CN117106879A - 一种基于dna发夹结构的dna连接酶检测探针及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶检测技术领域，公开了一种基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针及应用。DNA连接酶检测探针包括四条寡核苷酸链；四条寡核苷酸链包括短单链Oligo 1、长单链Oligo 2、长单链Oligo 3、短单链Oligo 4；短单链Oligo 1可与长单链Oligo 2互补形成双链结构1；长单链Oligo 3可与短单链Oligo 4互补形成双链结构2；双链结构1中长单链Oligo 2的未互补部分可与双链结构2中长单链Oligo3的未互补部分进行互补形成双链结构3。本发明在退火过程中优先形成稳定的发夹，从而产生显著的荧光信号，实现对DNA连接酶活性的实时检测。
Description
技术领域
本发明涉及酶检测技术领域，具体涉及一种基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针及应用。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)连接酶是DNA合成过程中一种必不可少的、普遍存在的酶，并在原核和真核细胞中进行复制、修复和重组。该酶在ATP存在下催化双链DNA中并列的5'磷酸端和3'羟基端形成磷酸二酯键。无论其来源如何，DNA连接酶催化反应的连接机制都有一个共同的特点，即关键步骤是形成共价DNA连接酶-腺苷酸中间体。此外，已知真核生物、古细菌和病毒中的DNA连接酶依赖于ATP，而细菌中的DNA连接酶依赖于NAD。因此，NAD依赖性DNA连接酶被认为是新型抗菌药物的靶标，因为它们广泛存在于细菌中，但在哺乳动物细胞中却很少见。近年来，DNA连接酶也被作为癌症的生物标志物，因为其过表达和缺陷与癌症和神经退行性疾病的发病密切相关。此外，DNA连接酶已被用作DNA体外操作的重要工具，如DNA纳米技术、DNA计算以及DNA传感。因此，检测DNA连接酶的活性对药物开发、医学诊断以及基础生化研究具有重要意义。传统的DNA连接酶活性检测方法主要依靠聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影，这是一个复杂且不敏感的过程。此外，通过使用多种酶和多步骤反应来检测DNA连接酶在过去也得到了发展。然而，这些方法的一个缺点是，它们的检测结果不能反映实时DNA连接反应。
另一方面，“超稳定发夹”的概念是1989年引入核酸化学研究领域的，通常是指某些具有超高热稳定性和对核酸酶抗性的短DNA或RNA序列。这些DNA和RNA序列通常包含7到10个核苷酸的长度，并显示发夹状结构。尽管非常稳定的发夹的序列相对较短，但它们的熔点高于普通DNA发夹。尽管非常稳定的发夹具有上述独特的性质，但是这些易于形成的结构在过去还没有被用于检测DNA修饰酶。
因此有必要开发一种基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针及应用，提高探针对DNA连接酶检测的灵敏度、特异性和稳定性，从而实现对DNA连接酶活性的实时检测。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针及应用，提高探针对DNA连接酶检测的灵敏度、特异性和稳定性，从而实现对DNA连接酶活性的实时检测。
本发明第一方面提供一种基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针。
具体的，所述DNA连接酶检测探针包括四条寡核苷酸链；
所述四条寡核苷酸链包括短单链Oligo 1、长单链Oligo 2、长单链Oligo 3、短单链Oligo 4；
所述短单链Oligo 1可与长单链Oligo 2互补形成双链结构1；所述长单链Oligo 3可与短单链Oligo 4互补形成双链结构2；
所述双链结构1中长单链Oligo 2的未互补部分可与双链结构2中长单链Oligo 3的未互补部分进行互补形成双链结构3。
优选的，所述长单链Oligo 3的5’端被磷酸修饰；所述长单链Oligo 3的3’端连接荧光基团。
进一步优选的，所述荧光基团为Cy3。
优选的，所述短单链Oligo 4的5’端连接淬灭基团。
进一步优选的，所述淬灭基团为BHQ2。
优选的，所述双链结构3中短单链Oligo 1与长单链Oligo 3相隔一个缺口；所述双链结构3中长单链Oligo 2与短单链Oligo 4相隔一个缺口。
优选的，所述短单链Oligo 1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述长单链Oligo2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述长单链Oligo 3的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述短单链Oligo 4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明第二方面提供一种基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针的制备方法。
具体的，包括以下步骤：
将短单链Oligo 1、长单链Oligo 2、长单链Oligo 3、短单链Oligo 4与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液及氯化钠溶液于15-30℃混合，制得混合液；再混合液于90-98℃孵育3-10min，冷却后制得DNA连接酶检测探针。
优选的，将短单链Oligo 1、长单链Oligo 2、长单链Oligo 3、短单链Oligo 4与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液及氯化钠溶液于25℃混合，制得混合液；再混合液于95℃孵育5min，冷却后制得DNA连接酶检测探针。
优选的，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的浓度为35-45mM。
进一步优选的，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的浓度为40mM。
优选的，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的pH为8.0。
优选的，所述氯化钠溶液的浓度为15-25mM。
进一步优选的，所述氯化钠溶液的浓度为20mM。
优选的，所述短单链Oligo 1、长单链Oligo 2、长单链Oligo 3、短单链Oligo 4的浓度为850-950nM。
进一步优选的，所述短单链Oligo 1、长单链Oligo 2、长单链Oligo 3、短单链Oligo 4的浓度为900nM。
优选的，所述短单链Oligo 1、长单链Oligo 2、长单链Oligo 3、短单链Oligo 4的添加比例为1：1：1：1。
本发明第三方面提供一种基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针在实时检测DNA连接酶活性中的应用。
本发明第四方面提供一种基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针在靶点鉴定和药物发现中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明通过巧妙地设计链长，可以在退火过程中优先形成稳定的发夹，与双链竞争，达到分离双链DNA的效果，从而导致荧光基团和淬灭基团的有效分离，并进一步产生显著的荧光信号，从而实现对DNA连接酶活性的实时检测。
附图说明
图1为本发明实施例1探针实时检测DNA连接酶活性的原理图；
图2为本发明实施例1探针在T4 DNA连接酶存在和缺失时的荧光发射光谱图；
图3为本发明实施例1探针与T4 DNA连接酶相互作用孵育时间的优化结果图；
图4为本发明实施例1探针最佳浓度的优化结果图；
图5为不同浓度T4 DNA连接酶对荧光信号的响应结果图；
图6为荧光强度与T4 DNA连接酶浓度的相关性的结果分析图；
图7为本发明实施例1、对比例1和对比例2制得的探针在T4 DNA连接酶存在和缺失时的荧光发射光谱图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
本发明的发明构思：本发明首先利用了超稳定发夹的独特热力学性质来确定DNA连接酶的催化活性。通过巧妙地设计链长，可以在退火过程中优先形成稳定的发夹，与双链竞争，达到分离双链DNA的效果。因此，本发明设计的双链DNA，一端用荧光基团和淬灭基团修饰，并将稳定的发夹剪切成粘性末端。考虑到Tm(5'CGCGAAGCG 3')88.5℃>Tm(完全双链)74℃>Tm(Oligo 1和Oligo 2形成的双链结构)44℃>Tm(Oligo 3和Oligo 4形成的双链结构)38℃>37℃,Oligo 1和Oligo 3可以在DNA连接酶存在下连接形成长单链Oligo A。其中，一个非常稳定的发夹被诱导来刺激Oligo A从双链结构上去杂交化。这导致荧光基团和淬灭基团的有效分离，并进一步产生显著的荧光信号，从而实时检测DNA连接酶活性。(注：Tm：DNA双链结构的预测熔点)
实施例1
一种基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针。
DNA连接酶检测探针包括四条寡核苷酸链；包括短单链Oligo 1、长单链Oligo 2、长单链Oligo 3、短单链Oligo 4；短单链Oligo 1与长单链Oligo 2互补形成双链结构1；长单链Oligo 3与短单链Oligo 4互补形成双链结构2；双链结构1中长单链Oligo2的未互补部分与双链结构2中长单链Oligo 3的未互补部分进行互补形成双链结构3。双链结构3中短单链Oligo 1与长单链Oligo 3相隔一个缺口；所述双链结构3中长单链Oligo 2与短单链Oligo 4相隔一个缺口。
表1实施例1探针各DNA单链的核苷酸序列及修饰
注：P’表示5’端磷酸修饰；y表示3’端连接有荧光基团Cy3；B表示5’端连接有淬灭基团BHQ2。
该基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针的制备方法为：
将各浓度为900nm的短单链Oligo 1、长单链Oligo 2、长单链Oligo 3、短单链Oligo 4按1：1：1：混合后，与40mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(pH 8.0)及20mM氯化钠溶液于25℃混合至总体积为30μL，制得混合液；再混合液于95℃孵育5min，冷却后制得基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针。
检测实施例1基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针的性能：
1.对于DNA连接酶检测能力的初步验证。
方法：
(1)实验组配置：从制备好的探针溶液中取900nm，在其中依次加入20ul去离子水、5U/μL的标准T4 DNA ligase 6μL之后与40mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(pH 8.0)、20mM氯化钠溶液、10mM氯化镁溶液、10mM DDT溶液以及0.5mM ATP溶液于25℃混合至总体积为60μL。常温下孵育30min以上，再加热至44℃～46℃保持5min后降温至25℃。
(2)对照组配置：将上述“5U/μL的标准T4 DNA ligase 6μL”换成等体积的去离子水即可，其余步骤完全相同。
(3)进行荧光检测：将样品放入荧光分光光度计中检测，如果实验组荧光强度比对照组高出2倍以上。即可认为探针配置成功。
结果：图2为本发明实施例1探针在T4 DNA连接酶存在和缺失时的荧光发射光谱图，从荧光光谱结果可以看出，在没有T4 DNA连接酶的情况下，实施例1制得的探针的荧光强度相对较低(峰值为24.9a.u)，这表明在室温下，Oligo 3和Oligo 4形成的双链结构只发生了部分解离，导致剩余的未淬灭的荧光团在激发光下产生了少量荧光。另一方面，当实施例1制得的探针与1.3U/mL的T4 DNA连接酶孵育时，荧光信号大大增强(峰值为106.7a.u.)，说明本发明实施例1制得的探针具备检测DNA连接酶的能力。
2.实施例1探针检测性能的优化。
为了获得更好的传感性能，以优化孵育时间和探针浓度两个主要因素。为确定最佳孵育时间，在上述初步验证实验的基础上进行5次平行实验，分别孵育5、15、30、60、90min。如图3所示，实施例1探针的荧光强度随着孵育时间的增加而增加，并在30min内达到平台期。因此，选择30min作为实施例1探针与DNA连接酶相互作用的孵育时间。
进一步对实施例1探针的浓度进行优化。如图4所示，随着实施例1探针浓度的增加，荧光强度逐渐增加。当探针浓度达到900nM时，生长速率明显降低。因此，选择900nM作为实施例1探针的最佳浓度。
3.确认实施例1探针检测方法的相关性及检出限。
检测不同浓度T4 DNA连接酶对荧光信号的响应。由低到高依次设置T4 DNA连接酶浓度为0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.3U/mL。如图5可知，T4 DNA连接酶浓度越高，荧光信号越强。通过线性回归的方法进一步得出产生的荧光强度与T4 DNA连接酶浓度的相关性(如图6所示)，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)发布的EP17指南，计算出的实施例1基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针对T4 DNA连接酶的检测限(LoD)为0.055U/mL。(注：T4 DNA连接酶单位(U)定义:在ATP-PPi交换反应中，1U被定义为在37℃20min内将1nmoL(32PPi)转化为Norit可吸收形式所需的酶量)。
对比例1
一种DNA连接酶检测探针。(碱基数量增加)
与实施例1的不同在于对比例1的DNA连接酶检测探针的4条寡核苷酸的核苷酸序列不同，4条寡核苷酸的碱基数量均多于实施例1，具体如下，短单链Oligo 5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；长单链Oligo 6的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述长单链Oligo7的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述短单链Oligo 8的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
表2对比例1探针各DNA单链的核苷酸序列及修饰
注：P’表示5’端磷酸修饰；y表示3’端连接有荧光基团Cy3；B表示5’端连接有淬灭基团BHQ2。
对比例2
一种DNA连接酶检测探针。(含普通发夹序列)
与实施例1的不同在于对比例2的DNA连接酶检测探针含普通发夹序列，具体如下，短单链Oligo 9的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；长单链Oligo 10的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；所述长单链Oligo 11的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述短单链Oligo 12的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
表3对比例2探针各DNA单链的核苷酸序列及修饰
注：P’表示5’端磷酸修饰；y表示3’端连接有荧光基团Cy3；B表示5’端连接有淬灭基团BHQ2。
检测：基于实施例1中对于DNA连接酶检测能力的初步验证的方法，由图7可知，在反应条件相同的情况下，对比例1和对比例2制得的探针较实施例1探针的荧光强度有大幅下降，探针的检测性能大幅下降。说明当探针增加各寡核苷酸的碱基数量或者不含超稳定发夹序列时，探针检测DNA连接酶活性的性能大幅降低。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验所作的任何修改、等同替换、改进等得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针，其特征在于，所述DNA连接酶检测探针包括四条寡核苷酸链；
所述四条寡核苷酸链包括短单链Oligo 1、长单链Oligo 2、长单链Oligo 3、短单链Oligo 4；
所述短单链Oligo 1可与长单链Oligo 2互补形成双链结构1；所述长单链Oligo 3可与短单链Oligo 4互补形成双链结构2；
所述双链结构1中长单链Oligo 2的未互补部分可与双链结构2中长单链Oligo 3的未互补部分进行互补形成双链结构3。
2.根据权利要求1所述的DNA连接酶检测探针，其特征在于，所述长单链Oligo3的5’端被磷酸修饰；所述长单链Oligo 3的3’端连接荧光基团。
3.根据权利要求1所述的DNA连接酶检测探针，其特征在于，所述短单链Oligo4的5’端连接淬灭基团。
4.根据权利要求1所述的DNA连接酶检测探针，其特征在于，所述双链结构3中短单链Oligo 1与长单链Oligo 3相隔一个缺口；所述双链结构3中长单链Oligo 2与短单链Oligo4相隔一个缺口。
5.根据权利要求1所述的DNA连接酶检测探针，其特征在于，所述短单链Oligo1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述长单链Oligo 2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述长单链Oligo 3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述短单链Oligo4的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
6.权利要求1至5中任一项所述的DNA连接酶检测探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将短单链Oligo 1、长单链Oligo 2、长单链Oligo 3、短单链Oligo 4与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液及氯化钠溶液于15-30℃混合，制得混合液；
再混合液于90-98℃孵育3-10min，冷却后制得DNA连接酶检测探针。
7.根据权利要求6所述的DNA连接酶检测探针的制备方法，其特征在于，所述短单链Oligo 1、长单链Oligo 2、长单链Oligo 3、短单链Oligo 4的浓度为850-950nM。
8.根据权利要求6所述的DNA连接酶检测探针的制备方法，其特征在于，所述短单链Oligo 1、长单链Oligo 2、长单链Oligo 3、短单链Oligo 4的添加比例为1：1：1：1。
9.权利要求1至5中任一项所述的DNA连接酶检测探针在实时检测DNA连接酶活性中的应用。
10.权利要求1至5中任一项所述的DNA连接酶检测探针在靶点鉴定和药物发现中的应用。
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| CN113061645A (zh) * | 2021-04-30 | 2021-07-02 | 上海碧云天生物技术有限公司 | 一种dna连接酶的酶活测定方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZIANG WU等: "Extraordinarily Stable Hairpin-Based Biosensors for Rapid Detection of DNA Ligases", BIOSENSORS, vol. 13, no. 9, pages 3 * |
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