CN105209639B - 在固相载体扩增核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用一固相载体从一核酸的混合物中扩增一核酸的方法。所提供的方法使用用户定义的引物寡核苷酸来进行定向扩增。同时所提供的方法还使用封闭子和取代子寡核苷酸来产生长度限定的扩增的目标核酸。一样本被施用于所述固相载体，所述样本中的所述目标核酸与一固定于一固相载体的第一寡核苷酸结合。含有一目标结合区域和一聚合酶启动子序列的一引物序列退火与所述被结合的目标核酸结合，延伸产生一第一双重核酸。所述目标序列移除后，留下与一固定于一固相载体的第二寡核苷酸结合的一第一核酸。所述第二寡核苷酸延伸以产生一含有一第二核酸的第二双重核酸，所述第二核酸通过添加一聚合酶扩增。

Description

在固相载体扩增核酸的方法
相关申请的交叉引用
本申请是申请日为2013年3月14日、申请号为61/781,356的临时专利申请的非临时专利申请。
关于联邦研究或发展资助的申明
无
以光盘形式提交的相关参考资料
无
背景技术
(1)发明领域
本发明与纯化、固定和扩增核酸的方法有关，尤其是，使用一固相载体扩增核酸。
(2)相应技术描述
对于本领域技术人员而言，已知有许多纯化和扩增核酸的方法。然而，这些方法缓慢、冗长、昂贵并且难以实行自动化和生产化。并且它们在灵敏性、特异性、准确性、精确性，和否则能使它们成功应用于许多不同的应用所需的特质中表现欠佳。这些方法通常复杂，需要将目标核酸从样本中分离出来，准备扩增的目标，实行扩增并检测扩增的产物。在一些应用中，还可能包括为测序如下一代测序准备模板，和对目标核苷酸进行测序。在很多方法中，还需要一或多步纯化的步骤。所有这些步骤增加了操作的时间、花费、复杂度和劳动量。提供具备诸如特异性、灵敏性、选择性、准确性和精确性等多种优势的方法十分重要。这些方法快速、高效、易于使用，实验步骤和用于容易地从一个原始样本中获得一期望的分离和扩增的产物的试剂的用量都是最少的。这些产物可能为可作为用于立即测序或下一代测序的模板的扩增的核酸或者一组扩增的核酸(即多重反应，包括高度的多重反应)，溶解于溶液中或在固相载体上。此外，保持链方向的定向扩增方法在测绘和更精确的定量测量中(如基因表达水平)提供了合适的序列排列。另外，这些方法能够与本领域已知的广泛的核酸扩增方法一起使用。此外这些方法也能够与标签序列合用。本发明提供了从样本中纯化、固定和扩增特异的核酸的方法，克服了本领域技术中现有的很多不足之处。
发明概要
本发明提供了在固相载体上固定和扩增核酸的方法。更具体地，是一种从含有核酸混合物的样本中固定和扩增期望的一核酸或一些核酸(多重反应)的方法。
本发明的一方面是，所述方法提供与一固相载体或可选择地与分别的固相载体相连的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。所述第一寡核苷酸被封闭以防止3’端的延伸，并且具有与一目标核酸的一第一部分相互补的序列。所述第二寡核苷酸具有一与所述目标核苷酸的一第二部分相同的序列。一样本被施用于所述固相载体，并且所述样本中的目标序列与所述第一寡核苷酸结合。然后洗涤所述固相载体以去除未结合的核酸以及所述样本中的其他组分。包括一目标结合区域和一含有聚合酶启动子序列的标签区域的一引物退火后与结合的目标核苷酸结合。通过聚合酶引物延伸产生一第一双重核酸。所述目标序列从所述第一双重核酸移除，产生一未被结合的第一核酸。所述第一核酸退火与所述第二寡核苷酸结合，并且所述第二寡核苷酸通过聚合酶延伸，产生一包括一第一核酸和一第二核酸的一第二双重核酸。通过向所述固相载体加入特异于启动子序列的聚合酶产生了一多拷贝的第三核酸的，以此来扩增所述目标核酸。
在第二实施方案中，所述引物可与所述样本和固相载体相连，从而所述引物与所述目标杂交，同时所述目标与所述第一寡核苷酸杂交。然后洗涤所述固相载体以去除未被结合的核酸和引物以及所述样本中的其他组分。
在第三实施方案中，所述方法还包括可以额外扩增所述期望的目标核酸的步骤。在这些步骤中，所述多拷贝的第三核酸与所述第二寡核苷酸在所述固相载体上结合。所述第二寡核苷酸通过聚合酶延伸产生一第三双重核酸。所述第三核酸从所述第三双重核酸上分离产生一与所述固相载体相结合的一第四核酸。所述引物序列退火后与所述第四核酸结合，并且所述引物和所述第四核酸均通过聚合酶延伸产生包括一第五核酸和额外的第二核酸的一第四双重核酸。所述第四双重核酸与一特异于在所述第四双重核酸上的一启动子的聚合酶孵育，产生额外的多拷贝的所述第三核酸。根据该实施方案，所述第三核酸可被进一步扩增。
在第四实施方案中，所述引物包括一含有一个或多个非天然核苷酸，如异胞嘧啶(isoC)和/或异鸟嘌呤(isoG)的标签序列以提高与所述目标核酸结合的特异性并减少其余核酸的扩增。
在第五实施方案中，四个不同的第二寡核苷酸可与所述固相载体相连，四个不同的第二寡核苷酸各含有一位于3’末端的不同的核苷酸以及与在一特定的单核苷酸多态性(SNP)位点上的所述第一核酸相连的序列。在此形态下，扩增可被应用于在单个实验中鉴定所有四个可能的SNP。
在第二方面，为后续操作提供了一片段核酸目标的方向性扩增，如测序。在一实施方案中，一样本与一第一引物施用于一固相载体。所述第一引物含有在3’端含有约3至9个核苷酸的随机序列以及在5’端的一第一标签序列，用以决定所述片段化的核酸目标的方向。提供了与固相载体结合的第一和第二寡核苷酸，其可与相同的固相载体结合或，可选择地，与不同的固相载体固定。所述第一寡核苷酸任选地被封闭以阻止可能的核酸外切酶酶切，如在5’端的酶切，并且含有一与所述片段化的核酸目标的一部分互补的序列。可选择地，所述第一寡核苷酸含有一序列(譬如，一随机或半随机序列)使得所述片段化的核酸目标的一些片段得到固定。所述第二寡核苷酸序列与所述第一引物的所述标签序列中至少一部分互补。
所述第一引物退火后与所述片段化的核酸目标结合，所述结合的片段化的核酸目标退火后与所述第一寡核苷酸结合。洗涤所述固相载体以清除未被结合的样本和第一引物。所述第一引物序列通过聚合酶延伸以产生含有所述片段化的核酸目标和一第一核酸的一第一双重核酸。
所述片段化的核酸目标从所述第一双重核酸移除以产生一第一核酸。所述第一核酸退火后与所述第二寡核苷酸结合，并且一第二引物添加至所述固相载体。所述第二引物含有一3’末端为大约6～9个核苷酸、5’末端有一第二标签序列的随机序列，其可含或不含与所述第一引物中的所述第一标签序列中发现的原件相同或相似的原件。所述第二引物退火后与所述第一核酸结合，通过聚合酶延伸以产生一含有所述第一核酸和一第二核酸的第二双重核酸，所述第二核酸在3’末端含有一第一标签序列且在5’末端含有一第二标签序列。
所述第二核酸进一步扩增以产生一目标核酸，其含有决定所述核酸目标方向的标签序列。
在这方面的一个实施方案中，所述第一引物可进一步含有一条形码序列作为标签序列的一部分进一步辅助鉴定和定向。
在第三方面，提供了一方法，其中所述第一引物含有与所述目标核酸互补的序列，并且固定在一固相载体上。在一实施方案中，取代子和封闭子寡核苷酸被应用。所述取代子寡核苷酸与所述核酸目标在所述目标序列的一位点上杂交，所述位点位于一条或多条结合在同一核酸目标上的寡核苷酸的3’端。当所述取代子通过聚合酶延伸，所述增长的延伸产物与所述另外结合的一条或多条寡核苷酸相遇，并将其连同任何由所述结合的一条或多条寡核苷酸所启始的延伸产物一起取代。在这一实施方案中，所述取代子寡核苷酸有一与所述目标核酸的第二部分互补的序列，所述第二部分在所述第一位置的3’端处。所述封闭子有一与所述目标核酸的第三部分互补的序列，所述第三部分在所述第一部分的5’端处。这些寡核苷酸和所述目标核酸被应用于所述固相载体。所述取代子和封闭子寡核苷酸退火后与所述目标核酸结合，通过与所述第一引物的杂交，所述退火的目标被固定于所述固相载体上。
所述固相载体被洗涤以除去未结合的核酸和所述样本的其他成分。所述第一引物通过聚合酶延伸。延伸在所述封闭子寡核苷酸处终止，以产生一长度限定的第一双重核酸。所述取代子寡核苷酸也通过聚合酶延伸，以取代所述第一双重核酸中的所述目标链。延伸在所述封闭子寡核苷酸处终止，以产生一含有未与所述固相载体结合的、长度限定的一第二核酸的第二双重核酸。
一第二引物退火后与所述第一核酸结合，并通过聚合酶延伸以产生一含有所述第一核酸和一第三核酸的一第三双重核酸。然后所述第二和第三双重核酸解离，如通过高温变性或者本领域已知的其他合适手段。所述第二引物退火后于所述第一核苷酸结合，延伸以产生更多的所述第三双重核酸。
所述第三核酸通过杂交与固定到所述固相载体上的未被结合的第一引物。所述第一引物通过聚合酶延伸产生更多的第三双重核酸。与取代子和封闭子相结合的所述原始目标核酸，退火后与所述固相载体上未被结合的第一引物结合。所述第一引物通过聚合酶延伸以产生更多的第一双重核酸。所述取代子寡核苷酸也延伸，从所述第一双重核酸上取代所述目标核酸。延伸在所述封闭子寡核苷酸处终止以产生一第二双重核酸，其含有一长度限定的且不与所述载体结合的第二核酸。
所述第二引物退火后与所述第二核酸杂交，通过聚合酶延伸以产生一含有所述第二核酸和一第四核酸的第四双重核酸。然后所有的双重核酸都变性，并根据需要重复上述循环以扩增所述目标核酸。
在这方面的一实施方案中，所述核酸目标为双链，并且两条链都被固定和扩增。根据上述的方法，为每条链准备一引物和，任选地，一取代子和/或一封闭子。若使用单个载体，则目标核酸的每条链的引物均固定于一固相载体上；若使用两个载体，则每个载体上固定一引物。每条目标链与所述含有一与所述目标核酸链互补的序列的引物通过杂交而固定。所述引物通过聚合酶延伸以产生一cDNA，然后移除所述目标核酸链。若使用的是一取代子，则移除通过取代进行；若不使用一取代子，则移除通过高温变性进行，或者本领域已知的一些其他合适的方法。这时，所述为所述目标核酸链之一设计的引物能够被用作所述第二引物，从所述另一目标核酸链获得所述cDNA，反之亦可。所述cDNAs与它们各自的第二引物结合(也就是说，所述相反目标核酸链的所述第一引物)，所述第二引物通过聚合酶延伸，结果产生的双重核酸被解离。为扩增所述目标核酸根据需要重复上述的过程。
本发明的其他方面在说明书全文中说明。
图片简述
图1：(A)是一本发明方法之一的示意图，(B)显示了可被包含于图1A所述方法的额外步骤。
图2：是一使用一含有非天然核苷酸以增加选择度并降低非期望核酸序列扩增的引物的本发明另一方法的示意图。
图3：是一使用一含有标签序列以在扩增后确立所述目标寡核苷酸定向的引物的本发明另一方法的示意图。
图4：是使用封闭子和取代子以准备扩增长度限定的核酸目标的本发明另一方法的示意图。
图5：是使用一桥形构象的结合所述目标核酸的cDNAs的所述第一和第二链的第一和第二固定寡核苷酸的本发明另一方法的示意图。
图6：是使用PCR的本发明另一方法的示意图。
图7：是本发明另一方法的示意图，其中在所述方法起始时所述第一固定寡核苷酸和封闭子寡核苷酸同时与所述目标核酸结合。
发明详述
除另外别说明，此处所用的所有术语都与本发明所属的本领域技术人员所通常理解的含义相同。此处公开全文所引用的所有专利、专利申请和出版物都以它们全文的形式被引用。若此处的某一术语含有多重的定义，则以本部分最通常的定义为准。
此处所用术语“寡核苷酸”指核苷酸的一聚合物形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核酸，含有天然或非天然的核苷酸，长度至少为2，通常在约5至约200，或者更常见地至约100。因此，该术语包含双链和单链DNA和RNA。此外，寡核苷酸可抗核酸酶，包括但不限于2’-O-甲基核糖核苷酸、硫代核苷酸、二硫代核苷酸、磷酰胺核苷酸和甲基膦酸酯核苷酸。
此处所用术语“目标”、“目标序列”或者“目标核苷酸”指一含有一所关注的多聚核苷酸的核酸，需要对其进行纯化、分离、捕获、固定、扩增、鉴定、检测、定量、质量测定和/或测序以及类似操作。所述目标序列就其实际序列而言可已知或未知，并且可以是合成的或获取自一生物样本。
此处所用术语“引物”或“引物序列”是指含有挑选到的与将扩增的每一特定序列基本上互补的序列的核酸。更具体地，引物是与它们相应的目标杂交充分互补的。因此，所述引物序列不需要准确地反映所述目标的精确的序列。所述引物中可散布非互补碱基或更长的序列，只要所述引物序列与所述目标核酸的序列具有足够的互补性以允许杂交和延伸。
此外，引物可抗核酸酶并包括经过修饰以阻止核酸外切酶降解的引物。在一些实施方案中，所述引物已经过修饰以保护不被3’或5’端核酸外切酶的活性所降解。这些修饰包括但不限于2’-O-甲基核糖核苷酸修饰、硫代骨架修饰、二硫代骨架修饰、磷酰胺骨架修饰、甲基膦酸酯骨架修饰、3’端磷酸修饰和3’烷基取代。在一些实施方案中，在一扩增反应中施用的所述引物和/或探针通过一种或多种修饰保护不被3’或5’端核酸外切酶的活性所降解。
技术人员能够设计和准备适于延伸一目标序列的引物。此处提供的应用于所述方法和组分的引物的长度取决于多种因素，包括鉴定所述核苷酸序列特性及这些核酸在杂交或在体外核酸延伸时的温度。对具备通常手段的人员而言，其知晓决定上述针对具有一特定序列特性的所述引物的优选长度所要考虑的事宜。
术语“载体”或“固相载体”指传统的载体，其包括，如微量滴定孔、玻璃粉、微粒或纤维的聚合物，和诸如载玻片、试管等捕获分子，如所述第一和第二寡核苷酸与之共价键或非共价键结合的硅烷或硅酸盐载体。
此处所用术语“样本”指本质上任何含有所期望的目标核酸的样本，包括但不限于分离自一人或一动物的组织或体液，包括但不限于，譬如，血液、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、眼泪或唾液、尿液、精子、粪便、痰液、呕吐物、胃吸出物、支气管吸出物、棉签拭样(鼻咽的、直肠的、眼的、泌尿生殖器的等)、器官、肌肉、骨髓、石蜡包埋组织、皮肤、肿瘤和/或获取自所述生物体任何部分的细胞；植物材料、细胞、液体等；一单独的细菌、菌群及其培养物、食物、化妆品、药品/药物、通过生物工艺准备的材料(终产品和中间材料)、水、环境样品，包括但不限于，譬如，土壤、水和空气；从以上所列所述来源中获得的半纯化或纯化的核酸，诸如，作为一过程的结果的核酸，如测序的模板形成，包括下一代测序、样本处理、核酸酶消化、限制酶消化、复制或类似。
此处所用术语“扩增”指产生与一完整的目标核酸序列或其一部分或作为所述目标核酸序列的一替代物的通用序列的相同或互补的核酸链的过程。此处所用术语“相同”指一核酸含有与另一核酸相同或基本上相同的核苷酸序列。
此处所用术语“固定”指一分子，诸如所述第一和第二寡核苷酸与一固相载体相连接。本领域通常已知的广泛的方法能用于连接。一个优选的方法是共价键相连接。
此处所用术语“核酸”指一多核苷酸化合物，其包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包括核苷或含有含氮杂环碱基或其碱基类似物的核苷类似物，通过标准磷酸二酯键或其他键合共价连接而成。核酸包括RNA、DNA、嵌合的DNA-RNA聚合物及其类似物。在一核酸中，所述骨架由多种键合方式构成，包括一个或多个糖-磷酸二酯键、肽核酸键(PCT No.WO 95/32305)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或其组合。在一核酸中，糖部分可为核糖、脱氧核糖或带有如2’甲氧基和2’卤素(如2’-F)取代基的相似化合物。
含氮碱基可为传统的碱基(A、G、C、T、U)，诸如异胞嘧啶和异鸟嘌呤的非天然核苷酸及其类似物(如肌苷，The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36,Adams et al.,ed.,1lth ed.,1992)，嘌呤和嘧啶碱基的衍生物，如N4-甲基脱氧鸟苷、氮杂或吖嘌呤、氮杂或吖嘧啶、在任意一系列化学位上有改变或取代的取代基的嘌呤或嘧啶，例如2-氨基-6甲氨基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲肼-嘧啶及O4-烷基-嘧啶或者吡唑啉酮化合物，如非取代或3-取代吡唑啉酮[3,4-d]嘧啶(如U.S.Pat.Nos.5,378,825,6,949,367和PCT No.WO 93/13121)。
核酸可包括“非碱基的”位置，其骨架在一个或多个位点上不包括一含氮碱基(U.S.Pat.No.5,585,481)，如一个或多个非碱基位置可形成一个结合分散的寡核苷酸序列的结合区域。一核酸可仅包括传统的糖、碱基和在传统的RNA和DNA中的结合方式，或者可包括传统组分和取代基(如由一2’甲氧基骨架相连的传统碱基，或者一含有传统的碱基及一种或多种类似物的一混合物的聚合物)。所述术语包括“锁核酸”(LNA)，其含有一个或多个带有闭合于一类似RNA的糖构型中的一双环呋喃糖单位的LNA核苷酸单体，其提高了与ssRNA、ssDNA或dsDNA的互补序列杂交的亲和力(Vester et al.,2004,Biochemistry 43(42):13233-41)。
此处所用术语“释放”指通过将所述双重核酸升温至一变性温度，使所述核酸双重形成两条分散的寡核苷酸，从而将所述期望扩增的核酸从它的模板中分离。
此处所用术语“移除”指一系列从一双重核酸中分离或通过其他方法移除或分开一条核酸链的方法，譬如酶解、升温和/或化学分解、降解和/或切割所述双重核酸中的一条链，或通过加热、声能量、化学物、酶及其结合变性/解离所述链。
此处所用术语“标签区域”或“标签序列”指一条或多条用户定义的被包含在一寡核苷酸内的核酸序列或其他核酸结构，如一引物，以提供一种或多种期望的功能。这样的原件包括，譬如，衔接子、测序引物、扩增引物、捕获和/或锚定原件、杂交位点、启动子原件、核酸内切酶抑制位点、检测原件、质谱标签、条形码序列、结合原件和/或非天然核苷酸。其他原件包括在一混合物中能够清楚地区分和/或鉴定一个或多个含有来自其他核酸或核酸片段的一段标签序列的核酸或核酸片段的原件，在一核酸混合物中独特的以最大程度减少交叉反应以及类似情况的原件和有助于确定序列方向的原件。在一标签序列中部分或所有所述原件能够包含于扩增产物中。
此处所用术语“杂交”、“退火”指在合适的条件下，通过Watson&Crick碱基配对，具有与基本上互补的序列的核酸互相结合的能力。核酸退火或杂交技术在本领域为已知。参见，例如，Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.(1989)；Ausubel,F.M.,et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Secaucus,N.J.(1994)。此处所用术语“基本上互补”指与所结合的核酸完全互补，在某些情况下指一条相同的序列，以及互补性足够达到与所期望的核酸结合。相应地，术语“互补杂交”包括基本上互补杂交。
此处所用术语“取代子寡核苷酸”或“取代子”指在所述目标序列的一位点上与一核酸目标杂交的一寡核苷酸，所述位点在同一所述核酸目标上的另一条或多条结合的寡核苷酸的3’端。当所述取代子通过聚合酶延伸，所述增长的延伸产物与所述另一结合的寡核苷酸相遇，并将其连同任何由所述结合的一条或多条寡核苷酸所启始的延伸产物一起从所述核酸链上取代。
此处所用术语“封闭子寡核苷酸”或“封闭子”指与一核酸结合的经过修饰的寡核苷酸或试剂，或结合一经过修饰的核酸的试剂，其能够阻止或抑制复制并且其在一扩增反应中与引物和/或探针相融合。封闭子寡核苷酸可包含2’氟代(2’-脱氧-2’氟代-核苷酸)修饰、抗核酸酶核苷酸或者3’端带有修饰的核苷酸，以上均抑制或阻止复制。
通常的扩增核酸序列的方法已在本领域被充分描述并且众所周知。任何这样的方法都可以与本发明所述的方法一起施用。在一些实施方案中，用数字PCR方法进行所述扩增，如文献中所描述，譬如，Vogelstein和kinzler(“Digital PCR，”PNAS,96:9236-9241(1999)，此处引用其全文作为参考)。这些方法包括在扩增所述目标区域前，稀释含有所述目标区域的所述样本。稀释可包括稀释到传统的平板、多孔板和纳孔中，以及稀释到微板和微滴上。(参见，如，Beer NR,et al“On-chip,real time,single copy polymerase chainreaction in picoliter droplets,”Anal.Chem.79(22):8471-8475(2007)；Vogelsteinand Kinzler，“Digital PCR,”PNAS,96:9236-9241(1999)；和Pohl and Shih,"Principleand applications of digital PCR,”Expert Review of Molecular Diagnostics,4(1):41-47(2004)，此处引用其全文作为参考)。在一些实施方案中，所述扩增通过数字PCR进行。
在一些实例中，用本发明所示方法扩增所述目标区域的所述酶包括但不限于高保真DNA聚合酶，譬如有3’-5’端核酸外切酶校正能力的DNA聚合酶。能够用于所述方法的酶包括但不限于AmpliTaq、Phusion HS II、Deep Vent和Kapa HiFi DNA聚合酶。
高保真酶能够使一目标序列高保真(高精确)扩增。在一些实施例中，所用的酶包括高保真DNA聚合酶，譬如有3’-5’端核酸外切酶校正能力的DNA聚合酶。能够用于所述方法的酶包括但不限于AmpliTaq、Phusion HS II、Deep Vent和Kapa HiFi DNA聚合酶。
所述扩增产物能通过使用一些本领域技术人员知晓的方法进行检测或分析，这些方法包括但不限于，荧光、电化学检测、凝胶分析和测序。进一步地，所述产物能使用本领域技术人员知晓的一些方法如实时扩增进行定量。定量能够通过与所谓管家基因，如肌动蛋白、GAPDH或与在可以所述反应中加入的已知量的一内参相比较进行标准化。这些方法是已知的，并且在Sambrook和Russell的Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Ed.)(2001)中描述。
用仪器来实施此处所述的方法可以随时进行。这些仪器可包括进行实时和终点PCR试验、乳剂PCR、固相PCR、熔解曲线分析和测序分析的仪器。这些仪器包括7500Fast Dx实时仪器(其还能够进行高分辨熔解曲线分析)(Life Technologies，Carlsbad，USA)和所述3500xl毛细管凝胶仪。其他本领域所已知的将有益于本发明所述方法的仪器也应被本领域技术人员在实施本发明的所述方法时考虑在内加以使用。
本发明提供了从含有一核酸混合物的一样本中固定和扩增一核酸目标的方法。本领域中已知很多种扩增技术。其中一些已知方法可与本发明的所述方法一起使用。专利申请公开文本NO.2011/0003305 Al公开了一些这样的技术并且此处引用其全文作为参考。
本发明所述方法使用多种核酸结构和组成。使用本领域技术人员熟知的标准亚磷酸酰胺化学法合成这些寡核苷酸。
本发明的方法之一，如图1A所示，提供的是第一和第二固定寡核苷酸结合到一固相载体的相同或相邻区域，或可替换地，结合到不同的载体上。所述第一固定寡核苷酸的序列与所述目标核酸序列的第一部分互补。所述第二固定寡核苷酸的序列与所述目标核酸序列的第二部分互补。所述第一固定寡核苷酸的3’末端被封闭以阻碍延伸，而所述第二固定寡核苷酸的3’末段可以延伸。
在本领域已知，一寡核苷酸的3’末端能够通过化学上的或结构上使用一封闭部分进行封闭。封闭的寡核苷酸在如美国专利Nos.5,399,491,5,554,516,5,824,518和美国专利申请No.2006-0046265中描述。一封闭的寡核苷酸指一在靠近或位于3’端含有一化学和/或结构修饰的、防止或阻碍通过酶途径从寡核苷酸合成DNA的起始的寡核苷酸。这些修饰的实例包括使用一3’2’-双脱氧核苷酸碱基、一阻止酶催化延伸的3’-非核苷酸部分或者一短序列沿3’到5’方向与所述寡核苷酸相连形成一最终含有2个5’末端的寡核苷酸。(也就是说，一第一5’到3’-寡核苷酸通过在它们3’末端共价连接与一更短的第二5’到3’-寡核苷酸相连)。另一修饰的实例是一由含有与所述寡核苷酸的3’末端至少3个核苷酸互补的一序列组成的“帽子”，所述帽子的5’末端的碱基与所述寡核苷酸的3’端终点的碱基互补。另外，将一寡核苷酸的3’末端束缚于一固相载体上可以封闭其延伸。因此，如果期望封闭延伸，本发明所述固定寡核苷酸可通过将其与一固相载体在其3’末端或附近结合进行定向。
所述目标核苷酸序列的所述第一和第二部分可以是相同的或不同的。在大部分情况下，优选所述第一和第二固定寡核苷酸序列并不是完全互补的。
在一实例中，一样本中的一RNA目标(如mRNA)通过与所述第一固定寡核苷酸杂交而固定于所述固相载体之上。这可以为一第一固相载体，如果所述第一和第二固定寡核苷酸结合于不同的载体上。所述固相载体被洗涤以移除未结合的所述样本的成分。然后，一第一引物和所述固定的目标RNA杂交，所述第一引物含有一目标结合区域和一标签区域，所述标签区域含有一聚合酶启动子序列(如T7RNA聚合酶启动子序列)。所述第一引物然后通过一聚合酶延伸产生一与所述RNA目标的一部分相结合的第一cDNA链。然后所述RNA目标的一部分通过酶解降解(如RNaseH)，使所述第一cDNA链在溶液中游离。然后所述第一cDNA链退火后与所述第二固定寡核苷酸在所述第一固相载体上结合，若所述第一和第二固定寡核苷酸与不同的载体结合，则在一第二固相载体上结合。所述第二固定寡核苷酸然后通过聚合酶延伸以产生一第二cDNA链与所述第一cDNA链的一部分相结合。由此产生一个两重复合物，其含有一活跃的双链T7RNA聚合酶启动子位点。在溶液中使用一T7RNA聚合酶使该两重复合物产生多个的RNA转录本。
可选择地，在所述方法中，所述第一固定寡核苷酸可用于阻止所述第一引物的延伸。因此，若期望，所述目标链上的所述第一固定寡核苷酸的位置能够决定所述第一cDNA链的长度。譬如，通过设计所述固定寡核苷酸的所述目标结合区域使其与所述目标核酸具有非常高亲和性能够实现这种封闭的功能。比如，若所述目标核酸是RNA或则使所述固定寡核苷酸有2’甲氧基残基；若所述目标是DNA则用锁核酸(LNAs)，或在5’末端连接一封闭基团(如空间封闭子、插入分子或沟槽结合剂)抑制所述聚合酶的前行。该技术还可被用于本发明的其他方法中。
在一实施方案中，所述第一和第二固定寡核苷酸可在一个或多个固相载体上通过多种方式成形，包括但不限于两个固定寡核苷酸均结合于同一固相载体。这包括所述固定寡核苷酸基本上与整个表面相连，或所述寡核苷酸与所述表面的特定区域，诸如点、一表面的一部分，如一层膜，或诸如一线路或管的部分相连。所述固定寡核苷酸可混合，或者与所述载体上分离的位置相连，诸如不同的点、一膜上不同的部分或一线或试管的不同区域。根据所设计的试验的流程和所述试验仪器、器材和设备的构造，这些分离的位置可直接互相连接，或者(在不同程度上)相互处于较远的位置。可选择地是，每个所述寡核苷酸可与不同的载体相结合。譬如，所述固定寡核苷酸能与不同颗粒、不同线路、一膜的不同层、一阵列的不同板块、一仪器的不同腔室或不同纤维相结合。
所述不同的载体也可以是不同类型的固相载体。譬如，所述第一寡核苷酸可与一腔室的所述壁相结合，并且所述第二寡核苷酸可与一在所述腔室的内部的纤维网相结合。可选择地，所述两个不同的载体可以譬如一个是膜一个是面，一个是管一个是孔，或者一个是管一个是线路。
所述不同的固相载体可以相互是分离的，诸如一悬浮颗粒的混合物、一纤维的基质或者一束线路。它们也可在分离的位置上，诸如一静态的珠状阵列、一阵列的不同板块或者一仪器的不同腔室，如在一微流控装置中。
进一步地，所述不同的固相载体可根据所述实验中所设计的试验流程和所述实验中的仪器、器材和设备的构造来成型。在本发明中可以使用很多不同种固相载体类型，包括但不限于，一有孔的或无孔的颗粒、纤维、膜、线路、网、管、腔室、孔和高通量测序检测芯片(flow cell)。所述载体的量可在大量、微量、纳量甚至更小的范围内变化。
所述方法进一步包括额外的增加所需要的RNA转录本量的步骤。以上产生的所述RNA转录本可退火后与所述第二固定寡核苷酸结合，然后通过聚合酶延伸以产生另外的第二cDNA链。利用RNaseH降解获得的RNA∶DNA二重复合物中的所述RNA链，所述第一引物与这些额外的第二cDNA链相杂交。所述第一引物和所述额外的第二cDNA链延伸以产生带有一活跃的T7RNA聚合酶启动子的一二重复合物，然后用T7RNA聚合酶产生更多的RNA转录本。这些额外的RNA转录产物在溶液中退火后与所述第二固定寡核苷酸结合，并且重复上述循环。
在如上所述的实施方案中，能够设计所述第一固定寡核苷酸的序列使其与所关注的所述目标杂交的特异性较高、较低或在一特定的期望的特异性水平上。这使得在所述样本中可以以非常高的特异性捕获一单个目标序列，或捕获在所述样本中一般的非特异的全部/大部分/许多核酸。类似的，能够设计所述第一引物和所述第二固定寡核苷酸使其在期望的任何特异性水平上结合。譬如，能够设计所述第一引物和所述两条寡核苷酸的序列使其与所关注的所述目标核酸的特定区域完全互补，从而达到高水平的特异性(在合适的结合条件下)。另外，能够设计一个或多个所述寡核苷酸的序列以区分只含有一个或多个区别的序列(如一SNP、一点突变或者一个以上的SNP或点突变)。区分SNPs或者点突变的方法之一是设计一个或两个所述引物以在3’末端含有所述SNP或点突变的位点。一正确的配对将能够延伸和扩增，而一错误的配对则不会。
所述寡核苷酸也可被设计成跨立于一嵌合目标的交叉位点上，譬如一mRNA目标，其为一基因移位事件(例如在慢性骨髓白血病中的BCR/abl)或者其他融合事件(例如在前列腺癌中的T2:ERG)的产物。可选择地，任何所述寡核苷酸的序列都可被设计成与所述目标的多种区域以合适的特异性相结合。
在上述方面的第二实施方案中，一取代子寡核苷酸也可与所述目标核酸在所述第一引物的3’端的一位点杂交。当所述第一引物延伸，所述取代子也延伸，从所述目标核酸上取代了所述第一引物的所述延伸产物。该途径的优势之一是从所述目标核酸上移除所述扩增产物并不需要高温变性，例如，如果所述目标是DNA，无需考虑用RNasesH酶切。更进一步，所述取代子的所述延伸产物可进入所述扩增程序，因此增大了扩增量。此外，一封闭子寡核苷酸也可以杂交到所述目标核酸上。所述封闭子与所述目标核酸在所述引物的5’端的一位点上相结合。所述封闭子抑制了所述引物的延伸(若用所述取代子，相同)，因此限制了所述延伸产物的长度，该使用取代子和/或封闭子寡核苷酸的技术也可应用于本发明的其他方法中。
在第三实施方案中，所述寡核苷酸的序列可含有简并碱基和/或随机碱基区域，或者完全由随机碱基组成，因此产生低特异性。此处所述方法的在控制试验特异性方面相比现有的其他方法产生改进，因为所述特异性能够通过使用所述第一和第二固定寡核苷酸和一上述方法中的所述第一引物调节。譬如，设计第一和第二固定寡核苷酸和所述第一引物高特异性地与所述目标核酸杂交能达到特别高的特异性。相应地，所述目标核酸与所述第一固定寡核苷酸的结合能在更低的特异性条件下施行。这使得包括野生型和突变体序列的多重目标型能够被捕获，而所述第二固定寡核苷酸的延伸能够在更高的特异性下施行。这让检测SNPs或点突变(见上)成为可能。在这些条件下，所述第一引物的特异性可调整到赋予所期望的整体特异性水平。
在第四实施方案中，设计了一套四个不同的第二固定寡核苷酸，每个都在3’末端有一不同的核苷酸(A、C、G或T)。每个均在所述目标核酸的对应位置，特异性地针对一不同的SNP。在一个构型中，这四个不同的第二固定寡核苷酸可与固相载体相结合，包围着所述第一固定寡核苷酸。在使用所述第一固定寡核苷酸和所述第一链cDNA捕获所关注的所述目标核酸后，使用第二固定寡核苷酸和特异性延伸再次捕获所述cDNA(也就是说，已配对的3’末端会延伸，而错配的则不会)。在一实验中，所有4个可能的SNPs均能在一次试验中被鉴定。
在第五实施方案中，所述T7启动子能够被多种启动子所取代，诸如SP6和T3。如果进行了取代，则使用与所述启动子相应的酶进行延伸。
在第六实施方案中，所述第一引物可进一步含有一标签区域，其中包括其他原件提供一期望的功能。这样的要素的实例包括但不限于，衔接子、测序引物、扩增引物、额外的捕获原件、检测原件、质谱标签、条形码序列和结合原件。这些要素与扩增产物相融合。进一步地，所述固定第二寡核苷酸也还可包括一位于所述目标核酸结合区域5’端的标签区域并还可包括其他的要素以增加期望的功能，这样的例子已包括于上述。
所述第一引物的标签区能进一步包括非天然核苷酸，如异胞嘧啶(isoC)和/或异鸟嘌呤(isoG)(图2)。这些非天然核苷酸能够分别与isoG和isoC相结合，但是不与所述天然核苷酸(A、C、G和T)结合。这些非天然氨基酸可通过标准磷酸二酯键或诸如硫代磷酸键或甲基膦酸酯键等其他键以共价键相连。使用如此构型的一第一引物产生一含有isoC和/或isoG的第一cDNA，然后用于产生也含有该isoG和/或isoC核苷酸的RNA转录本。在下一轮的扩增中，使用一含有与从所述第一引物产生的所述序列结合的启始区域的第二引物。所述引物区域含有与在第一轮扩增中产生的所述isoC和/或isoG互补的isoC和/或isoG核苷酸。所述扩增然后按上述进行，但是现在由所述第二引物驱使。这方面的优势之一是所述第二引物十分特异性于所述isoC和/或isoG核苷酸，从而不会与所述目标的其他区域结合，因此减少了扩增副产物。也可使用其他非天然核苷酸对，只要它们相互配对而不与所述天然核苷酸(A、C、G和T)配对，并且为一DNA和/或RNA聚合酶的底物。非天然核苷酸的实例包括但不限于6-氨基-5-硝基-3-(10-β-D-20-氟脲脱氧核苷)-2(1H)-羟基吡啶(也称为Z)和2-氨基-8-(10-β-D-20-氟脲脱氧核苷)-咪唑[l,2-a]-l,3,5-三嗪-4(8H)-一(也称为P)。(StevenA.Benner,J.Am.Chem.Soc.2011,133,15105-15112)、2,4-二氨基-5-(3-D-呋核亚硝脲)嘧啶(pyDAD)、2’-脱氧黄嘌呤核苷(puADA)(US 8,354,225Bl)和吡啶-2-1,2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤(Lee and Berdis,Biochim Biophys Acta,2010May；1804(5):1064-1080)。
本发明的第二方面，以图6所示，提供了第一和第一固定寡核苷酸与第二寡核苷酸结合到固相载体的相同或相邻区域或结合到不同的载体上。所述第一固定寡核苷酸的序列与所述目标序列的一第一部分相互补。所述第二固定寡核苷酸的序列与所述目标序列的一第二部分相同。所述第一固定寡核苷酸的3’端以一阻碍延伸的方式被封闭，而所述第二固定寡核苷酸的3’末端能够延伸。
所述目标核酸序列的第一和第二部分可相同或不同，在大部分情况下，优选所述第一和第二固定寡核苷酸序列并不完全互补。
可通过RNA或DNA目标核酸进行扩增。在一实例中，一样本中的一RNA目标(如mRNA)通过与所述第一固定寡核苷酸杂交固定于所述固相载体上。若所述第一和第二固定寡核苷酸与不同的载体相结合，这可以是一第一固相载体。洗涤所述固相载体以移除所述样本中未结合的组分。
含有一目标结合区的一第一引物与所述固定目标RNA杂交。所述第一引物由聚合酶延伸以产生一第一cDNA链并与所述固定目标RNA的一部分结合。RNA目标的一部分被酶解(如RNaseH)，使所述第一cDNA链游离于溶液中。所述第一cDNA链退火与所述第二固定寡核苷酸在所述第一固相载体上结合，或者在一第二固相载体上结合，若所述第一和第二固定寡核苷酸与不同的载体结合。所述第二固定寡核苷酸通过聚合酶延伸以产生一第二cDNA链，与所述第一cDNA链的一部分结合。所述第一引物和/或所述第二固定寡核苷酸可进一步包含一标签序列。
然后分开双链(如高温变性)。所述第一引物在所述固相载体上与所述第二cDNA链杂交结合，所述第一cDNA链与所述第二固定寡核苷酸杂交。进一步地，所述原始目标链与所述第一固定寡核苷酸杂交，所述第一引物与所述原始目标链杂交。所述第一引物和所述第二固定寡核苷酸通过聚合酶延伸，并重复所述的过程。所述循环可被重复以获得所期望的扩增。本领域技术人员应意识到，本发明的该实施方案中也可用可选择的其他工作流程。譬如，所述第一引物与所述目标核酸的结合和所述目标核酸与所述第一固定寡核苷酸的结合在一个步骤中。同样，所述原始目标链与所述第一cDNA链能够通过除RNAse H酶解以外的方法分开，如高温变性。
在本发明的第三方面，如图7所示，一固定寡核苷酸/引物与一固相载体杂交。所述固定寡核苷酸/第一引物的序列与所述目标序列的一第一部分互补。在该实施方案的一个实例中，任选地提供一封闭子寡核苷酸，其与位于所述目标的第一部分的5’端的所述目标的一第二部分互补；互补。所述封闭子寡核苷酸与所述核酸目标杂交，所述核酸目标与所述固定寡核苷酸/第一引物在所述固相载体上杂交。
洗涤所述固相载体以除去所述样本中未结合的部分。所述固定寡核苷酸/第一引物通过聚合酶延伸，延伸终点在所述封闭子处，以产生一长度限定的、与所述固相载体结合的第一双重核酸。所述目标核酸从所述第一双重核酸除去(例如，若所述目标是RNA用RNaseH降解，或者高温变性)，使一第一核酸与所述固相载体结合。一第二引物含有一结合区域和一标签区域，所述标签区域含有一聚合酶启动子序列(如T7RNA聚合酶启动子序列)和，任选地，一阻止延伸的封闭的3’端，所述第二引物与所述第一核酸杂交，从而所述结合区域与所述第一核酸的所述3’末端相重叠。
所述第一核酸延伸以产生一第二双重核酸，其包括一活跃双链T7RNA聚合酶启动子位点。使用T7RNA聚合酶从该双重核酸在溶液中产生多重RNA转录本。这些RNA转录本可与在所述固相载体上的所述固定寡核苷酸/引物杂交，所述固定寡核苷酸/引物通过聚合酶延伸以产生一第三双重核酸。所述第三双重核酸的RNA链被移除(如RNaseH降解、高温变性)，使一第三核酸与所述固相载体结合。所述第二引物与所述第三核酸杂交，并且重复该循环至获得所期望的扩增。
在第四方面，提供了一种从一片段化的样本，如新鲜冷冻或甲醛固定、石蜡包埋组织样本，确定核酸目标扩增方向的方法，从而简化测序(图3)。
在一实例中，一来自于新鲜冷冻或甲醛固定石蜡包埋组织(FFPE)、生物体液或其他相似的样本的核酸，被片段化以产生多种核酸。所述目标核酸的初始捕获可发生于与所述第一引物杂交之前或之后。此外，捕获可能基于杂交或者被离子或其他结合相互作用(诸如核酸浓缩或拥挤方法)所驱动。任选地，捕获可使用一发夹引物。通常地，所述捕获的方向是朝所述目标核酸的5’末端，或者基于沿着所述目标核酸序列长度的微弱的相互作用，这样所述捕获不会干扰所述第一引物或发夹引物的延伸。可选择地，多余的第一引物移除后，所述目标/第一引物复合物从所述固相载体中释放。
如果之前没有结合，所述第一引物或发夹引物与所述目标核酸杂交。所述第一引物在其3’末端含有一随机或者大致上随机的大约6个至大约9个核苷酸片段序列；在5’端含有一标签序列。所述标签序列中也可任选地包括一条形码序列，典型地，其插入到随机序列的3’端和所述标签序列的剩余部分之间。正是该标签序列盒或者所述条形码序列(如果包括的话)或者上述两种的结合被用于决定所述起始的mRNA目标序列的方向。如果所述引物是一发夹引物，其在3’端会含有一外伸的、大约6个至大约9个核苷酸的区域，优选地杂交于通过有利的末端堆积相互作用产生的所述目标核酸序列的3’端。可选择地，所述发夹可与所述目标序列的3’末端相连接。
一旦所述第一引物或发夹引物与所述目标核酸完成杂交，洗涤所述固相载体以移除多余的引物，所述引物通过一合适的聚合酶延伸。典型地，若目标为mRNA，则所述聚合酶是一反转录酶，任选地，所述反转录酶缺乏RNaseH活性。取决于所述目标核酸上所述第一引物的杂交位置，产生一个或多个cDNA/mRNA复合物。更具体地，取决于所述引物与所述mRNA目标的3’端杂交还是沿着所述mRNA目标的长度有多个杂交的位置。
所述cDNA从所述mRNA目标中分开。该步骤可通过RNaseH降解而完成。所述游离的cDNA被捕获，典型地使用在所述；流程中的前一步骤中所使用的方法，并被杂交到一与所述第一引物类似的第二引物，尽管，任选地可能不含条形码序列。洗涤所述cDNA/第二引物复合物以除去多余的引物。所述第二引物通过一合适的DNA聚合酶延伸。然而，也同样能使用具有DNA聚合酶活性的反转录酶。所述延伸的产物(此处被称为核酸载体)的5’端和3’端均有已知的标签序列。
然后这些核酸载体通过第三和第四引物扩增，所述第三和第四引物在序列上至少分别与所述第一和第二引物的所述原始标签序列的一部分完全相同。这些第三和第四引物可任选地在5’末端也含有标签序列，其含有所述第一和/或第二引物的标签序列中所不包括的期望的功能性原件。任选地，只要合适和期望，在该方法中任何地方都能够根据大小分开不同的种类。
该方法还可应用到DNA目标，其中使用DNA聚合酶取代了RNA聚合酶，DNA/DNA二重复合物中的链由RNA降解以外的方法，如高温变性分开。另外，所述第一和第二引物可被核苷酸类似物，如5-甲基-dC、2，6-二氨基嘌呤、C5丙炔基-dC和-dU和2’-F修饰的核苷酸修饰，以提高它们与所述目标序列杂交的性能。
在第五方面，提供了一使用取代子和封闭子寡核苷酸制备长度限定的、扩增的目标核酸。
在一实例中，一第一引物在一固相载体上固定(图4)。所述第一引物的序列与一目标核酸的一第一部分互补。一取代子寡核苷酸，封闭子寡核苷酸和目标核酸添加于所述固相载体上。所述取代子序列与所述目标核酸的一第二部分互补。所述第二部分在所述第一部分位置的3’端。所述封闭子序列与所述目标核酸的一第三部分互补。所述第三部分在所述目标的所述第一部分的5’端。所述取代子和封闭子寡核苷酸与所述目标核酸杂交。所述杂交的目标通过与所述第一引物杂交而固定于所述固相载体。
洗涤所述固相载体以移除所述样本的未结合部分和未结合的封闭子和取代子寡核苷酸。所述第一引物由聚合酶延伸。延伸在所述封闭子寡核苷酸处终止，以产生一含有一长度限定的、与所述固相载体结合的第一核酸的第一双重核酸。所述取代子寡核苷酸也通过聚合酶延伸，并从所述第一双重核酸中取代所述目标核酸。延伸在所述封闭子寡核苷酸处终止，以产生一含有一长度限定的、不与所述固相载体结合的第二核酸的第二双重核酸。
然后一第二引物与所述第一核酸杂交，通过聚合酶延伸以产生一含有所述第一核酸和一第三核酸的第三双重核酸。然后所述第二和第三双重核酸解离，通过如高温变性或其他本领域已知的手段。所述第二引物退火与所述第一核酸结合并通过聚合酶延伸以产生更多的所述第三双重核酸。
所述第三核酸通过与未被结合的第一引物杂交而固定于所述固相载体上。所述第一引物通过聚合酶延伸以产生更多的第三双重核酸。所述原始目标核酸链，以及与其结合的所述取代子和封闭子寡核苷酸与未被结合的第一引物杂交，所述第一引物通过聚合酶延伸以产生更多的第一双重核酸。所述取代子寡核苷酸也通过多聚酶延伸，从所述第一双重核酸中取代所述目标核酸链。延伸在所述封闭子寡核苷酸处终止，以产生一含有长度限定的、不与所述载体结合的第二核酸的第二双重核酸。
所述第二引物与所述第二核酸杂交并通过多聚酶延伸以产生一含有所述第二核酸和一第四核酸的第四双重核酸。所有双重核酸均变性，并且所述循环按期望重复。
在该实例的一个实施方案中，额外的封闭子和/或取代子寡核苷酸在所述清洗步骤后被加入所述反应混合物中。可选择地，封闭子和取代子寡核苷酸酶排除于与目标的所述第一杂交的步骤之外，但是在所述清洗的步骤后加入。
在一第二实施方案中，所述取代子和/或封闭子寡核苷酸被省略了。如果省略了所述取代子，通过取代活性实现的一双重核酸的链相互的分离被通过其他方式来达到，如高温变性。
在该实例的一第三实施方案中，一条或另一条或两条引物含有一标签序列。在一构型中，一个或两个所述标签序列含有一额外的引物位点，其是用户所选的序列。这些一个或两个额外的引物序列能够被用于在上述第一轮扩增结束后驱动扩增。进一步地，这些一个或两个外的引物能够与一固定载体或载体结合，所述载体或者相同或者不同于上述所述第一引物所结合的载体。
此处所述的本发明的一特定实施方案中的标签序列所具有和潜在的用途也能被预计应用到本发明的其他实施方案中。
在一第四实施方案中，所述第一引物(与一固相载体结合)有一支持所述样本中一些目标核酸的固定的序列。譬如，所述第一引物的序列含有一可延伸的、在长度上约6至约9个核苷酸的随机核苷酸，其支持与许多目标核酸结合(如一mRNA目标的多重片段)。可选择地，所述第一引物的序列可含有可延伸的、在长度上约8至约20个核苷酸的半随机核苷酸，其支持一定义的或半定义的许许多多的目标核酸中的一部分的结合(如一基因组DNA目标中的许多片段)。进一步的，一些特异性的其他水平可被设定从而固定一样本中所感兴趣的所述目标核酸中的绝大部分，所述引物延伸和所述步骤按上述进行。
在一第五实施方案中，所述方法提供一第一和第二固定寡核苷酸/引物，其均与一固相载体结合(图5)。所述第一固定寡核苷酸/引物的序列与所述目标核酸序列的一第一部分互补。所述第二固定寡核苷酸/引物的序列与所述目标核酸序列的一第二部分互补。在一实例中，取代子和封闭子寡核苷酸在所述扩增方法中使用。所述取代子寡核苷酸有一与所述目标核酸的一第二部分互补的序列，其中所述第二部分位于所述目标核酸的所述第一部分的3’侧。所述封闭子寡核苷酸有一与所述目标核酸的一第三部分互补的序列，其中所述第三部分在所述目标核酸的所述第一部分的5’侧。所述取代子和封闭子寡核苷酸与所述目标核酸杂交，且速所述目标核酸与所述第一固定寡核苷酸/引物在所述固相载体上杂交。
洗涤所述固相载体以去除所述样本中未结合的部分。所述第一固定寡核苷酸/引物通过聚合酶延伸。所述延伸在所述封闭子寡核苷酸处终止，并产生一含有一与所述固相载体结合的、长度限定的第一核酸的第一双重核酸。所述取代子寡核苷酸也延伸从所述第一双重核酸中取代所述目标核酸。延伸在所述封闭子寡核苷酸处终止，产生一含有一长度限定的第二核酸的第二双重核酸。该双重核酸并不与所述固相载体结合。所述第二固定寡核苷酸/引物与在所述固相载体上的所述第一核酸杂交以产生一桥形构型(见图5)。
所述第二固定寡核苷酸/引物由聚合酶延伸以产生一含有均与所述固相载体结合的所述第一核酸和一第三核酸的第三双重核酸。然后所述第二和第三双重核酸解离(如，通过高温变性或本领域已知的其他合适方法)。所述第一核酸与一未被结合的第二固定寡核苷酸/引物杂交；所述第二固定寡核苷酸/引物通过聚合酶延伸以产生更多的所述第三双重核酸。同样地，所述第三核酸与未被结合的第一固定寡核苷酸/引物杂交，所述第一固定寡核苷酸/引物由聚合酶延伸以产生更多的第三双重核酸。进一步地，所述第二核酸与所述第二固定寡核苷酸/引物杂交，延伸第二固定寡核苷酸/引物以产生一第四双重核苷酸。
所述原始目标核酸及其所杂交的取代子和封闭子，与未被结合的固定寡核苷酸/第一引物杂交。所述固定寡核苷酸/第一引物由聚合酶延伸以产生更多的第一双重核酸。所述取代子寡核苷酸也延伸，并在延伸时从所述第一双重核酸中取代所述目标核酸。延伸在所述封闭子处终止，产生一含有一不与所述固相载体结合的、长度限定的第二核酸的第二双重核酸。然后所有的双重核酸均变性，所述循环按期望重复。
在第六实施方案中，所述目标核酸是双链的。所述第一和第二固定寡核苷酸/引物分别与所述目标核酸双链的第一链和第二链的一第一区域互补。这两个区域在所述双链目标核酸的不同位置上。如上所述，也可任选地向一条链或另一条链或两条链提供取代子和/或封闭子寡核苷酸。扩增每条链的方法与上述所述第一轮扩增的方法相同，然后进行如上所述的桥式扩增，同时所述取代链进入所述过程，从而增加扩增产物产量。遗留在溶液中的目标核酸也能参与到与所述取代子和/或封闭子杂交并且在所述载体上与所述引物结合的后续循环中，还参与到后续扩增中，以增加扩增产物的产量。
同样可预计，将本发明此处所述的一特定的实施方案中扩增一双链目标的两条链的扩增也能在本发明其他实施方案的扩增中。
上述的信息为本领域技术人员提供一完整的披露，并描述了如何制造和使用所述仪器和方法的实施方案，且其意图并不限于发明人在其发明中提及的范围。对于上述模式的修改(对本领域技术人员而言实施所述发明是显而易见的)被确定为在下述权利要求的范围内。在本说明书中所引用的所有的出版物、专利和专利申请均被包含作为参考。譬如，在所述不同的方法中所引用的许多所述清洗的步骤是可选择的，就如一些将两条核酸链相互去除和/或分开的步骤。不实施所述清洗和/或分离步骤的至少一些步骤会使得工作流程更快速、更简单和更经济，并且也能达到所期望的结果。在另一实例中，在所述已例证的方法中逐步地增加/结合某些寡核苷酸和/或目标核酸也能被结合。此外，在一些实施方案中，标签序列的使用是任选的，并且其潜在组成与在上述例证中的不同，但依然在本领域技术人员认知的范围内。在一些情况下，并不要求运用一封闭子基团以防止从5’末端被核酸外切酶降解。进一步地，多种聚合酶、延伸条件和其他本领域技术人员已知的扩增方法能在上述方法中的不同的步骤或步骤组合中来使用。其他对本领域技术人员而言对所公开的方法明显的改进也包括在本发明中。

Claims (7)

1.一从一含有一核酸混合物的样本中固定和扩增一目标核酸的方法，所述方法包括步骤：
施用所述样本于一固相载体，所述固相载体含有与其粘附的一第一寡核苷酸与一第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸被封闭以防止从3’末端的延伸，并具有与所述目标核酸的一第一部分互补的序列，所述第二寡核苷酸具有一与所述目标核酸的一第二部分相同的序列，其中所述目标核酸与所述第一寡核苷酸结合，任选地洗涤所述固相载体以移除未结合的核酸；
一引物与所述目标核酸杂交，其中所述引物含有一目标结合区域和一聚合酶启动子序列，通过聚合酶延伸所述引物以产生一第一双重核酸，任选地从所述双重核酸移除所述目标核酸以产生一第一核酸；
所述第一核酸退火与所述第二寡核苷酸结合，通过聚合酶延伸所述第二寡核苷酸以产生一含有所述第一核酸和一第二核酸的第二双重核酸；和，
通过聚合酶产生多重拷贝的一第三核酸，从而扩增所述目标核酸；所述聚合酶特异于所述聚合酶启动子序列。
2.如权利要求1所述的方法，进一步包括步骤：
所述扩增的第三核酸退火与所述第二寡核苷酸结合，延伸所述第二寡核苷酸以产生一第三双重核酸；
任选地移除所述扩增的第三核酸以产生一与固相载体结合的第四核酸；
所述引物序列退火与所述第四核酸结合，通过聚合酶延伸所述引物和所述第四核酸以产生一含有一第五核酸和额外的第二核酸的第四双重核酸；和，
通过聚合酶产生多重拷贝的所述第三核酸，所述聚合酶特异于所述第四双重核酸的一启动子，从而扩增所述目标核酸。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述引物进一步包括一含有一个或多个非天然核苷酸的一标签区域。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述第二寡核苷酸是四个寡核苷酸，其各自在3’末端有一特异于所述第一核酸的四个不同的SNPs的核苷酸。
5.一从一含有片段化的核酸的样本中定向地扩增一目标核酸的方法，所述方法包括步骤：
施用所述样本和一第一引物于一固相载体，其中所述第一引物在其3’末端含有6个至9个核苷酸的随机序列，在其5’末端含有一第一标签序列，其中所述固相载体具有与其粘附的一第一寡核苷酸和一第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸被封闭以防止从所述5’末端的被核酸外切酶消化，且具有一与所述目标核酸的一部分相互补的序列；
所述第一引物退火与所述片段化的目标核酸结合，所述被结合的片段化的目标核酸退火与所述第一寡核苷酸结合；
洗涤所述固相载体以移除没有与所述片段化的核酸目标结合的所述第一引物；
延伸所述第一引物序列产生一含有一片段化的核酸目标和一第一核酸的第一双重核酸；
从所述第一双重核酸移除所述目标核酸以产生一第一核酸；
所述第一核酸退火与所述第二寡核苷酸结合；
添加一第二引物于所述固相载体，其中所述第二引物在其3’末端含有6个至9个核苷酸的随机序列，在其5’末端含有一第二标签序列；
所述第二引物退火与所述第一核酸结合；
延伸所述第二引物以产生一第二双重核酸，其中所述第二双重核酸含有一第一核酸和含有所述第一和第二标签序列的一第二核酸；和，
扩增所述第二核酸，其中所述标签序列决定所述目标核酸的方向。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述第一引物的所述标签序列进一步在所述随机序列和所述标签序列的所述剩余序列之间含有一条形码序列。
7.一从一含有一核酸混合物的样本中固定和扩增长度限定的目标核酸的方法，所述方法包括步骤：
施用一取代子寡核苷酸、一封闭子寡核苷酸和所述样本于一固相载体，其中一第一引物被粘附于所述固相载体，其中所第一引物具有一与所述目标核酸的一第一部分互补的序列，其中所述取代子寡核苷酸具有一与所述目标核酸的一第二部分互补的序列，其中所述第二部分位于所述第一部分的3’末端一定距离，其中所述封闭子寡核苷酸具有一与所述目标核酸的一第三部分互补的序列，其中所述第三部分位于所述第一部分的5’末端一定距离；
所述取代子寡核苷酸和所述封闭子寡核苷酸退火与所述目标核酸结合，所述目标核酸退火与所述第一引物在所述固相载体上结合；
洗涤所述固相载体以移除未结合的核酸；
通过聚合酶延伸所述第一引物，其中所述延伸由所述封闭子寡核苷酸终止以产生一含有所述目标核酸和一长度限定的第一核酸的第一双重核酸，通过聚合酶延伸所述取代子寡核苷酸，其中所述延伸从所述第一双重核酸中取代所述目标核酸，其中延伸在所述封闭子寡核苷酸终止以产生一含有所述目标核酸和一长度限定的、未与所述固相载体结合的第二核酸的第二双重核酸；
一第二引物退火与所述结合于所述固相载体的所述第一核酸结合，通过聚合酶延伸所述第二引物以产生一含有一第一核酸和一第三核酸的第三双重核酸；
解离所述第二和第三双重核酸；
所述第二引物退火与所述第一核酸结合，通过聚合酶延伸所述第二引物以产生额外的第三双重核酸；
所述第三核酸退火与在所述固相载体的所述第一引物结合，所述第一引物通过聚合酶延伸以产生额外的第三双重核酸；
所述取代子寡核苷酸和所述封闭子寡核苷酸退火与所述目标核酸结合以产生一被结合的目标核酸，所述被结合的目标核酸退火与在所述固相载体上的所述第一引物结合，延伸所述第一引物以产生额外的第一双重核酸；
通过聚合酶在所述额外的第一双重核酸上延伸所述取代子寡核苷酸，取代所述目标核酸以产生一额外的含有一长度限定的、未与所述固相载体结合的第二核酸的第二双重核酸；
所述第二引物退火与所述第二核酸结合，通过聚合酶延伸所述第二引物以产生一含有一第二核酸和一第四核酸的第四双重核酸；
解离所述额外的第一、所述额外的第二、所述额外的第三和所述第四双重核酸，其中重复所述退火和延伸步骤以扩增所述目标核酸。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6523874B2 (ja) * 2015-08-27 2019-06-05 株式会社理研ジェネシス 核酸増幅基板、該基板を用いた核酸増幅方法、及び核酸検出キット
AU2018259206A1 (en) * 2017-04-23 2019-11-07 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
CA3060979C (en) 2017-04-23 2023-07-11 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
EP3842545B1 (en) 2017-04-23 2022-11-30 Illumina, Inc. Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
JP7226926B2 (ja) * 2018-05-30 2023-02-21 シスメックス株式会社 ｃＤＮＡの合成方法、標的ＲＮＡの検出方法及び試薬キット
CN111378645B (zh) * 2018-12-27 2020-12-01 江苏金斯瑞生物科技有限公司 一种基因合成的方法
CN110511973B (zh) * 2019-07-16 2021-05-07 杭州原合生物科技有限公司 一种用于核酸原位合成的固相载体及其制备方法
WO2023034920A2 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Singular Genomics Systems, Inc. Amplification oligonucleotides

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
DE69232816T2 (de) * 1991-11-26 2003-06-18 Isis Pharmaceuticals Inc Gesteigerte bildung von triple- und doppelhelices aus oligomeren mit modifizierten pyrimidinen
KR940703846A (ko) 1991-12-24 1994-12-12 비. 린네 파샬 갭(gap)이 형성된 2′ 변성된 올리고뉴클레오티드(gapped 2′ modifed oligonucleotides)
WO1993022461A1 (en) 1992-05-06 1993-11-11 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
AU2522095A (en) 1994-05-19 1995-12-18 Dako A/S Pna probes for detection of neisseria gonorrhoeae and chlamydia trachomatis
US6949367B1 (en) 1998-04-03 2005-09-27 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6376191B1 (en) * 2000-03-22 2002-04-23 Mergen, Ltd. Microarray-based analysis of polynucleotide sequence variations
TWI335938B (en) * 2001-08-15 2011-01-11 Rna replication and amplification
WO2003106714A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-24 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting hepatitis b virus
US7927840B2 (en) * 2006-09-11 2011-04-19 Gen Probe Incorporated Method for detecting West Nile Virus nucleic acids in the 3′ non-coding region
US20050064432A1 (en) * 2003-09-19 2005-03-24 Linden Technologies, Inc. Nucleic acid amplification and detection
JP5192229B2 (ja) * 2004-04-07 2013-05-08 エクシコン・アクティーゼルスカブ ｍｉｃｒｏＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡの定量化のための新規方法
WO2006007603A2 (en) * 2004-07-13 2006-01-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detection of hepatitis a virus nucleic acid
AU2005280162B2 (en) 2004-08-27 2012-04-26 Gen-Probe Incorporated Single-primer nucleic acid amplification methods
US8354225B1 (en) 2004-08-28 2013-01-15 Steven Albert Benner Amplification of oligonucleotides containing non-standard nucleobases
EP1647600A3 (en) * 2004-09-17 2006-06-28 Affymetrix, Inc. (A US Entity) Methods for identifying biological samples by addition of nucleic acid bar-code tags
US20070072223A1 (en) * 2005-09-16 2007-03-29 Primera Biosystems, Inc. Compositions and methods for purifying nucleic acids
JP5299986B2 (ja) * 2007-11-01 2013-09-25 国立大学法人山口大学 核酸の定量方法
WO2009073629A2 (en) * 2007-11-29 2009-06-11 Complete Genomics, Inc. Efficient shotgun sequencing methods
US9879330B2 (en) * 2008-04-05 2018-01-30 Versitech Limited Hepatitis B variants with reduced sensitivity to therapeutic compounds, their detection and uses thereof
WO2010126913A1 (en) * 2009-04-27 2010-11-04 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for use in the selective amplification of target sequences
EP3450573B1 (en) * 2009-06-23 2022-01-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acid from mollicutes
US8512955B2 (en) * 2009-07-01 2013-08-20 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
CN102639712A (zh) * 2009-10-23 2012-08-15 卢米耐克斯公司 用于提高反应特异性的具有非标准碱基的扩增引物
CN102191321B (zh) * 2011-03-23 2013-10-16 上海仁度生物科技有限公司 一种利用rna恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒

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