CN105247076B - 使用拼装序列扩增片段化的目标核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供扩增一含有短目标核酸片段的片段化的目标核酸的方法，使用一拼装序列将这些短片段转化为更长的序列，从而鉴定和检测这些序列。这对于试图在高度片段化的核酸样本中鉴定微小的遗传变异，诸如SNVs尤其重要。扩增伴随着所述短目标核酸序列与所述拼装序列的杂交，这些短序列作为延伸的引物。由于含有SNVs的所述片段的目标核酸作为在所述拼装序列上的引物使用，它们在扩增中被保存并且能被检测到。

Description

使用拼装序列扩增片段化的目标核酸的方法

相关申请的交叉引用

本申请是申请日为2013年3月15日、申请号为61/789,984的临时专利申请的非临时专利申请。

关于联邦研究或发展资助的申明

无

以光盘形式提交的相关参考资料

无

发明背景

(1)本发明的领域

本发明涉及扩增一含有短核酸片段的片段化的目标核酸的方法。具体地，使用一拼装模板拼装和延伸这些短核酸以产生用于进一步操作的更大的扩增子。

(2)背景技术描述

有许多样本类型的目标核酸被严重降解，导致标准分子的诊断试验难以检测目标核酸。更具体地，这些目标核酸比所述用于检测它们的试验的“足迹”更短。譬如，为了检测一拷贝数非常低的目标，一般会扩增所述目标。另外，在许多情况下，会期望高度特异地检测所述目标。这一检测常常在一单核苷酸变化的分辨率上。实行扩增时，如PCR反应，存在一正向引物、一反向引物和一检测探针。通常地，这些引物和所述检测探针至少在长度上约为20个核苷酸。假设所述引物和探针不存在部分重叠，那么要求所述目标至少在长度上为60个核苷酸以容纳这三个原件(即所述试验的足迹)的结合。而且，所述将被检测的期望的单核苷酸变化(SNV)可发生于所述目标核酸序列的任何位置。为了可靠地检测，所述单核酸变化必须定位在所述扩增的目标核酸之中(即在所述引物结合位点之内的所述扩增子的一区域之内)以使所述探针选择性地与该区域杂交。这有效地增加所述试验的所述潜在足迹到至少约100核苷酸的长度以用于该种检测。

在很多情况下，检测一在所述目标序列中的已知或未知的SNV要求进行所述检测的片段长达160个核苷酸。这在很大程度上归因于探针、引物和封闭探针在所述扩增子上的排列。

这一需求的挑战在于许多样本类型含有短至20-50个核苷酸长度的片段，通常归因于所述目标DNA或RNA的部分降解。这在RNA序列中是典型的，因为它们更容易降解。这也常见于特殊的样本类型，如尿液、血液样本，和进行甲醛固定石蜡包埋(FFPE)的、细针抽吸(FNA)的样本，其中交联的核酸随着储存变得降解程度更大。在尿液的情况下，由于通过肾脏的处理，核酸天生的以小片段的形式进入尿液。通常地，穿过所述肾脏的核酸片段的大小约为20-50个核苷酸或更小。

因此，需要延伸短目标片段的长度以进行更为有效率和准确的检测。这需要所述被扩大的目标短片段具有与所述短片段原始来源的序列具有相同的序列背景以使得进行适当的处理成为可能。本发明提供了方法以实现这一需要。

发明概要

本发明提供了使用拼装模板扩增一片段化的目标核酸的方法，所述拼装模板结合并延伸一目标核酸的短核酸片段以产生更大的扩增子来进行进一步操作。本发明的一方面是一扩增一含有短目标核酸片段的片段化的目标核酸的方法，因为其长度原因难以使用现有的技术扩增。在一实施方案中，所述片段化的目标核酸与一含有一与所述目标核酸基本上互补、却有显著不同的序列的拼装序列混合。一群短目标核酸片段退火与所述拼装序列结合，所述短目标核酸片段通过聚合酶在3’方向延伸以产生一群含有一群第一核酸和所述拼装序列的第一双重核酸。

所述一群第一双重核酸从所述拼装序列解离，所述一群第一核酸退火与一含有一与所述拼装引物的一区域相同的序列的第一引物结合，所述第一引物位于待检目标区域的5’端(拼装序列的同义链)。在一些情况下，所述引物位点恰好位于所述拼装序列的5’末端。所述引物向其3’端方向衍生一产生一群第二核酸。所述第一和第二核酸解离并又退火与所述拼装序列及自身之间相结合，并通过聚合酶分别向其3’端延伸。重复该步骤，从而在由所述拼装序列的5’端的所述第一引物与同所述拼装序列最接近3’端的大部分区域互补的所述目标核酸片段所产生的边界内延伸并线性扩增所述短片段化的目标核酸。

在第二方面，一旦实现了拼装，所述方法进一步包括，在所述拼装序列存在时通过使用能够检测罕见的遗传事件实验方法对所述目标序列特异性的基因变体的检测。

在一实施方案中所述拼装序列是一野生型拼装序列。

在第二实施方案中，所述拼装序列是基因组DNA或其特异于所述所关注的目标的一部分。在一些实施方案中，所述基因组DNA或其部分是人基因组DNA。在另一些实施方案中，所述基因组DNA或其部分与特定的生物体如病毒、细菌、寄生虫和真菌有关。

在第三实施方案中，所述拼装序列可为所述目标核酸序列的一片段和/或其他任意的但是已知的序列。

在第四实施方案中，所述拼装序列含有突变体和野生型序列的基因变异。在该应用中，一旦经过拼装，突变体(遗传变异序列)或野生型序列就可以用下游的分析方法在一相对于所述拼装序列的野生型序列与一相对于所述拼装序列的基因变异存在时被确定。同样，在平行反应中野生型和基因变异的拷贝的普遍程度和/或拷贝数能够被确定。

在所有情况下，所述拼装序列被设计为通过3’端延伸扩大所述目标核酸的短核酸片段以检测一目标核酸的一区域。

在第六实施方案中，所述拼装序列是双链的。

在第七实施方案中，同时使用正向引物和反向引物在PCR条件下进行所述拼装。

在第八实施方案中，多重线性扩增循环被用于线性地拼装短核酸片段，而不会发生在同时存在正向引物和反向引物时，所述拼装序列在指数扩增条件下扩增。

在第九实施方案中，拼装在更低的温度下进行以帮助短核酸与所述拼装序列杂交，一旦发生拼装，所述扩增温度可被升高，并可添加其他试剂以支持指数扩增。

在第十实施方案中，进行两个拼装反应，一个反应使用一所关注的检测区域3’端的引物，另一个则使用一所关注的检测区域的5’端的引物。一旦在所述两个分开的反应混合物中发生拼装，可以将它们结合用正向和反向引物进行指数扩增。

在第十一实施方案中，当所述片段化的核酸浓度更高时，所述拼装反应可与聚合酶链式反应(PCR)同时进行。

在另一实施方案中，所述拼装序列超过所述用于拼装的核酸片段预期浓度的10、100、1000、10000或100000倍。

本发明的其他方面参见于所述说明书的全文中。

图片简述

图1是本发明中一个方面的示意图。

除非另有说明，此处所用的所有术语都与本发明所属的本领域技术人员所通常理解的含义相同。此处公开全文所引用的所有专利、专利申请和出版物都以它们全文的形式被引用。若此处的某一术语含有多重的定义，则以本部分最通常的定义为准。

此处所用术语“寡核苷酸”指核苷酸的一聚合物形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核酸，含有天然或非天然的核苷酸，长度至少为2，通常在约5至约200，或者更常见地至约100。因此，该术语包含双链和单链DNA和RNA。此外，寡核苷酸可抗核酸酶，包括但不限于2’-O-甲基核糖核苷酸、硫代核苷酸、二硫代核苷酸、磷酰胺核苷酸和甲基膦酸酯核苷酸。

此处所用术语“目标”、“目标序列”或者“目标核苷酸”指一含有一所关注的多聚核苷酸的核酸，需要对其进行纯化、分离、捕获、固定、扩增、鉴定、检测、定量、质量测定和/或测序以及类似操作。所述目标序列就其实际序列而言可已知或未知，并且可以是合成的或获取自一生物样本。

此处所用术语“引物”或“引物序列”是指含有挑选到的与将扩增的每一特定序列基本上互补的序列的核酸。更具体地，引物是与它们相应的目标杂交充分互补的。因此，所述引物序列不需要准确地反映所述目标的精确的序列。所述引物中可散布非互补碱基或更长的序列，只要所述引物序列与所述目标核酸的序列具有足够的互补性以允许杂交和延伸。

此外，引物可抗核酸酶并包括经过修饰以阻止核酸外切酶降解的引物。在一些实施方案中，所述引物已经过修饰以保护不被3’或5’端核酸外切酶的活性所降解。这些修饰包括但不限于2’-O-甲基核糖核苷酸修饰、硫代骨架修饰、二硫代骨架修饰、磷酰胺骨架修饰、甲基膦酸酯骨架修饰、3’端磷酸修饰和3’烷基取代。在一些实施方案中，在一扩增反应中施用的所述引物和/或探针通过一种或多种修饰保护不被3’或5’端核酸外切酶的活性所降解。

技术人员能够设计和准备适于延伸一目标序列的引物。此处提供的应用于所述方法和组分的引物的长度取决于多种因素，包括鉴定所述核苷酸序列特性及这些核酸在杂交或在体外核酸延伸时的温度。对具备通常手段的人员而言，其知晓决定上述针对具有一特定序列特性的所述引物的优选长度所要考虑的事宜。

此处所用术语“封闭子寡核苷酸”或“封闭子”指结合于一核酸的一修饰的寡核苷酸或试剂，或结合于一修饰的核酸的试剂，所述封闭子能够阻止或抑制复制并且其在一扩增反应中与引物和/或探针相融合。阻塞子核苷酸可包含2’氟代(2’-脱氧-2’氟代-核苷)修饰、抗核酸酶核苷酸或者3’端带有抑制或阻止复制的修饰的核苷酸。

此处所用术语“样本”指本质上任何含有所期望的目标核酸的样本，包括但不限于分离自一人或一动物的组织或体液，包括但不限于，譬如，血液、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、眼泪或唾液、尿液、精子、粪便、痰液、呕吐物、胃吸出物、支气管吸出物、棉签拭样(鼻咽的、直肠的、眼的、泌尿生殖器的等)、器官、肌肉、骨髓、石蜡包埋组织、皮肤、肿瘤和/或获取自所述生物体任何部分的细胞；植物材料、细胞、液体等；一单独的细菌、菌群及其培养物、食物、化妆品、药品/药物、通过生物工艺准备的材料(终产品和中间材料)、水、环境样品，包括但不限于，譬如，土壤、水和空气；从以上所列所述来源中获得的半纯化或纯化的核酸，诸如，作为一过程的结果的核酸，如测序的模板形成，包括下一代测序、样本处理、核酸酶消化、限制酶消化、复制或类似。

此处所用术语“扩增”指产生与一完整的目标核酸序列或其一部分或作为所述目标核酸序列的一替代物的通用序列的相同或互补的核酸链的过程。

此处所用术语“核酸”指一多核苷酸化合物，其包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包括核苷或含有含氮杂环碱基或其碱基类似物的核苷类似物，通过标准磷酸二酯键或其他键合共价连接而成。核酸包括RNA、DNA、嵌合的DNA-RNA聚合物及其类似物。在一核酸中，所述骨架由多种键合方式构成，包括一个或多个糖-磷酸二酯键、肽核酸键(PCT No.WO 95/32305)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或其组合。在一核酸中，糖部分可为核糖、脱氧核糖或带有如2’甲氧基和2’卤素(如2’-F)取代基的相似化合物。

含氮碱基可为传统的碱基(A、G、C、T、U)，诸如异胞嘧啶和异鸟嘌呤的非天然核苷酸及其类似物(如肌苷，The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36,Adams et al.,ed.,1lth ed.,1992)，嘌呤和嘧啶碱基的衍生物，如N4-甲基脱氧鸟苷、氮杂或吖嘌呤、氮杂或吖嘧啶、在任意一系列化学位上有改变或取代的取代基的嘌呤或嘧啶，例如2-氨基-6甲氨基嘌呤、O⁶-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲肼-嘧啶及O⁴-烷基-嘧啶或者吡唑啉酮化合物，如非取代或3-取代吡唑啉酮[3,4-d]嘧啶(如U.S.Pat.Nos.5,378,825,6,949,367和PCT No.WO 93/13121)。

此处所用术语“杂交”、“退火”指在合适的条件下，通过Watson&Crick碱基配对，具有与基本上互补的序列的核酸互相结合的能力。核酸退火或杂交技术在本领域为已知。参见，例如，Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.(1989)；Ausubel,F.M.,et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Secaucus,N.J.(1994)。此处所用术语“基本上互补”指与所结合的核酸完全互补，在某些情况下指一条相同的序列，以及互补性足够达到与所期望的核酸结合。相应地，术语“互补杂交”包括基本上互补杂交。

通常的扩增核酸序列的方法已在本领域被充分描述并且众所周知。任何这样的方法都可以与本发明所述的方法一起施用。在一些实施方案中，用数字PCR方法进行所述扩增，如文献中所描述，譬如，Vogelstein和kinzler(“Digital PCR，”PNAS,96:9236-9241(1999)，此处引用其全文作为参考)。这些方法包括在扩增所述目标区域前，稀释含有所述目标区域的所述样本。稀释可包括稀释到传统的平板、多孔板和纳孔中，以及稀释到微板和微滴上。(参见，如，Beer NR,et al“On-chip,real time,single copy polymerase chainreaction in picoliter droplets,”Anal.Chem.79(22):8471-8475(2007)；Vogelsteinand Kinzler，“Digital PCR,”PNAS,96:9236-9241(1999)；和Pohl and Shih,"Principleand applications of digital PCR,”Expert Review of Molecular Diagnostics,4(1):41-47(2004)，此处引用其全文作为参考)。在一些实施方案中，所述扩增通过数字PCR进行。

在一些实例中，用本发明所示方法扩增所述目标区域的所述酶包括但不限于高保真DNA聚合酶，譬如有3’-5’端核酸外切酶校正能力的DNA聚合酶。能够用于所述方法的酶包括但不限于AmpliTaq、Phusion HS II、Deep Vent和Kapa HiFi DNA聚合酶。

高保真酶能够使一目标序列高保真(高精确)扩增。在一些实施例中，所用的酶包括高保真DNA聚合酶，譬如有3’-5’端核酸外切酶校正能力的DNA聚合酶。能够用于所述方法的酶包括但不限于AmpliTaq、Phusion HS II、Deep Vent和Kapa HiFi DNA聚合酶。

所述扩增产物能通过使用一些本领域技术人员知晓的方法进行检测或分析，这些方法包括但不限于，荧光、电化学检测、凝胶分析和测序。进一步地，所述产物能使用本领域技术人员知晓的一些方法如实时扩增进行定量。定量能够通过与所谓管家基因，如肌动蛋白、GAPDH或与在可以所述反应中加入的已知量的一内参相比较进行标准化。这些方法是已知的，并且在Sambrook和Russell的Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Ed.)(2001)中描述。

用仪器来实施此处所述的方法可以随时进行。这些仪器可包括进行实时和终点PCR试验、乳剂PCR、固相PCR、熔解曲线分析和测序分析的仪器。这些仪器包括7500Fast Dx实时仪器(其还能够进行高分辨熔解曲线分析)(Life Technologies，Carlsbad，USA)和所述3500xl毛细管凝胶仪。其他本领域所已知的将有益于本发明所述方法的仪器也应被本领域技术人员在实施本发明的所述方法时考虑在内加以使用。

本发明提供了利用一种拼装模板来扩增一片段化的目标核酸的方法，所述拼装模板结合并延伸一目标核酸的短核酸片段以产生更大的扩增子用于进一步的操作和分析。所述目标核酸片段可为DNA、RNA或两者的结合。

在本发明的一方面，一拼装引物或拼装序列被用于将短核酸片段转化为更长的序列从而鉴定和检测它们。这在高度片段化的核酸样本中试图鉴定诸如SNVs的微小遗传变异时尤为重要。这通过所述所关注的短目标核酸片段序列与更长的拼装序列杂交而实现，其中所述短序列作为延伸的引物。由于含有SNVs的所述片段化的目标核酸被用作所述拼装序列上的引物，所述SNVs被保护并能够被检测。

譬如，本发明的方法提供了含有短核酸片段的一片段化的目标核酸的扩增，其由于长度原因用现有技术难以扩增。所述片段化的目标核酸和一含有与所述目标核酸基本上互补，但是又显著地与所述目标核酸不同的序列的单链拼装序列混合。一群短目标核酸片段退火与所述拼装序列杂交，所述短目标核酸片段通过聚合酶在3’端方向延伸以产生一群含有一群第一核酸和所述拼装序列的第一双重核酸。

所述一群第一双重核酸从所述拼装序列解离。所述一群第一核酸退火与一含有一与所述拼装引物的一区域相同的序列的第一引物结合，所述第一引物位于待检目标区域的5’端(拼装序列的同义链)。譬如，如果所关注的区域是与所述EGFR基因的与医学意义相关的多种突变，则所述第一引物要被选在所述EGFR基因区域的5’端(拼装序列的同义链)，使得这些相对于所述第一引物处于3’端位置的序列能够被检测。。在一些实例中，所述第一引物位点正好位于所述拼装序列的5’端。所述第一和第二核酸解离，所述第一和第二核酸退火后相互结合，通过聚合酶从其3’端延伸。类似地，所述第一核酸也能退火与所述拼装序列结合，在此情况下所述第一核酸通过聚合酶从其3”端延伸。相似地，所述第一引物也能退火与所述第一核酸结合，在此情况下所述第一引物通过聚合酶从其3’端延伸。

重复该步骤，从而在由所述拼装序列的5’端的所述第一引物与同所述拼装序列最接近3’端的大部分区域互补的所述目标核酸片段所产生的边界内延伸并线性扩增所述短片段化的目标核酸。数轮线性扩增(例如10-15轮或更多)可以按需要实施。相应地，延伸的和再延伸的序列也能自己重新结合，也能与所述拼装序列结合以延伸它们的长度并产生更大的目标核酸序列。如果所述引物不是始终位于所述拼装序列的3’端，一些所述目标核酸片段的延伸产物将会长于上述的边界。

如果需要让短目标核酸片段稳定地结合所述拼装序列，起始的所述目标核酸片段与所述拼装序列(或多个序列，如果两条链都存在时)退火的步骤可以在更低的温度下进行。在上述的延伸的起始的一轮或多轮结束后，所述温度能够被升高以完成上述的过程。

本发明的另一方面，也提供与所述第一引物负义的第二引物，其方向为要被检测的所述目标核酸区域的3’端(拼装序列的同义链)。然而，所述第二引物不能够比所述混合物中的最靠近3’端的片段更加靠近3’端。所述方法如上述进行，但是现在所述第二引物将与长度足够跨越所述第二引物结合位点的第二核酸结合。另外，长度变得足够跨越两个引物位点的拼装片段将被指数扩增。

该方法的另一个方面，所述拼装序列是双链的。这时，所述拼装序列被变性，所述目标核酸片段退火与所述拼装序列的互补链结合(即，如果所述片段是负义，它们将退火与所述拼装序列的所述正义链结合，反之亦然)。所述方法将按上述进行以产生第一和第二核酸(如果片段的正负义出现，第一核酸的正义链和负义链都会产生；然而，如果所述第一引物是正义，只会产生正义的第二核酸)。这时，所述第一和第二核酸解离并退火相互结合(由正义和负义的互补所指引)，和/或所述第一核酸退火与所述拼装序列的正链结合，和/或所述第二核酸与所述拼装序列的负链结合，和/或所述第一引物会与所述第一核酸结合(与之相反义的链)且所述第一和第二核酸和所述第一引物通过聚合酶向它们各自的3’端延伸。重复该步骤，从而延伸和线性扩增所述短片段化的目标核酸。

该方法的另一个方面，所述拼装序列是双链的，并且在该过程中还使用一第二引物。该第二引物在设计与使用上相对于所述第一引物类似，但相对于所述拼装序列的另一条链设计，所述拼装序列的另一条链现在所述反应混合物中存在。所述过程按上述进行，不同在于会产生正义和负义的第二核酸，并且所述两条第二核酸将与所述拼装序列的所述链义相反的链结合，而所述第二引物将与链义适合的第二核酸结合。重复所述解离、退火和延伸的步骤将延伸和线性扩增所述片段。另外，当所述第一和第二引物同时存在时，被拼装的、变得长度足够跨越两个引物位点的片段将指数扩增。

在所述方法的另一个方面，用到了所述拼装序列的所述正义链和负义链，但是所述延伸和线性扩增所述目标核酸片段的方法在两个不同的管中进行，一个含有所述正义拼装序列和一正义第一引物，一个含有所述负义拼装序列和一负义第二引物。在所述反应完成后，所述试管的内容物可分别操作(如指数扩增)或者结合在一起操作(如指数扩增)。

在所述方法的另一个方面，按上述任一的所述拼装序列的方法，在所述待检测的目标核酸的所述边界内能够自发地进行一个或多个PCR反应或者一个或多个额外的含有引物对的PCR反应(如果已有一第一和第二引物)。

在上述各方面中，所述一条或多条拼装链优选地比所述目标核酸片段多10、100、1000、10000、100000或更多倍。在一些情况下，不超过10倍。在一些情况下，所有或部分所述片段含量超过所述拼装序列。

所述拼装序列与所述片段化的目标核酸来源于相同的遗传物种并且高度相关。譬如，如果所评估的所述片段化的目标核酸是人源的，在所关注的区域内所述拼装序列将含有紧密相关的基因组目标序列。在一些情况下，所述拼装序列为人基因组DNA或其部分。在另一些情况下，所述拼装序列和为与特定的生物体相关的基因组DNA或其部分，诸如病毒、细菌、寄生物和真菌的。在一些情况下，所述拼装序列是一任意的但已知的序列。

所述拼装序列可从天然的或合成的序列中制备。天然序列包括，譬如基因组DNA、mRNA、质粒DNA和使用DNA合成获得的DNA或其类似物。合成序列可为制备得到的DNA、RNA或其类似物，能达到DNA或RNA聚合酶延伸反应的模板的要求。在一实施方案中，人基因组DNA被用作所述拼装序列。在其他实施方案中，使用DNA合成或克隆方法获得一人源序列等同物。典型地，所述拼装序列可含有所述野生型和突变体序列的轻微的遗传变异，但是保留了足够高的序列互补性以与所述片段化的目标核酸杂交，从而保持所述片段化的目标核酸的所述基因序列区域的特异性。

在另一实施方案中，所述拼装序列是一野生型序列，不含有诸如SNVs的罕见的突变。使用一野生型拼装序列能可靠地检测这些突变。在每种情况下，所述片段化的目标核酸序列有适当的互补性使其可以高特异性地与所述拼装序列杂交。

一旦按照本发明的所述方法发生了拼装，所述目前更长的目标核酸的分析能够使用本领域已知的很多方法进行，可以是基于非扩增的和扩增的方法，并包括设计来检测罕见的遗传事件和罕见的变体的方法。

如果用于所述拼装目标核酸的后续分析的方法是基于扩增的，譬如基于PCR，所述拼装序列的扩增可通过记载于U.S.Pat.APP.NO.WO/2012/151560的一Selector试验抑制。所述Selector试验使用一封闭子抑制野生型序列，同时最小化地影响突变序列的扩增。实施该试验能够在“野生型”背景中检测到罕见的突变，其占存在的所述目标物种中的0.1-0.01％甚至更少。因此使用所述Selector试验，普遍性在1∶10000至1至100000范围的突变位点都能被检测到。所述Selector试验可用于抑制所述拼装序列的扩增，无论它是一野生型序列或一野生型序列的变体，只要所述拼装序列已知的或者能够被确定。

在一些情况下，与所述目标核酸序列相比，所述拼装序列含有一个或多个SNVs。在另一后拼装分析方法中，一种类Selector的试验可用于抑制所述拼装序列的扩增，而允许与所述短目标序列相关的SNVs的扩增，而一单独的试验可用于检测所述野生型序列，上述试验都需要在抑制所述拼装序列时进行。如果想知道野生型和突变体的数量有多少，可以制备一与突变体和野生型均存在错配的拼装序列。可以拼装可能的突变体序列和可能的野生型序列。所述拼装序列拼装两者。施用一Selector试验(或等同物)抑制所述拼装序列，但是不抑制所述突变体或所述野生型。然后施用等位基因特异性的Selector试验以确定在每个SNV位点上突变体的数量和野生型的数量。使用一和所述被拼装的序列不同的、对所述拼装序列区域(即发现一个或几个核苷酸基因变异的区域)具有特异性的封闭寡聚物来实现抑制。

在有所述拼装序列或多个拼装序列、或者从所述混合物中选择性地移除所述拼装序列或多个拼装序列时进行后拼装分析方法，在有或者无所述结合序列或多个拼装序列的减少水平下进行分析。通过越来越多的所述目标核酸和所述拼装序列或多个拼装序列之间的区别，这对所述目标核酸的分析产生了进一步的益处。从所述目标核酸序列分离所述拼装序列或多个拼装序列的方法包括但不限于，譬如，使用本领域已知的方法按照大小分离(如凝胶电泳、离心柱、磁力小珠纯化技术、过滤和沉淀)，当目标核酸和拼装序列存在可区分的大小区别时，或者，用诸如生物素和链霉亲和素(譬如，所述拼装序列或多个拼装序列能用生物素提前标记，且拼装后，使用链霉亲和素包被的微粒进行特异性捕获从所述混合物移除)、地高辛和抗地高辛抗体(譬如，所述拼装序列或多个拼装序列能用地高辛提前标记，且拼装后，用抗地高辛抗体包被的微粒进行特异性捕获从所述混合物移除)、或特异性核酸序列捕获(譬如，在所述拼装序列中的、不与所述目标核酸序列相关的一序列或多个序列能与微粒上的所述互补序列或多个互补序列结合，从所述反应混合物中移除)进行特异性分离。可选择地，所述被拼装的目标核酸序列能在所述拼装过程中进行标记，譬如，通过标记的核苷酸三磷酸盐或一标记的引物。

上述的信息为本领域技术人员提供一完整的披露，并描述了如何制造和使用所述仪器和方法的实施方案，且其意图并不限于发明人在其发明中提及的范围。对于上述模式的修改(对本领域技术人员而言实施所述发明是显而易见的)被确定为在下述权利要求的范围内。在本说明书中所引用的所有的出版物、专利和专利申请均被包含作为参考。譬如，在所述不同的方法中所引用的许多所述清洗的步骤是可选择的，就如一些将两条核酸链相互去除和/或分开的步骤。不实施所述清洗和/或分离步骤的至少一些步骤会使得工作流程更快速、更简单和更经济，并且也能达到所期望的结果。在另一实例中，在所述已例证的方法中逐步地增加/结合某些寡核苷酸和/或目标核酸也能被结合。进一步地，多种聚合酶、延伸条件和其他本领域技术人员已知的扩增方法能在上述方法中的不同的步骤或步骤组合中来使用。其他对本领域技术人员而言对所公开的方法明显的改进也包括在本发明中。

Claims (3)

1.一扩增含有短目标核酸片段的一片段化的目标核酸的方法，所述方法包括步骤：

A.混合所述片段化的目标核酸和一拼装序列，其中所述拼装序列与所述片段化的目标核酸互补，所述拼装序列与所述片段化的目标核酸来源于相同的遗传物种并且高度相关；

B.所述短目标核酸片段退火与所述拼装序列结合，通过聚合酶所述短目标核酸片段在3’端方向延伸以产生一群含有一群第一核酸和所述拼装序列的第一双重核酸；

C.从所述一群第一核酸解离所述拼装序列；

D.一引物退火与所述一群第一核酸结合，其中所述引物与所述拼装序列相同，且位于相对于相结合的核酸片段的3’端方向的所关注的检测区域，用聚合酶在所述3’端方向延伸所述引物以产生一群含有一群第二核酸和所述一群第一核酸的第二双重核酸；

E.分离所述的所述第一和所述第二核酸群；

F.退火所述第一群和所述第二群核酸使其相互结合和与所述拼装序列结合，在3’端方向延伸所述一群第一核酸和所述一群第二核酸；且

G.重复步骤E和F，从而扩增所述片段化的目标核酸。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述拼装序列是一野生型拼装序列。

3.一扩增和检测含有与短目标核酸片段的一片段化的目标核酸的方法，所述方法包括步骤：

A.在一含有短目标核酸片段和一拼装序列的混合物中所述短目标核酸片段退火与所述拼装序列结合，其中所述拼装序列与所述片段化的目标核酸互补，通过聚合酶在所述3’端方向延伸所述短目标核酸片段以产生一群含有一群第一核酸和所述拼装序列的第一双重核酸，任选地从所述拼装序列解离所述一群第一核酸；

B.一引物退火与所述一群第一核酸结合，其中所述引物与所述拼装序列相同，且位于相对于相结合的核酸片段的3’端方向的所关注的检测区域，用聚合酶在所述3’端方向延伸所述引物以产生一群含有一群第二核酸和所述一群第一核酸的第二双重核酸；

C.退火所述第一群和所述第二群核酸使其相互结合和与所述拼装序列结合，在3’端方向延伸所述一群第一核酸和所述一群第二核酸；且

D.重复步骤B和C，从而扩增所述片段化的目标核酸；且

E.使用一能够检测低至单核苷酸水平的遗传变异的试验检测所述扩增的目标核酸。

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