JP6375230B2 - 分子計数のための組成物およびキット - Google Patents

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関連出願の引用
本願は、２０１２年２月２７日に出願した米国仮出願第６１／６０３，９２１号および２０１２年１２月２１日に出願した米国仮出願６１／７４５，３８５号の利益を主張する。これらの両方が、その全体に、本明細書に参考として援用される。
分子計数の方法および使用が開示される。標的分子を配列決定し、その発生回数を追跡することによって、分子を計数することができる。固体支持体への分子のハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズした分子の検出によって、分子を計数することもできる。一部の場合には、計数される分子は標識される。計数される分子は、増幅されてもよい。
様々な臨床および研究上の測定で、核酸の量の正確な決定が必要である。溶液に溶解する場合、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の平均濃度は、ＵＶ光吸光分光分析または蛍光性ＤＮＡ結合染色法によって決定することができる。しかし、しばしば、必要とされる測定は存在する核酸の総量のためだけでなく、特に、試料中の他の核酸の全てと一緒に含有され、混合される対象の１つまたは複数の種のためである。このような場合、通常、対象の核酸分子は、対象の種に特異であるヌクレオチドの規定の配列を通して他の核酸の全てから区別される。対象の核酸に相補的な配列を有する短い合成されたリボまたはデオキシリボオリゴヌクレオチドを、その検出および同定のために使用することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、これらのオリゴヌクレオチドの対を、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって媒介されるＤＮＡ重合の反復サイクルのためのアニーリングプライマーの役割をさせるために使用する。ＤＮＡマイクロアレイは、相補配列を運ぶＤＮＡ分子とハイブリダイズさせるために固体支持体の上にオリゴヌクレオチドが固定化される、別の普通の検出方法である。ＰＣＲおよびマイクロアレイ方法の両方は特異的検出が可能であるが、検出される分子の量の正確な決定は困難である（特にそれが低い存在度で存在するか、他の核酸の大きなバックグラウンドの中に含まれるとき）。ＰＣＲ（時には定量的ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＴａｑＭａｎまたはリアルタイムＰＣＲとも呼ばれる）の場合、増幅されるＤＮＡ分子の量は、出発溶液中のその濃度の推定値を表す。マイクロアレイの場合、ハイブリダイズされるＤＮＡの量は、溶液中のその濃度の推定値である。いずれの場合も、濃度の相対的測定だけを行うことができ、試料中の核酸のコピーの絶対数は正確に決定することができない。しかし、所定濃度の参照核酸が試験に含まれる場合は、検出される核酸のコピーの絶対数を推定するためにこの標準参照との相対的比較を行うことができる。
デジタル式ＰＣＲは、特定のヌクレオチド配列のＤＮＡ分子の絶対数を決定するために使用することができる１つの方法である（SykesらBiotechniques １３巻：４４４〜４４９頁（１９９２年）、VogelsteinらDigital PCR. Proc Natl Acad Sci USA ９６巻：９２３６〜９２４１頁（１９９９年））。この方法では、核酸溶液は希釈されて、２つの容器に平均して１つ未満の分子があるように個々の容器に確率的に分割される。各容器中の対象の核酸分子の存在を検出するために、次にＰＣＲを使用する。定量的分割を仮定すると、ダイナミックレンジは確率的分離のために利用できる容器の数によって支配される。利用できる容器の数を増加させ、それによって測定ダイナミックレンジを拡張するために、微細加工およびピコリットルサイズの乳濁液滴を使用することができる（FanらAm J Obstet Gynecol ２００巻：５４３ ｅ５４１〜５４７頁（２００９年）、KalininaらNucleic Acids Res ２５巻：１９９９〜２００４頁（１９９７年））。多数の個別容器を製造する物理的制約のために、およびこれらの多数の反応の実行において、実際には、デジタル式ＰＣＲ方法は一度に少数の異なるＤＮＡ分子の調査だけに限定される。
近年、１セットの多様な核酸標識の確率的付着の後に個々のＤＮＡ分子の同一のコピーを計数することができる、ＤＮＡ分子の絶対量を決定する新しい方法が実証された（FuらProc Natl Acad Sci USA １０８巻：９０２６〜９０３１頁（２０１１年））。デジタル式ＰＣＲと異なり、これは、同時に多くの異なるＤＮＡ分子を計数することが可能である高度並行方法である。この方法では、分子の各コピーは、多様な標識の大きな非枯渇性の貯蔵元から選択することによって、短い核酸標識にランダムに付着する。標識分子の以降の多様性は、ランダムな選択の統計量によって支配され、標識の種類の数と比較した集合体中の同一の分子のコピー数に依存する。分子が標識されると、それらは、簡単な存在／非存在閾値検出方法を各々のために使用することができるように増幅されてもよい。明確に標識された標的の数を計数することは、各々の種の分子の元の数を明らかにする。同一の分子を物理的空間に確率的に拡張させるデジタル式ＰＣＲと異なり、確率的標識の方法は同一の分子を化学的空間に拡張させる。デジタル式ＰＣＲとの重要な相違は、確率的標識方法が、個々の物理的容器への同一の分子の難しい物理的分離を必要としないことである。このアプローチは実際的であり、標識の後、存在する標識を同定してその数を計数するために、標識に相補的なプローブ配列を有するマイクロアレイなどの簡単な検出デバイスを使用することができる。さらに、ＤＮＡ配列決定読み出しのために調製されるＤＮＡ分子に確率的標識を付着させる場合は、標識する配列は、絶対的定量のための慎重な（discreet）計数タグの役割、または、当初タグ付けされた各鋳型とその増幅された娘分子を区別するための一意識別子の役割をすることができる（KindeらProc Natl Acad Sci USA １０８巻：９５３０〜９５３５頁（２０１１年））。
SykesらBiotechniques １３巻：４４４〜４４９頁（１９９２年） VogelsteinらDigital PCR. Proc Natl Acad Sci USA ９６巻：９２３６〜９２４１頁（１９９９年） FanらAm J Obstet Gynecol ２００巻：５４３ ｅ５４１〜５４７頁（２００９年） KalininaらNucleic Acids Res ２５巻：１９９９〜２００４頁（１９９７年） FuらProc Natl Acad Sci USA １０８巻：９０２６〜９０３１頁（２０１１年） KindeらProc Natl Acad Sci USA １０８巻：９５３０〜９５３５頁（２０１１年）
一部の実施形態では、ａ）複数のＲＮＡ分子を含む試料を複数のオリゴヌクレオチドタグと接触させて標識ＲＮＡ分子を生成するステップであって、前記複数のＲＮＡ分子は異なる配列の少なくとも２つのｍＲＮＡ分子を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドタグは異なる配列の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドタグを含み、前記複数のオリゴヌクレオチドタグはオリゴｄＴ配列を含む、ステップと、ｂ）前記標識ＲＮＡ分子を逆転写酵素と接触させて第１の鎖合成反応を実行することによって標識ｃＤＮＡ分子を生成するステップと、ｃ）前記標識ｃＤＮＡ分子を固体支持体とハイブリダイズすることによって前記標識ｃＤＮＡ分子を検出するステップとを含む、デジタル式逆転写方法がある。
一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸分子を複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグで確率的に標識するステップであって、前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグはオーバーハングを含み、前記１つまたは複数の核酸分子はハイブリダイゼーション連鎖反応のための開始剤として作用するステップを含む、確率的標識に基づくハイブリダイゼーション連鎖反応方法がある。
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部は、前記１つまたは複数の核酸分子の少なくとも一部とハイブリダイズすることができる。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグは、オリゴｄＴ配列を含むことができる。前記１つまたは複数の核酸分子は、１つまたは複数のアダプターを含むことができる。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部は、前記１つまたは複数のアダプターの少なくとも一部とハイブリダイズすることができる。前記複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグの少なくとも１つのヘアピンオリゴヌクレオチドタグは、１つまたは複数の標識を含むことができる。前記複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグの少なくとも１つのヘアピンオリゴヌクレオチドタグは、２つ以上の標識を含むことができる。
前記複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグの各ヘアピンオリゴヌクレオチドタグは、１つまたは複数の標識を含むことができる。前記複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグの各ヘアピンオリゴヌクレオチドタグは、２つ以上の標識を含むことができる。一部の場合には、前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグは標識を含まない。
前記複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグは、５’オーバーハングを有する１つまたは複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグ、３’オーバーハングを有するヘアピンオリゴヌクレオチドタグ、またはその組合せを含むことができる。
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分は、１ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分は、２ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分は、３ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分は、４ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分は、５ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分は、６ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分は、７ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分は、８ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分は、９ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分は、１０ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分は、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上の数のヌクレオチドの長さであってよい。
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、１ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、２ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、３ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、４ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、５ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、６ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、７ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、８ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、９ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、１０ヌクレオチド以上の長さであってよい。前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上の数のヌクレオチドの長さであってよい。
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグは、一意識別子（unique identifier）領域を含むことができる。前記一意識別子領域は、前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分にあってよい。前記一意識別子領域は、前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分にあってよい。前記一意識別子領域は、前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのオーバーハング部分にあってよい。
前記標識は、一意識別子領域を含むことができる。
一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドタグは一意識別子領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記一意識別子領域は少なくとも１ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドタグは汎用プライマー結合部位をさらに含む。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドタグは少なくとも１ヌクレオチドの長さである。
一部の実施形態では、前記固体支持体はアレイである。一部の実施形態では、前記固体支持体はアドレス可能なアレイである。一部の実施形態では、前記固体支持体はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ３Ｋタグアレイ、Ａｒｒａｙｊｅｔ非接触印刷アレイまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ Ｉｎｃ（ＡＭＩ）アレイである。一部の実施形態では、前記固体支持体はビーズである。
ａ）複数の分子を含む試料を複数のオリゴヌクレオチドタグと接触させて標識分子を生成するステップであって、前記複数の分子は異なる配列の少なくとも２つの分子を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドタグは異なる配列の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドタグを含み、前記試料は少なくとも１つの細胞に由来する、ステップと、ｂ）前記標識分子を固体支持体とハイブリダイズすることによって前記標識分子を検出するステップとを含む、細胞分析方法が本明細書でさらに開示される。
一部の実施形態では、ａ）複数の分子を複数のオリゴヌクレオチドタグで確率的に標識して標識分子を生成するステップであって、前記複数の分子は異なる配列の少なくとも２つの分子を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドタグは異なる配列の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドタグを含むステップと、ｂ）前記標識分子を増幅して標識アンプリコンを生成するステップと、ｃ）前記標識アンプリコンを検出するステップとを含むクローン増幅方法がある。
ａ）複数のオリゴヌクレオチドタグであって、前記複数のオリゴヌクレオチドタグのオリゴヌクレオチドタグは、標的特異的領域、および一意識別子領域を含む複数のオリゴヌクレオチドタグ、ならびにｂ）酵素を含むキットが本明細書でさらに開示される。
一部の実施形態では、前記酵素は逆転写酵素である。一部の実施形態では、前記酵素はリガーゼである。一部の実施形態では、前記酵素はポリメラーゼである。一部の実施形態では、前記酵素はＲＮアーゼである。一部の実施形態では、前記酵素はＤＮアーゼである。一部の実施形態では、前記酵素はエンドヌクレアーゼである。
一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドタグは少なくとも２５ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、前記一意識別子領域は少なくとも１０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、前記標的特異的領域は少なくとも１０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、前記標的特異的領域はオリゴｄＴ配列を含む。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドタグは汎用プライマー結合部位をさらに含む。
一部の実施形態では、本キットは支持体をさらに含む。一部の実施形態では、前記支持体は半固体支持体である。一部の実施形態では、前記支持体は固体支持体である。一部の実施形態では、前記固体支持体はアレイである。一部の実施形態では、前記支持体はアドレス可能なアレイである。一部の実施形態では、前記支持体はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ３Ｋタグアレイ、Ａｒｒａｙｊｅｔ非接触印刷アレイまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ Ｉｎｃ（ＡＭＩ）アレイである。一部の実施形態では、前記支持体はビーズである。
一部の実施形態では、本キットはプライマーをさらに含む。一部の実施形態では、前記プライマーは汎用プライマーである。一部の実施形態では、前記プライマーは前記オリゴヌクレオチドタグに結合する。一部の実施形態では、前記プライマーは前記オリゴヌクレオチドタグの汎用プライマー結合部位に結合する。
一部の実施形態では、本キットは対照オリゴをさらに含む。一部の実施形態では、前記対照オリゴは少なくとも１５ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記対照オリゴは明るいハイブリダイゼーション対照オリゴである。一部の実施形態では、前記対照オリゴはスパイクイン鋳型対照である。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドタグは標識をさらに含む。
一部の実施形態では、前記プライマーは標識をさらに含む。一部の実施形態では、前記対照オリゴは標識をさらに含む。一部の実施形態では、前記標識は色素標識である。一部の実施形態では、前記標識はＣｙ３色素である。一部の実施形態では、前記標識はＴｙｅ５６３色素である。
一部の実施形態では、本キットは緩衝剤をさらに含む。
一部の実施形態では、本キットは担体をさらに含む。
一部の実施形態では、本キットは洗浄剤をさらに含む。
複数の核酸分子の絶対量を決定するための系が、本明細書でさらに開示される。この系は、ａ）複数のオリゴヌクレオチドタグ、およびｂ）前記オリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部を検出するための検出器を含むことができる。
検出器は、アレイ検出器、蛍光リーダー、非蛍光検出器、ＣＲリーダーまたはスキャナを含むことができる。本方法がさらに含む一部の実施形態では、蛍光リーダーはＳｅｎｓｏｖａｔｉｏｎまたはＡＧ蛍光リーダーである。本方法がさらに含む一部の実施形態では、スキャナはフラットベッドスキャナである。
この系は、サーマルサイクラーをさらに含むことができる。一部の実施形態では、系はシーケンサーをさらに含む。一部の実施形態では、系はハイブリダイゼーションチャンバーをさらに含む。
系は、コンピューターをさらに含むことができる。一部の実施形態では、コンピューターはメモリデバイスを含む。一部の実施形態では、前記メモリデバイスはデータを保存することが可能である。一部の実施形態では、系はソフトウェアプログラムをさらに含む。一部の実施形態では、系はコンピューター可読プログラムをさらに含む。
一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドタグは一意識別子領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記一意識別子領域は少なくとも１０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、前記一意識別子領域は前記分子とハイブリダイズできない。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドタグは汎用プライマー結合部位をさらに含む。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドタグは少なくとも２０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドタグは標的特異的領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記標的特異的領域はオリゴｄＴ配列を含む。一部の実施形態では、前記標的特異的領域は少なくとも１０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、本方法は、第１の鎖合成反応を実行して標識ｃＤＮＡ分子を生成することをさらに含む。
一部の実施形態では、標識分子を増幅することはポリメラーゼ連鎖反応を実行することを含む。あるいは、標識分子を増幅することは、非ＰＣＲベースの増幅反応を実行することを含むことができる。標識分子を増幅することは、標識分子の指数関数的増幅を含むことができる。標識分子を増幅することは、標識分子の線形増幅を含むことができる。標識分子を増幅することは、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）に基づく増幅方法を含むことができる。
標識分子を増幅することは、標識分子の少なくとも標識部分、標識分子の分子部分またはその組合せを増幅することを含むことができる。
一部の実施形態では、本方法は、標識分子またはその任意の生成物に対してポリメラーゼ連鎖反応を実行して二本鎖標識分子を生成することをさらに含む。一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応を実行することは、第１の標的特異的プライマーを標識分子またはその任意の生成物にアニールすることを含む。一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応を実行することは、汎用プライマーをオリゴヌクレオチドタグの汎用プライマー結合部位にアニールすることをさらに含む。一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応は絶対ＰＣＲ、ＨＤ−ＰＣＲ、次世代ＰＣＲ、デジタル式ＲＴＡまたはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、本方法は、二本鎖標識ｃＤＮＡ分子に対してネステッドＰＣＲ反応を実行することを含む。一部の実施形態では、ネステッドＰＣＲ反応を実行することは、標識分子またはその任意の生成物を変性させて変性一本鎖標識分子またはその任意の生成物を生成することを含む。一部の実施形態では、ネステッドＰＣＲ反応を実行することは、第２の標的特異的プライマーを変性一本鎖標識分子またはその任意の生成物にアニールすることをさらに含む。一部の実施形態では、ネステッドＰＣＲ反応を実行することは、汎用プライマーをオリゴヌクレオチドタグの汎用プライマー結合部位にアニールすることをさらに含む。
一部の実施形態では、本方法は、オリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部、標識分子の少なくとも一部、その生成物、その相補配列、その逆相補配列またはその任意の組合せの配列を決定するために、配列決定反応を実行することをさらに含む。
一部の実施形態では、標識分子またはその任意の生成物を検出することは、アレイ検出器、蛍光リーダー、非蛍光検出器、ＣＲリーダーまたはスキャナを含む。一部の実施形態では、分子は核酸分子である。
一部の実施形態では、前記核酸分子はＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、前記核酸分子はＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、前記分子はペプチドである。一部の実施形態では、前記ペプチドはポリペプチドである。
一部の実施形態では、前記複数の分子は細胞に由来する。一部の実施形態では、前記試料は単一の細胞に由来する。一部の実施形態では、前記試料は約１００個未満の細胞に由来する。一部の実施形態では、前記試料は約５０個未満の細胞に由来する。一部の実施形態では、前記試料は約２０個未満の細胞に由来する。一部の実施形態では、前記試料は約１０個未満の細胞に由来する。一部の実施形態では、前記試料は約５個未満の細胞に由来する。一部の実施形態では、前記細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。一部の実施形態では、前記細胞は疾患または状態を患っている対象に由来する。一部の実施形態では、前記疾患または状態はがんである。一部の実施形態では、前記疾患または状態は病原体感染症である。一部の実施形態では、前記疾患または状態は遺伝的障害である。一部の実施形態では、前記細胞は健康な対象に由来する。一部の実施形態では、前記細胞は病的細胞である。一部の実施形態では、前記病的細胞はがん性細胞である。一部の実施形態では、前記細胞は健康な細胞である。一部の実施形態では、前記細胞は病的細胞でも感染細胞でもない。一部の実施形態では、標識分子は確率的標識によって生成される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ａ．複数のＲＮＡ分子を含む試料を複数のオリゴヌクレオチドタグと接触させて標識ＲＮＡ分子を生成するステップであって、
ｉ．前記複数のＲＮＡ分子は異なる配列の少なくとも２つのｍＲＮＡ分子を含み、
ｉｉ．前記複数のオリゴヌクレオチドタグは異なる配列の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドタグを含み、
ｉｉｉ．前記複数のオリゴヌクレオチドタグはオリゴｄＴ配列を含む、ステップと、
ｂ．前記標識ＲＮＡ分子を逆転写酵素と接触させて第１の鎖合成反応を実行することによって標識ｃＤＮＡ分子を生成するステップと、
ｃ．前記標識ｃＤＮＡ分子を固体支持体とハイブリダイズすることによって前記標識ｃＤＮＡ分子を検出するステップと
を含むデジタル式逆転写方法。
（項目２）
前記オリゴヌクレオチドタグが一意識別子領域をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記一意識別子領域が少なくとも１ヌクレオチドの長さである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記オリゴヌクレオチドタグが汎用プライマー結合部位をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記オリゴヌクレオチドタグが少なくとも１ヌクレオチドの長さである、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記固体支持体がアレイである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記固体支持体がアドレス可能なアレイである、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記固体支持体がＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ３Ｋタグアレイ、Ａｒｒａｙｊｅｔ非接触印刷アレイまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ Ｉｎｃ（ＡＭＩ）アレイである、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記固体支持体がビーズである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
ステップ（ｂ）の前記標識ｃＤＮＡ分子に対してポリメラーゼ連鎖反応を実行して二本鎖標識ｃＤＮＡ分子を生成することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ポリメラーゼ連鎖反応を実行することが、第１の標的特異的プライマーを前記標識ｃＤＮＡ分子にアニールすることを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ポリメラーゼ連鎖反応を実行することが、汎用プライマーを前記オリゴヌクレオチドタグの前記汎用プライマー結合部位にアニールすることをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が絶対ＰＣＲ、ＨＤ−ＰＣＲ、次世代ＰＣＲ、デジタル式ＲＴＡまたはその任意の組合せを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記二本鎖標識ｃＤＮＡ分子に対してネステッドＰＣＲ反応を実行することをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記ネステッドＰＣＲ反応を実行することが、前記二本鎖標識ｃＤＮＡ分子を変性させて変性一本鎖標識ｃＤＮＡ分子を生成することを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ネステッドＰＣＲ反応を実行することが、第２の標的特異的プライマーを前記変性一本鎖標識ｃＤＮＡ分子にアニールすることをさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記ネステッドＰＣＲ反応を実行することが、汎用プライマーを前記オリゴヌクレオチドタグの前記汎用プライマー結合部位にアニールすることをさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記オリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部、前記標識ｃＤＮＡ分子の少なくとも一部、その相補配列、その逆相補配列またはその任意の組合せの配列を決定するために、配列決定反応を実行することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記標識ｃＤＮＡ分子を検出することが、アレイ検出器、蛍光リーダー、非蛍光検出器、ＣＲリーダーまたはスキャナを含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記アレイ検出器がフラットベッドスキャナである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記蛍光リーダーがＳｅｎｓｏｖａｔｉｏｎ，ＡＧの蛍光リーダーである、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記標識ｃＤＮＡ分子を検出することが、前記固体支持体にハイブリダイズされた前記標識ｃＤＮＡ分子を検出することを含む、項目１に記載の方法。
（項目２３）
ハイブリダイゼーション連鎖反応を実行することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記オリゴヌクレオチドタグが１つまたは複数の二次構造を含む、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記１つまたは複数の二次構造がヘアピンである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記オリゴヌクレオチドタグが線状である、項目１に記載の方法。
（項目２７）
ａ．複数のオリゴヌクレオチドタグであって、前記複数のオリゴヌクレオチドタグのオリゴヌクレオチドタグは、
ｉ．標的特異的領域、および
ｉｉ．一意識別子領域
を含むオリゴヌクレオチドタグと、
ｂ．酵素と
を含むキット。
（項目２８）
前記酵素が逆転写酵素である、項目２７に記載のキット。
（項目２９）
前記酵素がリガーゼである、項目２７に記載のキット。
（項目３０）
前記酵素がポリメラーゼである、項目２７に記載のキット。
（項目３１）
前記酵素がＲＮアーゼである、項目２７に記載のキット。
（項目３２）
前記酵素がＤＮアーゼである、項目２７に記載のキット。
（項目３３）
前記酵素がエンドヌクレアーゼである、項目２７に記載のキット。
（項目３４）
前記オリゴヌクレオチドタグが少なくとも２５ヌクレオチドの長さである、項目２７に記載のキット。
（項目３５）
前記一意識別子領域が少なくとも１０ヌクレオチドの長さである、項目２７に記載のキット。
（項目３６）
前記標的特異的領域が少なくとも１０ヌクレオチドの長さである、項目２７に記載のキット。
（項目３７）
前記標的特異的領域がオリゴｄＴ配列を含む、項目２７に記載のキット。
（項目３８）
前記オリゴヌクレオチドタグが汎用プライマー結合部位をさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目３９）
支持体をさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目４０）
前記支持体が半固体支持体である、項目３９に記載のキット。
（項目４１）
前記支持体が固体支持体である、項目３９に記載のキット。
（項目４２）
前記固体支持体がアレイである、項目４１に記載のキット。
（項目４３）
前記支持体がアドレス可能なアレイである、項目３９に記載のキット。
（項目４４）
前記支持体がＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ３Ｋタグアレイ、Ａｒｒａｙｊｅｔ非接触印刷アレイまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ Ｉｎｃ（ＡＭＩ）アレイである、項目３９に記載のキット。
（項目４５）
前記支持体がビーズである、項目３９に記載のキット。
（項目４６）
プライマーをさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目４７）
前記プライマーが汎用プライマーである、項目４６に記載のキット。
（項目４８）
前記プライマーが前記オリゴヌクレオチドタグに結合する、項目４６に記載のキット。
（項目４９）
前記プライマーが前記オリゴヌクレオチドタグの汎用プライマー結合部位に結合する、項目４６に記載のキット。
（項目５０）
対照オリゴをさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目５１）
前記対照オリゴが少なくとも１５ヌクレオチドを含む、項目５０に記載のキット。
（項目５２）
前記対照オリゴが明るいハイブリダイゼーション対照オリゴである、項目５０に記載のキット。
（項目５３）
前記対照オリゴがスパイクイン鋳型対照である、項目５０に記載のキット。
（項目５４）
前記オリゴヌクレオチドタグが標識をさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目５５）
前記プライマーが標識をさらに含む、項目４６に記載のキット。
（項目５６）
前記対照オリゴが標識をさらに含む、項目５０に記載のキット。
（項目５７）
前記標識が色素標識である、項目５４〜５６のいずれかに記載のキット。
（項目５８）
前記標識がＣｙ３色素である、項目５４〜５６のいずれかに記載のキット。
（項目５９）
前記標識がＴｙｅ５６３色素である、項目５４〜５６のいずれかに記載のキット。
（項目６０）
緩衝剤をさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目６１）
担体をさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目６２）
洗浄剤をさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目６３）
サーマルサイクラーをさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目６４）
シーケンサーをさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目６５）
ハイブリダイゼーションチャンバーをさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目６６）
検出器をさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目６７）
アレイ検出器、蛍光リーダー、非蛍光検出器、ＣＲリーダーまたはスキャナをさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目６８）
前記蛍光リーダーがＳｅｎｓｏｖａｔｉｏｎまたはＡＧの蛍光リーダーである、項目６７に記載のキット。
（項目６９）
前記スキャナがフラットベッドスキャナである、項目６７に記載のキット。
（項目７０）
コンピューターをさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目７１）
前記コンピューターがメモリデバイスを含む、項目７０に記載のキット。
（項目７２）
前記メモリデバイスがデータを保存することが可能である、項目７１に記載のキット。
（項目７３）
ソフトウェアプログラムをさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目７４）
コンピューター可読プログラムをさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目７５）
ａ．複数の分子を含む試料を複数のオリゴヌクレオチドタグと接触させて標識分子を生成するステップであって、
ｉ．前記複数の分子は異なる配列の少なくとも２つの分子を含み、
ｉｉ．前記複数のオリゴヌクレオチドタグは異なる配列の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドタグを含み、
ｉｉｉ．前記試料は少なくとも１つの細胞に由来する、ステップと、
ｂ．前記標識分子を固体支持体とハイブリダイズすることによって前記標識分子を検出するステップと
を含む細胞分析方法。
（項目７６）
ａ．複数の分子を複数のオリゴヌクレオチドタグで確率的に標識して標識分子を生成するステップであって、
ｉ．前記複数の分子は異なる配列の少なくとも２つの分子を含み、
ｉｉ．前記複数のオリゴヌクレオチドタグは異なる配列の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドタグを含む、ステップと、
ｂ．前記標識分子を増幅して標識アンプリコンを生成するステップと、
ｃ．前記標識アンプリコンを検出するステップと
を含むクローン増幅方法。
（項目７７）
前記オリゴヌクレオチドタグが一意識別子領域をさらに含む、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目７８）
前記一意識別子領域が少なくとも１０ヌクレオチドの長さである、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記一意識別子領域が前記分子とハイブリダイズできない、項目７７に記載の方法。
（項目８０）
前記オリゴヌクレオチドタグが汎用プライマー結合部位をさらに含む、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目８１）
前記オリゴヌクレオチドタグが少なくとも２０ヌクレオチドの長さである、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目８２）
前記オリゴヌクレオチドタグが標的特異的領域をさらに含む、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目８３）
前記標的特異的領域がオリゴｄＴ配列を含む、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記標的特異的領域が少なくとも１０ヌクレオチドの長さである、項目８２に記載の方法。
（項目８５）
前記固体支持体がアレイである、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目８６）
前記固体支持体がアドレス可能なアレイである、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目８７）
前記固体支持体がＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ３Ｋタグアレイ、Ａｒｒａｙｊｅｔ非接触印刷アレイまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ Ｉｎｃ（ＡＭＩ）アレイである、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目８８）
前記固体支持体がビーズである、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目８９）
第１の鎖合成反応を実行して標識ｃＤＮＡ分子を生成することをさらに含む、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目９０）
前記標識分子またはその任意の生成物に対してポリメラーゼ連鎖反応を実行して二本鎖標識分子を生成することをさらに含む、項目７５に記載の方法。
（項目９１）
前記標識分子を増幅することがポリメラーゼ連鎖反応を実行することを含む、項目７６に記載の方法。
（項目９２）
前記ポリメラーゼ連鎖反応を実行することが、第１の標的特異的プライマーを前記標識分子またはその任意の生成物にアニールすることを含む、項目９０〜９１のいずれかに記載の方法。
（項目９３）
前記ポリメラーゼ連鎖反応を実行することが、汎用プライマーを前記オリゴヌクレオチドタグの前記汎用プライマー結合部位にアニールすることをさらに含む、項目９０〜９１のいずれかに記載の方法。
（項目９４）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が絶対ＰＣＲ、ＨＤ−ＰＣＲ、次世代ＰＣＲ、デジタル式ＲＴＡまたはその任意の組合せを含む、項目９０〜９１のいずれかに記載の方法。
（項目９５）
前記二本鎖標識ｃＤＮＡ分子に対してネステッドＰＣＲ反応を実行することをさらに含む、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目９６）
前記ネステッドＰＣＲ反応を実行することが、前記標識分子またはその任意の生成物を変性させて変性一本鎖標識分子またはその任意の生成物を生成することを含む、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記ネステッドＰＣＲ反応を実行することが、第２の標的特異的プライマーを前記変性一本鎖標識分子またはその任意の生成物にアニールすることをさらに含む、項目９５〜９６のいずれかに記載の方法。
（項目９８）
前記ネステッドＰＣＲ反応を実行することが、汎用プライマーを前記オリゴヌクレオチドタグの前記汎用プライマー結合部位にアニールすることをさらに含む、項目９５〜９６のいずれかに記載の方法。
（項目９９）
前記オリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部、前記標識分子の少なくとも一部、その生成物、その相補配列、その逆相補配列またはその任意の組合せの配列を決定するために、配列決定反応を実行することをさらに含む、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目１００）
前記標識分子またはその任意の生成物を検出することが、アレイ検出器、蛍光リーダー、非蛍光検出器、ＣＲリーダーまたはスキャナを含む、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目１０１）
前記蛍光リーダーがＳｅｎｓｏｖａｔｉｏｎ、またはＡＧの蛍光リーダーである、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記スキャナがフラットベッドスキャナである、項目１００に記載の方法。
（項目１０３）
前記標識分子またはその任意の生成物を検出することが、前記固体支持体にハイブリダイズされた前記標識分子を検出することを含む、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目１０４）
前記分子が核酸分子である、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目１０５）
前記核酸分子がＤＮＡ分子である、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記核酸分子がＲＮＡ分子である、項目１０４に記載の方法。
（項目１０７）
前記分子がペプチドである、項目７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目１０８）
前記ペプチドがポリペプチドである、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記複数の分子が細胞に由来する、項目７６に記載の方法。
（項目１１０）
前記試料が単一の細胞に由来する、項目７５に記載の方法。
（項目１１１）
前記試料が約１００個未満の細胞に由来する、項目７５に記載の方法。
（項目１１２）
前記試料が約５０個未満の細胞に由来する、項目７５に記載の方法。
（項目１１３）
前記試料が約２０個未満の細胞に由来する、項目７５に記載の方法。
（項目１１４）
前記試料が約１０個未満の細胞に由来する、項目７５に記載の方法。
（項目１１５）
前記試料が約５個未満の細胞に由来する、項目７５に記載の方法。
（項目１１６）
前記細胞が哺乳動物細胞である、項目７５に記載の方法。
（項目１１７）
前記細胞がヒト細胞である、項目７５に記載の方法。
（項目１１８）
前記細胞が疾患または状態を患っている対象に由来する、項目７５に記載の方法。
（項目１１９）
前記疾患または状態ががんである、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
前記疾患または状態が病原体感染症である、項目１１８に記載の方法。
（項目１２１）
前記疾患または状態が遺伝的障害である、項目１１８に記載の方法。
（項目１２２）
前記細胞が健康な対象に由来する、項目１０９〜１１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２３）
前記細胞が病的細胞である、項目１０９〜１１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２４）
前記病的細胞ががん性細胞である、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記細胞が健康な細胞である、項目１０９〜１１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２６）
前記細胞が病的細胞でも感染細胞でもない、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
標識分子が確率的標識によって生成される、項目１および７５〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目１２８）
１つまたは複数の核酸分子を複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグで確率的に標識するステップを含み、
（ａ）前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグはオーバーハングを含み、
（ｂ）前記１つまたは複数の核酸分子はハイブリダイゼーション連鎖反応のための開始剤として作用する、
確率的標識に基づくハイブリダイゼーション連鎖反応方法。
（項目１２９）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部が前記１つまたは複数の核酸分子の少なくとも一部とハイブリダイズする、項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグがオリゴｄＴ配列を含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１３１）
前記１つまたは複数の核酸分子が１つまたは複数のアダプターを含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１３２）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部が前記１つまたは複数のアダプターの少なくとも一部とハイブリダイズする、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグの少なくとも１つのヘアピンオリゴヌクレオチドタグが１つまたは複数の標識を含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１３４）
前記複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグの少なくとも１つのヘアピンオリゴヌクレオチドタグが２つ以上の標識を含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１３５）
前記複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグの各ヘアピンオリゴヌクレオチドタグが１つまたは複数の標識を含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１３６）
前記複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグの各ヘアピンオリゴヌクレオチドタグが２つ以上の標識を含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１３７）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグが標識を含まない、項目１２８に記載の方法。
（項目１３８）
前記複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグが、５’オーバーハングを有する１つまたは複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグ、３’オーバーハングを有するヘアピンオリゴヌクレオチドタグ、またはその組合せを含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１３９）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分が１ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１４０）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分が２ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１４１）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分が３ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１４２）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分が４ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１４３）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分が５ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１４４）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分が６ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１４５）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分が７ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１４６）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分が８ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１４７）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分が９ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１４８）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分が１０ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１４９）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分が１ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１５０）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分が２ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１５１）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分が３ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１５２）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分が４ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１５３）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分が５ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１５４）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分が６ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１５５）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分が７ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１５６）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分が８ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１５７）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分が９ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１５８）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分が１０ヌクレオチド以上の長さである、項目１２８に記載の方法。
（項目１５９）
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグが一意識別子領域を含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１６０）
前記一意識別子領域が前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分にある、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
前記一意識別子領域が前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのステム部分にある、項目１５９に記載の方法。
（項目１６２）
前記一意識別子領域が前記ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのオーバーハング部分にある、項目１５９に記載の方法。
（項目１６３）
前記標識が一意識別子領域を含む、項目１３３に記載の方法。
当業者は、以下に記載する図面は例示の目的にすぎないことを理解する。図面は、本発明の教示の範囲を決して限定しようとするものではない。
図１は、標的分子の標識および検出の模式図を示す（図は、現れる順で、そ れぞれ、配列番号１−２、１−２および２を開示する）。 図２は、ハイブリダイズした分子において標識を検出するためのシグナルを示す。 図３は、ハイブリダイズした分子において標識を検出するためのシグナルを示す。 図４は、ハイブリダイズした分子において標識を検出するためのシグナルを示す。 図５は、ハイブリダイズした分子において標識を検出するためのシグナルを示す。 図６は、ハイブリダイズした分子において標識を検出するためのシグナルを示す。 図７は、アレイ検出器による標識分子の検出の模式図を示す。 図８は、複数の分子の確率的標識の模式図を示す。 図９。汎用ＰＣＲ配列、短い標識配列、および標的特異的配列または遺伝子特異的配列からなる例示のＰＣＲプライマー（図は、現れる順で、それぞれ、配列番号３−４を開示する）。 図１０は、オリゴヌクレオチドタグの合成に対する模式図を示す（図は、 現れる順で、それぞれ、配列番号５としての領域「１００１」、配列番号６としての領域「１００３」、ならびに配列番号５および６としての領域「１００５」を開示する）。 図１１Ａは、標的特異的配列のないオリゴヌクレオチドタグの合成に対する模式図を示す（図は、配列番号５としての領域「１１０２」を開示し、現れる順で、それぞれ、配列番号５−６、５−６、６、５および５−６を開示する）。 図１１Ｂ〜Ｄは、オリゴヌクレオチドタグの合成に対する模式図を示す（図１１Ｂは、現れる順で、それぞれ、配列番号７−１０を開示し、そして図１１Ｃは、現れる順で、それぞれ、配列番号７、１１−１２、７、１３および１２を開示する）。 図１１Ｂ〜Ｄは、オリゴヌクレオチドタグの合成に対する模式図を示す（図１１Ｂは、現れる順で、それぞれ、配列番号７−１０を開示し、そして図１１Ｃは、現れる順で、それぞれ、配列番号７、１１−１２、７、１３および１２を開示する）。 図１１Ｂ〜Ｄは、オリゴヌクレオチドタグの合成に対する模式図を示す（図１１Ｂは、現れる順で、それぞれ、配列番号７−１０を開示し、そして図１１Ｃは、現れる順で、それぞれ、配列番号７、１１−１２、７、１３および１２を開示する）。 図１２Ａ〜Ｂは、縮重オリゴヌクレオチドタグを示す（現れる順で、それ ぞれ、配列番号１４−１５）。 図１３。標識プライマーのさらなる例。Ａ）総称的なプライマー配列のない標識プライマー（配列番号１６）。Ｂ）汎用標的配列を有する標識プライマー（配列番号１７）。 図１４。絶対ＰＣＲのプロトコール。 図１５。プライマーダイマーの形成。 図１６。プライマーアーチファクトの形成を防ぐための方法。 図１７。標準的なアレイとデジタルアレイとの間の違い 図１８。遺伝子および標識配列の組合せを使用したデジタルマイクロアレイプローブ検出。 図１９。個々のＤＮＡ分子を計数することによるｍＲＮＡ分子の絶対的定量（図は、現れる順で、それぞれ、配列番号１８−１９、および１９を開示する）。 図２０。ＲＮＡ発現に対するデジタルマイクロアレイ（図は、現れる順で 、それぞれ、配列番号２０−２１、２１、２１、２１および２１を開示する）。 図２１。ＤＮＡコピー数に対するデジタルマイクロアレイ。 図２２。マイクロＲＮＡに対するデジタルマイクロアレイ。 図２３Ａ。単一細胞着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）（ａ）サイクル０、（ｂ）サイクル５、（ｃ）サイクル１０、（ｄ）サイクル１５に対するデジタルマイクロアレイ。 図２３Ｂは、単一細胞着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）のための方法の模式図を示す。 図２４。母系循環核酸中の胎児異数性、例えば２１トリソミーを測定するためのデジタルマイクロアレイ。 図２５。個々のＤＮＡ分子を計数することによる、ｍＲＮＡ分子の絶対的定量（配列番号２２）。 図２６。「不活性な」プライマーでの標識（図は、現れる順で、それぞれ 、配列番号２３−２４、１８、２５−２６、１８、２７−２８、２７、２９−３０、２６および３１を開示し、そして配列番号２４として「ｄＵ１５」を開示する）。 図２７。増幅の間、ｃＤＮＡを打ち負かすことからのアーチファクトを防ぐためのエマルジョンＰＣＲ（図は、現れる順で、それぞれ、配列番号３２−３３、３０、３５−３７、３０、３５および３１を開示し、そして配列番号３４として「ｄＵ１７ｖ」を開示する）。 図２８。ホモポリマーのテーリングに頼らない方法（図は、現れる順で、 それぞれ、配列番号３０、３０、２７、２７、３８、２７、３９、２７および４０を開示する）。 図２９。直鎖増幅（ｌｉｎｅａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法（ 図は、現れる順で、それぞれ、配列番号４１、４１、４１、４１−４２および４２を開示する）。 図３０。ストランドスイッチングでの標識（図は、現れる順で、それぞれ 、配列番号４１、４１、４１、４１、４３および４３を開示する）。 図３１。ランダムプライミングによる標識（図は、現れる順で、それぞれ 、配列番号４４−４６および４６−５８を開示し、それぞれ配列番号２１および４７として「Ｔ２５」および「Ｕ２５」を開示する）。 図３２Ａ〜Ｂは、ｃＤＮＡ合成の最適化に対する結果を示す。 図３３。核酸分子の確率的標識とその後のＨＣＲ検出の模式図。 図３４。ヘアピンＨＣＲオリゴヌクレオチドの確率的標識の模式図。 図３５。段階希釈のカナマイシンＲＮＡでの滴定実験に対する段階希釈スキームの模式図。 図３６Ａ〜Ｈは、段階希釈のカナマイシンＲＮＡでの滴定実験に対する結果の散布図を示す。 図３６Ａ〜Ｈは、段階希釈のカナマイシンＲＮＡでの滴定実験に対する結果の散布図を示す。 図３６Ａ〜Ｈは、段階希釈のカナマイシンＲＮＡでの滴定実験に対する結果の散布図を示す。 図３６Ａ〜Ｈは、段階希釈のカナマイシンＲＮＡでの滴定実験に対する結果の散布図を示す。 図３６Ａ〜Ｈは、段階希釈のカナマイシンＲＮＡでの滴定実験に対する結果の散布図を示す。 図３６Ａ〜Ｈは、段階希釈のカナマイシンＲＮＡでの滴定実験に対する結果の散布図を示す。 図３６Ａ〜Ｈは、段階希釈のカナマイシンＲＮＡでの滴定実験に対する結果の散布図を示す。 図３６Ａ〜Ｈは、段階希釈のカナマイシンＲＮＡでの滴定実験に対する結果の散布図を示す。 図３７は、段階希釈のカナマイシンＲＮＡでの滴定実験に対する相関グラフを示す。 図３８。ＧＡＰＤＨ発現を測定するための段階希釈のヒト肝臓ＲＮＡでの滴定実験に対する段階希釈スキームの模式図。 図３９Ａ〜Ｈは、ＧＡＰＤＨ発現を測定するための段階希釈のヒト肝臓ＲＮＡでの滴定実験の結果に対する散布図を示す。 図３９Ａ〜Ｈは、ＧＡＰＤＨ発現を測定するための段階希釈のヒト肝臓ＲＮＡでの滴定実験の結果に対する散布図を示す。 図３９Ａ〜Ｈは、ＧＡＰＤＨ発現を測定するための段階希釈のヒト肝臓ＲＮＡでの滴定実験の結果に対する散布図を示す。 図３９Ａ〜Ｈは、ＧＡＰＤＨ発現を測定するための段階希釈のヒト肝臓ＲＮＡでの滴定実験の結果に対する散布図を示す。 図３９Ａ〜Ｈは、ＧＡＰＤＨ発現を測定するための段階希釈のヒト肝臓ＲＮＡでの滴定実験の結果に対する散布図を示す。 図３９Ａ〜Ｈは、ＧＡＰＤＨ発現を測定するための段階希釈のヒト肝臓ＲＮＡでの滴定実験の結果に対する散布図を示す。 図３９Ａ〜Ｈは、ＧＡＰＤＨ発現を測定するための段階希釈のヒト肝臓ＲＮＡでの滴定実験の結果に対する散布図を示す。 図３９Ａ〜Ｈは、ＧＡＰＤＨ発現を測定するための段階希釈のヒト肝臓ＲＮＡでの滴定実験の結果に対する散布図を示す。 図４０は、ＧＡＰＤＨ発現を測定するための段階希釈のヒト肝臓ＲＮＡでの滴定実験に対する相関グラフを示す。 図４１Ａ〜Ｄは、対照の細菌遺伝子の正確な測定に対する結果の散布図を示す。 図４１Ａ〜Ｄは、対照の細菌遺伝子の正確な測定に対する結果の散布図を示す。 図４２は、デジタルＰＣＲ実験によるカナマイシン計数の確証に対する散布図を示す。 図４３は、直接細胞可溶化物からのｍＲＮＡ分子の絶対的定量に対する方法の模式図を示す（図は、現れる順で、それぞれ、配列番号５９および１９を開示する）。
ここから、本発明の例示的な実施形態に詳細に言及する。本発明は例示的な実施形態と一緒に記載されるが、それらは本発明をこれらの実施形態に限定することを意図するものではないことが理解されよう。逆に、本発明は代替物、改変形および同等物をカバーするものであり、それらは本発明の精神および範囲の中に含めることができる。
本発明は多くの好ましい実施形態を有し、当業者に公知である詳細については、多くの特許、特許出願および他の参考文献に頼る。したがって、以下で特許、特許出願または他の参考文献、例えば印刷刊行物が引用されるかまたは繰り返される場合は、それが、全ての目的のために、特に列挙される提案のために参照により完全に組み込まれることを理解すべきである。
個体はヒトに限定されずに、他の生物体、例えば、それらに限定されないが、哺乳動物、植物、細菌、または上のいずれかに由来する細胞であってもよい。
この開示全体で、本発明の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲への硬直した限定と解釈されるべきでないことを理解すべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能なサブレンジならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと見なすべきである。例えば、１から６までなどの範囲の記載は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などのサブレンジ、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば１、２、３、４、５および６を具体的に開示したものと見なすべきである。範囲の幅に関係なく、これは適用される。
試料中の分子を検出および／または定量するための方法、キットおよび系が本明細書で開示される。一部の場合には、試料中の分子を個々に計数するための方法、キットおよび系が提供される。あるいは、遺伝子または遺伝子生成物の発現レベルを決定するための方法、キットおよび系が提供される。一部の場合には、本方法は、標識分子を形成するための、分子（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質）へのオリゴヌクレオチドタグの付着を含む。オリゴヌクレオチドタグは、標的特異的領域、一意識別子領域、汎用プライマー結合領域、検出可能な標識領域またはその任意の組合せを含むことができる。一部の場合には、分子へのオリゴヌクレオチドタグの付着は、オリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部および分子の少なくとも一部を含む特異接合部の形成をもたらす。遺伝子または遺伝子生成物の発現レベルは、標識分子の少なくとも一部（例えば、特異接合部、オリゴヌクレオチドタグ、分子）の一部を検出および／または定量することによって決定することができる。標的分子の絶対量は、標識分子の特異オリゴヌクレオチドタグの数および／または標識分子中の特異接合部の数を検出することによって決定することもできる。
１つまたは複数の分子を増幅および／または定量するための絶対ＰＣＲ方法が本明細書でさらに開示される。絶対ＰＣＲプロトコールの概略図を、図１４に表す。図１４のステップ１に示すように、汎用プライマー結合部位（１４０１）、一意識別子領域（１４０２）および標的特異的領域（１４０３）を含むオリゴヌクレオチドタグ（１４０４）を、標的分子（１４０５）とハイブリダイズさせる。図１４のステップ２に示すように、オリゴヌクレオチドタグ（１４０４）はプライマーとして作用することができ、標的分子（１４０５）のコピーをポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によるプライマー伸長によって合成して、アンプリコン（１４０６）を生成することができる。アンプリコン（１４０６）は、汎用プライマー結合部位（１４０１）、一意識別子領域（１４０２）および標的分子（１４１１）の相補配列を含むことができる。図１４のステップ３に示すように、リバースプライマー（１４０７）はアンプリコン（１４０６）にアニールすることができる。図１４のステップ４に示すように、アンプリコン（１４０６）は、第２のアンプリコン（１４０８）を合成するための鋳型として作用することができる。第２のアンプリコン（１４０８）は、標的分子（１４１１’）のコピーおよび汎用プライマー結合部位（１４０１’）の相補配列および一意識別子領域（１４０２’）の相補配列を含むことができる。図１４のステップ５に示すように、アンプリコン（１４０６、１４０８）は、汎用プライマー結合部位を含むフォワードプライマー（１４０９）および標的特異的配列を含むリバースプライマー（１４１０）による以降の増幅の鋳型として作用することができる。各以降のアンプリコンは、一意識別子領域（１４０２）を含む。一意識別子領域を各アンプリコンに組み込むことによって、増幅効率および／または増幅偏りを決定することができる。さらに、標的分子の量は、各標的分子と関連する異なる一意識別子領域の数を計数することによって決定することができる。絶対ＰＣＲ方法は、標的分子の以降の分析のために使用することができる（図１４のステップ６）。例えば、絶対ＰＣＲ方法によって生成されるアンプリコンは、１つまたは複数の標的分子を検出および／または定量するために使用することができる。組み込まれていないオリゴヌクレオチドタグは、アンプリコンの精製によって除去することができる。
Ｉ．オリゴヌクレオチドタグによる分子の標識
Ａ．分子の確率的標識
本明細書に開示される方法は、試料中の分子へのオリゴヌクレオチドタグの付着を含む。一部の場合には、分子へのオリゴヌクレオチドタグの付着は、分子の確率的標識を含む。分子を確率的に標識する方法は、例えば、米国特許出願第１２／９６９，５８１号および第１３／３２７，５２６号に見出すことができる。一般に、確率的標識方法は、１つまたは複数の分子への複数のオリゴヌクレオチドタグのランダム付着を含む。複数のオリゴヌクレオチドタグは、標識される１つまたは複数の分子を超えて提供される。確率的標識では、標識される各個々の分子は、複数のオリゴヌクレオチドタグに付着する個々の可能性を有する。標識される各個々の分子が、特定のタグに付着する可能性は、標識される他の任意の個々の分子とほぼ同じであってよい。したがって、一部の場合には、試料中の分子のいずれかがタグのいずれかを見出す可能性は等しいと仮定され、これは、試料中の分子の数を推定する数学的計算で使用することができる仮定である。一部の状況では、付着する可能性は、例えば、個々の分子とのそのタグの結合効率を増加または低下させる異なる特性を有するタグを選抜することによって操作することができる。確率的標識の間に特定のタグが結合パートナーを見出す可能性を変化させるために、オリゴヌクレオチドタグの数を変えることもできる。例えば、１つのタグはタグのプールで過度に多く、それによって、過度に多いタグが少なくとも１つの結合パートナーを見出す可能性を増加させることができる。
Ｂ．分子にオリゴヌクレオチドタグを付着させる方法
分子へのオリゴヌクレオチドタグの付着は様々な方法によって、例えば、それに限定されないが、分子へのオリゴヌクレオチドタグのハイブリダイゼーションによって起きることができる。一部の場合には、オリゴヌクレオチドタグは、標的特異的領域を含む。標的特異的領域は、標識される分子の少なくとも一部に相補的である配列を含むことができる。標的特異的領域は、分子とハイブリダイズし、それによって標識分子を生成することができる。
分子へのオリゴヌクレオチドタグの付着は、ライゲーションによって起きることができる。ライゲーション技術は、平滑末端ライゲーションおよび粘着末端ライゲーションを含む。ライゲーション反応は、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼを含むことができる。ライゲーション反応は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩおよびＴ４ ＲＮＡリガーゼＩＩなどのＲＮＡリガーゼを含むことができる。
ライゲーションの方法は、例えばSambrookら（２００１年）およびNew England BioLabsカタログに記載され、両方とも全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。方法は、平滑および粘着末端を有する二重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの並置された５’リン酸末端および３’ヒドロキシル末端の間でのホスホジエステル結合の形成を触媒するＴ４ ＤＮＡリガーゼ；相補的標的ＤＮＡとハイブリダイズされる２つの隣接オリゴヌクレオチドの並置された５’リン酸末端および３’ヒドロキシル末端の間でのホスホジエステル結合の形成を触媒するＴａｑ ＤＮＡリガーゼ；付着末端を有する二重鎖ＤＮＡの並置された５’リン酸末端および３’ヒドロキシル末端の間でのホスホジエステル結合の形成を触媒するＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡリガーゼ；ならびに、３’→５’ホスホジエステル結合の形成を通して３’ヒドロキシル末端核酸アクセプターへの５’ホスホリル末端核酸ドナーのライゲーションを触媒するＴ４ ＲＮＡリガーゼの使用を含み、基質は一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡならびにジヌクレオシドピロリン酸を含み；あるいは、当技術分野で記載される他の任意の方法が含まれる。ライゲーションに適合する末端を生成することによってライゲーションを促進するために、片方または両方の末端へのアダプターのライゲーションの前に、断片化されたＤＮＡを１つまたは複数の酵素、例えばエンドヌクレアーゼで処理することができる。
一部の場合には、オリゴヌクレオチドタグの両末端が、分子に付着する。例えば、オリゴヌクレオチドタグの両末端は、分子の１つまたは複数の末端へハイブリダイズおよび／またはライゲーションさせることができる。一部の場合には、分子の両末端へのオリゴヌクレオチドタグの両末端の付着は、環状化標識分子の形成をもたらす。オリゴヌクレオチドタグの両末端は、分子の同じ末端に付着させることもできる。例えば、オリゴヌクレオチドタグの５’末端は分子の３’末端にライゲーションされ、オリゴヌクレオチドタグの３’末端は分子の３’末端とハイブリダイズされ、１つの末端にヘアピン構造を有する標識分子をもたらす。一部の場合には、オリゴヌクレオチドタグは、分子の中央に付着させられる。
一部の場合には、分子へのオリゴヌクレオチドタグの付着は、１つまたは複数のアダプターの使用を含む。アダプターは、分子へのアダプターの付着を可能にする標的特異的領域を片方の末端に含むことができ、アダプターへのオリゴヌクレオチドタグの付着を可能にするオリゴヌクレオチドタグ特異的領域を他方の末端に含むことができる。アダプターは、それに限定されないがハイブリダイゼーションおよび／またはライゲーションを含む方法によって、分子および／またはオリゴヌクレオチドに付着させることができる。
核酸の断片にアダプターをライゲーションする方法は、周知である。アダプターは二本鎖、一本鎖または部分的に一本鎖であってよい。好ましい態様では、アダプターは、相補性の領域、例えば、完全な相補性の約１０〜３０または約１５〜４０塩基を有する２つのオリゴヌクレオチドから形成され、そのため、２つのオリゴヌクレオチドを一緒にハイブリダイズさせるとき、それらは二本鎖領域を形成する。任意選択で、オリゴヌクレオチドの一方または両方は、他のオリゴヌクレオチドに相補的でなく、アダプターの１つの末端または両末端で一本鎖のオーバーハングを形成する領域を有することができる。一本鎖のオーバーハングは、好ましくは約１〜約８塩基、最も好ましくは約２〜約４であってもよい。このオーバーハングは、「粘着末端」ライゲーションを促進するために制限酵素による開裂によって作製されるオーバーハングに相補的であってよい。アダプターは、他の特色、例えばプライマー結合部位および制限部位を含むことができる。一部の態様では、制限部位は、Ｔｙｐｅ ＩＩＳ制限酵素、またはＥｃｏＰ１５１などのその認識配列の外側で切断する別の酵素のためであってよい（参照により完全に本明細書に組み込まれる、MuckeらJ Mol Biol ２００１年、３１２巻（４号）：６８７〜６９８頁およびＵＳ５，７１０，０００を参照）。
オリゴヌクレオチドタグは、分子の任意の領域に付着させることができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の５’末端または３’末端に付着させることができる。例えば、オリゴヌクレオチドタグの標的特異的領域は、分子の５’領域の配列に相補的である配列を含む。オリゴヌクレオチドタグの標的特異的領域は、分子の３’領域の配列に相補的である配列を含むこともできる。一部の場合には、オリゴヌクレオチドタグは、遺伝子または遺伝子生成物の範囲内の領域に付着させられる。例えば、ゲノムＤＮＡが断片化され、オリゴヌクレオチドタグは断片化ＤＮＡに付着させられる。他の場合には、ＲＮＡ分子が代わりにスプライシングされ、オリゴヌクレオチドタグは代わりにスプライシングされた変異体に付着させられる。別の例では、ポリヌクレオチドが消化され、オリゴヌクレオチドタグは消化されたポリヌクレオチドに付着させられる。別の例では、オリゴヌクレオチドタグの標的特異的領域は、分子内の配列に相補的である配列を含む。
ＩＩ．逆転写
一部の場合には、本明細書に開示される方法は、標識ＲＮＡ分子を生成するための、ＲＮＡ分子へのオリゴヌクレオチドタグの付着を含む。本明細書に開示される方法は、標識ｃＤＮＡ分子を生成するための、標識ＲＮＡ分子の逆転写をさらに含むことができる。一部の場合には、オリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部は、逆転写反応のためのプライマーとして作用する。例えば、図１、ステップ１Ａ〜Ｂに示すように、オリゴｄＴ配列を含むオリゴヌクレオチドタグは、ｍＲＮＡ分子のポリＡテールとハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドタグのオリゴｄＴ部分は、ｃＤＮＡ分子の第１鎖合成のためのプライマーとして作用する。
一部の場合には、標識ｃＤＮＡ分子は、新しい確率的標識反応のための分子として使用することができる。標識ｃＤＮＡは、逆転写の前のＲＮＡへの付着からの第１のタグまたはタグのセット、およびｃＤＮＡ分子に付着した第２のタグまたはタグのセットを有することができる。これらの多重標識反応は、例えば、第１および第２のタグの付着の間に起こる事象、例えば任意選択の増幅反応または逆転写反応の効率を決定するために使用することができる。
別の例では、オリゴヌクレオチドタグをＲＮＡ分子の５’末端に付着させて標識ＲＮＡ分子を生成する。標識ＲＮＡ分子の逆転写は、逆転写プライマーの添加によって起こることができる。一部の場合には、逆転写プライマーは、オリゴｄＴプライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマーまたは標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーである。一般に、オリゴ（ｄＴ）プライマーは、長さが１２〜１８ヌクレオチドであり、哺乳動物ｍＲＮＡの３’末端の内在性ポリ（Ａ）＋テールに結合する。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、様々な相補部位でｍＲＮＡに結合することができる。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、対象のｍＲＮＡを一般的に選択的にプライミングする。
一部の場合には、本方法は、標識ＲＮＡ分子を繰り返し逆転写して、多重標識ｃＤＮＡ分子を生成することを含む。本明細書で開示される方法は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回の逆転写反応を実行することを含むことができる。本方法は、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００回の逆転写反応を実行することを含むことができる。
ＩＩＩ．標識分子の増幅
本明細書に開示される方法は、標識アンプリコンを生成するための、標識分子の増幅を含むことができる。標識分子の増幅は、ＰＣＲベースの方法または非ＰＣＲベースの方法を含むことができる。標識分子の増幅は、標識分子の指数関数的な増幅を含むことができる。標識分子の増幅は、標識分子の線形増幅を含むことができる。
一部の場合には、標識分子の増幅は、非ＰＣＲベースの方法を含む。非ＰＣＲベースの方法の例には、多重置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅またはサークル−ツー−サークル増幅が含まれるが、これらに限定されない。
標識分子の増幅は、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）に基づく方法を含むことができる（DirksおよびPierce、PNAS、２００４年；Zhangら、Anal Chem、２０１２年）。ＨＣＲベースの方法は、ＤＮＡベースのＨＣＲを含むことができる。ＨＣＲベースの方法は、１つまたは複数の標識プローブを含むことができる。１つまたは複数の標識プローブは、本明細書に開示される１つまたは複数のオリゴヌクレオチドタグを含むことができる。
一部の場合には、本明細書に開示される方法は、標識分子（例えば、標識ＲＮＡ、標識ＤＮＡ、標識ｃＤＮＡ）に対してポリメラーゼ連鎖反応を実行して、標識アンプリコンを生成することをさらに含む。標識アンプリコンは、二本鎖分子であってもよい。二本鎖分子は、二本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、またはＤＮＡ分子とハイブリダイズしたＲＮＡ分子を含むことができる。二本鎖分子の鎖の一方または両方が、オリゴヌクレオチドタグを含むことができる。あるいは、標識アンプリコンは、一本鎖分子である。一本鎖分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその組合せを含むことができる。本発明の核酸は、合成または変化させた核酸を含むことができる。
ポリメラーゼ連鎖反応は、ＰＣＲ、ＨＤ−ＰＣＲ、次世代ＰＣＲ、デジタル式ＲＴＡなどの方法、またはその任意の組合せで実施することができる。さらなるＰＣＲ法には、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、Ａｌｕ ＰＣＲ、アセンブリーＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ドロップレットＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、ヘリカーゼ依存性増幅ＨＤＡ、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ、指数関数後線形（ＬＡＴＥ）ＰＣＲ、ロングＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、半ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、単一細胞ＰＣＲおよびタッチダウンＰＣＲが含まれるが、これらに限定されない。
一部の場合には、ポリメラーゼ連鎖反応を実行することは、第１の標的特異的プライマーを標識分子にアニールすることを含む。あるいは、またはさらに、ポリメラーゼ連鎖反応を実行することは、汎用プライマーをオリゴヌクレオチドタグの汎用プライマー結合部位領域にアニールすることをさらに含み、そこにおいて、オリゴヌクレオチドタグは標識分子または標識アンプリコンの上にある。本明細書に開示される方法は、第２の標的特異的プライマーを標識分子および／または標識アンプリコンにアニールすることをさらに含むことができる。
一部の場合には、本方法は、標識分子を繰り返し増幅して、多重標識アンプリコンを生成することを含む。本明細書で開示される方法は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回の増幅反応を実行することを含むことができる。あるいは、本方法は、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００回の増幅反応を実行することを含む。
他の適する増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、WuおよびWallace、Genomics４巻、５６０頁（１９８９年）、Landegrenら、Science ２４１巻、１０７７頁（１９８８年）およびBarringerら、Gene ８９巻：１１７頁（１９９０年））、転写増幅（Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６巻、１１７３頁（１９８９年）およびＷＯ８８／１０３１５）、自律的配列複製（Guatelliら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、８７巻、１８７４頁（１９９０年）およびＷＯ９０／０６９９５）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、恣意的にプライミングされたポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号、第５，８６１，２４５号）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、FireおよびXu、PNAS ９２巻：４６４１頁（１９９５年）およびLiuら、J. Am. Chem. Soc.１１８巻：１５８７頁（１９９６年））および米国特許第５，６４８，２４５号、鎖置換増幅（LaskenおよびEgholm、Trends Biotechnol. ２００３年２１巻（１２号）：５３１〜５頁；BarkerらGenome Res.２００４年５月；１４巻（５号）：９０１〜７頁；DeanらProc Natl Acad Sci USA. ２００２年；９９巻（８号）：５２６１〜６頁；Walkerら１９９２年、Nucleic Acids Res.２０巻（７号）：１６９１〜６頁、１９９２年およびPaezら、Nucleic Acids Res.２００４年；３２巻（９号）：ｅ７１頁を参照）、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載されるＱβレプリカーゼ、ならびに核酸ベースの配列増幅（ＮＡＢＳＡ）が含まれる。（その各々は参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４０９，８１８号、第５，５５４，５１７号および第６，０６３，６０３号を参照）。使用することができる他の増幅方法は、米国特許第６，５８２，９３８号、第５，２４２，７９４号、第５，４９４，８１０号、第４，９８８，６１７号および米国特許出願公開第２００３０１４３５９９号に記載され、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。ＤＮＡは、多重遺伝子座特異的ＰＣＲによって、またはアダプター−ライゲーションおよび単一プライマーＰＣＲを使用して増幅することもできる（KinzlerおよびVogelstein、NAR（１９８９年）１７巻：３６４５〜５３頁を参照）。利用できる他の増幅方法、例えば均衡ＰＣＲ（Makrigiorgosら、（２００２年）、Nat Biotechnol、２０巻、９３６〜９頁）を使用することもできる。
選択された標的の増幅のために、分子反転プローブ（「ＭＩＰ」）を使用することもできる。前環プローブの末端が増幅される領域に連なる領域に相補的であるように、ＭＩＰを生成することができる。閉環を形成する末端のライゲーションの前に標的の相補配列がＭＩＰに組み込まれるように、プローブの末端の伸長によってギャップを閉じることができる。以前にHardenbolら、Genome Res.１５巻：２６９〜２７５頁（２００５年）および米国特許第６，８５８，４１２号に開示されているように、閉環を増幅し、配列決定またはハイブリダイゼーションによって検出することができる。
標識分子の増幅は、１つまたは複数のプライマーの使用を含むことができる。図９は、例示的なフォワードおよびリバースプライマーを表す。フォワードプライマー（９０１）は、汎用ＰＣＲ配列（９０２）、一意識別子配列（９０３）および標的配列（９０４）を含むことができる。リバースプライマー（９０５）は、標的配列を含むことができる。
本方法で使用されるプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３、使用者が定義する入力配列に基づいてプライマー配列を提案するコンピュータープログラムを使用して設計することができる。他のプライマー設計を使用してもよく、または、コンピュータープログラムを用いずに目でプライマーを選択することができる。ほとんどの用途に合わせてプライマー設計を調整するために、プログラムで利用できる多くの選択肢がある。Ｐｒｉｍｅｒ３は、それらに限定されないが、オリゴの融点、長さ、ＧＣ含有量、３’安定性、推定される二次構造、望ましくない配列（例えば散在する反復配列）にアニールするかそれを増幅する可能性、および同じプライマーの２つのコピー間のプライマー−二量体形成の可能性を含む、多くの因子を考慮することができる。プライマー対の設計では、Ｐｒｉｍｅｒ３は生成物のサイズおよび融点、対の２つのプライマー間のプライマー−二量体形成の可能性、プライマー融点間の差、および避けるべき特定の対象領域に対するプライマー位置を考慮することができる。
ＩＶ．配列決定
一部の態様では、本明細書に開示される方法は、標識分子またはその任意の生成物（例えば、標識アンプリコン、標識ｃＤＮＡ分子）の配列を決定することをさらに含む。標識分子またはその任意の生成物の配列を決定することは、オリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部、標識ｃＤＮＡ分子の少なくとも一部、その相補配列、その逆相補配列またはその任意の組合せの配列を決定するために、配列決定反応を実行することを含むことができる。一部の場合には、タグまたはタグの一部だけが配列決定をされる。標識分子またはその任意の生成物の配列を決定することは、配列決定方法、例えばＨｅｌｉｏｓｃｏｐｅ（商標）単一分子配列決定、Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＤＮＡ配列決定、Ｌｙｎｘ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＭａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＰＳＳ）、４５４パイロシークエンシング、Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅリアルタイム（ＲＮＡＰ）配列決定、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、イオン半導体配列決定、Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＳＭＲＴ（商標）配列決定、Ｐｏｌｏｎｙ配列決定、ＤＮＡ ｎａｎｏｂａｌｌ配列決定およびＶｉｓｉＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓアプローチによって実施することができる。あるいは、標識分子またはその任意の生成物の配列を決定することは、配列決定プラットホーム、例えば、それらに限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって提供されるＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩｘ、ＨｉＳｅｑおよびＭｉＳｅｑ、Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ（ＳＭＲＴ（商標））技術、例えばＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって提供されるＰａｃＢｉｏ ＲＳシステム、およびＳｏｌｅｘａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ（商標））技術、例えばＨｅｌｉｃｏｓ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）によって提供されるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用することができる。
一部の場合には、標識分子またはその任意の生成物の配列を決定することは、対末端配列決定、ナノポア配列決定、ハイスループット配列決定、ショットガン配列決定、色素−ターミネーター配列決定、多重プライマーＤＮＡ配列決定、プライマーウォーキング、サンガージデオキシ配列決定法、マキシム−ギルバート配列決定、パイロシークエンシング、真単一分子配列決定またはその任意の組合せを含む。あるいは、標識分子またはその任意の生成物の配列は、電子顕微鏡法または化学的高感度電界効果トランジスター（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイによって決定することができる。
別の例では、標識分子またはその任意の生成物の配列を決定することは、ＲＮＡ−ＳｅｑまたはマイクロＲＮＡ配列決定を含む。あるいは、標識分子またはその任意の生成物の配列を決定することは、タンパク質配列決定技術、例えばエドマン分解、ペプチド質量フィンガープリント、質量分析またはプロテアーゼ消化を含む。
特定の実施形態では、配列決定反応は、固体または半固体支持体の上、ゲル中、乳濁液中、表面、ビーズの上、液滴中、連続流中、希釈溶液中、または１つまたは複数の物理的に別個の容量中で起こることができる。
配列決定は、標識分子の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含むことができる。一部の場合には、配列決定は、標識分子の少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上のヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含む。他の場合には、配列決定は、標識分子の少なくとも約１５００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１０，０００またはそれ以上のヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含む。
配列決定は、１回の実行につき少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上の数の配列決定読取りを含むことができる。一部の場合には、配列決定は、１回の実行につき少なくとも約１５００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１０，０００またはそれ以上の数の配列決定読取りを配列決定することを含む。
Ｖ．検出方法
本明細書に開示される方法は、標識分子および／または標識アンプリコンの検出をさらに含むことができる。標識分子および／または標識アンプリコンの検出は、表面、例えば固体支持体との標識分子のハイブリダイゼーションを含むことができる。あるいは、またはさらに、標識分子の検出は、標識分子および／または標識アンプリコンを表面、例えば固体支持体と接触させることを含む。一部の場合には、本方法は、標識分子および／または標識アンプリコンを検出可能な標識と接触させて、検出可能な標識とコンジュゲートした標識分子を生成することをさらに含む。本明細書に開示される方法は、検出可能な標識とコンジュゲートした標識分子を検出することをさらに含むことができる。標識分子またはその任意の生成物（例えば、標識アンプリコン、検出可能な標識とコンジュゲートした標識分子）の検出は、オリゴヌクレオチドタグ、分子、検出可能な標識、オリゴヌクレオチドタグの相補配列、分子の相補配列またはその任意の組合せの少なくとも一部の検出を含むことができる。
標識分子またはその任意の生成物の検出は、乳濁液を含むことができる。例えば、標識分子またはその任意の生成物は、乳濁液中にあってよい。あるいは、標識分子またはその任意の生成物の検出は、１つまたは複数の溶液を含む。他の場合には、標識分子の検出は、１つまたは複数の容器を含む。
標識分子またはその任意の生成物（例えば、標識アンプリコン、検出可能な標識とコンジュゲートした標識分子）の検出は、各標識分子またはその生成物を検出することを含むことができる。例えば、本明細書に開示される方法は、各標識分子の少なくとも一部を配列決定し、それによって各標識分子を検出することを含む。
一部の場合には、標識分子および／または標識アンプリコンの検出は、電気泳動、分光法、鏡検、化学発光、発光、蛍光、免疫蛍光検査、比色または電気化学発光法を含む。例えば、本方法は蛍光色素の検出を含む。標識分子またはその任意の生成物の検出は、比色法を含むことができる。例えば、比色法は、比色計または比色リーダーの使用を含む。比色計および比色リーダーの非限定リストには、ＳｅｎｓｏｖａｔｉｏｎのＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｒｒａｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅａｄｅｒ（ＣＬＡＩＲ）、ＥＳＥＱｕａｎｔ Ｌａｔｅｒａｌ Ｆｌｏｗ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｒｅａｄｅｒ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ ３８、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０、ＶｅｒｓａＭａｘ、ＶＭａｘおよびＥＭａｘが含まれる。
標識分子および／またはアンプリコンを検出するために、単独でまたは他の方法と一緒に使用されるさらなる方法は、アレイ検出器、蛍光リーダー、非蛍光検出器、ＣＲリーダー、ルミノメータまたはスキャナの使用を含むことができる。一部の場合には、標識分子および／または標識アンプリコンを検出することは、アレイ検出器の使用を含む。アレイ検出器の例には、ダイオードアレイ検出器、フォトダイオードアレイ検出器、ＨＬＰＣフォトダイオードアレイ検出器、ピクセルアレイ検出器、ゲルマニウムアレイ検出器、ＣＭＯＳおよびＣＣＤアレイ検出器、ゲート制御線形ＣＣＤアレイ検出器、ＩｎＧａＡｓフォトダイオードアレイシステムおよびＴＥ冷却ＣＣＤシステムが含まれるが、これらに限定されない。アレイ検出器は、マイクロアレイ検出器であってよい。マイクロアレイ検出器の非限定例には、微小電極アレイ検出器、光学的ＤＮＡマイクロアレイ検出プラットホーム、ＤＮＡマイクロアレイ検出器、ＲＮＡマイクロアレイ検出器およびタンパク質マイクロアレイ検出器が含まれる。
一部の場合には、標識分子および／または標識アンプリコンを検出するために蛍光リーダーが使用される。蛍光リーダーは、バイオチップ、スライドまたはマイクロプレートで、１、２、３、４、５またはそれ以上の数の色蛍光マイクロアレイまたは他の構造を読み取ることができる。一部の場合には、蛍光リーダーは、Ｓｅｎｓｏｖａｔｉｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｒｒａｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＡＩＲ）である。あるいは、蛍光リーダーは、蛍光マイクロプレートリーダー、例えば、Ｇｅｍｉｎｉ ＸＰＳ蛍光マイクロプレートリーダー、Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭ蛍光マイクロプレートリーダー、Ｆｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎフィルターをベースにした蛍光マイクロプレートリーダー、ＰＨＥＲＡｓｔａｒマイクロプレートリーダー、ＦｌＵＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー、ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ多重モードマイクロプレートリーダーおよびＰＯＬＡＲｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ多重モードマイクロプレートリーダーである。蛍光リーダーのさらなる例には、ＰｈａｒｏｓＦＸ（商標）およびＰｈａｒｏｓＦＸ Ｐｌｕｓシステムが含まれる。
一部の場合には、標識分子および／または標識アンプリコンの検出は、マイクロプレートリーダーの使用を含む。一部の場合には、マイクロプレートリーダーは、ｘＭａｒｋ（商標）マイクロプレート吸光分光計、ｉＭａｒｋマイクロプレート吸光度リーダー、ＥｎＳｐｉｒｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅプレートリーダー、ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー、ＶＩＣＴＯＲ Ｘ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐａｒａｄｉｇｍ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ４、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２−Ｍ２ｅ、ＦｉｌｔｅｒＭａｘ Ｆシリーズ、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ＦｌｕｏｒｅｍｅｔｅｒおよびＬｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｆｌｕｏｒｅｍｅｔｅｒ、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｍｕｌｉｓｋａｎ ＦＣ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒおよびＭｕｌｉｓｋａｎ ＧＯ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒである。一部の場合には、マイクロプレートリーダーは、吸光度、蛍光、発光、時間分解蛍光、光散乱またはその任意の組合せを検出する。一部の実施形態では、マイクロプレートリーダーは、動的光散乱を検出する。一部の場合には、マイクロプレートリーダーは、静的光散乱を検出することができる。一部の場合には、標識分子および／または標識アンプリコンの検出は、マイクロプレート撮影装置の使用を含む。一部の場合には、マイクロプレート撮影装置は、ＶｉｅｗＬｕｘ ｕＨＴＳマイクロプレート撮影装置およびＢｉｏＲａｄマイクロプレート画像化システムを含む。
標識分子および／またはその生成物の検出は、ルミノメータの使用を含むことができる。ルミノメータの例には、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌ、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−９６マイクロプレートルミノメータ、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−２０／２０単管ルミノメータ、Ｉｎｓｔｉｎｃｔ（商標）ソフトウェアと一緒のＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ＋、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ Ｊｒ単管多重モードリーダー、ＬＵＭＩｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ、ＬＥＡＤＥＲ ＨＣ＋ルミノメータ、ＬＥＡＤＥＲ４５０ｉルミノメータおよびＬＥＡＤＥＲ ５０ｉルミノメータが含まれるが、これらに限定されない。
一部の場合には、標識分子および／または標識アンプリコンの検出は、スキャナの使用を含む。スキャナには、Ｃａｎｎｏｎ、Ｅｐｓｏｎ、ＨＰ、ＦｕｊｉｔｓｕおよびＸｅｒｏｘによって提供されるものなどの、フラットベッドスキャナが含まれる。フラットベッドスキャナのさらなる例には、ＦＭＢＩＯ（登録商標）蛍光画像スキャナ（例えば、ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＩＩ Ｐｌｕｓシステム）が含まれる。スキャナには、Ａｒｒａｙｉｔ ＡｒｒａｙＰｉｘ（商標）マイクロアレイマイクロプレートスキャナなどのマイクロプレートスキャナを含めることができる。一部の場合には、スキャナは、Ｂｉｏ−ｒａｄから提供されるＰｅｒｓｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ（商標）（ＰＭＩ）システムである。
標識分子の検出は、帯電粒子の質量−電荷比を測定する分析技術、例えば質量分析の使用を含むことができる。一部の実施形態では、帯電粒子の質量−電荷比は、クロマトグラフ分離技術と組み合わせて測定される。一部の実施形態では、配列決定反応が、帯電粒子測定の質量−電荷比と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、タグは同位体を含む。一部の実施形態では、タグライブラリーで同位体の型または比が制御または操作される。
標識分子またはその任意の生成物の検出は、小粒子および／または光散乱の使用を含む。例えば、増幅された分子（例えば、標識アンプリコン）は、ハプテンに、または小粒子に直接に付着させ、アレイとハイブリダイズさせる。小粒子は、サイズがナノメートルからマイクロメートルの範囲内であってよい。光がその表面から散乱するとき、粒子を検出することができる。
小粒子が有色であるか、またはハプテンを比色検出系で染色することができる場合は、比色アッセイを使用することができる。一部の場合には、粒子から散乱する光または有色物質の発生を検出するために、フラットベッドスキャナを使用することができる。本明細書に開示される方法は、吸光物質の使用をさらに含むことができる。吸光物質は、望ましくない光の散乱または反射をブロックするために使用することができる。吸光物質は、食品着色料または他の物質であってよい。一部の場合には、標識分子またはその任意の生成物の検出は、標識分子を軸外白色光と接触させることを含む。
標識分子の検出は、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）を含むことができる。図３３に表すように、複数の核酸分子（３３４０）を含む試料は、複数のオリゴヌクレオチドタグ（３３３０）で確率的に標識される。オリゴヌクレオチドタグ（３３３０）は、一意識別子領域（３３１０）およびアダプター領域（３３２０）を含む。核酸分子を確率的に標識することは、１つまたは複数の標識分子（３３４５）を生成するための、核酸分子（３３４０）の１つまたは複数の末端への１つまたは複数のオリゴヌクレオチドタグ（３３３０）の付着を含むことができる。１つまたは複数の標識分子は、複数のＨＣＲプローブ（３３５０）と接触させることができる。複数のＨＣＲプローブ（３３５０）は、オーバーハングおよび１つまたは複数の標識（３３６０、３３９０）を有するヘアピン分子を含むことができる。複数のＨＣＲプローブ（３３５０）は、５’オーバーハングを有するヘアピン分子と３’オーバーハングを有するヘアピン分子との混合物を含むことができる。複数のＨＣＲプローブは、ステム（３３７０、３３８０）を含むことができる。ステム（３３７０、３３８０）の配列は、オリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部に相補的であってよい。ステム（３３７０、３３８０）の配列は、オリゴヌクレオチドタグのアダプター領域（３３２０）に相補的であってよい。オリゴヌクレオチドのアダプター領域（３３２０）は、ハイブリダイゼーション連鎖反応のための開始剤として作用することができる。図３３に示すように、ＨＣＲプローブ（３３５０）のステム（３３７０）は、標識分子（３３４５）のアダプター領域（３３２０）とハイブリダイズすることができる。標識分子（３３４５）のアダプター領域（３３２０）とのＨＣＲプローブ（３３５０）のステム（３３７０）のハイブリダイゼーションは、ステムの解放（例えば、ステムの３３７０および３３８０はもはやアニールしない）およびＨＣＲプローブ（３３５０）の線形化をもたらすことができ、それはＨＣＲプローブ（３３５５）とハイブリダイズした標識分子の形成をもたらす。線形化ＨＣＲプローブは、別のＨＣＲプローブの以降のハイブリダイゼーションのための開始剤として次に作用することができる。第２のＨＣＲプローブのステムは、標識分子とハイブリダイズした線形化ＨＣＲプローブとハイブリダイズすることができ、第２のＨＣＲプローブの線形化および２つの線形化ＨＣＲプローブを有する標識分子の形成をもたらす。線形化した第２のＨＣＲプローブは、別のハイブリダイゼーション反応のための開始剤として作用することができる。複数の線形化ＨＣＲプローブ（３３７５）を有する標識分子を生成するために、この過程を複数回反復することができる。ＨＣＲプローブ上の標識（３３６０、３３９０）は、標識分子の検出を可能にすることができる。標識（３３６０、３３９０）は、任意の種類の標識（例えば、蛍光団、発色団、小分子、ナノ粒子、ハプテン、酵素、抗体、磁石）であってよい。標識（３３６０および３３９０）は、単一の標識の断片を含むことができる。標識（３３６０、３３９０）は、それらが近接しているとき、検出可能なシグナルを生成することができる。ＨＣＲプローブがヘアピンである場合は、標識（３３６０および３３９０）は、検出可能なシグナルを生成することができないほど遠く離れていてもよい。ＨＣＲプローブが線形化され、複数の線形化ＨＣＲプローブが一緒にハイブリダイズする場合は、標識（３３６０、３３９０）は検出可能なシグナルを生成するのに十分に近接してもよい。例えば、ＨＣＲプローブ（３３５０）は、標識（３３６０、３３９０）として２つのピレン部分を含むことができる。あるいは、標識はナノ粒子であってもよい。ＨＣＲは標識分子への複数のＨＣＲプローブの付着を可能にすることができ、それはシグナル増幅をもたらすことができる。確率的標識および続くＨＣＲは、核酸分子の検出、分析および／または定量の感度を増加させることができる。確率的標識および続くＨＣＲは、１つまたは複数の核酸分子の検出、分析および／または定量の正確度を増加させることができる。
シグナル検出および強度データの処理のためのさらなる方法および機器は、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、５，５４７，８３９号、５，５７８，８３２号、５，６３１，７３４号、５，８００，９９２号、５，８３４，７５８号、５，８５６，０９２号、５，９０２，７２３号、５，９３６，３２４号、５，９８１，９５６号、６，０２５，６０１号、６，０９０，５５５号、６，１４１，０９６号、６，１８５，０３０号、６，２０１，６３９号；第６，２１８，８０３号および第６，２２５，６２５号、米国特許出願公開第２００４００１２６７６号および第２００５００５９０６２号、ならびにＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（ＷＯ９９／４７９６４として公開される）に開示され、その各々も、全ての目的のためにここに参照により完全に組み込まれる。
標識分子の検出および／または定量は、コンピューターまたはコンピューターソフトウェアの使用を含むことができる。コンピューターソフトウェア製品は、本発明の方法の論理ステップを実施するためのコンピューターで実行可能な指示を有するコンピューター可読媒体を含むことができる。適するコンピューター可読媒体には、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープなどが含まれる。コンピューターで実行可能な指示は、適するコンピューター言語またはいくつかの言語の組合せで書くことができる。基本的なコンピューター生物学の方法は、例えば、ＳｅｔｕｂａｌおよびＭｅｉｄａｎｉｓら、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９７年）；Ｓａｌｚｂｅｒｇ、Ｓｅａｒｌｅｓ、Ｋａｓｉｆ（編）、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９８年）；ＲａｓｈｉｄｉおよびＢｕｅｈｌｅｒ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、２０００年）およびＯｕｅｌｅｔｔｅおよびＢｚｅｖａｎｉｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２版、２００１年）に記載されている。ＵＳ６，４２０，１０８も参照。
コンピュータープログラム製品およびソフトウェアは、様々な目的、例えばプローブ設計、データ管理、分析および機器操作のために使用することができる。米国特許第５，５９３，８３９号、５，７９５，７１６号、５，７３３，７２９号、５，９７４，１６４号、６，０６６，４５４号、６，０９０，５５５号、６，１８５，５６１号、６，１８８，７８３号、６，２２３，１２７号、６，２２９，９１１号および６，３０８，１７０号を参照。高密度マイクロアレイ分析を使用する遺伝子タイピングに関連するコンピューターによる方法を、本方法で使用することもできる、例えば、米国特許出願公開第２００５０２５０１５１号、第２００５０２４４８８３号、第２００５０１０８１９７号、第２００５００７９５３６号および第２００５００４２６５４号を参照。さらに、本開示は、米国特許出願公開第２００３００９７２２２号、第２００２０１８３９３６号、第２００３０１００９９５号、第２００３０１２０４３２号、第２００４０００２８１８号、第２００４０１２６８４０号および第２００４００４９３５４号に示すような、インターネットなどのネットワーク上で遺伝情報を提供する方法を含む、好ましい実施形態を有することができる。
標識分子またはその任意の生成物の検出および／または定量は、１つまたは複数のアルゴリズムの使用を含むことができる。あるいは、またはさらに、本方法、キットおよび組成物は、コンピューター、ソフトウェア、プリンター、および／または電子データまたは情報をさらに含むことができる。
本明細書に開示される方法は、データ／情報の伝達をさらに含むことができる。例えば、標識分子またはその任意の生成物の検出および／または定量に由来するデータ／情報は、別のデバイスおよび／または機器へ伝達される。一部の場合には、アルゴリズムから得られる情報を、別のデバイスおよび／または機器へ伝達することもできる。データ／情報の伝達は、第１の供給源から第２の供給源へのデータ／情報の移動を含むことができる。第１および第２の供給源は、同じおよその位置（例えば、同じ部屋、建物、ブロック、キャンパスの中）にあってよい。あるいは、第１および第２の供給源は、複数の位置（例えば、複数の都市、州、国、大陸など）にある。一部の実施形態では、一時的でないコンピューター可読媒体は、本明細書に記載される方法を使用して生成されるデータを保存または分析するために使用される。
データ／情報の伝達は、デジタル式伝達またはアナログ伝達を含むことができる。デジタル式伝達は、ポイント−ツー−ポイントまたはポイント−ツー−マルチポイント通信チャネル上でのデータ（デジタルビットストリーム）の物理的移動を含むことができる。そのようなチャネルの例は、銅線、光ファイバー、無線通信チャネルおよび保存媒体である。データは、電磁シグナル、例えば電圧、電波、マイクロ波または赤外線シグナルで表すことができる。
アナログ伝達は、連続的に変化するアナログシグナルの移動を含むことができる。メッセージは、デジタル式モジュレーション方法を使用する、回線コードによるパルスの配列（ベースバンド伝送）、または制限されたセットの連続的に変換する波形（通過帯域伝達）のいずれかで表すことができる。通過帯域モジュレーションおよび対応する復調（検出としても知られる）は、モデム装置で実行することができる。デジタルシグナルの最も一般的な定義によると、ビットストリームを表すベースバンドおよび通過帯域シグナルの両方はデジタル式伝達と見なされるが、代替定義ではベースバンドシグナルだけをデジタル式と見なし、デジタルデータの通過帯域伝達をＤ−Ａ変換の形と見なす。
本明細書に記載される系および方法の応用および使用は、個体、例えば患者の疾患状態を診断するために有益な１つまたは複数の結果をもたらすことができる。一実施形態では、疾患を診断する方法は、試料中の標的の存在および／または濃度レベルに関するデータを精査または分析することを含む。データの結論に基づく精査または分析は、患者、ヘルスケア医療提供者またはヘルスケアマネージャへ提供することができる。一実施形態では、結論は、疾患診断に関するデータの精査または分析に基づく。別の実施形態では、患者、ヘルスケア医療提供者またはヘルスケアマネージャに結論を提供することは、ネットワーク上でのデータの伝達を含むことが想定される。
したがって、本明細書に記載されるシステムおよび方法を使用するビジネスのシステムおよび方法が提供される。
本発明の一態様は、疾患診断に関するデータの精査または分析に基づいて結論を導くために、患者の試験試料を生物学的に活性な分析物の存在または非存在についてスクリーニングして、分析物に関するデータを生成し、分析物データを回収し、分析物データを患者、ヘルスケア医療提供者またはヘルスケアマネージャに提供することを含むビジネスの方法である。一実施形態では、患者、ヘルスケア医療提供者またはヘルスケアマネージャに結論を提供することは、ネットワーク上でのデータの伝達を含む。
したがって、図８は、それを通して本発明に関するデータを精査または分析することを達成することができる代表的な論理デバイスの例を示すブロック図である。そのようなデータは、個体での疾患、障害または状態に関するものであってよい。図８は、例えば結果を生成するための、スキャン検知システム８２４と一緒に使用する機器８２０に接続されたコンピューターシステム（または、デジタル式デバイス）８００を示す。コンピューターシステム８００は、媒体８１１および／またはやネットワークポート８０５からの指示を読むことができる論理機器と理解することができ、それは、固定媒体８１２を有するサーバー８０９と任意選択で接続されてもよい。図８に示すシステムは、ＣＰＵ８０１、ディスクドライブ８０３、任意選択の入力デバイス、例えばキーボード８１５および／またはマウス８１６、ならびに任意選択のモニター８０７を含む。データ通信は、指示された通信媒体を通してローカルのまたは離れた位置のサーバー８０９に対して達成することができる。通信媒体は、データを伝達および／または受信する任意の手段を含むことができる。通信媒体は、一時的でないコンピューター可読媒体を含むことができる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続またはインターネット接続であってよい。そのような接続は、ワールドワイドウエブの上での通信を可能にすることができる。当事者８２２による受信および／または精査のために、そのようなネットワークまたは接続の上でデータを伝達することができることが想定される。受信する当事者８２２は、限定されずに、患者、ヘルスケア医療提供者またはヘルスケアマネージャであってよい。
一実施形態では、コンピューター可読媒体は、環境または生物学的試料の分析の結果の伝達に適する媒体を含む。媒体は、対象の病態または状態に関する結果を含むことができ、そのような結果は本明細書に記載される方法を使用して導かれる。コンピューター可読媒体は、一時的でなくてもよい。
データ分析：一部の実施形態では、スキャナ機器は、アレイの上の各位置の生の強度値ならびにバックグラウンド強度を生成する。試料中の分子の数を計算するために、多くの方法を使用することができる。例えば、アレイの上の対照位置の値をデータセットから除去し、散布図を生成してデータの画像を提供する。これは、生データからバックグラウンド強度を引き算しようがしまいが起こることができる。陽性スポットおよび陰性スポットを分類するために、閾値強度値を確立することができる。陽性スポットの全てを合計して、特異な確率的標識の総数を提供する。この過程は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ｅｘｃｅｌまたは別のコンピューターソフトウェアプログラムで自動化することができる。
この戦略の代替手段は、ｋ平均法クラスタリングなどのクラスタリングアルゴリズムの使用である。ｋ平均法クラスタリングは、各観察が最も近い平均を有するクラスターに属するクラスターに全ての観察を分けることを目指す、クラスター分析の方法である。データは２つまたは３つのクラスター（またはそれ以上、これまで３クラスターが最もきれいな数を生成するようである）に分割することができ、カウント数を決定するためにデータポイントの数を追加することができる。
ＶＩ．標的分子
本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、分子の確率的標識で使用することができる。そのような分子には、限定されずに、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。本明細書で使用するように、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれであれ、プリンおよびピリミジン塩基、または他の天然であるか、化学的もしくは生化学的に改変されたか、非天然であるか、誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形を指す。「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、単一のヌクレオチドまたは塩基対からなることができる。あるいは、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、２個以上のヌクレオチドまたは塩基対を含む。例えば、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。別の例では、ポリヌクレオチドは、少なくとも約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００または１００００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、ＲＮＡまたはＤＮＡで一般的に見出されるように糖およびリン酸基を、または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド構成成分によって割り込まれてもよい。したがって、用語ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチドは、本明細書に記載のものなどの類似体を一般に含む。これらの類似体は、核酸またはオリゴヌクレオシド配列に組み込まれたときに、それらが溶液中の天然に存在する核酸配列とのハイブリダイゼーションを可能にするように、天然に存在するヌクレオシドまたはヌクレオチドと共通するいくつかの構造的特色を有する分子である。一般的に、これらの類似体は、塩基、リボースまたはホスホジエステル部分を交換および／または改変することにより、天然に存在するヌクレオシドおよびヌクレオチドから誘導される。所望によりハイブリッド形成を安定もしくは不安定にするか、相補核酸配列とのハイブリダイゼーションの特異性を増強するために、このような変化を調整することができる。一部の場合には、分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである。分子は、一本鎖または二本鎖であってよい。一部の場合には、分子は、ＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。ＲＮＡ分子は、ポリアデニル化されてもよい。あるいは、ｍＲＮＡ分子は、ポリアデニル化されない。あるいは、分子はＤＮＡ分子である。ＤＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡであってもよい。ＤＮＡ分子は、エクソン、イントロン、非翻訳領域またはその任意の組合せを含むことができる。
一部の場合には、分子はポリペプチドである。本明細書で使用するように、用語「ポリペプチド」は、少なくとも１つのペプチドを含む分子を指す。一部の場合には、ポリペプチドは単一のペプチドからなる。あるいは、ポリペプチドは２個以上のペプチドを含む。例えば、ポリペプチドは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個のペプチドを含む。ポリペプチドの例には、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ホルモン、オリゴ糖、脂質、糖脂質、リン脂質、抗体、酵素、キナーゼ、受容体、転写因子およびリガンドが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、同一であるかほとんど同一の分子および／または異なる分子の個々の発生を確率的に標識するために使用することができる。一部の場合には、本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、同一であるかほとんど同一の分子を確率的に標識するために使用することができる（例えば、分子は同一であるかほとんど同一の配列を含む）。例えば、標識される分子は、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。ほとんど同一の分子は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１未満の数のヌクレオチドまたは塩基対が異なっていてもよい。一部の場合には、標識される分子は互いに変異体である。例えば、標識される分子は、一塩基多型または他の型の突然変異を有することができる。別の例では、標識される分子は、スプライス変異体である。一部の場合には、少なくとも１つの分子は、確率的に標識される。他の場合には、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の同一であるかほとんど同一の分子が確率的に標識される。あるいは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の同一であるかほとんど同一の分子が確率的に標識される。他の場合には、少なくとも１５００、２，０００、２５００、３，０００、３５００、４，０００、４５００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１００００個の同一であるかほとんど同一の分子が確率的に標識される。他の場合には、少なくとも１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００または１００，０００個の同一であるかほとんど同一の分子が確率的に標識される。
他の場合には、本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、異なる分子を確率的に標識するために使用することができる。例えば、標識される分子は、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の配列同一性を含む。異なる分子は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上の数のヌクレオチドまたは塩基対が異なってよい。一部の場合には、少なくとも１つの分子は確率的に標識される。他の場合には、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なる分子が確率的に標識される。あるいは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の異なる分子が確率的に標識される。他の場合には、少なくとも１５００、２，０００、２５００、３，０００、３５００、４，０００、４５００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１００００個の異なる分子が確率的に標識される。他の場合には、少なくとも１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００または１００，０００個の異なる分子が確率的に標識される。
標識される異なる分子は、異なる濃度または量で試料中に存在することができる。例えば、１つの分子の濃度または量は、試料中の別の分子の濃度または量より大きい。一部の場合には、試料中の少なくとも１つの分子の濃度または量は、試料中の少なくとも１つの他の分子の濃度または量より少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００以上の倍数大きい。別の例では、１つの分子の濃度または量は、試料中の別の分子の濃度または量より小さい。試料中の少なくとも１つの分子の濃度または量は、試料中の少なくとも１つの他の分子の濃度または量より少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００以上の倍数小さい。
一部の場合には、標識される分子は１つまたは複数の試料中にある。標識される分子は、２個以上の試料中にあってよい。２個以上の試料は、標識される分子の異なる量または濃度を含有することができる。一部の場合には、１つの試料中の１つの分子の濃度または量は、異なる試料中の同じ分子の濃度または量より大きくてもよい。例えば、血液試料は尿試料より高い量の特定の分子を含有してもよい。あるいは、単一の試料は２個以上のサブサンプルに分割される。サブサンプルは、同じ分子の異なる量または濃度を含有することができる。１つの試料中の少なくとも１つの分子の濃度または量は、別の試料中の同じ分子の濃度または量より少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００以上の倍数大きくてもよい。あるいは、１つの試料中の１つの分子の濃度または量は、異なる試料中の同じ分子の濃度または量未満であってもよい。例えば、心臓組織試料は、肺組織試料より高い量の特定の分子を含有してもよい。１つの試料中の少なくとも１つの分子の濃度または量は、別の試料中の同じ分子の濃度または量より少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００以上の倍数小さくてもよい。一部の場合には、２つ以上の異なる試料中の分子の異なる濃度または量は、試料偏りと呼ばれる。
ＶＩＩ．オリゴヌクレオチドタグ
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、複数のオリゴヌクレオチドタグを含む。オリゴヌクレオチドタグは、標的特異的領域、一意識別子領域、アダプター領域、汎用プライマー結合部位領域またはその任意の組合せを含むことができる。図１０〜１３は、例示的なオリゴヌクレオチドタグを表す。
図１０に示すように、オリゴヌクレオチドタグ（１００４）は、汎用プライマー結合部位（１００１）、一意識別子領域（１００２）および標的特異的領域（１００３）を含むことができる。
図１１Ａに示すように、オリゴヌクレオチドタグ（１１０７）は、汎用プライマー結合部位（１１０２）、一意識別子領域（１１０３）および標的特異的領域（１１０５）を含むことができる。汎用プライマー結合部位（１１０２）は、図１１Ａで「＊」によって表されるように、ホスホロチオネート連結を含むことができる。図１１Ｂに示すように、オリゴヌクレオチドタグ（１１２８）は、汎用プライマー結合部位（１１２２）、一意識別子領域（１１２３）、橋スプリント（１１２９）および標的特異的領域（１１２６）を含むことができる。図１１Ｃに示すように、オリゴヌクレオチドタグ（１１５８）は、汎用プライマー結合部位（１１５１）、一意識別子領域（１１５２）、ライゲーション配列（１１５３）および標的特異的配列（１１５７）を含むことができる。図１１Ｄに示すように、オリゴヌクレオチドタグ（１１７７）は、汎用プライマー結合部位（１１７１）、一意識別子領域（１１７２）、ライゲーション配列（１１７３）およびＤＮＡ標的特異的配列（１１７８）を含むことができる。
図１２Ａに示すように、オリゴヌクレオチドタグ（１２０１）は、汎用プライマー結合部位（１２０２）、縮重配列（１２０３）を含む一意識別子領域および標的特異的領域（１２０４）を含むことができる。図１２Ｂに示すように、オリゴヌクレオチドタグ（１２１０）は、汎用プライマー結合部位（１２１１）、２つの隣接配列（１２１２および１２１４）が両端に隣接する縮重配列（１２１３）を含む一意識別子領域（１２１５）、および標的特異的領域（１２１６）を含むことができる。
オリゴヌクレオチドタグは、１つまたは複数の二次構造を含むことができる。図１３Ａに示すように、オリゴヌクレオチドタグ（１３０１）はヘアピン構造を含む。オリゴヌクレオチドタグ（１３０１）は、標的特異的領域（１３０２）、開裂可能なステム（１３０３、１３０４）および一意識別子領域（１３０５）を含むことができる。
オリゴヌクレオチドタグは、複数の異なる標的分子とハイブリダイズすることができる、標的特異的領域を含むことができる。例えば、図１３Ｂに示すように、オリゴヌクレオチドタグ（１３１０）は、汎用プライマー結合部位（１３１１）、一意識別子領域（１３１２）および汎用標的特異的領域（１３１３）を含む。汎用標的特異的領域（１３１３）は、ポリＡまたはポリＵ配列を含む標的分子とのハイブリダイゼーションを可能にするオリゴｄＴ配列を含むことができる。
複数のオリゴヌクレオチドタグを合成する方法を、図１０に表す。図１０に示すように、オリゴヌクレオチドタグ（１００４）は別々に合成することができる。オリゴヌクレオチドタグ（１００４）は、汎用プライマー結合部位（１００１）、一意識別子領域（１００２）および標的特異的領域を含むことができる。複数の異なる一意識別子領域を含む複数のオリゴヌクレオチドタグ（１００５）を生成するために、個々のオリゴヌクレオチドタグはプールされてもよい。
複数のオリゴヌクレオチドタグを合成する方法を、図１１Ａに表す。図１１Ａに示すように、オリゴヌクレオチド断片（１１０１）を、別々に合成することができる。オリゴヌクレオチド断片（１１０１）は、汎用プライマー結合部位（１１０２）および一意識別子領域（１１０３）を含むことができる。汎用プライマー結合部位（１１０２）は、図１１Ａで「＊」によって表されるように、ホスホロチオネート連結を含むことができる。図１１Ａのステップ１に示すように、複数のオリゴヌクレオチド断片（１１０４）を生成するために、個々のオリゴヌクレオチド断片（１１０１）を混合してもよい。複数のオリゴヌクレオチド断片（１１０４）は、標的特異的領域（１１０５）に付着させることができる。図１１Ａのステップ２に示すように、標的特異的領域（１１０５）を含むオリゴヌクレオチドタグを生成するために、標的特異的領域をオリゴヌクレオチドタグにライゲーションさせることができる。ライゲーションしていない生成物（１１０５、１１０１）を除去するために、５’および３’エキソヌクレアーゼを反応に加えることができる。汎用プライマー結合部位（１１０２）、一意識別子領域（１１０３）および標的特異的領域（１１０５）を含むオリゴヌクレオチドタグ（１１０６）は、５’および３’エキソヌクレアーゼに抵抗性であってよい。図１１Ａのステップ３に示すように、３’リン酸基のないオリゴヌクレオチドタグ（１１０７）を生成するために、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドタグ（１１０６）から３’リン酸基を除去することができる。３’リン酸基は、酵素によって除去することができる。例えば、３’リン酸基を除去するために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してもよい。
オリゴヌクレオチドタグを合成する別の方法を、図１１Ｂに表す。図１１Ｂに示すように、２つのオリゴヌクレオチド断片（１１２１および１１２７）をライゲーションすることによって、オリゴヌクレオチドタグ（１１２８）を合成することができる。１つのオリゴヌクレオチド断片（１１２１）は、汎用プライマー結合部位（１１２２）、一意識別子領域（１１２３）および左スプリント（１１２３）を含むことができる。他のオリゴヌクレオチド断片（１１２８）は、右スプリント（１１２５）および標的特異的領域（１１２６）を含むことができる。オリゴヌクレオチドタグ（１１２８）を生成するために２つのオリゴヌクレオチド断片（１１２１および１１２７）を連結するために、リガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）を使用することができる。左スプリント（１１２４）および右スプリント（１１２５）の二本鎖ライゲーションは、橋スプリント（１１２９）を有するオリゴヌクレオチドタグ（１１２８）を生成することができる。
２つのオリゴヌクレオチド断片をライゲーションすることによってオリゴヌクレオチドタグを合成する代替方法を、図１１Ｃに表す。図１１Ｃに示すように、２つのオリゴヌクレオチド断片（１１５０および１１５８）をライゲーションすることによって、オリゴヌクレオチドタグ（１１５８）が合成される。１つのオリゴヌクレオチド断片（１１５０）は、汎用プライマー結合部位（１１５１）、一意識別子領域（１１５２）およびライゲーション配列（１１５３）を含むことができる。他のオリゴヌクレオチド断片（１１５８）は、第１のオリゴヌクレオチド断片（１１５０）のライゲーション配列（１１５３）に相補的であるライゲーション配列（１１５４）、標的特異的領域（１１５５）の相補配列、および標識（１１５６）を含むことができる。オリゴヌクレオチド断片（１１５９）は、オリゴヌクレオチド断片の伸長を防止する３’リン酸を含むこともできる。図１１Ｃのステップ１に示すように、２つのオリゴヌクレオチド断片のライゲーション配列（１１５３および１１５４）はアニールすることができ、オリゴヌクレオチドタグ（１１５８）を生成するために第１のオリゴヌクレオチド断片（１１５０）の３’末端を伸長させるために、ポリメラーゼを使用することができる。オリゴヌクレオチドタグ（１１５８）は、汎用プライマー結合部位（１１５１）、一意識別子領域（１１５２）、ライゲーション配列（１１５３）および標的特異的配列（１１５７）を含むことができる。オリゴヌクレオチドタグ（１１５８）の標的特異的配列（１１５７）は、第２のオリゴヌクレオチド断片（１１５９）の標的特異的領域（１１５５）の相補配列の相補配列であってよい。標識（１１５６）を含むオリゴヌクレオチド断片は、オリゴヌクレオチドタグ（１１５８）から除去することができる。例えば、標識（１１５６）はビオチンを含むことができ、ビオチン標識（１１５６）を含むオリゴヌクレオチド断片（１１５９）は、ストレプトアビジン捕捉を通して除去することができる。別の例では、標識（１１５６）は５’リン酸を含むことができ、５’リン酸（１１５６）を含むオリゴヌクレオチド断片（１１５９）は、エキソヌクレアーゼ（例えば、ラムダエキソヌクレアーゼ）を通して除去することができる。
図１１Ｄに表すように、汎用プライマー結合部位（１１７１）、一意識別子領域（１１７２）、第１のライゲーション配列（１１７３）を含む第１のオリゴヌクレオチド断片（１１７０）は、第２のライゲーション配列（１１７４）および標的配列（１１７５）のＲＮＡ相補配列を含む第２のオリゴヌクレオチド断片（１１７６）にアニールされる。ステップ１は、第１および第２のライゲーション配列（１１７３および１１７４）をアニーリングし、続いて標的配列（１１７５）のＲＮＡ相補配列の逆転写を実施して、汎用プライマー結合部位（１１７１）、一意識別子領域（１１７２）、第１のライゲーション配列（１１７３）および標的特異的領域（１１７８）を含むオリゴヌクレオチドタグ（１１７７）を生成することを含むことができる。標的配列のＲＮＡ相補配列を含むオリゴヌクレオチド断片は、ＲＮアーゼ処理によって選択的に分解することができる。
オリゴヌクレオチドタグは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含むことができる。別の例では、オリゴヌクレオチドタグは、少なくとも約１５００、２，０００、２５００、３，０００、３５００、４，０００、４５００、５，０００、５５００、６，０００、６５００、７，０００、７５００、８，０００、８５００、９，０００、９５００または１０，０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。
タグは、六量体、例えばランダム六量体であってよい。タグは、モノヌクレオチドのセットからランダムに生成されてもよい。モノヌクレオチドをランダムに組み込むことによって、タグを組み立ててもよい。
ランダムに生成されないが、本方法を実施するために十分な数の異なるタグを含む異なるタグのライブラリーを生成するために、タグをランダムでなしに組み立てることもできる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドタグは標的分子のカットバックを含むことができる。カットバックは、例えば、標的分子の１つまたは両方の末端の酵素消化であってよい。カットバックは、付加オリゴヌクレオチドタグの追加と併用することができる。カットバックおよび付加タグの組合せは、特定の出発分子に関連する情報を含有することができる。ランダムなカットバックをタグに加えることによって、検出がランダムなカットバックおよび付加オリゴヌクレオチドの両方の判定を可能にする場合に、標的分子の数を計数するために付加タグのより狭い多様性が必要であり得る。
オリゴヌクレオチドタグは、標的特異的領域を含むことができる。標的特異的領域は、分子に相補的である配列を含むことができる。一部の場合には、分子はｍＲＮＡ分子であり、標的特異的領域は、ｍＲＮＡ分子のポリＡテールに相補的であるオリゴｄＴ配列を含む。標的特異的領域は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ合成のためのプライマーとして作用することもできる。例えば、標的特異的領域のオリゴｄＴ配列は、ｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡコピーの第１鎖の合成のためのプライマーとして作用することができる。あるいは、標的特異的領域は、分子の任意の部分に相補的である配列を含む。他の場合には、標的特異的領域は、分子とハイブリダイズまたはライゲーションさせることができるランダム配列を含む。標的特異的領域は、分子へのオリゴヌクレオチドタグの付着を可能にすることができる。オリゴヌクレオチドタグの付着は、本明細書に開示される方法（例えば、ハイブリダイゼーション、ライゲーション）のいずれかで起こすことができる。一部の場合には、標的特異的領域は、１つまたは複数の制限酵素によって認識される配列を含む。標的特異的領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含むことができる。別の例では、標的特異的領域は、少なくとも約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００または１００００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。好ましくは、標的特異的領域は、少なくとも約５〜１０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜３０、１５〜３０または２０〜３０個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。
一部の場合には、標的特異的領域は、特定の遺伝子または遺伝子生成物に特異的である。例えば、標的特異的領域は、ｐ５３遺伝子または遺伝子生成物の領域に相補的な配列を含む。したがって、オリゴヌクレオチドタグは、ｐ５３特異的配列を含む分子に付着することができるだけである。あるいは、標的特異的領域は、複数の異なる遺伝子または遺伝子生成物に特異的である。例えば、標的特異的領域は、オリゴｄＴ配列を含む。したがって、オリゴヌクレオチドタグは、ポリＡ配列を含む任意の分子に付着することができる。別の例では、標的特異的領域は、複数の異なる遺伝子または遺伝子生成物に相補的であるランダム配列を含む。したがって、オリゴヌクレオチドタグは、標的特異的領域に相補的である配列を有する任意の分子に付着することができる。他の場合には、標的特異的領域は、制限部位オーバーハング（例えば、ＥｃｏＲＩ粘着末端オーバーハング）を含む。オリゴヌクレオチドタグは、制限部位オーバーハングに相補的な配列を含む任意の分子にライゲーションすることができる。
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドタグは、一意識別子領域をしばしば含む。一意識別子領域は、標的種の発生を特異に特定し、それによって、さもなければ同一であるかほとんど同一の２つの標的を識別するために使用することができる識別子で各種に印を付けるために使用することができる。複数のオリゴヌクレオチドタグの一意識別子領域は、異なる半導体ナノクリスタル、金属化合物、ペプチド、オリゴヌクレオチド、抗体、小分子、同位体、異なる形状、色、バーコードもしくはそれに関連するかその中に埋め込まれる回折パターンを有する粒子または構造、数のストリング、タンパク質もしくは核酸のランダムな断片、異なる同位体、またはその任意の組合せの集合を含むことができる。一意識別子領域は、縮重配列を含むことができる。一意識別子領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含むことができる。別の例では、一意識別子領域は、少なくとも約１５００、２，０００、２５００、３，０００、３５００、４，０００、４５００、５，０００、５５００、６，０００、６５００、７，０００、７５００、８，０００、８５００、９，０００、９５００または１０，０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。好ましくは、一意識別子領域は、少なくとも約１０〜３０、１５〜４０または２０〜５０個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。
一部の場合には、オリゴヌクレオチドタグは汎用プライマー結合部位を含む。汎用プライマー結合部位は、標識分子および／または標識アンプリコンへの汎用プライマーの付着を可能にする。汎用プライマーは当技術分野で周知であり、例には、限定されずに、−４７Ｆ（Ｍ１３Ｆ）、アルファＭＦ、ＡＯＸ３’、ＡＯＸ５’、ＢＧＨ＿ｒ、ＣＭＶ＿−３０、ＣＭＶ＿−５０、ＣＶＭ＿ｆ、ＬＡＣｒｍｔ、ｌａｍｇｄａ ｇｔ １０Ｆ、ラムダｇｔ １０Ｒ、ラムダｇｔ １１Ｆ、ラムダｇｔ １１Ｒ、Ｍ１３ｒｅｖ、Ｍ１３Ｆｏｒｗａｒｄ（−２０）、Ｍ１３Ｒｅｖｅｒｓｅ、ｍａｌｅ、ｐ１０ＳＥＱＰ＿ｐＱＥ、ｐＡ＿−１２０、ｐｅｔ＿４、ｐＧＡＰ Ｆｏｒｗａｒｄ、ｐＧＬ＿ＲＶｐｒ３、ｐＧＬｐｒ２＿Ｒ、ｐＫＬＡＣ１＿４、ｐＱＥ＿ＦＳ、ｐＱＥ＿ＲＳ、ｐｕｃ＿Ｕ１、ｐｕｃ＿Ｕ２、ｒｅｖｅｒｓ＿Ａ、ｓｅｑ＿ＩＲＥＳ＿ｔａｍ、ｓｅｑ＿ＩＲＥＳ＿ｚｐｅｔ、ｓｅｑ＿ｏｒｉ、ｓｅｑ＿ＰＣＲ、ｓｅｑ＿ｐＩＲＥＳ−、ｓｅｑ＿ｐＩＲＥＳ＋、ｓｅｑ＿ｐＳｅｃＴａｇ、ｓｅｑ＿ｐＳｅｃＴａｇ＋、ｓｅｑ＿ｒｅｔｒｏ＋ＰＳＩ、ＳＰ６、Ｔ３−ｐｒｏｍ、Ｔ７−ｐｒｏｍおよびＴ７−ｔｅｒｍ＿Ｉｎｖが含まれる。汎用プライマー結合部位への汎用プライマーの付着は、標識分子および／または標識アンプリコンの増幅、検出および／または配列決定のために使用することができる。汎用プライマー結合部位は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含むことができる。別の例では、汎用プライマー結合部位は、少なくとも約１５００、２，０００、２５００、３，０００、３５００、４，０００、４５００、５，０００、５５００、６，０００、６５００、７，０００、７５００、８，０００、８５００、９，０００、９５００または１０，０００個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。好ましくは、汎用プライマー結合部位は、１０〜３０個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。
オリゴヌクレオチドタグは、アダプター領域を含むことができる。アダプター領域は、１つまたは複数のプローブのハイブリダイゼーションを可能にすることができる。アダプター領域は、１つまたは複数のＨＣＲプローブのハイブリダイゼーションを可能にすることができる。
オリゴヌクレオチドタグは、１つまたは複数の標識を含むことができる。
オリゴヌクレオチドタグは、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）のための開始剤として作用することができる。オリゴヌクレオチドタグのアダプター領域は、ＨＣＲのための開始剤として作用することができる。汎用プライマー結合部位は、ＨＣＲのための開始剤として作用することができる。
一部の場合には、オリゴヌクレオチドタグは一本鎖である。他の場合には、オリゴヌクレオチドタグは二本鎖である。オリゴヌクレオチドタグは線状であってよい。あるいは、オリゴヌクレオチドタグは二次構造を有する。本明細書で使用するように、「二次構造」には、三次、四次などの構造が含まれる。一部の場合には、二次構造は、ヘアピン、ステム−ループ構造、内部ループ、バルジループ、分枝構造もしくは疑似ノット、多重ステムループ構造、クローバー型構造または任意の三次元構造である。一部の場合には、二次構造はヘアピンである。ヘアピンは、オーバーハング配列を含むことができる。ヘアピンのオーバーハング配列は、ポリメラーゼ連鎖反応および／または逆転写反応のためのプライマーとして作用することができる。オーバーハング配列は、オリゴヌクレオチドタグが付着する分子に相補的である配列を含み、オーバーハング配列は分子とハイブリダイズする。オーバーハング配列は分子にライゲーションさせることができ、ポリメラーゼ連鎖反応および／または逆転写反応のための鋳型として作用する。一部の実施形態では、タグは、核酸および／または合成核酸および／または改変核酸を含む。
ヘアピンを含むオリゴヌクレオチドタグは、ハイブリダイゼーション連鎖反応のためのプローブとして作用することができる。さらに、本明細書では、確率的標識に基づくハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）方法であって、１つまたは複数の核酸分子をオリゴヌクレオチドタグで確率的に標識するステップを含み、オリゴヌクレオチドタグはヘアピンであり、１つまたは複数の核酸分子はハイブリダイゼーション連鎖反応のための開始剤として作用する方法が開示される。確率的標識に基づくハイブリダイゼーション反応の概略図を、図３４に表す。図３４に示すように、１つまたは複数の核酸分子（３４８０）は、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始することによって複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグ（３４９０）で確率的に標識される。ヘアピンオリゴヌクレオチドタグは、１つまたは複数の標識（３４１０、３４７０）、オーバーハング（３４２０、３４２０’）、ステム（３４３０、３４６０）およびループ（３４５０）を含むことができる。ヘアピンオリゴヌクレオチドタグ（３４９０）のオーバーハング領域（３４２０）は、標的特異的領域を含むことができる。オーバーハング領域（３４２０）は、オリゴｄＴ配列を含むことができる。１つまたは複数の核酸分子を含む試料は、確率的標識の前に１つまたは複数の制限ヌクレアーゼで処理されてもよい。オーバーハング領域（３４２０）は、制限酵素認識配列を含むことができる。アダプター−核酸分子ハイブリッドを生成するために、確率的標識の前に１つまたは複数の核酸分子を含む試料を１つまたは複数のアダプターと接触させることができる。オーバーハング領域（３４２０）およびステム（３４３０）は、１つまたは複数のアダプターに相補的であってよい。オリゴヌクレオチドタグのループ（３４５０）は、一意識別子領域を含むことができる。第１のヘアピンオリゴヌクレオチドタグ（３４９０）と核酸分子（３４８０）とのハイブリダイゼーションは標識分子（３４１５）の形成をもたらすことができ、そこにおいて、第１のヘアピンオリゴヌクレオチドタグは線形化されて第１の線形化オリゴヌクレオチドタグを生成する。標識分子（３４１５）の第１の線形化オリゴヌクレオチドタグは、第２のヘアピンオリゴヌクレオチドタグと標識分子（３４１５）とのハイブリダイゼーションのための開始剤として作用して、２つの線形化オリゴヌクレオチドタグ（３４２５）を有する標識分子を生成することができる。第２の線形化オリゴヌクレオチドタグは、別のハイブリダイゼーション反応のための開始剤として作用することができる。複数の線形化ＨＣＲプローブ（３４３５）を有する標識分子を生成するために、この過程を複数回反復することができる。ＨＣＲプローブ上の標識（３４１０、３４７０）は、標識分子の検出を可能にすることができる。標識（３４１０、３４７０）は、任意の種類の標識（例えば、蛍光団、発色団、小分子、ナノ粒子、ハプテン、酵素、抗体、磁石）であってよい。標識（３３６０および３３９０）は、単一の標識の断片を含むことができる。標識（３４１０、３４７０）は、それらが近接しているとき、検出可能なシグナルを生成することができる。オリゴヌクレオチドタグがヘアピンである場合は、標識（３３６０および３３９０）は、検出可能なシグナルを生成することができないほど遠く離れていてもよい。ヘアピンオリゴヌクレオチドタグが線形化され、複数の線形化ヘアピンオリゴヌクレオチドタグが一緒にハイブリダイズする場合は、標識（３４１０、３４７０）は検出可能なシグナルを生成するのに十分に近接してもよい。例えば、ヘアピンオリゴヌクレオチドタグ（３３５０）は、標識（３４１０、３４７０）として２つのピレン部分を含むことができる。あるいは、標識はナノ粒子であってもよい。確率的標識に基づくＨＣＲは標識分子への複数のヘアピンオリゴヌクレオチドタグの付着を可能にすることができ、それはシグナル増幅をもたらすことができる。確率的標識に基づくＨＣＲは、核酸分子の検出、分析および／または定量の感度を増加させることができる。確率的標識に基づくＨＣＲは、１つまたは複数の核酸分子の検出、分析および／または定量の正確度を増加させることができる。
一部の場合には、複数のオリゴヌクレオチドタグは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個の異なるオリゴヌクレオチドタグを含む。他の場合には、複数のオリゴヌクレオチドタグは、少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１００００個の異なるオリゴヌクレオチドタグを含む。あるいは、複数のオリゴヌクレオチドタグは、少なくとも約２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００または１００，０００個の異なるオリゴヌクレオチドタグを含む。
複数のオリゴヌクレオチドタグにおけるオリゴヌクレオチドタグの数は、標識する分子の数をしばしば上回る。一部の場合には、複数のオリゴヌクレオチドタグにおけるオリゴヌクレオチドタグの数は、標識する分子の数より少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の倍数大きい。
複数のオリゴヌクレオチドタグにおける異なるオリゴヌクレオチドタグの数は、標識する異なる分子の数をしばしば上回る。一部の場合には、複数のオリゴヌクレオチドタグにおける異なるオリゴヌクレオチドタグの数は、標識する異なる分子の数より少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の倍数大きい。
一部の場合には、分子の確率的標識は複数のオリゴヌクレオチドタグを含み、そこにおいて、複数のオリゴヌクレオチドタグにおける異なるオリゴヌクレオチドタグの濃度は同じである。このような場合には、複数のオリゴヌクレオチドタグは、各異なるオリゴヌクレオチドタグの同数を含む。さらに、複数のオリゴヌクレオチドにおける異なるオリゴヌクレオチドタグの相対比は、１：１：１・・・１である。
一部の場合には、分子の確率的標識は複数のオリゴヌクレオチドタグを含み、そこにおいて、複数のオリゴヌクレオチドタグにおける異なるオリゴヌクレオチドタグの濃度は異なる。このような場合には、複数のオリゴヌクレオチドタグは、各異なるオリゴヌクレオチドタグの異なる数を含む。さらに、複数のオリゴヌクレオチドにおける異なるオリゴヌクレオチドタグの相対比は、１：１：１・・・１でない。一部の場合には、一部のオリゴヌクレオチドタグは、複数のオリゴヌクレオチドタグにおける他のオリゴヌクレオチドタグより高い濃度で存在する。一部の場合には、異なる濃度のオリゴヌクレオチドタグによる確率的標識は、使用する異なる標識の数を増加させることなく、試料測定ダイナミックレンジを拡張する。例えば、全て等しい濃度の１０個の異なるオリゴヌクレオチドタグで３つの核酸試料分子を確率的に標識するとしよう。３つの異なる標識が観察されると予想される。今、３つの核酸分子ではなく、３０個の核酸分子とすると、１０個全ての標識が観察されると予想される。対照的に、なお１０個の異なる確率的標識を使用し、標識の相対比を１：２：３：４・・・１０に変化させるならば、３つの核酸分子では１〜３個の標識が観察されると予想されるが、３０個の分子ではおよそ５個の標識だけが観察されると予想され、したがって同数の確率的標識での測定範囲を拡張する。
複数のオリゴヌクレオチドタグにおける異なるオリゴヌクレオチドタグの相対比は１：Ｘであってよく、そこで、Ｘは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００である。あるいは、複数のオリゴヌクレオチドタグにおける「ｎ」個の異なるオリゴヌクレオチドタグの相対比は１：Ａ：Ｂ：Ｃ：・・・Ｚｎであり、そこで、Ａ：Ｂ：Ｃ：・・・Ｚｎは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００である。
一部の場合には、複数のオリゴヌクレオチドタグにおける２つ以上の異なるオリゴヌクレオチドタグの濃度は同じである。「ｎ」個の異なるオリゴヌクレオチドタグについては、少なくとも２、３、４・・・ｎ個の異なるオリゴヌクレオチドタグの濃度は同じである。あるいは、複数のオリゴヌクレオチドタグにおける２つ以上の異なるオリゴヌクレオチドタグの濃度は異なる。「ｎ」個の異なるオリゴヌクレオチドタグについては、少なくとも２、３、４・・・ｎ個の異なるオリゴヌクレオチドタグの濃度は異なる。一部の場合には、「ｎ」個の異なるオリゴヌクレオチドタグについては、少なくとも２、３、４・・・ｎ個の異なるオリゴヌクレオチドタグの濃度の差は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００倍である。
一部の場合には、複数のオリゴヌクレオチドタグにおける異なるオリゴヌクレオチドタグの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％は、同じ濃度を有する。あるいは、複数のオリゴヌクレオチドタグにおける異なるオリゴヌクレオチドタグの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％は、異なる濃度を有する。
オリゴヌクレオチドタグの二量体化を最小にするために、オリゴヌクレオチドタグの配列を最適化することができる。図１５は、オリゴヌクレオチドタグ配列が最適化されないときのオリゴヌクレオチドタグ二量体の形成を表す。図１５に示すように、オリゴヌクレオチドタグ配列が最適化されない場合は、汎用プライマー結合部位（１５０１）、第１の一意識別子領域（１５０２）および第１の標的特異的領域（１５０３）を含む第１のオリゴヌクレオチドタグ（１５０７）は、汎用プライマー結合部位（１５０１）、第２の一意識別子領域（１５０４）および第２の標的特異的領域（１５０５）を含む第２のオリゴヌクレオチドタグ（１５０８）にアニールすることができる。オリゴヌクレオチドタグ二量体を増幅させ、アンプリコンの各末端の２つの汎用プライマー結合部位、および標的特異的領域および一意識別子領域を含むアンプリコン（１５０６）の形成をもたらすことができる。オリゴヌクレオチドタグの濃度はＤＮＡ鋳型の数よりはるかに大きいので、これらのオリゴヌクレオチドタグ二量体は、増幅反応で標識ＤＮＡ分子を凌ぐことができる。増幅されないＤＮＡは偽陰性につながり、増幅されたオリゴヌクレオチドタグ二量体は高い偽陽性につながる。したがって、オリゴヌクレオチドタグ二量体形成を最小にするために、オリゴヌクレオチドタグを最適化することができる。あるいは、二量体化するオリゴヌクレオチドタグは廃棄され、それによってオリゴヌクレオチドタグ二量体形成が除去される。
あるいは、図１６に表すように、１つまたは複数の改変をオリゴヌクレオチドタグ配列に組み込むことによって、オリゴヌクレオチドタグ二量体形成を除去または低減することができる。図１６に示すように、汎用プライマー結合部位（１６１１）、一意識別子領域（１６１２）ならびにウラシルおよび３’リン酸基を含む標的特異的領域（１６１３）を含むオリゴヌクレオチドタグ（１６１０）は、標的分子（１６１６）にアニールされる。標的分子（１６１６）は、制限エンドヌクレアーゼで消化された断片であってよい。制限エンドヌクレアーゼは、図１６に表される認識部位を認識することができる。ＰＣＲ増幅は、１つまたは複数のフォワードプライマー（１６１８および１６１８）および１つまたは複数のリバースプライマー（１６１４および１６１５）を含むことができる。ＰＣＲ増幅は、オリゴヌクレオチドタグの汎用プライマー結合部位（１６１１）に特異的なフォワードプライマー（１６１８）、およびオリゴヌクレオチドタグの標的特異的領域（１６１３）に特異的なフォワードプライマー（１６１７）、および標的分子に特異的なリバースプライマー（１６１４および１６１５）によるネステッドＰＣＲを含むことができる。標的分子は、１つまたは複数のウラシルを含む鋳型を増幅することができないＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅させることができる。したがって、いかなる二量体化オリゴヌクレオチドタグも、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによって増幅させることができない。
ＶＩＩＩ．検出可能な標識
本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、検出可能な標識をさらに含むことができる。用語「検出可能な標識」または「標識」は互換的に使用することができ、ヌクレオチド、ヌクレオチドポリマーまたは核酸結合因子に付着する任意の化学部分を指し、そこで、付着とは共有結合または非共有結合であってよい。好ましくは、標識は検出可能であり、ヌクレオチドまたはヌクレオチドポリマーを本発明の実施者に検出可能にする。本明細書に開示される方法と組み合わせて使用することができる検出可能な標識には、例えば、蛍光標識、化学発光標識、失活剤、放射性標識、ビオチン、ピレン部分、金またはその組合せが含まれる。検出可能な標識の非限定例には、発光性分子、蛍光色素、蛍光失活剤、着色分子、放射性同位体またはシンチラントが含まれる。
一部の場合には、本明細書に開示される方法は、１つまたは複数の検出可能な標識を標識分子またはその任意の生成物（例えば、標識アンプリコン）に付着させることをさらに含む。本方法は、２個以上の検出可能な標識を標識分子に付着させることを含むことができる。あるいは、本方法は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９または１０個の検出可能な標識を標識分子に付着させることを含む。一部の場合には、検出可能な標識は、Ｃｙ（商標）標識である。Ｃｙ（商標）標識は、Ｃｙ３標識である。あるいは、またはさらに、検出可能な標識はビオチンである。一部の実施形態では、検出可能な標識は、分子または標識分子に結合するプローブに付着される。これは、例えば、分子または標識分子がアレイとハイブリダイズした後に起こることができる。１つの例では、分子はアレイの上のパートナーに結合される。結合の後、分子に結合することができるプローブは、アレイの上の分子に結合する。シグナルがアレイへの標識の非特異的結合または分子の非特異的結合の結果であるという可能性を減少させるために、この過程を複数のプローブおよび標識で繰り返すことができる。
一部の場合には、ドナーアクセプター対を検出可能な標識として使用することができる。ドナーまたはアクセプターのいずれかを、核酸に結合するプローブに付着させることができる。例えば、プローブは、分子または標識分子に結合することができる核酸プローブであってよい。シグナルを引き起こすために、対応するドナーまたはアクセプターを加えることができる。
一部の場合には、検出可能な標識は、Ｆｒｅｅｄｏｍ色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、Ｃｙ（商標）色素、フルオレセイン色素またはＬＩーＣＯＲ ＩＲＤｙｅｓ（登録商標）である。一部の場合には、Ｆｒｅｅｄｏｍ色素は、フルオレセイン（６−ＦＡＭ（商標）、６−カルボキシフルオレセイン）、ＭＡＸ（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）、ＴＹＥ（商標）５６３、ＴＥＸ６１５、ＴＹＥ（商標）６６５、ＴＹＥ７０５である。検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素であってよい。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素の例には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）が含まれる。あるいは、検出可能な標識は、Ｃｙ（商標）色素である。Ｃｙ（商標）色素の例には、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が含まれるが、これらに限定されない。一部の場合には、検出可能な標識は、フルオレセイン色素である。フルオレセイン色素の非限定例には、６−ＦＡＭ（商標）（Ａｚｉｄｅ）、６−ＦＡＭ（商標）（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）、フルオレセインｄＴ、ＪＯＥ（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）、ＴＥＴ（商標）およびＨＥＸ（商標）が含まれる。一部の場合には、検出可能な標識は、ＬＩ−ＣＯＲ ＩＲＤｙｅｓ（登録商標）、例えば５’ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、５’ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００またはＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）である。一部の場合には、検出可能な標識は、ＴＹＥ（商標）５６３である。あるいは、検出可能な標識は、Ｃｙ３である。
検出可能な標識は、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ色素であってもよい。ローダミン色素の例には、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）−Ｘ（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）、ＴＡＭＲＡ（商標）、ＴＡＭＲＡ（商標）（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ（商標）−Ｘ（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）、ＲＯＸ（商標）（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）、および５’ＴＡＭＲＡ（商標）（Ａｚｉｄｅ）が含まれるが、これらに限定されない。他の場合には、検出可能な標識は、ＷｅｌｌＲＥＤ色素である。ＷｅｌｌＲＥＤ色素には、ＷｅｌｌＲＥＤ Ｄ４色素、ＷｅｌｌＲＥＤ Ｄ３色素およびＷｅｌｌＲＥＤ Ｄ２色素が含まれるが、これらに限定されない。一部の場合には、検出可能な標識は、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）−Ｘ（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）６４０（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）またはＤｙ ７５０（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ）である。
一部の場合には、検出可能な標識には、リンカー分子が含まれる。リンカー分子の例には、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ＨＲＰ、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはその断片、Ｇｒｂ２、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、検出可能な標識には、重金属、電子供与体／アクセプター、アクリジニウムエステル、色素および熱量測定基質が含まれる。他の場合には、検出可能な標識には、アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびルシフェラーゼなどの酵素が含まれる。
表面プラズモン共鳴検出の場合のように、質量の変化は検出可能な標識と見なすことができる。当業者は、本発明の運用で使用することができる、本明細書で指摘されない有益で検出可能な標識を容易に認識する。
一部の場合には、検出可能な標識はプライマーで使用される。例えば、汎用プライマーは、検出可能な標識で標識される（例えば、Ｃｙ３標識汎用プライマー、蛍光団標識汎用プライマー）。あるいは、標的特異的プライマーは検出可能な標識で標識される（例えば、ＴＹＥ５６３標識標的特異的プライマー）。他の場合には、検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドタグで使用される。例えば、オリゴヌクレオチドタグは検出可能な標識で標識される（例えば、ビオチン標識オリゴヌクレオチドタグ）。他の場合には、検出可能な標識は、核酸鋳型分子で使用される。検出可能な標識は、標識分子または標識アンプリコンを検出するために使用することができる。あるいは、検出可能な標識は、核酸鋳型分子を検出するために使用される。
一部の場合には、検出可能な標識は、プライマー、オリゴヌクレオチドタグ、標識分子、標識アンプリコン、プローブ、ＨＣＲプローブおよび／または非標識分子に付着させる。検出可能な標識をプライマー、オリゴヌクレオチドタグ、標識分子、標識アンプリコンおよび／または非標識分子に付着させる方法には、化学標識および酵素標識が含まれるが、これらに限定されない。一部の場合には、検出可能な標識は、化学標識によって付着させる。一部の実施形態では、化学標識技術は、化学的反応性の基を含む。反応性の基の非限定例には、ＮＨＳ−フルオレセインまたはＮＨＳ−ローダミンなどのアミン反応性スクシンイミジルエステル、ＦＩＴＣを含むアミン反応性イソチオシアネート誘導体、およびフルオレセイン−５−マレイミドなどのスルフヒドリル反応性マレイミド活性化蛍光体が含まれる。一部の実施形態では、これらの反応性色素のいずれかと別の分子との反応は、蛍光団とリンカーおよび／または薬剤の間で形成される安定した共有結合をもたらす。一部の実施形態では、反応性の基はイソチオシアネートである。一部の実施形態では、標識は、リシン側鎖の第一級アミンを通して薬剤へ付着させる。一部の実施形態では、化学標識は、ＮＨＳ−エステル化学方法を含む。
あるいは、検出可能な標識は、酵素標識によって付着させる。酵素標識方法には、ビオチンアクセプターペプチド／ビオチンリガーゼ（ＡＰ／Ｂｉｒ Ａ）、アシル担体タンパク質／ホスホパンテテイン転移酵素（ＡＣＰ／ＰＰＴａｓｅ）、ヒトＯ６−アルキルグアニン転移酵素（ｈＡＧＴ）、Ｑータグ／トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）、アルデヒドタグ／ホルミルグリシン生成酵素、突然変異原核生物デハロゲナーゼ（ＨａｌｏＴａｇ（商標））、およびファルネシル化モチーフ／タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ（ＰＦＴａｓｅ）方法を含めることができるが、これらに限定されない。親和性標識には、ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびＦＫ５０６−結合性タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ））のＰｈｅ３６Ｖａｌ突然変異体を利用する非共有的方法、ならびに金属キレート化方法を含めることができるが、これらに限定されない。
架橋試薬は、検出可能な標識をプライマー、オリゴヌクレオチドタグ、標識分子、標識アンプリコンおよび／または非標識分子に付着させるために使用することができる。一部の場合には、架橋試薬は、グルタルアルデヒドである。グルタルアルデヒドは、いくつかの経路によってアミン基と反応して架橋を形成することができる。例えば、還元条件下では、グルタルアルデヒドの両末端のアルデヒドは、アミンと結合して第二級アミン連結を形成する。
一部の場合には、プライマー、オリゴヌクレオチドタグ、標識分子、標識アンプリコンおよび／または非標識分子への検出可能な標識の付着は、過ヨウ素酸活性化および続く還元アミノ化を含む。一部の場合には、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣまたは他のヘテロ二官能性架橋剤は、検出可能なものをプライマー、オリゴヌクレオチドタグ、標識分子、標識アンプリコンおよび／または非標識分子にコンジュゲートするために使用される。例えば、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣは、酵素を薬物にコンジュゲートするために使用される。一部の実施形態では、酵素は１つのステップで活性化および精製され、次に第２のステップで薬物にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、架橋の方向性は、１つの特定の配向に限定される（例えば、酵素のアミンは抗体のスルフヒドリル基に）。
ＩＸ．支持体
一部の場合には、本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、支持体を含む。本明細書で使用される用語「支持体」および「基質」は互換的に使用され、硬質または半硬質の表面（複数可）を有する材料または材料群を指す。支持体または基質は、固体支持体であってよい。あるいは、支持体は非固体支持体である。支持体または基質は、膜、紙、プラスチック、コーティングされた表面、平面、ガラス、スライド、チップまたはその任意の組合せを含むことができる。多くの実施形態では、固体支持体の少なくとも１つの表面は実質的に平らであるが、一部の実施形態では、例えばウェル、隆起領域、ピン、エッチングされた溝などで、異なる化合物のために合成領域を物理的に切り離すことが望ましいことがある。他の実施形態により、固体支持体（複数可）は、ビーズ、樹脂、ゲル、マイクロスフェアまたは他の幾何学的構成の形をとる。あるいは、固体支持体（複数可）は、シリカチップ、微粒子、ナノ粒子、プレートおよびアレイを含む。ポリマー（タンパク質を含む）アレイ合成に適用できる方法および技術は、米国特許出願公開第２００５００７４７８７号、ＷＯ００／５８５１６、米国特許第５，１４３，８５４号、５，２４２，９７４号、５，２５２，７４３号、５，３２４，６３３号、５，３８４，２６１号、５，４０５，７８３号、５，４２４，１８６号、５，４５１，６８３号、５，４８２，８６７号、５，４９１，０７４号、５，５２７，６８１号、５，５５０，２１５号、５，５７１，６３９号、５，５７８，８３２号、５，５９３，８３９号、５，５９９，６９５号、５，６２４，７１１号、５，６３１，７３４号、５，７９５，７１６号、５，８３１，０７０号、５，８３７，８３２号、５，８５６，１０１号、５，８５８，６５９号、５，９３６，３２４号、５，９６８，７４０号、５，９７４，１６４号、５，９８１，１８５号、５，９８１，９５６号、６，０２５，６０１号、６，０３３，８６０号、６，０４０，１９３号、６，０９０，５５５号、６，１３６，２６９号、６，２６９，８４６号および６，４２８，７５２号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３６７６０およびＷＯ０１／５８５９３に記載され、それらは全ての目的のために参照により完全に本明細書に全て組み込まれる。具体的な実施形態で合成技術を記載する特許には、米国特許第５，４１２，０８７号、６，１４７，２０５号、６，２６２，２１６号、６，３１０，１８９号、５，８８９，１６５号および５，９５９，０９８号が含まれる。核酸アレイは上記の特許の多くに記載されているが、同じ技術の多くはポリペプチドアレイに適用することができる。さらなる例示的な基質は、米国特許第５，７４４，３０５号および米国特許出願公開第２００９０１４９３４０号および第２００８００３８５５９号に開示されている。
一部の場合には、固体支持体は、ビーズである。ビーズの例には、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）ミクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ（例えば、抗免疫グロブリン性ミクロビーズ）、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴｄＴコンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンミクロビーズ、抗フルオロクロムミクロビーズおよびＢｃＭａｇ（商標）カルボキシ末端磁気ビーズが含まれるが、これらに限定されない。
固体支持体は、アレイまたはマイクロアレイであってよい。固体支持体は、別個の領域を含むことができる。固体支持体は、アドレス可能なアレイであってよい。一部の場合には、アレイは、固体表面の上に固定される複数のプローブを含む。複数のプローブは、固体表面への標識分子および／または標識アンプリコンのハイブリダイゼーションを可能にする。複数のプローブは、標識分子および／または標識アンプリコンの少なくとも一部に相補的である配列を含む。一部の場合には、複数のプローブは、標識分子および／または標識アンプリコンのオリゴヌクレオチドタグ部分に相補的である配列を含む。他の場合には、複数のプローブは、分子へのオリゴヌクレオチドタグの付着によって形成される接合部に相補的である配列を含む。
アレイは、１つまたは複数のプローブを含むことができる。図１８に表すように、プローブは様々なフォーマットであってよい。図１８Ａ〜１８Ｃ、１８Ｇおよび１８Ｈに示すように、アレイ（１８０１、１８０６、１８１１、１８２８、１８３２）は、標的分子（１８０２、１８０７、１８１３、１８２９、１８３３）の少なくとも一部に相補的である配列、およびオリゴヌクレオチドタグ（１８０３、１８０８、１８１２、１８３０、１８３４）の一意識別子領域に相補的である配列を含むプローブ（１８０４、１８０９、１８１４、１８３６、１８３５）を含むことができる。図１８Ａ〜１８Ｂ、１８Ｇおよび１８Ｈに示すように、標的分子（１８０２、１８０７、１８２９、１８３３）の少なくとも一部に相補的である配列は、アレイに付着させることができる。図１８Ｃに示すように、一意識別子領域（１８１２）に相補的である配列は、アレイに付着させることができる。図１８Ｄ〜１８Ｆに示すように、アレイ（１８１６、１８２０、１８２４）は、標的分子の少なくとも一部に相補的である配列を含む第１のプローブ（１８１７、１８２１、１８２５）、および一意識別子領域に相補的である第２のプローブ（１８１９、１８２３、１８２７）を含むことができる。図１８Ａ〜１８Ｈは、確率的に標識される分子（１８０５、１８１０、１８１５、１８１８、１８２２、１８２６、１８３１、１８３７）がアレイとハイブリダイズすることができる様々な方法も表す。例えば、図１８Ａおよび１８Ｃに示すように、確率的に標識される分子（１８０５、１８１５）の一意識別子領域および標的分子の接合部は、アレイの上のプローブ（１８０４、１８１４）とハイブリダイズすることができる。図１８Ｂ、１８Ｄ〜１８Ｈに示すように、アレイの上のプローブとハイブリダイズすることができる確率的に標識される分子（１８１０、１８１８、１８２２、１８２６、１８３１、１８３７）の領域には、ギャップがあってよい。図１８Ｄ〜１８Ｆおよび１８Ｈに示すように、確率的に標識される分子（１８１８、１８２２、１８２６、１８３７）の異なる領域は、アレイの上の２個以上のプローブとハイブリダイズすることができる。したがって、アレイのプローブは、多くの異なるフォーマットであってよい。アレイのプローブは、一意識別子領域に相補的である配列、標的分子に相補的である配列、またはその組合せを含むことができる。アレイとの確率的に標識される分子のハイブリダイゼーションは、様々な方法によって起こることができる。例えば、確率的に標識される分子の２個以上のヌクレオチドは、アレイの上の１つまたは複数のプローブとハイブリダイズすることができる。プローブとハイブリダイズする確率的に標識される分子の２個以上のヌクレオチドは、連続的なヌクレオチド、連続的でないヌクレオチド、またはその組合せであってもよい。プローブとハイブリダイズする確率的に標識される分子は、当技術分野で公知である任意の方法によって検出することができる。例えば、確率的に標識される分子は、直接に検出することができる。確率的に標識される分子を直接に検出することは、蛍光団、ハプテンまたは検出可能な標識の検出を含むことができる。確率的に標識される分子は、間接に検出することができる。確率的に標識される分子の間接的な検出は、ライゲーションまたは他の酵素的もしくは非酵素的方法を含むことができる。
アレイは、様々なフォーマットであってよい。例えば、アレイは、１６−、３２−、４８−、６４−、８０−、９６−、１１２−、１２８−、１４４−、１６０−、１７６−、１９２−、２０８−、２２４−、２４０−、２５６−、２７２−、２８８−、３０４−、３２０−、３３６−、３５２−、３６８−、３８４−または４００−フォーマットであってよい。あるいは、アレイは、８×６０Ｋ、４×１８０Ｋ、２×４００Ｋ、１×１Ｍフォーマットである。他の場合には、アレイは、８×１５Ｋ、４×４４Ｋ、２×１０５Ｋ、１×２４４Ｋのフォーマットである。
アレイは、単一のアレイを含むことができる。単一のアレイは、単一の基質の上にあってよい。あるいは、アレイは複数の基質の上にある。アレイは、複数のフォーマットを含むことができる。アレイは、複数のアレイを含むことができる。複数のアレイは、２個以上のアレイを含むことができる。例えば、複数のアレイは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のアレイを含むことができる。一部の場合には、複数のアレイの少なくとも２つのアレイは同一である。あるいは、複数のアレイの少なくとも２つのアレイは異なる。
一部の場合には、アレイは対称的なチャンバー領域を含む。例えば、アレイは、０．５×０．５ｍｍ、１×１ｍｍ、１．５×１．５ｍｍ、２×２ｍｍ、２．５×２．５ｍｍ、３×３ｍｍ、３．５×３．５ｍｍ、４×４ｍｍ、４．５×４．５ｍｍ、５×５ｍｍ、５．５×５．５ｍｍ、６×６ｍｍ、６．５×６．５ｍｍ、７×７ｍｍ、７．５×７．５ｍｍ、８×８ｍｍ、８．５×８．５ｍｍ、９×９ｍｍ、９．５×９．５ｍｍ、１０×１０ｍｍ、１０．５×１０．５ｍｍ、１１×１１ｍｍ、１１．５×１１．５ｍｍ、１２×１２ｍｍ、１２．５×１２．５ｍｍ、１３×１３ｍｍ、１３．５×１３．５ｍｍ、１４×１４ｍｍ、１４．５×１４．５ｍｍ、１５×１５ｍｍ、１５．５×１５．５ｍｍ、１６×１６ｍｍ、１６．５×１６．５ｍｍ、１７×１７ｍｍ、１７．５×１７．５ｍｍ、１８×１８ｍｍ、１８．５×１８．５ｍｍ、１９×１９ｍｍ、１９．５×１９．５ｍｍ、または２０×２０ｍｍのチャンバー領域を含む。一部の場合には、アレイは６．５×６．５ｍｍのチャンバー領域を含む。あるいは、アレイは、非対称のチャンバー領域を含む。例えば、アレイは、６．５×０．５ｍｍ、６．５×１ｍｍ、６．５×１．５ｍｍ、６．５×２ｍｍ、６．５×２．５ｍｍ、６．５×３ｍｍ、６．５×３．５ｍｍ、６．５×４ｍｍ、６．５×４．５ｍｍ、６．５×５ｍｍ、６．５×５．５ｍｍ、６．５×６ｍｍ、６．５×６．５ｍｍ、６．５×７ｍｍ、６．５×７．５ｍｍ、６．５×８ｍｍ、６．５×８．５ｍｍ、６．５×９ｍｍ、６．５×９．５ｍｍ、６．５×１０ｍｍ、６．５×１０．５ｍｍ、６．５×１１ｍｍ、６．５×１１．５ｍｍ、６．５×１２ｍｍ、６．５×１２．５ｍｍ、６．５×１３ｍｍ、６．５×１３．５ｍｍ、６．５×１４ｍｍ、６．５×１４．５ｍｍ、６．５×１５ｍｍ、６．５×１５．５ｍｍ、６．５×１６ｍｍ、６．５×１６．５ｍｍ、６．５×１７ｍｍ、６．５×１７．５ｍｍ、６．５×１８ｍｍ、６．５×１８．５ｍｍ、６．５×１９ｍｍ、６．５×１９．５ｍｍ、または６．５×２０ｍｍのチャンバー領域を含む。
アレイは、少なくとも約１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、１２５μｍ、１５０μｍ、１７５μｍ、２００μｍ、２２５μｍ、２５０μｍ、２７５μｍ、３００μｍ、３２５μｍ、３５０μｍ、３７５μｍ、４００μｍ、４２５μｍ、４５０μｍ、４７５μｍ、または５００μｍのスポットを含むことができる。一部の場合には、アレイは、７０μｍのスポットを含む。
アレイは、少なくとも約１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、１２５μｍ、１５０μｍ、１７５μｍ、２００μｍ、２２５μｍ、２５０μｍ、２７５μｍ、３００μｍ、３２５μｍ、３５０μｍ、３７５μｍ、４００μｍ、４２５μｍ、４５０μｍ、４７５μｍ、５００μｍ、５２５μｍ、５５０μｍ、５７５μｍ、６００μｍ、６２５μｍ、６５０μｍ、６７５μｍ、７００μｍ、７２５μｍ、７５０μｍ、７７５μｍ、８００μｍ、８２５μｍ、８５０μｍ、８７５μｍ、９００μｍ、９２５μｍ、９５０μｍ、９７５μｍ、１０００μｍのフィーチャーピッチを含むことができる。一部の場合には、アレイは、１６１μｍのフィーチャーピッチを含む。
アレイは、１つまたは複数のプローブを含むことができる。一部の場合には、アレイは、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個のプローブを含む。あるいは、アレイは、少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００個のプローブを含む。アレイは、少なくとも約３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００または１００００個のプローブを含むことができる。一部の場合には、アレイは、少なくとも約９６０個のプローブを含む。あるいは、アレイは、少なくとも約２７８０個のプローブを含む。プローブは、複数のオリゴヌクレオチドタグに特異的であってよい。プローブは、複数のオリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部に特異的であってよい。プローブは、複数のオリゴヌクレオチドタグの総数の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％または１００％に特異的であってよい。あるいは、プローブは、複数のオリゴヌクレオチドタグの中の異なるオリゴヌクレオチドタグの総数の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％または１００％に特異的である。他の場合には、プローブは非特異的プローブである。例えば、プローブは、標識分子に付着する検出可能な標識に特異的であってよい。プローブは、ストレプトアビジンであってよい。
アレイは、印刷されたアレイであってよい。一部の場合には、印刷されたアレイは、基質に付着する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。例えば、印刷されたアレイは、エポキシシラン基質に付着する５’アミン改変オリゴヌクレオチドを含む。
あるいは、アレイは１つまたは複数のウェルを有するスライドを含む。スライドは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のウェルを含むことができる。あるいは、スライドは、少なくとも約１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００個のウェルを含む。一部の場合には、スライドは１６個のウェルを含む。あるいは、スライドは９６個のウェルを含む。他の場合には、スライドは、少なくとも約８０、１６０、２４０、３２０、４００、４８０、５６０、６４０、７２０、８００、８８０または９６０個のウェルを含む。
一部の場合には、固体支持体は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ３Ｋタグアレイ、Ａｒｒａｙｊｅｔ非接触印刷アレイ、またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ Ｉｎｃ（ＡＭＩ）アレイである。あるいは、支持体は、コンタクトプリンター、インパクトプリンター、ドットプリンターまたはピンプリンターを含む。
固体支持体は、マイクロウェルで自己組織化するビーズの使用を含むことができる。例えば、固体支持体は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＢｅａｄＡｒｒａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを含む。あるいは、固体支持体は、Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ技術、およびＡｐｐｌｉｅｄ ＭｉｃｒｏａｒｒａｙのＦｌｅｘｉＰｌｅｘ（商標）システムを含む。
他の場合には、固体支持体はプレートである。プレートの例には、ＭＳＤマルチアレイプレート、ＭＳＤ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ（登録商標）プレート、マイクロプレート、ＰｒｏｔｅＯｎマイクロプレート、ＡｌｐｈａＰｌａｔｅ、ＤＥＬＦＩＡプレート、ＩｓｏＰｌａｔｅおよびＬｕｍａＰｌａｔｅが含まれるが、これらに限定されない。
Ｘ．酵素
本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、１つまたは複数の酵素を含む。酵素の例には、リガーゼ、逆転写酵素、ポリメラーゼおよび制限ヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。一部の場合には、分子へのオリゴヌクレオチドタグの付着は、１つまたは複数のリガーゼの使用を含む。リガーゼの例には、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼ、ならびにＴ４ ＲＮＡリガーゼＩおよびＴ４ ＲＮＡリガーゼＩＩなどのＲＮＡリガーゼが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、１つまたは複数の逆転写酵素の使用をさらに含むことができる。一部の場合には、逆転写酵素は、ＨＩＶ−１逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素およびテロメラーゼ逆転写酵素である。一部の場合には、逆転写酵素はＭ−ＭＬＶ逆転写酵素である。
一部の場合には、本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、１つまたは複数のポリメラーゼの使用を含む。ポリメラーゼの例には、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。一部の場合には、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、およびＤＮＡポリメラーゼＩＶである。市販されているＤＮＡポリメラーゼには、限定されずに、Ｂｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎ（商標）ｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＯｎｅＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）γＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼおよび末端転移酵素が含まれる。あるいは、ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ｐｈｉ６ ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼである。
一部の場合には、本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、１つまたは複数の制限酵素を含む。制限酵素には、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型の制限酵素が含まれる。一部の場合には、Ｉ型酵素は、それらの認識配列から遠く離れて無作為にＤＮＡを切断する、複合的、多サブユニットの制限および改変組合せ酵素である。一般に、ＩＩ型酵素は、それらの認識配列の近くの、またはその中の規定の位置でＤＮＡを切断する。それらは、別個の制限断片および異なるゲルバンドパターンを生成することができる。ＩＩＩ型酵素も、大きな制限および改変組合せ酵素である。それらは、それらの認識配列の外側でしばしば開裂させ、開裂を達成するためには、同じＤＮＡ分子の中で反対側の配向の２つのそのような配列を必要とすることがある。それらは、完全な消化物を稀にしか与えない。一部の場合には、ＩＶ型酵素は、改変された、一般的にメチル化されたＤＮＡを認識し、Ｅ．ｃｏｌｉのＭｃｒＢＣおよびＭｒｒ系によって例示することができる。
ＸＩ．その他の構成成分
本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、１つまたは複数の試薬の使用を含むことができる。試薬の例には、ＰＣＲ試薬、ライゲーション試薬、逆転写試薬、酵素試薬、ハイブリダイゼーション試薬、試料調製試薬、および核酸の精製および／または単離のための試薬が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、１つまたは複数の緩衝液の使用を含むことができる。緩衝液の例には、洗浄緩衝液、ライゲーション緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液、増幅緩衝液および逆転写緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。一部の場合には、ハイブリダイゼーション緩衝液は、市販緩衝液、例えばＴＭＡＣ Ｈｙｂ溶液、ＳＳＰＥハイブリダイゼーション溶液およびＥＣＯＮＯ（商標）ハイブリダイゼーション緩衝液である。本明細書に開示される緩衝液は、１つまたは複数の洗浄剤を含むことができる。
本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、１つまたは複数の担体の使用を含むことができる。担体は、本明細書に開示される１つまたは複数の反応（例えば、ライゲーション反応、逆転写、増幅、ハイブリダイゼーション）の効率を強化するか、向上させることができる。担体は、分子またはその任意の生成物（例えば、標識分子、標識ｃＤＮＡ分子、標識アンプリコン）の非特異的減損を減少させるか、防止することができる。例えば、担体は、表面への吸収を通しての標識分子の非特異的減損を減少させることができる。担体は、表面または基質（例えば、容器、エッペンドルフ管、ピペットチップ）への分子、標識分子またはその任意の生成物の親和性を減少させることができる。あるいは、担体は、表面または基質（例えば、ビーズ、アレイ、ガラス、スライド、チップ）への分子またはその任意の生成物の親和性を増加させることができる。担体は、分子またはその任意の生成物を分解から保護することができる。例えば、担体は、ＲＮＡ分子またはその任意の生成物をリボヌクレアーゼから保護することができる。あるいは、担体は、ＤＮＡ分子またはその任意の生成物をＤＮアーゼから保護することができる。担体の例には、核酸分子、例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、またはポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡ担体の例には、プラスミド、ベクター、ポリアデニル化ＤＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドが含まれる。ＲＮＡ担体の例には、ポリアデニル化ＲＮＡ、ファージＲＮＡ、ファージＭＳ２ ＲＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡ、酵母ＲＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、哺乳動物のＲＮＡ、哺乳動物のｔＲＮＡ、短いポリアデニル化合成リボヌクレオチドおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドが含まれる。ＲＮＡ担体は、ポリアデニル化ＲＮＡであってよい。あるいは、ＲＮＡ担体は、非ポリアデニル化ＲＮＡであってもよい。一部の場合には、担体は、細菌、酵母またはウイルスからのものである。例えば、担体は、細菌、酵母またはウイルスに由来する核酸分子またはポリペプチドであってよい。例えば、担体は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓからのタンパク質である。別の例では、担体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからの核酸分子である。あるいは、担体は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ヤギ、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌまたはウサギ）、トリ、両生類または爬虫類からの核酸分子またはペプチドである。
本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、１つまたは複数の対照薬剤の使用を含むことができる。対照薬剤には、対照オリゴ、不活性の酵素、非特異的な競合物質が含まれてもよい。あるいは、対照薬剤は、明るいハイブリダイゼーション、明るいプローブ対照、核酸鋳型、スパイクイン鋳型、ＰＣＲ増幅対照を含む。ＰＣＲ増幅対照は、陽性対照であってよい。他の場合には、ＰＣＲ増幅対照は、陰性対照である。核酸鋳型対照は、既知濃度のものであってよい。対照薬剤は、１つまたは複数の標識を含むことができる。
スパイクイン鋳型は、反応または試料に加えられる鋳型であってよい。例えば、スパイクイン鋳型は、増幅反応に加えることができる。スパイクイン鋳型は、第１の増幅サイクルの後の任意の時間に増幅反応に加えることができる。一部の場合には、スパイクイン鋳型は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０回目の増幅サイクルの後に増幅反応に加えられる。スパイクイン鋳型は、最後の増幅サイクルの前の任意の時間に増幅反応に加えることができる。スパイクイン鋳型は、１つまたは複数のヌクレオチドまたは核酸塩基対を含むことができる。スパイクイン鋳型は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその任意の組合せを含むことができる。スパイクイン鋳型は、１つまたは複数の標識を含むことができる。
本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、１つまたは複数のピペットチップおよび／または容器（例えば、管、バイアル、多重ウェルプレート）の使用を含むことができる。一部の場合には、ピペットチップは、低結合性ピペットチップである。あるいは、またはさらに、容器は、低結合性容器であってよい。低結合性ピペットチップおよび低結合性容器は、シリコーンベースのチップおよび非低結合性容器と関連する、低減された溶脱および／または以降の試料分解を有することができる。低結合性ピペットチップおよび低結合性容器は、非低結合性ピペットチップおよび容器と比較して低減された試料結合を有することができる。低結合性チップの例には、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤｅｃｋＷｏｒｋｓ（商標）低結合性チップおよびＡｖａｎｔ Ｐｒｅｍｉｕｍ低結合性目盛付チップが含まれるが、これらに限定されない。低結合性容器の非限定リストには、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）低結合性微量遠心管、ならびにＣｏｓｍｏｂｒａｎｄ低結合性ＰＣＲ管および微量遠心管が含まれる。
ＸＩＩＩ．適応症
本明細書に開示される方法は、遺伝子発現モニタリング、転写産物プロファイリング、ライブラリースクリーニング、遺伝子タイピング、後成的分析、メチル化パターン分析、腫瘍タイピング、薬理ゲノミクス、農業遺伝学、病原体プロファイリングならびに検出および診断で使用することができる。遺伝子発現モニタリングおよびプロファイリング方法は、米国特許第５，８００，９９２号、第６，０１３，４４９号、第６，０２０，１３５号、第６，０３３，８６０号、第６，０４０，１３８号、第６，１７７，２４８号および第６，３０９，８２２号に示されている。したがって、遺伝子タイピングおよび使用は、米国特許出願公開第２００３００３６０６９号および第２００７００６５８１６号ならびに米国特許第５，８５６，０９２号、第６，３００，０６３号、第５，８５８，６５９号、第６，２８４，４６０号、第６，３６１，９４７号、第６，３６８，７９９号および第６，３３３，１７９号に示されている。他の使用は、米国特許第５，８７１，９２８号、第５，９０２，７２３号、第６，０４５，９９６号、第５，５４１，０６１号および第６，１９７，５０６号に具体化されている。
対象における疾患または状態の検出、モニタリングおよび／または予後診断のための方法、キットおよび組成物が本明細書に開示される。一般に、本方法は、（ａ）分子を確率的に標識して、確率的に標識された分子を生成すること、および（ｂ）確率的に標識された分子を検出および／または定量し、それによって対象で疾患または状態を検出、モニタリングおよび／または予後診断することを含む。疾患または状態を検出することは、疾患または状態を診断することを含むことができる。
対象で疾患または状態をモニタリングすることは、治療レジメンをモニタリングすることをさらに含むことができる。治療レジメンをモニタリングすることは、治療レジメンの効能を決定することを含むことができる。一部の場合には、治療レジメンをモニタリングすることは、治療レジメンを投与するか、終了するか、加えるか、変更することを含む。治療レジメンを変更することは、治療レジメンの投薬量、投与頻度または投与様式を増加または低減することを含むことができる。治療レジメンは、１つまたは複数の治療薬を含むことができる。治療薬は、抗がん剤、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗病原体薬またはその任意の組合せであってよい。
Ａ．がん
一部の場合には、疾患または状態は、がんである。確率的に標識される分子は、がん性の細胞または組織からのものであってよい。一部の場合には、がんは、肉腫、癌腫、リンパ腫または白血病である。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管または他の結合もしくは支持組織のがんである。肉腫には、骨がん、線維肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性の血管内皮腫、悪性のシュワン細胞腫、両側性の前庭シュワン細胞腫、骨肉腫、軟部組織肉腫（例えば、蜂窩性軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢肉腫、皮膚線維肉腫、類腱腫、類上皮肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性の線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫および滑膜肉腫）が含まれるが、これらに限定されない。
癌腫は、体の表面を覆い、ホルモンを生成し、腺を構成する細胞である、上皮細胞で始まるがんである。非限定例として、癌腫には、乳がん、膵がん、肺がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、腎臓がん、膀胱がん、胃がん、前立腺がん、肝がん、卵巣がん、脳がん、膣がん、外陰部がん、子宮がん、口のがん、陰茎がん、精巣がん、食道がん、皮膚がん、卵管がん、頭頸部がん、胃腸間質がん、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部のがん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、上皮小体がん、副腎がん、尿道がん、腎盤がん、尿管がん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、下垂体がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫および脊髄軸腫瘍が含まれる。一部の場合には、がんは、基底細胞癌、扁平上皮、黒色腫、非黒色腫または紫外線（日光）角化症などの皮膚がんである。
一部の場合には、がんは肺がんである。肺がんは、気管から分岐して肺（気管支）または肺の小さな気嚢（肺胞）に供給する気道から出発することができる。肺がんには、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌および中皮腫が含まれる。ＮＳＣＬＣの例には、扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌が含まれる。中皮腫は、肺および胸部腔（胸膜）の内膜または腹部（腹膜）の内膜のがん性腫瘍であってよい。中皮腫は、アスベスト曝露によることがある。がんは、グリア芽細胞腫などの脳がんであってよい。
あるいは、がんは、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍であってもよい。ＣＮＳ腫瘍は、神経膠腫または非神経膠腫に分類することができる。神経膠腫は、悪性の神経膠腫、ハイグレード神経膠腫、びまん性内在性の脳橋神経膠腫であってよい。神経膠腫の例には、星状細胞腫、希突起膠細胞腫（または、希突起膠細胞腫および星状細胞腫要素の混合）、および脳室上衣細胞腫が含まれる。星状細胞腫には、ローグレード星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形神経膠芽腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形性黄色星状細胞腫および上衣下巨細胞星状細胞腫が含まれるが、これらに限定されない。希突起膠細胞腫には、ローグレード希突起膠細胞腫（または、希星状細胞腫）および未分化希突起膠腫が含まれる。非神経膠腫には、髄膜腫、下垂体腺腫、原発性ＣＮＳリンパ腫および髄芽細胞腫が含まれる。一部の場合には、がんは髄膜腫である。
白血病は、急性のリンパ性白血病、急性の骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、または慢性骨髄性白血病であってもよい。さらなるタイプの白血病には、毛様細胞性白血病、慢性骨髄単球性白血病および若年性の骨髄単球性白血病が含まれる。
リンパ腫はリンパ球のがんであり、ＢまたはＴリンパ球のいずれからでも発生することができる。リンパ腫の２つの主要なタイプは、以前はホジキン病として知られるホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫である。ホジキンリンパ腫は、リードシュテルンベルグ細胞の存在によって特徴づけられる。非ホジキンリンパ腫は、ホジキンリンパ腫でない全てのリンパ腫である。非ホジキンリンパ腫は、無痛性のリンパ腫および攻撃的なリンパ腫であってよい。非ホジキンリンパ腫には、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小細胞リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレーム病、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾臓辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、結節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性浸出リンパ腫およびリンパ腫様肉芽腫症が含まれるが、これらに限定されない。
Ｂ．病原体感染
一部の場合には、疾患または状態は、病原体感染である。確率的に標識される分子は、病原体からのものであってよい。病原体は、ウイルス、細菌、真菌または原生動物であってよい。一部の場合には、病原体は、原生動物、例えば、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ（例えば、Ａ．ａｓｔｒｏｎｙｘｉｓ、Ａ．ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ、Ａ．ｃｕｌｂｅｒｔｓｏｎｉ、Ａ．ｈａｔｃｈｅｔｔｉ、Ａ．ｐｏｌｙｐｈａｇａ、Ａ．ｒｈｙｓｏｄｅｓ、Ａ．ｈｅａｌｙｉ、Ａ．ｄｉｖｉｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｂｒａｃｈｉｏｌａ（例えば、Ｂ．ｃｏｎｎｏｒｉ、Ｂ．ｖｅｓｉｃｕｌａｒｕｍ）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ（例えば、Ｃ．ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ）、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ（例えば、Ｅ．ｃｕｎｉｃｕｌｉ、Ｅ．ｈｅｌｌｅｍ、Ｅ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ（例えば、Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ（例えば、Ｅ．ｂｉｅｎｅｕｓｉ）、Ｇｉａｒｄｉａ（例えば、Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ）、Ｉｓｏｓｐｏｒａ（例えば、Ｉ．ｂｅｌｌｉ）、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｃｅｙｌｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ（例えば、Ｎ．ｆｏｗｌｅｒｉ）、Ｎｏｓｅｍａ（例えば、Ｎ．ａｌｇｅｒａｅ、Ｎ．ｏｃｕｌａｒｕｍ）、Ｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ、Ｔｒａｃｈｉｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ（例えば、Ｔ．ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈｔｈｅｒａ、Ｔ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、およびＶｉｔｔａｆｏｒｍａ（例えば、Ｖ．ｃｏｒｎｅａｅ）であってよい。病原体は、真菌、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、ＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓおよびＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓであってもよい。
病原体は、細菌であってもよい。例示的な細菌には、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、ＶｉｂｒｉｏまたはＹｅｒｓｉｎｉａが含まれるが、これらに限定されない。
ウイルスは、逆転写ウイルスであってよい。逆転写ウイルスの例には、一本鎖ＲＮＡ−ＲＴ（ｓｓＲＮＡ−ＲＴ）ウイルスおよび二本鎖ＤＮＡ−ＲＴ（ｄｓＤＮＡ−ＲＴ）ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルスの非限定例には、レトロウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス、メタウイルスおよび偽ウイルスが含まれる。ｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルスの非限定例には、ヘパデノウイルスおよびカリモウイルスが含まれる。あるいは、ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスである。ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスであってよい。一部の場合には、ｄｓＤＮＡウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはポックスウイルスである。アデノウイルスの例には、アデノウイルスおよびイヌ伝染性肝炎ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ヘルペスウイルスの例には、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン・バーウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ポックスウイルスの非限定リストには、天然痘ウイルス、ウシポックスウイルス、ヒツジポックスウイルス、サルポックスウイルスおよびワクシニアウイルスが含まれる。ＤＮＡウイルスは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであってもよい。ｓｓＤＮＡウイルスは、パルボウイルスであってもよい。パルボウイルスの例には、パルボウイルスＢ１９、イヌパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ネコジステンパーおよびミンク腸炎ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
あるいは、ウイルスはＲＮＡウイルスである。ＲＮＡウイルスは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ウイルス、（＋）センス一本鎖ＲＮＡウイルス（（＋）ｓｓＲＮＡ）ウイルス、または（−）センス一本鎖（（−）ｓｓＲＮＡ）ウイルスであってよい。ｄｓＲＮＡウイルスの非限定リストには、レオウイルス、オルトレオウイルス、サイポウイルス、ロタウイルス、ブルータングウイルスおよびフィトレオウイルスが含まれる。（＋）ｓｓＲＮＡウイルスの例には、ピコルナウイルスおよびトガウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ピコルナウイルスの例には、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス、カルジオウイルス、アフトウイルス、ポリオウイルス、パレコウイルス、エルボウイルス、コブウイルス、テッショウウイルスおよびコクサッキーが含まれるが、これらに限定されない。一部の場合には、トガウイルスは、風疹ウイルス、シンドビスウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロス川ウイルス、オニオンニオンウイルス、チクングンヤ熱またはセムリキ森林ウイルスである。（−）ｓｓＲＮＡウイルスの非限定リストには、オルソミクソウイルスおよびラブドウイルスが含まれる。オルソミクソウイルスの例には、インフルエンザウイルスａ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、イサウイルスおよびトゴトウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ラブドウイルスの例には、サイトラブドウイルス、ジコラブドウイルス、エフェメラウイルス、リッサウイルス、ノビラブドウイルスおよびベシクロウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
Ｃ．胎児障害
一部の場合には、疾患または状態は、妊娠である。本明細書に開示される方法は、妊娠対象で胎児の状態を診断することを含むことができる。本明細書に開示される方法は、胎児の突然変異または遺伝子異常を同定することを含むことができる。確率的に標識される分子は、胎児の細胞または組織からのものであってよい。あるいは、またはさらに、標識される分子は、妊娠対象からのものであってよい。
本明細書に開示される方法、キットおよびシステムは、常染色体トリソミー（例えば、１３、１５、１６、１８、２１または２２トリソミー）の診断、予測またはモニタリングで使用することができる。一部の場合には、トリソミーは流産の可能性の増加と関連していてよい（例えば、１５、１６または２２トリソミー）。他の場合には、検出されるトリソミーは、乳児が先天性異常（例えば、１３トリソミー（パトー症候群）、１８トリソミー（エドワーズ症候群）および２１トリソミー（ダウン症候群））を持って産まれることを示すことができる、生産のトリソミーである。異常は、性染色体のものであってもよい（例えば、ＸＸＹ（クラインフェルター症候群）、ＸＹＹ（ジェーコブス症候群）またはＸＸＸ（Ｘトリソミー）。標識される分子（複数可）は、以下の染色体、１３、１８、２１、ＸまたはＹの１つまたは複数の上にあってよい。例えば、分子は、第２１染色体、および／または第１８染色体、および／または第１３染色体の上にある。
本明細書に開示される方法、キットおよびシステムに基づいて決定することができるさらなる胎児の状態には、１つまたは複数の染色体のモノソミー（Ｘ染色体モノソミー、ターナー症候群としても知られる）、１つまたは複数の染色体（１３、１８、２１およびＸ）のトリソミー、１つまたは複数の染色体のテトラソミーおよびペンタソミー（それは、ヒトでは、性染色体で最も一般的に観察される、例えばＸＸＸＸ、ＸＸＹＹ、ＸＸＸＹ、ＸＹＹＹ、ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＹ、ＸＸＸＹＹ、ＸＹＹＹＹおよびＸＸＹＹＹ）、一倍性、三倍性（あらゆる染色体が３つ、例えばヒトでは６９個の染色体）、四倍性（あらゆる染色体が４つ、例えばヒトでは９２個の染色体）、五倍性および多倍性が含まれる。
例示的実施形態
一部の実施形態では、本明細書に、ＲＮＡ分子のデジタル式逆転写のための方法、キット、およびシステムを開示する。一部の場合には、方法は、（ａ）（ｉ）複数のＲＮＡ分子が、少なくとも２つの異なる配列を含むＲＮＡ分子を２つ以上含み、（ｉｉ）複数のオリゴヌクレオチドタグが、２つ以上の異なる一意識別子配列を含むオリゴヌクレオチドタグを含む、複数のＲＮＡ分子を含む試料を複数のオリゴヌクレオチドタグと接触させることにより標識ＲＮＡ分子を生成するステップと、（ｂ）標識ＲＮＡ分子を逆転写酵素と接触させて第１の鎖合成反応を実行することによって標識ｃＤＮＡ分子を生成するステップと、（ｃ）標識ｃＤＮＡ分子を固体支持体にハイブリダイズさせることによって標識ｃＤＮＡ分子を検出するステップとを含む。
標識ＲＮＡ分子の生成は、オリゴヌクレオチドタグをＲＮＡ分子に付着させることを含み得る。一部の場合には、オリゴヌクレオチドタグを、ＲＮＡ分子にハイブリダイゼーションにより付着させる。他の場合には、オリゴヌクレオチドタグを、ＲＮＡ分子にライゲーションにより付着させる。オリゴヌクレオチドタグの付着はリガーゼ酵素の使用を含み得る。オリゴヌクレオチドタグはＲＮＡ分子のあらゆる部分に付着させることができる。例えば、オリゴヌクレオチドタグをＲＮＡ分子の５’末端に付着させることができる。あるいは、オリゴヌクレオチドタグをＲＮＡ分子の３’末端に付着させる。他の場合には、オリゴヌクレオチドタグをＲＮＡ分子の内部領域に付着させる。オリゴヌクレオチドタグのＲＮＡ分子への付着は、１つまたは複数のアダプター分子の使用を含み得る。
一部の場合には、オリゴヌクレオチドタグは標的特異的領域を含む。標的特異的領域は、複数のオリゴヌクレオチドタグの、少なくとも１つのＲＮＡ分子への付着を可能にし得る。標的特異的領域は、複数のオリゴヌクレオチドタグの、２つ以上の異なるＲＮＡ分子への付着を可能にし得る。一部の場合には、標的特異的領域は、複数のオリゴヌクレオチドタグの、少なくとも約３、４、または５つの異なるＲＮＡ分子への付着を可能にする。あるいは、標的特異的領域は、複数のオリゴヌクレオチドタグの、少なくとも約６、７、８、９、または１０の異なるＲＮＡ分子への付着を可能にする。他の場合には、標的特異的領域は、複数のオリゴヌクレオチドタグの、少なくとも約１１、１２、１３、１４、または１５の異なるＲＮＡ分子への付着を可能にする。標的特異的領域は、オリゴｄＴ配列を含み得る。あるいは、標的特異的領域は、ＲＮＡ分子のあらゆる部分に付着することができるランダム配列を含む。
一部の場合には、オリゴヌクレオチドタグは、汎用プライマー領域をさらに含む。一意識別子領域を、汎用プライマー領域と標的特異的領域との間に配置することができる。オリゴヌクレオチドタグは、少なくとも１ヌクレオチドの長さであってよい。一意識別子領域は、少なくとも１ヌクレオチドの長さであってよい。標的特異的領域は、少なくとも１ヌクレオチドの長さであってよい。汎用プライマー領域は、少なくとも１ヌクレオチドの長さであってよい。オリゴヌクレオチドタグは、１つまたは複数のヌクレオチド部分を含み得る。あるいは、またはさらに、ヌクレオチドタグは、１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む。
一部の場合には、標識ＲＮＡ分子の生成は、ｄＮＴＰミックス、アニーリング緩衝剤、リガーゼ、ライゲーション緩衝剤、またはこれらのあらゆる組合せをさらに含む。第１の鎖合成反応の実行は、第１の鎖緩衝剤、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＲＮアーゼインヒビター、ＤＮＡポリメラーゼ、またはこれらのあらゆる組合せをさらに含み得る。
第１の鎖合成反応は、サーマルサイクラーをさらに含み得る。第１の鎖合成反応は、５０℃６０分間を１サイクル、その後９４℃２分間、５８℃２分間、および６８℃２分間を３サイクル、その後４℃少なくとも２分間を１サイクルからなるサーマルサイクラープログラムをさらに含み得る。本明細書に開示する方法は、標識ｃＤＮＡ分子を標的の特異的なプライマーと接触させることをさらに含み得る。標的特異的プライマーは、ウラシル含有ＤＮＡプライマーであってよい。標的特異的プライマーは標識ｃＤＮＡ分子にハイブリダイズすることができ、ポリメラーゼ連鎖反応を実行して二本鎖標識ｃＤＮＡ分子を生成することができる。
試料を、１つまたは複数の酵素とさらに処理して、ＲＮＡ分子、標識ＲＮＡ分子、非結合のオリゴヌクレオチドタグ、および／または非結合の標的特異的プライマーを除去または分解してもよい。例えば、試料を、ＲＮアーゼ酵素で処理してＲＮＡ分子（標識および／または非結合のＲＮＡ分子）を試料から除去することができる。あるいは、試料をウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で処理してウラシルをＤＮＡから加水分解することができる。
方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行して標識アンプリコンを生成するステップをさらに含み得る。一部の場合には、ポリメラーゼ連鎖反応はネステッドＰＣＲである。ネステッドＰＣＲは、二本鎖の標識ｃＤＮＡ分子を、第１の標的特異的ＰＣＲプライマー、汎用ＰＣＲプライマー、ポリメラーゼ緩衝剤、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス、またはこれらのあらゆる組合せを含む第１のＰＣＲ混合物と混合することを含む、第１のＰＣＲを実行することを含み得る。第１のＰＣＲはサーマルサイクラー中で実行することができる。第１のＰＣＲは、９４℃２分間を１サイクル、その後９４℃２０秒間、５８℃２０秒間、および６８℃２０秒間を３０サイクル、その後６８℃４分間を１サイクル、および４℃少なくとも２分間を１サイクルを含むサーマルサイクラープログラムを含み得る。ネステッドＰＣＲは、第１のＰＣＲ反応において生成されたアンプリコンの少なくとも一部を、第２の標的特異的ＰＣＲプライマー、標識汎用ＰＣＲプライマー、ポリメラーゼ緩衝剤、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス、またはこれらのあらゆる組合せを含む第２のＰＣＲ混合物と混合することを含む、第２のＰＣＲを実行することを含み得る。第２の標的特異的プライマーは、第１の標的特異的プライマーの下流である標識分子における領域にハイブリダイズすることができる。標識汎用ＰＣＲプライマーは検出可能な標識で標識される。一部の場合には、標識汎用ＰＣＲプライマーはＣｙ３標識汎用ＰＣＲプライマーである。あるいは、標識汎用ＰＣＲプライマーはＴＹＥ５６３標識汎用ＰＣＲプライマーである。第２のＰＣＲは、サーマルサイクラー中で実行することができる。第２のＰＣＲは、９４℃２分間を１サイクル、その後９４℃２０秒間、５８℃２０秒間、および６８℃２０秒間を３０サイクル、その後少なくとも６８℃４分間を１サイクル、および４℃少なくとも２分間を１サイクルを含むサーマルサイクラープログラムを含み得る。ネステッドＰＣＲの第２のＰＣＲは、ｃＤＮＡ分子、オリゴヌクレオチドタグ、および検出可能な標識を含む標識アンプリコンを生成し得る。一部の場合には、ステップ１ｃの標識ｃＤＮＡ分子は、ネステッドＰＣＲの第２のＰＣＲによって生成された標識アンプリコンである。
一部の場合には、標識ｃＤＮＡ分子の検出は、ｃＤＮＡ分子、オリゴヌクレオチドタグ、および検出可能な標識を含む標識アンプリコンを含む試料の少なくとも一部を固体支持体にハイブリダイズさせることを含む。標識アンプリコンを含む試料の少なくとも一部のハイブリダイズは、ネステッドＰＣＲの第２のＰＣＲにおいて生成された標識アンプリコン、対照オリゴ、ハイブリダイゼーション緩衝剤、またはこれらのあらゆる組合せを含む試料の少なくとも一部を含むハイブリダイゼーション混合物を含み得る。対照オリゴは、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は、標識アンプリコンにおける検出可能な標識と同じである。例えば、標識アンプリコンはＣｙ３標識を含み、対照オリゴはＣｙ３標識オリゴヌクレオチドを含む。ハイブリダイゼーション混合物中の標識アンプリコンは変性されている。一部の場合には、標識アンプリコンの変性は、ハイブリダイゼーション混合物を９５℃でインキュベートすることを含む。一部の場合には、ハイブリダイゼーション混合物を、９５℃で少なくとも約１、２、３、４、または５分間インキュベートする。標識アンプリコンの変性後、ハイブリダイゼーション混合物を４℃で少なくとも２分間インキュベートする。標識アンプリコンの支持体へのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション混合物の少なくとも一部を固体支持体に加えることを含み得る。一部の場合には、標識アンプリコンの固体支持体へのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション混合物の少なくとも一部をＡＭＩアレイスライドのウェルに加えることを含む。標識アンプリコンを、支持体に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８時間ハイブリダイズさせてもよい。標識アンプリコンを支持体に少なくとも約４時間ハイブリダイズさせてもよい。標識アンプリコンを支持体に終夜ハイブリダイズさせてもよい。あるいは、標識アンプリコンを支持体に約１２〜１４時間ハイブリダイズさせる。他の場合には、標識アンプリコンを支持体に約３〜５時間、約４〜６時間、約６〜８時間、約８〜１０時間、約９〜１１時間、約１３〜１５時間、約１４〜１６時間、約１７〜１９時間、または１８〜２０時間ハイブリダイズさせる。標識アンプリコンの支持体へのハイブリダイゼーションは、支持体を標識アンプリコンと接触させ、標識アンプリコンおよび支持体をハイブリダイゼーション温度でインキュベートすることを含み得る。一部の場合には、ハイブリダイゼーション温度は少なくとも約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３２℃、３４℃、３６℃、３８℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、または６５℃である。
固体支持体は複数のプローブを含み得る。複数のプローブは、標識ｃＤＮＡ分子または標識アンプリコンの少なくとも一部に相補的である配列を含み得る。複数のプローブが固体支持体上の別個の領域に並べられてもよく、固体支持体上の別個の領域は、同一の、またはほぼ同一の配列のプローブを含む。一部の場合には、固体支持体上の２つ以上の別個の領域は、オリゴヌクレオチドタグの２つの異なる一意識別子領域の配列に相補的な配列を含む２つの異なるプローブを含む。
方法は、アレイスライドを粘着剤で覆って、密封されたアレイスライドを生成することをさらに含む。密封されたアレイスライドは、３７℃でインキュベートすることができる。密封されたアレイスライドは、３７℃で終夜インキュベートすることができる。一部の場合には、密封されたアレイを、３７℃で少なくとも約１２〜１４時間インキュベートする。密封されたアレイを３７℃でインキュベートした後、方法は、密封されたアレイを３７℃から取り除くことをさらに含み得る。ハイブリダイゼーション混合物を各ウェルから取り除くことができる。ハイブリダイゼーション混合物は−２０℃で貯蔵することができる。あるいは、ハイブリダイゼーション混合物は廃棄される。
方法は、ウェルを第１の洗浄緩衝剤で洗浄することをさらに含み得る。ウェルの洗浄は、洗浄緩衝剤をウェルに加え、次いで洗浄緩衝剤を吸引することを含む。さらに、第２の洗浄を、同じまたは第２の洗浄緩衝剤で実行することができる。洗浄緩衝剤をウェルから吸引した後、アレイスライドをスキャンすることができる。一部の場合には、アレイスライドを乾燥状態でスキャンする（例えば、液体をウェルから除去する）。あるいは、アレイスライドを湿潤状態でスキャンする（例えば、ウェル中に液体がある）。アレイスライドはスキャナによりスキャンすることができる。
方法は、増幅生成物（例えば、標識アンプリコン）を断片化して断片化された標識アンプリコンを生成することを含み得る。断片化された標識アンプリコンを固体支持体に付着させてもよい。本明細書に開示する方法は、検出可能な標識を標識分子、標識アンプリコン、または断片化された標識アンプリコンを付着させることをさらに含み得る。検出可能な標識を標識分子、標識アンプリコン、または断片化された標識アンプリコンに付着させた後、標識分子、標識アンプリコン、または断片化された標識アンプリコンを固体支持体に付着させてもよい。あるいは、標識分子、標識アンプリコン、または断片化された標識アンプリコンを固体支持体に付着させた後に、検出可能な標識を標識分子、標識アンプリコン、または断片化された標識アンプリコンに付着させる。本明細書に開示する方法は、２つ以上の検出可能な標識を、標識分子、標識アンプリコン、または断片化された標識アンプリコンに付着させることを含み得る。一部の場合には、検出可能な標識は標識ｃＤＮＡ分子であり、検出可能な標識は標識アンプリコン中に組み入れられる。例えば、Ｃｙ３汎用ＰＣＲプライマーを標識ｃＤＮＡ分子にアニールする。標識ｃＤＮＡ分子をＣｙ３汎用ＰＣＲプライマーで増幅することにより、Ｃｙ３標識アンプリコンを生成することができる。本明細書に開示する方法は、第２の検出可能な標識を、第１の検出可能な標識分子に付着させることをさらに含み得る。例えば、本明細書に開示する方法は、ビオチンをＣｙ３標識アンプリコンに付着させてビオチン／Ｃｙ３標識アンプリコンを生成することを含み得る。
一部の場合には、標識ｃＤＮＡ分子の検出は蛍光リーダーを含む。蛍光リーダーはＳｅｎｓｏｖａｔｉｏｎ ＦＬＡＩＲ機器であってよい。
一部の場合には、スキャナからのデータはコンピューター上に保存される。あるいは、またはさらに、スキャナからのデータはエクスポートされる。一部の場合には、スキャナからのデータはコンピューター上で送信される。データのエクスポートおよび／または送信は、１つまたは複数のコンピューターネットワークを含み得る。
本明細書には、分子を確率的標識するための方法、キット、およびシステムをさらに開示する。一般的に、方法は、複数の分子を含む試料を、複数のオリゴヌクレオチドタグに接触させ、複数のオリゴヌクレオチドタグからの１つまたは複数のオリゴヌクレオチドタグを、試料中の１つまたは複数の分子にランダムに付着させることを含む。複数のオリゴヌクレオチドタグは、２つ以上の異なる一意識別子領域を含むオリゴヌクレオチドタグを含む。
一部の場合には、方法、キット、およびシステムは、複数のオリゴヌクレオチドタグにおける異なるオリゴヌクレオチドタグの濃度を含む。例えば、異なるオリゴヌクレオチドタグが、同じ濃度中の複数のオリゴヌクレオチドタグ中に存在する。あるいは、複数のオリゴヌクレオチドタグ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドタグの濃度は、複数のオリゴヌクレオチドタグ中の少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドタグの濃度より高い。複数のオリゴヌクレオチドタグ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドタグの濃度は、複数のオリゴヌクレオチドタグ中の少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドタグの濃度よりも、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍高い。一部の場合には、複数のオリゴヌクレオチドタグ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドタグの濃度は、複数のオリゴヌクレオチドタグ中の少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドタグの濃度よりも低い。複数のオリゴヌクレオチドタグ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドタグの濃度は、複数のオリゴヌクレオチドタグ中の少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドタグの濃度よりも、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍低い。一部の場合には、複数のオリゴヌクレオチドタグ中少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、または１００％の異なるオリゴヌクレオチドタグが、同じまたは同様の濃度において複数のオリゴヌクレオチドタグ中に存在する。あるいは、複数のオリゴヌクレオチドタグ中少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、または１００％の異なるオリゴヌクレオチドタグが、異なる濃度において複数のオリゴヌクレオチドタグ中に存在する。
オリゴヌクレオチドタグは、標的特異的領域、汎用プライマー結合部位、またはこれらのあらゆる組合せをさらに含み得る。一部の場合には、一意識別子領域が、標的特異的領域と汎用プライマー結合部位との間にある。オリゴヌクレオチドタグは、分子に、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、またはこれらのあらゆる組合せによって付着していてよい。一部の場合には、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドタグが分子に付着している。オリゴヌクレオチドタグは、分子の５’末端、分子の３’末端、分子内の内部部位、またはこれらのあらゆる組合せに付着していてよい。オリゴヌクレオチドタグの一端または両端が分子に付着していてよい。
分子はポリヌクレオチドであってよい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはこれらのあらゆる組合せを含み得る。分子はＲＮＡ分子であってよい。ＲＮＡ分子はｍＲＮＡ分子であってよい。分子はポリアデニル化されていてよい。あるいは、分子はポリアデニル化されていない。
本明細書において、試料中の核酸分子の量を増大するためのデジタル前増幅方法をさらに開示する。一般的に、方法は、（ａ）標識核酸分子が、核酸分子に付着しているオリゴヌクレオチドタグを含む、本明細書に開示するあらゆる方法により、試料中の核酸分子を確率的に標識して標識核酸分子を生成するステップと、（ｂ）複数の標識アンプリコンにおける標識アンプリコンが標識核酸分子のコピーである、標識核酸分子を増幅して複数の標識アンプリコンを生成するステップとを含む。ステップ（ａ）の標識核酸分子を繰返し増幅して、試料中の核酸分子の量を増大してもよい。オリゴヌクレオチドタグは、同一のまたはほぼ同一の核酸分子を区別するのに使用することができる一意識別子領域を含む。
増幅前の核酸分子の確率的標識により、試料の鋳型の親分子から生じるクローン的に複製された分子の同定が可能になり得る。増幅前の核酸分子の確率的標識により核酸分子の制御された増幅が可能になり得、個々の核酸分子の増幅はオリゴヌクレオチド標識によって追跡し、モニタリングすることができる。デジタル前増幅方法により、試料中の核酸分子の真の存在量レベルを説明することができる。この方法は、限られた量の核酸分子を含む試料に特に有用であり得る。例えば、この方法を使用して、単一細胞からの核酸分子の量を増大することができる。細胞中の核酸分子を確率的に標識し、その後標識核酸分子を増幅することにより、核酸分子をより正確に定量測定することができ得る。
一部の場合には、試料中の標識核酸分子は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増幅される。あるいは、試料中の標識核酸分子は、少なくとも約１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍増幅される。
核酸分子のデジタル前増幅により、オリジナルの試料を枯渇させずに、試料中の核酸分子が繰り返しサンプリングできるようになり得る。試料中の核酸分子の繰返しサンプリングは、標識核酸分子に対して実行される増幅または繰返し増幅反応から生成される標識アンプリコンに対して１つまたは複数の測定および／または実験を実行することを含み得る。試料中の核酸分子の繰返しサンプリングは、核酸分子を検出および／または定量するための測定を含み得る。試料中の核酸分子の繰返しサンプリングは、試料中の核酸分子に対してさらなる実験を実行することを含み得る。
一部の実施形態では、標識分子の遺伝子特異的検出のための方法、キット、およびシステムを開示する。方法、キット、およびシステムを使用して、１つまたは複数の対象の遺伝子に対する検出特異性を向上することができる。方法の模式図を図７に図示する。一般的に、方法は、ａ）少なくとも１つの標的分子を固体支持体にハイブリダイズさせるステップと、ｂ）標識した遺伝子特異的オリゴを標的の分子にハイブリダイズして標識標的分子を生成するステップとを含む。
本明細書において、１つまたは複数の分子を絶対的定量するための方法、キット、およびシステムをさらに開示する。図１７は、２つの遺伝子（遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂ）の定量の比較を示す。２つの遺伝子を標準のアレイの読取りにより定量することにより、遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂの相対的な定量を提供することができる。標準のアレイの読取りにおいて、遺伝子は増幅され、アンプリコンはアレイにハイブリダイズされる。遺伝子ＡおよびＢの相対量を蛍光により検出することができ、シグナルの強度（例えば、明るさ）を使用して、遺伝子Ｂの量が遺伝子Ａの量を超えることを決定することができる。本明細書に開示するデジタル増幅方法を使用して、遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂの絶対的定量を提供することができる。絶対的定量方法は、（ａ）複数のオリゴヌクレオチドタグが２つ以上の異なる一意識別子領域を含む、２つ以上の遺伝子に複数のオリゴヌクレオチドタグで確率的に標識して確率的標識分子を生成するステップと、（ｂ）確率的標識分子を増幅して１つまたは複数の確率的標識アンプリコンを生成するステップと、（ｃ）各々の確率的標識アンプリコンに関連する異なる一意識別子領域の数を検出し、それにより２つ以上の分子の絶対量を検出するステップとを含み得る。図１７Ｂに示す通り、一意識別子領域の検出は、確率的標識アンプリコンを固体支持体（例えば、アレイ）にハイブリダイズさせることを含む。確率的標識アンプリコンは固体支持体上の別個の位置にハイブリダイズすることができ、異なる一意識別子領域の数は、蛍光によって検出される別個の位置の数を計数することにより決定することができる。
図１９は、１つまたは複数のＲＮＡ分子の絶対的定量方法の模式図を示す。図１９のステップ１に示す通り、１つまたは複数の標的ＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成は、オリゴヌクレオチドタグ（１９２０）のオリゴｄＴ配列（例えば、標的特異的領域、１９２０）をｍＲＮＡ分子（１９１０）のポリＡテールにアニールすることを含む。オリゴヌクレオチドタグ（１９２０）は、一意識別子領域（１９４０）および汎用プライマー結合部位（１９５０）をさらに含む。一意識別子領域（１９４０）は予め決定された配列を含み得る。あるいは、一意識別子領域（１９４０）はランダム配列を含む。得られたｃＤＮＡ分子（１９６０）は、ｍＲＮＡ分子、一意識別子領域（１９４０）、および汎用プライマー結合部位（１９５０）のコピーを含む。ステップ２に示す通り、ｃＤＮＡ分子（１９６０）は、第１のフォワードプライマー（１９８０）、第２のフォワードプライマー（１９９０）、および１つまたは複数の標識アンプリコン（例えば、一意識別子領域を含むアンプリコン）を生成するための汎用プライマー（１９７０）を含むリバースプライマーを含むネステッドＰＣＲによって増幅することができる。フォワードプライマー（１９８０、１９９０）は、遺伝子特異的プライマーであってよい。標識アンプリコンは、当技術分野において公知のあらゆる方法によって検出することができる。ｍＲＮＡ分子の絶対的定量は、異なる一意識別子領域を検出および計数することにより生じることができる。
図２０は、１つまたは複数の分子を定量するための別の方法を示す。方法は、（ａ）確率的標識ｃＤＮＡのコピーが一意識別子領域を含む、標的特異的領域（２０５０）、一意識別子領域（２０６０）、および汎用プライマー結合部位（２０７０）を含む２つ以上のオリゴヌクレオチドタグ（２０２０）を含む複数のオリゴヌクレオチドタグ（２０３０）を使用して、１つまたは複数のＲＮＡ分子を逆転写して、１つまたは複数の確率的標識ｃＤＮＡのコピーを生成するステップを含み得る。一意識別子領域はランダム配列を含み得る。方法は、確率的標識ｃＤＮＡのコピーを増幅して１つまたは複数の確率的標識アンプリコンを生成することをさらに含み得る。増幅は、ＰＣＲおよびＴ７増幅を含み得る。確率的標識アンプリコンは、一意識別子領域を含み得る。方法は、確率的標識ｃＤＮＡのコピー、または確率的標識アンプリコンを検出することをさらに含み得る。確率的標識分子の検出は、確率的標識分子を１つまたは複数のデジタルアレイにハイブリダイズさせて、対象の各遺伝子に対する別個の標識の数を決定することを含み得る。ハイブリダイゼーションは、遺伝子の３’エクソン上のセグメントである可能性が最も高いｍＲＮＡ配列の存在、および一意識別子領域の両方を必要とし得る。アレイは７００万フィーチャーを含み得る。１つまたは複数の分子が試料中にあってよい。試料は、２０，０００の異なるｍＲＮＡ配列を含み得る。方法は、試料中に存在する各ｍＲＮＡのコピーの数を決定するステップを含んでもよい。複数のオリゴヌクレオチドタグは、３５０以上のオリゴヌクレオチドタグを含み得る。一部の場合には、３５０のオリゴヌクレオチドタグのサブセットを低濃度で適用して、測定の効率的なダイナミックレンジを増大してもよい。
図２５は、ｍＲＮＡ分子の絶対的定量の別の方法を示す。図２５に示す通り、方法は、（ａ）確率的標識ｃＤＮＡ分子が、ｍＲＮＡ分子（２５１０）、一意識別子領域（２５４０）、および汎用プライマー結合部位（２５５０）のｃＤＮＡコピーを含む、オリゴヌクレオチドタグ（２５６０）との逆転写反応を実行して確率的標識ｃＤＮＡ分子（２５２０）を生成するステップと、（ｂ）確率的標識ｃＤＮＡ分子を検出するステップとを含む。オリゴヌクレオチドタグ（２５６０）は、逆転写反応のためのプライマーとして働くことができる。オリゴヌクレオチドタグ（２５６０）は、標的特異的領域（２５３０）、一意識別子領域（２５４０）、および汎用プライマー結合部位（２５５０）を含み得る。方法は、確率的標識ｃＤＮＡ分子の検出に基づいてｍＲＮＡ分子を絶対的定量することをさらに含み得る。確率的標識ｃＤＮＡ分子の検出は、各タイプのｃＤＮＡ分子に関連する異なる一意識別子領域の数を計数することを含み得る。方法は、確率的標識ｃＤＮＡ分子を増幅した後、前記の検出をして１つまたは複数の確率的標識アンプリコンを生成することをさらに含み得る。
本明細書において、ＤＮＡコピー数を決定するための方法、キット、およびシステムをさらに開示する。方法の一般的な模式図を図２１に示す。図２１のステップ１に示す通り、ゲノムＤＮＡ（２１１０）を断片化してＤＮＡ断片（２１３０）を生成することができる。ゲノムＤＮＡの断片化は、当技術分野において公知のあらゆる方法によって生じ得る。例えば、断片化は機械的せん断を含み得る。あるいは、断片化は、ゲノムＤＮＡの、１つまたは複数の制限ヌクレアーゼでの消化を含み得る。図２１のステップ２に示す通り、ＤＮＡ断片（２１２０）を、複数のオリゴヌクレオチドタグ（２１４０）で確率的に標識して、確率的に標識した分子（２１７０）を生成することができる。オリゴヌクレオチドタグ（２１４０）は、アダプター配列（２１５０）および一意識別子領域（２１６０）を含み得る。アダプター配列（２１５０）により、オリゴヌクレオチドタグ（２１４０）のＤＮＡ断片への付着が可能になり得る。アダプター配列（２１５０）は、ＤＮＡ断片にアニールすることができる１つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。確率的に標識した各分子（２１７０）は１つまたは複数のオリゴヌクレオチドタグ（２１５０）を含み得る。方法は、確率的に標識した分子（２１７０）を増幅して、１つまたは複数の確率的標識アンプリコンを生成することをさらに含み得る。方法は、増幅前に１つまたは複数のＤＮＡ断片を除去することをさらに含み得る。１つまたは複数のＤＮＡ断片の除去は、増幅前に１つまたは複数の制限酵素でＤＮＡ断片を消化して、ある特定の断片の複製を防ぐことを含み得る。方法は、確率的標識分子を検出することをさらに含み得る。検出は、各ＤＮＡ断片にライゲーションしている別個の一意識別子領域の数を検出するデジタルアレイに対するハイブリダイゼーションを含み得る。
本明細書において、１つまたは複数のＲＮＡ分子を分析するための方法、キット、およびシステムをさらに開示する。ＲＮＡ分子は小型ＲＮＡ分子であってよい。小型ＲＮＡ分子はマイクロＲＮＡであってよい。図２２は、小型ＲＮＡ分子を分析するための一般的方法を示す。図２２のステップ１に示す通り、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ分子（２２１０）は第１の複数のオリゴヌクレオチドタグ（２２３０）で確率的に標識されている。オリゴヌクレオチドタグ（２２３０）は、アダプター配列（２２４０）、および一意識別子領域（２２５０）を含み得る。アダプター配列（２２４０）により、３’−確率的標識ｍｉＲＮＡ（２２６０）を生成するための、オリゴヌクレオチドタグ（２２３０）のｍｉＲＮＡ分子（２２２０）への付着が可能になり得る。図２２のステップ２に示す通り、方法は、３’−確率的標識マイクロＲＮＡ（２２６０）の、第２の複数のオリゴヌクレオチドタグ（２２７０）での確率的標識をさらに含み得る。第２の複数のオリゴヌクレオチドタグ（２２７０）は、アダプター配列（２２９０）および一意識別子領域（２２８０）を含み得る。アダプター配列（２２９０）により、５’および３’−確率的標識ｍｉＲＮＡ（２２９５）を生成するための、オリゴヌクレオチドタグ（２２７０）の３’−確率的標識ｍｉＲＮＡ分子（２２６０）への付着が可能になり得る。方法は、確率的に標識したｍｉＲＮＡを逆転写するステップ、確率的標識ｍｉＲＮＡを増幅するステップ、確率的標識ｍｉＲＮＡを検出するステップ、確率的標識ｍｉＲＮＡを検出することによりｍｉＲＮＡを定量するステップ、確率的標識ｍｉＲＮＡをアレイにハイブリダイズさせるステップ、またはこれらの組合せをさらに含み得る。アレイはデジタルアレイであってよい。ｍｉＲＮＡ分子はあらゆるｍｉＲＮＡ配列を含み得る。例えば、ｍｉＲＮＡ分子は、２０１１年１１月に公開され、独特の成熟ヒトｍｉＲＮＡを１９２１個列挙する、ｍｉＲＢａｓｅ １８ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／に開示されている配列を含み得る。２００万フィーチャーのアレイは、１９２１個のｍｉＲＮＡにライゲーションされている標識１０００個を十分に検出することができる。
本明細書に開示する方法、キット、およびシステムは、遺伝子診断に使用することができる。例えば、本明細書に開示する方法、キット、およびシステムを、単一細胞着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）に使用することができる。単一細胞ゲノムＤＮＡ増幅アッセイでの第一の難題は、アレルドロップアウトおよび複製バイアス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｉａｓ）に由来し得る。図２３Ａに示す、あらゆる分子の複製の確率が０．８であるコンピュテーションモデリング（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）分析に示す通り、初期のコピー比が１：１である分子は、数サイクルの複製の直後に１：１０以上に容易に歪められ得る。しかし、標識を最初に付着させた後に増幅する場合、標識を計数してコピー数を決定することは、複製が生じる限り、複製バイアスによる影響を受けない。異数性の決定、および大きな領域の欠失または増幅は、本明細書に開示する確率的標識方法により、容易かつ正確に決定することができる。図２３Ｂは、一般的方法の模式図を示す。図２３Ｂのステップ１に示す通り、方法は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ、２３１０）を断片化して、１つまたは複数の断片化分子（２３２０）を生成するステップを含み得る。ｇＤＮＡ（２３１０）の断片化は、当技術分野において公知のあらゆる方法を含み得る。例えば、断片化は、制限消化反応を実行することを含み得る。図２３Ｂのステップ２に示す通り、断片化したＤＮＡ（２３２０）を、複数のオリゴヌクレオチドタグ（２３８０）で確率的に標識して１つまたは複数の確率的標識分子（２３２０）を生成することができる。確率的標識分子（２３３０）は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドタグ（２３８０）を含み得る。オリゴヌクレオチドタグ（２３８０）は、一意識別子領域（２３５０）および汎用プライマー結合部位（２３４０）を含み得る。確率的標識分子（２３８０）は、汎用プライマー結合部位（２３４０）にハイブリダイズして１つまたは複数の確率的標識アンプリコンを生成することができる１つまたは複数のプライマー（２３６０、２３７０）を使用して増幅してもよい。図２３Ｂのステップ３に示す通り、確率的標識分子（２３３０）は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ検出器（２３９５）によって検出することができる。確率的標識分子（２３３０）は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ検出器（２３９５）上のプローブ（２３９０）にハイブリダイズすることができる。
本明細書に開示する方法、キット、およびシステムは、胎児診断において使用することができる。方法は、（ａ）試料中の核酸分子を断片化して１つまたは複数の核酸断片を生成するステップと、（ｂ）１つまたは複数の核酸断片を、一意識別子領域を含む複数のオリゴヌクレオチドタグで確率的に標識して、１つまたは複数の確率的標識分子を生成するステップと、（ｃ）一意識別子領域の数を計数することにより、確率的標識分子を検出するステップとを含み得る。方法は、確率的標識分子の検出に基づいて胎児の遺伝的障害を診断することをさらに含み得る。
図２４は、胎児診断において確率的標識方法を使用するための一般的模式図を示す。循環ＤＮＡ１００ナノグラム中に、約１０，０００個のゲノム同等物が存在し得る。母系の血漿の第１三半期では、胎児ＤＮＡの全濃度は、母系血漿試料中全ＤＮＡの約１０％であり得る。この方法は、図２４に示す通り、ＤＮＡ分子（２４１０）を断片化するステップを含み得る。断片化は、４塩基制限酵素カッターの使用を含み得る。断片化されたＤＮＡ分子を、複数のオリゴヌクレオチドタグ（２４２０）で確率的に標識してもよい。確率的標識は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドタグを断片化したＤＮＡ分子にライゲーションして、１つまたは複数の確率的標識分子を生成することを含み得る。確率的標識分子をマルチプレックス反応（２４３０）において増幅して、１つまたは複数の確率的標識アンプリコンを生成してもよい。確率的標識アンプリコンは、アレイ（２４４０）上で検出され得る。アレイは、５００万フィーチャーを含み得る。胎児の遺伝的障害（例えば、２１トリソミー）の診断は、確率的標識アンプリコン（２４５０、２４６０）の検出に基づくことができる。１００，０００個のオリゴヌクレオチドタグは、１９９６年７月３０日発行の、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｐ．Ａ．Ｆｏｄｏｒら、米国特許第５５４１０６１号に記載されている通りに合成することができる。
図２６は、１つまたは複数の分子を不活性なプライマーで確率的に標識するための模式図を示す。方法は、（ａ）ｃＤＮＡコピーが３’ポリＡテールおよび５’オリゴｄＴ配列を含む、ｍＲＮＡ分子（２６１０）をオリゴｄＵ配列を含むプライマー（２６２０）で逆転写してｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡコピー（２６３０）を生成するステップと、（ｂ）ｃＤＮＡコピー（２６２０）を、汎用プライマー結合部位（２６５０）、一意識別子領域（２６６０）、およびオリゴｄＵ配列（２６７０）を含むオリゴヌクレオチドタグ（２６４０）で確率的に標識して、確率的標識ｃＤＮＡ分子（２６８０）を生成するステップとを含み得る。方法は、ｃＤＮＡ分子の両端がオリゴヌクレオチドタグで確率的に標識されている、確率的標識ｃＤＮＡ分子を生成するための第２の確率的標識ステップをさらに含み得る。方法は、試料をウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で処理して、オリゴｄＵプライマー（２６２０）およびオリゴｄＵ配列を含むオリゴヌクレオチドタグを除去するステップをさらに含み得る。方法は、確率的標識ｃＤＮＡ分子を増幅して、１つまたは複数の確率的標識アンプリコンを生成するステップをさらに含み得る。
図２７は、１つまたは複数の分子を分析するための模式図を示す。方法は、（ａ）ｃＤＮＡコピー（２７６０）が一意識別子領域（２７４０）および汎用プライマー結合部位（２７５０）を含む、ｍＲＮＡ分子（２７１０）を、オリゴｄＵ配列（２７３０）、一意識別子領域（２７４０）、および汎用プライマー結合部位（２７５０）を含むオリゴヌクレオチドタグ（２７２０）で逆転写してｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡコピー（２７６０）を生成するステップと、（ｂ）ｃＤＮＡコピーを、オリゴｄＵ配列を含む第１のプライマー（２７９０）、および汎用プライマー配列を含む第２のプライマー（２７８０）で増幅して確率的標識アンプリコンを生成するステップとを含み得る。方法は、分子を１つまたは複数の制限酵素で処理するステップを含み得る。方法は、確率的標識分子上でエマルジョンＰＣＲ反応を実行するステップをさらに含み得る。
図２６〜２７に示す方法は、ホモポリマーテーリングに頼り得る。図２８は、ホモポリマーテーリングに頼らない方法を示す。図２８に示す通り、方法は、ｍＲＮＡ分子を逆転写してｃＤＮＡコピーを生成するステップを含み得る。ｍＲＮＡ分子の逆転写は、ビーズ表面で実行されてもよい。方法は、ｍＲＮＡ分子のＲＮアーゼＨ消化を含み得る。方法は、複数のオリゴヌクレオチドタグでｃＤＮＡコピーを確率的に標識して、１つまたは複数の確率的標識ｃＤＮＡ分子を生成するステップを含み得る。オリゴヌクレオチドタグは第２の構造を含み得る。第２の構造はヘアピンであってもよい。オリゴヌクレオチドタグは、汎用プライマー結合部位、一意識別子領域、制限酵素認識部位、標的特異的領域、またはこれらのあらゆる組合せを含み得る。ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、汎用プライマー結合配列を含み得る。ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、一意識別子領域を含み得る。ヘアピンオリゴヌクレオチドタグのループ部分は、制限酵素認識部位をさらに含み得る。オリゴヌクレオチドタグは一本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドタグは二本鎖であってもよい。方法は、確率的標識ｃＤＮＡ分子を増幅して１つまたは複数の確率的標識アンプリコンを生成するステップをさらに含み得る。方法は、確率的標識アンプリコンを制限ヌクレアーゼで消化して、消化された確率的標識アンプリコンを生成するステップをさらに含み得る。方法は、１つまたは複数のプライマーを、消化された確率的標識アンプリコンにライゲーションしてプライマー−確率的標識アンプリコンを生成するステップをさらに含み得る。プライマーは配列決定プライマーであってもよい。方法は、プライマー−確率的標識アンプリコンを配列決定するステップをさらに含み得る。この方法は、ＰＣＲ増幅の間にオリゴヌクレオチドタグの意図的でない組み入れを低減または防止し得る。この方法は、ホモポリマーテールに基づいた反応からの確率的標識分子の配列決定に比べて、確率的標識分子の配列決定を改善し得る。この方法は、配列決定エラーを低減または防止し得る。オリゴヌクレオチドタグは３’ホスフェートを含み得る。３’ホスフェートは、ＰＣＲ反応の間の３’末端の伸長を防ぎ、それにより非特異的な増幅を低減または防止することができる。
図２９は、直鎖増幅方法を示す。方法は、１つまたは複数のＲＮＡ分子を複数のオリゴヌクレオチドタグで確率的に標識してｍＲＮＡ分子の１つまたは複数のｃＤＮＡコピーを生成することにより、１つまたは複数のｍＲＮＡ分子を逆転写するステップを含み得、ｃＤＮＡコピーはオリゴヌクレオチドタグを含む。オリゴヌクレオチドタグは、汎用プライマー結合部位、一意識別子領域、およびオリゴｄＴ配列を含み得る。方法は、第２の鎖合成によりｍＲＮＡ分子のＤＮＡコピーを合成するステップをさらに含み得る。方法は、確率的標識ｃＤＮＡ分子の直鎖増幅を含み得る。直鎖増幅は、確率的標識ｃＤＮＡ分子を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ニッキング酵素鎖置換合成、またはＲｉｂｏＳＰＩＡ（ＮｕＧＥＮ）により増幅するステップを含み得る。方法は、１つまたは複数の配列決定プライマーを確率的標識分子に付着させるステップをさらに含み得る。方法は、確率的標識分子を増幅して１つまたは複数の確率的標識アンプリコンを生成するステップをさらに含み得る。方法は、確率的標識アンプリコンを配列決定するステップをさらに含み得る。この方法は、指数関数的ＰＣＲが後に続く低レベルの最初の増幅を含み得る。この方法は、ライゲーションと独立であってよい。この方法は、ＰＣＲにより産生されるアーチファクトを低減または防止し得る。
図３０は、ストランドスイッチング（ｓｔｒａｎｄ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）により１つまたは複数の分子を確率的に標識する方法を示す。方法は、ストランドスイッチオリゴヌクレオチドの存在下で第１の鎖合成を逆転写して確率的標識ｃＤＮＡ分子を生成するステップを含み得る。方法は、確率的標識ｃＤＮＡ分子を増幅するステップをさらに含み得る。
図３１は、ランダムプライミングにより１つまたは複数の分子を確率的に標識する方法を示す。方法は、ｍＲＮＡ分子を逆転写して確率的標識ｃＤＮＡのコピーを生成するステップを含み得る。逆転写は、１つまたは複数の分子を複数のオリゴヌクレオチドタグで確率的に標識するステップを含み得、オリゴヌクレオチドタグはオリゴｄＵ配列、一意識別子配列、および汎用プライマー配列を含む。オリゴヌクレオチドタグは制限酵素認識部位をさらに含み得る。方法は、ｍＲＮＡ分子をＲＮアーゼＨで除去するステップをさらに含み得る。方法は、第２の鎖合成反応を第２のセットのオリゴヌクレオチドタグで実行するステップをさらに含み得る。第２のセットのオリゴヌクレオチドタグは、汎用プライマー結合部位、制限酵素認識部位、および一意識別子領域を含み得る。方法は、試料をＵＤＧで処理して、１つまたは複数のウラシルを含むオリゴヌクレオチドタグを除去することをさらに含み得る。方法は、確率的標識分子を増幅するステップをさらに含み得る。方法は、１つまたは複数のアダプターを確率的標識分子に付着させることをさらに含み得る。オリゴヌクレオチドタグは、あらゆる３つのヌクレオチド（例えば、Ｃ、Ｇ、Ｔ−Ａなし；Ｃ、Ｇ、Ａ−Ｔなし）を含み得る。オリゴヌクレオチドタグはあらゆる２つのヌクレオチド（例えば、Ｇ、Ｔ−Ａ、Ｃなし；Ａ、Ｃ−Ｇ、Ｔなし）を含み得る。図３１に示す通り、方法は、１２の可変の標識のヌクレオチド（Ｃ／Ｇ／Ｔ−Ｔ／Ｕストリングへの偽の自己プライミングを防ぐためにＡが除外されている）を保有するオリゴｄＴ（またはＵＤＧで引き続き除去するためのｄＵ）オリゴヌクレオチドタグでの、第１の鎖ｃＤＮＡ合成を含み得る。しかし、第２のＰＣＲプライミング部位を産生するためのＴｄＴテーリングの代わりに、疑似ランダムストリング（ｑｕａｓｉ−ｒａｎｄｏｍ ｓｔｒｉｎｇ）を含むオリゴヌクレオチドタグおよびＰＣＲ配列が使用される。
図４３は、直接的に１つまたは複数の細胞可溶化液からの１つまたは複数の分子の絶対的定量のための方法の模式図を示す。図４３に示す通り、１つまたは複数のＤＮＡ分子（４３２０）、ＲＮＡ分子（４３３０）、タンパク質（４３４０）、またはこれらの組合せを含むインタクトな細胞（４３１０）を溶解して溶解細胞（４３５０）を生成する。１つまたは複数のＤＮＡ分子（４３２０）、ＲＮＡ分子（４３３０）、および／またはタンパク質（４３４０）が細胞から遊離され得る。１つまたは複数のｍＲＮＡ分子（４３３０）の量を、複数のオリゴヌクレオチドタグ（４３９０）でｍＲＮＡ分子を確率的標識することにより決定することができる。オリゴヌクレオチドタグは、標的特異的領域（４３６０）、一意識別子領域（４３７０）、および汎用プライマー結合部位（４３８０）を含み得る。
一部の場合には、標的分子はＤＮＡ分子である。あるいは、標的分子はＲＮＡ分子である。一部の場合には、本明細書に開示する方法はＲＮＡ分子の逆転写をさらに含む。標識遺伝子特異的オリゴは、１つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のヌクレオチドはデオキシヌクレオチドであってよい。あるいは、またはさらに、１つまたは複数のヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。１つまたは複数のヌクレオチドは合成のヌクレオチドであってよい。標識遺伝子特異的オリゴは、少なくとも約５個のヌクレオチドを含み得る。あるいは、標識遺伝子特異的オリゴは、少なくとも約１０個のヌクレオチドを含む。あるいは、標識遺伝子特異的オリゴは、少なくとも約１２個のヌクレオチドを含む。標識遺伝子特異的オリゴは、少なくとも約１５個のヌクレオチドを含み得る。標識遺伝子特異的オリゴは、少なくとも約１７個のヌクレオチドを含み得る。標識遺伝子特異的オリゴは、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含み得る。一部の場合には、標識遺伝子特異的オリゴは、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個のヌクレオチドを含む。
標識遺伝子特異的オリゴは、標的特異的領域を含み得る。標識遺伝子特異的オリゴの標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的であってよい。一部の場合には、標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチドを少なくとも約５個含む。あるいは、標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチドを少なくとも約１０個含む。他の場合には、標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチドを少なくとも約１２個含む。標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチドを少なくとも約１５個含み得る。標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチドを少なくとも約１７個含み得る。標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチドを少なくとも約２０個含み得る。標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチドを少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９６、または１００個含み得る。標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補性が少なくとも約６０％である配列を含み得る。あるいは、標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補性が少なくとも約７０％である配列を含む。標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補性が少なくとも約８０％である配列を含み得る。標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補性が少なくとも約８５％である配列を含み得る。標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補性が少なくとも約９０％である配列を含み得る。標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補性が少なくとも約９５％である配列を含み得る。標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補性が少なくとも約９７％である配列を含み得る。標的特異的領域は、標的分子の少なくとも一部に相補性が少なくとも約９８％である配列を含み得る。
標識遺伝子特異的オリゴは、本明細書に開示するあらゆる標識を含み得る。一部の場合には、標識はフルオロフォアである。あるいは、標識はシアニン色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５）である。
固体支持体は、本明細書に開示するあらゆる固体支持体であってよい。一部の場合には、固体支持体は検出器アレイである。検出器アレイは、複数のプローブを含み得る。標的分子は、検出器アレイ上の複数のプローブの１つまたは複数のプローブにハイブリダイズすることができる。
方法は、固体支持体へのハイブリダイゼーション前に、標的分子を増幅するステップをさらに含み得る。本明細書に開示する方法は、固体支持体にハイブリダイズした標的分子を配列決定するステップをさらに含み得る。本明細書に開示する方法は、対象の遺伝子を含まない、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの偽陽性検出を防ぐのに使用することができる。
方法は、標識標的分子を検出するステップをさらに含み得る。標識標的分子を検出するための方法は、本明細書に開示するあらゆる検出方法および機器を含み得る。一部の場合には、標識標的分子の検出は、標識の検出を含む。標識標的分子の検出は蛍光光度計を含み得る。あるいは、標識標的分子の検出はルミノメータを含む。他の場合には、標識標的分子の検出はプレートリーダーを含む。
本明細書には、標的分子の集団を捕捉および／または濃縮するための方法、キット、およびシステムをさらに開示する。図８は方法の模式図を示す。一般的に、方法は、ａ）試料中の１つまたは複数の核酸分子を確率的に標識して確率的標識分子を生成するステップと、ｂ）捕捉分子が標的分子を含む、１つまたは複数の確率的標識分子を捕捉して捕捉分子を生成するステップとを含む。
確率的標識分子の捕捉は、１つまたは複数の遺伝子特異的オリゴの使用を含み得る。遺伝子特異的オリゴは、特異的な確率的標識分子に付着してオリゴ連結分子を生成することができる。一部の場合には、本明細書に開示する方法は、試料からオリゴ連結分子を単離するステップをさらに含む。遺伝子特異的オリゴは、標識またはタグを含み得る。標識またはタグにより、オリゴ連結分子の単離が可能になり得る。
あるいは、確率的標識分子の捕捉は、確率的標識分子を含む試料を固体支持体と接触させるステップを含み得る。一部の場合には、標的分子を含む確率的標識分子を固体支持体にハイブリダイズさせ、それにより確率的標識分子を捕捉する。あるいは、固体支持体にハイブリダイズさせた確率的標識分子は標的分子を含まず、確率的標識分子の捕捉はあらゆる非結合の確率的標識分子（例えば、固体支持体にハイブリダイズしていない確率的標識分子）の収集を含む。固体支持体は、本明細書に開示するあらゆる固体支持体であってよい。一部の場合には、固体支持体はアレイである。他の場合には、固体支持体はビーズである。ビーズは磁性ビーズであってよい。一部の場合には、確率的標識分子の捕捉は磁石の使用を含む。
方法は、確率的標識分子および／または捕捉分子の増幅をさらに含み得る。確率的標識分子および／または捕捉分子の増幅は、本明細書に開示するあらゆる増幅方法を含み得る。一部の場合には、確率的標識分子および／または捕捉分子の増幅はＰＣＲを含む。
本明細書に開示する方法は、捕捉分子の配列決定をさらに含み得る。配列決定は、本明細書に開示するあらゆる配列決定方法を含み得る。一部の場合には、捕捉分子は固体支持体上で直接配列決定される。
本明細書には、核酸分子をデジタル検出および／または定量するための方法、キット、およびシステムをさらに開示する。一般的に、方法、キット、およびシステムは（ａ）核酸分子を複数のオリゴヌクレオチドタグで確率的に標識して確率的標識核酸分子を生成するステップと、（ｂ）確率的標識核酸分子を検出および／または定量するステップとを含む。核酸分子はＤＮＡ分子であってよい。核酸分子は細胞由来であってよい。あるいは、核酸分子は無細胞の分子である。核酸分子は対象由来であってよい。あるいは、核酸分子は外来の対象由来であってよい。外来の対象は病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌）であってよい。
方法は、確率的標識核酸分子を増幅して確率的標識核酸分子アンプリコンを生成するステップをさらに含み得る。確率的標識核酸分子またはそのあらゆる生成物（例えば、確率的標識核酸分子アンプリコン）は、繰返し増幅され得る。
一部の場合には、方法は、１つまたは複数の検出可能な標識を確率的標識核酸分子またはその生成物に付着させるステップをさらに含む。一部の場合には、少なくとも１つの検出可能な標識が確率的標識核酸分子またはその生成物に付着している。あるいは、少なくとも２つの検出可能な標識が確率的標識核酸分子またはその生成物に付着している。検出可能な標識はビオチンであってよい。あるいは、検出可能な標識は蛍光色素である。蛍光色素はＣｙ（商標）色素またはＴＹＥ ５６３色素であってよい。Ｃｙ（商標）色素はＣｙ３であってよい。
方法は、確率的標識核酸分子またはあらゆるその生成物の、固体支持体へのハイブリダイゼーションをさらに含み得る。固体支持体はビーズであってよい。あるいは、固体支持体はアレイである。
方法は、配列決定反応を実行して、確率的標識核酸分子またはその生成物の少なくとも一部の配列を決定するステップをさらに含み得る。一部の場合には、確率的標識核酸分子またはその生成物のオリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部は配列である。例えば、オリゴヌクレオチドタグの一意識別子領域の少なくとも一部が配列決定される。別の例では、オリゴヌクレオチドタグの標的特異的領域の少なくとも一部が配列決定される。あるいは、またはさらに、確率的標識核酸分子の核酸分子の少なくとも一部が配列決定される。
確率的標識核酸分子の検出および／または定量は、確率的標識ｃＤＮＡのコピーおよび／または確率的標識核酸分子アンプリコンの検出および／または定量を含み得る。確率的標識核酸分子の検出および／または定量は、確率的標識核酸分子またはその生成物に付着している１つまたは複数の検出可能な標識の検出をさらに含み得る。確率的標識核酸分子またはその生成物の検出および／または定量は、本明細書に開示するあらゆる検出および／または定量方法を含み得る。例えば、蛍光リーダーを使用して確率的標識核酸分子またはその生成物を検出および／または定量することができる。あるいは、マイクロアレイリーダーを使用して確率的標識核酸分子またはその生成物を検出および／または定量することができる。
本明細書には、ウイルス分子をデジタル検出および／またはデジタル定量するための方法、キット、およびシステムをさらに開示する。一般的に、方法、キット、およびシステムは、（ａ）１つまたは複数のウイルス分子を複数のオリゴヌクレオチドタグで確率的に標識して確率的標識ウイルス分子を生成するステップと、（ｂ）確率的標識ウイルス分子を検出および／または定量するステップとを含む。一部の場合には、ウイルス分子は核酸分子である。核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。
方法は、逆転写反応を実行して確率的標識ウイルス分子（例えば、確率的標識ウイルスＲＮＡ分子）の確率的標識ｃＤＮＡコピーを生成するステップをさらに含み得る。確率的標識ウイルス分子を繰り返し逆転写して、確率的標識ウイルス分子の多数の確率的標識ｃＤＮＡコピーを生成することができる。方法は、確率的標識ウイルス分子またはあらゆるその生成物（例えば、確率的標識ｃＤＮＡコピー）を増幅して、確率的標識ウイルスアンプリコンを生成するステップをさらに含み得る。確率的標識ウイルス分子を繰返し増幅することができる。あるいは、確率的標識ウイルス分子の生成物を繰返し増幅することができる。一部の場合には、確率的標識ウイルス分子の生成物は、確率的標識ウイルス分子の確率的標識ｃＤＮＡコピーである。あるいは、確率的標識ウイルス分子の生成物は、確率的標識ウイルスアンプリコンである。
一部の場合には、方法は、１つまたは複数の検出可能な標識を確率的標識ウイルス分子またはその生成物に付着させるステップをさらに含む。一部の場合には、少なくとも１つの検出可能な標識が、確率的標識ウイルス分子またはその生成物に付着している。あるいは、少なくとも２つの検出可能な標識が確率的標識ウイルス分子またはその生成物に付着している。検出可能な標識はビオチンであってよい。あるいは、検出可能な標識は蛍光色素である。蛍光色素はＣｙ（商標）色素またはＴＹＥ ５６３色素であってよい。Ｃｙ（商標）色素はＣｙ３であってよい。
方法は、確率的標識ウイルス分子またはあらゆるその生成物の固体支持体へのハイブリダイゼーションをさらに含み得る。固体支持体はビーズであってよい。あるいは、固体支持体はアレイである。
方法は、配列決定反応を実行して、確率的標識ウイルス分子またはその生成物の少なくとも一部の配列を決定するステップをさらに含み得る。一部の場合には、確率的標識ウイルス分子またはその生成物のオリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部は配列である。例えば、オリゴヌクレオチドタグの一意識別子領域の少なくとも一部が配列決定される。別の例では、オリゴヌクレオチドタグの標的特異的領域の少なくとも一部が配列決定される。あるいは、またはさらに、確率的に標識したウイルス分子のウイルス分子の少なくとも一部が配列決定される。
確率的標識ウイルス分子の検出および／または定量は、確率的標識ｃＤＮＡのコピーおよび／または確率的標識ウイルスアンプリコンの検出および／または定量を含み得る。確率的標識ウイルス分子の検出および／または定量は、確率的標識ウイルス分子またはその生成物に付着している１つまたは複数の検出可能な標識の検出をさらに含み得る。確率的標識ウイルス分子またはその生成物の検出および／または定量は、本明細書に開示するあらゆる検出および／または定量方法を含み得る。例えば、蛍光リーダーを使用して確率的標識ウイルス分子またはその生成物を検出および／または定量することができる。あるいは、マイクロアレイリーダーを使用して確率的標識ウイルス分子またはその生成物を検出および／または定量することができる。
一部の場合には、ウイルス分子のデジタル検出および／またはデジタル定量を使用して、ウイルス感染症に罹患している対象におけるウイルス量を決定することができる。あるいは、ウイルス分子のデジタル検出および／またはデジタル定量を、ウイルス感染症の診断および／または予後診断において使用することができる。一部の場合には、ウイルス分子のデジタル検出および／またはデジタル定量を、抗ウイルス治療レジメンのモニタリングにおいて使用することができる。
本明細書には、バイオマーカーをデジタル検出および／またはデジタル定量するための方法、キット、およびシステムをさらに開示する。方法、キット、およびシステムを使用してバイオマーカーを定量することができる。一般的に、方法、キット、およびシステムは、（ａ）複数のオリゴヌクレオチドタグでバイオマーカーを確率的に標識して確率的標識バイオマーカーを生成するステップと、（ｂ）確率的標識バイオマーカーを検出および／または定量するステップとを含む。バイオマーカーは、がんのバイオマーカーであってよい。バイオマーカーは核酸分子またはタンパク質であってよい。核酸分子はＤＮＡ分子であってよい。あるいは、核酸分子はＲＮＡ分子であってよい。バイオマーカーは対象由来であってよい。あるいは、バイオマーカーは外来の対象由来であってよい。外来の対象は病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌）であってよい。
方法は、逆転写反応を実行して確率的標識バイオマーカー（例えば、確率的標識バイオマーカーＲＮＡ分子）の確率的標識ｃＤＮＡのコピーを生成するステップをさらに含み得る。確率的標識バイオマーカーを繰り返し逆転写して、確率的標識バイオマーカーの多数の確率的標識ｃＤＮＡのコピーを生成することができる。方法は、確率的標識バイオマーカーまたはそのあらゆる生成物（例えば、確率的標識ｃＤＮＡコピー）を増幅して確率的標識バイオマーカーアンプリコンを生成するステップをさらに含み得る。確率的標識バイオマーカーを繰返し増幅することができる。あるいは、確率的標識バイオマーカーの生成物を繰返し増幅することができる。一部の場合には、確率的標識バイオマーカーの生成物は、確率的標識バイオマーカーの確率的標識ｃＤＮＡのコピーである。あるいは、確率的標識バイオマーカーの生成物は確率的標識バイオマーカーアンプリコンである。
一部の場合には、方法は、１つまたは複数の検出可能な標識を、確率的標識バイオマーカーまたはその生成物に付着させるステップをさらに含む。一部の場合には、少なくとも１つの検出可能な標識が、確率的標識バイオマーカーまたはその生成物に付着している。あるいは、少なくとも２つの検出可能な標識が、確率的標識バイオマーカーまたはその生成物に付着している。検出可能な標識はビオチンであってよい。あるいは、検出可能な標識は蛍光色素である。蛍光色素はＣｙ（商標）色素またはＴＹＥ ５６３色素であってよい。Ｃｙ（商標）色素はＣｙ３であってよい。
方法は、確率的標識バイオマーカーまたはそのあらゆる生成物の固体支持体へのハイブリダイゼーションをさらに含み得る。固体支持体はビーズであってよい。あるいは、固体支持体はアレイである。
方法は、配列決定反応を実行して、確率的標識バイオマーカーまたはその生成物の少なくとも一部の配列を決定するステップをさらに含み得る。一部の場合には、確率的標識バイオマーカーまたはその生成物のオリゴヌクレオチドタグの少なくとも一部は配列である。例えば、オリゴヌクレオチドタグの一意識別子領域の少なくとも一部が配列決定される。別の例では、オリゴヌクレオチドタグの標的特異的領域の少なくとも一部が配列決定される。あるいは、またはさらに、確率的標識バイオマーカーの少なくとも一部のバイオマーカーが配列決定される。
確率的標識バイオマーカーの検出および／または定量は、確率的標識ｃＤＮＡのコピーおよび／または確率的標識バイオマーカーアンプリコンの検出および／または定量を含み得る。確率的標識バイオマーカーの検出および／または定量は、確率的標識バイオマーカーまたはその生成物に付着している１つまたは複数の検出可能な標識の検出をさらに含み得る。確率的標識バイオマーカーまたはその生成物の検出および／または定量は、本明細書に開示するあらゆる検出および／または定量方法を含み得る。例えば、蛍光リーダーを使用して、確率的標識バイオマーカーまたはその生成物を検出および／または定量することができる。あるいは、マイクロアレイリーダーを使用して確率的標識バイオマーカーまたはその生成物を検出および／または定量することができる。
一部の場合には、バイオマーカーのデジタル検出および／またはデジタル定量を使用して、それを必要とする対象における状態を診断または予後診断することができる。一部の場合には、バイオマーカーのデジタル検出および／またはデジタル定量を使用して治療レジメンをモニタリングすることができる。
状態はがんであってよい。がんは、肉腫、がん種、白血病、またはリンパ腫であってよい。
あるいは、状態は病原体感染症である。病原体感染症は、細菌またはウイルスの感染症であってよい。
本明細書には、試料中の数々の核酸分子を計数または検出するための方法、キット、およびシステムをさらに開示する。方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドタグが一意識別子配列、標的配列、および任意選択のＰＣＲプライマー配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドタグを準備するステップと、（ｂ）各標的の核酸分子が一意識別子配列を有するオリゴヌクレオチドタグに付着することができる、核酸分子を含む試料を複数の標識プライマーと組み合わせて標識核酸分子を形成するステップと、（ｃ）（ｉ）核酸分子、核酸分子の相補配列、核酸分子の逆相補配列、またはこれらの一部、および（ｉｉ）オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチドタグの相補配列、オリゴヌクレオチドタグの逆相補配列、またはこれらの一部を検出して、異なる標識核酸分子の計数値または数を決定し、それにより試料中の数々の核酸分子を計数または決定するステップとを含み得る。方法は、１０以上の数々の異なる核酸分子を計数または決定するステップを含み得る。方法は、２０以上の数々の異なる核酸分子を計数または決定するステップを含み得る。異なる核酸分子は、１つまたは複数のヌクレオチドまたは塩基対が異なっていてもよい。異なる核酸を同時に計数してもよい。あるいは、異なる核酸分子を逐次的に計数してもよい。
試料中の数々の核酸分子を計数または決定する方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドタグが一意識別子配列、標的配列、および任意選択のＰＣＲプライマー配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドタグを準備するステップと、（ｂ）核酸分子のオリゴヌクレオチドタグへの付着により独特の分子−タグジャンクションが形成する、核酸分子を含む試料を複数の標識プライマーと組み合わせて標識核酸分子を形成するステップと、（ｃ）独特の分子−タグジャンクション、独特の分子−タグジャンクションの相補配列、独特の分子−タグジャンクションの逆相補配列、またはこれらの一部を検出して異なる標識核酸分子の計数値または数を決定し、それにより試料中の数々の核酸分子を計数または決定するステップとを含み得る。方法は、１０以上の数々の異なる核酸分子を計数または決定するステップを含み得る。方法は、２０以上の数々の異なる核酸分子を計数または決定するステップを含み得る。異なる核酸分子は、１つまたは複数のヌクレオチドまたは塩基対が異なっていてもよい。異なる核酸を同時に計数してもよい。あるいは、異なる核酸分子を逐次的に計数してもよい。
試料中の数々の核酸分子を計数または決定する方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドタグが標的特異的配列、リボ核酸を含む一意識別子配列、および任意選択のＰＣＲプライマー配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドタグを準備するステップと、（ｂ）標的の核酸分子が異なる一意識別子配列を有するオリゴヌクレオチドタグに付着することができる、核酸分子を含む試料を複数のオリゴヌクレオチドタグと合わせて標識核酸分子を形成するステップと、（ｃ）標識核酸分子のコピーが核酸分子のコピーおよびオリゴヌクレオチドタグのコピーを含み、一意識別子配列のリボ核酸がデオキシリボ核酸での置換を含む、標識核酸分子のコピーを合成するステップと、（ｄ）標識核酸分子のコピー、標識核酸分子のコピーの相補配列、標識核酸分子のコピーの逆相補配列、またはこれらの一部を検出して標識核酸分子のコピーの計数値を決定し、それにより試料中の数々の核酸分子を計数または決定するステップとを含み得る。方法は、１０以上の数々の異なる核酸分子を計数または決定するステップを含み得る。方法は、２０以上の数々の異なる核酸分子を計数または決定するステップを含み得る。異なる核酸分子は、１つまたは複数のヌクレオチドまたは塩基対が異なっていてもよい。異なる核酸を同時に計数してもよい。あるいは、異なる核酸分子を逐次的に計数してもよい。
試料中の数々のＲＮＡ分子を計数または決定する方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドタグがＲＮＡ特異的配列、一意識別子配列、および任意選択のＰＣＲプライマー配列を含む、ＲＮＡ分子を含む試料を複数のオリゴヌクレオチドタグと合わせるステップと、（ｂ）各ＲＮＡ分子が異なる一意識別子配列を有するオリゴヌクレオチドタグに付着することができ、各標識ＤＮＡ分子がＲＮＡ分子のコピーおよびオリゴヌクレオチドタグのコピーを含む、オリゴヌクレオチドタグをＲＮＡ分子に付着させることによりＲＮＡ分子のコピーを合成して標識ＤＮＡ分子を形成するステップと、（ｃ）標識ＤＮＡ分子、標識ＤＮＡ分子の相補配列、標識ＤＮＡ分子の逆相補配列、またはこれらの一部を検出して標識ＤＮＡ分子の計数値を決定し、それにより試料中の数々のＲＮＡ分子を計数または決定するステップとを含み得る。
試料中の数々のＲＮＡ分子を計数または決定する方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドタグがＲＮＡ特異的配列、リボ核酸を含む一意識別子配列、および任意選択のＰＣＲプライマー配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドタグを準備するステップと、（ｂ）標的のＲＮＡ分子が異なる一意識別子配列を有するオリゴヌクレオチドタグに付着することができる、ＲＮＡ分子を含む試料を複数のオリゴヌクレオチドタグと合わせて標識ＲＮＡ分子を形成するステップと、（ｃ）標識ＤＮＡ分子がＲＮＡ分子のコピーを含み、オリゴヌクレオチドタグのコピーおよび一意識別子配列のリボ核酸がデオキシリボ核酸での置換を含む、標識ＲＮＡ分子のコピーを合成して標識ＤＮＡ分子を形成するステップと、（ｄ）標識ＤＮＡ分子、標識ＤＮＡ分子の相補配列、標識ＤＮＡ分子の逆相補配列、またはこれらの一部を検出して標識ＤＮＡ分子の計数値を決定し、それにより試料中の数々のＲＮＡ分子を計数または決定するステップとを含み得る。
試料中の数々のＲＮＡ分子を計数または決定する方法は、（ａ）各標的のＲＮＡ分子が異なる標識に付着することができる、ＲＮＡ分子を含む試料を複数のオリゴヌクレオチドタグと合わせて標識ＲＮＡ分子を形成するステップと、（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドタグを標識ＲＮＡ分子に任意選択により付着させて二重標識ＲＮＡ分子を形成するステップと、（ｃ）標識ＤＮＡ分子および二重標識ＤＮＡ分子がオリゴヌクレオチドタグのコピーおよびＲＮＡ分子のコピーを含む、標識ＲＮＡ分子または二重標識ＲＮＡ分子のコピーを合成して標識ＤＮＡ分子または二重標識ＤＮＡ分子を形成するステップと、（ｄ）標識ＤＮＡ分子、標識ＤＮＡ分子の相補配列、標識ＤＮＡ分子の逆相補配列、二重標識ＤＮＡ分子、二重標識ＤＮＡ分子の相補配列、二重標識ＤＮＡ分子の逆相補配列、またはこれらの一部を検出して、異なる標識ＤＮＡ分子または異なる二重標識ＤＮＡ分子の数を計数または決定し、それにより試料中の数々のＲＮＡ分子を計数または決定するステップとを含み得る。
試料中の数々のＲＮＡ分子を計数または決定する方法は、（ａ）各標的のＲＮＡ分子が異なる標識に付着することができる、ＲＮＡ分子を含む試料を複数の標識と合わせて標識ＲＮＡ分子を形成するステップと、（ｂ）第２の標識を標識ＲＮＡ分子に任意選択により付着させて二重標識ＲＮＡ分子を形成するステップと、（ｃ）標識ＲＮＡ分子、標識ＲＮＡ分子の相補配列、標識ＲＮＡ分子の逆相補配列、二重標識ＲＮＡ分子、二重標識ＲＮＡ分子の相補配列、二重標識ＲＮＡ分子の逆相補配列、またはこれらの一部を検出して、異なる標識ＲＮＡ分子または異なる二重標識ＲＮＡ分子の数を計数または決定し、それにより試料中の数々のＲＮＡ分子を計数または決定するステップとを含み得る。
試料中の数々のｍＲＮＡ分子を計数または決定する方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドタグが標的特異的配列、一意識別子配列、および任意選択のＰＣＲプライマー配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドタグを準備するステップと、（ｂ）各標的のｍＲＮＡ分子が異なるオリゴヌクレオチドタグに付着することができる、ｍＲＮＡ分子を含む試料を複数のオリゴヌクレオチドタグと合わせて標識ｍＲＮＡ分子を形成するステップと、（ｂ）標識ＤＮＡ分子がｍＲＮＡ分子のコピーおよびオリゴヌクレオチドタグまたはオリゴヌクレオチドタグのコピーを含む、標識ｍＲＮＡ分子のコピーを合成して標識ＤＮＡ分子を形成するステップと、（ｃ）標識ＤＮＡ分子、標識ＤＮＡ分子の相補配列、標識ＤＮＡ分子の逆相補配列、またはこれらの一部を検出して異なる標識ＤＮＡ分子の計数値を決定し、それにより試料中の数々のｍＲＮＡ分子を計数または決定するステップとを含み得る。
一態様では、単一の細胞からのポリアデニル化ＲＮＡを、本明細書に開示する方法により分析する。細胞溶解後、ポリＡ ＲＮＡを、オリゴｄＴが付着しているビーズなどの固体支持体上に捕捉することにより濃縮してもよく、または可溶化液に対して増幅を実行することができる。ＲＮＡの標識ｃＤＮＡのコピーは、オリゴｄＴ領域および標識−タグ領域を有するプライマーをハイブリダイズさせることにより作製される。標識−タグ領域はオリゴｄＴ領域の５’である。プライマー間で可変である標的−タグ領域が５’共通増幅プライマー配列と３’オリゴｄＴ領域との間にあるように、標識−タグ領域の５’である増幅配列が存在するのが好ましい。次いで、ＲＮアーゼＨおよびＤＮＡポリメラーゼを使用するなど、標準方法を使用して、第２の鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、得られたｄｓＤＮＡを、増幅プライマー配列に応じて直鎖増幅してもよい。例えば、増幅プライマー配列がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列である場合、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌを使用したＩＶＴにより、アンチセンスＲＮＡを産生してもよい。増幅プライム（prime）配列がニッキング酵素（例えば、Ｎｔ．ＢｓｐＱｌ）に対する部位を含む場合、ニッキング酵素鎖置換を使用してＲＮＡ標的のＤＮＡコピーを産生してもよい。次いで、コピーを、一端または両端に配列決定プライマーを含むように改変することができ、生成物を配列決定することができる。タグ、および十分な隣接の配列に対する配列情報を収集して、標的の同定をもたらす。
一部の場合には、オリゴヌクレオチドタグはリボ核酸を含む。オリゴヌクレオチドタグは、ウラシルであるリボ核酸を含み得る。オリゴヌクレオチドタグは、シトシンであるリボ核酸を含み得る。オリゴヌクレオチドタグは、アデニンであるリボ核酸を含み得る。オリゴヌクレオチドタグは、グアノシンであるリボ核酸を含み得る。
一意識別子配列は予め決定された配列を含み得る。一意識別子配列はランダム配列を含み得る。
オリゴヌクレオチドタグの標的特異的配列は、複数の標的に特異的であってよい。一部の態様では、オリゴヌクレオチドタグの標的特異的配列はオリゴｄＴ配列を含む。一部の態様では、オリゴヌクレオチドタグの標的特異的配列はオリゴｄＵ配列を含み得る。一部の場合には、標的特異的配列は、オリゴｄＴ配列も、オリゴｄＵ配列も含まない。
標識ＤＮＡ分子のコピーを、逆転写酵素により合成してもよい。逆転写酵素は、レトロウイルスの逆転写酵素、ファージＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼから選択することができる。
方法は、リボ核酸をデオキシリボ核酸で置換するために、標識核酸分子のコピーの合成をさらに含み得る。
一部の態様では、検出ステップは、標識核酸分子のコピー、標識核酸分子のコピーの相補配列、標識核酸分子のコピーの逆相補配列、またはこれらの一部を検出することを含む。一部の態様では、検出ステップは、標識核酸分子の核酸分子部分、標識核酸分子の核酸分子部分の相補配列、標識核酸分子の核酸分子部分の逆相補配列、標識核酸分子のオリゴヌクレオチドタグ、標識核酸分子のオリゴヌクレオチドタグの相補配列、標識核酸分子のオリゴヌクレオチドタグの逆相補配列、これらの一部、またはこれらのあらゆる組合せの、固体支持体へのハイブリダイゼーションを含み得る。一部の態様では、検出ステップは、標識核酸分子のコピーの核酸分子部分、標識核酸分子のコピーのオリゴヌクレオチドタグ部分、これらの相補配列、これらの逆相補配列、これらの一部分、またはこれらのあらゆる組合せの、固体支持体へのハイブリダイゼーションを含み得る。
一部の態様では、検出ステップは、オリゴヌクレオチドタグのコピー、オリゴヌクレオチドタグのコピーの相補配列、オリゴヌクレオチドタグのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の検出を含む。
検出ステップは、独特の分子−タグジャンクション、独特の分子−タグジャンクションの相補配列、独特の分子−タグジャンクションの逆相補配列、またはこれらの一部の固体支持体へのハイブリダイゼーションを含み得る。検出ステップは、独特の分子−タグジャンクションのコピー、独特の分子−タグジャンクションのコピーの相補配列、独特の分子−タグジャンクションのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の固体支持体へのハイブリダイゼーションを含み得る。
一部の態様では、固体支持体はアレイを含む。アレイは、表面に付着しているプローブを含み得る。アレイは、可能な各標識核酸分子の組合せに対するプローブフィーチャーをさらに含み得る。別の態様では、固体支持体はビーズを含み得る。
一部の態様では、検出ステップは、（ｉ）標識核酸分子の核酸分子部分、その相補配列、その逆相補配列、またはこれらの一部、および（ｉｉ）標識核酸分子のオリゴヌクレオチドタグ部分、その相補配列、その逆相補配列、またはこれらの一部の配列決定を含む。一部の態様では、検出ステップは、（ｉ）標識核酸分子のコピーの核酸分子部分、その相補配列、その逆相補配列、またはこれらの一部、および（ｉｉ）標識核酸分子のコピーのオリゴヌクレオチドタグ部分、その相補配列、その逆相補配列、またはこれらの一部の配列決定を含む。
一部の態様では、検出ステップは、独特のオリゴヌクレオチドタグ−ＤＮＡジャンクション、独特のオリゴヌクレオチドタグ−ＤＮＡジャンクションの相補配列、独特のオリゴヌクレオチドタグ−ＤＮＡジャンクションの逆相補配列、またはこれらの一部の配列決定を含み得る。一部の態様では、検出ステップは、独特のオリゴヌクレオチドタグ−ＤＮＡジャンクションのコピー、独特のオリゴヌクレオチドタグ−ＤＮＡジャンクションのコピーの相補配列、独特のオリゴヌクレオチドタグ−ＤＮＡジャンクションのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の配列決定を含み得る。
別の態様では、標識核酸分子が増幅される。別の態様では、標識核酸配列のコピーが増幅される。標識核酸分子または標識核酸分子のコピーの増幅は、ＰＣＲベースの方法を含み得る。ＰＣＲベースの方法はｑＰＣＲを含み得る。ＰＣＲベースの方法はＲＴ−ＰＣＲを含み得る。ＰＣＲベースの方法はエマルジョンＰＣＲを含み得る。核酸分子−標識コンジュゲートの増幅は、非ＰＣＲベースの方法を含み得る。非ＰＣＲベースの方法は、多置換増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含み得る。非ＰＣＲベースの方法は、鎖置換ポリメラーゼによるランダムプライミングを含み得る。
別の態様では、試料は少なくとも１個の単一の細胞に由来する。あるいは、試料は複数の細胞に由来する。試料は約１００個未満の細胞由来であってよい。
一部の態様では、核酸分子はＤＮＡ分子である。別の態様では、核酸分子はＲＮＡ分子である。核酸分子はｍＲＮＡ分子であってもよい。核酸分子は非コードＲＮＡ分子であってもよい。非コードＲＮＡ分子は小型非コードＲＮＡ分子であってもよい。非コードＲＮＡ分子は長鎖非コードＲＮＡ分子であってもよい。非コードＲＮＡ分子はマイクロＲＮＡ分子であってもよい。一部の態様では、オリゴヌクレオチドタグは核酸分子にライゲーションにより付着している。別の態様では、オリゴヌクレオチドタグは核酸分子にハイブリダイゼーションにより付着している。
別の態様は、（ａ）オリゴヌクレオチドタグが一意識別子配列、標的配列、および任意選択のＰＣＲプライマー配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドタグを準備するステップと、（ｂ）標識ＤＮＡ分子がＤＮＡ分子を含み、オリゴヌクレオチドタグおよび各標的ＤＮＡ分子が異なるオリゴヌクレオチドタグに付着することができる、ＤＮＡ分子を含む試料を複数の標識プライマーと合わせて標識ＤＮＡ分子を形成するステップと、（ｃ）（ｉ）ＤＮＡ分子、ＤＮＡ分子の相補配列、ＤＮＡ分子の逆相補配列、またはこれらの一部、および（ｉｉ）オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチドタグの相補配列、オリゴヌクレオチドタグの逆相補配列、またはこれらの一部を検出して異なる標識ＤＮＡ分子の計数値または数を決定し、それにより試料中の数々のＤＮＡ分子を計数または決定するステップを含む、試料中の数々のＤＮＡ分子を計数または決定する方法である。
別の態様は、（ａ）オリゴヌクレオチドタグが一意識別子配列、標的配列、および任意選択のＰＣＲプライマー配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドタグを準備するステップと、（ｂ）ＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドタグへの付着により独特の分子−タグジャンクションが形成する、ＤＮＡ分子を含む試料を複数の標識プライマーと合わせて標識ＤＮＡ分子を形成するステップと、（ｃ）独特の分子−タグジャンクション、独特の分子−タグジャンクションの相補配列、独特の分子−タグジャンクションの逆相補配列、またはこれらの一部を検出して異なる標識ＤＮＡ分子の計数値または数を決定し、それにより試料中の数々のＤＮＡ分子を計数または決定するステップとを含む、試料中の数々のＤＮＡ分子を計数または決定する方法である。
別の態様は、（ａ）アダプターが一意識別子配列を含み、各アダプターが複数の異なるＤＮＡ分子に付着することができる、複数のアダプターを準備するステップと、（ｂ）ゲノムＤＮＡを含む試料を断片化してＤＮＡ断片を含む試料を生成するステップと、（ｃ）実質的に全てのＤＮＡ断片が、一意識別子配列を有するアダプターにランダムに付着している、複数のアダプターを、ＤＮＡ断片を含む試料と合わせて、アダプター−ＤＮＡ断片コンジュゲートを形成するステップと、（ｄ）アダプター、アダプターの相補配列、アダプターの逆相補配列、またはこれらの一部を検出して異なるアダプター−ＤＮＡ断片コンジュゲートの数を決定し、それにより標的ＤＮＡのコピー数を決定するステップとを含む、試料中の標的ＤＮＡのコピー数を決定するための方法である。
別の態様は、（ａ）アダプターが一意識別子配列を含み、アダプターが複数の異なるＤＮＡ分子に付着することができる、複数のアダプターを準備するステップと、（ｂ）ゲノムＤＮＡを含む試料を断片化してＤＮＡ断片を含む試料を生成するステップと、（ｃ）実質的に全てのＤＮＡ断片が、一意識別子配列を有するアダプターにランダムに付着することができ、アダプターのＤＮＡ断片への付着により独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションが形成する、アダプターをＤＮＡ断片に付着させるステップと、（ｄ）独特のアダプター−ＤＮＡジャンクション、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションの相補配列、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションの逆相補配列、またはこれらの一部を検出して異なる独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションの計数値または数を決定し、それにより標的ＤＮＡのコピー数を決定するステップとを含む、試料中の標的ＤＮＡのコピー数を決定する方法である。
一部の態様では、アダプターはリボ核酸を含む。一部の態様では、リボ核酸はウラシルである。一部の態様では、リボ核酸はシトシンである。一部の態様では、リボ核酸はアデニンである。一部の態様では、リボ核酸はグアニンである。
一部の態様では、方法は、アダプター−ＤＮＡ断片コンジュゲートのコピーを合成して、アダプターにおけるリボ核酸配列をデオキシリボ核酸配列で置換するステップをさらに含む。
一部の態様では、検出ステップは、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションのコピー、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションのコピーの相補配列、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の検出を含む。一部の態様では、検出ステップは、アダプターのコピー、アダプターのコピーの相補配列、アダプターのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の検出を含む。
一部の態様では、検出ステップは、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクション、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションの相補配列、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションの逆相補配列、またはこれらの一部の固体支持体へのハイブリダイゼーションを含む。別の態様では、検出ステップは、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションのコピー、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションのコピーの相補配列、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の固体支持体へのハイブリダイゼーションを含む。
一部の態様では、固体支持体はアレイを含む。一部の態様では、アレイは表面に付着しているプローブを含む。一部の態様では、アレイは、各独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションに対するプローブフィーチャーを含む。一部の態様では、アレイは、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションの各コピーに対するプローブフィーチャーを含む。別の態様では、固体支持体はビーズを含む。一部の態様では、検出ステップは、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクション、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションの相補配列、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションの逆相補配列、またはこれらの一部の配列決定を含む。一部の態様では、検出ステップは、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションのコピー、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションのコピーの相補配列、独特のアダプター−ＤＮＡジャンクションのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の配列決定を含む。
一部の態様では、検出ステップは、アダプターのコピー、アダプターのコピーの相補配列、アダプターのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の配列決定を含む。一部の態様では、アダプター−ＤＮＡ断片コンジュゲートを増幅する。
一部の態様は、（ａ）オリゴヌクレオチドタグが一意識別子配列、標的配列、および任意選択のＰＣＲプライマー配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドタグを準備するステップと、（ｂ）各ゲノムＤＮＡが一意識別子配列を有するオリゴヌクレオチドタグに付着することができる、ゲノムＤＮＡを含む試料を複数の標識プライマーと合わせてゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートを形成するステップと、（ｃ）ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲート、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートの相補配列、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートの逆相補配列、またはこれらの一部を検出して数々の異なるゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートを計数または決定し、それにより遺伝子異常の存在または非存在を検出するステップとを含む、遺伝子異常の存在または非存在を検出するステップを含む方法である。
一部の態様では、検出ステップは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの相補配列、ゲノムＤＮＡの逆相補配列、またはこれらの一部の検出を含む。一部の態様では、検出ステップは、オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチドタグの相補配列、オリゴヌクレオチドタグの逆相補配列、またはこれらの一部の検出を含む。
一部の態様では、遺伝子異常は異数性を含む。異数性はモノソミーであってよい。モノソミーは性染色体のモノソミーであってよい。異数性はトリソミーであってよい。トリソミーは２１トリソミーであってよい。トリソミーは１８トリソミーであってよい。トリソミーは１３トリソミーであってよい。異数性はテトラソミーであってよい。異数性はペンタソミーであってよい。一部の態様では、方法は、遺伝子異常を診断するステップをさらに含む。一部の態様では、方法は、ターナー症候群を診断するステップをさらに含み得る。一部の態様では、方法は、ダウン症候群を診断するステップをさらに含み得る。一部の態様では、方法は、エドワード症候群を診断するステップをさらに含み得る。一部の態様では、方法は、パトー症候群を診断するステップをさらに含み得る。一部の態様では、遺伝子異常はゲノムＤＮＡにおける欠失を含む。一部の態様では、遺伝子異常は遺伝子多型を含む。一部の態様では、遺伝子異常は単一遺伝子障害を含む。一部の態様では、遺伝子異常は染色体転座を含む。
一部の態様では、試料は胎児由来である。一部の態様では、試料は、胎児由来の細胞を少なくとも１個含む。
一部の態様では、方法は、検出ステップに基づいて、胎児の着床状態を決定するステップをさらに含む。一部の態様では、ゲノムＤＮＡは、断片化された後、オリゴヌクレオチドタグに付着する。
一部の態様では、ゲノムＤＮＡは制限酵素により断片化される。一部の態様では、ゲノムＤＮＡはアレル特異的制限酵素により断片化される。
一部の態様では、オリゴヌクレオチドタグはリボ核酸を含む。一部の態様では、リボ核酸はウラシルである。一部の態様では、リボ核酸はシトシンである。一部の態様では、リボ核酸はアデニンである。一部の態様では、リボ核酸はグアニンである。一部の態様では、方法は、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートのコピーを合成して、オリゴヌクレオチドタグ中のリボ核酸配列をデオキシリボ核酸配列で置換するステップをさらに含む。
一部の態様では、検出ステップは、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートのコピー、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートのコピーの相補配列、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の検出を含む。
一部の態様では、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートのコピーは逆転写酵素により合成される。
一部の態様では、検出ステップは、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲート、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートの相補配列、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートの逆相補配列、またはこれらの一部の固体支持体へのハイブリダイゼーションを含む。一部の態様では、検出ステップは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの相補配列、ゲノムＤＮＡの逆相補配列、またはこれらの一部の固体支持体へのハイブリダイゼーションを含む。一部の態様では、検出ステップは、オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチドタグの相補配列、オリゴヌクレオチドタグの逆相補配列、またはこれらの一部の固体支持体へのハイブリダイゼーションを含む。一部の態様では、検出ステップは、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートのコピー、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートのコピーの相補配列、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の固体支持体へのハイブリダイゼーションを含む。一部の態様では、検出ステップは、ゲノムＤＮＡのコピー、ゲノムＤＮＡのコピーの相補配列、ゲノムＤＮＡのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の固体支持体へのハイブリダイゼーションを含む。一部の態様では、検出ステップは、オリゴヌクレオチドタグのコピー、オリゴヌクレオチドタグのコピーの相補配列、オリゴヌクレオチドタグのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の固体支持体へのハイブリダイゼーションを含む。
一部の態様では、検出ステップは、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲート、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートの相補配列、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートの逆相補配列、またはこれらの一部の配列決定を含む。一部の態様では、検出ステップは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの相補配列、ゲノムＤＮＡの逆相補配列、またはこれらの一部の配列決定を含む。一部の態様では、検出ステップは、オリゴヌクレオチドタグ、オリゴヌクレオチドタグの相補配列、オリゴヌクレオチドタグの逆相補配列、またはこれらの一部の配列決定を含む。一部の態様では、検出ステップは、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートのコピー、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートのコピーの相補配列、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の配列決定を含む。一部の態様では、検出ステップは、ゲノムＤＮＡのコピー、ゲノムＤＮＡのコピーの相補配列、ゲノムＤＮＡのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の配列決定を含む。一部の態様では、検出ステップは、オリゴヌクレオチドタグのコピー、オリゴヌクレオチドタグのコピーの相補配列、オリゴヌクレオチドタグのコピーの逆相補配列、またはこれらの一部の配列決定を含む。
一部の態様では、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートが増幅される。一部の態様では、ゲノムＤＮＡ−オリゴヌクレオチドタグコンジュゲートのコピーが増幅される。
本明細書には、分子（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子などの核酸、またはタンパク質および酵素などのポリペプチド）を確率的に標識するためのキットおよび組成物をさらに開示する。一部の場合には、キットおよび組成物はポリアデニル化分子を確率的に標識するのに使用される。ポリアデニル化分子はポリアデニル化ＲＮＡ分子であってもよい。あるいは、キットおよび組成物はＤＮＡ分子を確率的に標識するのに使用される。
一部の場合には、キットは、確率的標識プライマー、汎用ＰＣＲプライマー、色素標識プライマー、逆転写酵素、ＵＤＧ酵素、ポリメラーゼ、緩衝剤、ｄＮＴＰ、アレイ、遺伝子特異的プライマー、標的特異的プライマー、対照オリゴ、またはこれらのあらゆる組合せを含む。あるいは、キットは、ａ）汎用ＰＣＲプライマー、ｂ）Ｃｙ３標識汎用ＰＣＲプライマー、ｃ）Ｃｙ３ ＴｒｕｅＴａｇ Ｇｒｉｄ、およびｄ）アレイを含む。アレイは２×８アレイであってよい。本明細書に開示するキットは、確率的標識プライマー、担体、対照オリゴ、逆転写酵素、ＵＤＧ酵素、ポリメラーゼ、遺伝子特異的プライマー、標的特異的プライマー、ｄＮＴＰ、またはこれらのあらゆる組合せをさらに含み得る。
確率的標識プライマーは、オリゴヌクレオチドタグに付着しているプライマーを含むことができ、オリゴヌクレオチドタグはオリゴｄＴ配列、一意識別子領域、および汎用プライマー結合部位を含み、汎用プライマー結合部位は、キットの汎用ＰＣＲプライマーの確率的標識プライマーへのアニーリングを可能にし得る。一部の場合には、確率的標識オリゴｄＴプライマーは、オリゴｄＴプライマーに付着しているオリゴヌクレオチドタグである。
色素標識プライマーは、色素で標識されているプライマーを含み得る。プライマーは汎用ＰＣＲプライマーであってよい。あるいは、プライマーは標的特異的プライマーである。色素は蛍光色素であってよい。一部の場合には、色素はＣｙ（商標）色素である。一部の場合には、Ｃｙ（商標）色素はＣｙ３色素である。
本明細書に開示するキットおよび組成物は、複数のプローブをさらに含み得る。一部の場合には、複数のプローブがアレイにハイブリダイズされる。複数のプローブにより、標識分子のアレイへのハイブリダイゼーションが可能になり得る。複数のプローブは、確率的標識オリゴｄＴに相補的である配列を含み得る。あるいは、またはさらに、複数のプローブは、分子に相補的である配列を含む。
本明細書に開示するキットおよび組成物は、非標識の分子、過剰のプライマー、または過剰のオリゴヌクレオチドタグ（もしくは確率的標識プライマー）を、標識分子を含む試料から除去するための試薬を１つまたは複数さらに含み得る。
一部の場合には、キットおよび組成物は逆転写酵素を含む。逆転写酵素はＭＭＬＶ逆転写酵素であってよい。
キットおよび組成物はポリメラーゼ酵素を含み得る。ポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼであってよい。例えば、ＴａｑポリメラーゼはチタニウムＴａｑポリメラーゼである。
一部の場合には、キットおよび組成物は酵素を含む。酵素はＲＮアーゼ酵素であってよい。あるいは、酵素はＵＤＧである。他の場合には、酵素は制限酵素である。酵素はプロテアーゼであってよい。一部の場合には、酵素はＤＮアーゼ酵素である。あるいは、酵素はリガーゼである。キットおよび組成物は、本明細書に開示する酵素を不活性化することができる試薬を１つまたは複数含み得る。
一部の場合には、キットは担体物質をさらに含む。担体物質は、反応（例えば、増幅、逆転写、ライゲーション、ハイブリダイゼーション）の効率を向上させることができる。担体物質は核酸分子であってよい。核酸分子はＲＮＡ分子であってよい。ＲＮＡ分子はポリアデニル化ＲＮＡまたはファージＲＮＡであってよい。ファージＲＮＡは、ＭＳ２ファージ由来のＲＮＡであってよい。あるいは、核酸分子はプラスミドである。
キットは固体支持体をさらに含み得る。固体支持体はビーズであってよい。ビーズは標識分子にハイブリダイズすることができる。ビーズは標識分子の検出を可能にし得る。ビーズはストレプトアビジンビーズまたはビオチン標識ビーズであってよい。
キットは、標識分子を検出および／または定量するためのアルゴリズムをさらに含み得る。あるいは、またはさらに、キットは、標識分子を検出および／または定量するためのソフトウェアプログラムを含む。一部の場合には、キットはサーマルサイクラーをさらに含む。キットは、標識分子を配列決定するための成分を１つまたは複数さらに含み得る。配列決定するための１つまたは複数の成分は、シーケンサー、配列決定用の１つまたは複数のプライマー、配列決定用のビーズ、またはこれらのあらゆる組合せを含み得る。キットは、標識分子を検出および／または定量するための成分を１つまたは複数さらに含み得る。標識分子を検出および／または定量するための１つまたは複数の成分は、アレイ検出器、アレイリーダー、ビーズ検出器、スキャナ、蛍光光度計、または本明細書に開示するあらゆる機器もしくは成分を含み得る。
（実施例１）絶対的計数プロトコール
パート１．逆転写および確率的標識
本ステップでは、確率的標識をポリＡ ＲＮＡにアニールする。その後の逆転写反応の全体的な効率を向上させるために、大量の担体ＲＮＡも試料に加える。
一部の場合には、極めて低濃度のＲＮＡをピペッティングする場合は、核酸に結合する性質の低いチップを使用する。これら特別のチップは、ＲＮＡ試料をアニーリングマスターミックス中にピペッティングするのに使用することができる。ＲＮＡの希釈液が必要である場合は、低結合性のチューブをやはり使用することができる。ＲＮＡをアニーリングマスターミックスに加えた後は、通常のチューブ／チップを使用することができる。
以下に列挙する試薬を合わせることによりマスターミックスを作成する：
水 ７．８μｌ
Ｋ５６２ 全ＲＮＡ（１μｇ／μｌ） １μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ
遺伝子特異的ｄＵＴＰプライマー（１０μＭ） ０．４μｌ
確率的標識（１０μＭ） ＊ ０．４μｌ
合計 １０．６μｌ
分析しようとするＲＮＡ試料２μｌを加える。
ピペッティングにより十分に混合し、短時間回転させる。
６５°で５分間インキュベートし（プログラム１）、次いで、少なくとも１分間チューブを氷上に配置する。
このステップでは、対象の特異的な遺伝子に対する二本鎖ｃＤＮＡを作成する。各ｃＤＮＡ分子は、ここでは、その後のＰＣＲステップのためのプライマー部位を含む。以下のものを合わせて、転写用のマスターミックスを作製する。
５×第１の鎖緩衝剤 ４μｌ
０．１Ｍ ＤＴＴ １μｌ
Ｓｕｐｅｒ ＲＮアーゼＩｎ（２０Ｕ／μｌ） １μｌ
ＭＭＬＶ ＲＴ １μｌ
ＮＥＢ Ｔａｑポリメラーゼ ０．４μｌ
スーパースクリプトＩＩＩおよびチタニウムＴａｑの代わりにＭＭＬＶ ＲＴおよびＮＥＢ Ｔａｑポリメラーゼの使用を、代替的に使用することができる。
マスターミックス７．４μｌを各チューブに加え、ピペッティングにより穏やかに混合する。短時間回転させる。
以下のプログラム（プログラム２）をサーマルサイクラー上で実行する：
３７°６０分間、その後、
９４°２分間
５５°２分間
６８°２分間
を３サイクル、
次いで、永久に４°
ＰＣＲ反応後、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で試料を消化して、組み入れられなかったプライマーが遺伝子特異的ＰＣＲにおいて増幅されるのを防ぐ必要がある。
各反応液にＵＤＧ０．５μｌを加える。ピペッティングにより極めて十分に混合する。液体を全て新たなＰＣＲチューブに移して、混合されない試料の持越しが確実にないようにする。
３７°で３０分間、次いで４°でインキュベートする。
パート２．初期の遺伝子特異的ＰＣＲ
以下の試薬を合わせてＰＣＲ用のマスターミックスを作製する：
ヌクレアーゼフリー水 １０．９μｌ
１０×ＮＥＢ Ｔａｑ緩衝剤 １．５μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．３μｌ
遺伝子特異的プライマー（１μＭ） １μｌ
汎用ＰＣＲプライマー（１μＭ）＊ １μｌ
ＮＥＢ Ｔａｑポリメラーゼ ０．３μｌ
合計 １５μｌ
プライマーの最終濃度を０．０５ｕＭにすると生成物の特異性が向上する。
前のステップからの標識生成物５μｌを新たなＰＣＲチューブに加える。各試料にＰＣＲマスターミックス１５μｌを加える。
ピペッティングにより十分に混合し、短時間回転させる。
以下のプログラム（プログラム４）をサーマルサイクラー上で実行する：
９４°２分間、その後、
９４°２分間
５５°２分間
６８°２分間
を３０サイクル、
次いで、６８°４分間
永久に４°
パート３．第２のネステッドＰＣＲ
プレＰＣＲ領域における第２のネステッドＰＣＲ用にマスターミックスを調製する：
ヌクレアーゼフリー水 ３９．５μｌ
１０×ＮＥＢ Ｔａｑ緩衝剤 ５μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ
遺伝子特異的ネステッドプライマー（１０μＭ） １μｌ
５Ｔｙｅ ５６３標識汎用ＰＣＲプライマー（１０μＭ）＊ １μｌ
ＮＥＢ Ｔａｑポリメラーゼ ０．５μｌ
合計 ４８μｌ
マスターミックスのアリコート４８μｌを新たなＰＣＲチューブに混合する。
第１のＰＣＲ反応からの２μｌを、プレＰＣＲ領域の汚染を避けるために増幅後プロセシング用にデザインされた別の部屋でチューブに加える。その後のステップは全てこの領域において実行する。
ピペッティングにより十分に混合し、短時間回転させる。
以下のプログラム（プログラム４）をサーマルサイクラー上で実行する：
９４°２分間、その後、
９４°２分間
５５°２分間
６８°２分間
を３０サイクル、
次いで、６８°４分間
永久に４°
任意選択のステップ：サイズおよび純度を評価するためにポリアクリルアミド４〜２０％勾配ＴＢＥゲル上、ＰＣＲ生成物４ｕｌを流す。
パート４．標的ハイブリダイゼーション
３７°のハイブリダイゼーションオーブンのスイッチを入れる。
ハイブリダイゼーション用試料をＡｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｉｎｃ．のアレイスライドに準備する。ＰＣＲチューブ０．２ｍＬ中に以下のものを加える：
洗浄液Ａ（６×ＳＳＰＥ＋０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００） ５５μｌ
Ｃｙ３対照オリゴ（７６０ｐＭ）＊ １μｌ
ＰＣＲ生成物 ２０μｌ
合計 ７６μｌ
ピペッティングにより混合し、短時間回転させる。
チューブを９５°でインキュベートして変性させ、次いで氷上に配置する。
ＡＭＩアレイスライドから粘着シールを取り除く。各ハイブリダイゼーションカクテルをＡＭＩアレイスライドのウェル中にピペッティングする。標的を加えた順序を書き留めておく。スライドを、粘着シールの第２のストリップ（含まれている）で覆う。
密封したアレイスライドを湿度室中に配置し、ハイブリダイゼーションオーブン中に入れる。３７°で終夜インキュベートする。
パート５．アレイの洗浄およびスキャン
終夜ハイブリダイゼーション後、アレイスライドをハイブリダイゼーションオーブンから取り出し、粘着シールの覆いを取り除く。残りのハイブリダイゼーションカクテルをピペッティングして出し、所望により−２０°で保存する。
使用した各ウェルに洗浄液Ａ１５０μｌを分配する。液体を吸引し、洗浄液Ｂ（０．６×ＳＳＰＥ＋０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）１５０μｌを各ウェルに分配する。アレイは乾燥状態でスキャンするので、液体を吸引し、アレイスライドをスキャナに運ぶ。
Ｓｅｎｓｏｖａｔｉｏｎ ＦＬＡＩＲ機器のスイッチを入れる。機械がウォームアップする間、１０分待機する。
ソフトウェアをあけ、「トレイオープン」をクリックする。アレイスライドを４−スライドホルダー中に配置する。スライドが適切に設置されているのを確かめる。ソフトウェア上で「トレイクローズ」をクリックする。
「スキャン」アイコンをクリックする。実行しようとするスキャンについての情報の書かれたウインドウが現れる。所望によりスキャン名を変更し、「スキャンポジション」フィールド中の「・・・」アイコンをクリックすることにより、スキャンしようとする適切なウェルを選択する。スキャンしようとする各ウェルをクリックする。ソフトウェアは、各選択されたウェルを黄色い丸で囲む。「オーケー」をクリックする。
スキャンの進行を示すプレートオーバーヴュー（Ｐｌａｔｅ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ）ウインドウが現れる。ウェルをスキャンした後は、基準のパターンが検出され格子が位置付けられた場合、スクリーン上の色は灰色から緑色に変わる。基準のパターンが検出されなかった場合、ウェルは赤色に着色する。あらゆるスキャンが基準を検出しない場合、スクリーン上部の「再分析」ボタンをクリックすることにより、格子を手操作で整列させてもよい。これにより適切に位置づけることができる格子が表示される。スクリーン上部の、緑色の「分析受入れ」ボタンをクリックする。
格子が全て整列したら、データをエクスポートすることができる。ウインドウズの機能性を得るには、キーボード上の「ウインドウズ」キーおよび「Ｄ」を同時に押す。スキャン結果を、ＡｒｒａｙＲｅａｄｅｒ／ｓｅｎｓｏｖａｔｉｏｎ／ａｒｒａｙｒｅａｄｅｒ．ｓｃａｎｒｅｓｕｌｔｓ下の「マイドキュメンツ」ホルダーに位置決めする。適切なスキャンホルダーを開け、ＴＩＦＦ画像および結果 ．ｃｓｖファイルをフラッシュドライブにコピーし、またはネットワークを通じて送信する。
手操作またはコンピューターソフトウェアパッケージのいずれかで、データ分析に進む。
（実施例２）ＲＮＡ分子１２０個をバックグラウンドの全ＲＮＡの試料に加えた４つの実験
ポリアデニル化した核酸断片２４０コピーを、１×チタニウムＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝剤、ｄＮＴＰ ０．２μＭ、９６０オリゴ（ｄＴ）の確率的標識のプール０．２μＭ、第２の鎖ｃＤＮＡプライマー０．２μＭ、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．２μＬを含む反応液１０μｌに加えた。一部の反応では、２４０コピーの試験核酸断片に無関係な配列を有するさらなる数のポリアデニル化ＤＮＡ断片も加えた。反応Ａでは、バックグラウンドのポリアデニル化ＤＮＡ分子１×１０１０を反応液に加えた。反応Ｂでは、バックグラウンドのポリアデニル化ＤＮＡ分子１×１０９を反応液に加えた。反応Ｃでは、バックグラウンドのポリアデニル化ＤＮＡ分子１×１０６を反応液に加えた。また、反応Ｄでは、バックグラウンドのポリアデニル化ＤＮＡ分子を反応液に加えなかった。ランダムに断片化し、ポリアデニル化したヒトゲノムＤＮＡ １０ｎｇ、１ｎｇ、または１ｐｇを試験した。９４℃２分間、４５℃２分間、および６５℃５分間を３サイクルインキュベートした後、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１単位を加え、反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応液の半量を、１×チタニウム緩衝剤、ｄＮＴＰ ０．２μＭ、遺伝子特異的フォワードプライマー０．２μＭ、汎用リバースプライマー０．２μＭ、およびチタニウムＴａｑポリメラーゼ０．３μＬからなるＰＣＲ反応液２０μＬ中に加えた。ＰＣＲ条件は、９４℃２分間、その後９４℃２０秒間、５８℃２０秒間、および６８℃２０秒間を３０サイクルであった。最終インキュベートを６８℃で４分間実行した。ネステッドＰＣＲを、第１のＰＣＲと同じ条件に従って実行したが、ネステッドフォワードプライマーを使用した点が異なった。初期のＰＣＲの１：２５希釈液２μＬをネステッドＰＣＲに対する鋳型として使用した。ＰＣＲ生成物をＤＮアーゼでランダムに断片化し、ターミナルトランスフェラーゼ酵素でビオチン標識し、次いで３７℃で１２時間、検出器アレイにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたＤＮＡからのシグナルを、ストレプトアビジンコンジュゲートしたフィコエリスリン（phycoerytherin）での染色により検出し、マイクロアレイスキャナ上に画像化した。図２Ａ〜Ｄはそれぞれ、反応液Ａ〜Ｄに対して、ハイブリダイズしたＤＮＡからのシグナルを示す。ハイブリダイズしたＤＮＡ中に存在する標識の数を計数し、核酸断片のオリジナルのコピー数を決定するのに使用した。
（実施例３）デジタルＰＣＲとの比較
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡの濃度を、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザ機器を使用して決定した。このＲＮＡ ０．５μｇを、担体として使用したＫ５６２細胞系の全ＲＮＡ ２μｇと混合した。３μＬ中のＲＮＡ混合物を、１０ｍＭ ｄＮＴＰ溶液１μＬ、９６０オリゴ（ｄＴ）標識の１０μＭプール２μＬ、および水７μＬに加えた。この混合物を６５℃で５分間インキュベートし、直ちに氷上で冷却した。第１の鎖反応緩衝剤（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、３７５ｍＭ ＫＣｌ）４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μＬ、ＲＮアーゼインヒビター（２０単位）１μＬ、およびスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（２００単位）１μＬを加え、反応液を５０℃で６０分間、次いで７０℃で１５分間インキュベートした。ＲＮアーゼＨ（２単位）１μＬを加え、反応液を３７℃で２０分間インキュベートした。デジタルＰＣＲを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡから合成したｃＤＮＡのコピー数を定量した。試料を確率的標識ＰＣＲにより、やはり試験した。９０コピーのｃＤＮＡ（デジタルＰＣＲにより決定して）を、１×チタニウムＰＣＲ緩衝剤、ｄＮＴＰ ０．２μＭ、およびチタニウムｔａｑポリメラーゼ０．２μＬを含む反応液１０μＬに加えた。反応液を９４℃２分間、５５℃２分間、および６８℃２分間の３サイクルの間インキュベートした。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１単位を加え、反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。第１のネステッドＰＣＲ、断片化、ビオチン標識、およびアレイ検出を、実施例２に記載した通りに実行した。図３は、ハイブリダイズしたＤＮＡ中の標識からのシグナルを示す。ハイブリダイズしたＤＮＡ中に存在する標識の数を計数し、核酸断片のオリジナルコピー数を決定するのに使用した。デジタルＰＣＲによって決定された４３コピーに比べて、ハイブリダイズしたＤＮＡ中に標識が４０存在し、４１コピーが確率的標識によって決定された。これらの結果は、確率的標識は分子の計数を決定するのに効果的な方法であり、その正確さはデジタルＰＣＲに匹敵することを実証するものである。
（実施例４）ＲＴ収率は反応液の担体で増大した
担体ＲＮＡの逆転写収率の改善に対する有効性を試験するために、また、反応の間の非特異的なＲＮＡまたはｃＤＮＡの喪失を低減する手段として、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたポリアデニル化ＲＮＡのコピーを、実施例２において記載したプロトコールに従って、確率的標識で試験した。さらに、哺乳動物細胞、酵母、またはＥ．ｃｏｌｉから単離した全ＲＮＡ、短いポリアデニル化した合成リボヌクレオチド、酵母のｔＲＮＡ、またはＭＳ２ファージＲＮＡを反応混合物に加えた。各反応は、０．５μｇから２μｇの間のいずれかの担体ＲＮＡを使用した。ｃＤＮＡに逆転写されたＲＮＡ分子の数を、アレイ上で検出された観察された標識の数によって決定し、各々の場合において、試験した各担体ＲＮＡの有効性を容易に決定することができた。図４Ａ〜Ｄはそれぞれ、反応液Ａ〜Ｄに対して観察された標識を示す。
（実施例５）ＭＭＬＶとＲＮアーゼＨマイナスＭＭＬＶ逆転写酵素との比較
野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素の性能を、酵素のＲＮアーゼＨマイナス変異バージョン（スーパースクリプトＩＩＩ）と比較した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写したポリアデニル化ＲＮＡ ３７５コピーを、Ｋ５６２細胞系の全ＲＮＡ １μｇの担体に加えた。ＲＮＡを、１０ｍＭｄＮＴＰ溶液１μＬ、１０μＭ第２の鎖のプライマー０．４μＬ、９６０オリゴ（ｄＴ）標識の１０μＭプール０．４μＬを含む反応液１２．６μＬ中に加えた。反応液を６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させ、次いで、直ちに氷上で冷却した。５×第１の鎖緩衝剤４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μＬ、スペラーゼ（ｓｕｐｅｒａｓｅ）ＲＮアーゼインヒビター（２０単位）１μＬ、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２単位）０．４μＬを加えた。さらに、反応液Ａに、ＲＮアーゼＨマイナス変異体（スーパースクリプトＩＩＩ）１μＬ（２００単位）を加えた。また、反応液Ｂには、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素１μＬ（２００単位）を加えた。反応液を４２℃６０分間、次いで９４℃２分間、５５℃２分間、および６８℃２分間を３サイクルインキュベートした。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１単位を加え、反応液を混合し、新たなチューブに移し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応液５μＬを、１×チタニウム緩衝剤、ｄＮＴＰ０．２μＭ、遺伝子特異的フォワードプライマー０．２μＭ、汎用リバースプライマー０．２μＭ、およびチタニウムＴａｑポリメラーゼ０．３μＬからなるＰＣＲ反応液２０μＬに加えた。ＰＣＲ条件は、９４℃２分間、その後９４℃２０秒間、５８℃２０秒間、および６８℃２０秒間を３０サイクルであった。最終インキュベートを６８℃で４分間実行した。ネステッドＰＣＲを、第１のＰＣＲと同じ条件に従って実行したが、ネステッドフォワードプライマーを使用した点が異なった。初期のＰＣＲの１：２５希釈液２μＬをネステッドＰＣＲに対する鋳型として使用した。ＰＣＲ生成物をＤＮアーゼでランダムに断片化し、ターミナルトランスフェラーゼ酵素でビオチン標識し、次いで３７℃で１２時間、検出器アレイにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたＤＮＡからのシグナルを、ストレプトアビジンコンジュゲートしたフィコエリスリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）での染色により検出し、マイクロアレイスキャナ上に画像化した。図５Ａ〜Ｂはそれぞれ、反応ＡおよびＢにおいてハイブリダイズしたＤＮＡ中に存在する標識を示す。ハイブリダイズしたＤＮＡ中に存在する標識の数を計数し、核酸断片のオリジナルのコピー数を決定するのに使用した。
（実施例６）第２の鎖合成のためのポリメラーゼの比較
Ｔａｑポリメラーゼの性能を、チタニウムＴａｑポリメラーゼと比較した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したポリアデニル化ＲＮＡ１８７５コピーを反応液Ａに加えた。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したポリアデニル化ＲＮＡ１８８コピーを反応液Ｂに加えた。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したポリアデニル化ＲＮＡ１８７５コピーを反応液Ｃに加えた。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したポリアデニル化ＲＮＡ １８８コピーを反応液Ｄに加えた。Ｋ５６２細胞系からの担体ＲＮＡ １μｇを各反応混合液に加えた。ＲＮＡを、１０ｍＭ ｄＮＴＰ溶液１μＬ、１０μＭ第２の鎖のプライマー０．４μＬ、９６０オリゴ（ｄＴ）標識の１０μＭプール０．４μＬを含む反応液１２．６μＬ中に加えた。反応液を６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させ、次いで、直ちに氷上で冷却した。５×第１の鎖緩衝剤４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μＬ、スペラーゼＲＮアーゼインヒビター（２０単位）１μＬ、逆転写酵素、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２単位）０．４μＬを各反応液に加えた。反応液を４２℃６０分間、次いで９４℃２分間、５５℃２分間、および６８℃２分間を３サイクルインキュベートした。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１単位を加え、反応液を混合し、新たなチューブに移し、３７℃で３０分間インキュベートした。反応液ＡおよびＢ５μｌを、１×Ｔａｑ緩衝剤、ｄＮＴＰ ０．２μＭ、遺伝子特異的フォワードプライマー０．２ｕＭ、汎用リバースプライマー０．２μＭ、およびＴａｑポリメラーゼ０．３μＬからなるＰＣＲ反応液２０μＬと混合した。反応液ＣおよびＤ５μＬを、１×チタニウム緩衝剤、ｄＮＴＰ０．２μＭ、遺伝子特異的フォワードプライマー０．２ｕＭ、汎用リバースプライマー０．２μＭ、およびチタニウムＴａｑポリメラーゼ０．３μＬからなるＰＣＲ反応液２０μＬと混合した。ＰＣＲ条件は、９４℃２分間、その後９４℃２０秒間、５８℃２０秒間、および６８℃２０秒間を３０サイクルであった。最終インキュベートを６８℃で４分間実行した。ネステッドＰＣＲを、第１のＰＣＲと同じ条件に従って実行したが、ネステッドフォワードプライマーを使用した点が異なった。初期のＰＣＲの１：２５希釈液２μＬをネステッドＰＣＲに対する鋳型として使用した。ＰＣＲ生成物をＤＮアーゼでランダムに断片化し、ターミナルトランスフェラーゼ酵素でビオチン標識し、次いで３７℃で１２時間、検出器アレイにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたＤＮＡからのシグナルを、ストレプトアビジンコンジュゲートしたフィコエリスリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）での染色により検出し、マイクロアレイスキャナ上に画像化した。図６Ａ〜Ｄはそれぞれ、反応液Ａ〜ＤにおいてハイブリダイズしたＤＮＡ中に存在する標識を示す。ハイブリダイズしたＤＮＡ中に存在する標識の数を計数し、核酸断片のオリジナルコピー数を決定するのに使用した。
（実施例７）個々のＤＮＡ分子の計数によるｍＲＮＡの絶対的定量
標識を加えた後でｃＤＮＡ分子を増幅することにより、ｍＲＮＡ分子を定量することができる（図１９）。標識ｃＤＮＡ分子は、（１）ポリ−Ａ ＲＮＡテールにアニールするためのオリゴｄＴ配列、（２）予め決定された、またはランダム配列の標識タグの収集物、および（３）共通の、または汎用ＰＣＲプライマー配列と一緒に、デオキシオリゴヌクレオチドプライマーを加えることにより、ｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成により形成される。標識ｃＤＮＡ分子を、遺伝子特異的プライマー、および共通の、または汎用ＰＣＲプライマーを使用して増幅する。増幅後、配列組成の異なる標識の数を、ハイブリダイゼーション、配列決定、または他の検出方法によって容易に検出することができる。溶液中の個々のｍＲＮＡ分子の数を計数する困難な課題は、異なる標識のタイプの数を決定する単純な課題に形を変え、異なる標識は、初期の標識の配列の多様性が、存在する分子の数よりも十分に大きいのであれば、増幅後に各々高濃度で存在する。あらゆる他の適切な方法をやはり使用して、増幅の前または間にＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子中に標識を組み入れることができる。あらゆる他のＰＣＲまたはＰＣＲ以外に基づいた方法をやはり使用して、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子を増幅することができる。標識分子の増幅は、これら実施例において有用であるが、検出に必要とされないことがある。
（実施例８）ＲＮＡ発現のためのデジタルマイクロアレイ
ｎ個のオリゴｄＴ標識プライマーのプールを使用してｍＲＮＡを逆転写する（標識を有するランダムプライマーも使用することができる）（図２０）。ｃＤＮＡを、ＰＣＲおよびＴ７増幅などの方法で、任意選択により増幅してもよい。標識は各ｃＤＮＡ分子と一緒に増幅される。ｃＤＮＡをデジタルアレイにハイブリダイズして、対象の各遺伝子の個々の標識の数を決定する。ハイブリダイゼーションには、遺伝子配列（遺伝子の３’エクソン上のセグメントの可能性が最も高い）および標識配列の１つの両方の存在が必要である。７００万フィーチャーを有するアレイは、試料中に存在する各ｍＲＮＡのコピー数を決定するために、２０，０００の異なるｍＲＮＡ配列を有する試料に適用される３５０の標識の収集物を検出するのに十分である。測定の効果的なダイナミックレンジを向上させるために、３５０の標識プライマーのサブセットを低濃度で適用してもよい。この方法は、単一細胞中など、出発材料の量を限定する試料に特に有利である。
（実施例９）ＤＮＡコピー数のためのデジタルマイクロアレイ
ゲノムＤＮＡを、１つまたは複数の制限酵素を使用して、１つまたは複数の反応において小さな断片に消化する。標識配列を有するアダプターをＤＮＡ断片にライゲーションする（図２１）。ライゲーションした断片を、任意選択により増幅する。ライゲーションした断片を、任意選択により、１つまたは複数の制限酵素で消化した後で増幅してある特定の断片の複製を防いでもよく、これは対象の断片だけを選択的に増幅する上で有用である。デジタルアレイに対するハイブリダイゼーションにより、各制限断片にライゲーションされた個々の標識の数が検出される。３５０の標識配列を使用して、７００万フィーチャーのアレイは、ゲノムにおける２０，０００断片をアッセイすることができ、これはヒトにおける平均インターバル１５０ｋｂを表す。さらに、一部のアレル特異的断片を、対象のアレルに特異的な制限酵素（例えば、４塩基カッター）を選択することにより、アッセイしてもよい。
（実施例１０）マイクロＲＮＡのためのデジタルマイクロアレイ
標識を、マイクロＲＮＡの３’末端および５’末端に、ライゲーションまたは他の手段によって付着させる（図２２）。標識−マイクロＲＮＡ複合体を逆転写して、標識−ＤＮＡ生成物を産生する。標識−ＤＮＡ生成物を、任意選択により増幅する。標識−ＤＮＡ生成物を、デジタルアレイ上でハイブリダイズして、マイクロＲＮＡ１個あたりの標識の数を検出する。ｍｉＲＢａｓｅ１８（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）は２０１１年１１月に公開されたものであり、１９２１の独特の成熟ヒトｍｉＲＮＡを列挙している。２００万フィーチャーのアレイにより、１９２１のｍｉＲＮＡにライゲーションしている１０００の標識を適切に検出することができる。
（実施例１１）単一細胞着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）のためのデジタルマイクロアレイ
単一細胞ゲノムＤＮＡ増幅アッセイでの第一の難題は、アレルドロップアウトおよび複製バイアスに由来する。図４３における、あらゆる分子の複製の確率が０．８であるコンピュテーションモデリング分析に示す通り、初期のコピー比が１：１である分子は、数サイクルの複製の直後に１：１０以上に容易に歪めることができる。
しかし、最初に標識を付着させた後に増幅する場合、標識を計数してコピー数を決定することは、複製が生じる限り、複製バイアスによる影響を受けない。しかし、これはアレルドロップアウトの問題を解決するわけではなく、異数性の決定および大きな領域の欠失または増幅を、容易かつ正確に決定することができる。これは、ＰＧＤ適用に特に有用である。
（実施例１２）母系循環核酸中の胎児異数性を測定するためのデジタルマイクロアレイ
デジタルマイクロアレイを使用して、母系循環核酸中の胎児異数性を測定することができる。母系循環核酸を含む試料を準備する。４塩基カッターを使用してＤＮＡを断片化する。断片化したＤＮＡに標識を付着させる。マルチプレックスＰＣＲを循環させて２１染色体マーカー４０個および対照の染色体マーカー１０個を増幅する。増幅された標識−ＤＮＡ生成物を５００万フィーチャーのアレイ上で検出する。２１染色体のコピー数を使用して、胎児異数性の出現を決定することができる（図２４）。
（実施例１３）個々のＤＮＡ分子の計数によるｍＲＮＡの絶対的定量
第１の鎖ｃＤＮＡ合成の間に標識を組み入れることにより、ｍＲＮＡ分子を定量することができる（図２５）。標識ｃＤＮＡ分子は、（１）ポリ−Ａ ＲＮＡテールにアニールするためのオリゴｄＴ配列、（２）予め決定された、またはランダム配列の標識タグの収集物、および（３）共通の、または汎用ＰＣＲプライマー配列と一緒に、デオキシオリゴヌクレオチドプライマーを加えることにより、ｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成により形成される。第１の鎖ｃＤＮＡ合成の後、配列組成の異なる標識の数を、ハイブリダイゼーション、配列決定、または他の検出方法により容易に検出することができる。溶液中の個々のｍＲＮＡ分子の数を計数する困難な課題は、異なる標識のタイプの数を決定する単純な課題に形を変え、異なる標識は、初期の標識配列の多様性が、存在する分子数よりも十分に大きいのであれば、増幅後に各々高濃度で存在する。あらゆる他の適切な方法をやはり使用して、第１の鎖ｃＤＮＡ合成の前または間にＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子中に標識を組み入れることができる。
（実施例１４）段階希釈のカナマイシンＲＮＡでの滴定実験
広範なダイナミックレンジの絶対的計数プロトコールを説明するために、カナマイシンＲＮＡの段階希釈を実行することにより、滴定曲線を生成した。各９個の段階希釈を、２．５ｐｇ／μｌ、１．２５ｐｇ／μｌ、０．２５ｐｇ／μｌ、０．１２５ｐｇ／μｌ、０．０２５ｐｇ／μｌ、１２．５ｆｇ／μｌ、２．５ｆｇ／μｌ、１．２５ｆｇ／μｌ、および０．２５ｆｇ／μｌから０．２５ｆｇ／μｌの濃度に標準化した。希釈は全て、試料ＲＮＡのチューブの壁への粘着を妨害するために酵母ＲＮＡ１０ｎｇ／μｌ溶液で予めすすいだチューブ中、Ｅ．ｃｏｌｉ全ＲＮＡ１ｎｇ／μｌの希釈溶液を使用して作製した。試料を、Ｅ．ｃｏｌｉ全ＲＮＡ１μｇ、ｄＮＴＰの１０ｍＭ溶液１μｌ、カナマイシンに特異的な１０ｕＭｄＵプライマー０．４μｌ、および９６０ｄＴオリゴ標識の１０μΜプール０．４μｌを含む反応液１２．６μｌに加えた。反応液を６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させ、次いで、直ちに氷上で冷却した。５×第１の鎖緩衝剤４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μＬ、スペラーゼＲＮアーゼインヒビター（２０単位）１μＬ、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素１μＬ（２００単位）、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２単位）０．４μＬを加えた。反応液を３７℃６０分間、その後９４℃２分間、５５℃２分間、および７２℃２分間を３サイクルインキュベートした。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１単位を加え、反応液を混合し、新たなチューブに移し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応液５μＬを、１×Ｔａｑ反応緩衝剤、ｄＮＴＰ ０．２μΜ、遺伝子特異的フォワードプライマー０．０５ｕＭ、汎用リバースプライマー０．０５μＭ、およびＴａｑポリメラーゼ０．３μＬからなるＰＣＲ反応液２０μＬに添加した。ＰＣＲ条件は、９４℃２分間、その後９４℃２０秒間、５８℃２０秒間、および７２℃２０秒間を３０サイクルであった。最終のインキュベートを７２℃で４分間実行した。ネステッドＰＣＲを、ネステッドフォワードプライマーおよびＣｙ３標識を付着させた汎用リバースプライマーを使用して実行した。初期のＰＣＲ ０．５μｌをネステッドＰＣＲに対する鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は第１のＰＣＲと同じであったが、５８℃のステップを５５℃で実行した点が異なった。試料を、３７℃で終夜、検出器アレイにハイブリダイズさせ、翌日、蛍光リーダーを使用してスキャンしてアレイ上のどの位置がＣｙ３標識を含んでいたかを検出した。ポジティブのスポットの数を使用して、試料の初期濃度を決定した。図３５は希釈スキームを示す。図３６Ａ〜Ｈは結果の散布図を示し、表１は結果を示す。図３７は相関グラフを示す。
（実施例１５）ＧＡＰＤＨ発現を測定するためのヒト肝臓ＲＮＡの段階希釈での滴定実験
ヒト肝臓の全ＲＮＡの段階希釈を実行することにより、滴定曲線を作成して、遺伝子発現のレベルを検出するための確率的標識プロトコールの能力を示した。各８個の段階希釈を、５０００ｐｇ／μｌ、１２５０ｐｇ／μｌ、５００ｐｇ／μｌ、１２５ｐｇ／μｌ、５０ｐｇ／μｌ、１２．５ｐｇ／μｌ、５ｐｇ／μｌ、および１．２５ｐｇ／μｌから１．２５ｐｇ／μｌの濃度に標準化した。希釈は全て、試料ＲＮＡのチューブの壁への粘着を妨害するために酵母ＲＮＡ１０ｎｇ／μｌ溶液で予めすすいだチューブ中、Ｅ．ｃｏｌｉ全ＲＮＡ１ｎｇ／μｌの希釈溶液を使用して作製した。試料を、Ｅ．ｃｏｌｉ全ＲＮＡ１μｇ、ｄＮＴＰの１０ｍＭ溶液１μｌ、ＧＡＰＤＨに特異的な１０ｕＭｄＵプライマー０．４μｌ、および９６０ｄＴオリゴ標識の１０μΜプール０．４μｌを含む反応液１２．６μｌに加えた。反応液を６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させ、次いで、直ちに氷上で冷却した。５×第１の鎖緩衝剤４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μＬ、スペラーゼＲＮアーゼインヒビター（２０単位）１μＬ、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素１μＬ（２００単位）、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２単位）０．４μＬを加えた。反応液を３７℃６０分間、その後９４℃２分間、５５℃２分間、および７２℃２分間を３サイクルインキュベートした。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１単位を加え、反応液を混合し、新たなチューブに移し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応液５μＬを、１×Ｔａｑ反応緩衝剤、ｄＮＴＰ ０．２μΜ、遺伝子特異的フォワードプライマー０．０５ｕＭ、汎用リバースプライマー０．０５μＭ、およびＴａｑポリメラーゼ０．３μＬからなるＰＣＲ反応液２０μＬに添加した。ＰＣＲ条件は、９４℃２分間、その後９４℃２０秒間、５８℃２０秒間、および７２℃２０秒間を３０サイクルであった。最終インキュベートを７２℃で４分間実行した。ネステッドＰＣＲを、ネステッドフォワードプライマーおよびＣｙ３標識を付着させた汎用リバースプライマーを使用して実行した。初期のＰＣＲ０．５μｌをネステッドＰＣＲに対する鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は第１のＰＣＲと同じであったが、５８℃のステップを５５℃で実行した点が異なった。試料を、３７℃で終夜、検出器アレイにハイブリダイズさせ、翌日、蛍光リーダーを使用してスキャンしてアレイ上のどの位置がＣｙ３標識を含んでいたかを検出した。ポジティブのスポットの数を使用して、試料の初期濃度を決定した。図３８は希釈スキームを示す。図３９は結果の散布図を示し、表２は結果を示す。図４０は相関グラフを示す。
（実施例１６）対照の細菌遺伝子の測定
プロトコールを、ポリＡ細菌対照ＲＮＡ（Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｄａｐ、およびＰｈｅ）、ならびにカナマイシン耐性遺伝子からのＲＮＡを使用して検証した。各対照の異なる４つの希釈を使用して、計数の正確さを検証した。試料を、Ｅ．ｃｏｌｉ全ＲＮＡ１μｇ、ｄＮＴＰの１０ｍＭ溶液１μｌ、遺伝子特異的ｄＵプライマー１０ｕＭ、および９６０ｄＴオリゴ標識の１０μΜプール０．４μｌを含む反応液１２．６μｌに加えた。反応液を６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させ、次いで、直ちに氷上で冷却した。５×第１の鎖緩衝剤４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μＬ、スペラーゼＲＮアーゼインヒビター（２０単位）１μＬ、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素１μＬ（２００単位）、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２単位）０．４μＬを加えた。反応液を３７℃６０分間、その後９４℃２分間、５５℃２分間、および７２℃２分間を３サイクルインキュベートした。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１単位を加え、反応液を混合し、新たなチューブに移し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応液５μＬを、１×Ｔａｑ反応緩衝剤、ｄＮＴＰ ０．２μΜ、遺伝子特異的フォワードプライマー０．０５ｕＭ、汎用リバースプライマー０．０５μＭ、およびＴａｑポリメラーゼ０．３μＬからなるＰＣＲ反応液２０μＬに添加した。ＰＣＲ条件は、９４℃２分間、その後９４℃２０秒間、５８℃２０秒間、および７２℃２０秒間を３０サイクルであった。最終インキュベートを７２℃で４分間実行した。ネステッドＰＣＲを、ネステッドフォワードプライマーおよびＣｙ３標識を付着させた汎用リバースプライマーを使用して実行した。初期のＰＣＲ ０．５μｌをネステッドＰＣＲに対する鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は第１のＰＣＲと同じであったが、５８℃のステップを５５℃で実行した点が異なった。試料を、３７℃で終夜、検出器アレイにハイブリダイズさせ、翌日、蛍光リーダーを使用してスキャンしてアレイ上のどの位置がＣｙ３標識を含んでいたかを検出した。ポジティブのスポットの数を使用して、試料の初期濃度を決定した。図４１は、最小濃度希釈からの結果の散布図を示し、表３は結果の概略表を表す。
（実施例１７）確率的標識およびデジタルＰＣＲによるカナマイシンＲＮＡの定量の比較
確率的標識により産生されたカナマイシンＲＮＡの計数値を、別の例の検証としてデジタルＰＣＲから得た計数値と比較した。カナマイシンＲＮＡ ５μｇを、Ｅ．ｃｏｌｉ全ＲＮＡ２μｇ、ｄＮＴＰの１０ｍＭ溶液１μｌ、および９６０ｄＴオリゴ標識の１０μΜ溶液２μｌを含む反応液１３μｌに加えた。試料を６５℃で５分間加熱し、次いで、氷上で冷却した。５×第１の鎖緩衝剤４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μＬ、スペラーゼＲＮアーゼインヒビター（２０単位）１μＬ、スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素１μＬ（２００単位）を反応液に加えた。試料を５０℃で６０分間インキュベートし、次いで１５分間７０℃に加熱し、次いで４℃に冷却した。ＲＮアーゼＨ２単位を加え、試料を３７℃で２０分間インキュベートした。最終のインキュベートの後、ＴＥ ２９μｌを加えた。５０００万倍の段階希釈を実行し、１ｕｌを１５ｕｌデジタルＰＣＲの７５反応において使用した。これら反応液は各々、２×ＳＹＢＲ ＰＣＲマスターミックス７．５μｌ、１０ｕＭカナマイシンフォワードプライマー０．１３μｌ、および１０ｕＭカナマイシンリバースプライマー０．１３μｌを含んでいた。ＰＣＲ条件は、９５℃３０秒間の初期インキュベート、その後９５℃１５秒間および５８℃６０秒間を４５サイクル含んでいた。結果を検証する目的で、ＰＣＲの後に融解曲線プログラムを続けた。図４２は、結果の散布図を示し、表３はカナマイシンに対する計数の概略を示す。図４２は、ＳＹＢＲグリーンｑＰＣＲ試薬を使用した０．０００２ｐｇカナマイシンＲＮＡのｄＰＣＲ結果を示す。図４２に示す通り、７５反応中ポジティブのウェルが５０個観察され、ｎ＝１０４分子が０．０００２ｐｇ中に存在した（０．００１ｐｇ中に５２０分子が存在した）。
（実施例１８）肝臓ＲＮＡにおける遺伝子発現測定
様々な存在量の標的の遺伝子発現値を、確率的標識を使用して測定した。転写物の存在量についての以前の仮定に基づいて、様々な濃度のヒト肝臓の全ＲＮＡを使用して９個の遺伝子；ＧＡＰＤＨ、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ１９、ＳＤＨＡ、ＧＵＳＢ、ＴＵＢＢ、ＡＢＣＦ１、Ｇ６ＰＤ、およびＴＢＰを各々試験した。各反応において使用したＲＮＡ量を、１〜３００分子の範囲の理想的な計数を標的にするよう設計し、これらはそれぞれ０．６２５ｐｇ、１．２５ｐｇ、１．２５ｐｇ、１２５ｐｇ、１２．５ｐｇ、１２．５ｐｇ、２５００ｐｇ、６５０ｐｇ、および６５０ｐｇであった。試料を、Ｅ．ｃｏｌｉ全ＲＮＡ１μｇ、ｄＮＴＰの１０ｍＭ溶液１μｌ、１０ｕＭ遺伝子特異的ｄＵプライマー０．４μｌ、および９６０ｄＴオリゴ標識の１０μΜプール０．４μｌを含む反応液１２．６μｌに加えた。反応液を６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させ、次いで、直ちに氷上で冷却した。５×第１の鎖緩衝剤４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μＬ、スペラーゼＲＮアーゼインヒビター（２０単位）１μＬ、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素１μＬ（２００単位）、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２単位）０．４μＬを加えた。反応液を３７℃６０分間、その後９４℃２分間、５５℃２分間、および７２℃２分間を３サイクルインキュベートした。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１単位を加え、反応液を混合し、新たなチューブに移し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応液５μＬを、１×Ｔａｑ反応緩衝剤、ｄＮＴＰ ０．２μΜ、遺伝子特異的フォワードプライマー０．０５ｕＭ、汎用リバースプライマー０．０５μＭ、およびＴａｑポリメラーゼ０．３μＬからなるＰＣＲ反応液２０μＬに添加した。ＰＣＲ条件は、９４℃２分間、その後９４℃２０秒間、５８℃２０秒間、および７２℃２０秒間を３０サイクルであった。最終インキュベートを７２℃で４分間実行した。ネステッドＰＣＲを、ネステッドフォワードプライマーおよびＣｙ３標識を付着させた汎用リバースプライマーを使用して実行した。初期のＰＣＲ ０．５μｌをネステッドＰＣＲに対する鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は第１のＰＣＲと同じであったが、５８℃のステップを５５℃で実行した点が異なった。試料を、３７℃で終夜、検出器アレイにハイブリダイズさせ、翌日、蛍光リーダーを使用してスキャンしてアレイ上のどの位置がＣｙ３標識を含んでいたかを検出した。ポジティブのスポットの数を使用して、試料の初期濃度を決定した。表４は９個の遺伝子全てに対する計数値の概要を示す。
（実施例１９）細胞可溶化物から直接のｍＲＮＡ分子の絶対的定量
本実施例は細胞可溶化物から直接、転写物の計数値を生成する方法を記載するものである。ＰＢＳ中洗浄したＲａｍｏｓ（ＲＡ１）細胞系から細胞４０〜１００個の範囲を、以下の試薬と一緒にＰＣＲチューブ中に配置した：Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ５％１μｌ、Ｅ．ｃｏｌｉ全ＲＮＡ １μｇ、ｄＮＴＰの１０ｍＭ溶液１μｌ、遺伝子特異的ｄＵプライマー０．４μｌ、および９６０ ｄＴオリゴの１０ｕΜプール０．４μｌ。試料を１０分間７０℃に加熱し、氷上で冷却して細胞を溶解し、プライマーをアニールさせた。５×第１の鎖緩衝剤４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ １μＬ、スペラーゼＲＮアーゼインヒビター（２０単位）１μＬ、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素１μＬ（２００単位）、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２単位）０．４μＬを加えた。対照の試料も、逆転写酵素なしで同じ細胞数に対して実行した。反応液を３７℃６０分間、その後９４℃２分間、５５℃２分間、および７２℃２分間を３サイクルインキュベートした。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ１単位を加え、反応液を混合し、新たなチューブに移し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応液５μＬを、１×Ｔａｑ反応緩衝剤、ｄＮＴＰ ０．２μΜ、遺伝子特異的フォワードプライマー０．０５ｕＭ、汎用リバースプライマー０．０５μＭ、およびＴａｑポリメラーゼ０．３μＬからなるＰＣＲ反応液２０μＬに添加した。ＰＣＲ条件は、９４℃２分間、その後９４℃２０秒間、５８℃２０秒間、および７２℃２０秒間を３０サイクルであった。最終インキュベートを７２℃で４分間実行した。ネステッドＰＣＲを、ネステッドフォワードプライマーおよびＣｙ３標識を付着させた汎用リバースプライマーを使用して実行した。初期のＰＣＲ ０．５μｌをネステッドＰＣＲに対する鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は第１のＰＣＲと同じであったが、５８℃のステップを５５℃で実行した点が異なった。試料を、３７℃で終夜、検出器アレイにハイブリダイズさせ、翌日、蛍光リーダーを使用してスキャンしてアレイ上のどの位置がＣｙ３標識を含んでいたかを検出した。ポジティブのスポットの数を使用して、試料中のＲＰＬ１９転写物の濃度を決定した。図４３は、確率的標識のプロトコールを直接細胞に適用したことを概略する模式図を示す。
（実施例２０）ｃＤＮＡ合成の最適化
ｃＤＮＡ合成反応を３つ実行した。３つの反応液の組成を以下に記載する。
反応液１：Ｓｔｄ＝対照のＲＮＡ＋１０ｎＭ ｄＴ２４（配列番号６０）＋逆転写酵素
反応液２：Ｃｈｕｍ＝対照のＲＮＡ＋１０ｎｇポリＡ担体ＲＮＡ＋１０ｎＭ ｄＴ２４（配列番号６０）＋逆転写酵素
反応液３：Ｂｅａｄ＝対照のＲＮＡ＋ｄＴ４０（配列番号６１）ビーズ１×１０６＋逆転写酵素
反応液を４２℃で１時間インキュベートし、次いで３５サイクルのＰＣＲ用に、示した数のインプットＲＮＡコピーに希釈した。各反応に対するＰＣＲ生成物を図３２に示す。図３２Ａに示す通り、ＲＮＡのｃＤＮＡへの変換は、溶液中よりビーズ上のほうが高い。
ここに、本発明を、理解を明確にする目的で図および例によりある程度詳細に、十分に記載してきたが、当業者であれば、本発明の範囲またはあらゆる具体的なその実施形態に影響を及ぼさずに、広範かつ同等の条件の範囲、処方、および他のパラメータ内で本発明を改変または変更することにより同じことを実行することができ、ならびにこのような改変または変更は添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されることが明らかであろう。
本明細書において言及する刊行物、特許、および特許出願は全て、本発明が関係する技術分野の技術者の技術のレベルを示すものであり、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により援用されることを具体的かつ個々に示す如く、同程度に参照により本明細書に援用される。

Claims (14)

  1. 試料中のｍＲＮＡ分子のコピー数を決定する方法であって、
    （ａ）試料中の複数のｍＲＮＡ分子を、複数のオリゴヌクレオチドタグで確率的に標識して、複数の標識ｍＲＮＡ分子を生成するステップであって、ここで、前記複数のｍＲＮＡ分子は、少なくとも２つの異なる配列を有するｍＲＮＡ分子を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドタグのうちのオリゴヌクレオチドタグの各々が、オリゴｄＴ配列、識別子領域および汎用プライマー結合部位を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドタグは、前記複数のｍＲＮＡ分子のコピーを同定するための異なる配列の識別子領域を有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドタグを含み、そして、前記複数のオリゴヌクレオチドタグにおける異なるオリゴヌクレオチドタグの数が、標識するあらゆる複数のｍＲＮＡ分子のコピー数の少なくとも５の倍数大きい、ステップと、
    （ｂ）少なくとも１つの前記複数の標識ｍＲＮＡ分子を、逆転写酵素と接触させることによって第１鎖合成反応を実施して、一本鎖標識ｃＤＮＡ分子を生成するステップと、
    （ｃ）前記一本鎖標識ｃＤＮＡ分子を増幅して、二本鎖標識ｃＤＮＡ分子を生成するステップと、
    （ｄ）前記二本鎖標識ｃＤＮＡ分子上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施して、ネステッドＰＣＲ−標識アンプリコンを生成するステップと、
    （ｅ）前記ネステッドＰＣＲ−標識アンプリコンの少なくとも一部を検出して、前記標識ｃＤＮＡ分子に関連する異なる識別子領域の数を決定し、それにより、前記試料中の前記複数のｍＲＮＡ分子のコピー数を決定するステップと、
    を含む、方法。
  2. 前記オリゴヌクレオチドタグが少なくとも２０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
  3. 各一意識別子配列が、ランダム配列または予め決定された配列を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記試料が、細胞可溶化物を含み、そして必要に応じて、前記ｍＲＮＡが、オリゴｄＴが付着した、ビーズなどの固体支持体上に捕捉されることによって濃縮される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ネステッドポリメラーゼ連鎖反応が、汎用プライマーを前記オリゴヌクレオチドタグの汎用プライマー結合部位にアニールすることおよび／または遺伝子特異的プライマーを前記二本鎖標識ｃＤＮＡ分子にアニールすることを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記検出ステップが、前記ネステッドＰＣＲ−標識アンプリコン、またはそれらの任意の生成物を、固体支持体、場合によってはビーズまたはアレイにハイブリダイズすることを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記試料が単一の細胞に由来する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記試料が、約５０個未満の細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 試料中の複数のｍＲＮＡ分子を確率的に標識するためのキットであって、ここで、前記複数のｍＲＮＡ分子は、少なくとも２つの異なる配列を有するｍＲＮＡ分子を含み、前記キットは、
    （ａ）複数のオリゴヌクレオチドタグであって、前記複数のオリゴヌクレオチドタグのうちのオリゴヌクレオチドタグは、
    （ｉ）オリゴｄＴ配列、
    （ｉｉ）少なくとも６つのヌクレオチドを含む識別子領域であって、前記識別子領域の配列が、少なくとも１，０００の異なる一意識別子配列を含むセットから選択される、識別子領域、および
    （ｉｉｉ）ネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための汎用プライミング部位を含む、複数のオリゴヌクレオチドタグと、
    （ｂ）酵素と
    を含み、ここで、前記複数のオリゴヌクレオチドタグにおける異なるオリゴヌクレオチドタグの数が、標識するあらゆる複数のｍＲＮＡ分子のコピー数の少なくとも５の倍数大きく、そして、少なくとも１，０００の前記複数のオリゴヌクレオチドタグが、異なる一意識別子配列を含む、キット。
  10. 前記酵素が逆転写酵素である、請求項９に記載のキット。
  11. 前記検出ステップが、アレイ検出器、蛍光リーダー、非蛍光検出器、ＣＲリーダー、シーケンサーまたはスキャナの使用を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記複数のオリゴヌクレオチドタグが、少なくとも１００の異なる配列のオリゴヌクレオチドタグを含む、請求項１〜８および１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ポリメラーゼ連鎖反応が、絶対ＰＣＲ、ＨＤ−ＰＣＲ、次世代ＰＣＲ、デジタル式ＲＴＡまたはその任意の組合せを含む、請求項１〜８および１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記増幅ステップが、汎用プライマーを前記オリゴヌクレオチドタグの前記汎用プライマー結合部位にアニールすることを含む、請求項１〜８および１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
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