JP6983906B2 - ライブラリーの定量および定性 - Google Patents
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Description
本出願に関連付けられる配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、Sequence_listing.txtである。テキストファイルは、約27KBであり、EFS−Web経由で電子的に提出されている。
本明細書には、ライブラリーを定量および定性するための方法、組成物、およびキットが記載されている。一部の実施形態は、ライブラリーを定量する方法に関する。例えば、本方法は、DNA断片を提供すること、それぞれフルオロフォアで標識されたプライマーの存在下でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりDNA断片を増幅することを含み得る。これらの事例では、所定の数のフルオロフォアのみが各DNA断片に結合する。本方法は、増幅されたDNA断片によって生成された蛍光シグナルを検出すること、および検出された蛍光シグナルに基づいて、増幅されたDNA断片の数を算出することをさらに含み得る。
本明細書には、ライブラリーを定量および定性するための方法、組成物、およびキットが記載されている。本開示の実施形態は、ライブラリーの定量および定性のためにDNA断片に蛍光色素を結合させることが、その後の配列決定を妨げないという驚くべき発見に関する。一部の実施形態では、蛍光色素が結合したプライマーが、ライブラリーの定量および定性に使用される。蛍光色素が結合したプライマーはライブラリーに残存するが、その後のライブラリーの配列決定は、蛍光に基づく配列決定技術を使用して実施することができる。
蛍光標識PCRプライマー(/56−FAM/CAA GCA GAA GAC GGC ATA CG(配列番号1))を使用して、2つのIllumina TruSeq DNAライブラリー(BC11およびBC13)をPCR増幅した。精製されたライブラリーをAgilent BioAnalyzerで分析し、ライブラリーの平均サイズを決定し、結果を図1(A)に示す。ライブラリーはまた、NanoDrop UV−Vis分光光度計およびKAPAライブラリー定量キットによって定量された。モル濃度は、KAPAライブラリー定量キットによって決定された量、およびBioAnalyzerによって決定されたライブラリーの平均サイズを使用して算出された。2〜8マイクロリットルのライブラリーを200μLのTE緩衝液と混合し、Qubit 2.0蛍光計で蛍光を読み取った。Qubit蛍光読み取り値およびモル量の線形相関を図1(B)に示す。
(実施例2)
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
ライブラリーを定量する方法であって、
DNA断片を提供すること;
フルオロフォアで標識された少なくとも1つのプライマーで、少なくとも1つのプライマーの存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により前記DNA断片を増幅し、結果として、増幅された各DNA断片に所定の数のフルオロフォアを結合させること;
前記増幅されたDNA断片から生成された蛍光シグナルを検出すること;
前記検出された蛍光シグナルに基づいて、前記増幅されたDNA断片の数を算出すること;および
前記増幅されたDNA断片を所定の濃度に希釈することにより、固相結合を調製すること
を含む方法。
(項目2)
前記増幅されたDNA断片によって生成されたシグナルを検出する前に、
蛍光配列決定の調製において前記増幅されたDNA断片に組み込まれていないプライマーを除去すること
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記少なくとも1つのプライマーが、第1のプライマータイプおよび第2のプライマータイプを含み、前記第1のプライマータイプが、結合した単一のフルオロフォアを有する、項目1に記載の方法。
(項目4)
単一のフルオロフォアが各DNA断片に結合している、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記増幅されたDNA断片により生成されたシグナルを検出することが、蛍光光度計を用いて、前記増幅されたDNA断片に組み込まれたフルオロフォアにより生成された前記蛍光シグナルを検出することを含む、項目2に記載の方法。
(項目6)
参照試料に由来するDNA断片の数と、前記DNA断片によって生成される蛍光シグナルとの間の関係を示す標準曲線を生成すること
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記検出されたシグナルに基づいて、前記増幅されたDNA断片の数を算出することが、前記検出された蛍光シグナルおよび前記標準曲線に基づいて、前記増幅されたDNA断片の数を算出することを含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
2回目の測定を行って、前記増幅されたDNA断片の特徴を決定すること
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
試料中のDNAの総質量を決定することをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記増幅されたDNA断片の特徴が、断片の数とDNAの質量との間の比に由来する、前記増幅されたDNA断片の平均サイズを含む、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記DNA断片が少なくとも1つのアダプターを含み、前記プライマーが前記アダプターに相補的である、項目1に記載の方法。
(項目12)
所定の数のフルオロフォアのみがそれぞれ結合したDNA断片を含む核酸ライブラリーであって、それにより、前記結合したフルオロフォアにより生成された蛍光シグナルに基づいて、前記DNA断片の数が算出される、核酸ライブラリー。
(項目13)
前記DNA断片が2つの別個のプライマーを使用して生成されるPCRアンプリコンであり、1つのプライマーがフルオロフォアで標識され、それにより、所定の数のフルオロフォアのみが各PCRアンプリコン断片に結合する、項目12に記載の核酸ライブラリー。
(項目14)
前記DNA断片がアダプターを含み、前記プライマーが前記アダプターに相補的である、項目12に記載の核酸ライブラリー。
(項目15)
DNA試料を配列決定する方法であって、
前記DNA試料を使用してDNA断片を生成すること;
1つのプライマーがフルオロフォアで標識された2つの別個のプライマーの存在下でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により前記DNA断片を増幅して、各DNA断片に結合する所定の数のフルオロフォアを提供すること;
前記増幅されたDNA断片によって生成された蛍光シグナルを検出すること;
前記検出された蛍光シグナルに基づいて、前記増幅されたDNA断片の数を算出すること;
前記増幅されたDNA断片を、蛍光に基づく配列決定に適した所定の濃度に希釈すること;および
蛍光に基づく配列決定技術を使用して、前記増幅されたDNA断片の少なくとも一部分を配列決定すること
を含む方法。
(項目16)
前記増幅されたDNA断片によって生成された前記シグナルを検出する前に、
蛍光配列決定の調製において前記増幅されたDNA断片に組み込まれていないプライマーを除去すること
をさらに含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
単一のフルオロフォアのみが各DNA断片に結合している、項目15に記載の方法。
(項目18)
前記増幅されたDNA断片により生成されたシグナルを検出することが、蛍光光度計を用いて、前記増幅されたDNA断片に組み込まれたフルオロフォアにより生成された前記蛍光シグナルを検出することを含む、項目16に記載の方法。
(項目19)
標準ライブラリーに由来するDNA断片の数と、前記DNA断片によって生成される蛍光シグナルとの間の関係を示す標準曲線を生成すること
をさらに含む、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記検出されたシグナルに基づいて、前記増幅されたDNA断片の数を算出することが、前記検出された蛍光シグナルおよび前記標準曲線に基づいて、前記増幅されたDNA断片の数を算出することを含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記増幅されたDNA断片の特徴を決定すること
をさらに含む、項目15に記載の方法。
(項目22)
前記増幅されたDNA断片の特徴が、前記増幅されたDNA断片の平均サイズを含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記DNA断片がアダプターを含み、前記プライマーが前記アダプターに相補的である、項目15に記載の方法。
(項目24)
ライブラリーアダプターに相補的な2つの別個のプライマーを含むキットであって、少なくとも1つのプライマーがフルオロフォアで標識され、それにより、DNA断片が所定の数の結合したフルオロフォアを有するプライマーを使用して増幅される、キット。
(項目25)
1つまたは複数のポリメラーゼをさらに含む、項目24に記載のキット。
(項目26)
増幅のための試薬をさらに含む、項目24に記載のキット。
(項目27)
配列決定のための試薬をさらに含む、項目24に記載のキット。
(項目28)
キットの使用に関する指示書をさらに含む、項目24に記載のキット。
(項目29)
dATP、dCTP、dGTP、dTTP、またはそれらの任意の混合物をさらに含む、項目24に記載のキット。
(項目30)
DNA断片に連結することができるアダプターをさらに含む、項目24に記載のキット。
Claims (20)
- ライブラリーを定量する方法であって、
DNA断片を提供すること;
複数のプライマーの存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により前記DNA断片を増幅し、ここで、前記複数のプライマーの少なくとも1つはフルオロフォアで標識されており、結果として、増幅された各DNA断片に所定の数のフルオロフォアを結合させること;
前記増幅されたDNA断片から生成された蛍光シグナルを検出すること;
前記検出された蛍光シグナルに基づいて、前記増幅されたDNA断片の数を算出すること;
前記増幅されたDNA断片を所定の濃度に希釈すること;および
前記増幅されたDNA断片を固体支持体上に固定化すること
を含む方法。 - 前記増幅されたDNA断片によって生成されたシグナルを検出する前に、
蛍光配列決定の調製において前記増幅されたDNA断片に組み込まれていないプライマーを除去すること
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記複数のプライマーが、第1のプライマータイプおよび第2のプライマータイプを含み、前記第1のプライマータイプが、結合した単一のフルオロフォアを有する、請求項1に記載の方法。
- 単一のフルオロフォアが各DNA断片に結合している、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅されたDNA断片により生成されたシグナルを検出することが、蛍光光度計を用いて、前記増幅されたDNA断片に組み込まれたフルオロフォアにより生成された前記蛍光シグナルを検出することを含む、請求項2に記載の方法。
- 参照試料に由来するDNA断片の数と、前記DNA断片によって生成される蛍光シグナルとの間の関係を示す標準曲線を生成すること
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記検出されたシグナルに基づいて、前記増幅されたDNA断片の数を算出することが、前記検出された蛍光シグナルおよび前記標準曲線に基づいて、前記増幅されたDNA断片の数を算出することを含む、請求項6に記載の方法。
- 2回目の測定を行って、前記増幅されたDNA断片の特徴を決定すること
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 試料中のDNAの総質量を決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅されたDNA断片の特徴が、断片の数とDNAの質量との間の比に由来する、前記増幅されたDNA断片の平均サイズを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記DNA断片が少なくとも1つのアダプターを含み、前記プライマーが前記アダプターに相補的である、請求項1に記載の方法。
- DNA試料を配列決定する方法であって、
前記DNA試料を使用してDNA断片を生成すること;
2つの別個のプライマーの存在下でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により前記DNA断片を増幅し、ここで、前記プライマーの1つがフルオロフォアで標識されており、各DNA断片に結合する所定の数のフルオロフォアを提供すること;
前記増幅されたDNA断片によって生成された蛍光シグナルを検出すること;
前記検出された蛍光シグナルに基づいて、前記増幅されたDNA断片の数を算出すること;
前記増幅されたDNA断片を、蛍光に基づく配列決定に適した所定の濃度に希釈すること;および
蛍光に基づく配列決定技術を使用して、前記増幅されたDNA断片の少なくとも一部分を配列決定すること
を含む方法。 - 前記増幅されたDNA断片によって生成された前記シグナルを検出する前に、
蛍光配列決定の調製において前記増幅されたDNA断片に組み込まれていないプライマーを除去すること
をさらに含む、請求項12に記載の方法。 - 単一のフルオロフォアのみが各DNA断片に結合している、請求項12に記載の方法。
- 前記増幅されたDNA断片により生成されたシグナルを検出することが、蛍光光度計を用いて、前記増幅されたDNA断片に組み込まれたフルオロフォアにより生成された前記蛍光シグナルを検出することを含む、請求項13に記載の方法。
- 既知の平均サイズおよび濃度を有する核酸ライブラリーに由来するDNA断片の数と、前記DNA断片によって生成される蛍光シグナルとの間の関係を示す標準曲線を生成すること
をさらに含む、請求項15に記載の方法。 - 前記検出されたシグナルに基づいて、前記増幅されたDNA断片の数を算出することが、前記検出された蛍光シグナルおよび前記標準曲線に基づいて、前記増幅されたDNA断片の数を算出することを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記増幅されたDNA断片の特徴を決定すること
をさらに含む、請求項12に記載の方法。 - 前記増幅されたDNA断片の特徴が、前記増幅されたDNA断片の平均サイズを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記DNA断片がアダプターを含み、前記プライマーが前記アダプターに相補的である、請求項12に記載の方法。
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