CN116287129B - 一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法及系统，利用针对待检测miRNA的crRNA的3'端尾部回折设计，满足“激活Cas13酶的HEPN结构域中的催化位点”的长度要求，从而实现检测超短链miRNA，并直接启动Cas13酶的非特异性反式切割活性实现检测信号读出。本发明的检测方法突破了CRISPR/Cas13酶检测长度极限，适配任何长度的miRNA，且具有设计简单、操作简便和实时监测的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法及系统。
背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是广泛存在于动物、植物和病毒中的一类由17-22个核苷酸组成的非编码RNA，它在多种生物学过程中发挥重要的调控作用，包括：免疫系统、细胞发育、增值分化和细胞凋亡等。目前已经发现2600多种调节生物过程各个环节的miRNAs存在于人体内。miRNAs的异常表达与多种癌症疾病密切相关，是癌症诊断的重要生物标志物，因此，miRNAs的早期检测对于基础生物研究、疾病预后和分子诊断具有重要意义。
传统的miRNAs检测方法包括：RNA印迹(Northern blotting)、实时定量PCR(quantitative real time PCR，qRT-PCR)和微阵列。RNA印迹是最早的基于杂交技术分析miRNAs表达的尝试方法，RNA印迹因其无需扩增、检测过程中序列中的碱基不改变的特点，所以其检测结果具有较高可信度，但是其检测需要大量的RNA样本，并且实验过程中RNA易降解；实时定量PCR被认为是miRNAs检测的金标准，然而，成熟的miRNAs序列较短，无法按照常规方法设计引物进行逆转录和扩增；微阵列(microarray)也可以对miRNAs进行快速、高通量检测，但由于miRNAs序列较短，探针和miRNAs杂交形成的双链产物的熔解温度(Tm)较低，增加了错配的几率。所以，发展新的miRNAs检测方法势在必行。
成簇的规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats,CRISPR)相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)系统作为一种革命性的基因编辑技术，已被广泛应用于临床医学的各个领域。该系统除了具有非凡的基因编辑能力之外，Cas12、Cas13、Cas14还表现出优异的核酸识别性能和活化后的非特异性核酸切割功能，这使其为下一代高灵敏且快速的核酸检测技术提供了广阔的应用前景。例如，一系列的Cas效应子包括Cas12a、Cas13a已被开发来建立基于CRISPR-Cas的MicroRNAs生物传感检测，邢达等人利用CRISPR/LbuCas13a以高特异性和简单性直接检测miR-17，该方法直接识别靶标RNA可以避免基因组DNA的污染，最终这种一步法可以在30分钟内实现检测限低至4.5阿摩尔；唐波等人开发了一个整合CRISPR-Cas12a和个人血糖计(personal glucose meter,PGM)的检测策略实现对miR-21和miR-205的高灵敏检测，该策略利用了双链特异性核酸酶(duplex-specific nuclease,DSN)实现对靶标信号的转换和放大，该方法对miR-21和miR-205的检测限为2.4pM和1.1pM。
然而，研究表明，不同的Cas13酶对于“激活HEPN结构域内的催化位点”所要求的“crRNA-靶标”双链体的碱基对(bp)长度是不同的，例如：当使用LwaCas13a和LshCas13a检测小于22nt的靶标长度时未显示反式切割活性，而20bp的“crRNA-靶标”双链体对于激活LbuCas13a的HEPN结构域内的催化位点以反式切割ssDNA是必不可少的；此外，由于miRNAs本身长度的影响导致无法通过常规逆转录直接生成Cas12酶可以识别的产物，到目前为止，还没有关于突破CRISPR/Cas13酶检测长度极限并识别超短链MicroRNAs的报道。
因此，现有技术还有待改进。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法及系统，旨在突破现有技术中的CRISPR/Cas13酶检测长度极限，提供能够直接识别任何长度的MicroRNAs、且设计简单、操作简便和实时监测的核酸诊断检测方法。
本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法，其中，所述的检测方法为非诊断目的，包括步骤：
提供CRISPR/Cas13系统，所述CRISPR/Cas13系统包括CRISPR/Cas13反应体系以及Cas13蛋白；
设计针对待检测miRNA的回折crRNA，所述回折crRNA包括通用序列、识别序列和回折序列，其中所述识别序列与待检测miRNA的序列互补；
将待检测miRNA以及针对待检测miRNA的回折crRNA加入到所述CRISPR/Cas13系统中进行反应，所述回折crRNA的回折序列与待检测miRNA形成RNA链；
形成的所述RNA链激活所述CRISPR/Cas13系统中Cas13蛋白的非特异性反式切割活性，实现信号检出；
根据检出的信号计算待检测miRNA的含量。
所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法，其中，所述回折序列在所述回折crRNA的3'端尾部回折。
所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法，其中，所述回折序列如SEQ.IDNO.1所示。
所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法，其中，所述Cas13蛋白包括Cas13a、Cas13b、Cas13d或者Cas13X。
所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法，其中，所述Cas13蛋白的反应浓度为1nM-5nM。
所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法，其中，将反应体系置于实时荧光定量PCR仪中，在25℃孵育60-90min进行反应。
第二方面，本发明还提供一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测系统，其中，所述检测系统包括针对待检测miRNA的回折crRNA、Cas13蛋白以及CRISPR/Cas13反应体系；所述回折crRNA包括通用序列、识别序列和回折序列，其中，所述识别序列与待检测miRNA的序列互补。
所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测系统，其中，所述回折序列在所述回折crRNA的3'端尾部回折，所述回折序列如SEQ.ID NO.1所示。
第三方面，本发明还提供一种基于回折crRNA的超短链miRNA试剂盒，其中，所述试剂盒包括如上任一所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测系统。
第四方面，本发明还提供一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法的应用，其中，将如上任一所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法或者如上任一所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测系统应用于小于22nt的超短链miRNA的检测，所述应用为非诊断目的。
有益效果：本发明提供了一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法及系统，利用针对待检测miRNA的crRNA的3'端尾部回折设计，满足“激活Cas13酶的HEPN结构域中的催化位点”的长度要求，从而实现检测超短链miRNA，并直接启动Cas13酶的非特异性反式切割活性实现检测信号读出。本发明的检测方法突破了CRISPR/Cas13酶检测长度极限，能够直接识别和适配任何长度的miRNA，且具有设计简单、操作简便和实时监测的优点。
附图说明
图1为本发明实施例中基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法的原理示意图。
图2为本发明实施例提供的Cas13蛋白的温度优化数据图。
图3为本发明实施例提供的Cas13蛋白的浓度优化曲线图。
图4为本发明实施例提供的不同长度靶标对Cas13蛋白激活的动力学曲线对比图。
图5为本发明实施例提供的不同长度靶标以及延伸核酸对Cas13蛋白激活的动力学曲线对比图。
图6为本发明实施例提供的分别使用17nt crRNA与28nt crRNA检测miR-720的动力学曲线图。
图7为本发明实施例提供的两种检测miR-720的检测方法数据图。
图8为本发明实施例提供的miR-720的核酸检测数据图。
图9为本发明实施例提供的miR-2392的核酸检测数据图。
具体实施方式
本发明提供一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法及系统，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法，包括步骤：
S10、提供CRISPR/Cas13系统，所述CRISPR/Cas13系统包括CRISPR/Cas13反应体系以及Cas13蛋白；
S20、设计针对待检测miRNA的回折crRNA，所述回折crRNA包括通用序列、识别序列和回折序列，其中所述识别序列与待检测miRNA的序列互补；
S30、将待检测miRNA以及针对待检测miRNA的回折crRNA加入到所述CRISPR/Cas13系统中进行反应，所述回折crRNA的回折序列与待检测miRNA形成RNA链；
S40、形成的所述RNA链激活所述CRISPR/Cas13系统中Cas13蛋白的非特异性反式切割活性，实现信号检出；
S50、根据检出的信号计算待检测miRNA的含量。
其中，所述的检测方法为非诊断目的。
图1所示为本发明实施例基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法的原理示意图，基于回折crRNA(CRISPR-derived RNA)的设计，实现超短链MicroRNAs的检测。本发明在回折crRNA的CRISPR/Cas13酶体系中，设计了一个回折crRNA，它由3个部分组成：通用序列(direct repeat)、识别序列(spacer)和回折序列，其中识别序列能够与待检测靶标miRNA互补。在无回折crRNA的检测体系中，由于靶标miRNA的长度小于22nt，无法满足Cas13蛋白的靶标检测极限要求，无法成功激活HEPN结构域内的催化位点；而在回折crRNA的检测体系，回折crRNA的尾部回折部分会与靶标miRNA形成一条带缺口的24-28nt的RNA链，这条RNA链能够激活Cas13蛋白的HEPN结构域内的催化位点，从而激活Cas13蛋白的非特异性的反式切割活性实现信号检出。故而，不同长度的靶标miRNA与crRNA回折部分至少要形成长度为24-28nt的RNA链。
在一些实施方式中，所述回折序列在所述回折crRNA的3'端尾部回折。但不限于此。crRNA的延伸方向可以进行改变，在其他的实施方式中可以更换为crRNA的5'端进行延伸回折。
在一些实施方式中，所述回折序列的回折长度并不固定，例如可以为11bp-20bp。回折部分的核酸与靶标miRNA至少要共同形成一条长度为24-28nt的核酸链，确保能够正常激活cas13蛋白并且发挥其良好的反式切割活性。crRNA的3'端尾部回折长度也可以根据不同的Cas13酶进行改变；不同的Cas13酶对于“激活HEPN结构域内的催化位点”所要求的“crRNA-靶标”双链体的碱基对(bp)长度是不同的，所以在使用不同的Cas13a酶去检测超短链miRNAs时，可以根据Cas13酶的不同设计crRNA的3'端尾部回折长度的不同。
具体的，所述回折序列如SEQ.ID NO.1所示。
SEQ.ID NO.1：UAACAAGACCAUGGUCUUGUUA
本发明提供的回折序列是可以固定的，例如SEQ.ID NO.1所示的序列，只需根据待测样本的序列，相应地修改crRNA的识别序列部分即可。但不限于此。本发明实施例crRNA尾部延伸部分序列为Nupack设计生成的，也可以更换为其他核酸序列。回折序列在设计上要满足两个原则：1)不能与靶标互补，2)不与crRNA链互补。而该回折序列会形成回折互补的二级结构，其使用的前提是：待测样本的长度无法满足激活Cas13蛋白的HEPN催化位点的长度需求。
在一些实施方式中，所述Cas13蛋白包括Cas13a、Cas13b、Cas13d或者Cas13X。
在一些具体地实施方式中，所述Cas13蛋白包括LwaCas13a、LshCas13a等，但不限于此。本发明所述的检测方法同样可以解决其他Cas13酶无法检测超短链RNA的问题。
在一些实施方式中，所述Cas13蛋白的反应浓度为1nM-5nM。优选为5nM。本发明实施例通过Cas13蛋白的浓度优化曲线图发现，当Cas13核糖核蛋白由1nM提升到5nM时反应速率显著提升，值得注意的是，后续在提升Cas13核糖核蛋白浓度时反应速率没有明显提升，表明适当提升Cas13核糖核蛋白浓度有助于提高反应速率，但过量的Cas13核糖核蛋白并未能显著改善检测性能。因此，反应体系中Cas13核糖核蛋白的浓度优选为5nM。
在一些实施方式中，将反应体系置于实时荧光定量PCR仪中，在25℃孵育60-90min进行反应。反应温度对Cas13蛋白的反应活性有影响。本发明实施例通过Cas13蛋白的温度优化数据图，观察到Cas13蛋白的反应活性随着反应温度的升高而降低，并且在25℃时具有最大的信噪比，考虑到反应速率在核酸检测中起着至关重要的作用，本实施例选择了25℃作为后续反应温度。
在一些实施方式中，将50nM Cas13蛋白和50nM回折crRNA按照1:1的比例混合并在室温下孵育15-30分钟，预先组装成Cas13核糖核蛋白复合物(13a-RNP)。
本发明实施例还提供一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测系统，所述检测系统包括针对待检测miRNA的回折crRNA、Cas13蛋白以及CRISPR/Cas13反应体系；所述回折crRNA包括通用序列、识别序列和回折序列，其中，所述识别序列与待检测miRNA的序列互补。
在一些实施方式中，所述回折序列在所述回折crRNA的3'端尾部回折，所述回折序列如SEQ.ID NO.1所示。
SEQ.ID NO.1：UAACAAGACCAUGGUCUUGUUA
在一些实施方式中，所述CRISPR/Cas12a反应体系还包括ssDNA-FQ报告系统。
在一些实施方式中，所述ssDNA-FQ报告系统为两端分别修饰有荧光基团和对应的猝灭基团的单链DNA。但不限于此，本领域常用的ssDNA-FQ系统都可以合理应用于所述体系。
在一些实施方式中，本发明实施例核酸检测方法中信号检测方法为基于荧光的信号检测。但不限于此，可以更换为其他的可视化信号检测方法，例如：免疫层析分析法(LFA)，金纳米粒子的比色分析方法，基于电子读出系统的分析法。
本发明实施例还提供一种基于回折crRNA的超短链miRNA试剂盒，所述试剂盒包括上述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测系统。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括试纸条、微流控芯片等产品。
本发明实施例还提供一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法的应用，将上述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法或者上述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测系统应用于小于22nt的超短链miRNA的检测，所述应用为非诊断目的。
已知的现有CRISPR检测技术使用的crRNA设计是无法突破CRISPR/Cas13酶检测长度极限，也难以直接检测超短链miRNAs，本发明利用crRNA的3'端尾部回折设计以满足“激活Cas13酶的HEPN结构域中的催化位点”的长度要求，从而实现检测超短链miRNAs，并直接启动Cas13酶的非特异性反式切割活性实现检测信号读出。
在一些实施方式中，待测miRNA样品来源于包括人类在内的哺乳动物或植物，但不限于此。待测靶标样品可经过核酸提取处理，例如，使用核酸提取试剂盒，根据核酸提取试剂盒说明书提供的核酸提取技术提取获得的总核酸样品。
下面通过具体实施例对本发明一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法及系统做进一步的解释说明：
若无特别说明，实施例中使用的化学试剂均为市售试剂。
实施例1
1、LwaCas13a核糖核蛋白(13a-RNP)的准备
将50nM LwaCas13a和50nM crRNA按照1:1的比例混合并在室温下孵育15-30分钟，预先组装成LwaCas13a核糖核蛋白复合物(13a-RNP)。
2、LwaCas13a的反应温度优化
反应温度对LwaCas13a蛋白的反应活性有影响，本实施例设置了6个不同的温度(25℃、29℃、33℃、37℃、41℃、45℃)，检验LwaCas13a蛋白在不同温度下的反应活性。25μL反应体系包含以下试剂：1×缓冲液(10mM Tris-HCl(PH 8.0)、50mM KCl、1.5mM MgCl2)、500pM Target、1μM RNA荧光探针、1U/μL酶抑制剂、10nM LwaCas13a核糖核蛋白(13a-RNP)，将所有反应体系置于实时荧光定量PCR仪在25-45℃进行孵育60-90min，每30s测量一次荧光读数。
图2所示为Cas13蛋白的温度优化数据图，观察到LwaCas13a的反应活性随着反应温度的升高而降低，并且在25℃时具有最大的信噪比，考虑到反应速率在核酸检测中起着至关重要的作用，本实施例选择了25℃作为后续反应温度。
3、LwaCas13a核糖核蛋白的反应浓度优化
为了优化检测系统，本实施例评估不同浓度的LwaCas13a核糖核蛋白对反应速率的影响，25μL反应体系包含以下试剂：1×缓冲液(10mM Tris-HCl(PH 8.0)、50mM KCl、1.5mM MgCl2)、500pM Target、1μM RNA荧光探针、1U/μL酶抑制剂，将不同浓度的LwaCas13a核糖核蛋白(13a-RNP)加入到上述体系中，混匀至最终浓度为：1nM、5nM、10nM、15nM和20nM，最后将所有反应体系置于实时荧光定量PCR仪，在25℃进行孵育60-90min，每30s测量一次荧光读数。
图3所示为Cas13蛋白的浓度优化曲线图。其中，当LwaCas13a核糖核蛋白由1nM提升到5nM时反应速率显著提升，值得注意的是，后续在提升LwaCas13a核糖核蛋白浓度时反应速率没有明显提升，表明适当提升LwaCas13a核糖核蛋白浓度有助于提高反应速率，但过量的LwaCas13a核糖核蛋白并未能显著改善检测性能。因此，5nM的LwaCas13a核糖核蛋白的反应体系将用于后续的检测应用。
实施例2
研究靶标RNA激活LwaCas13a的HEPN催化位点的长度需求
为了研究不同长度靶标对LwaCas13a蛋白的激活情况，本实施例比较了不同长度的“crRNA-靶标”双链体存在下RNA荧光探针(RNA reporter)的切割效率。25μL反应体系包含以下试剂：1×缓冲液(10mM Tris-HCl(PH8.0)、50mM KCl、1.5mM MgCl2)、1μM RNA荧光探针、1U/μL酶抑制剂、5nM LwaCas13a核糖核蛋白，将不同长度的靶标RNA(Target-14nt、Target-16nt、Target-18nt、Target-20nt、Target-22nt、Target-24nt、Target-26nt和Target-28nt，其序列如表1所示)加入到上述体系中，混匀至最终浓度为：500pM，最后将所有反应体系置于实时荧光定量PCR仪在25℃进行孵育60-90min，每30s测量一次荧光读数。
图4所示为不同长度靶标对Cas13蛋白激活的动力学曲线对比图。先前的研究表明LwaCas13a至少需要22nt的靶标长度才可以有效激活HEPN结构域中的催化位点，从图4不难发现，靶标长度小于22nt时几乎不激活LwaCas13a的反式切割活性，结论与先前研究一致。此外，本实施例分别使用17nt crRNA与28nt crRNA去检测miR-720的动力学曲线图，观察到：靶标长度从22nt延长到24nt时反应速率有明显改善，而继续延长靶标长度则没有提升空间(图4)。基于这样的数据结果，或许在crRNA尾部回折设计长度上可以考虑在识别序列(spacer)的第24nt处进行回折，而无需在识别序列的第28nt处回折。
实施例3
研究加入与crRNA互补的“靶标的延伸部分核酸片段”是否激活LwaCas13a
基于实施例2的实验结论，靶标长度小于22nt时几乎不激活LwaCas13a的反式切割活性，那么是否可以通过加入与crRNA互补的“靶标的延伸部分核酸片段”，观察形成的“crRNA-靶标-延伸部分核酸”三元复合物能否激活LwaCas13a的反式切割活性。本实施例比较了不同长度的“crRNA-靶标-延伸部分核酸”三链体存在下RNA荧光探针(RNA reporter)的切割效率。25μL反应体系包含以下试剂：1×缓冲液(10mM Tris-HCl(PH 8.0)、50mM KCl、1.5mM MgCl2)、1μM RNA荧光探针、1U/μL酶抑制剂、5nM LwaCas13a核糖核蛋白，将不同长度的靶标RNA(Target-14nt、Target-16nt、Target-18nt、Target-20nt、Target-22nt、Target-24nt、Target-26nt和Target-28nt，其序列如表1所示)加入到上述体系中，混匀至最终浓度为：500pM，此外将不同长度的延伸部分核酸(Target-extend-14nt、Target-extend-12nt、Target-extend-10nt、Target-extend-8nt、Target-extend-6nt、Target-extend-4nt，其序列如表1所示)加入到前述体系，混匀至最终浓度为：500pM，最后将所有反应体系置于实时荧光定量PCR仪在25℃进行孵育60-90min，每30s测量一次荧光读数。
结果如图5所示，不难观察到，原先无法直接激活LwaCas13a的靶标(14-20nt)，通过加入与crRNA互补的“靶标的延伸部分核酸片段”，形成的“crRNA-靶标-延伸部分核酸”三元复合物是可以激活LwaCas13a的反式切割活性(图5C-5F)，该方法在一定程度上能够改善LwaCas13a的检测瓶颈，这也为后续“回折crRNA设计理念”奠定了实验基础。
实施例4
研究同一靶标在不同长度的crRNA互补下能否激活LwaCas13a
本实施例初期猜想：延长crRNA的识别序列长度是否可以解决“激活LwaCas13a的HEPN催化位点的长度需求”这一问题，为此本实施例选择了靶标长度为17nt的miR-720，该长度在“激活LwaCas13a的HEPN催化位点的长度需求”之外，并分别设计了靶向MiR-720的识别序列长度为17nt的crRNA(MiR-720 17nt-crRNA，序列见表1)和识别序列长度为28nt的crRNA(MiR-720 28nt-crRNA，序列见表1)，并分别与LwaCas13a蛋白预组装成“17nt-LwaCas13a核糖核蛋白”和“28nt-LwaCas13a核糖核蛋白”，25μL反应体系包含以下试剂：1×缓冲液(10mM Tris-HCl(PH 8.0)、50mM KCl、1.5mM MgCl2)、1μM RNA荧光探针、1U/μL酶抑制剂、500pM miR-720，将预组装成的“17nt-LwaCas13a核糖核蛋白”和“28nt-LwaCas13a核糖核蛋白”加入到上述体系中，混匀至最终浓度为：5nM，最后将所有反应体系置于实时荧光定量PCR仪在25℃进行孵育60-90min，每30s测量一次荧光读数。
结果如图6所示，不难看出，无论crRNA延长与否，阳性对照组和阴性对照组都无法很好地实现区分，这意味两者都无法直接检测靶标长度为17nt的miR-720，显然“延长crRNA的spacer长度”是无法解决“激活LwaCas13a的HEPN催化位点的长度需求”问题。
实施例5
对比两种检测miRNAs的检测方法
激活LwaCas13a的反式切割活性的靶标长度至少需要22nt，那么是否可以通过加入与crRNA互补的“靶标的延伸部分核酸片段”去形成一个28bp的三链体复合物(图7A)，看能否实现激活LwaCas13a的反式切割活性？本实施例继续沿用实施例3当中的28nt的crRNA(MiR-720 28nt-crRNA)，以miR-720作为检测对象，首先与LwaCas13a蛋白预组装成“28nt-LwaCas13a核糖核蛋白”，25μL反应体系包含以下试剂：1×缓冲液(10mM Tris-HCl(PH8.0)、50mM KCl、1.5mM MgCl2)、1μM RNA荧光探针、1U/μL酶抑制剂、500pM miR-720(17nt)、500pM MiR-720延伸部分片段(11nt)，将“28nt-LwaCas13a核糖核蛋白”加入到上述体系中，混匀至最终浓度为：5nM，最后将所有反应体系置于实时荧光定量PCR仪在25℃进行孵育60-90min，每30s测量一次荧光读数。
结果如图7B所示，加入与crRNA互补的“靶标的延伸部分核酸片段”是能够激活LwaCas13a，阳性对照组和阴性对照组都可以实现区分，这其中的可能原因是：加入与crRNA互补的“靶标的延伸部分核酸片段”与靶标miR-720形成一条带缺口的28nt的新靶标链，这条新靶标链满足了“激活LwaCas13a的HEPN催化位点的长度需求”，并且其与crRNA形成的三链体复合结构，促使HEPN1结构域的催化残基向HEPN2催化残基移动形成“近邻”，从而成功激活LwaCas13a的两个HEPN结构域内的催化位点。
基于前述的实验结论，本实施例将前述的“靶标的延伸部分核酸片段”与crRNA的3'端进行连接，从而形成一个3'端回折结构，回折长度为11bp(图7C)，研究回折crRNA是否同样也能实现miR-720检测，首先回折crRNA(MiR-720回折crRNA，序列见表1)与LwaCas13a蛋白预组装成“回折LwaCas13a核糖核蛋白”，25μL反应体系包含以下试剂：1×缓冲液(10mMTris-HCl(PH 8.0)、50mM KCl、1.5mM MgCl2)、1μM RNA荧光探针、1U/μL酶抑制剂、500pMmiR-720(17nt)，将“回折LwaCas13a核糖核蛋白”加入到上述体系中，混匀至最终浓度为：5nM，最后将所有反应体系置于实时荧光定量PCR仪在25℃进行孵育60-90min，每30s测量一次荧光读数。
结果如图7D所示，回折crRNA不仅能够激活LwaCas13a反应活性，而且相较于“加入靶标的延伸部分核酸片段”的检测方法，其反应速率有大幅度的提升，或许是因为：靶标与回折crRNA形成的双链体结构相较于前述的“三链体结构”，更能够长期稳定维持两个HEPN结构域的催化残基处于“近邻”状态，从而使两个HEPN结构域内的催化位点长期激活。
实施例6
应用回折crRNA设计检测miR-720
根据实施例4提供的实验数据，本实施例设计了靶向miR-720的无回折crRNA(MiR-720 17nt-crRNA)与回折crRNA(MiR-720回折crRNA)进行检测，miR-720是结直肠癌和乳腺癌的生物标志物，其长度为17nt(序列见表1)，该长度在“激活LwaCas13a的HEPN催化位点的长度需求”之外。
25μL反应体系包含以下试剂：1×缓冲液(10mM Tris-HCl(PH 8.0)、50mM KCl、1.5mM MgCl2)、1μM RNA荧光探针、1U/μL酶抑制剂、500pM miR-720，将“无回折LwaCas13a核糖核蛋白”和“回折LwaCas13a核糖核蛋白”加入到上述体系中，混匀至最终浓度为：5nM，最后将所有反应体系置于实时荧光定量PCR仪在25℃进行孵育60-90min，每30s测量一次荧光读数。
miR-720的核酸检测数据结果如图8所示，本申请实施例提供的“回折crRNA”设计能够快检测出17nt的靶标miR-720，解决“LwaCas13a无法直接检测miR-720”问题，实现miR-720从“不能检测”到“检测”这一目标。
实施例7
回折crRNA设计的稳健性
为了进一步评估该方法的稳健性，本实施例对miR-2392进行检测，miR-2392是SARS-Cov-2的生物标志物，并且其长度为20nt(序列见表1)，该长度在“激活LwaCas13a的HEPN催化位点的长度需求”之外。本实施例设计了靶向miR-2392的无回折crRNA(MiR-2392无回折crRNA，序列见表1)与回折crRNA(MiR-2392回折crRNA，序列见表1)，并分别与LwaCas13a蛋白预组装成“无回折LwaCas13a核糖核蛋白”和“回折LwaCas13a核糖核蛋白”，25μL反应体系包含以下试剂：1×缓冲液(10mM Tris-HCl(PH 8.0)、50mM KCl、1.5mMMgCl2)、1μM RNA荧光探针、1U/μL酶抑制剂、500pM miR-2392，将“无回折LwaCas13a核糖核蛋白”和“回折LwaCas13a核糖核蛋白”加入到上述体系中，混匀至最终浓度为：5nM，最后将所有反应体系置于实时荧光定量PCR仪在25℃进行孵育60-90min，每30s测量一次荧光读数。
miR-2392的核酸检测数据结果如图9所示，不难看出，本实施例提供的核酸检测方法能够实现对miR-2392快速检测。
参照上述实施例所述内容，本申请所述的核酸检测方法同样可以解决其他Cas13酶无法检测超短链RNA的问题，例如：LwaCas13a、LshCas13a等，对上述对各个Cas13酶的具体实验过程本申请所述实施例中不再一一赘述。
表1实施例中反应体系所使用的核酸序列
综上所述，本发明提供了一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法及系统，利用针对待检测miRNA的crRNA的3'端尾部回折设计，满足“激活Cas13酶的HEPN结构域中的催化位点”的长度要求，从而实现检测超短链miRNA，并直接启动Cas13酶的非特异性反式切割活性实现检测信号读出。本发明的检测方法突破了CRISPR/Cas13酶检测长度极限，适配任何长度的miRNA，且具有设计简单、操作简便和实时监测的优点。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法，其特征在于，所述的检测方法为非诊断目的，包括步骤：
提供CRISPR/Cas13系统，所述CRISPR/Cas13系统包括CRISPR/Cas13反应体系以及Cas13蛋白，所述Cas13蛋白为Cas13a蛋白；
设计针对待检测miRNA的回折crRNA，所述回折crRNA包括通用序列、识别序列和回折序列，其中所述识别序列与待检测miRNA的序列互补,所述回折序列在所述回折crRNA的3'端尾部回折；
将待检测miRNA以及针对待检测miRNA的回折crRNA加入到所述CRISPR/Cas13系统中进行反应，所述回折crRNA的回折序列与待检测miRNA形成RNA链；
形成的所述RNA链激活所述CRISPR/Cas13系统中Cas13蛋白的非特异性反式切割活性，实现信号检出；
根据检出的信号计算待检测miRNA的含量；
其中，所述超短链miRNA为小于22nt的miRNA。
2.根据权利要求1所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法，其特征在于，所述回折序列如SEQ. ID NO. 1所示。
3.根据权利要求1所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法，其特征在于，所述Cas13蛋白的反应浓度为1nM-5nM。
4.根据权利要求1所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法，其特征在于，将反应体系置于实时荧光定量PCR仪中，在25℃孵育60-90min进行反应。
5.一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测系统，其特征在于，所述检测系统包括针对待检测miRNA的回折crRNA、Cas13蛋白以及CRISPR/Cas13反应体系，所述Cas13蛋白为Cas13a蛋白；所述回折crRNA包括通用序列、识别序列和回折序列，其中，所述识别序列与待检测miRNA的序列互补，所述回折序列在所述回折crRNA的3'端尾部回折，所述超短链miRNA为小于22nt的miRNA。
6.根据权利要求5所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测系统，其特征在于，所述回折序列如SEQ. ID NO. 1所示。
7.一种基于回折crRNA的超短链miRNA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求5-6任一所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测系统。
8.一种基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法的应用，其特征在于，将如权利要求1-4任一所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测方法或者如权利要求5-6任一所述的基于回折crRNA的超短链miRNA检测系统应用于小于22nt的超短链miRNA的检测，所述应用为非诊断目的。
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| A CRISPR-Cas13a Based Strategy That Tracks and Degrades Toxic RNA in Myotonic Dystrophy Type 1;Nan Zhang等;Front. Genet;第11卷;全文 * |
| CRISPR/Cas13-Based Approaches for Ultrasensitive and Specific Detection of microRNAs;Javier Tadeo Granados-Riveron等;Cells;第10卷(第7期);全文 * |
| Hairpin-Spacer crRNA-Enhanced CRISPR/Cas13a System Promotes the Specificity of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Identification;Yuqing Ke等;Advanced Science;第8卷(第6期);图2，第2页左栏第1段、最后1段至右栏第1段，第5页右栏第2段，第6页右栏第2段 * |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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