCR的底物相比是增加的。这种裂解的改进的效率现在允许在比先前可用的温度相比更高的温度下使用MNA酶qPCR进行高效并稳健的检测。在使用需要更高的扩增温度的DNA聚合酶制剂时这还可以证明是有益的。
值得注意的是这些被高效裂解的底物的核苷酸序列的性质以及特异性核苷酸与底物的核糖核苷酸相靠近的重要性。这些特征形成了一组产生通用底物的指导方针的基础，这些通用底物在升高的温度下具有更高的可能性被高效裂解。这些设计指导方针包括但不限于（并非所有都是必需的）：（i）核糖核苷酸周围的十个碱基（N4-N13）中有七个或更多个胞嘧啶核苷酸；（ii）与这些核糖核苷酸紧紧相邻的碱基是胞嘧啶（N8和N9）；（iii）底物的总含量具有>64%的嘧啶；（iv）寡核苷酸的总Tm是66℃或更高（其中这个后面的指导方针仅适用于底物裂解的反应温度在50℃以上的情况）（表9）。此外，观察到在这些核糖核苷酸周围的10个碱基中有少量（例如三个、两个、一个或没有）的鸟嘌呤核苷酸也是有益的。
在图5中的在退火温度58℃下具有<27的Ct的所有通用底物遵从这些设计指导方针中的三个或更多个（表9）。
表9：通用底物的裂解效率（按照基于Ct的裂解效率的顺序列出）
^大写字母的碱基代表DNA，小写字母的碱基代表RNA，碱基在底物中的位置表示为(Nx)-N1-N2-N3-N4-N5-N6-N7-N8-rR-rY-N9-N10-N11-N12-N13-N14-N15-(Nx)。
+各底物的如上所示的序列长度的%C/T(嘧啶)不包括核糖核苷酸
*在此给出的Tm等于结合碱基的解链温度，采用华莱士律进行计算–只用于对与其互补物杂交的碱基的计算。当底物与基于10-23DNA核酶的MNA酶结合时，“g”核糖核苷酸保持不结合，因此不会贡献于整体结合的Tm。
～底物序列已经满足的设计指导原则(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)的的数量。
§在Sub60T中加入的“T”不与部分酶臂结合，并且因此不被包括在%C/T和Tm的计算中。
实例3：以用于核酸靶标的直接检测的形式，将通用底物与MNA酶一起使用。
对基于系列1和2的底物性能的底物裂解效率的研究，导致有助于设计第三轮底物（系列3）的指导方针的开发。这些指导方针包括但不限于（i）核糖核苷酸周围的十个碱基（N4-N13）中有七个或更多个胞嘧啶核苷酸，（ii）与这些核糖核苷酸紧紧相邻的碱基是胞嘧啶（N8和N9），（iii）底物的总含量具有>64%的嘧啶，以及（iv）寡核苷酸的总Tm是66℃或更高以上（其中这个后面的指导方针仅适用于底物裂解的反应温度在50℃以上的情况）。
MNA酶可被用于在没有任何靶标扩增的等温反应中对靶标核酸进行直接检测。这种直接靶标检测的方法可被用于对底物的裂解效率进行评估。部分酶被设计成在一系列温度下当与对基因TFRC进行的直接检测偶联时对一系列通用底物的裂解效率进行测试。在这个实例中，将先前已知的系列1的通用底物（Sub2、Sub3和Sub6）与系列2的通用底物（Sub44、Sub45、Sub46、Sub49、Sub55和Sub60T）和系列3的底物（Sub61、Sub65、Sub72、Sub73、Sub74、Sub75、Sub77、Sub79、Sub80、Sub82、Sub83、Sub84、Sub85、Sub86、Sub87、Sub88、Sub89和Sub90）进行比较，以便确定这些由对系列1和2的底物进行的分析而得到的设计指导方针是否可用于开发与来自系列1和2的底物相比以相同或更高的活性水平被裂解的系列3底物。在52℃、54℃、56℃和58℃的温度范围上在10分钟之后对信噪比（来自于含有模板的“测试”反应以及无模板的对照反应的结果）进行计算来确定裂解效率的水平。还计算在这个温度范围上的信噪比的标准差，作为底物相对于温度的稳健性的量度。
3.1.部分酶寡核苷酸
在这些用于使用直接靶标检测对如在表4和表5中所描述的系列1、2和3的通用底物的裂解效率进行测量的实验中，所有部分酶寡核苷酸A和B都被设计成其感应臂与人TFRC基因的相同序列是互补的。以下从5’到3’列出了部分酶A和B的序列，其中加下划线的碱基与底物进行杂交。“-P”是指寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO：34部分酶A TFRCA/2-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：35部分酶B TFRCB/2-P：
TGCCCAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：36部分酶A TFRCA/3-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGTTGTGCTG
SEQ ID NO：37部分酶B TFRCB/3-P：
CGGTTGGTGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：38部分酶A TFRCA/6-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO：39部分酶B TFRCB/6-P：
CTGGGAGGAAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：40部分酶A TFRCA/44-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAGACCTG
SEQ ID NO：41部分酶B TFRCB/44-P：
TCACTATAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：42部分酶A TFRCA/45-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGACCCGT
SEQ ID NO：43部分酶B TFRCB/45-P：
TTCCAAAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：44部分酶A TFRCA/46-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAAGGTGCGGT
SEQ ID NO：45部分酶B TFRCB/46-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：93部分酶A TFRCA/49-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGCCAAGTTTA
SEQ ID NO：94部分酶B TFRCB/49-P：
TATCACAGCCAAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：46部分酶A TFRCA/55-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：48部分酶A TFRCA/60-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGTGGTTGGC
SEQ ID NO：49部分酶B TFRCB/60-P：
GTCGTGTTGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：50部分酶A TFRCA/61-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGTCGAG
SEQ ID NO：51部分酶B TFRCB/61-P：
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：52部分酶A TFRCA/65-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTCGAGA
SEQ ID NO：55部分酶B TFRCB/72-P：
CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：56部分酶A TFRCA/73-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGACGCCA
SEQ ID NO：57部分酶B TFRCB/73-P：
CACGAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：58部分酶A TFRCA/74-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGTGAT
SEQ ID NO：59部分酶B TFRCB/74-P：
CTGGGAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：60部分酶A TFRCA/75-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAGGGTCA
SEQ ID NO：61部分酶B TFRCB/75-P：
TAGTGGGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：62部分酶A TFRCA/77-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGAGGAG
SEQ ID NO：63部分酶B TFRCB/77-P：
AGGAGGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：64部分酶A TFRCA/79-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGAGGA
SEQ ID NO：65部分酶B TFRCB/79-P：
GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：66部分酶A TFRCA/80-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGCGGTT
SEQ ID NO：67部分酶B TFRCB/80-P：
GGTTCACGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：68部分酶B TFRCB/82-P：
TGGACGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：69部分酶A TFRCA/83-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGCGGA
SEQ ID NO：70部分酶B TFRCB/83-P：
GTTGCAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：71部分酶ATFRCA/90-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGTCGAG
3.2.报告底物
下文从5’至3’显示了用于此实例的报告底物的序列。小写字母的碱基代表RNA，而大写字母的碱基代表DNA。在当前实例中，底物的5’端用6-FAM部分进行末端标记（在下文底物的名称中由“F”指示），并且3’端用爱荷华黑FQ猝灭剂部分进行末端标记（在下文底物的名称中由“IB”指示）。在510-530nm之间（CFX96（BioRad）上的FAM发射波长范围）对底物的裂解进行监测，并且在450-490nm之间（CFX96（BioRad）上的FAM激发波长范围）激发。
SEQ ID NO：21 Sub2-FIB：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
SEQ ID NO：22 Sub3-FIB：
CAGCACAACCguCACCAACCG
SEQ ID NO：23 Sub6-FIB：
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
SEQ ID NO：25 Sub44-FIB：
CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGA
SEQ ID NO：26 Sub45-FIB：
ACGGGTCCCguCTCCTTTGGAA
SEQ ID NO：27 Sub46-FIB：
ACCGCACCTguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：28 Sub49-FB：
TAAACTTGGCTCguTGGCTGTGATASEQ ID NO：29 Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：72 Sub60T-FIB：
TGCCAACCACguCCAACACGAC
SEQ ID NO：73 Sub61-FIB：
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO：74 Sub65-FIB：
TCTCGACCTCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO：75 Sub72-FIB：
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
SEQ ID NO：76 Sub73-FIB：
TGGCGTCCCCguCCCCTCGTG
SEQ ID NO：77 Sub74-FIB：
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
SEQ ID NO：78 Sub75-FIB：
TGACCCTCCTCguCTCCCCACTA
SEQ ID NO：79 Sub77-FIB：
CTCCTCCCTCguCCCTCCTCCT
SEQ ID NO：80 Sub79-FIB：
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
SEQ ID NO：81 Sub80-FIB：
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
SEQ ID NO：82 Sub82-FIB：
CTCCTCCCTCguCCCTCGTCCA
SEQ ID NO：83 Sub83-FIB：
TCCGCTCCCCguCCCCTGCAAC
SEQ ID NO：84 Sub84-FIB：
ACCGCACCTCguCTCCTCCCAG
SEQ ID NO：85 Sub85-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCTCCCAG
SEQ ID NO：86 Sub86-FIB：
ATCACGCCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：87 Sub87-FIB：
ATCACTCCCCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：88 Sub88-FIB：
CTCCTCCCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：89 Sub89-FIB：
ACCGCACCTCguCCCTCCTCCT
SEQ ID NO：90 Sub90-FIB：
CTCGACCCTCguCCCTCGTCCA
3.3.靶标序列
用于此实例的靶标序列是合成寡核苷酸AF-TFRC，在下文中其序列是5’到3’。此靶标序列具有与TFRC基因的段具有相同的序列。
SEQ ID NO：95组装易化子AF-TFRC：
AGTCTGTTTTCCAGTCAGAGGGACAGTCTCCTTCCATATTCC
3.4.反应组分：靶标序列的直接等温检测
通过催化活性MNA酶对报告底物进行裂解导致的荧光信号的增加，对靶标序列的检测进行测量。所有反应的总体积是25μL，并且所有反应是在CFX96TM实时PCR检测系统（BioRad）上进行的，其中对部分酶与底物（表10）的各组合在52℃、54℃、56℃、58℃和60℃下进行测试。对于首个50个循环，通过程序控制在1秒后读取各反应的荧光值，并且然后对于下50个循环，通过程序控制在25秒之后读取荧光值。所有反应包含1×PCR缓冲液II（应用生物系统公司（Applied Biosystems））、10mM MgCl2、0.2μM的部分酶A和B、以及0.2μM的底物（联合测定，表10）。在用10nM的靶标序列（AF-TFRC）进行的“测试”或无模板对照（NF-H2O）时，各反应重复进行。
表10：用于各底物的部分酶组合
3.5.结果：靶标序列的直接等温检测
各通用底物的各反应显示，对于含有合成模板AF-TFRC（对应于TFRC基因的一部分的靶标序列）的反应，荧光随时间而增加。对于所有底物，无模板对照的荧光值低于含有靶标序列的反应中的荧光值。这证实了，在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于：催化活性MNA酶的靶标依赖性组装，进而对通用报告底物进行裂解。
对于各反应，通过将各数据点除以从配对无模板反应中在首次读取中得到的值，对从CFX96得到的原始荧光数据点进行归一化。然后使用这个归一化数据在大约10分钟标志处通过将测试数据除以无模板数据点对信噪比值进行计算。对在各反应温度下的各底物进行这项计算。信噪比值提供了对底物的裂解效率的量度（图6，（i）），其中高的信噪比指示高效裂解。还可以对各底物在该温度范围上的信噪比的标准差进行计算并绘图，从而确定在测试温度范围内具有始终高活性的底物（图6，（ii））。低的标准差的值指示在多个温度之间的信噪比水平的变化较小。这表明这些底物相对于温度而言是稳健的。
对各底物在温度范围中的信噪比的分析（图6，（i））显示，系列1的底物（Sub2、Sub3和Sub6）在更低的测量温度下具有更高的信噪比。然而，当反应温度升高到58℃时，这些底物的裂解效率急剧降低。对于系列2的底物子集（Sub44、Sub45、Sub46和Sub60T），可以看到相似的模式。系列2的底物Sub49在更低的温度下表现较差，并且在更高温度下稍好一些，但是总的来说比其他底物具有更低的信噪比。系列2的底物Sub60T显示，其信噪比随着温度的升高而下降，并且总的来说在更低的温度下其信噪比低于大多数其他系列1和2的底物。其他系列2的底物（Sub55）以及系列3底物子集（Sub61、Sub65、Sub74、Sub79、Sub80、Sub82、Sub83、Sub84、Sub85、Sub86、Sub87、Sub88、Sub89和Sub90）显示了高的荧光水平，并且由此在整个测试温度中被高效裂解。系列3的底物Sub73、Sub75和Sub77显示其在测试温度下的信噪比值基本相同，然而，其整体信噪比水平是低的。当用MNA酶qPCR进行测试时，这三种底物都给出具有相对较低的Ct值的良好结果（见实例2）。将用于实例2和3的这些底物的数据进行比较，可以指示，当采用在52℃至58℃范围内的恒温时，这些底物的转换更低，由此影响了裂解效率。这种降低的底物转换可与裂解产物的“解离”率是相关的。在实例2中，当作为PCR的热循环模式的一部分，温度升高至90℃以上时，裂解产物会与部分酶的底物臂解离，每个循环至少一次。
总的来说，符合设计指导方针的底物（表9）显示了其在测试温度范围内的信噪比大于在这些指导方针之外的底物（图6，（i））。更确切地说，与Sub55、Sub61、Sub65、Sub72、Sub74、Sub79、Sub80、Sub82、Sub83、Sub84、Sub85、Sub86、Sub87、Sub88、Sub89和Sub90的反应显示了在每个测试温度下的高信噪比值，证明了这些底物是在一系列温度下的稳健底物。当对于各底物从在这些温度下的信噪比计算标准差时，这种改进更为明显（图6、（ii））。对与信噪比的绝对值成对的可变性的这种测量指示，在测试温度范围下，系列2的底物Sub55和系列3的底物Sub61、Sub65、Sub74、Sub79、Sub80、Sub82、Sub83、Sub85、Sub86、Sub87Sub88、Sub89和Sub90具有高信噪比，其中在一个宽温度范围内的可变性较小。有三种系列3的底物Sub65，Sub72和Sub84只匹配四个设计指导方针中的三个，其中的两种即Sub72和Sub84的信噪比标准差略大于与全部四个设计指导方针匹配的系列3的底物的信噪比标准差，如在表9中所指出的。
在三种或更高温度下的信噪比值小于1.6的底物（Sub60、Sub73、Sub75和Sub77）被认为相对于测试温度范围不是稳健的底物。
这些数据表明，遵从所有四种设计指导方针（表9）通常可产生可在一系列温度下被高效并稳健裂解的底物。
对来自系列2和3中的最成功的底物的序列的研究显示，这些底物具有共同的特征。在测试温度下的信噪比之间具有较小变化的底物（图6，（i）和（ii））通常在碱基N4至N13内含有七个或更多个胞嘧啶核苷酸。这指示，核心区，即核糖核苷酸周围的10个碱基，可高度影响底物活性。此外，观察到在核糖核苷酸周围的10个碱基中有少量（例如三个、两个、一个或没有）的鸟嘌呤核苷酸也是有益的。
实例4：在退火温度52℃和58℃下进行的MNA酶qPCR中的通用底物的使用。
MNA酶可被用于使用体外靶标扩增方法（如PCR）对靶标核酸的扩增进行实时监测。进一步地，在qPCR过程中使用荧光团-猝灭剂对标记的MNA酶底物而进行的实时监测产生了一个曲线，该曲线可通过其Ct值及倾斜度（反应速率）来指示反应效率。在这个实例中，以一步法进行扩增和检测，其中PCR扩增和MNA酶介导的检测同时发生在一个单个试管中。通用底物的序列可影响在不同的退火温度如52℃和58℃（此温度下收集数据）下的信号生成的速率（通过反应曲线的Ct和倾斜度来测量）。
本领域中使用的MNA酶qPCR的退火/检测温度是在50℃与54℃之间。这个温度是基于以下事实说明的：本领域已知的通用底物对其被高效裂解的温度有限制，其中54℃对于系列1的通用底物来说是上限。需要更高温度下裂解的通用底物，以允许在更高温度下退火的引物和部分酶的设计具有更大的灵活性。这种对引物和部分酶的设计灵活性对于许多应用都非常有益，如在其序列中具有高比例G和C碱基的感兴趣的基因靶标需要具有更高Tm的部分酶和引物以用于特定检测。如果在52℃和58℃之间的一系列温度下被高效裂解的底物存在，可大大增加通用底物的实用性。
在这个实例中，与系列1、2和3的通用底物相对应的部分酶被设计成靶向一系列的基因，如在表11中所概述的。本领域技术人员将会领会到，任何基因序列或基因转录物或任何其他核酸扩增产物可以用作在此所述的靶标。在qPCR中，在退火温度52℃和58℃下，对部分酶与其相关联的通用底物的各组合进行测试。比较的结果将确定系列1、2和3的底物是否靶向不同的基因，并且在实时PCR中在不同的退火温度下是否允许相同、更高或更低的裂解效率。通过测量Ct值并检查包含不同通用底物的反应的反应曲线的倾斜度，来确定裂解效率的水平。
表11.用于通过MNA酶qPCR对不同基因进行检测的底物
4.1.部分酶寡核苷酸
在这些用于在实时PCR中对通用底物的裂解效率进行测量的实验中，部分酶寡核苷酸A和B都被设计成其感应臂与人CYP2C9、TP53、B2M、HMBS、RPL13a或TFRC基因是互补的。以下从5’到3’列出了部分酶A和B的序列，其中加下划线的碱基与底物进行杂交。“-P”是指寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO：96 部分酶A CYP2C9A/3-P：
GGGAAGAGGAGCATTGAGGAACAACGAGGTTGTGCTG
SEQ ID NO：97 部分酶B CYP2C9B/3-P：
CGGTTGGTGAGGCTAGCTCCGTGTTCAAGAGGAAGC
SEQ ID NO：98 部分酶A CYP2C9A/61-P：
GGGAAGAGGAGCATTGAGGAACAACGAGGGGTCGAG
SEQ ID NO：99 部分酶B CYP2C9B/61-P：
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCCGTGTTCAAGAGGAAGC
SEQ ID NO：100 部分酶A TP53A/6-P：
GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO：101 部分酶B TP53B/6-P：
CTGGGAGGAAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG
SEQ ID NO：103 部分酶B TP53B/72-P：
CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG
SEQ ID NO：104 部分酶A TP53A/74-P：
GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGGGGAGTGAT
SEQ ID NO：105 部分酶B TP53B/74-P：
CTGGGAGGGGAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG
SEQ ID NO：106 部分酶A TP53A/79-P：
GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGGGGAGAGGA
SEQ ID NO：107 部分酶B TP53B/79-P：
GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG
SEQ ID NO：108 部分酶A B2MA/60-P：
ATTCAGGTTTACTCACGTCATCACAACGAGTGGTTGGC
SEQ ID NO：109 部分酶B B2MB/60-P：
GTCGTGTTGGAGGCTAGCTCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAA
SEQ ID NO：110 部分酶A B2MA/61-P
ATTCAGGTTTACTCACGTCATCACAACGAGGGGTCGAG
SEQ ID NO：111 部分酶B B2MB/61-P
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAA
SEQ ID NO：112 部分酶A B2MA/79-P
ATTCAGGTTTACTCACGTCATCACAACGAGGGGAGAGGA
SEQ ID NO：113 部分酶B B2MB/79-P
GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAA
SEQ ID NO：114 部分酶A HMBSA/49-P：
GCCATGTCTGGTAACGGCAAACAACGAGAGCCAAGTTTA
SEQ ID NO：115 部分酶B HMBSB/49-P：
TATCACAGCCAAGGCTAGCTTGCGGCTGCAACGGCGGTG
SEQ ID NO：116 部分酶A HMBSA/75-P：
GCCATGTCTGGTAACGGCAAACAACGAGAGGAGGGTCA
SEQ ID NO：117 部分酶B HMBSB/75-P：
TAGTGGGGAGAGGCTAGCTTGCGGCTGCAACGGCGGTG
SEQ ID NO：34 部分酶A TFRCA/2-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：35 部分酶B TFRCB/2-P：
TGCCCAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：38 部分酶A TFRCA/72-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO：55 部分酶B TFRCB/72-P：
CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：66 部分酶A TFRCA/80-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGCGGTT
SEQ ID NO：67 部分酶B TFRCB/80-P：
GGTTCACGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：118 部分酶A RPL13aA/55-P
TTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：119 部分酶B RPL13aB/55-P
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
SEQ ID NO：120 部分酶A RPL13aA/80-P
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGGCGGTT
SEQ ID NO：121 部分酶B RPL13aB/80-P
GGTTCACGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
SEQ ID NO：122 部分酶A RPL13aA/88-P
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGGAGGAG
4.2.报告底物
在当前实例中，底物的5’端用荧光团进行末端标记，并且3’端用猝灭剂部分进行标记。表12对底物–荧光团/猝灭剂组合进行了描绘。用一种以上特定的荧光团/猝灭剂组合对一些底物进行测试。在不同的发射和激发波长下对这些底物的裂解进行监测（表12）。
表12.底物及其荧光标记
^BHQ1；黑洞（black hole）猝灭剂1，BHQ2；黑洞（black hole）猝灭剂2，IB；爱荷华黑（Iowa black）FQ，IBR；爱荷华黑（Iowa black）RQ
*CFX96实时PCR检测系统（Biorad）激发，并且测量各荧光团在各通道的一系列波长下的发射。
以下从5’至3’列出了在此实例中所测试的报告底物的序列。小写字母的碱基代表RNA，而大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：21 Sub2：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
SEQ ID NO：22 Sub3：
CAGCACAACCguCACCAACCG
SEQ ID NO：23 Sub6：
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
SEQ ID NO：28 Sub49：
TAAACTTGGCTCguTGGCTGTGATA
SEQ ID NO：29 Sub55：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：30 Sub60：
GCCAACCACguCCAACACGAC
SEQ ID NO：73 Sub61：
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO：75 Sub72：
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
SEQ ID NO：77 Sub74：
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
SEQ ID NO：78 Sub75：
TGACCCTCCTCguCTCCCCACTA
SEQ ID NO：80 Sub79：
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
SEQ ID NO：81 Sub80：
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
SEQ ID NO：88 Sub88：
CTCCTCCCTCguCCCCAGCTC
4.3.用于CYP2C9、TP53、B2M、HMBS、TFRC和RPL13a基因的扩增的靶标序列和PCR引物
从IM9细胞系（Promega）中提取的人基因组DNA被用作靶标基因的体外扩增的模板。通过qPCR，使用以下所列的寡核苷酸PCR引物，产生扩增子。引物序列是从5’到3’列出的。引物序列中的粗体表示的序列与通用标签（U1、U2或U3）是相对应的，该通用标签增加了引物的Tm而不会影响引物对基因靶标的特异性。这种标签在PCR反应中提高了扩增效率。
SEQ ID NO：91 正向引物5TFRC_U1
GCTAAAACAATAACTCAGAACTTACG
SEQ ID NO：92 反向引物3TFRC_U2
CAGCTTTCTGAGGTTACCATCCTA
SEQ ID NO：123 正向引物5B2M_U1
GCTAATCTTTTCCCGATATTCCTCAG
SEQ ID NO：124 反向引物3B2M_U2
CAGCCCAGACACATAGCAATTCAG
SEQ ID NO：125 正向引物5TP53_U3
CTAACTTACTGCCTCTTGCTTCTC
SEQ ID NO：126 反向引物3TP53_U2
CAGCTCTGTGCGCCGGTCTCTC
SEQ ID NO：127 正向引物5RPL13a_U3
CTAAACCGGAAGAAGAAACAGCTCA
SEQ ID NO：128 反向引物3RPL13a_U2
CAGGAGGAATTAACAGTCTTTATTGG
SEQ ID NO：129 正向引物5CYP2C9_U3
CTAACCTCATGACGCTGCGGAA
SEQ ID NO：130 反向引物3CYP2C9_U2
CAGATATGGAGTAGGGTCACCCA
SEQ ID NO：131 正向引物5HMBS_U3
CTAAACCCACACACAGCCTACTTTC
SEQ ID NO：132 反向引物3HMBS_U2
CAGAGCCCAAAGTGTGCTGGTCA
4.4.反应组分：靶标序列的扩增和定量
在25μL的总反应体积中进行对靶标序列的实时PCR扩增和检测。所有反应是在CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad）中进行的。用如表13中的底物及其相关联的部分酶建立反应。循环参数如下；
1)95℃2分钟，95℃15秒和52℃60秒进行50个循环（在52℃步骤收集数据），或
2)95℃2分钟，95℃15秒和58℃60秒进行50个循环（在58℃步骤收集数据）。
各组反应条件重复运行，并且包含40nM的正向引物和200nM的反向引物、部分酶A和部分酶B各200nM，200nM的底物、8mM MgCl2、各dNTP200μM、10个单位的RiboSafe核糖核酸酶抑制剂（Bioline）、1×Immobuffer（Bioline）、2个单位的MyTaqHSTMDNA聚合酶（Bioline）以及基因组DNA模板（100ng）或无靶标（NF-H2O）。
表13：用于各通用底物的寡核苷酸组合
4.5.结果：靶标的扩增以及报告底物的裂解
包含人基因组DNA的各MNA酶qPCR反应显示，对于基因CYP2C9、TP53、B2M、HMBS、RPL13a和TFRC的实时检测中，荧光随着时间而增加，退火温度是52℃和58℃（图7）。对于所有通用底物，无DNA靶标对照的荧光值低于含有DNA靶标的反应中的荧光值。这证实了，在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于：催化活性MNA酶的靶标依赖性组装，进而对通用报告底物中的一种进行裂解。
CYP2C9和TP53基因的MNA酶qPCR检测的结果显示，所有测试的通用底物都在52℃等效地表现，其中底物之间的Ct差异小于0.5，并且扩增曲线的斜度相似（表14和对应的图7（i）a和（ii）a）。在更高的温度58℃下，测试的系列1的底物（Sub3和Sub6）比测试的系列3的底物（Sub61、Sub72、Sub74和Sub79）的表现更差，其中在底物之间的差异超过1个Ct，并且Sub3和Sub6的扩增曲线的斜度更小，指示了一种低效反应（表14和对应的图7（i）b和（ii）b）。这些数据显示，系列3的底物（Sub61、Sub72、Sub74和Sub79）的改进的设计使得能够在58℃更有效地裂解，并且这种升高的温度下改进的性能不会妨碍这些底物在更低温度下被高效裂解。
B2M和HMBS基因的MNA酶qPCR检测的结果显示，所有测试的通用底物在52℃都等效地表现，其中底物之间的Ct差异为大约0.5，并且扩增曲线的斜度相似（表14和对应的图7（iii）a和（iv）a）。在更高的温度58℃下，测试的系列2的底物（Sub60和Sub49）比测试的系列3的底物（Sub61、Sub75和Sub79）的表现较差，其中在底物之间的差异超过1个Ct，并且Sub60和Sub49的扩增曲线的斜度更小，指示一种低效反应（表14和对应的图7（iii）b和（iv）b）。这些数据显示，系列3的底物（Sub61、Sub75和Sub79）的改进的设计使得能够在58℃更有效地裂解，但是这种升高温度下改进的性能不会妨碍这些底物在更低温度下被高效裂解。系列3的底物在58℃时相对于系列2的底物具有更好的性能，这可归因于系列3的底物遵照用于高度活性底物的所有设计指导方针、而系列2的底物则不遵照所有这些设计指导方针的事实（见表9）。
TFRC基因的MNA酶qPCR检测的结果显示，所有测试的通用底物都在52℃等效地表现，其中底物之间的Ct差异只有大约0.5，并且扩增曲线的斜度相似（表14和图7（v）a）。测试的系列3的底物（Sub72和Sub80）两者在58℃下的表现好于测试的系列1的底物（Sub2），其中底物之间的Ct差异大于1，并且Sub2的扩增曲线的斜度更小，指示一种低效反应（表14和图7（v）b）。系列3的底物Sub80在58℃下比系列3的底物Sub72的表现更好，其中底物之间的Ct差异大于1。Sub80遵照所有用于高度活性底物的设计指导方针，而Sub72则没有（见表9）。
RPL13a基因的MNA酶qPCR检测的结果显示，在52℃下，系列2的底物Sub55和系列3底物Sub88优于系列3的底物Sub80（表14和图7（vi）a）。在58℃下，系列3的底物Sub80和系列2的Sub55的表现相同，并且这两种底物的表现均优于系列3的底物Sub88（表14和图7（vi）b）。系列2的底物Sub55满足所有的用于高度活性底物的设计指导方针（见表9），并且因此预期表现良好。系列3的Sub88也满足所有的用于高度活性底物的设计指导方针（表9），但是其表现不如Sub55。总的来说，这些设计指导方针显示了产生可在MNA酶qPCR条件下被高效裂解的底物的高度可能性。
总的来说，对于一系列的不同的靶标序列，系列1、2和3的底物在52℃下在MNA酶qPCR中的表现是可比的。在58℃，系列3的底物的表现超过了系列1和2的底物，除了系列2的底物Sub55之外，如上面所解释的，Sub55遵循所有的高度活性底物的设计指导方针。这些数据显示，这些设计指导方针通常产生的底物可在qPCR所用的热循环方案背景中的一系列温度下保持稳健并且被高效地裂解。
需要注意的是，在表14中由（^）指示的一些系列3的底物具有非常高的Tm，并且因此在更低的温度下它们对裂解的底物的转化较差，并且由此即使其活性与其他底物是可比的，最终荧光值更低。
表14.由靶向不同基因的MNA酶所裂解的底物。
*扩增曲线的形状（倾斜度以及达到反应平台的时间）证明反应效率。
^这些底物的Tm对于更低的反应温度来说太高了，并且这可导致底物的被裂解部分的转换较差，并由此产生更低的最终荧光值。
实例5：将通用底物与DNA核酶一起使用
10-23DNA核酶是一种单分子结构，可与底物序列直接结合，并修饰该底物序列。10-23DNA核酶在体外诊断应用中具有实用性。由于在催化区中具有相似性，10-23DNA核酶可与底物结合并裂解这些底物，这些底物可被基于10-23DNA核酶的MNA酶裂解。和MNA酶不同，DNA核酶不需要靶标序列来形成活性核心，并且因此，由10-23DNA核酶对底物的结合以及后续的裂解不会受靶标序列影响，并且不使用分离的催化核心。相匹配的10-23DNA核酶对系列1的通用底物（Sub2、Sub3和Sub6）、系列2的通用底物（Sub44、Sub45、Sub49、Sub55和Sub60T）和系列3的底物（Sub61、Sub72、Sub73、Sub74、Sub75、Sub77、Sub79、Sub80、Sub84、Sub85、Sub86、Sub87、Sub88和Sub89）的裂解能力可被测量，以确定本发明的设计指导方针是否能够开发可被10-23DNA核酶在一系列的温度下高活性地并且稳健地裂解的底物。
5.1.10-23DNA核酶寡核苷酸
一系列的10-23DNA核酶可被设计成，其感应臂与如上所述的并列于表4和5中的底物是互补的。下文从5’至3’列出了DNA核酶的序列，其中加下划线的碱基与底物杂交，并且以斜体表示的碱基形成催化核心。以下一些DNA核酶序列在最5’和3’端包含额外的G（例如Dz55）。这些增加的碱基不会与底物杂交，并且不会影响DNA核酶对底物裂解的效率。
SEQ ID NO：133 DNA核酶Dz2
TGCCCAGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：134 DNA核酶Dz3
CGGTTGGTGAGGCTAGCTACAACGAGGTTGTGCTG
SEQ ID NO：135 DNA核酶Dz6
CTGGGAGGAAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO：136 DNA核酶Dz44
TCACTATAGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGAGACCTG
SEQ ID NO：137 DNA核酶Dz45
TTCCAAAGGAGAGGCTAGCTACAACGAGGGACCCGT
SEQ ID NO：138 DNA核酶Dz49
TATCACAGCCAAGGCTAGCTACAACGAGAGCCAAGTTTA
SEQ ID NO：139 DNA核酶Dz55
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
SEQ ID NO：140 DNA核酶Dz60
GTCGTGTTGGAGGCTAGCTACAACGAGTGGTTGGC
SEQ ID NO：141 DNA核酶Dz61
GTGGCGTGGAGAGGCTAGCTACAACGAGGGGTCGAGG
SEQ ID NO：142 DNA核酶Dz72
GCTGGGAGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTGATG
SEQ ID NO：143 DNA核酶Dz73
GCACGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGACGCCAG
SEQ ID NO：144 DNA核酶Dz74
GCTGGGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGTGATG
SEQ ID NO：145 DNA核酶Dz75
GTAGTGGGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGAGGGTCAG
SEQ ID NO：146 DNA核酶Dz77
GAGGAGGAGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGGAGGAGG
SEQ ID NO：147 DNA核酶Dz79
GGGTTGAAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGAGGAG
SEQ ID NO：148 DNA核酶Dz80
GGGTTCACGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGGCGGTTGG
SEQ ID NO：149 DNA核酶Dz84
GCTGGGAGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
SEQ ID NO：150 DNA核酶Dz85
GCTGGGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
SEQ ID NO：151 DNA核酶Dz86
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTGATG
SEQ ID NO：152 DNA核酶Dz87
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGTGATG
SEQ ID NO：153 DNA核酶Dz88
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGGAGGAGG
SEQ ID NO：154 DNA核酶Dz89
GAGGAGGAGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
5.2.报告底物
在当前实例中，底物的5’端用6-FAM部分进行末端标记（在下文底物的名称中由“F”指示），并且3’端用爱荷华黑FQ猝灭剂部分进行末端标记（在下文底物的名称中由“IB”指示）。在510-530nm之间（CFX96（BioRad）上的FAM发射波长范围）对底物的裂解进行监测，并且在450-490nm之间（CFX96（BioRad）上的FAM激发波长范围）激发。以下从5’至3’显示了用于此实例的报告底物的序列。小写字母的碱基代表RNA，而大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：21 Sub2-FIB：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
SEQ ID NO：22 Sub3-FIB：
CAGCACAACCguCACCAACCG
SEQ ID NO：23 Sub6-FIB：
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
SEQ ID NO：25 Sub44-FIB：
CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGA
SEQ ID NO：26 Sub45-FIB：
ACGGGTCCCguCTCCTTTGGAA
SEQ ID NO：28 Sub49-FB：
TAAACTTGGCTCguTGGCTGTGATA
SEQ ID NO：29 Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：72 Sub60T-FIB：
TGCCAACCACguCCAACACGAC
SEQ ID NO：73 Sub61-FIB：
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO：75 Sub72-FIB：
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
SEQ ID NO：76 Sub73-FB：
TGGCGTCCCCguCCCCTCGTG
SEQ ID NO：77 Sub74-FIB：
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
SEQ ID NO：78 Sub75-FIB：
TGACCCTCCTCguCTCCCCACTA
SEQ ID NO：79 Sub77-FB：
CTCCTCCCTCguCCCTCCTCCT
SEQ ID NO：80 Sub79-FIB：
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
SEQ ID NO：81 Sub80-FIB：
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
SEQ ID NO：84 Sub84-FIB：
ACCGCACCTCguCTCCTCCCAG
SEQ ID NO：85 Sub85-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCTCCCAG
SEQ ID NO：86 Sub86-FIB：
ATCACGCCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：87 Sub87-FIB：
ATCACTCCCCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：88 Sub88-FIB：
CTCCTCCCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：89 Sub89-FIB：
ACCGCACCTCguCCCTCCTCCT
5.3.反应组分：在50℃与60℃之间的温度下，DNA核酶对底物的裂解
通过由相匹配的DNA核酶进行的结合及随后的裂解而引起的荧光信号的增加来对底物的裂解进行测量。建立单独的反应，来测量相匹配的DNA核酶（如在表15中的寡核苷酸）对各底物的裂解。这些反应包含1×PCR缓冲液II（应用生物系统公司（AppliedBiosystems））、10mM MgCl2、200nM的底物以及NF-H2O，总体积是25μL。作为“测试”（加入1nMDNA核酶）或“对照”（加入NF-H2O）反应时，各反应重复进行。在CFX96TM实时PCR检测系统（BioRad）上，在52℃、54℃、56℃、58℃和60℃下进行反应。对于首个50个循环，通过程序控制在1秒后读取各反应的荧光值，并且然后对于下50个循环，通过程序控制在25秒之后读取荧光值。
表15：用相匹配的底物对DNA核酶进行测试
底物 DNA核酶
Sub2SEQ ID NO：21 Dz2SEQ ID NO：133
Sub3SEQ ID NO：22 Dz3SEQ ID NO：134
Sub6SEQ ID NO：23 Dz6SEQ ID NO：135
Sub44SEQ ID NO：25 Dz44SEQ ID NO：136
Sub45SEQ ID NO：26 Dz45SEQ ID NO：137
Sub49SEQ ID NO：28 Dz49SEQ ID NO：138
Sub55SEQ ID NO：29 Dz55SEQ ID NO：139
Sub60T SEQ ID NO：72 Dz60SEQ ID NO：140
Sub61SEQ ID NO：73 Dz61SEQ ID NO：141
Sub72SEQ ID NO：75 Dz72SEQ ID NO：142
Sub73SEQ ID NO：76 Dz73SEQ ID NO：143
Sub74SEQ ID NO：77 Dz74SEQ ID NO：144
Sub75SEQ ID NO：78 Dz75SEQ ID NO：145
Sub77SEQ ID NO：79 Dz77SEQ ID NO：146
Sub79SEQ ID NO：80 Dz79SEQ ID NO：147
Sub80SEQ ID NO：81 Dz80SEQ ID NO：148
Sub84SEQ ID NO：84 Dz84SEQ ID NO：149
Sub85SEQ ID NO：85 Dz85SEQ ID NO：150
Sub86SEQ ID NO：86 Dz86SEQ ID NO：151
Sub87SEQ ID NO：87 Dz87SEQ ID NO：152
Sub88SEQ ID NO：88 Dz88SEQ ID NO：153
Sub89SEQ ID NO：89 Dz89SEQ ID NO：154
5.5.结果：在不同温度下，DNA核酶对底物的裂解
含有DNA核酶与相匹配的底物的各测试反应显示，荧光随时间而增加。在只有水的对照反应（没有加入DNA核酶）中，荧光值没有上升。这证明了，在含有DNA核酶的反应中产生的荧光的增加是由于DNA核酶对报告底物的结合及随后的催化裂解而引起的。
对于各底物数据集（测试和对照反应），将原始荧光数据点输出到Excel（微软）中，对重复值取平均数，然后进行归一化。在含有相同底物的反应的第一次读取时，将各平均化的数据点除以无DNA核酶反应的平均值，来进行归一化（例如将Sub61的测试反应的数据平均值，除以Sub61无DNA核酶对照反应的第1循环的荧光平均值；将Sub61无DNA核酶对照反应的数据平均值，除以Sub61无DNA核酶对照反应的第1循环的荧光平均值）。然后使用这些归一化数据，在反应开始之后大约10分钟时，通过将在10分钟时的测试反应的荧光归一化值除以在10分钟时的无DNA核酶反应的荧光归一化值来对信噪比进行计算。对DNA核酶与底物的各组合，在各测试温度下进行信噪比的计算。然后将信噪比值绘成柱状图，以比较各底物被其相匹配的DNA核酶在不同温度下的裂解的效率（图8，（i））。还可以对各底物在该温度范围上的信噪比的标准差进行计算并绘图，以确定在测试温度范围内具有一致的信噪比的底物（图8，（ii））。这表明这些底物相对于温度是稳健的。
由于实验误差，没有Sub2在54℃下或Sub79在58℃下的数据，然而这对数据的整体解释的影响不大。
对各底物的信噪比的分析（图8，（i））显示，系列1的底物（Sub2、Sub3和Sub6）在更低的测量温度下具有高的信噪比。然而，当反应温度升高时，这些底物的裂解效率急剧降低。对于系列2的底物的子集（Sub44、Sub45、Sub49和Sub60T），可以看到相似的模式。其他系列2的底物（Sub55）以及大多数所测试的系列3的底物（Sub61、Sub72、Sub74、Sub75、Sub79、Sub80、Sub84、Sub85、Sub86、Sub87、Sub88和Sub89）在所有测试温度下显示了高信噪比。系列3的底物Sub73和Sub77在所有测试温度下具有均匀的低的信噪比，指示尽管新的设计指导方针提供了稳健底物的设计的较好的可能性（对于这种应用，成功率是83%），但是仍然有一些满足这些指导方针的序列不适合用于MNA酶和/或DNA核酶诊断应用。Sub73和Sub77的结果还证明，使用DNA核酶用于对潜在的底物序列进行整群筛选来寻找适于MNA酶诊断应用的那些底物的方法可能漏掉对可在qPCR应用中稳健并高效地被MNA酶裂解的底物的检测，反之亦然（见实例2，Sub73和Sub77在MNA酶qPCR中的成功使用，图5）。
总的来说，大多数符合所有设计指导方针的底物（表9）显示了其在测试温度范围内的信噪比要比在一个或多个指导方针之外的底物的大（图8，（i））。更确切地说与Sub55、Sub61、Sub72、Sub74、Sub75、Sub79、Sub80、Sub84、Sub85、Sub86、Sub87、Sub88和Sub89的反应显示了在各测试温度下的高信噪比值，证明了这些底物是在一系列温度下的稳健底物。当针对各底物从在多个温度下的信噪比计算标准差时，这种改进更为明显（图8（ii））。可变性的测量指示，在所测试的温度范围中，系列2的底物Sub55以及系列3底物Sub61、Sub72Sub74、Sub75、Sub79、Sub80、Sub82、Sub83、Sub85、Sub86、Sub87、Sub88和Sub89在这些测试温度下具有相似的信噪比，证明它们在一个宽温度范围内是稳健的底物。应指出的是，尽管Sub60T、Sub73和Sub77没有证明其在该温度范围内具有信噪比的低标准差，其绝对信噪比在所有温度下都相当低，排除了这些底物在这个应用中是一种稳健的底物。
实例6：用MNA酶qPCR对通用底物的非特异性裂解进行测试。
MNA酶可被用于使用体外靶标扩增方法（如PCR）对靶标核酸的扩增进行实时监测。以一步法进行扩增和检测，其中PCR扩增和MNA酶介导的检测同时发生在一个单个试管中。可使用其感应臂对单独的靶标具有特异性的部分酶，在一个单个反应容器中对多种靶标进行扩增及检测。用于对第一靶标进行检测的部分酶将与第一底物结合并将其裂解，用于对第二靶标进行检测的部分酶将与第二底物结合并将其裂解，以此类推。为了使靶标检测具有特异性，被设计成对在反应混合物中的任何其他底物进行裂解的部分酶对底物的非特异性裂解不可以存在。
MNA酶部分酶的底物感应臂与存在于反应中的其他底物的互补性的程度可影响结合的特异性。与核糖核苷酸最接近的碱基的完全互补性对特异性裂解更为关键。用于生成被高效裂解的通用底物的设计指导方针包括对通用底物的序列组成的限制，即核糖核苷酸周围的十个碱基（N4-N13）中有七个或更多个胞嘧啶核苷酸；与核糖核苷酸紧紧相邻的碱基是胞嘧啶（N8和N9）；底物的总含量具有>64%的嘧啶。这些限制可能会导致接近核糖核苷酸的底物序列的相似性，并且可能会导致部分地匹配的部分酶对通用底物的非特异性裂解，尤其是在其中一系列的通用底物和与其相关联的部分酶存在于一个单一的反应混合物中的多重模式中。如果底物以一种非特异性方式被部分地匹配的被设计成特异性裂解第二底物的部分酶所裂解，那么底物的特定组合可能不适用于以多重形式使用。
在这个实例中，对通用底物Sub44、Sub55、Sub61、Sub65、Sub72和Sub74，针对它们被与Sub44、Sub55、Sub72和Sub74相关联的部分酶进行非特异性裂解的活性进行测试。这涉及使用部分酶对单独地测试各通用底物，这些部分酶对被设计成可完全互补地与其他底物结合，用于观察在MNA酶qPCR中方式中是否检测到信号。针对这项测试选择Sub72和Sub74的部分酶，因为它们对应的底物只有3个碱基是不同的（图9，（i）a和（ii）a）。选择用Sub61和Sub65来测试Sub55的部分酶，因为它们的核糖核苷酸周围的中心区（N4-N13）非常相似（图9，（iii）a）。选择Sub44的部分酶作为对照，因为它们与其他底物不太相似（图9，（iv）a）。
6.1.部分酶寡核苷酸
在这些用于对非互补性部分酶的非特异性裂解进行测试的实验中，部分酶寡核苷酸A和B被设计成其靶标感应臂与人RPL13a基因是互补的，并且其底物感应臂与如上所讨论的各通用底物是互补的。以下从5’到3’列出了部分酶A和B的序列，其中加下划线的碱基与底物进行杂交。“-P”是指寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO：155 部分酶A RPL13aA/44-P：
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGAGACCTG
SEQ ID NO：156 部分酶B RPL13aB/44-P：
TCACTATAGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
SEQ ID NO：118 部分酶A RPL13aA/55-P
TTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：119 部分酶B RPL13aB/55-P
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
SEQ ID NO：157 部分酶A RPL13aA/72-P：
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO：158 部分酶B RPL13aB/72-P：
CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
SEQ ID NO：159 部分酶A RPL13aA/74-P：
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGGGGAGTGAT
SEQ ID NO：160 部分酶B RPL13aB/74-P：
CTGGGAGGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
6.2.报告底物
在当前实例中，底物的5’端用6-FAM部分进行末端标记（在下文底物的名称中由“F”指示），并且3’端用爱荷华黑FQ猝灭剂部分进行末端标记（在下文底物的名称中由“IB”指示）。在530nm处（FAM发射波长）对底物的裂解进行监测，并且在485nm处激发（FAM激发波长）。以下从5’至3’显示了用于此实例的报告底物的序列。小写字母的碱基代表RNA，而大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：25 Sub44-FB：
CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGA
SEQ ID NO：29 Sub55-FB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：73 Sub61-FB：
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO：74 Sub65-FB：
TCTCGACCTCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO：75 Sub72-FB：
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
SEQ ID NO：77 Sub74-FB：
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
6.3.RPL13a的扩增的靶标序列和PCR引物
用于此实例的靶标序列是一种来自RPL13a基因的PCR扩增子，是由从IM9细胞系（Promega）中提取的人基因组DNA的体外PCR扩增而产生的，以下列出了所使用的寡核苷酸PCR引物。以下从5’至3’显示了用于此实例的报告底物的序列。
SEQ ID NO：161 正向引物5RPL13a：
ACCGGAAGAAGAAACAGCTCA
SEQ ID NO：162 反向引物3RPL13a：
GAGGAATTAACAGTCTTTATTGG
6.4.反应组分：通用底物的特异性和非特异性裂解的扩增和测量
在25μL的总反应体积中，进行对靶标序列的实时PCR扩增和检测。所有反应都是在Mx3005P QPCR系统（Stratagene）上进行的。循环参数是：95℃2分钟，95℃15秒和52℃60秒进行40个循环（在52℃步骤收集数据）。用如在表16中的底物及部分酶建立反应。对各组反应条件重复进行测试，并且包含40nM的5RPL13a和200nM的3RPL13a、200nM的部分酶A、200nM的部分酶B、200nM的底物、8mM的MgCl2、各dNTP200μM、10个单位的核糖核酸酶（Promega）、1×Immobuffer（Bioline）、2个单位的MyTaqHSTMDNA聚合酶（Bioline）以及基因组DNA模板（50ng）或无靶标（NF-H2O）。
表16：用于各通用底物的部分酶组合
6.5.结果：测量由MNA酶进行的特异性以及潜在的非特异性裂解
在所有含有基因组DNA和带有部分酶的通用底物的反应中，都出现荧光增加，这些部分酶的底物感应臂与该通用底物是完全互补的（即用于对特异性裂解进行测试的反应）。无DNA靶标对照的荧光值低于用于对特异性裂解进行测试的反应中的荧光值，证明了在用于对特异性裂解进行测试的反应中的荧光的增加是由于：催化活性MNA酶的靶标依赖性组装，进而可对完全互补的通用报告底物进行裂解。
在对交叉反应性进行测试的反应中，荧光没有增加（图9，（i）b-（iv）b）。这证明，被设计成对密切相关的这些通用底物进行裂解的部分酶只对与其完全互补的底物进行裂解。这些数据显示，这些通用底物在多重MNA酶qPCR测定中是相容的。
实例7：对于DNA核酶对通用底物的非特异性裂解进行测试
10-23DNA核酶是一种单分子结构，可与底物序列直接结合，并修饰该底物序列。与MNA酶不同，10-23DNA核酶不需要靶标序列来形成活性核心，因此，10-23DNA核酶对底物的结合以及随后的裂解不会受靶标序列影响，或者不需要具有分离的催化核心。
DNA核酶的感应臂与底物的互补性的程度可影响结合的特异性。与核糖核苷酸最接近的碱基的完全互补性对特异性裂解更为关键。用于生成被高效裂解的通用底物的设计指导方针包括对通用底物的序列组成的限制，即核糖核苷酸周围的十个碱基（N4-N13）中有七个或更多个胞嘧啶核苷酸；与核糖核苷酸紧紧相邻的碱基是胞嘧啶（N8和N9）；底物的总含量具有>64%的嘧啶。这些限制可以导致接近核糖核苷酸的底物序列的相似性，并且可能会导致部分地匹配的DNA核酶对通用底物的非特异性裂解，尤其是在其中一系列的通用底物和与其相关联的DNA核酶存在于一个单一的反应混合物中的多重模式中。如果底物以一种非特异性方式被部分地匹配的被设计成特异性地裂解第二底物的DNA核酶所裂解，那么底物的特定组合可能不适用于以多重形式使用。
在此实例中，针对非特异生裂解活性，对通用底物Sub55、Sub61、Sub72、Sub74、Sub75、Sub79、Sub80和Sub85及与其相关联的10-23DNA核酶进行测试。这涉及使用DNA核酶单独地对每个通用底物进行测试，这些DNA核酶被设计成可完全互补地与所有其他底物结合，以便观察在等温检测模式下是否可检测到信号。选择这些底物进行检测，是因为它们在底物的不同区域中具有相似的序列。
7.1.10-23DNA核酶寡核苷酸
下文从5’至3’列出了10-23DNA核酶，这些DNA核酶用于通过非互补性DNA核酶进行非特异性裂解测试的实验中，其中加下划线的碱基与底物杂交，并且以斜体表示的碱基形成催化核心。以下一些DNA核酶序列在最5’和3’端包含额外的G。这些增加的碱基不会与底物序列杂交，并且不会影响DNA核酶对底物进行裂解的效率。
SEQ ID NO：139 DNA核酶Dz55
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
SEQ ID NO：141 DNA核酶Dz61
GTGGCGTGGAGAGGCTAGCTACAACGAGGGGTCGAGG
SEQ ID NO：142 DNA核酶Dz72
GCTGGGAGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTGATG
SEQ ID NO：144 DNA核酶Dz74
GCTGGGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGTGATG
SEQ ID NO：145 DNA核酶Dz75
GTAGTGGGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGAGGGTCAG
SEQ ID NO：147 DNA核酶Dz79
GGGTTGAAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGAGGAG
SEQ ID NO：148 DNA核酶Dz80
GGGTTCACGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGGCGGTTGG
SEQ ID NO：150 DNA核酶Dz85
GCTGGGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
7.2.报告底物
在当前实例中，底物的5’端用6-FAM部分进行末端标记（在下文底物的名称中由“F”指示），并且3’端用爱荷华黑FQ猝灭剂部分进行末端标记（在下文底物的名称中由“IB”指示）。在510-530nm之间（CFX96（BioRad）上的FAM发射波长范围）对底物的裂解进行监测，并且在450-490nm之间（CFX96（BioRad）上的FAM激发波长范围）激发。以下从5’至3’显示了用于此实例的报告底物的序列。小写字母的碱基代表RNA，而大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：29 Sub55-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：73 Sub61-FIB：
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO：75 Sub72-FIB：
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
SEQ ID NO：77 Sub74-FIB：
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
SEQ ID NO：78 Sub75-FIB：
TGACCCTCCTCguCTCCCCACTA
SEQ ID NO：80 Sub79-FIB：
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
SEQ ID NO：81 Sub80-FIB：
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
SEQ ID NO：85 Sub85-FIB：
ACCGCACCTCguCCCCTCCCAG
7.3.反应组分：测量由DNA核酶在52℃和58℃对通用底物进行的特异性和潜在非特异性的裂解
通过对由DNA核酶对底物的结合及随后的修饰而产生的荧光信号进行监测，来对通用底物的裂解进行测量。DNA核酶对通用底物的裂解将导致荧光团与猝灭剂的分离，产生荧光的增加。所有反应，如在表17中所概述的，包含1×PCR缓冲液II（应用生物系统公司（Applied Biosystems））、10mMMgCl2、200nM底物以及NF-H2O，总体积是25μL。在作为“测试”（加入10nM DNA核酶）或“对照”（加入NF-H2O）反应时，各反应重复进行。在CFX96TM实时PCR检测系统（BioRad）上，在52℃和58℃下进行反应。对于首个50个循环，通过程序控制在1秒后读取各反应的荧光值，然后对于下50个循环，通过程序控制在25秒之后读取荧光值。
表17：针对特异性和非特异性裂解所测试的DNA核酶-底物组合
测试；底物与DNA核酶臂完全互补（用于特异性裂解的测试）
-ve；对照反应，底物与DNA核酶臂不完全互补（用于非特异性裂解的检测）
7.5.结果：测量由DNA核酶对通用底物的特异性和潜在非特异性的裂解
在含有DNA核酶及其完全互补的底物的各“测试”反应中，荧光有增加。在任何不含有DNA核酶（未加入DNA核酶）的反应中，荧光没有增加。这证明了，在含有DNA核酶的“测试”反应中产生的荧光的增加是由于DNA核酶对报告底物的结合及随后的催化裂解而造成的。
对于各底物数据集（测试和对照反应），将原始荧光数据点输出到Excel（微软）中，对重复值取平均数，并且然后进行归一化。通过在含有相同底物的反应的第一次读取之后，将各平均数据点除以无DNA核酶反应的平均值来进行归一化（例如，将对于Sub61的测试反应的荧光平均值除以Sub61无DNA核酶反应的第1循环的荧光平均值（在第1个8秒之后）；将Sub61的无DNA核酶对照反应的荧光平均值除以无DNA核酶对照反应的第1循环的荧光平均值）。然后使用这些归一化数据，通过将在10分钟时的测试荧光归一化值除以在10分钟时的无DNA核酶的荧光归一化值来对10分钟时的信噪比进行计算。针对各温度进行信噪比的计算。然后将信噪比值绘成柱状图，以便比较在不同检测温度下各通用底物被各DNA核酶裂解的效率（图10，（i）和(ii)）。
底物与非互补性DNA核酶的不同组合的一些反应显示，与配对的无DNA核酶对照反应相比，其荧光水平略微增加。这个信号不会随时间而增加，并且因此不指示非互补性DNA核酶对通用底物的裂解。显示这种水平背景荧光的检测图的信噪比都小于1.2。显示信噪比在1.2以上的任何反应都因此被认为是（i）指示通用底物的裂解（特异性的或非特异性的），或（ii）指示底物与非互补性DNA核酶的特定组合产生了一定水平的背景噪声，这种背景噪声可与特异性裂解在多重形式中区分开。
在两种测试温度下，通用底物及与其完全匹配的DNA核酶的任所有组合显示了高信噪比（在阈值1.2以上）（图10，（i）和（ii））。
在任一温度下，非互补性DNA核酶均没有对通用底物Sub61、Sub74、Sub75、Sub79和Sub80产生非特异性裂解（图10、（i）和（ii））。
在52℃下，一些通用底物被与该底物不完全匹配的DNA核酶所裂解（其中裂解被定义为信噪比在如上所述的阈值1.2之上）。显示非特异性裂解的组合是：被Dz55非特异性裂解的Sub85、被Dz74和Dz85非特异性裂解的Sub72、以及被Dz85非特异性裂解的Sub55（图10，（i））。
可以预期Dz85对Sub55的非特异性裂解，因为Sub55与Dz85只有四个碱基是不同的。Sub55与Dz85的比对显示，四个碱基错配是位于3’底物臂上的远离核糖核苷酸邻近的关键区域的远端（表18）。进一步地，4个碱基中的一个是G/T错配，本领域中已知该错配与某些亲和性有关系，尽管该错配弱于A/T和G/C匹配。也可以预期Dz55对Sub85的非特异性裂解，这是由于Sub85与Dz55只有五个碱基对是不同的，并且发现这五个碱基错配是位于3’底物臂上的远离核糖核苷酸邻近的关键区域的远端（表18）。然而，与上述的反向方案不同，不存在G/T错配，并且因此显现Sub85不会如Sub55与Dz85的反向组合一样被高效裂解。可以预期Dz74对Sub72的非特异性裂解，因为Sub72与Sub74只有3个碱基是不同的。Sub72与Dz74的比对显示，与核糖核苷酸最接近的两种错配是G/T错配（表18）。这还解释了为什么Sub74不会被Dz72裂解，因为两种错配是C/A并且其发生处与核糖核苷酸非常接近，并且这足以使底物不能被DNA核酶裂解（表18）。可以通过对表18中的序列的比对来解释Dz85对Sub72的非特异性裂解，该比对显示错配碱基主要是G/T，并且这因此可致使Dz85与Sub72结合并裂解Sub72。再次地，不可以预期Dz72对Sub85的非特异性裂解的反向的情况，这是因为相关的错配变为更不稳定的C/A错配，这种C/A错配不可能导致DNA核酶与底物之间的足够强的结合而致使裂解。
表18.观察到非特异性裂解时对底物与DNA核酶的比对。
^底物序列是从5’至3’书写的，DNA核酶序列是从3’至5’书写的。错配的碱基用粗体和下划线表示，G/T错配的碱基只用粗体表示。DNA核酶核心序列用斜体表示。
将反应温度上升至58℃，形成用于寡核苷酸杂交的更为严格的条件，并且致使在52℃所见到的几乎所有非特异性裂解的丢失（图10，（ii））。在58℃时显示非特异性裂解的通用底物与DNA核酶的唯一组合是Sub55被Dz85非特异性地裂解。预期有这种非特异性，是由于Sub55与Dz85只有四个碱基是不同的，并且发现这四种碱基错配是在底物臂的远离核糖核苷酸邻近的关键区域的远端，并且其中一种错配是G/T（表18）。即使在Sub72与Sub74之间只有三种碱基不同，这三种碱基错配发生在靠近核糖核苷酸的关键区域，并且因此对于特异性更为关键，并且在为寡核苷酸的结合创造了更严格条件的更高温度下将会更为不稳定。
这些结果证明，设计指导方针产生的通用底物可在用于涉及10-23DNA核酶的应用中的一系列温度下被有效地多重化。有需求对反应温度进行某些优化，以便为底物的一些组合的结合提供充分的严格性，但是总的来说，这些指导方针产生了可被多重化的几组底物。本领域技术人员可以领会到，可对底物以及DNA核酶结合臂的长度进行调节，以在更低和更高的温度下形成更严格的结合。
实例8：将通用底物用于多重MNA酶qPCR，以用于在退火温度是52℃或58℃的多重反应中对五种不同的核酸靶标进行定量。
可使用如qPCR等体外靶标扩增方法对多种靶标同时进行扩增和实时检测。进一步地，可在一个包括多种独特的MNA酶的多重反应中对这些靶标的扩增进行同时实时监测。各MNA酶可被设计成其感应臂对于一种靶标具有特异性，并且其底物臂对于一系列通用底物中的唯一成员具有特异性。如果该系列通用底物的每一个是由不同的荧光团进行标记的，可单独地检测各靶标。以一步法对多个靶标进行扩增和检测，其中PCR扩增和MNA酶介导的检测同时发生在一个单个试管中。实时监测可生成一个扩增曲线，由曲线的形状（倾斜度以及达到反应平台的速度）可以指示反应效率。
本领域中所用的MNA酶qPCR的退火/检测温度是在50℃与54℃之间。这个温度是基于以下事实说明的：本领域已知的通用底物对其被高效裂解的温度有限制，其中54℃对于系列1的通用底物的高效裂解来说是上限。需要一组可与多重反应结合并在更高温度下被高效裂解的通用底物。这不仅允许对在更高温度下退火的并且靶向富含G/C模板的引物和部分酶的设计有更大的灵活性，而且还使得MNA酶qPCR检测能够与其他如（其标准退火/检测温度范围是60℃-65℃）等本领域中熟知的实时化学反应多重化。如果在更大范围的温度下可以一起很好发挥作用的底物存在，通用底物的实用性将会得到很大提高。
在此实例中，进行了两种多重反应，均包括被设计成检测五种不同靶标（称为人TFRC、HPRT、TP53、RPL13a和CYP2C9基因）的MNA酶。在多重反应1中，各靶标MNA酶被设计成裂解系列1的通用底物Sub2、Sub3、Sub4、Sub6和Sub7中的一种，并且在多重反应2中，各靶标MNA酶被设计成裂解系列2或3的通用底物Sub55、Sub61、Sub74、Sub79和Sub80中的一种。应领会到，可根据方法使用不同数量的靶标，并且本领域的技术人员可设计适当的对任何靶标进行检测的部分酶。
将这两种多重反应进行比较，从而通过查看曲线形状（倾斜度以及达到反应平台的速度）来确定各组通用底物的裂解效率。在此实例中，在一种有利于所有底物的温度52℃下以及在系列1的底物的有效温度范围以外的一种温度58℃下，对扩增和检测进行比较。
8.1.部分酶寡核苷酸
以下从5’至3’列出了各靶标的部分酶A和B的序列。对于各靶标，部分酶是被设计成可与原来的系列1的通用底物中的一种以及新的来自系列3的改进的底物中的一种一起使用。在以下序列中，加下划线的碱基与底物进行杂交。“-P”是指寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO：157 部分酶A RPL13aA/6-P
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO：163 部分酶B RPL13aB/6-P
CTGGGAGGAAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
SEQ ID NO：120 部分酶A RPL13aA/80-P
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGGCGGTT
SEQ ID NO：121 部分酶B RPL13aB/80-P
GGTTCACGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
SEQ ID NO：96 部分酶A CYP2C9A/3-P
GGGAAGAGGAGCATTGAGGAACAACGAGGTTGTGCTG
SEQ ID NO：97 部分酶B CYP2C9B/3-P
CGGTTGGTGAGGCTAGCTCCGTGTTCAAGAGGAAGC
SEQ ID NO：98 部分酶A CYP2C9A/61-P
GGGAAGAGGAGCATTGAGGAACAACGAGGGGTCGAG
SEQ ID NO：99 部分酶B CYP2C9B/61-P
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCCGTGTTCAAGAGGAAGC
SEQ ID NO：164 部分酶A TP53A/4-P
GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGTGCGCCATG
SEQ ID NO：165 部分酶B TP53B/4-P
TACTTCTCCCAAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG
SEQ ID NO：106 部分酶A TP53A/79-P：
GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGGGGAGAGGA
SEQ ID NO：107 部分酶B TP53B/79-P：
GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG
SEQ ID NO：34 部分酶A TFRCA/2-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO：35 部分酶B TFRCB/2-P：
TGCCCAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：58 部分酶A TFRCA/74-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGTGAT
SEQ ID NO：59 部分酶B TFRCB/74-P：
CTGGGAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：166 部分酶A HPRTA/7-P
CTGAATAGAAATAGTGATAGATCACAACGAGTGCCATGTTAA
SEQ ID NO：167 部分酶B HPRTB/7-P
TATCACAGCCAAGGCTAGCTCATTCCTATGACTGTAGATTTTA
SEQ ID NO：168 部分酶A HPRTA/55-P
CTGAATAGAAATAGTGATAGATCACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：169 部分酶B HPRTB/55-P
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCATTCCTATGACTGTAGATTTTA
8.2.报告底物
对于此实例，在各多重反应中，在一个反应室中一起使用五种不同的通用底物。在各多重反应中的各通用底物是用五种不同的荧光团中的一种进行标记的。在当前实例中，底物的5’端用荧光团进行末端标记，并且3’端用猝灭剂部分进行标记（表19）。在不同的发射和激发波长下对这些底物的裂解进行监测（表19）。
表19.底物及其荧光标记
^BHQ1；黑洞（black hole）猝灭剂1，BHQ2；黑洞（black hole）猝灭剂2，IB；爱荷华黑（Iowa black）FQ，IBR；爱荷华黑（Iowa black）RQ
*CFX96实时PCR检测系统(Biorad)激发，并且测定各荧光团在各通道的一系列波长下的发射。
以下从5’至3’列出了在这个实例中所测试的报告底物的序列。小写字母的碱基代表RNA，而大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：21 Sub2-Q705B2：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
SEQ ID NO：22 Sub3-FIB：
CAGCACAACCguCACCAACCG
SEQ ID NO：23 Sub6-Q670B2：
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
SEQ ID NO：24 Sub7-JB：
TTAACATGGCACguTGGCTGTGATA
SEQ ID NO：171 Sub4-TRB2：
CATGGCGCACguTGGGAGAAGTA
SEQ ID NO：73 Sub61-FIB：
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO：77 Sub74-Q705B2：
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
SEQ ID NO：80 Sub79-TRIBR：
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
SEQ ID NO：81 Sub80-Q670B2：
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
SEQ ID NO：29 Sub55-HIB：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
8.3用于CYP2C9、TP53、HPRT、TFRC和RPL13a基因扩增的靶标序列和PCR引物
通过从IM9细胞系（Promega）中提取的人DNA的体外扩增可产生用于所有五种基因的靶标PCR扩增子。使用以下从5’至3’列出的寡核苷酸PCR引物可产生这些扩增子。用粗体表示的序列与通用标签（U1、U2或U3）是相对应的，该通用标签增加了引物的Tm而不会影响引物对基因靶标的特异性。这种标签在PCR反应中提高了扩增效率。
SEQ ID NO：91 正向引物5TFRC_U1
GCTAAAACAATAACTCAGAACTTACG
SEQ ID NO：92 反向引物3TFRC_U2
CAGCTTTCTGAGGTTACCATCCTA
SEQ ID NO：125 正向引物5TP53_U3
CTAACTTACTGCCTCTTGCTTCTC
SEQ ID NO：126 反向引物3TP53_U2
CAGCTCTGTGCGCCGGTCTCTC
SEQ ID NO：127 正向引物5RPL13a_U3
CTAAACCGGAAGAAGAAACAGCTCA
SEQ ID NO：128 反向引物3RPL13a_U2
CAGGAGGAATTAACAGTCTTTATTGG
SEQ ID NO：129 正向引物5CYP2C9_U3
CTAACCTCATGACGCTGCGGAA
SEQ ID NO：130 反向引物3CYP2C9_U2
CAGATATGGAGTAGGGTCACCCA
SEQ ID NO：176 正向引物5HPRT_U3
CTAACTTTGCTGACCTGCTGGATTA
SEQ ID NO：177 反向引物3HPRT_U2
CAGCAATAGCTCTTCAGTCTGATAA
8.4.反应组分：多重MNA酶qPCR模式中靶标序列的扩增和检测
在25μL的总反应体积中对靶标序列进行实时扩增和检测。所有反应是在CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad）中进行的。循环参数是：1）95℃2分钟，95℃15秒和52℃60秒进行40个循环，或2）95℃2分钟，95℃15秒和58℃60秒进行40个循环。在52℃或58℃步骤收集荧光数据。各多重反应重复进行，并且含有10mM MgCl2、200μM dNTP、10个单位的RiboSafe核糖核酸酶抑制剂（Bioline）、1×Immobuffer（Bioline）、2个单位的MyTaqHS（Bioline）。在表20中列出了部分酶、引物和底物的身份及其各自的浓度。反应含有DNA模板（100ng或391pg）或无靶标对照（NF-H20）。
用如表20中的引物、底物及与其相关联的部分酶建立多重反应（多重反应1或多重反应2）。对于两种多重反应使用相同的PCR引物，并且所有的部分酶具有相同的靶标感应部分。因此，对相同的靶标进行检测的反应的效率的任何差异是由底物的裂解效率的差异所引起的。
表20.用于各多重反应的寡核苷酸组合
8.5.结果：在多重MNA酶qPCR模式中靶标的扩增和报告底物的裂解
含有人基因组DNA的各多重反应显示，对于CYP2C9、TP53、HPRT、RPL13a和TFRC基因的实时检测，荧光随着时间而增加。对于所有反应，无DNA靶标对照的荧光值低于含有DNA靶标的反应中的荧光值。这证实了，在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于：催化活性MNA酶的靶标依赖性组装，进而对通用底物中的一种进行裂解。
CYP2C9、TP53、HPRT、RPL13a和TFRC基因在52℃下的扩增图证明，使用了新的改进的系列2和3通用底物的多重反应2（图11，（i））具有更陡的曲线，与使用了系列1通用底物的多重反应1（图11，（i））相比可更快地到达平台。在52℃下Sub2和Sub74对于检测TFRC的扩增图中，只有很小的差异。本领域的技术人员将会领会到，相对系列2和3的底物，使用了系列1底物的多重反应1的所有扩增图都具有足够好的质量，在对这些靶标的检测领域中是易于被接受的。
CYP2C9、TP53、HPRT、RPL13a和TFRC基因在58℃下的扩增图证明，使用了新的改进的系列2和3通用底物的多重反应2（图11，（ii））具有显著更陡的曲线，比使用了系列1的通用底物的多重反应1（图11，（ii））可更快地到达平台。进一步地，本领域的技术人员会承认，通过在多重反应1中使用Sub2、Sub3、Sub6和Sub7而产生的扩增曲线可能不具有可用于靶标的稳健检测的足够质量，并且因此通常不能在此领域中被接受。
总的来说，新的系列2和3底物显示了改进的质量，并且因此显示MNA酶qPCR反应中使用的当前温度下多重数据的改进的稳健性，并且使得可在一种大大高于先前能用的温度下进行多重检测。这些新的设计指导方针增加了设计通用底物的可能性，延伸了在MNA酶qPCR中使用的当前温度下进行多重反应的能力，并且可在更高的反应温度下产生稳健数据。
实例9：被设计成在不同的温度下具有功能的通用底物与MNA酶在实时PCR中的使用。
已经使用一组新的设计指导方针发明了一系列新的高度活性底物，以便与10-23DNA核酶或基于10-23DNA核酶的MNA酶一起使用。
MNA酶可被定制为可通过底物在不同温度下的裂解或连接而产生一种可检测效应。MNA酶或DNA核酶的催化活性的效率和严格性可通过改变反应温度来操纵。对催化活性效率和严格性进行优化的另一种方式是更改一种或多种底物的Tm和/或长度以及匹配的部分酶或匹配的DNA核酶的Tm和/或长度。通过将核苷酸加在底物序列的5’和/或3’端，可提高底物的Tm。可在设计指导方针内作出这些改变。被选择用于这种延伸的核苷酸还可对Tm具有效应。在3’或5’端添加额外的G或C碱基，与添加额外的A或T碱基相比，将对Tm具有更大的影响。类似地，可通过将核苷酸从3’或5’端移走而降低底物的Tm。MNA酶部分酶和DNA核酶可被截短或延伸来与经过调节的底物序列相匹配。
在此实例中，系列2的底物Sub55的长度和碱基组成可被更改来产生一系列具有不同Tm的衍生的底物（表21）。这些更改包括通过将一个至三个核苷酸从5’和3’端的各端移走而将底物截短；通过在5’和3’端两端添加核苷酸而使底物延伸。还可通过对在5’和3’端具有添加的A或C核苷酸的底物进行设计，来对添加不同的核苷酸产生这种延伸的效应进行测试。然后在MNA酶qPCR反应中对得到的底物进行测试，从而对底物衍生物的设计灵活性以及它们在一系列温度下的实用性进行评估。以一步法进行PCR扩增和MNA酶介导的检测，其中PCR扩增和MNA酶介导的检测同时发生在一个单个试管中。可通过在许多退火温度下产生的Ct值对底物的裂解效率进行测量。产生更低Ct值的反应指示特异性底物的更有效的裂解，因为此类反应能更快地达到阈值循环。
表21：Sub55及衍生物
^所有序列是从5’至3’书写的；大写字母的碱基代表DNA，小写字母的碱基代表RNA
*在此给出的Tm等于结合碱基的解链温度，采用华莱士律进行计算–只用于对与其互补物杂交的碱基的计算。当底物与基于10-23DNA核酶的MNA酶结合时，“g”核糖核苷酸保持不结合，因此不会贡献于整体结合的Tm。
9.1.部分酶寡核苷酸
在用于测量在表21中所述的Sub55及其衍生物的催化活性率的实验中，部分酶寡核苷酸A和B被设计成其靶标感应臂与人TFRC基因是互补的。以下从5’到3’列出了部分酶A和B的序列，其中加下划线的碱基与底物进行杂交。“-P”是指寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO：179 部分酶A TFRCA/55（18）-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCG
SEQ ID NO：180 部分酶B TFRCB/55（18）-P：
AGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：181 部分酶A TFRCA/55（16）-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGC
SEQ ID NO：182 部分酶B TFRCB/55（16）-P：
GCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：183 部分酶A TFRCA/55（23A）-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGTT
SEQ ID NO：184 部分酶B TFRCB/55（23A）-P：
TGAGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：185 部分酶B TFRCA/55（23C）-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGTG
SEQ ID NO：186 部分酶B TFRCB/55（23C）-P：
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO：46 部分酶A TFRCA/55-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO：45 部分酶B TFRCB/55-P：
GAGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
9.2.报告底物
在当前的实例中，底物在5’端用Quasar670部分进行末端标记，并且在3’端用BHQ2部分进行末端标记。在665nm处（Quasar670发射波长）对底物的裂解进行监测，并且在635nm处激发（Quasar670激发波长）。以下从5’至3’列出了在此实例中所测试的报告底物的序列。小写字母的碱基代表RNA，而大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：29 Sub55-Q670B2：
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO：172 Sub55（16）-Q670B2：
GCACCTCguCCCCAGC
SEQ ID NO：173 Sub55（18）-Q670B2：
CGCACCTCguCCCCAGCT
SEQ ID NO：174 Sub55（23A）-Q670B2：
AACCGCACCTCguCCCCAGCTCA
SEQ ID NO：175 Sub55（23C）-Q670B2：
CACCGCACCTCguCCCCAGCTCC
9.3.用于TFRC扩增的靶标序列和PCR引物
用于此实例的靶标序列是一种PCR扩增子，是由从IM9细胞系（Promega）中提取的人基因组DNA的体外PCR扩增而产生的，以下列出了所使用的寡核苷酸PCR引物。引物序列是从5’到3’列出的。
SEQ ID NO：187 正向引物5TFRC：
AACAATAACTCAGAACTTACG
SEQ ID NO：188 反向引物3TFRC：
CTTTCTGAGGTTACCATCCTA
9.4.反应组分：靶标序列的扩增和检测
在25μL的总反应体积中，进行对靶标序列的实时扩增和检测。所有反应都是在Mx3005P QPCR系统（Stratagene/安捷伦）上进行的。循环参数随着退火温度各不相同，（如下加下划线的），并且是下面的任一种，
1）95℃10分钟，95℃15秒和55℃30秒进行5个循环，95℃15秒和50℃60秒进行50个循环，或者
2）95℃10分钟，95℃15秒和55℃30秒进行5个循环，95℃15秒和52℃60秒进行50个循环，或者
3）95℃10分钟，95℃15秒和55℃30秒进行5个循环，95℃15秒和55℃60秒进行50个循环，或者
4）95℃10分钟，95℃15秒和55℃30秒进行5个循环，95℃15秒和60℃60秒进行50个循环。
所有荧光数据都是在退火温度下收集的。用在表22中的底物及其相关联的部分酶建立反应。各组反应条件重复运行，并且包含40nM的5TFRC、200nM的3TFRC、部分酶A和部分酶B各200nM，200nM的底物、8mMMgCl2、各dNTP200μM、10个单位的Rnasin（Bioline）、1×Immobuffer（Bioline）、1个单位的Immolase(Bioline)、以及基因组DNA模板（100ng）或无靶标（NF-H2O）。建立单独的反应来对各底物用其相匹配的部分酶进行测试。对于所有反应使用相同的PCR引物，并且所有的部分酶具有相同的靶标感应部分。因此，反应效率的任何差异是由在不同温度下底物的裂解效率的差异所引起的。
表22：用于各通用底物的部分酶组合
9.5.结果：靶标的扩增以及报告底物的裂解
含有人基因组DNA的各反应显示，使用Sub55以及不同的衍生物来对TFRC基因进行的实时检测中，荧光随着时间而增加。无DNA靶标对照的荧光值低于含有DNA靶标的反应中的荧光值。这证实了，在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于：催化活性MNA酶的靶标依赖性组装，进而对通用底物中的一种进行裂解。
通过Ct测量的反应效率将取决非于反应温度（退火/裂解温度）与在反应中所用的底物的Tm的相容性。不同的Sub55衍生物具有不同的长度和核苷酸组成，并因此具有不同的解链温度（Tm），并且因此被预期在所测试的不同退火温度（50℃、52℃、55℃和60℃）下的表现各不相同。在表23中的结果显示了在不同反应温度下的各底物的Ct。用粗体表示的Ct值指示在所指温度下表现最高效的一种或多种底物。
在更低的温度下，更短的底物（Sub55（18））表现更好（具有最低Ct值）。当退火温度升高时，长度增加的并且由此Tm也增加的底物表现最优。本领域普通技术人员可通过从5’和/或3’端延长或缩短底物臂和/或改变底物的5’和3’端的核苷酸组成而得到可在所选反应温度下被高效裂解的底物的衍生物。
表23：用于在不同退火温度下使用Sub55及衍生物进行的MNA酶qPCR的Ct值
名称 50℃ 52℃ 55℃ 60℃
Sub55(16) 26.1 26.7 31.2 n/a
Sub55(18) 23.9 23 24.8 n/a
Sub55 24.4 22.8 23.0 26.8
Sub55(23A) 25.3 23.9 23.0 25.8
Sub55(23C) 25.8 24.1 23.9 26.2
实例10：退火温度58℃下进行的MNA酶qPCR中通用底物的使用。
MNA酶可被用于使用体外靶标扩增方法（如PCR）对靶标核酸的扩增进行实时监测。进一步地，在qPCR过程中使用荧光团-猝灭剂对标记的MNA酶底物而进行的实时监测生成了一个曲线，在该曲线上，荧光的任意水平的阈值线可被放在反应的指数期，产生了一个称为Ct（循环阈值）的值。产生更低Ct值的反应指示特异性底物的更有效的裂解，因为此类反应能更快地达到阈值循环。在此实例中，以一步法进行扩增和检测，其中PCR扩增和MNA酶介导的检测同时发生在一个单个试管中。当所有其他反应条件相同时，通用底物的序列可对Ct值产生影响。本领域中所用的MNA酶qPCR的退火/检测温度是在50℃与54℃之间。这个温度是基于以下事实说明的：本领域已知的通用底物对其被高效裂解的温度有限制，54℃对于系列1的通用底物来说是上限。需要更高温度下裂解的通用底物，以允许在更高温度下退火的引物和部分酶的设计具有更大的灵活性。这种对引物和部分酶的设计灵活性对于许多应用都非常有益，如在其序列中具有高比例G和C碱基的感兴趣的基因靶标需要更高的反应温度并且由此需要具有更高Tm的部分酶和引物以用于特定检测。
对基于系列1和2底物性能的底物裂解效率的研究，导致有助于设计第三轮底物的指导方针的开发，其结果是系列3的底物。这些指导方针包括但不限于（i）核糖核苷酸周围的十个碱基（N4-N13）中有七个或更多个胞嘧啶核苷酸，（ii）与核糖核苷酸紧紧相邻的碱基是胞嘧啶（N8和N9），（iii）底物的总含量具有>64%的嘧啶，以及（iv）寡核苷酸的总Tm是66℃或更高（其中这个后面的指导方针只用于底物裂解的温度在50℃以上的情况）。
在此实例中，将系列2的通用底物Sub59与系列3的底物Sub77进行比较，来比较它们在58℃下在实时PCR中的裂解效率，从而确保这些设计指导方针可产生具有在升高的温度下用于MNA酶qPCR的较高可能性的通用底物。通过对含有不同通用底物的反应的Ct值进行测量来确定裂解效率的水平。
10.1.部分酶寡核苷酸
在这些用于在实时PCR中对系列2和3的通用底物的裂解效率进行测量的实验中，所有部分酶寡核苷酸A和B都被设计成其感应臂与人TFRC基因的相同序列是互补的。以下从5’到3’列出了部分酶A和B的序列，其中加下划线的碱基与其相配的通用底物进行杂交。“-P”是指寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO：47部分酶A TFRCA/59-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAAGGGAGGAGG
SEQ ID NO：62部分酶A TFRCA/77-P：
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGAGGAG
SEQ ID NO：63部分酶B TFRCB/77-P：
AGGAGGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
10.2.报告底物
以下从5’至3’显示了用于这个实例的报告底物的序列。小写字母的碱基代表RNA，而大写字母的碱基代表DNA。在当前实例中，底物的5’端用6-FAM部分进行末端标记（在下文中底物的名称中由“F”指示），并且3’端用爱荷华黑FQ猝灭剂部分进行末端标记（在下文中底物的名称中由“IB”指示）。在530nm处（在Mx3005P（Stratagene）上的FAM发射波长）对底物的裂解进行监测，并且在485nm处激发（在Mx3005P（Stratagene）上的FAM激发波长）。
SEQ ID NO：33 Sub59-FIB：
CCTCCTCCCTguCCCTCCTCCT
SEQ ID NO：79 Sub77-FIB：
CTCCTCCCTCguCCCTCCTCCT
10.3.用于TFRC扩增的靶标序列和PCR引物
用于此实例的靶标序列是一种来自TFRC基因的PCR扩增子，是由从IM9细胞系（Promega）中提取的人基因组DNA的体外PCR扩增而产生的，以下列出了所使用的寡核苷酸PCR引物。引物序列是从5’到3’列出的。
SEQ ID NO：187 正向引物5TFRC：
AACAATAACTCAGAACTTACG
SEQ ID NO：188 反向引物3TFRC：
CTTTCTGAGGTTACCATCCTA
10.4.反应组分：靶标序列的扩增和定量
在25μL的总反应体积中，进行对靶标序列的实时PCR扩增和检测。所有反应都是在Mx3005P QPCR系统（Stratagene）上进行的。用在表24中的底物及其相关联的部分酶建立反应。循环参数是：95℃2分钟，95℃15秒和58℃60秒进行40个循环（在58℃步骤收集数据）。各组反应条件重复运行，并且包含40nM的5TFRC、200nM的3TFRC、部分酶A和部分酶B各200nM，200nM的底物、8mM MgCl2、各dNTP200μM、10个单位的Rnasin（Bioline）、1×Immobuffer（Bioline）、2个单位的MyTaqHSTMDNA聚合酶（Bioline）、以及基因组DNA模板（50ng）或无靶标（NF-H2O）。
表24：用于各通用底物的部分酶组合
10.5.结果：靶标的扩增以及报告底物的裂解
含有人基因组DNA的各MNA酶qPCR反应显示出荧光的随时间的增加，以用于人基因组DNA的TFRC的实时检测。对于所有反应，无DNA靶标对照的荧光值低于含有DNA靶标的反应中的荧光值。这证实了，在含有靶标的反应中产生的荧光的增加是由于：催化活性MNA酶的靶标依赖性组装，进而对通用报告底物中的一种进行裂解。
系列2的底物Sub59的反应显示其Ct平均值是28.5，而系列3的底物Sub77的反应显示其Ct平均值26.5。
应注意，Sub59和Sub77具有相同的Tm和%C/T，但是它们在中心区域N4-N13中的胞嘧啶的数量和N8的组成是不同的。在核糖核苷酸周围的中心区域中，Sub77在N8位置有一个胞嘧啶，该胞嘧啶显现可导致Sub77的裂解效率比由更低Ct值（26.5）指示的Sub59的裂解效率有所提高。Sub59在N8包含一个胸腺嘧啶，在5’臂的远端具有一个添加的胞嘧啶，该胞嘧啶可导致减少的裂解反应，并且因此具有较高的Ct值（28.5）。
应注意的是被高效裂解的底物的核苷酸序列的性质以及特异性核苷酸与底物的核糖核苷酸相靠近的重要性。这些特征形成了一组产生通用底物的指导方针的基础，这些通用底物在升高的温度下具有更高的可能性被高效裂解。这些设计指导方针包括但不限于（并非所有都是必需的）：（i）核糖核苷酸周围的十个碱基（N4-N13）中有七个或更多个胞嘧啶核苷酸；（ii）与核糖核苷酸紧紧相邻的碱基是胞嘧啶（N8和N9）；（iii）底物的总含量具有>64%的嘧啶；（iv）寡核苷酸的总Tm是66℃或更高（其中这个后面的指导方针只用于底物裂解的温度在50℃以上的情况）（表25）。系列3的底物Sub77的Ct值较早出现，预计是因为这个底物符合所有这些设计指导方针，而Sub59只符合这些设计指导方针中的两种（表25）。
表25：通用底物的裂解效率（按照基于Ct的裂解效率的顺序列出）
^大写字母的碱基代表DNA，小写字母的碱基代表RNA，碱基在底物中的位置表示为(Nx)-N1-N2-N3-N4-N5-N6-N7-N8-rR-rY-N9-N10-N11-N12-N13-N14-N15-(Nx)
+各底物的如上所示的序列长度的%C/T（嘧啶）不包括核糖核苷酸
*在此给出的Tm等于结合碱基的解链温度，采用华莱士律进行计算-只用于对与其互补物杂交的碱基的计算。当底物与基于10-23DNA核酶的MNA酶结合时，“g”核糖核苷酸保持不结合，因此不会贡献于整体结合的Tm。
～底物序列已经满足的设计指导原则(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)的的数量。
参考文献
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PCT国际公开号WO/2008/040095
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Claims (26)

1.一种用于催化性核酸酶的分离的多核苷酸底物，所述多核苷酸底物包括序列N1-N2-N3-N4-N5-N6-N7-N8-rR-rY-N9-N10-N11-N12-N13-N14-N15，其中：
rR是嘌呤核糖核苷酸；
rY是嘧啶核糖核苷酸；
N1-N15的每一个是核苷酸；
N5-N13中的六个或更多个是胞嘧啶核苷酸；
N9是胞嘧啶核苷酸；
嘧啶核糖核苷酸包括尿嘧啶；并且
N9-N15中少于三个是鸟嘌呤核苷酸，
其中所述多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：29-30、72-90或172-175中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中N5-N13中的七个或更多个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：29、73、76-80、82-83、85-90或172-175中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
3.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中N5-N13中的八个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：76、77、80、83或87中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
4.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中N4-N13中的七个或更多个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：29、73、76-83、85-90或172-175中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
5.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中N8和N9是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：73、76、77、79、83或87中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
6.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中N9-N15中的一个是鸟嘌呤核苷酸或者都不是鸟嘌呤核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：29-30、72-75、77-79、81-90或174-175中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
7.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中N1-N15中的十一个、十二个、或多于十二个是嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：29、72-90或174-175中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
8.根据权利要求7所述的分离的多核苷酸底物，其中N1-N15中的十三个或十四个是嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：29、73、76、81、86或174中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
9.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中N1-N14中的十个或十一个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：29、74-76、81、86或87中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
10.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中N1-N14中的十一个是胞嘧啶核苷酸，并且该多核苷酸底物包括一个由SEQ ID NO：29、74、75或87中的任一个所定义的序列，或由该序列组成。
11.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，进一步包括一种用于对该多核苷酸底物进行检测的可检测标记。
12.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，进一步包括一个可检测部分以及一个猝灭剂部分，其中该可检测部分提供的可检测效应可基于所述催化性核酸酶对该多核苷酸底物的修饰而增加或减少。
13.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中该嘌呤核糖核苷酸包括鸟嘌呤。
14.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中该嘌呤核糖核苷酸包括鸟嘌呤，并且该嘧啶核糖核苷酸包括尿嘧啶。
15.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中该底物的与所述催化性核酸酶结合的一个部分具有的解链温度是在50℃与90℃之间。
16.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中该底物的与所述催化性核酸酶结合的一个部分具有的解链温度是在50℃与65℃之间，或者在66℃与76℃之间。
17.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中该底物的与所述催化性核酸酶结合的一个部分具有的解链温度是在50℃与60℃之间，或者在68℃与76℃之间。
18.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中该底物的与所述催化性核酸酶结合的一个部分具有的解链温度是在52℃与58℃之间，或者在70℃与76℃之间。
19.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中该底物的与所述催化性核酸酶结合的一个部分具有的解链温度是在64℃与70℃之间，或者在72℃与76℃之间。
20.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中该底物的与所述催化性核酸酶结合的一个部分具有的解链温度是在70℃与75℃之间。
21.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中该底物的与所述催化性核酸酶结合的一个部分具有的解链温度为52℃、58℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃或76℃。
22.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸底物，其中所述催化性核酸酶是：
(a)一种多组分核酸酶，并且所述底物与所述多组分核酸酶的至少一个底物臂结合；或者
(b)一种DNA核酶。
23.一种包括如权利要求1至22中任一项所述的分离的多核苷酸底物的试剂盒。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，进一步包括一种能够对所述多核苷酸底物进行催化修饰的催化性核酸酶。
25.一种试剂盒，该试剂盒包括如权利要求1至22中任一项所述的分离的多核苷酸底物以及多种寡核苷酸部分酶，这些寡核苷酸部分酶被设计为组装一种能够检测至少一种靶标的多组分核酸酶，其中所述多组分核酸酶能够对该多核苷酸底物进行催化修饰。
26.一种组装物，该组装物包括一种与如权利要求1至22中任一项所述的多核苷酸底物结合的固体载体。
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