JP2023514388A - 並列化サンプル処理とライブラリー調製 - Google Patents

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Abstract

サンプルの濃縮、多段階ライブラリーの調製、サンプルの正規化、サンプル生体分子の検出、およびそれらの組合せのための方法、キット、およびシステムが、本明細書に記載される。濃縮および多段階ライブラリーの調製が、マイクロ流体ワークフローの文脈で記載される。陰性サンプルのバックグラウンドを低減しながらサンプルのスループットを増加させるための、サンプルバーコード付加の方法およびキットが記載される。反応部位のアレイに結合されたサンプル処理ユニットセルを備える集積化マイクロ流体デバイスが、集積型ワークフローのために提供される。【選択図】図４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月９日出願の米国仮特許出願第６３／０４９，９９８号、２０２０年２月２１日出願の米国仮特許出願第６２／９７９，８３２号、および２０２０年２月２０日出願の米国仮特許出願第６２／９７９，２０９号への優先権を主張し、それらすべての全体の内容は、すべての目的で参照により本明細書に組み込まれる。
自動マイクロ流体システムおよび／またはサンプルの並列的なライブラリー調製は、サンプル処理における労働力、試薬の使用、および変動性を低減することができる。これらの恩恵は、サンプルへのインデックス付与（バーコード付与）によってさらに高められ、それにより、ｑＰＣＲによるシークエンシングまたは検出の前に、並行して処理されたサンプルを組み合わせることが可能になる。さらに、より完全に集積化されたマイクロ流体ワークフローにより、実務時間と人為的ミスが低減されるものとなる。
それゆえに、本明細書に記載されるように、集積化マイクロ流体デバイスは、反応部位のアレイと、複数のサンプル処理部位を含む複数のサンプル処理ユニットセルとを含んでいてもよく、ユニットセルは、複数の異なる試薬入口と流体連通しており、アレイへのサンプル入口は、複数のユニットセルの複数のサンプル処理部位の下流にある。
複数の試薬入口は、各ユニットセルに共通のチャネルを共有してもよい。マイクロ流体デバイスは、ユニットセルの処理部位を装填するために使用される試薬入口を制御するように構成されたマルチプレクサを含みうる。
複数のサンプル処理部位は、複数のループおよび／またはチャンバを含みうる。各ユニットセルは、サンプル入口チャネル、廃液出口チャネル、追加試薬入口、および／または追加のカラムのうちの一つまたは複数をさらに含む。
各ユニットセルは、ユニットセルを制御するように構成された複数の弁を含みうる。複数の弁は、サンプルおよび試薬をユニットセル内の異なる位置に送達するように構成されてもよい。複数の弁は、サンプル処理場所を単独で設置し、または互いに連通して設置するように構成されうる。複数の弁は、異なる位置で混合を駆動するように構成されうる。複数の弁は、ユニットセルからサンプルまたは試薬溶液の流れを向けるように構成される。例えば、ユニットセルは、蠕動式ポンプ（例えば、連続した一連の弁によって画定される）を含む。
個々のユニットセルは、ビーズを保持するように構成された少なくとも一つのカラムをさらに含む。カラムは、複数の開口部を提供するふるい構造を含み、複数の開口部を通って、流体が流れるが、出口開口部よりも大きなビーズが保持されうる。
ある態様では、集積化マイクロ流体デバイスは、反応部位のアレイと、複数のサンプル処理部位を含む複数のサンプル処理ユニットセルとを含んでいてもよく、ユニットセルは、複数の異なる試薬入口と流体連通しており、アレイへのサンプル入口は、複数のユニットセルの複数のサンプル処理部位の下流にある。
方法は、ビーズをユニットセルのカラム内に装填すること、およびビーズ上にサンプル（すなわち、タンパク質、抗体、ＲＮＡ、ウイルス粒子などのサンプルの生体分子）を捕捉すること（例えば、ビーズをカラム内に装填する前または後に）を含みうる。本明細書で論じるように、ビーズは、一つまたは複数のタンパク質（例えば、標的血清タンパク質またはウイルス抗原に対する抗体などの抗体）およびオリゴヌクレオチド（例えば、ウイルスＲＮＡなどの標的ＲＮＡにハイブリダイズする）を含みうる（例えば、その表面上に存在しうる）。追加の工程は、洗浄緩衝液がカラム内のビーズの上と廃棄出口内とを流れるように、ビーズを洗浄することを含みうる。任意選択的に、レポーター、例えば、標的生体分子に結合するオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体、または標的生体分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブなどを、ビーズ上に流してもよい。追加の工程は、ビーズから溶出すること、例えば、溶出緩衝液をカラム内のビーズ上に流すこと、および任意選択的に、蠕動式ポンプを用いてループの周りに緩衝液を渡すなどによって、溶出緩衝液をビーズ間にわたってさらに循環させることなどを含みうる。
マルチプレックス化のためのサンプルバーコード付与は、サンプルのスループットを増加させうるが、残りのプライマー（例えば、標的がほとんどまたは全くないサンプル由来の）は、クロストークを作り出し、偽陽性および／または高いバックグラウンドをもたらしうる。このようなクロストークを低減するための方法およびキットを本明細書で論じる。
ある態様では、複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのアッセイ方法は、
ａ）別々のサンプルＳ中のそれぞれの標的ヌクレオチド配列を逆転写および予備増幅して、各サンプルからタグ付き標的ヌクレオチド配列を産生することであって、
サンプルＳのうち少なくとも一つが、標的ヌクレオチド配列を含み、
タグ付き標的ヌクレオチド配列が、サンプルタグおよび標的ヌクレオチド配列を含み、
予備増幅が、サンプルタグおよび標的特異的配列を含む、タグ付き標的特異的プライマーを用いて行われ、
標的特異的配列が、標的ヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする、逆転写および予備増幅すること；
ｂ）サンプルＳのそれぞれのタグ付き標的ヌクレオチド配列を混合して、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物を産生すること；
ｃ）混合物を複数の反応部位に分割すること；
ｄ）各反応部位に異なるプライマー対を添加すること；
ｅ）各反応部位の異なるサンプルからタグ付き標的ヌクレオチド配列を増幅することであって、異なる各プライマー対が、異なるサンプルタグにハイブリダイズするプライマーを含む、増幅すること；および／または
ｆ）増幅されたタグ付き標的核酸の存在を、標的特異的配列の少なくとも一部を含むがサンプルタグを含まない蛍光標的特異的プローブを用いて、ｑＰＣＲにより検出すること；を含み、
増幅の工程ｅは、標的特異的プローブの存在下である。
より大まかには、複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのアッセイ方法は、
ａ）少なくとも一つのタグ付き標的特異的プライマーを用いて、タグ付き標的ヌクレオチド配列を産生するコード反応に、各サンプルＳを別々に供することであって、サンプルＳのうち少なくとも一つは、標的ヌクレオチド配列を含み、タグ付き標的ヌクレオチド配列は、サンプルタグおよび標的ヌクレオチド配列を含むこと；
ｂ）サンプルＳのそれぞれのタグ付き標的ヌクレオチド配列を混合して、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物を産生すること；
ｃ）混合物を複数の反応部位に分割すること；
ｄ）異なるプライマー対を異なる反応部位に添加することであって、異なる各プライマー対が、異なるサンプルタグにハイブリダイズしてタグ付き標的ヌクレオチド配列を特定のサンプルから増幅するプライマーを含む、添加すること；
ｅ）標的特異的プローブの存在下でサンプルＳのうち少なくとも一つからタグ付き標的ヌクレオチド配列を増幅することであって、標的特異的プローブが、標的特異的プライマーの標的特異的配列の少なくとも一部と同一の配列を含むがサンプルタグを含まない、増幅することと；および／または
ｆ）タグ付き標的ヌクレオチドの存在を検出することを含みうる。
複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのアッセイ方法は、
ａ）少なくとも一つのタグ付き標的特異的プライマーを用いて、タグ付き標的ヌクレオチド配列を産生するコード反応に、各サンプルＳを別々に供することであって、サンプルＳのうち少なくとも一つは、標的ヌクレオチド配列を含み、タグ付き標的ヌクレオチド配列は、サンプルタグおよび標的ヌクレオチド配列を含むこと；
ｂ）サンプルＳのそれぞれのタグ付き標的ヌクレオチド配列を混合して、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物を産生すること；
ｃ）標的特異的プローブの存在下でサンプルＳのうち少なくとも一つからタグ付き標的ヌクレオチド配列を増幅することであって、標的特異的プローブが、標的特異的プライマーの標的特異的配列の少なくとも一部と同一の配列を含むがサンプルタグを含まない、増幅することと；および／または
ｄ）タグ付き標的ヌクレオチドの存在を検出することを含みうる。
また、本明細書に記載される方法のいずれかを実施するためのキットも、本明細書に記載される。
対象出願の態様はまた、ライブラリーの調製および／または正規化など、サンプルの並列処理のための方法、キット、およびデバイスを含む。
一部の実施形態では、ライブラリーの正規化の方法は、以下のうち一つまたは複数を含む：
ａ．複数のサンプルからアリコートを取得することであって、サンプルのポリヌクレオチドが、離間した逆位リピートを含む、取得すること、
ｂ．工程ａのアリコートに対し抑制ＰＣＲを行うこと、
ｃ．工程ｂ由来の増幅産物を定量すること、
ｄ．複数のサンプルをプールして、工程ｃの定量に基づいて正規化されたライブラリーを形成すること、および／または
プールされた複数のサンプルが、工程ｂの抑制ＰＣＲを受けないこと。
上記実施形態の方法は、本明細書に記載されるようなサンプルのタイプ、サンプルの数、抑制ＰＣＲ、ポリヌクレオチドの特性、サンプルの濃縮および／もしくは調製、プライマー、サンプルの定量および／もしくは正規化、マイクロ流体デバイス、改善の指標、ならびに／またはシークエンシング用途の態様をさらに含みうる。
一部の実施形態では、抑制ｑＰＣＲによるポリヌクレオチドのライブラリー定量のためのキットは、少なくとも１５０ヌクレオチド隔てられた離間した逆位リピートを有するライブラリー定量標品など、キット中の別のポリヌクレオチドの逆位リピートのうち一つの少なくとも８ヌクレオチドと同一の配列を含むプライマーを含みうる。
一部の実施形態では、ライブラリーの調製および定量のためのキットは、少なくとも８ヌクレオチド長の逆位リピート（例えば、インサートの側面に位置する逆位リピートを有するポリヌクレオチドを産生することができる）、および／または少なくとも８ヌクレオチドの逆位リピートと同一の配列を含むプライマーを、併せて提供するアダプター（またはプライマー）を含みうる。
いずれかの上記実施形態のキットは、本明細書に記載されるようなサンプルのタイプ、サンプルの数、抑制ＰＣＲ用の試薬、ポリヌクレオチドの特性、サンプルの濃縮および／もしくは調製用の試薬、プライマー、サンプルの定量および／もしくは正規化用の試薬、マイクロ流体デバイス、改善の指標、ならびに／またはシークエンシング用途の態様をさらに含みうる。キットは、ビーズ、マイクロ流体デバイス、逆転写試薬、プライマー、および／またはＰＣＲ（抑制ＰＣＲなど）試薬用マスターミックス、色素（受動参照色素（ｐａｓｓｉｖｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ）など）を含みうる。
概して、対象出願の態様は、上記方法の態様のいずれかを実施するためのキット、抑制ｑＰＣＲに基づくライブラリー正規化の方法、抑制ｑＰＣＲの方法、抑制ｑＰＣＲにより正規化されたライブラリーをシークエンシングする方法、および／または上記方法の態様のいずれかの抑制ｑＰＣＲに基づいて正規化されたサンプルのプールのうち、一つまたは複数を含みうる。
ある態様では、並列サンプル処理の方法は、標的核酸がスプリント鋳型であるスプリントライゲーションを含む。
例えば、スプリントハイブリダイゼーション産物を処理する方法は、第一のプローブおよび第二のプローブを標的核酸にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション産物を形成することを含んでいてもよく、その際に、第一のプローブの３’－ＯＨ末端は、第二のプローブの５’－ＰＯ４末端に隣接している。第一のプローブおよび第二のプローブのうち少なくとも一つは、結合部分を含む。本方法は、結合部分を固体支持体に特異的に結合することによって、ハイブリダイゼーション産物を捕捉することをさらに含みうる。
別の例では、スプリントライゲーション産物を検出する方法は、第一のプローブおよび第二のプローブを標的核酸にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション産物を形成することを含んでいてもよく、その際に、第一のプローブの３’－ＯＨ末端は、第二のプローブの５’－ＰＯ４末端に隣接している。本方法は、第一のプローブと第二のプローブとをライゲーションしてライゲーション産物を形成することをさらに含みうる。本方法は、ライゲーション産物の存在を検出することをさらに含みうる。
ハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物は、本明細書にさらに記載されるように、固体支持体（例えば、マイクロ流体デバイスのカラム中のビーズなどのビーズ）上に捕捉されてもよい。スプリントライゲーションプローブは、一つまたは複数のサンプルバーコード配列を含んでいてもよく、これにより、プールを分割して異なるサンプルのライゲーション産物を（例えば、アレイＩＦＣ上で）別々に検出する前に、サンプルのプーリング、サンプルの一括処理（例えば、捕捉、ライゲーション、および／または予備増幅）が可能になる。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばウイルスゲノムＲＮＡまたは哺乳類遺伝子転写物であってもよい。
ある態様では、並行サンプル処理用キットは、本明細書に記載のスプリントライゲーション法のための試薬を含みうる。このようなキットは、本明細書の任意の実施形態に記載される二つのスプリントライゲーションプローブを有していてもよく、任意選択的に、ライゲーション産物を形成するためのリガーゼ、ライゲーション産物を増幅するためのプライマー、および／またはライゲーション産物を固体支持体から分離するための試薬などの追加の試薬を、さらに含んでいてもよい。スプリントライゲーションキットは、本明細書に記載される一つまたは複数のマイクロ流体デバイスをさらに含みうる。
図１は、流体回路１０２内に供給する少なくともサンプル入口１０４と試薬入口１０６とを有するマイクロ流体デバイス１００の概要図である。このようなデバイスは、本明細書に記載のサンプル調製工程を実施しうる。このデバイスは、追加の入口および出口を含んでいてもよい。 図２は、対象出願の例示的なエラストマー製マイクロ流体デバイス２００のイメージである。図２Ａは、デバイスそのものである４８．Ａｔｌａｓ ＩＦＣ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社）を示す。図２Ｂは、サンプル入口２０４、サンプルバーコード試薬入口２０６、共通試薬入口２０８、洗浄溶液入口２１０、ならびに廃棄出口２１２を標示するマーキングに重ね合わされたデバイスを示す。入口は、空気圧系統（コントローラ）によって適用される背圧を介してマイクロ流体上に装填することができる。制御ポート２１４もマークされており、空気圧系統によって加圧されてデバイス上のエラストマー弁を動作させ、流れおよび流体連通を方向付けることができる。マイクロ流体回路の下にある基材は、サーモサイクラーに熱的に結合している。 図３は、ユニットセル３２０のアーキテクチャ、例えば、図１または図２の流体回路の概要図である。ユニットセルは、サンプル入口３０４によって提供される単一のサンプルを処理し、一つまたは複数の試薬入口３０６によって提供される異なる試薬にサンプルが反応する複数のサンプル処理部位３１４を提供しうる。ユニットセルは、ユニットセル内のサンプルを濃縮するためのカラム３０８、および／または本明細書に記載の廃棄出口、弁、ポンプ、またはマイクロ流体デバイスの他の構成要素などの追加要素を含みうる。 図４は、図２の例示的なユニットセル４０２の詳細な概略図である。ユニットセルを接合するチャネルを共有しうる、複数の試薬入口チャネル４０６が示されている。複数のサンプル処理部位は、チャンバ間のサンプルおよび／または試薬を混合するためのチャンバ４１４および／またはサンプル処理ループ４１２を有していてもよい。ユニットセルから過剰なまたは望ましくない流体を除去するための、廃棄出口チャネル４１６が示されている。弁（図示せず）が、ユニットセルに沿って構成されて、ユニットセル内の異なる位置（例えば、カラム、チャンバ、ループ）にサンプルおよび試薬を送達し、サンプル処理ループまたはチャンバを互いに隔離または連通するように配置し、異なる場所で試薬および／またはサンプル間の混合を駆動し、ユニットセルから（例えば、廃棄出口および／または採集出口へ）サンプルまたは試薬溶液の流れを方向付けるように動作されうる。ユニットセルは、サンプル入口チャネル４０４、ユニットセル内のサンプルを濃縮するためのカラム４０８、および／または弁、ポンプ、または本明細書に記載のマイクロ流体デバイスの他の構成要素などの追加要素を含みうる。 図５は、抑制ＰＣＲの主な機構を示し、この機構では、ＩＴＲなどの離間した逆位リピートを有する短い配列はヘアピンを形成し、このヘアピンは、より長いＤＮＡ分子により露出される逆位リピートにハイブリダイズするプライマーによる増幅を抑制する。 図６は、逆位リピート、シークエンシングアダプター、および／またはサンプルバーコードのＰＣＲベースの組込みを介するなどで、特定のライブラリー調製ワークフローで産生された様々なポリヌクレオチドを示す。ポリヌクレオチドの半分以上の長さを含みうるインサートの側面に位置する離間した逆位リピート（円で囲まれた）を有する所望のライブラリー産物（上）。ポリヌクレオチドは、シークエンシングアダプター（点線）をさらに含む。近接して逆位リピートを有するプライマー二量体産物（中央）が示されている。このような産物は、従来のｑＰＣＲに干渉する場合がある。「バブルＤＮＡ」産物（下）が示されており、ここでは、アダプターが再アニーリングし、インサートがミスマッチとなっている。このような産物は、長い産物の定量（例えば、キャピラリー電気泳動などの移動性アッセイによる）に干渉しうる。 図７は、サンプルバーコード付きライブラリーを提供するマイクロ流体多段階サンプル調製のワークフロー（上）を示す。異なるサンプルの異なるサンプルのプーリングをガイドするためのｑＰＣＲ定量および正規化のワークフローを示す（下）。対象出願において、ｑＰＣＲ工程は、本明細書に記載されるような抑制ｑＰＣＲであってもよい。 図８は、正規化されていないサンプルプールと正規化されたサンプルプールとのリードの均一性を示す。正規化されたサンプルプールを、抑制ｑＰＣＲによる定量に基づいてプールした。従来の正規化（例えば、バイオアナライザーまたは従来のｑＰＣＲによる）は、非正規化サンプルとの類似性を示す傾向がある。 図９は、正規化されていないサンプルプールと正規化されたサンプルプールとを比べて検出された遺伝子の数を示す。正規化されたサンプルプールを、抑制ｑＰＣＲによる定量に基づいてプールした。従来の正規化（例えば、バイオアナライザーまたは従来のｑＰＣＲによる）は、非正規化サンプルとの類似性を示す傾向がある。 図１０Ａおよび図１０Ｂはそれぞれ、例示的なスプリントハイブリダイゼーション産物およびスプリントライゲーション産物を示す。 図１０Ａおよび図１０Ｂはそれぞれ、例示的なスプリントハイブリダイゼーション産物およびスプリントライゲーション産物を示す。 図１１は、例示的なスプリントライゲーションのワークフローを示す。 図１２は、アレイ集積化流体回路（ＩＦＣ）の概略図である。 図１３は、対象出願の例示的なエラストマー製マイクロ流体デバイスおよび例示的な装填スキームのイメージである。 図１４は、図３のものと類似した概略図であり、例えば図１３の装填スキームなどにあるような、入口から、出口、およびユニットセル内の流れの方向を示す。 図１５は、ＲＮＡシークエンシング調製（Ａ）およびＤＮＡシークエンシング調製（Ｂ）のための例示的な装填スキームを示す概略図である。 図１６は、チップ上でのオリゴヌクレオチドの検出（ウイルスＲＮＡの検出など）（Ａ）、およびタンパク質（がんマーカー、ウイルス抗原、またはウイルス抗原に対する抗体など）の検出用のサンプル調製（Ｂ）のための、例示的な装填スキームを示す概略図である。 図１７は、図３のものと類似した概略図であり、複数のカラムを有する例示的なユニットセルを示す。 図１８は、例示的なクリーンアップ工程を示す。 図１９は、例示的な捕捉、サンプル調製、およびＰＣＲ増幅を示す。 図２０は、対象出願のマルチプレックスサンプルバーコード付与のワークフローを示す。 図２１は、単純なＤｏｒｆｍａｎプーリング法を示す。 図２２は、４つのサンプルが混合された（Ａ）際の、または８つのサンプルが混合された（Ｂ）際の、マルチプレックスサンプルバーコード付与（ｍｐｅ）法およびＤｏｒｆｍａｎプーリング（ｐｅ）法の効率を示す。 図２３は、図２０のマルチプレックス化サンプルバーコード付与アプローチを使用した場合に発生する可能性があるクロストークを示す。 図２４は、陰性サンプル（すなわち、標的ヌクレオチド配列を有しないサンプルＢ）由来の残りのプライマーが、陽性サンプル（サンプルＡ）由来の予備増幅された標的ヌクレオチド配列と反応し得る、反応スキームを提供する。 図２５は、標的特異的プローブが残りのプライマーと競合する、反応スキームを提供する。 図２６は、図２４のスキーム下のｑＰＣＲ曲線を示す。 図２７は、図２５のスキーム下のｑＰＣＲ曲線を示し、図２６と比較して、陰性サンプルについてＣＴの増加が２であったことを明示する。 図２８は、クロストークを低減するための別のアプローチを示す。
ライブラリーの調製および正規化を含む、サンプル調製のための方法、マイクロ流体システム、およびキットが、本明細書に提供される。一部の実施形態は、本明細書に記載されるｍＲＮＡシークエンシングアプリケーションまたはＤＮＡシークエンシングアプリケーションを含む、特定のシークエンシングアプリケーションを提供しうる。
方法、システム、およびキットは、濃縮および多段階サンプル調製のためのマイクロ流体デバイスおよび／またはコントローラを含みうる。
定義
本明細書で使用される用語は、概して、本発明の文脈内、および各用語が使用される特定の文脈内で、当技術分野でのそれらの通常の意味を有する。本発明のデバイスおよび方法、ならびにそれらの作製方法および使用方法を説明する際に、追加の指針を実務者に提供するために、特定の用語が下記または本明細書の他の場所で論じられる。便宜上、特定の用語は、例えば、斜体および／または引用符を用いて強調表示される。強調表示の使用は、用語の範囲および意味に影響を与えない。すなわち、用語の範囲および意味は、同じ文脈では、強調表示されているか否かにかかわらず同じである。同じ物事を複数のやり方で言うことができることが認識されよう。したがって、代替的な言語および同義語は、本明細書で論じる任意の一つまたは複数の用語に使用されてもよく、また用語が本明細書で詳述されるまたは論じられるか否かには、いかなる特別な意義も置かれない。特定の用語の同義語が提供される。一つまたは複数の同義語の詳述は、他の同義語の使用を除外しない。本明細書の任意の用語の例を含めて、本明細書の任意の場所での例の使用は、例示に過ぎず、本発明または例証された任意の用語の範囲および意味を決して限定しない。同様に、本発明は、好適な実施形態に限定されない。
本明細書で使用される際に、「約」または「およそ」は、概して、所与の値または範囲の２０パーセント以内、好ましくは１０パーセント以内、より好ましくは５パーセント以内を意味するものとする。本明細書中に与えられる数量はおおよそであり、このことは、用語「約」または「およそ」が明示的に記述されていない場合に推定されうることを意味する。
用語「分子」は、一つまたは複数の原子を含む、任意の別々のまたは区別可能な物質構造単位を意味し、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む。
用語「ポリマー」とは、互いに反復的に連結された二つ以上の構成単位（「ｍｅｒ」）から構成される任意の物質または化合物を意味する。例えば、「二量体」は、二つの構成単位が共に接合されている化合物である。
本明細書で使用される際の用語「ポリヌクレオチド」（オリゴヌクレオチドとも称される）とは、典型的なポリヌクレオチドに水素結合できる塩基を支持する骨格を有するポリマー分子を指し、このポリマー骨格は、ポリマー分子と典型的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＤＮＡ）との間で配列特異的にそのような水素結合を可能にするような様式で塩基を提示する。そのような塩基は、典型的には、イノシン、アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシル、およびチミジンである。ポリマー分子には、二本鎖および一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにその骨格修飾体、例えばメチルホスホン酸結合が含まれる。ライブラリーの正規化のためのサンプルの文脈において、ポリヌクレオチドとは、インデックス付き（またはバーコード付き）ポリヌクレオチドのサンプルを指すことがある。そのようなポリヌクレオチドはまた、ｍＲＮＡまたはｇＤＮＡに由来する「インサート」配列の側面に位置するシークエンシングアダプターを有することがある。
したがって、「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」とは、概してＤＮＡおよびＲＮＡ中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）であり、二つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ヌクレオチド配列は、典型的には、タンパク質および酵素を作製するために細胞機構によって使用される情報を含めた、遺伝情報を担持する。これらの用語には、二本鎖または一本鎖のゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成ポリヌクレオチドおよび遺伝子操作ポリヌクレオチド、ならびにセンスポリヌクレオチドとアンチセンスポリヌクレオチドとの両方が含まれる（センス鎖のみが本明細書に表されているが）。これには、一本鎖および二本鎖分子、すなわちＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、およびＲＮＡ－ＲＮＡのハイブリッド、ならびに塩基をアミノ酸骨格にコンジュゲートすることによって形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これには修飾塩基、例えば、チオウラシル、チオグアニン、およびフルオロウラシルなどを含有する核酸も含まれる。
本明細書のポリヌクレオチドは、天然の調節配列の側面に位置することもあるし、プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’－および３’－非コード領域などを含む異種配列に付随することもある。核酸はまた、当技術分野で公知の多くの手段によって修飾されていてもよい。このような修飾の非限定的な例としては、メチル化、「ｃａｐ」、天然のヌクレオチドのうちの一つまたは複数を類似体により置換すること、およびヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバマートなど）および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するものなどが挙げられる。ポリヌクレオチドは、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジンなど）、インターカレート剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化金属など）、およびアルキル化剤など、一つまたは複数の追加の共有結合部分を含有していてもよい。ポリヌクレオチドは、メチル結合もしくはエチルホスホトリエステル結合またはアルキルホスホロアミデート結合の形成によって誘導体化されてもよい。さらに、本明細書のポリヌクレオチドは、直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供することができる標識により修飾されてもよい。例示的な標識には、放射性同位元素、蛍光分子、ビオチンなどが含まれる。
「ＤＮＡ」（デオキシリボ核酸）とは、デオキシリボース糖骨格上に併せて連結される、ヌクレオチド塩基と呼ばれる化学構成単位であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）の任意の鎖または配列を意味する。ＤＮＡは、一本のヌクレオチド塩基鎖、または二重らせん構造を形成し得る二本の相補鎖を有することができる。「ＲＮＡ」（リボ核酸）とは、リボース糖骨格上に共に連結される、ヌクレオチド塩基と呼ばれる化学構成単位であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）のの任意の鎖または配列を意味する。ＲＮＡは、典型的には、一本のヌクレオチド塩基鎖を有する。
「ポリペプチド」または「タンパク質」（一つまたは複数のペプチド）は、ペプチド結合と呼ばれる化学結合によって併せて連結されるアミノ酸と呼ばれる化学構成単位の鎖である。酵素を含めたタンパク質またはポリペプチドは、自然界で発生することを意味する「天然」または「野生型」であってもよいし、「変異型」、「バリアント」、もしくは「改変型」であってもよく、このことは、それが天然のタンパク質または別の変異体から、作製、変更、誘導されているか、または何らかで異なるかもしくは変化していることを意味する。
オリゴヌクレオチド反応（例えば、コード反応、逆転写、増幅など）の文脈における「プローブ」とは、単に標的に結合する（ハイブリダイズする）オリゴヌクレオチド配列を指す。標的ヌクレオチド配列に結合した際に必ずしもシグナルをもたらさないスプリントライゲーションプローブおよび競合プローブが、本明細書に記載される。しかし、ｑＰＣＲプローブ、またはフルオロフォア（もしくはフルオロフォアおよびクエンチャー）を有するものと記載されるプローブを使用して、標的を検出してもよい。
「対象サンプル生体分子」とは、本明細書に記載されるアッセイにおいて特異的に結合、処理、および／または検出されうる標的であり、多くの場合は特定のオリゴヌクレオチドまたはタンパク質である。
用語「流れ」とは、本発明のデバイスを通るかまたは本発明の方法における液体または固体の任意の移動を意味し、以下に限定されないが、任意の流体の流勢を包含し、流勢によって材料が運ばれるか否かにかかわらず、その流勢により、流勢内で、または流勢に対して移動する任意の物質を包含する。例えば、本発明のデバイスを通るかまたは本発明の方法における、例えば、本発明のマイクロ流体チップのチャネルを通る、分子または細胞の移動は、流れを含む。このことは、本発明によれば、分子または細胞が、流れも含む流体の流勢によって運ばれるか否か、または分子もしくは細胞が、他の何らかの直接的もしくは間接的な力もしくは誘因によって移動させられるか、ならびに任意の誘因力の性質が既知であるもしくは理解されているか否かに関わらず成り立つ。分子または細胞が、本発明による検出、測定、またはソーティングに向けられる限り、いかなるの力の適用も、いかなる特定の理論または作用機序に関わらず、圧力、毛細管作用、電気浸透、電気泳動、誘電泳動、光学ピンセット、およびそれらの組合せを含むがこれらに限定されない流れを提供するために使用されうる。
「入口領域」とは、検出、測定、またはソーティングのために分子または細胞を受け取る、微細加工チップの範囲である。入口領域は、入口チャネル、ウェルまたはリザーバ、開口、および分子または細胞のデバイス内への進入を促進する他の特徴を含みうる。所望に応じて、チップは、一つを超える入口領域を含みうる。入口領域は、メインチャネルと流体連通し、そこから上流にある。
「出口領域」とは、検出、測定、またはソーティング後に分子または細胞を収集または分注する、微細加工チップの領域である。出口領域は、判別領域の下流であり、分岐チャネルまたは出口チャネルを含みうる。所望に応じて、チップは、一つを超える出口領域を含みうる。
「ループ」または「サンプル処理ループ」は、ループ内の溶液を混合するために（例えば、拡張ポンプまたは蠕動式ポンプによって）動作されうるループ状のチャネルである。弁がループを画定しかつ異なるチャンバを互いに連通させて配するよう動作されるように、ループは動的とされうる。ループは、任意の形状を有してよい。ループを含む一つまたは複数のチャネルは、ポンプおよび／もしくは弁を有するかもしくはそれらと協働してループを開閉してもよく、ならびに／または内容物をループに供給するかもしくはループから排出してもよい。ある実施形態では、ループは、マイクロ流体デバイス内の他のチャネルから隔離または閉鎖することができる。また、ある実施形態では、流体は、例えば、三つ以上のマイクロ弁を含む蠕動式ポンプを提供することによって、ループ内で循環させることができる。
ある実施形態では、「循環ループ」は、チップ内に位置し、典型的には、流体（例えば、生体サンプルの流れ）が循環するユニットセル中に、またはユニットセルと連通して位置する。循環ループは、「ハイブリダイゼーションループ」または「標的ループ」を含んでいてもよく、そこでは、流れが、ループおよびその内容物の中にあるかまたはそれらに露出している、例えばカラムの中などの、一連の標的またはプローブ（例えば、ＤＮＡまたはタンパク質）を通過して方向付けられている。例えば、プローブは、基材またはビーズ、例えば、固体基材などの表面にパターン形成されていてもよく、「プローブ基材」とも呼ばれる。
「検出領域」は、チップ内の場所であり、典型的には、メインチャネル（またはその一部）中にあるかもしくはそれに一致する、および／または検出ループ中にあるかもしくはそれに一致する場所であり、この場所では、識別、特性解析、ハイブリダイズ、測定、解析、またはソーティング（など）される分子または細胞は、所定の特徴に基づいて検査される。好適な実施形態では、分子または細胞は、一度に一つずつ検査される。他の好適な実施形態では、分子、細胞、またはサンプルは、例えば、グループで、アレイで、迅速な同時もしくは同時期の直列もしくは並列の配置で、または親和性クロマトグラフィーによって、併せて検査される。このような一実施形態では、サンプルは、検出領域中のプローブに曝露されるが、好ましくは、プローブは、検出領域内、例えば標的ハイブリダイゼーションもしくは検出ループ内で所定のパターンを有するか、または検出領域と一致している。好ましくは、分子または細胞の特性は、例えば、レポーターの存在または量を試験することによって、光学的に検出または測定される。例えば、検出領域は、顕微鏡、ダイオード、光刺激デバイス（例えば、レーザー）、光電子増倍管、およびプロセッサ（例えば、コンピュータおよびソフトウェア）、ならびにそれらの組合せのうち一つまたは複数と連通し、それらの組合せは、特性、マーカー、またはレポーターを代表するシグナルを検出し、判別領域で測定またはソーティングの動作を決定し方向付けるように協働する。ソーティングの実施形態では、検出領域は、判別領域と流体連通し、判別領域にあるか、その近傍にあるか、またはその上流にある。
「判別領域」または「分岐点」とは、チャネルの接合部であり、ここでは、分子または細胞の流れが、検出領域の検査に関連して受信されるシグナルに応じて、一つまたは複数の他のチャネル、例えば分岐チャネルに入るように方向を変えることができる。典型的には、判別領域は、モニタリングされる、および／または検出領域の制御下にあるため、判別領域は、このような検出領域に「対応」しうる。判別領域は、一つまたは複数のソーティング技法または流れ制御システム、例えば、電気、電気浸透圧、（マイクロ）弁などによるシステムと連通しており、その影響を受ける。流れ制御システムは、分子または細胞の流れを所定の分岐チャネルに変えるかまたは方向付けるために、種々のソーティング技法を採用することができる。
「分岐チャネル」とは、判別領域およびメインチャネルと連通するチャネルである。典型的には、分岐チャネルは、検出領域によって検出されて判別領域でソートされた際に、対象の分子または細胞の特性に応じて、分子または細胞を受け取る。ブランチチャネルは、他のチャネルと連通して、追加のソーティングを可能にしうる。あるいは、分岐チャネルはまた、出口領域を有していてもよく、および／または分子または細胞の収集または廃棄を可能にするウェルもしくはリザーバにより終結してもよい。
「遺伝子」とは、機能性ポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列である。本発明の目的では、遺伝子は、細胞内に見出され得るｍＲＮＡ配列を含む。例えば、本発明による遺伝子発現レベルを測定することは、ｍＲＮＡレベルを測定することに対応しうる。「ゲノム配列」とは、生物体の総遺伝子セットである。用語「ゲノム」とは、全ゲノムのコード配列を示す。
ポリヌクレオチドは、一つのポリヌクレオチドの少なくとも一つの鎖が、所望または規定のストリンジェンシー条件下で別のポリヌクレオチドにアニーリングできる場合に、互いに「ハイブリダイズ」しうる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、ａ）ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が行われる温度、ならびにｂ）ハイブリダイゼーション溶液および洗浄溶液のイオン強度および極性（例えば、ホルムアミド）、ならびに他のパラメータによって決定される。ハイブリダイゼーションは、二つのポリヌクレオチドが実質的に相補的な配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、ミスマッチが許容される場合がある。典型的には、高ストリンジェンシー（例えば、６５℃での０．５×ＳＳＣの水溶液中など）での二つの配列のハイブリダイゼーションは、配列がその配列全体にわたってある程度の高度の相補性を呈することを必要とする。中間ストリンジェンシー（例えば、６５℃での２×ＳＳＣの水溶液など）および低ストリンジェンシー（例えば、５５℃での２×ＳＳＣの水溶液など）の条件は、ハイブリダイズしている配列間に、その条件に対応して全体的な相補性がより少ないことを必要とする。（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａである。）本明細書のポリヌクレオチドに「ハイブリダイズする」ポリヌクレオチド配列は、任意の長さであってよい。一実施形態では、そのようなポリヌクレオチド配列は、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０ヌクレオチドの長さである。
本明細書で使用される際のサンプルの「バーコード」、「タグ」、または「インデックス」は、互換的でありうる。サンプルタグ付き（すなわち、バーコード付き）プライマーなどによるコード反応の文脈では、タグ（すなわち、バーコード）とは、サンプルを識別する配列であり、それにより、以後、各サンプルから生じた反応産物を識別し続けつつ、サンプルが他のサンプルと共にプールされうる。そのため、サンプルタグ付きプライマーは、標的ヌクレオチド配列を増幅するサンプルを識別する配列を含む。例えば、シークエンシングは、サンプルタグ（すなわち、インデックス）を読み取り、どのサンプルから標的リードが来たかを識別することができる。本願の態様には、サンプルタグ（サンプルタグ配列をハイブリダイズする）に対する少なくとも一つのプライマーを用いたｑＰＣＲによるものなど、サンプルタグ付きヌクレオチド配列の選択的な増幅が含まれる。
「同一配列」とは、互いに同一である、通常は６ヌクレオチド以上の配列を意味する。ある一つの配列が、増幅された標的ヌクレオチド配列などのオリゴヌクレオチドのものである場合、配列が同一であるか否か（例えば、プライマーまたはプローブに対して）を決定する際に、どちらかの鎖を考慮することができる。
サンプル
ある態様では、少なくとも８、１２、２４、４８、９６、または３８４個のサンプルが、対象の方法またはキットによって処理される。サンプルは、真核生物サンプル（例えば、ヒト、霊長類、齧歯類）または細菌サンプルなどの任意の生物学的供給源由来としうる。サンプルは、本明細書に記載の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）などの対象生体分子を有しうる。サンプルは、細胞サンプル、例えば組織サンプルまたは細胞培養物などを由来としていてもよい。ある態様では、サンプルは、固定した組織（例えば、固形組織または細胞）を由来としていてもよい。ある態様では、固定した組織（ＦＦＰＥ組織など）は、断片化（例えば、ＲＮＡ）を受け、質が変わりやすいことがあり、結果としてシークエンシング深度が変わりやすいものとなる。標的生体分子がバイオマーカーまたはウイルス抗原である場合など、ある特定の態様では、サンプルは、血液サンプル（例えば、血清、血漿、もしくは全血）、唾液サンプル、または鼻腔スワブを含みうる。核酸は、タンパク質が存在しないかまたは最小限の量で存在する、サンプル中に存在しうる。態様は、シークエンシングアダプターの添加によるものなど、シークエンシングのためにサンプルポリヌクレオチドが少なくとも部分的に調製されるサンプルライブラリーの提供または産生を含む。
シークエンシング技術
一部の実施形態は、ｍＲＮＡシークエンシングアプリケーション（標的ＲＮＡ－ｓｅｑ、３’ＲＮＡ－ｓｅｑ、完全長ＲＮＡシークエンシングなど）、またはＤＮＡシークエンシングアプリケーション（全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）、標的再シークエンシング、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）シークエンシング、ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ－Ｓｅｑ）、クロマチンアクセシビリティシークエンシング（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）など）、およびメチル化シークエンシング（亜硫酸シークエンシング）などのエピジェネティックスを含む、特定のシークエンシングアプリケーションを提供しうる。本明細書で論じられる、または当技術分野で公知の任意の適切なシークエンシング技術は、対象出願の範囲内である。
サンプルのバーコード付与を（例えば、二重インデックス付与を通じて）可能にするワークフローを含む、特定のシークエンシング法、および対応するライブラリー調製ワークフローは、当技術分野で公知である。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって公開されたＩｌｌｕｍｉｎａ Ａｄａｐｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓのリストは、Ｎｅｘｔｅｒａキット、ＡｍｐｌｉＳｅｑキット、ＴｒｕＳｉｇｈｔキット、およびＴｒｕＳｅｑキットを含めて一般的なライブラリー調製キット用のアダプター配列、インデックス配列、およびプライマーを提供する。これらおよびその他のシークエンシング方法およびライブラリー調製キットは、本願の範囲内であり、Ｓｌａｔｋｏらにより“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｎｅｘｔ‐ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．”Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １２２．１（２０１８）：ｅ５９に一部が記載されている。現在のシークエンシング方法は、本明細書では次世代シークエンシング（ＮＧＳ）と称されることがある。ＮＧＳには、クローン性拡大（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングにおけるブリッジ増幅）に基づく技術と単一分子シークエンシング技術とを含む、合成技術による多くのシークエンシングが含まれる。
シークエンシングライブラリーの調製およびアプリケーション
本明細書で使用される際に、ライブラリー調製は概して、シークエンシングのためのサンプルの調製を指す。結果として生じるポリヌクレオチドは、シークエンシングアダプターを有してもよく、サンプルにバーコード付与（インデックス付与）されてもよい。
これらおよび他のライブラリー調製の方法およびキットは、本発明の目的に適合しうるものであり、Ｈｅａｄらによって“Ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｏｖｅｒｖｉｅｗｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２０１４；５６（２）：６１－ｐａｓｓｉｍに一部が記載され、本明細書にさらに記載されている。
なお、ライブラリー調製前のサンプル調製工程は、本願の範囲内であり、以下に限定されないが、サンプル溶解、核酸精製、および特定の核酸群（ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、標的ｍＲＮＡなど）の濃縮のうち一つまたは複数を含む。シークエンシングは、全ゲノムシークエンシング、全トランスクリプトームシークエンシング、ＴＣＲ／ＢＣＲシークエンシングなどの標的特異的シークエンシング、またはクロマチンアクセシビリティシークエンシングなど、ＲＮＡまたはｇＤＮＡ標的のものでありうる。
ライブラリー調製工程は、断片化、逆転写（例えば、テール付加および鋳型切替えを伴う）、ならびにシークエンシングアダプターおよび／またはサンプルバーコードの付加（例えば、ＰＣＲを介して）を含みうる。
追加の工程としては、マイクロ流体デバイスからの採集、サンプル定量に基づくプーリング（サンプルの正規化）、枯渇工程（酵素分解、切断、ハイブリダイゼーションなどを介したリボソームＲＮＡの枯渇工程など）、短い産物（例えば、プライマー二量体）などの望ましくないアーチファクトを除去するためのクリーンアップ工程、プールされたサンプルの増幅（例えば、ｐ５／Ｐ７プライマーによる）、およびシークエンシング前のプールされたサンプルの定量が含まれる。
断片化およびライブラリー調製
一般に、ＮＧＳ解析のためのＲＮＡまたはＤＮＡを調製するためのコア工程は、（ｉ）標的配列を所望の長さに断片化および／またはサイズ調整すること、（ｉｉ）標的を二本鎖ＤＮＡに変換すること、（ｉｉｉ）標的断片の末端にオリゴヌクレオチドアダプターを付加させること、および（ｉｖ）シークエンシングのための最終ライブラリー産物を定量することである。
断片化は、加熱、せん断、または酵素（例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、制限酵素、トランスポザーゼなどを用いて）によって実施されうる。
最終ライブラリー中の標的ＤＮＡ断片のサイズは、ＮＧＳライブラリー構築の重要なパラメータである。核酸鎖の断片化には、物理的、酵素的、および化学的という三つのアプローチが利用可能である。ＤＮＡ断片化は、典型的には、物理的方法（すなわち、音波せん断および超音波処理）、または酵素的方法（すなわち、非特異的エンドヌクレアーゼカクテルおよびトランスポザーゼタグ付け反応）によって行われる。当研究室では、Ｃｏｖａｒｉｓ機器（Ｃｏｖａｒｉｓ社、マサチューセッツ州ウォバーン）を用いた音波せん断を、典型的には、１００～５０００ｂｐの範囲のＤＮＡ断片を得るために行うのに対し、メイトペアライブラリーに必要な６～２０Ｋｂｐの範囲には、Ｃｏｖａｒｉｓ ｇ－ＴＵＢＥを採用している。酵素法としては、ＤＮａｓｅ Ｉまたはフラグメンターゼ、二つの酵素混合物（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州イプスウィッチ）による消化が挙げられる。
しかし、フラグメンターゼは、物理的方法と比較して、より多くの人工インデルを産生した。ＤＮＡを断片化するための代替的な酵素法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＮｅｘｔｅｒａ断片化技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、カリフォルニア州サンディエゴ）であり、この技術では、トランスポザーゼ酵素が断片化とｄｓＤＮＡへのアダプター配列の挿入とを同時に行う。この方法には、サンプル操作および調製の時間の減少を含む、いくつかの利点がある。
アダプター配列の長さが一定であるため、所望のライブラリーサイズは、所望のインサートサイズ（アダプター配列間のライブラリー部分を指す）によって決定される。次いで、最適なインサートサイズは、ＮＧＳ機器の限界によって、および特定のシークエンシングアプリケーションによって決定される。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ技術を使用する場合、ライブラリーを変性し、希釈し、フローセルの二次元表面上に分配し、次いで増幅するというクラスタ生成のプロセスによって、最適なインサートサイズは影響を受ける。より短い産物はより長い産物よりも効率的に増幅するが、より長いライブラリーインサートはより短いインサートよりも大きなかつ散在性のクラスタを生成する。最適なライブラリーサイズは、シークエンシングアプリケーションによっても規定される。エキソームシークエンシングでは、ヒトエキソームの８０％超が２００塩基未満の長さである。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）／スモールＲＮＡライブラリー調製の場合、所望の産物は、１２０ｂｐのアダプター二量体よりも２０～３０塩基大きいに過ぎない。したがって、所望の産物についてライブラリーを可能な限り濃縮するためにゲルサイズ選択を行うことが決定的に重要である。
全ゲノムをシークエンシングするためのＤＮＡサンプル、ゲノム内の標的領域（例えば、エキソームシークエンシング）、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ実験、またはＰＣＲアンプリコン（以下を参照）からのライブラリー調製は、同じ一般的なワークフローに従う。最終的に、あらゆるアプリケーションについて、ライブラリーを可能な限り複雑にすることが目標である（以下を参照）。
ＤＮＡからシークエンシングライブラリーを作製するための数多くのキットが、様々なベンダーから市販されている。競争により、価格が着実に低下し、品質が上がった。マイクログラムからピコグラムまでの量の出発物質のライブラリーを作製するためのキットが利用可能である。しかし、出発物質が多いほど増幅が少なくなり、それゆえにライブラリーの複雑さも改善するという一般原則を念頭に置くべきである。
ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔｅｒａ ｐｒｅｐを除いて、ライブラリー調製は、（ｉ）断片化、（ｉｉ）末端修復、（ｉｉｉ）５’プライム末端のリン酸化、（ｉｖ）シークエンシングアダプターへのライゲーションを容易にする３’末端のＡテール付加、（ｖ）アダプターのライゲーション、および（ｖｉ）両端にライゲーションされたアダプターを有する産物を濃縮するための数回のＰＣＲサイクル、のうち一つまたは複数を含み得る。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔワークフローの主な違いは、異なるアダプター配列への平滑末端ライゲーションの使用である。
Ｔａｋａｒａのサンプル調製キットは、第一鎖合成、テール付加、および鋳型切替えを実施する。テールを付加される第一鎖は、第一のプライマー（例えば、ポリ（Ｔ）プライマー、標的特異的プライマー、または縮重プライマー）から合成される。テール配列に相補的な３’配列を有するオリゴヌクレオチドであって、伸長によって第一鎖に組み込まれる鋳型プライマー結合部位を提供する。別のプライマー結合部位が、第一のプライマーによって提供されてもよいし、別のプライマー（例えば、ポリ（Ｔ）プライマー、標的特異的プライマー、または縮重プライマー）を用いてＰＣＲにより添加されてもよい。組み込まれたプライマー結合部位は、以降のＰＣＲおよびアダプター配列（例えば、インデックス、リード配列、増幅配列など）の組込みに使用することができる。
オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズする 増幅は、テール配列に対するプライマーと、ランダマー（Ｎ６）プライマー、標的特異的プライマー、ポリ（Ａ）プライマーなどの適用特異的プライマーとを用いて実施される。プライマー（アダプター配列を含む）による増幅のための部位は、によって導入される。
開始ＤＮＡが断片化されると、断片末端は平滑化され、以下の三つの酵素の混合物を用いて５’リン酸化されうる：Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＫｌｅｎｏｗラージフラグメント。次に、３’末端は、ＴａｑポリメラーゼまたはＫｌｅｎｏｗフラグメント（ｅｘｏ－）のどちらかを用いてＡテールを付加される。ＴａｑはＡテール付加ではより効率的であるが、Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）は、加熱が望ましくない用途、例えばメイトペアライブラリーの調製などに用いることができる。アダプターライゲーション反応中、最適なアダプターとフラグメントとの比は、コピー数またはモル濃度に基づいて計算された約１０：１である。アダプターが多すぎる場合、分離が難しくその後のＰＣＲ増幅で優勢となる可能性のあるアダプター二量体が形成しやすい。ビーズまたはカラムベースのクリーンアップは、末端修復反応およびＡテール反応後に実施することができるが、ライゲーション後では、ビーズベースのクリーンアップを行うことが、過剰なアダプター二量体を除去する際により効果的であることが見出された。
マルチプレックス化を容易にするために、異なるバーコード付きアダプターを各サンプルに使用することができる。あるいは、異なるバーコード付きＰＣＲプライマーを用いて異なるサンプルを増幅することによって、ＰＣＲ増幅工程でバーコードを導入することができる。バーコード付きアダプターおよびＰＣＲプライマーを含む高品質試薬は、多くのベンダーのキットで容易に入手可能である。しかし、アダプターから酵素までＤＮＡライブラリー構築のすべての構成要素は、今では十分に文書化されており、容易に「自家製」ライブラリー調製キットに組み立てることができる。
代替的な方法は、Ｎｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）であり、これは、トランスポザーゼ酵素を用いることによってゲノムＤＮＡライブラリーを調製するとともに、ＤＮＡを断片化し、「タグ化」と称する単一チューブ反応でタグ付けする。工学的に操作された酵素は二重の活性を有し、すなわち、ＤＮＡを断片化するとともに、断片の両端に特定のアダプターを付加する。これらのアダプター配列を用いて、ＰＣＲによりインサートＤＮＡを増幅する。このＰＣＲ反応は、インデックス（バーコード）配列も追加する。調製手順は、ＤＮＡ断片化、末端修復、およびアダプターライゲーションを単一の工程に組み合わせることによって、従来のプロトコールを改善する。このプロトコールは、機械的断片化法と比較して、ＤＮＡ入力量に非常に影響され易い。適切な距離で分離された転位事象を得るためには、トランスポザーゼ複合体とサンプルＤＮＡとの比率が決定的に重要である。断片サイズも反応効率に依存するため、温度および反応時間などのすべての反応パラメータは決定的に重要であり、厳密に制御されなければならない。
ＲＮＡシークエンシングライブラリー調製
最良のライブラリープロトコールを決定する前に、ＲＮＡシークエンシング実験の主な目的を考慮することが重要である。目的が、複雑かつグローバルな転写事象の発見である場合、ライブラリーは、コードＲＮＡ、非コードＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子間ＲＮＡを含めたトランスクリプトーム全体を、可能な限り整合性をもって捕捉するべきである。しかし、多くの場合、目的は、タンパク質に翻訳されるコードｍＲＮＡ転写物のみを研究することである。さらに別の目的は、小さなＲＮＡ、最も一般的にはｍｉＲＮＡだけでなく、小さな核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、小さな核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、および転写ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）もプロファイリングすることである可能性がある。本レビューでは、ＲＮＡシークエンシングライブラリーの原理を説明するよう努めるが、利用可能な各種プロトコールのすべてを説明することはできない。興味のある読者は、多くの選択肢を自分で調べるべきである。
ｍｉＲＮＡライブラリー構築における大きな制約の一つは、入力ＲＮＡの量が少ない場合（例えば、＜２００ｎｇの総ＲＮＡ量）に発生する。すなわち、短いアダプター二量体が、ＲＴ－ＰＣＲ反応において、所望の産物、アダプター、およびｍｉＲＮＡインサートと競合する。アダプターの二量体が多すぎる場合、サイズ選択工程中にゲルを流れ上って、産物のバンドを汚染する。
ｍＲＮＡシークエンシングライブラリーについては、ランダムプライマー、オリゴ－ｄＴプライマーを用いた、またはアダプターをｍＲＮＡ断片に取り付けた後に何らかの形の増幅を行うことによる、ｃＤＮＡ合成（逆転写）に基づく方法が開発されている。ｍＲＮＡは、ランダムオリゴマーによって、またはアンカー型オリゴ－ｄＴによってプライミングされて、第一鎖ｃＤＮＡを生成することができる。ランダムプライミングを使用する場合、最初にｒＲＮＡを除去または還元する必要がある。ｒＲＮＡは、Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、ウィスコンシン州マディソン）およびＲｉｂｏＭｉｎｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）などのオリゴヌクレオチドプローブベースの試薬を用いて除去することができる。あるいは、ポリアデニル化ＲＮＡを、オリゴｄＴビーズを用いて陽性選択することができる。このようなポリＡテールは、末端修復（例えば、Ａテール付加酵素）によって付加されて、短いまたは断片化されたＲＮＡの捕捉を可能にしうる。あるいは、またはさらに、ビーズは、ＴＣＲ配列および／またはＢＣＲ配列などの一つまたは複数の標的核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含みうる。あるいは、またはさらに、ビーズは、ＴＣＲ配列および／またはＢＣＲ配列などの一つまたは複数の標的核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含みうる。あるいは、またはさらに、標的特異的プローブは、ＴＣＲ配列および／またはＢＣＲ配列などの一つまたは複数の標的核酸にハイブリダイズしてもよく、前記プローブは、ビーズによる特異的結合を可能にする結合部分を含んでいてもよい。
多くの場合、元のＲＮＡ標的の鎖の配向を保持するライブラリーを作出することが望ましい。例えば、一部の事例では、転写は、遺伝子発現の制御に役割を果たしうるアンチセンスＲＮＡ構築物を作り出す。実際に、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）解析は、指向性ＲＮＡシークエンシングに依存する。指向性ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを調製する方法は、容易に入手可能である。この概念は、第二鎖ｃＤＮＡ合成反応にｄＵＴＰを組み込むことによって、ｃＤＮＡ反応を行い、二本鎖のうちの一方を選択的に除去することである。次いで、ウラシル含有鎖は、酵素的に除去されうるか（ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、または鋳型鎖中のウラシルを認識できないＰＣＲポリメラーゼによりさらに増幅するのを防止されうる（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡキット）。さらに、アクチノマイシンＤが、高頻度で第一鎖ｃＤＮＡ合成反応に添加され、第一鎖合成反応中の偽アンチセンス合成を低減する。
代替的なハイブリッドの方法では、プライマーの５’末端上にアダプター配列を有するランダムなまたはアンカーされたオリゴｄＴプライマーを利用して、第一鎖ｃＤＮＡ合成を開始する。次に、鋳型切替え（図４Ｂに示す）と呼ばれる手順で、３’アダプター配列がｃＤＮＡ分子に付加される。この方法は、鋳型切替え反応によって３’末端上に配される固有の配列タグを用いて、第二鎖合成することなく第一鎖ｃＤＮＡ分子を直接的にＰＣＲ増幅することができるという点で、明確な利点を有する。５’の固有の配列タグも、第一鎖合成における標準的なプライミングによっても導入される。
標的ＤＮＡシークエンシング
標的化シークエンシングにより、研究者は、選択された遺伝子セットまたは特定のゲノム要素、例えば、ＣｐＧアイランドおよびプロモーター／エンハンサー領域を研究することが可能になる。標的化シークエンシングの一般的な用途は、エキソームシークエンシングであり、高品質なキットが市販されている。すなわち、ＳｕｒＳｅｌｅｃｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＳｅｑＣａｐ（Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ社、ウィスコンシン州マディソン）、およびＴｒｕＳｅｑ Ｅｘｏｍｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）である。三つの捕捉方法はすべて、全ゲノムサンプルから作製されたシークエンシングライブラリーを濃縮するためのプローブハイブリダイゼーションに基づく。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社は、高度にマルチプレックス化されたＰＣＲベースのＡｍｐｌｉＳｅｑ技術に基づく代替的なアプローチを商品化している。これら全ての製品をカスタマイズする選択肢があり、研究者は、ゲノム内の数千から数百万の塩基をカバーする標的領域について、捕捉またはＰＣＲプローブを設計することができる。
ハイブリダイゼーション捕捉アプローチは、概して良好に機能するが、標的外捕捉に遭い、高レベルの反復を有するかまたは複雑さの低い配列（すなわち、ヒト組織適合遺伝子座領域）を効果的に捕捉するのに難航しうる。ＰＣＲベースのＡｍｐｌｉＳｅｑ法は、より少ない量のＤＮＡでより効率的である。また、プローブは参照配列に基づいており、参照から実質的に逸脱するバリエーション、ならびに有意な挿入／欠失変異は、必ずしも識別されないものとなることにも留意すべきである。
短いアンプリコンのシークエンシングはまた、シングルリードまたはペアエンドリードのデザインの使用のどちらかで配列全体を取得することを可能にする。ここで、アダプターをアンプリコンの末端に直接付加し、抗体またはＴ細胞受容体遺伝子配列の再構築、ならびにマイクロバイオームプロジェクトにおける種の識別に必要不可欠なハプロタイプ情報を保持するようにシークエンシングすることができる。
しかし、多くの場合、標的シークエンシング用途のためにより長いアンプリコンを設計する必要がある。この場合、ＰＣＲ産物は、シークエンシングのために断片化される必要がある。アンプリコンは、音波せん断、超音波処理、または酵素消化を使用して、現状のまま断片化することができる。あるいは、ライゲーションとその後の断片化を用いて、まず、より長い断片に連結することができる。アンプリコンシークエンシングに付随する問題の一つは、ＰＣＲ媒介性組換えによってＰＣＲ中に生成されたキメラアンプリコンの存在である。この問題は、複雑さの低いライブラリーで、および過剰増幅によって悪化する。ＰＣＲプライマー配列または他の高度に保存された配列の存在は、蛍光検出（すなわち、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を利用するいくつかのシークエンシングプラットフォーム上の技術的制約を提示する。これは、種の識別のための１６Ｓ ｒＲＮＡを用いたマイクロバイオーム研究などのアンプリコンベースのシークエンシングで起こりうる。この状況では、リード開始時のＰＣＲプライマー配列は、シークエンシングの各サイクルと全く同じ塩基を生成し、シグナル検出ハードウェアおよびソフトウェアに問題を生じさせるものとなる。この制約は、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシステム（蛍光ベースではない）では問題ではなく、可能な限り同じレーン内の複数の異なるアンプリコンをシークエンシングすることによって、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムで対処することができる。本発明者らが採用する代替的な戦略は、特定のアンプリコンのＰＣＲ中にいくつかのＰＣＲプライマーを使用することである。各プライマーは、アダプターがアンプリコンにライゲーションされる場合にシークエンシングの順序を相殺する／ずらすために、異なる数の塩基（典型的には１～３個のランダム塩基）を５’末端に付加されている。
追加のシークエンシングアプローチ
元来、ロースループットＰＣＲベースアッセイとして開発されていたところ、ＮＧＳ技術の導入により、ＣｈＩＰ－ｓｅｑをゲノムワイドスケールで効率的に適用することが可能になった。このアッセイの一般的な原理は、付随するＤＮＡに連動する特定のタンパク質の免疫沈降を伴う。この手順では通常、ＤＮＡ－タンパク質をホルムアルデヒドにより架橋した後に、ミクロコッカスヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）および／または超音波処理を用いてクロマチンを断片化する必要がある。特異的な抗体を用いて、対象のタンパク質またはヒストン修飾を標的とするが、この時点でＤＮＡを精製し、ハイスループットシークエンシングに供する。シークエンシングの結果は、適正な対照と比較されるべきである。成功したＣｈＩＰ－ｓｅｑからのデータは、標的タンパク質／改変ヒストンに架橋された配列について濃縮されるべきである。
ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）は、特定の配列、一本鎖骨格、二次構造、および二本鎖ＲＮＡを含めたリボ核酸モチーフを認識する（７２、７３）。これらの相互作用は、あらゆるタイプのＲＮＡを含み、転写から分解まで、あらゆる段階で発生する。メッセンジャーＲＮＡの転写後プロセッシングにおける数多くの工程が重複し、その結果、その存在の任意の所与の時点で転写物に結合した複数のＲＢＰ複合体が生じる。ＲＩＰ－ｓｅｑは、タンパク質特異的抗体を用いて、または対象のＲＢＰのタグ付けされたバージョンを発現することによって行うことができる。さらに、ＲＩＰ－ｓｅｑは、結合ＲＮＡの集団に基づいて、特定の細胞型および／または細胞状態でＲＢＰの機能を特性解析することを可能にする。
シトシンの５つの位置のメチル化（５ｍＣ）は、ＤＮＡメチル化の最も一般的な形態であり、ヒトゲノム中の２，８００万個のＣｐＧジヌクレオチドの６０％～８０％がメチル化されている。ゲノムワイドの低メチル化は、突然変異および染色体の不安定性の増加率と関連しているが、プロモーターの高メチル化は遺伝子転写を阻害する。ＤＮＡメチル化は、遺伝子インプリント、転移因子の抑制、およびＸ染色体の不活化にも不可欠である。異常なＤＮＡメチル化は、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、および代謝障害を含めた多くの疾患と関連している。メチル化感受性制限酵素シークエンシング（ＭＲＥ－ｓｅｑ）は、ＣｐＧメチル化に感受性である制限酵素に依存する。メチル化ＤＮＡの親和性濃縮は、メチル化ＤＮＡ（ＭｅＤＩＰ）に特異的な抗体、またはメチル化ＤＮＡを結合できる他のタンパク質（ＭＢＤｓｅｑ）のどちらかが必要である。亜硫酸ナトリウムを用いたＤＮＡの処理は、メチル化シトシンが保護される一方で、非メチル化シトシンのウラシルへの化学的変換をもたらす。
ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、シークエンシングアダプターをゲノムの開放領域に挿入する超活性変異体Ｔｎ５トランスポザーゼを用いてオープンクロマチンを探索することによって、アクセス可能なＤＮＡ領域を特定する。天然由来のトランスポザーゼは活性レベルが低いが、ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、変異した超活性トランスポザーゼを利用する。「タグ化」と呼ばれるプロセスにおいて、Ｔｎ５トランスポザーゼは、二本鎖ＤＮＡを切断してシークエンシングアダプターによりタグ付けする。次いで、タグ付きＤＮＡ断片を精製し、ＰＣＲ増幅し、次世代シークエンシングを用いてシークエンシングする。次いで、シークエンシングリードを用いて、アクセシビリティの増加した領域を推定するとともに、転写因子結合部位およびヌクレオソーム位置の領域をマッピングすることができる。ある領域のリード数は、１ヌクレオチドの分解能で、そのクロマチンがどの程度開いているかに相関する。
アダプターとサンプルインデックスの付加
本明細書に記載されるように、配列は、転位、ライゲーション、テール付加、および鋳型切替え、ならびに／またはプライマー（例えば、縮重型であるか、標的特異的であるか、または転位、ライゲーション、もしくはテール付加および鋳型切替えにより断片に付加された配列にハイブリダイズする）を用いたＰＣＲを介して、サンプルのポリヌクレオチドに付加されてもよい。付加された配列は、ｃＤＮＡインサートまたはｇＤＮＡインサートなどのインサートの側面に位置しうる。付加された配列は、さらに別の増幅のためのプライマー結合部位、シークエンシングアダプター、一分子識別子、および／またはサンプルのプーリングを可能にするサンプルインデックス（バーコード）を提供しうる。シークエンシングアダプターは、インデックスおよび任意選択的なインデックスプライマー、増幅要素（例えば、シークエンシング中のブリッジ増幅用）、およびシークエンシング用のリードプライマーを含みうる。
追加の工程
追加の工程としては、マイクロ流体デバイスからの採集、枯渇工程（酵素分解、切断、ハイブリダイゼーションなどを介したリボソームＲＮＡの枯渇工程など）、サンプルの正規化、およびシークエンシング前のプーリングが挙げられる。サンプルの正規化、および特に、抑制ｑＰＣＲに基づくサンプルの正規化を、本明細書でさらに説明する。
バイアス
シークエンシングライブラリーを調製する際の主な目標は、バイアスをできるだけ少なく作り出すことである。バイアスは、実験デザインに起因するデータの体系的な歪みとして定義できる。すべての実験バイアス源を排除することは不可能であるため、最善の戦略は、（ｉ）バイアスがどこで発生するかを知り、それを最小にするためのすべての実用的なステップを講じること、および（ｉｉ）排除できないバイアス源が最終的な解析に与える影響を最小限にするように実験デザインに注意を払うことである。
ＮＧＳライブラリーの複雑さは、所与の実験デザインによって作り出されるバイアスの量を反映しうる。ライブラリーの複雑さに関しては、供給源材料の元の複雑さを高い忠実性で反映する高度に複雑なライブラリーが理想である。技術的課題は、いかなる増幅量もこの忠実性を減少させうることである。ライブラリーの複雑さは、シークエンシングデータ中に存在する重複リードの数またはパーセンテージによって測定することができる。重複リードは、参照配列に揃えて整列された際に、通常は、全く同一であるかまたは全く同じ開始位置を有するリードとして定義される。注意の一つは、シークエンシングの深度の増加に伴い、偶発的に起こる（かつ元のサンプル源からの真に独立したサンプリングを表す）重複リードの頻度が増加することである。したがって、どの条件下で重複リード率がライブラリーの複雑さの正確な尺度を表すかを理解することが決定的に重要である。
ライブラリーの複雑さの尺度としての重複リード率の使用は、ゲノムＤＮＡシークエンシングを行う際には良好に機能するが、それはなぜなら、開始プール内の核酸配列がほぼ等モル比であるためである。しかし、ＲＮＡ－ｓｅｑはいっそうかなり複雑であり、なぜなら、本質的に、配列の出発プールが、発現の差異の生物学を反映する様々な数のｍＲＮＡ転写物の複雑な混合物を表すためである。ＣｈＩＰ－ｓｅｑの場合、特定のＤＮＡ配列に対する標的タンパク質の両方の親和性の差異（すなわち、高低）によって複雑さが作り出される。これらの生物学的有意差は、最終プールで終わる配列の数が等モルではないことを意味する。
しかし、要点は同じである。すなわち、ライブラリー調製の目標は、複雑さを最大化し、ＰＣＲまたは他の増幅ベースのクローン性バイアスを最小化するような方法で調製することである。これは、多くのＣｈＩＰ－ｓｅｑ実験や、限られた数の細胞に由来するＲＮＡ／ＤＮＡサンプルなど、低入力のライブラリーでは大きな課題である。現在では、単一細胞からゲノムＤＮＡおよびＲＮＡのシークエンシングを実施することが技術的に可能である。重要な点は、必要とされる広範な増幅のレベルは、異なる配列の優先的な増幅の形態でバイアスを作り出し、このバイアスは、結果として生じるデータの分析において依然として重大な課題である。難題に対処する一つのアプローチは、インデックス付きアダプターの複数の組合せを用いて、ＲＮＡ－ｓｅｑアプリケーションにおける生物学的およびＰＣＲ由来の重複リードの区別を可能にする、デジタルシークエンシングの方法である（４１，４２）。この方法のバージョンの一つは、現在、Ｂｉｏｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（テキサス州オースティン）からキットとして市販されている。
ＮＧＳシークエンシング用のライブラリーを調製する際には、バッチ効果の軽減を考慮することも決定的に重要である。ＮＧＳデータの生成に必要な分子操作の結果として生じる系統的バイアスの影響を認識することも重要である。例えば、ｍｉＲＮＡ－ｓｅｑライブラリー調製物におけるアダプターライゲーション効率の配列依存的な違いによって導入されるバイアスなどである。バッチ効果は、日常的なサンプル処理の変動から、例えば、反応条件、試薬バッチ、ピペッティングの正確さ、および技術者の違いさえからも生じる可能性がある。さらに、バッチ効果は、シークエンシングラン間、およびＩｌｌｕｍｉｎａフローセル上の異なるレーン間で観察されることがある。バッチの影響の軽減は、いくぶん単純であることもあるし、かなり複雑であることもある。疑わしい場合、実験デザインのプロセスの間に統計学者に相談することで、膨大な費用と時間の浪費を節約することができる。
ライブラリー調製の間のバイアスを最小化する方法は数多く存在する。単一の実験内では、発明者らは、類似の質と量のサンプルから始めることを心掛けている。発明者らはまた、可能な限り、試薬のマスターミックスを使用している。バイアスの特に顕著な原因の一つは、ＰＣＲなどの増幅反応に由来する。そして、ＧＣ含量がＰＣＲ増幅効率に実質的な影響を与えることが十分に文書化されている。Ｋａｐａ ＨｉＦｉ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、マサチューセッツ州ウィルミントン）またはＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼハイフィデリティ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などのＰＣＲ酵素は、極端なＧＣ含量から生じる増幅バイアスを最小にすることが示されている。
酵素的な工程に加えて、ゲルまたはビーズによる精製の前にバーコード化されたサンプルをプールすることにより、精製工程におけるバイアスを低減することができる。ｍｉＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーの場合、まず、個々のライブラリーをＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州サンタクララ）上でランし、ｍｉＲＮＡピークを定量する。発明者らはこの情報を用いて、最大２４個のサンプルのバーコード付きライブラリープールを作出し、サンプル間のサイズの変動を避けるために、アガロースゲルの単一レーンでゲル精製を行う。
サンプルの正規化
本明細書で言及されるサンプルの正規化は、サンプル間にわたって均一なシークエンシングを達成するために、プールされるサンプルのポリヌクレオチドを定量して、プールに添加される各サンプルの量を決定する物理工程である。このプロセスは、ライブラリーの定量およびプーリングとも呼ばれる。定量は、典型的には、従来のｑＰＣＲ、またはＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（チップベースのキャピラリー電気泳動システム）などの移動性（例えば、電気泳動）アッセイによって行われ、サンプル間にわたって所望の産物（ポリヌクレオチド）の量を定量する。次いで、この定量に基づいて、例えば、サンプル間にわたってリード深度の均一性を改善するように、サンプルをプールする。例えば、より低い濃度のライブラリー調製済みポリヌクレオチド（または所望のライブラリー調製済みポリヌクレオチド）を有するサンプルを、より大きな体積でプールに添加してもよい。ライブラリー調製済みポリヌクレオチドは、サンプルバーコード付与されてもよく（例えば、二重インデックスを含む）、追加のアダプター配列を含んでいても含んでいなくてもよい。リード深度は、所与のシークエンシングランにおけるリード数として定義することができ、成功したリード数（例えば、既知の配列またはゲノムにマッピングされたリード）としてさらに定義することができる。関連する概念であるシークエンシング深度の均一性も使用されうる。所望の産物は、例えば、所与の長さのインサートを有するライブラリー調製済みポリヌクレオチドでありうる。
従来の定量法は、プライマー二量体などのアーチファクトを増幅するか、またはバブルＤＮＡ（インサートのミスマッチを有するアダプター再ハイブリダイゼーションから形成される）などのアーチファクトが所望の長い産物に類似したスピードでランする電気泳動などの移動性ベースのアッセイによるものである。したがって、対象出願の一態様は、プライマー二量体、バブルＤＮＡ、および短いインサートを有する産物などのアーチファクトよりも長い所望の産物を定量化するための、抑制ＰＣＲ（例えば、抑制ｑＰＣＲ）の使用である。
リード深度はシークエンシングコストに正比例するため、変動の少なさゆえに結果が良いものとなり、シークエンシングコストが下がる。
抑制ＰＣＲ
例えば、ベクターとして使用するための長い産物を増やすために、またはシークエンシング用に長い産物を濃縮するために、短い産物がプライマー結合部位でヘアピンを形成するように、抑制ＰＣＲは長い産物を濃縮するために使用されている。産物の長さを調節するための抑制ＰＣＲは、Ｓｈａｇｉｎらによって、“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｖｅｒａｇｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７．１８（１９９９）：ｅ２３－ｉに記載された。発明者の知る限り、抑制ｑＰＣＲとライブラリーの正規化におけるその使用は開示されていない。抑制ＰＣＲを図５に説明する。
本明細書で使用される際の抑制ＰＣＲでは、逆位リピートがより遠くに離間しているより長い産物が線状のままである傾向があるため、逆位リピートに相補的な単一プライマー（または複数のプライマー）は、それらのより長い産物を優先的に延伸する。例えば、逆位リピートが１００ヌクレオチド未満、８０ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、または３０ヌクレオチド未満で離間している短い産物ほど、ヘアピンを形成する傾向があり、そのヘアピンでは、逆位末端リピートがネックを形成し、プライマーハイブリダイゼーションを防止する。
上述のように、定量方法は、ｑＰＣＲに干渉するプライマー二量体、または毛細管電気泳動などの移動性ベースのアッセイに干渉するバブルＤＮＡなど、ライブラリー調製物由来のアーチファクト（例えば、図６に示す）を増幅しうる。したがって、対象出願の一態様は、プライマー二量体、バブルＤＮＡ、および短いインサートを有する産物などのアーチファクトよりも長い所望の産物を定量化するための、抑制ＰＣＲ（例えば、抑制ｑＰＣＲ）の使用である。
ある態様では、抑制ＰＣＲは、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、または少なくとも１５ヌクレオチドの離間した逆位リピートと同一の（および、それゆえに他方の離間した逆位リピート配列のヌクレオチドの長さに対して相補的な）配列を含むプライマーを用いて行われる。サンプル調製は、ポリヌクレオチドの逆位リピートと同一の（および、例えば、ＰＣＲ中に少なくとも一つの逆位リピートにハイブリダイズするように、パートナー逆位リピートに対して相補的である）プライマーを用いてもよい。
抑制ＰＣＲによる定量は、サンプルのプーリングを方向付けて、リードの均一性を正規化しうる。ある態様では、サンプルプール自体のポリヌクレオチドではなく、サンプル由来のアリコートが、抑制ＰＣＲを受ける。
抑制ＰＣＲは、より長いアンプリコンを濃縮しうる。例えば、抑制ＰＣＲは、長いポリヌクレオチド（例えば、逆位リピート間が１００ヌクレオチド超、１５０ヌクレオチド超、２００ヌクレオチド超、３００ヌクレオチド超、４００ヌクレオチド超の）を、短いポリヌクレオチド（例えば、逆位リピート間が１００ヌクレオチド未満であり、８０ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、または２０ヌクレオチド未満）よりも少なくとも５倍（例えば、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍）濃縮しうる。
抑制ＰＣＲは、より長いポリヌクレオチドを優先的に増幅しうる。例えば、抑制ＰＣＲは、長いポリヌクレオチド（例えば、逆位リピート間が１００ヌクレオチド超、１５０ヌクレオチド超、２００ヌクレオチド超、３００ヌクレオチド超、４００ヌクレオチド超の）を、短いポリヌクレオチド（例えば、逆位リピート間が１００ヌクレオチド未満であり、８０ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、または２０ヌクレオチド未満）よりも少なくとも０．２０（例えば、０．２５、０．３、０．４、０．５、または０．６）のＰＣＲサイクル効率で増幅しうる。例えば、長いポリヌクレオチドのＰＣＲ効率は、１．６超、１．７５超、１．８超、１．８５超、または１．９超でありうる。短いポリヌクレオチドのＰＣＲ効率は、１．６未満、１．５未満、１．４未満、または１．３未満でありうる。
定量は、本明細書に記載されるｑＰＣＲ（すなわち、抑制ｑＰＣＲなど）によるものであってよい。抑制ＰＣＲを定量する代替的な方法も本明細書に記載される。ライブラリー定量標品の長さは、１５０～８００ヌクレオチドの間、例えば２００～６００ヌクレオチドなどの間でありうる。方法は、抑制ＰＣＲ産物の融解曲線解析をさらに含んでもよい。定量は、ライブラリー定量標品の希釈系列に基づいてもよい。
一部のライブラリー調製ワークフローは、短い産物中にヘアピンを形成する、パリンドローム配列（離間した逆位リピート）を導入する。より長い配列は、逆位リピートに相補的な単一のプライマーが使用される抑制ｑＰＣＲによって定量できる。より短い産物は、逆位リピートがより近接しているため、ヘアピンを形成し、それによってプライマーとの競合が生じ、増幅効率が低下する。長い（例えば、＞２００ｎｔ）産物の増幅効率が１サイクル当たり１．８倍であり、短い（例えば、＜５０ｎｔのインサート）産物の増幅効率が約１．５である場合、２４サイクルにわたって、長い産物は、短い産物よりも（１．８＾２４）／（１．５＾２４）＝８０倍多く増幅するものとなる。
ライブラリー調製のワークフローは、シークエンシングランの各プールにおけるサンプル当たりのリード深度の均一性の問題につながる可能性がある。例えば、最初の市販プロトコールでは、Ａｄｖａｎｔａ（商標）ＲＮＡ－Ｓｅｑ ＮＧＳ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社）は、プーリングの前に各サンプルライブラリーを定量して正規化する方法を含まなかった。リード深度はシークエンシングコストに正比例するため、変動の少なさゆえに結果が良いものとなり、シークエンシングコストが下がる。発明者らは、プーリング前に定量－正規化法を利用しようとしており、この方法は、ビーズ精製を必要としないものでもある。
本明細書に記載されるキットの態様では、ランダムプライマーを用いて、例えば、ＰＣＲを介してＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を導入するが、このＰＣＲは、従来のｑＰＣＲによる定量に干渉する望ましくないプライマー二量体（例えば、ｐ５およびｐ７プライマー）を作り出す。プライマー二量体は、より低い入力でより広範囲に形成される。サンプル入力で、量および／または質が変わりやすい場合、正規化されていない（または不十分に正規化されている）プールは、不均一なリード深度をもたらすものとなる。アダプター駆動型の再ハイブリダイゼーションによって産生されるバブルＤＮＡは、（ゲルまたはバイオアナライザー機器上などでの）移動性による定量を複雑なものとし、バブルＤＮＡは、所望のより長い二重鎖産物と類似のスピードでランする。
他のライブラリー調製方法もまた、定量を複雑にしてまさにヘアピン構造を形成する望ましくない短い産物を作り出しうる。例えば、逆位末端リピートを導入するトランスポザーゼから形成される短い断片は、本発明によって対処できる類似の問題を作り出しうる。
抑制ＰＣＲは、短いヘアピンよりも長い産物を優先的に増幅するため、抑制ｑＰＣＲは、このような長い産物の定量を可能にするものとなる。抑制ｑＰＣＲに基づいてサンプルをプーリングすることによってサンプルを正規化することにより、サンプル間にわたってロングリードの均一なシークエンシングが可能となる。そのため、アーチファクトゆえに従来の定量方法がサンプルの正規化に使用されるのを防止または阻害される場合であっても、長い産物を豊富に含むサンプルは、プール内の他のサンプルについて適切なシークエンシング深度を達成するために過剰にシークエンシングされる必要はない。
ある態様では、抑制ｑＰＣＲは、短い産物が長い産物よりも高い存在量に増幅されないように、融解曲線解析と組み合わされてもよい（例えば、短い産物が最初に、抑制ｑＰＣＲによって改善できる点を超えて、長い産物を数ではるかに上回る場合、例えば上記の例で８０倍超など）。
なお、他の定量ワークフローは適切ではない場合がある。低入力で形成されたプライマー二量体は、従来のｑＰＣＲに干渉する。プライマー配列が逆位リピートを含む際に、これらのプライマー二量体は、逆位リピートによって画定されるネックを有するヘアピンを形成するものとなる。
異なるインサート上のアダプターのアニーリングによって形成されたバブルＤＮＡは、移動性に基づく方法（例えば、電気泳動）に干渉する。
追加のライブラリー調製のワークフローは、ヘアピンを形成しないより長い産物を優先的に増幅する抑制ｑＰＣＲによる定量に役立つものとなる。例えば、トランスポザーゼベースのワークフローに導入された逆位リピートは、より小さな断片にヘアピンを形成しうる。
抑制ｑＰＣＲによるサンプル正規化の態様は、サンプルをプールする（ＡｄｖａｎｔａのワークフローまたはＩＦＣと結び付けられない）任意のライブラリー調製のワークフローで使用され、その結果、ネックを形成する既知の逆位リピートを有する望ましくない短いヘアピン副産物をもたらす。例えば、プライマー（例えば、アダプター）二量体は、一部のサンプルが低入力を有する場合に形成されうる。短い産物は、サンプル核酸が断片化されている（例えば、ＦＦＰＥサンプル中のＲＮＡ）場合に形成されうる。いずれの場合またはどちらの場合も、プライマーが共有配列（８ヌクレオチド以上、１０ヌクレオチド以上、または１２ヌクレオチド以上の長さなど）を有する場合、これらの短い産物はヘアピン構造を形成するものとなり、また、パリンドローム配列をハイブリダイズするプライマーによるｑＰＣＲは、一本鎖パリンドローム配列を呈示しない短いヘアピンよりも、長い「読みやすい」産物を優先的に増幅する。別の例では、ＡＴＡＣ ｓｅｑまたはＷＧＳなどのトランスポザーゼベースのワークフローは、側面に位置するサンプルＤＮＡ断片が短い場合にヘアピン構造を形成する、逆位末端リピートを組み込みうる。
ＰＣＲ条件（例えば、ＰＣＲサイクル中の工程の温度および／または時間、サイクル数、緩衝剤など）は、抑制（例えば、長いポリヌクレオチドを短いものよりも優先的に増幅すること）を高めるために調整されてもよい。ある態様では、アニーリング工程および／または伸長工程は、より高い温度（例えば、摂氏で少なくとも３、５、または１０度高い）で、後のサイクルで実行されうる（例えば、サイクル１、２、５、１０など、後のサイクルで開始する）。このことは、ポリヌクレオチドにハイブリダイズしないがより早期のサイクルのアンプリコンにハイブリダイズするものとなる（第一のサイクル後のプライマーハイブリダイゼーションの融解温度を増加させる）５’配列を、抑制ＰＣＲ用のプライマーが含む際に、最も有益であり得る。ヘアピン構造のネックがこの５’配列を含みうることから、短いアンプリコンは、これらのより高い温度でヘアピンをやはり形成するものとなる。
サンプルポリヌクレオチド
サンプルの正規化のためのサンプルポリヌクレオチドは、サンプルがプール後に脱マルチプレックス化されうるように、サンプルにバーコード付与された（例えば、インデックス付与された）任意のライブラリー調製済みヌクレオチドであってよい。サンプルポリヌクレオチドは、シークエンシングアダプターを有してもよいし、そのようなシークエンシングアダプターは、プーリング後に添加されてもよい。抑制ｑＰＣＲによるサンプルの正規化については、サンプルポリヌクレオチドは、離間した逆位リピート（すなわち、インサートなどの別の配列によって隔てられた逆位リピート）を有してもよい。
ポリヌクレオチドは、シークエンシングのために調製されたライブラリー（例えば、サンプルライブラリーと称される）であってもよく、アダプター（例えば、インデックス、リードプライマー結合部位、インデックス付与プライマー結合部位、Ｐ５／Ｐ７配列などの増幅プライマー結合部位などの、シークエンシングを支援するための一つまたは複数の配列）を含んでいてもよい。ポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチドのアダプター領域）は、本明細書に記載される離間した逆位リピートを含みうる。アダプターおよび／または離間した逆位リピートは、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ配列などのインサートの側面に位置していてもよい。断片化がサンプル調製用である場合などに、インサートは、長さが変わりやすくてもよい。ポリヌクレオチドは、例えばアダプター配列上の、サンプルバーコードを含んでいてもよい。サンプルバーコードは、二重インデックスであってもよい。
ある態様では、ポリヌクレオチドは、離間した逆位リピート、例えば二つの離間した逆位リピートなどを含む。離間した逆位リピートは、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、または少なくとも１５ヌクレオチド長である。離間した逆位リピートは、それぞれの末端（３’末端および５’末端）の５０ヌクレオチド以内にある。例えば、離間した逆位リピートは、末端逆位リピートであってもよい。
逆位リピート間の間隔は変わりやすくてもよい。例えば、サンプル中のより長いポリヌクレオチドは、逆位リピート間に１００ヌクレオチド超、１５０ヌクレオチド超、２００ヌクレオチド超、３００ヌクレオチド超、または４００ヌクレオチド超を有しうる。より短いポリヌクレオチドは、逆位リピート間に１００ヌクレオチド未満、８０ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、または２０ヌクレオチド未満を有しうる。対象出願の態様は、より長いポリヌクレオチドを優先的に増幅する抑制ＰＣＲを含みうる。一部のポリヌクレオチドは、逆位リピートの側面に位置するｃＤＮＡ配列またはｇＤＮＡ配列などのインサートを含んでいてもよい。インサートは、ランダムに生成されてもよいし、標的特異的（例えば、遺伝子特異的）配列であってもよい。インサート配列は、内因性配列であってもよいしその逆相補体であってもよい。
ポリヌクレオチドは、離間した逆位リピート（例えば、シークエンシングアダプターの）を含んでいてもよいし。それを含むように調製されたサンプルであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｐ５およびｐ７シークエンシングアダプターを含んでいてもよい。ある態様では、サンプルは、サンプル間にわたる平均ポリヌクレオチド長の半分未満の平均ポリヌクレオチド長を有する。
サンプルポリヌクレオチドの産生
サンプルポリヌクレオチドは、サンプル調製（例えば、ライブラリー調製）のために本明細書に記載される方法のいずれかによって提供されうる。例えば、ＰＣＲは、離間した逆位リピート（例えば、サンプルインデックスおよび／またはシークエンシングアダプターに加えて）を組み込みうる。別の例では、トランスポザーゼは、標的ＤＮＡを断片化し、離間した逆位リピートを導入してもよく、多くの場合、当技術分野では「逆位末端リピート」として記載される。マイクロ流体のワークフローおよびサンプルの正規化を使用したサンプル産生（ライブラリー調製）の例を図７に示す。
ポリヌクレオチドは、シークエンシングのために調製されたライブラリー（例えば、サンプルライブラリーと称される）であってもよく、アダプター（例えば、インデックス、リードプライマー結合部位、インデックス付与プライマー結合部位、Ｐ５／Ｐ７配列などの増幅プライマー結合部位などの、シークエンシングを支援するための一つまたは複数の配列）を含んでいてもよい。ポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチドのアダプター領域）は、本明細書に記載される離間した逆位リピートを含みうる。アダプターおよび／または離間した逆位リピートは、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ配列などのインサートの側面に位置していてもよい。断片化がサンプル調製用である場合などに、インサートは、長さが変わりやすくてもよい。ポリヌクレオチドは、例えばアダプター配列上の、サンプルバーコードを含んでいてもよい。サンプルバーコードは、二重インデックスであってもよい。
ある態様では、ポリヌクレオチドは、離間した逆位リピート、例えば二つの離間した逆位リピートなどを含む。離間した逆位リピートは、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、または少なくとも１５ヌクレオチド長である。離間した逆位リピートは、それぞれの末端（３’末端および５’末端）の８０ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、または２０ヌクレオチド以内でありうる。例えば、離間した逆位リピートは、末端逆位リピートであってもよい。
逆位リピート間の間隔は変わりやすくてもよい。例えば、サンプル中のより長いポリヌクレオチドは、逆位リピート間に１００ヌクレオチド超、１５０ヌクレオチド超、２００ヌクレオチド超、３００ヌクレオチド超、または４００ヌクレオチド超を有しうる。より短いポリヌクレオチドは、逆位リピート間に１００ヌクレオチド未満、８０ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、または２０ヌクレオチド未満を有しうる。対象出願の態様は、より長いポリヌクレオチドを優先的に増幅する抑制ＰＣＲを含みうる。一部のポリヌクレオチドは、逆位リピートの側面に位置するｃＤＮＡ配列またはｇＤＮＡ配列などのインサートを含んでいてもよい。インサートは、ランダムに生成されてもよいし、標的特異的（例えば、遺伝子特異的）配列であってもよい。インサート配列は、内因性配列であってもよいしその逆相補体であってもよい。
ポリヌクレオチドは、離間した逆位リピート（例えば、シークエンシングアダプターの）を含んでいてもよいし。それを含むように調製されたサンプルであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｐ５およびｐ７シークエンシングアダプターを含んでいてもよい。ある態様では、サンプルは、サンプル間にわたる平均ポリヌクレオチド長の半分未満の平均ポリヌクレオチド長を有する。
サンプルは、他のセクションに記載される工程によって調製されてもよい。
抑制ＰＣＲ用プライマー
抑制ＰＣＲプライマーは、逆位リピートと同一であってもよい（およびそれゆえに、そのパートナーに相補的であってもよい）し、ＰＣＲ反応のストリンジェンシー条件下で逆位リピート（またはその一部）に特異的にハイブリダイズするのに十分に同一性があるかまたは類似している部分配列を含んでいてもよい。
ある態様では、抑制ＰＣＲ用のプライマーは、逆位リピートまたはその一部分と同一の（すなわち、他方の逆位リピートに相補的な）３’配列を有していてもよい。この配列は、逆位リピートの少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、または少なくとも１５ヌクレオチドと同一でありうる。単一プライマーは、より長い産物（例えば、離間した逆位リピート間により多くの間隔を有する）を選択的に増幅してもよく、別のプライマーが存在しない場合には（例えば、マスターミックスおよび適切なポリメラーゼの存在下、ならびにサーモサイクリング条件下では）、ＰＣＲ反応を駆動するのに十分である。プライマーが、プライマーの３’末端に離間した逆位リピートと同一の配列を含む場合、ポリヌクレオチドが逆位リピートによって画定されるネックを有するヘアピンを形成していない時にのみハイブリダイズしうる。
ポリヌクレオチドに相補的ではないが、以前のＰＣＲサイクルで産生された長いアンプリコンよりも短いアンプリコンの抑制を増加させる５’配列を、プライマーが含んでいてもよい。例えば、５’配列は、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、または少なくとも１５ヌクレオチドでありうる。ヘアピンがより長いネックを有して形成される（短いアンプリコンの抑制を増加させる）ように、５’配列は、アンプリコンにおける逆位リピートの長さを増加させうる。このように、ＰＣＲアニーリング温度および／または伸長温度は、少なくとも初期サイクルでは低くてもよい（摂氏６０度未満、摂氏５６度未満、または摂氏５２度未満など）。後のサイクルのアニーリング温度および／または伸長温度は、本明細書に記載される初期サイクル時よりも高くてもよい。一般に、ＰＣＲのアニーリング温度および／または伸長温度は、摂氏５０度超および／または７５度未満でありうる。
抑制ＰＣＲおよびそのキットは、一つのプライマーのみを使用してもよいし、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、または少なくとも１５ヌクレオチドの離間した逆位リピートと同一の３’配列をどちらも有する二つの異なるプライマーを使用してもよい。
一部の実施形態では、プライマー（例えば、単一のプライマー）は、マスターミックスおよびポリメラーゼの存在下、５０ヌクレオチド以下で離間した逆位リピートを有するサンプルポリヌクレオチドよりも、０．２５以上のサイクル効率で、２００ヌクレオチド以上離間した逆位リピートを有するサンプルポリヌクレオチドを増幅することができる。プライマーは、マスターミックスおよびポリメラーゼの存在下、１サイクル当たり１．８以上の効率で、ライブラリー定量標品を増幅しうるが、１サイクル当たり１．５以下の効率で、５０ヌクレオチド以下で離間した逆位リピートを有するサンプルポリヌクレオチドを増幅するものとなる。
プライマーがハイブリダイズする（例えば、同一である）逆位リピートは、本明細書に記載されるライブラリー調製キットで使用されるものなどのシークエンシングアダプターによって導入されてもよい。そのため、本明細書に記載のライブラリー調製キットによって提供されるＩｌｌｕｍｉｎａアダプターの逆位リピートをハイブリダイズする抑制ＰＣＲプライマーは、本願の範囲内である。
定量
サンプルライブラリーは、シークエンシング前にサンプルプールに添加する個々のサンプルの量を決定するために定量されてもよい。本明細書に記載されるように、抑制ＰＣＲは、サンプルからのアリコートのポリヌクレオチドを増幅するために使用されてもよい。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡなどのインサート配列の側面に位置する離間した逆位リピート（例えば、横に並んだサンプルバーコードおよび／またはシークエンシングアダプター）を含む、ライブラリー調製済み反応産物であってもよい。より短いポリヌクレオチドがヘアピン構造を優先的に形成しうるが、そのヘアピン構造では、逆位リピートがプライマーのハイブリダイゼーションおよび／または伸長を防止する二本鎖ネックを形成するため、抑制ＰＣＲは、より長いインサートを有するポリヌクレオチドを優先的に増幅しうる。
抑制ＰＣＲ産物を定量して、サンプルのプールに添加するサンプル（例えば、サンプルライブラリー）の量を決定してもよい。定量は、定量的抑制ＰＣＲまたは「ｑＰＣＲ」など、抑制ＰＣＲの間に実施されうる。ｑＰＣＲでは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の存在量は、染料インジケータ（ｄｓＤＮＡインターカレート染料など）を用いて複数のサイクルにわたって測定され、増幅曲線の線形相を用いて、増幅された標的の開始量を計算する。他の形態の定量としては、エンドポイント検出（例えば、染料によるか、またはゲル上でランされるアンプリコンの検出によるなど、設定された数のランの後に増幅された標的の量を測定する）またはデジタルＰＣＲが挙げられる。
プーリングは、サンプルの定量に基づいて行われてもよい。例えば、定量を用いて、プールするサンプルおよび／またはプールする具体的なサンプルの量（例えば、体積）を決定してもよい。ある態様では、複数のサンプルプールが作り出されてもよい。
改善の指標
主題の方法および／またはキットの抑制ｑＰＣＲ定量に基づいて形成された最終ライブラリープールは、本明細書に記載される成功の一つまたは複数の指標を提供しうる。改善のいくつかの指標を図８および図９に示す。
ある態様では、以下の一つまたは複数の追加的または代替的な指標を使用してもよい。ライブラリープールは、少なくとも５０ｆｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、２００ｆｍｏｌ、３００ｆｍｏｌ、５００ｆｍｏｌ、または１０００ｆｍｏｌでありうる（そして例えば、少なくとも２４個または４８個のサンプルを有しうる）。最終的なライブラリープールは、サンプル間の平均のリード深度を少なくとも半分または少なくとも三分の二有する、サンプルの８０％超または９０％超のシークエンシングリード深度の均一性を提供しうる。
ライブラリーの正規化により、プールされたサンプル間にわたる深度の均一性が読み取られうる。例えば、本明細書に記載されるライブラリーの正規化は、標準偏差によって測定された際に、および正規化しないものと比較して、または通常のｑＰＣＲ（抑制ｑＰＣＲではない）に基づく正規化と比較して、リード深度の変動に少なくとも２倍の減少（例えば、少なくとも３倍の減少、または少なくとも５倍の減少）をもたらしうる。
一部の実施形態では、５％未満のサンプルが、サンプル間にわたる平均リード深度の５０％未満のリード深度にある。例えば、ある態様では、サンプル間にわたる平均リード深度の５０％未満（例えば、４０％未満、２５％未満、または１０％未満）のリード深度にあるライブラリー正規化サンプルはない。さらに、５％超のサンプルは、ライブラリーが正規化されなかったか、または通常のｑＰＣＲによって正規化された場合、サンプル間にわたる平均リード深度の５０％未満（例えば、４０％未満、２５％未満、または１０％未満）のリード深度にありうる。
一部の実施形態では、正規化されたすべてのサンプルでは、２５００遺伝子超が検出され、例えば、５０００遺伝子超が検出され、７５００遺伝子超が検出され、または１０，０００遺伝子超が検出されうる。さらに、少なくともいくつかのサンプルでは、ライブラリーが正規化されていなかった場合（例えば、同じ総リード数に対して）、５０００遺伝子未満が検出され、２５００遺伝子未満が検出され、１０００遺伝子未満が検出されうる。
ライブラリーの正規化は、正規化のないものと比較して、またはｑＰＣＲ定量に基づく正規化と比較して（例えば、ビーズのクリーンアップ工程の後であるが抑制ｑＰＣＲにはよらない）、シークエンシングのコストに少なくとも２倍の減少（例えば、少なくとも３倍の減少、または少なくとも５倍の減少）をもたらしうる。ある態様では、シークエンシングのコストは、プール内のすべてのサンプルの適切なカバレッジを達成するために必要なコストである。
キット
対象出願のキットは、ライブラリー調製および／または正規化の方法を含めた、本明細書に記載される方法のいずれかを実施するための試薬および／またはデバイスを含みうる。シークエンシングのためのライブラリー調製、および／またはシークエンシングのためのライブラリーの定量もしくは正規化の文脈で本明細書に記載されるキットは、本明細書に記載される構成要素および／または本明細書に記載される方法工程に適合されうる。
ある態様では、サンプル正規化キット（例えば、ライブラリー定量キット）は、離間した逆位リピートを有するＤＮＡ標品と、逆位リピートのうち一つをハイブリダイズする単一のプライマーとを含みうる。単一プライマーは、より長い産物（例えば、離間した逆位リピート間により多くの間隔を有する）を選択的に増幅してもよく、別のプライマーが存在しない場合には（例えば、マスターミックスおよび適切なポリメラーゼの存在下、ならびにサーモサイクリング条件下では）、ＰＣＲ反応を駆動するのに十分である。
ある態様では、ライブラリー調製キットは、逆位リピート、サンプルインデックス、および任意選択的にシークエンシングアダプターをサンプルポリヌクレオチドに加えるための試薬を含んでもよい。キットはさらに、逆位リピートのうち一つをハイブリダイズする単一のプライマーを含んでもよい。単一プライマーは、より長い産物（例えば、離間した逆位リピート間により多くの間隔を有する）を選択的に増幅してもよく、別のプライマーが存在しない場合には（例えば、マスターミックスおよび適切なポリメラーゼの存在下、ならびにサーモサイクリング条件下では）、ＰＣＲ反応を駆動するのに十分である。
キットは、定量に基づいてサンプルのプーリングを決定するための構成要素、例えば、ｑＰＣＲ測定の入力および出力の命令を取り込むワークブック（例えば、スプレッドシート）など、例えば、どのサンプルをプールするか、および／または具体的なサンプルをどの程度の量（例えば、体積）でプールするかなどを含みうる。
抑制ＰＣＲの代替的な使用
ある態様では、抑制ＰＣＲは、ライブラリー定量以外の用途に使用されうる。
一部の実施形態では、プライマーは、互いに同一である配列（例えば、内部またはそれらの５’末端に）（例えば、６ヌクレオチド、８ヌクレオチドもしくは１２ヌクレオチド、または１５ヌクレオチド超の長さの）を含んでいてもよく、互いに異なっており標的ヌクレオチドをハイブリダイズする３’配列を含んでいてもよい。短い生成物（例えば、プライマー二量体）がヘアピンを形成して、ｑＰＣＲまたはｄＰＣＲの間などの以降のサイクルで効率的に増幅されないように、同一の配列は、離間した逆位リピートを増幅中に導入することができる。３’配列が、ヘアピンを形成する元の標的も短いアンプリコン（例えば、プライマー二量体）ももはやハイブリダイズしないように、アニーリングおよび／または伸長の温度は、増加されてもよい（例えば、少なくとも摂氏３度、５度、または１０度であって、サイクル１、２、３、５、１０などの後のサイクルで開始する）。
ある態様では、３’配列は縮重している（例えば、３ヌクレオチド超、４ヌクレオチド超、６ヌクレオチド超、または８ヌクレオチド超のランダマー）。ランダマープライマーを用いた複数サイクルの増幅では、新しいランダマープライマーが新しい部位をハイブリダイズするため、後続の増幅サイクルのアンプリコンが次々に小さくなってゆく可能性があり、これは多くの用途（シークエンシングを含む）には望ましくない。しかし、逆位リピートを導入したプライマーにより産生された短いアンプリコンにおけるヘアピン構造の形成により、以降のサイクルでは長いアンプリコンの増幅が促進されうる。さらに、追加の一つまたは複数のプライマー（例えば、３’末端の最初の二つのプライマーとアダプター配列との同一配列を有する）は、ヘアピンを形成しない長いアンプリコンを増幅することができる。追加のプライマーは、前述のプライマーを超過してもよい。
マイクロ流体デバイス
本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスとは、マイクロリットルスケール（例えば、１ｕｌ～数百ｕｌ）以下、例えば、０．１ｎｌ～１００ｕｌ、１ｎｌ～１０ｕｌ、５ｎｌ～１ｕｌ、または１０ｎｌ～１００ｎｌなどで、流体体積（例えば、サンプル体積）を処理するデバイスを指す。あるいは、マイクロ流体デバイスとは、チャネル、チャンバ、またはマイクロメートルスケール（例えば、１ｕｍ～数百ｕｍ）以下、例えば、１００ｎｍ～１ｍｍ、または１ｕｍ～１００ｕｍなどの寸法を有する他の流体アーキテクチャを有する、流体デバイスを指す。対象出願のマイクロ流体デバイスのアーキテクチャは、サンプル、試薬、および溶液の装填、単離、混合、および／または採集の制御を可能にしうる。マイクロ流体デバイスは、シークエンシング前のサンプルの正規化（定量およびプーリング）が非常に有益となる程度にまで、サンプル調製を並列化しうる。例示的なマイクロ流体デバイスを図１および図２に示し、例示的なマイクロ流体アーキテクチャを図３および図４に示す。
ポリヌクレオチドは、マイクロ流体デバイスにおける多段階反応において、例えば、シークエンシングライブラリー調製などのために産生され得る。マイクロ流体デバイスは、エラストマー製マイクロ流体デバイスであってもよいし、容積式液体処理器であってもよいが、これらに限定されない。核酸は、ビーズを用いてマイクロ流体デバイス上で濃縮されてもよく、例えば、ＲＮＡは、ポリＡ捕捉によって濃縮されてもよい。核酸は、マイクロ流体デバイスにおいて、断片化され、逆転写され、および／またはＰＣＲによりサンプルにバーコード付与されてもよい。マイクロ流体デバイスで産生されたサンプルポリヌクレオチドは、離間した逆位リピートを含みうる。
濃縮
濃縮機構は、マイクロ流体デバイス内の固体支持体上のサンプル核酸などの生体分子の固相化を含む。固体支持体は、本明細書にさらに記載される流体透過性マトリクス、チャネルもしくはチャンバの壁、またはビーズでありうる。
ビーズ保持機構は、マイクロ流体ネットワーク内に配置された任意の適切な物理的バリアとの粒子の接触に少なくとも部分的に基づいてもよい。このような粒子－バリア接触は、概して、流体流の方向に沿った長手方向の粒子移動を制限し、流れにより支援される保持を生じる。流れにより支援される粒子－バリア接触はまた、横方向／直交（横向き）の移動を制限しうる。適切な物理的バリアは、チャネルまたは他の通路（すなわち、壁、ルーフ、および／または床）の任意の部分から内側に延在する突起部によって形成されうる。例えば、突起部は、特にカラム、ポスト、ブロック、隆起、壁、および／または部分的／完全に閉じた弁を含めて、固定されうるおよび／または移動可能でありうる。弁などのいくつかの物理的バリアは、移動可能または調節可能でありうる。あるいは、またはさらに、物理的バリアは、チャネルもしくは他の通路に形成されたくぼみによって、または流体透過性膜によって、画定されうる。他の物理的バリアは、通路の断面寸法に基づいて形成されうる。例えば、サイズ選択チャネルは、大きすぎてチャネルに入れない粒子を保持しうる。ふるい構造は、流体が流れるが穴よりも大きなビーズが保持されうる、複数の開口部を提供しうる。
化学的保持機構は、化学的相互作用に基づいて粒子を保持しうる。化学的相互作用は、特にイオン性、静電性、疎水性、ファンデルワールス、および／または金属配位性の相互作用を含む、共有結合性および／または非共有結合性の相互作用でありうる。化学的相互作用は、粒子を選択的および／または非選択的に保持しうる。選択的および非選択的な保持は、粒子と通路表面との間の特異的および／または非特異的な化学的相互作用に基づいてもよい。
このような保持機構は、ユニットセル内の生体分子の濃縮のためにビーズを保持するカラムの一部であってもよい。
ビーズ
ビーズは、無機材料、または化学的、酵素的、および／または生物学的に合成された材料から製造されてもよい。さらに、ビーズは任意の適切な多孔性を有してもよく、固体またはゲルとして形成されてもよい。適切なビーズ組成物は、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、デキストラン、ガラス、セラミック、ゾル－ゲル、エラストマー、シリコン、金属、および／またはバイオポリマー（タンパク質、核酸など）を含みうる。ビーズは、任意の適切な粒子直径または直径範囲を有してもよい。したがって、ビーズは、狭い直径範囲の実質的に均一な集団であってもよいし、ビーズは、幅広い直径範囲かまたは二つ以上の別々の直径を有する不均一な集団であってもよい。
ビーズは、任意の適切な材料に付随していてもよい。材料としては、特に化合物、ポリマー、複合体、混合物、ファージ、ウイルス、および／または細胞が挙げられうる。例えば、ビーズは、受容体、リガンド、核酸、化合物ライブラリーのメンバー、親和性試薬（および抗体、アビジン／ビオチン、またはその誘導体など）などの特異的な結合対のメンバーに付随していてもよい。例えば、ビーズは、ストレプトアビジンにより官能基化されて、ビオチン化分子に結合されてもよい。別の例では、ビーズは、カルボキシ官能基などの化学基（例えば、核酸に結合する）により官能基化される（すなわち、その表面上に存在する）。別の例では、ビーズは、ポリＡ配列または標的特異的配列へのハイブリダイゼーションを介するなどで、サンプル中の核酸に結合するオリゴヌクレオチドにより官能基化される。ある態様では、ビーズは、抗体（例えば、もしくはその断片）、アプタマー、四量体（例えば、ＭＨＣもしくはＭＨＣ－ペプチドなど）、受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）、アビジン（例えば、ストレプトアビジン）、またはビオチンなどの親和性試薬により官能基化されてもよい。例えば、ビーズは、本明細書にさらに記載されるように、ペプチド／タンパク質バイオマーカーまたはウイルス抗原などの一つまたは複数のタンパク質標的に対する抗体により官能基化されてもよい。ある態様では、ビーズは、本明細書に記載されるウイルス粒子またはウイルス抗原などの病原体またはその抗原により官能基化されてもよい。ある態様では、ビーズは、標的ヌクレオチド配列（例えば、特定のＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｇＤＮＡ配列）に特異的にハイブリダイズするｓｓＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドにより官能基化されてもよい。ある態様では、異なる標的サンプル生体分子を結合するために官能基化されたビーズは、マルチプレックスアッセイのための混合物に使用されてもよい。
ビーズは、チューブ中での濃縮および／または洗浄を容易にするために磁気を有していてもよい。あるいは、ビーズは、磁気を有していなくてもよい（マイクロ流体デバイス上の物理的バリアを通じて保持される場合など）。
サンプル調製および検出のためのマイクロ流体デバイス
本明細書に記載される方法の態様は、マイクロ流体デバイス（または流体デバイス）上で実施されてもよく、それ自体が対象出願の範囲内である。例示的なマイクロ流体デバイスを図２に示す。
サンプル処理は、マイクロ流体デバイス上で少なくとも部分的に行われてもよい。例えば、複数のサンプルを、マイクロ流体デバイス上（例えば、別々のユニットセル中）で並列に処理し、採集し、次いでシークエンシングのためにプールしてもよい。デバイスは、少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも１２個、少なくとも２４個、少なくとも４８個、少なくとも９６個、または少なくとも３８４個の異なるサンプルを処理してもよい。マイクロ流体デバイス上の処理は、例えば、シークエンシングアダプターおよび／またはサンプルインデックスを有するポリヌクレオチド反応産物の形成などのライブラリー調製を含みうる。アプリケーションに応じて、マイクロ流体デバイス上のサンプル処理は、生体分子（例えば、核酸）の濃縮、洗浄、溶出、断片化、逆転写（生体分子がＲＮＡである場合）、およびＰＣＲ（例えば、シークエンシングアダプターおよび／または二重インデックスなどのサンプルバーコードを組み込むための）のうち一つまたは複数を含みうる。クリーンアップ、増幅、サンプル正規化のための定量、および／またはプーリングなどの追加の工程は、マイクロ流体デバイスから離れて、または下流の流体デバイスで行われてもよい。
マイクロ流体デバイスは、マルチウェルプレートで多段階反応を行うように、フローチャネルのネットワークを含んでもいてもよく、および／またはマイクロリットルもしくはナノリットルスケールのピペッティング装置（容積式ピペッティングアームなど）を含んでいてもよい。
ある態様では、濃縮は、マイクロ流体デバイス上で行われてもよい。例えば、マイクロ流体デバイス（例えば、マイクロ流体デバイスのユニットセル）は、固体支持体上に標的生体分子を固相化するためのカラムを含んでもよい。ある態様では、カラムは、ビーズを含んでいてもよいし、ビーズを保持するように構成されていてもよく、特殊チャンバとして記載されうる。例えば、カラム中のビーズは、ビーズが流体（例えば、サンプル、洗浄溶液、試薬など）の流れの下で保持されうるように、ふるいの上流に詰め込まれていてもよい。ビーズは、本明細書にさらに記載されるように、標的生体分子を結合するために化学基または生体分子により官能基化されてもよい。ビーズは、マイクロ流体デバイスのカラム内に装填されてもよく、その後、サンプル（および任意選択的に洗浄溶液）がビーズを横断して流れてもよい。あるいは、ビーズをサンプルと混合し、任意選択的に洗浄してから、マイクロ流体デバイスに注入してもよい。この代替法は、マイクロ流体デバイス上でより少ない自動化のコストで、濃縮を改善し、および／またはサンプル装填時間を短縮しうる。どちらの場合も、マイクロ流体デバイスは、ユニットセルで処理された生体分子の量を増加させるために、ビーズベースの濃縮を可能にする（とともに、使用する試薬を少量のまま維持し、単一のマイクロ流体デバイスでサンプルの並列処理を可能にする）。
マイクロ流体デバイスは、一つまたは複数のサンプル処理部位（例えば、ユニットセルのカラムの下流）を提供しうる。例えば、デバイスは、ユニットセルに少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの処理部位を提供しうる。サンプル処理部位は、一つまたは複数の処理部位および／またはカラム間の混合工程が開始されるまで、ユニットセルに沿って配置された弁を通してなどで、動作中に互いにおよび／またはカラムから流体的に隔てられていてもよい。混合は、界面のない混合によっていてもよいし、拡張ポンプまたは蠕動式ポンプなどの能動的混合によっていてもよい。
マイクロ流体デバイスは、異なる試薬を異なる処理部位内に（例えば、混合工程の前に）装填することを可能にしうる。マイクロ流体デバイスは、カラム内に詰め込まれた溶液懸濁ビーズなど、過剰な溶液を除去するための一つまたは複数の廃棄チャネルを有してもよい。廃棄チャネル、試薬チャネル、および／またはサンプルチャネルは、それらの長さの一部分を互いに共有しうる。
サンプルチャネルは、ユニットセル（例えば、カラムの近位）の第一の接合部にサンプル（例えば、ビーズ）を注入するように構成されてもよい。サンプルは、カラムを通して廃棄出口から流れ出て、ビーズを装填させうる、および／またはカラム内のビーズ上にサンプル生体分子を通過させうる。異なるサンプルが、異なるユニットセルに送達されてもよい。
複数の試薬チャネルは、異なるサンプル処理部位（異なるサンプル処理部位のチャンバなど）に試薬を導入するように構成されうる。このような試薬は、本願全体にわたって記載される任意のサンプル処理工程を実施しうる。少なくともいくつかの（例えば、またはすべての）試薬チャネルは、共有チャネルに沿ってそれらのチャネル長の一部を共有してもよく、マイクロ流体デバイスは、異なる時点で、共有チャネルを通して所与の試薬を流すように動作されてもよい。例えば、マイクロ流体デバイスは、ユニットセルの処理部位を装填するためにどの試薬入口が使用されるかを制御するように動作されうるマルチプレクサを含みうる。共有チャネルは、ユニットセルの第二の接合部を通して試薬を送達してもよい。共有チャネルを通して流れる試薬は、異なるサンプル処理部位に方向付けられてもよい（例えば、バルブのネットワークを介して）。あるいは、少なくともいくつかの試薬チャネルはそれぞれ、特定のサンプル処理部位に直接的に（例えば、共有チャネルを介してではなく）試薬を送達してもよい。ある態様では、複数のユニットセルの試薬の装填は、同時におよび／または同一に行われてもよい。試薬のサンプル処理部位内への装填は、ブラインド充填によってもよい（例えば、サンプル処理部位のチャンバまたはチャネルの一方の端部が、閉じた弁または壁によって、またはサンプル処理部位を通り廃棄出口から出てゆく試薬の流れによって、遮断される場合など）。
マイクロ流体デバイスは、サンプルを装填した後にカラムを通って流れる洗浄溶液および／または溶出溶液と、デバイスから調製サンプルを除去するために使用される採集溶液とを含めて、溶液をユニットセルに送達しうる。
マイクロ流体デバイスは、このような溶液の導入および除去のための追加のチャネルおよび接合部を有してもよい。例えば、廃棄出口チャネルは、過剰なサンプル、試薬、および／または溶液を収集しうる。採集出口は、調製されたサンプルを収集しうる。ある態様では、採集溶液は、採集入口からユニットセルを通ってサンプル入口（各サンプルに対する採集出口として機能する）内に流れてもよい。一般に、サンプルチャネル、試薬チャネル、溶液チャネル、および廃棄チャネルは、ユニットセルへの入口のチャネルセグメントおよび／または接合部を共有しうるが、その場合、アーキテクチャが簡素化され、サンプル処理反応に干渉しないかまたは汚染を生じさせない。
一例では、サンプルは溶解されてもよく、核酸（例えば、ＲＮＡ）は、サンプル調製のためのマイクロ流体デバイスのカラムにビーズを装填する前に、ビーズ上に固相化されてもよい。マイクロ流体デバイスは、逆転写およびライブラリー調製（サンプルへのインデックス付与を含む）を実施するように動作されてもよい。ライブラリー調製済みサンプルは、マイクロ流体デバイスから採集され、次いでプールされてもよい。ある態様では、ライブラリー調製済みサンプルのプーリングは、サンプルの正規化、例えば本明細書に記載されるような抑制ｑＰＣＲに基づいてもよい。
本明細書に記載されるように、マイクロ流体デバイスは、複数の弁を含みうる。マイクロ流体デバイスの弁およびチャネルは、カラム内にサンプルを装填し、異なる試薬を（異なる試薬入口から）別々のサンプル処理部位（例えば、チャンバ）内に方向付けて、反応部位を隔て、反応部位間で流体を混合するように（例えば、サンプル処理ループ間にわたって流体を循環させることによって）配置されてもよい。
マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載のコントローラなどのシステムによって動作されてもよい。システムなどはまた、逆転写および／またはＰＣＲなどの反応を駆動するためのサーモサイクラーを含んでいてもよい。ある態様では、マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載のエラストマー弁を有するエラストマー製マイクロ流体デバイスであってもよい。
対象出願のマイクロ流体デバイスは、任意の数のアッセイを実施することができ、そのようなものとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＣＲ（エンドポイントＰＣＲ、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、または定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）など）、免疫ＰＣＲ（免疫ｑＰＣＲなど）、近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、逆転写、予備増幅（例えば、標的化、マルチプレックス標的化、または全ゲノム増幅もしくは全トランスクリプトーム増幅などの非特異的な予備増幅）、サンプルコード／インデックス化など。ある態様では、検出方法は、標的の存在量を決定することができるように、いくつかの熱サイクルにわたって反応が調査されるｑＰＣＲ（すなわち、リアルタイムＰＣＲ）である。ｑＰＣＲは、標的の存在量に関連するサイクル閾値（ＣＴ）を提供する。アレイマイクロ流体デバイス上のｑＰＣＲ方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６０１５３０２６号に記載される。ｑＰＣＲのサイクル閾値は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８０１２９７３６号に詳細に記載されている。
米国特許出願公開第２００５０００３３６１号に記載される近接ライゲーションでは、スプリント鋳型にハイブリダイズしてライゲーションされる近接プローブ上に結合部分が提供される。しかし、これらの結合部分は、親和性試薬（例えば、抗体）との各プローブのカップリング用であり、スプリント鋳型は、それらの親和性試薬が近接して結合された際にプローブのライゲーションを可能にする合成された標的（例えば、合成された一本鎖ＤＮＡ配列）である。近接伸長などの近接アッセイも、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６００２４５５７号のマイクロ流体デバイスの文脈で記載される。タンパク質標的を検出するための近接アッセイは、本明細書にさらに記載されるのと同じサンプル中のＲＮＡ標的またはＤＮＡ標的の検出と共に実施されうる。
エラストマー製マイクロ流体デバイス
適切なマイクロ流体デバイスは、エラストマー弁を有するエラストマー製マイクロ流体デバイスを含む。このようなエラストマー弁を加圧して、エラストマー膜をマイクロ流体デバイスのフローチャネル内に偏向させ、それによって流体連通を制御してもよい。入口の背圧は、閉じた弁によって遮断されないチャネルを通して流体（例えば、サンプル、試薬、溶液など）を駆動することができる。
エラストマー製マイクロ流体デバイスの早期の開示は、米国特許第７６０１２７０号に見出すことができ、ループチャネルおよび蠕動式ポンプの開示は、米国特許第７３５１３７６号に見出すことができ、デッドエンド（ブラインド）充填の開示は、米国特許第７７６６０５５号に見出すことができ、表面の官能基化および固相化の開示は、米国特許第７６９１３３３号に見出すことができ、マルチプレクサアーキテクチャの開示は、米国特許第７６９１３３３号に見出すことができ、多段階処理アーキテクチャにおける開示は、米国特許第９４２９５００号に見出すことができ、それら全てが参照により本明細書に組み込まれる。
エラストマー製マイクロ流体デバイスの文脈では：
「フローチャネル」とは、概して、溶液が通って流れることができる流路を指す。
別段の示唆が無い限り、用語「弁」とは、流れチャネルと制御チャネルとが交差し、作動力に応答して流れチャネル内に偏向されうるかまたは流れチャネルから引き戻されうるエラストマー膜によって隔てられている構成を指す。
「隔てられた反応部位」とは、一般に、デバイス上に存在する他の反応部位と流体連通しない反応部位を指す。ブラインドチャネルに関して使用される場合、隔てられた反応部位は、ブラインドチャネルに関連付けられた弁によって遮断され得るブラインドチャネルの末端の領域である。
用語「エラストマー」および「エラストマーの」とは、当技術分野で使用される場合、その一般的な意味を有する。したがって、例えば、Ａｌｌｃｏｃｋら（Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版）は一般的に、エラストマーを、そのガラス転移温度と液化温度との間の温度で存在するポリマーとして説明する。エラストマー材はエラストマー特性を呈するが、なぜなら、ポリマー鎖が、力に応答して容易にねじり運動を起こして骨格鎖のコイルを解くことが可能となるとともに、骨格鎖が、力の不在下では再度コイル状となって以前の形状を呈するためである。一般的に、エラストマーは力を加えると変形するが、力が取り除かれると元の形状に戻る。エラストマー材の呈する弾性は、Ｙｏｕｎｇの弾性率によって特徴付けることができる。本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスにおいて利用されるエラストマー材は、典型的には、約１０Ｐａ～１００ＧＰａの間、さらに他の場合では約２０Ｐａ～１ＧＰａの間、さらに他の場合では約５０Ｐａ～１０ＭＰａの間、および特定の場合では約１００Ｐａ～１ＭＰａのＹｏｕｎｇの弾性率を有する。これらの範囲以外のＹｏｕｎｇの弾性率を有するエラストマー材も、特定の用途のニーズに応じて利用することができる。
マイクロ流体デバイスを操作するためのシステム
マイクロ流体デバイスに結合されたシステムは、空気圧コントローラなどのマイクロ流体デバイス内の流体流のコントローラを含みうる。あるいは、またはさらに、マイクロ流体デバイスの反応部位（例えば、サンプル処理部位）における溶解、核酸精製、逆転写、およびＰＣＲなどの反応を駆動するためのサーモサイクラーを含みうる。マイクロ流体キャリア、コントローラ、およびサーモサイクラーインターフェースの開示は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７７０４７３５号に見出すことができる。
例示的なライブラリー調製および正規化のワークフロー
例示的なＲＮＡシークエンシングライブラリー調製のワークフローを以下に記載し、その態様は、対象の方法、デバイスおよび／またはキットによって実施されうる。
この例示的な方法は、以下の工程を含む。
ｉ）流体回路上でＲＮＡおよび試薬を、次いでオリゴｄ（Ｔ）ビーズを調製および装填する。
ｉｉ）Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ４８．Ａｔｌａｓ ＩＦＣ（集積流体回路）上でライブラリー調製を実施する。
ｉｉｉ）採集されたバーコード付きライブラリーを正規化する（ｑＰＣＲにより定量し、プールする）。
ｉｖ）プールされたライブラリーをクリーンアップし（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用いて）、シークエンシングアダプター（アダプター配列のＰ５部分およびＰ７部分から増幅するプライマー）を使用してＰＣＲにより増幅し、プールされたサンプルをシークエンシング前にｑＰＣＲにより定量する。
工程ｉｉ）のライブラリー調製は、以下の工程を含みうる：
－固相ビーズ上にポリ（ａ）ＲＮＡを捕捉
－ポリ（Ａ）ＲＮＡの溶出および断片化
－逆転写および鋳型切替え
－サンプルバーコードＰＣＲ
－サンプルライブラリーの採集
工程ｉｉｉ）におけるバーコード付きライブラリーの定量は、下記のワークフローに従って実施することができる。
－ｑＰＣＲプライマープレミックス、およびライブラリー希釈緩衝液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）により改良されたＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（マスターミックスおよびＤＮＡ標品）を準備する。
－サンプルライブラリーを５０倍希釈し、２ｕｌの個々のサンプルを分注する
－改変ライブラリー定量キットを用いて、サンプルのアリコートでｑＰＣＲを実行する
－ｑＰＣＲの結果を正規化ワークブックにインポートする
－正規化ワークブックの出力に従ってサンプルライブラリーをプールする
標的ＲＮＡ検出のためのスプリントライゲーション
少量の反応量は、サンプル濃縮ワークフローの進歩から恩恵を受けうる。さらに、サンプル入力および品質の変動は、プールされたサンプル間にわたって変わりやすいシークエンシング深度をもたらすことがあり、その結果、サンプルプールは、乏しいサンプルに適した深度を得るために過剰にシークエンシングを行う必要があり、コストが著しく増大する。一般的な解決策は、所望のライブラリー産物を定量し、この定量に基づいてプールに添加されるサンプルライブラリーの量を正規化することである。このような定量方法としては、長さに基づいてライブラリー産物を検出する、従来のｑＰＣＲおよび移動性ベースの方法が挙げられる。しかし、ライブラリー調製ワークフロー由来のアーチファクトは、既存の定量方法に干渉する可能性がある。定量方法の改善は、結果としてシークエンシングコストを何倍にも低減しうる。
本明細書における並列処理の態様は、標的ＲＮＡなどの標的核酸のスプリントライゲーションベースの検出のための方法およびキットを含む。本明細書に記載されるスプリントライゲーションの態様は、検出（例えば、ｑＰＣＲなどのＰＣＲベースの検出による検出、またはシークエンシングによる検出）の前に逆転写および任意選択的な予備増幅を行う必要性をなくしうる。
スプリントライゲーションは、Ｍａｒｏｎｅｙらにより“Ａ ｒａｐｉｄ， ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｕｓｉｎｇ ｓｐｌｉｎｔｅｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ”Ｒｎａ １３．６（２００７）：９３０－９３６にて報告されている。Ｍａｒｏｎｅｙは、標的ＲＮＡがスプリント鋳型ではないＲＮＡ検出、およびゲル電気泳動によるライゲーション産物のその後の検出を報告した。ＰＣＲによるスプリントライゲーションの検出は、Ｂｌｅｗｅｔｔらにより、“Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｐｐｉｎｇ ｂｙ ｓｐｌｉｎｔｅｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｑＳＬ－ＲＴ－ＰＣＲ”Ｒｎａ １７．３（２０１１）：５３５－５４３に報告されている。しかし、Ｂｌｅｗｅｔｔが報告した方法では、標的ＲＮＡはスプリント鋳型ではなく、スプリントライゲーション産物は、ＰＣＲベースの検出の前に逆転写を必要とした。米国特許出願公開第２００５０００３３６１号に記載される近接ライゲーションでは、スプリント鋳型にハイブリダイズしてライゲーションされる近接プローブ上に結合部分が提供される。しかし、これらの結合部分は、親和性試薬（例えば、抗体）との各プローブのカップリング用であり、スプリント鋳型は、それらの親和性試薬が近接して結合された際にプローブのライゲーションを可能にする合成された標的（例えば、合成された一本鎖ＤＮＡ配列）である。近接伸長などの近接アッセイも、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６００２４５５７号のマイクロ流体デバイスの文脈で記載される。タンパク質標的を検出するための近接アッセイは、本明細書にさらに記載されるのと同じサンプル中のＲＮＡ標的またはＤＮＡ標的の検出と共に実施されうる。
上記刊行物のいずれも、二つの合成スプリントライゲーションプローブ（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡベース）のスプリント鋳型において、内因性核酸標的（例えば、ゲノムウイルスＲＮＡまたは哺乳類遺伝子転写物などの内因性標的ＲＮＡ）、それによって逆転写の必要性をなくす方法を提供していない。さらに、上記刊行物のいずれも、プローブの一方または両方に存在する結合部分を特異的に結合する固体支持体（例えば、ビーズ）上でのスプリントライゲーションプローブの捕捉（例えば、濃縮のための）を開示していない。さらに、上記刊行物のいずれも、ＰＣＲによる検出の前にサンプルのプーリングを可能にする、サンプルバーコードプライマー（例えば、サンプルバーコード配列または逆相補体にハイブリダイズする）による選択的な増幅のための、サンプルバーコードを有する一つまたは複数のスプリントライゲーションプローブを記載していない。これらの個別の態様のうち一つまたは複数は、任意選択的に、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスおよびワークフローとの組合せで、固有の利益を提供しうる。このような態様および追加の態様は、キットまたは方法における任意の適切な組合せについて本明細書にさらに考察される。
対象のスプリントライゲーションの方法およびキットは、下記に記載される一つまたは複数の明確な利点を提供しうる。ＲＮＡ標的をスプリント鋳型として使用することにより、逆転写酵素工程を回避してもよい。このような工程は、溶解物、血液、唾液、または他の流体サンプル中で阻害されうる。リガーゼは、阻害されない場合も阻害の少ない場合もあり、そのようなサンプルである。さらに、オフＩＦＣの逆転写および予備増幅の必要がないため、アンプリコン汚染のリスクが低減されうる（例えば、逆転写は不要であることがあり、予備増幅は、必要に応じて、以下に記載される任意選択的な濃縮の後にＩＦＣ上で行われうる）。本明細書に記載される結合部分を含むプローブの捕捉（例えば、濃縮）によって、ライゲーション前の溶解物、血液、唾液、または他の体液サンプルの阻害成分からハイブリダイゼーション産物を分離することが可能になりうる。本明細書に記載されるハイブリダイゼーションスキームは、最小限のフットプリントを有しうる。例えば、両プローブは、６０ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、または３０ヌクレオチド未満の長さの標的ＲＮＡの配列を、併せてハイブリダイズしうる。そのため、短いＲＮＡまたは分解されたＲＮＡが、このアプローチによって検出されうるが、その際に、より大きなセグメントの従来型ＰＣＲまたはポリＡベースの濃縮および／もしくは逆転写が適さないものとなる、。このようなＲＮＡは、固定（ＦＦＰＥ組織など）によって、または体液サンプル（唾液中のウイルスＲＮＡの分解など）中で、分解されていることがある。マイクロ流体（例えば、ＩＦＣ）ベースのワークフローでは、本明細書に記載のマイクロ流体デバイス上の捕捉により、ＩＦＣの反応部位における標的ＲＮＡ、ハイブリダイゼーション産物、および／またはライゲーション産物の濃縮がもたらされうる。このような反応部位は、１ｕｌ未満、５００ｎｌ未満、２００ｎｌ未満、１００ｎｌ未満、５０ｎｌ未満、または２０ｎｌ未満の体積を有しうる。ライゲーション産物の形成は、互いに隣接する二つのプローブの結合を必要とするため、この方法は高い特異性をもたらす。サンプルバーコード付きプローブは、ライゲーションおよび／または増幅などの工程の前にサンプルをプールすることを可能にして、均一なサンプルの扱いを可能にし、並列サンプル処理を増加させる。個々のサンプルは、プールされたサンプル中のライゲーション産物をシークエンシングすることによって、またはプールされたサンプルを別々の反応体積に分離し、本明細書に記載の一つまたは複数のサンプルバーコードプライマーを使用してサンプル特異的ＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ）を行うことによって、調査されうる。例えば、プールされたサンプルは、異なる反応体積（例えば、アレイＩＦＣ上の反応部位）に分割されてもよく、個々のサンプルからの標的ＲＮＡは、異なるサンプルバーコードプライマーを用いて、異なる反応部位の異なるサンプルからのライゲーション産物を増幅することによって検出されうる。このようなサンプルバーコード付きプライマーは、本明細書に記載されるようにアレイＩＦＣのアッセイ入口を通して入力されてもよく、プールされたサンプルは、サンプル入口を通して入力されてもよく、任意選択的にアレイの上流のマイクロ流体デバイス上で捕捉および／または前処理されてもよい。アレイＩＦＣ上の検出は、並列サンプル処理、自動化および均一なサンプル処理、ならびに試薬コストの低減をもたらす少ない反応体積を実現しうる。
標的核酸スプリント鋳型を用いたスプリントライゲーション
ある態様では、標的核酸は、内因性ＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。内因性標的ＲＮＡは、ウイルスＲＮＡ（例えば、ゲノムウイルスＲＮＡ）、または哺乳類種のもの、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、または齧歯類対象由来の遺伝子転写物または非コードＲＮＡでありうる。サンプルは、細胞溶解物（例えば、細胞培養物もしくは組織由来）、無細胞核酸（例えば、体液由来）、または精製核酸、例えば、以下にさらに記載されるようなものでありうる。
例えば、標的ＲＮＡは、呼吸器ウイルス（例えば、合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス、ライノウイルス、およびコロナウイルス）などのゲノムウイルスＲＮＡでありうる。このような場合、対象（例えば、ヒト）からのサンプルを採取して、ウイルス感染を決定してもよい。サンプルは、唾液、鼻腔スワブ、血液、またはそれらの抽出成分でありうる。ある態様では、ウイルスＲＮＡは、部分的に分解され（例えば、唾液サンプルにおいて）、従来の逆転写およびＰＣＲ増幅によって検出するのが困難であることがある。
別の例では、標的ＲＮＡは、内因性哺乳類（例えば、齧歯類、非ヒト霊長類、またはヒト）ＲＮＡでありうる。哺乳類ＲＮＡは、遺伝子転写物、またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）などの非コードＲＮＡ、ならびにマイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、またはｎｃＲＮＡなどのスモールＲＮＡでありうる。ある態様では、ＲＮＡは、ＦＦＰＥ固定および／または長期保存によってなどで、断片化されていてもよい。そのため、ウイルス感染および／または株、ならびに任意選択的にさらにウイルス量が、本明細書に記載のスプリントライゲーション法および／またはキットを用いて検出されうる。
ＲＮＡの検出は、典型的には、ＲＮＡ抽出、逆転写、および／または予備増幅（例えば、ウイルスｃＤＮＡの）を必要としうるが、本明細書に記載される対象のスプリントライゲーションの実施形態は、これらの工程のうちの一つまたは複数を省略することがあり、それゆえにアッセイコストが低減し、および／またはサンプル分析の並列化が増大する。そのため、遺伝子型判定または遺伝子発現は、本明細書に記載のスプリントライゲーション法および／またはキットを用いて検出されうる。
対象のスプリントライゲーション法およびキットでは、標的ＲＮＡはスプリントとして機能する。対象の標的ＲＮＡは、通常は既知である（例えば、配列決定され好適に入手可能なウイルスまたは哺乳類のゲノムまたはトランスクリプトームに基づく）ため、スプリントライゲーションプローブ（本明細書のスプリントライゲーションの文脈において単に「プローブ」と称される）は、第一のプローブの３’－ＯＨ末端が第二のプローブの５’－ＰＯ４末端の隣りになるように、互いに隣接して標的ＲＮＡを特異的にハイブリダイズするように設計されうる。このようなハイブリダイゼーションは、スプリントハイブリダイゼーション産物（本明細書のスプリントライゲーションの文脈において単に「ハイブリダイゼーション産物」と称される）を形成し、第一および第二のプローブをそれぞれ３’－ＯＨ末端と５’－ＰＯ４末端との間にニックを有するものとして記載することができる。
スプリントライゲーションプローブは、ＤＮＡベースであってもＲＮＡベースであってもよい。ＤＮＡベースのプローブは、ＰＣＲ増幅を可能にしうる。プローブはそれぞれ、標的核酸上の隣接配列、例えば、１０～３０ヌクレオチドの長さ、１５～２５ヌクレオチドの長さ、４０ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満、または１５ヌクレオチド未満の長さなどの配列にハイブリダイズしうる。プローブは、結合部分（例えば、ライゲーションされていない端部に付加される）を有してもよい。このようなプローブは、固体支持体からの分離を（例えば、シークエンシングまたはＰＣＲによる予備増幅および／または検出の前に）可能にする切断部位を有してもよい。あるいは、またはさらに、プローブは、本明細書にさらに記載されるように、特定のサンプル中に形成されたライゲーション産物の選択的な増幅のためのサンプルバーコードを有してもよい。
ハイブリダイゼーション産物中の前記プローブのライゲーションは、適切なリガーゼによってもよく、スプリントライゲーション産物（本明細書のスプリントライゲーションの文脈において単に「ライゲーション産物」と称される）を形成する。このようなライゲーションは、任意の適切なリガーゼによってもよい。例えば、プローブがＤＮＡプローブである場合、Ｔ４リガーゼまたはＰＢＣＶ－１リガーゼなどのリガーゼが、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド上のニックＤＮＡをライゲーションすることが、Ｌｏｈｍａｎらにより“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ ＤＮＡ－ＲＮＡ ｈｙｂｒｉｄ ｈｅｌｉｃｅｓ ｂｙ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ”Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２．３（２０１４）：１８３１－１８４４に示されている。
標的核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。さらに、スプリントライゲーションプローブは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含んでいてもよい。このように、ハイブリダイゼーション産物は、ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＲＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡのハイブリッドでありうる。ハイブリダイゼーション産物に適したリガーゼは、当業者によって選択されうる。
図１０Ａおよび図１０Ｂはそれぞれ、例示的なスプリントハイブリダイゼーション産物およびスプリントライゲーション産物を示す。図１０Ａは、標的核酸（例えば、内因性哺乳類またはウイルスＲＮＡなどのＤＮＡまたはＲＮＡ）がスプリント鋳型として機能する、対象出願の例示的なスプリントハイブリダイゼーション産物を示す。二つのプローブは、第一のプローブの３’－ＯＨ末端が第二のプローブの５’－ＰＯ４末端に隣接するように、標的核酸の隣接する配列に特異的にハイブリダイズする。プローブの一方または両方はさらに、サンプルバーコードなどのバーコード配列を有してもよい。プローブの一方または両方は、結合部分を有してもよい（例えば、ビーズなどの固体支持体上での捕捉を、濃縮および／または精製などのために可能にするために）。そのような捕捉は、ハイブリダイゼーション産物の捕捉であり、続いて、捕捉されたハイブリダイゼーション産物のライゲーションを行ってもよい。あるいは、そのような捕捉は、溶液中でライゲーションすると形成されるライゲーション産物の捕捉でありうる。図１０Ｂは、隣接する領域（すなわち、ニック）での二つのプローブのライゲーションから形成された例示的なスプリントライゲーション産物を示す。標的核酸は、やはりライゲーション産物にハイブリダイズされてもよいし、分解されてもよい（または熱、ＲＮａｓｅ、もしくは任意の適切な手段による標的ＲＮＡの分解などの分解が可能であってもよい）。プローブは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。例えば、ＤＮＡプローブは、ライゲーション産物の以降のＰＣＲを可能にしうる。
図１１は、例示的なスプリントライゲーションのワークフローを示す。このような方法のすべてにおいて、ハイブリダイゼーション産物は、スプリント鋳型として機能する標的核酸（例えば、標的ＲＮＡ）に対する二つのプローブのハイブリダイゼーションによって形成される。ハイブリダイゼーション産物中のプローブのライゲーションにより、ライゲーション産物が形成される。標的核酸の検出は、図１１に示すように、ライゲーション産物配列のシークエンシングによる場合も、ライゲーション産物のＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ）による場合もある。左端のワークフローで示されるような特定の態様では、ハイブリダイゼーション産物は、ライゲーションされ、次いで捕捉またはプーリングすることなくＰＣＲによって検出される。中央左のワークフローに示されるような特定の態様では、ハイブリダイゼーション産物は、ライゲーションされ、次いで固体支持体上に捕捉されてから（例えば、濃縮および／または精製）、ＰＣＲにより検出される。なお、捕捉工程は、ライゲーション工程の前に、例えば、ハイブリダイゼーション産物が依然として固体支持体に結合されている際にライゲーションが行われる場合などに、実施されうる。中央、中央右、および右端のワークフローに示されるような特定の態様では、少なくとも一つのプローブは、ハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物をプールすることを可能にするサンプルバーコードを有していてもよい。プールは分離されてもよく（例えば、ライゲーション、捕捉、および／または予備増幅などの工程の後に）、異なるサンプルからのライゲーション産生が、サンプルバーコードプライマーを用いて、異なる反応体積で検出されてもよい。例えば、ハイブリダイゼーション産物は、中央のワークフローに示されるように、捕捉され、次いでプールされ、次いでライゲーションされてから、ＰＣＲにより検出されてもよい。別の例では、ハイブリダイゼーション産物は、中央右のワークフローに示されるように、ライゲーションされ、次いでプールされ、次いで捕捉されてから、ＰＣＲに供されてもよい。別の例では、ハイブリダイゼーション産物は、右のワークフローに示されるように、プールされ、次いで捕捉され、次いでライゲーションされてから、ＰＣＲに供されてもよい。ある態様では、捕捉、ライゲーション、予備増幅、プールの分割、および／またはＰＣＲ検出は、カラムおよび／またはアレイＩＦＣを含むデバイスなどのマイクロ流体デバイス上で行われてもよい。例えば、ハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物の捕捉は、マイクロ流体デバイス上のふるい構造に流れ込んでカラムを形成するビーズ上であってもよいし、捕捉は、マイクロ流体デバイスのカラムに既に装填されたビーズ上にハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物を流すことによってもよい。本明細書に記載されるように、ライゲーション産物が異なる標的に対して、および／または異なるサンプル中で形成される場合などでは、検出はアレイＩＦＣ上であってもよい。
ある態様では、ライゲーションおよび予備増幅は、例えばマイクロ流体デバイス上またはチューブ内などで、同じ反応工程または反応体積で実施されうる。
スプリントライゲーションの方法およびキット
対象出願は、以下の態様を含む。
１．ライブラリー正規化の方法であって、
ａ．複数のサンプルからアリコートを取得することであって、サンプルが、離間した逆位リピートを含むポリヌクレオチドを含む、取得すること、
ｂ．工程ａのアリコートに対し抑制ＰＣＲを行うこと、
ｃ．工程ｂ由来の増幅産物を定量すること、
ｄ．複数のサンプルをプールして、工程ｃの定量に基づいて正規化されたライブラリーを形成すること、および
プールされた複数のサンプルが、工程ｂの抑制ＰＣＲを受けないこと。
２．複数のサンプルが、少なくとも８個のサンプルを含む、態様１の方法。
３．サンプルが、シークエンシング用にライブラリー調製される、態様１の方法。
４．サンプルが、固定した組織に由来する、態様１の方法。
５．抑制ＰＣＲが、離間した逆位リピートの少なくとも８ヌクレオチドと同一の配列を含むプライマーを伴う、態様１の方法。
６．離間した逆位リピートと同一の配列が、プライマーの３’末端にある、態様１または５の方法。
７．ポリヌクレオチドに相補的ではないが、以前のＰＣＲサイクルで産生された長いアンプリコンよりも短いアンプリコンの抑制を増加させる５’配列を、プライマーが含む、態様６の方法。
８．５’配列が、少なくとも６ヌクレオチド長である、態様７の方法。
９．抑制ＰＣＲが、一つのプライマーのみを伴う、態様１の方法。
１０．サンプルをプールしてリード均一性を正規化する、態様１の方法。
１１．プールされた複数のサンプルが、抑制ＰＣＲを受けなかった、態様１の方法。
１２．抑制ＰＣＲが、逆位リピート間に２００ヌクレオチド超を有するアンプリコンを、逆位リピート間で５０ヌクレオチドより短いアンプリコンよりも少なくとも２５倍多く濃縮する、態様１の方法。
１３．抑制ＰＣＲが、一つのプライマーのみを伴う、態様１の方法。
１４．抑制ＰＣＲが、離間した逆位リピートの少なくとも８ヌクレオチドと同一の３’配列を含む二つの異なるプライマーを伴う、態様１の方法。
１５．定量がｑＰＣＲによるものである、態様１の方法。
１６．定量が、ライブラリー定量標品の希釈系列に基づく、態様１の方法。
１７．ライブラリー定量標品の長さが、１５０～８００ヌクレオチドである、態様１６の方法。
１８．工程ｂ由来の増幅産物の融解曲線解析をさらに含む、態様１または１５に記載の方法。
１９．ポリヌクレオチドがｃＤＮＡを含む、態様１または３の方法。
２０．ポリヌクレオチドがｇＤＮＡを含む、態様１または３の方法。
２１．ポリヌクレオチドがサンプルバーコードを含む、態様１または３の方法。
２２．ポリヌクレオチドが二重インデックスを含む、態様２１の方法。
２３．ポリヌクレオチドが、可変長のインサートの側面に位置する離間した逆位リピートを含む、態様１の方法。
２４．インサートがｃＤＮＡである、態様１の方法。
２４．ポリヌクレオチドが、ちょうど二つの長さ８ヌクレオチド以上の離間した逆位リピートを含む、態様１の方法。
２５．離間した逆位リピートが、それぞれの末端の５０ヌクレオチド以内である、態様１または２４の方法。
２６．離間した逆位リピートが末端である、態様２５の方法。
２７．逆位リピートの間隔は可変性がある、態様１の方法。
２８．ポリヌクレオチドが、離間した逆位リピートを含むシークエンシングアダプターを含む、態様１の方法。
２９．サンプルのポリヌクレオチドが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｐ５およびｐ７シークエンシングアダプターを含む、態様１または２８の方法。
３０．離間した逆位リピートが、少なくとも８ヌクレオチド長である、態様２８の方法。
３１．少なくとも一つのサンプルが、サンプル間にわたる平均ポリヌクレオチド長の半分未満の平均ポリヌクレオチド長を有する、態様１の方法。
３２．工程ａの前にポリヌクレオチドを産生することをさらに含む、態様１の方法。
３３．ポリヌクレオチドを産生することが、３’濃縮を含む、態様３２の方法。
３４．ポリヌクレオチドを産生することが、ポリヌクレオチドのビーズベースの濃縮を含む、態様３２の方法。
３５．ポリヌクレオチドを産生することが、逆転写を含む、態様３２の方法。
３６．ポリヌクレオチドを産生することが、テール付与および鋳型切替えを含む、態様３２または３５の方法。
３７．ポリヌクレオチドを産生することが、断片化を含む、態様３２または３３の方法。
３８．ポリヌクレオチドを産生することが、ランダムプライミングを含む、態様３２の方法。
３９．ポリヌクレオチドを産生することが、離間した逆位リピートをポリヌクレオチドに添加するライゲーションを含む、態様３２の方法。
４０．ポリヌクレオチドを産生することが、サンプルバーコードのＰＣＲ導入を含む、態様３２の方法。
４１．ポリヌクレオチドを産生することが、離間した逆位リピートのＰＣＲ導入を含む、態様３２または４０の方法。
４２．ポリヌクレオチドがＲＮＡから産生される、態様３２の方法。
４３．ポリヌクレオチドがｇＤＮＡから産生される、態様３２の方法。
４４．ポリヌクレオチドが、マイクロ流体デバイス中の多段階反応で産生される、態様３２の方法。
４５．マイクロ流体デバイスが、エラストマー製マイクロ流体デバイスである、態様４４の方法。
４６．核酸が、ビーズを用いてマイクロ流体デバイス上で濃縮される、態様４４または４５の方法。
４７．ＲＮＡが、ポリＡ捕捉によって濃縮される、態様４６の方法。
４８．ポリ（Ａ）ＲＮＡが断片化され、逆転写され、結果として生じるｃＤＮＡが、マイクロ流体デバイスにおいてＰＣＲによりバーコード付けされたサンプルである、態様４７の方法。
４９．ポリヌクレオチドが、容積式液体処理器によって実施される多段階反応で産生される、態様４４の方法。
５０．プールされた複数のサンプルのポリヌクレオチドをシークエンシングすることをさらに含む。態様１の方法。
５１．シークエンシングが、全ゲノムシークエンシング、全トランスクリプトームシークエンシング、標的特異的シークエンシング、またはクロマチンアクセシビリティシークエンシングである、態様５０の方法。
５２．ライブラリーの正規化により、プールされたサンプルにわたるリード深度の均一性が改善される、態様５０の方法。
５３．ライブラリーの正規化の結果、ｑＰＣＲ定量に基づくが抑制ｑＰＣＲに基づかない正規化と比較して、リード深度の変動に少なくとも二倍の減少がもたらされる、態様５０の方法。
５４．ライブラリーの正規化の結果、ｑＰＣＲ定量に基づくが抑制ｑＰＣＲに基づかない正規化と比較して、シークエンシングコストに少なくとも二倍の減少がもたらされる、態様５０の方法。
５５．シークエンシングコストが、プール内のすべてのサンプルの適切なリード深度を達成するために必要なコストである、態様５０の方法。
５６．適切なリード深度が、少なくとも５０００リードである、態様５０の方法。
５７．５％未満のサンプルが、サンプル間にわたる平均リード深度の５０％未満のリード深度にある。態様５０の方法。
５８．サンプル間にわたる平均リード深度の５０％未満のリード深度にあるサンプルがない、態様５７の方法。
５９．ライブラリーが正規化されていなかった場合、５％超のサンプルが、サンプル間にわたる平均リード深度の５０％未満のリード深度にあるものとなる、態様５０の方法。
６０．ライブラリーが正規化されていなかった場合、少なくとも一部のサンプルが、サンプル間にわたる平均リード深度の２５％未満のリード深度にあるものとなる、態様５９の方法。
６１．正規化されたライブラリー中のすべてのサンプルは、５０００個を超える遺伝子が検出される、態様６０の方法。
６２．ライブラリーが正規化されていない場合、少なくともいくつかのサンプルは、２５００個未満の遺伝子が検出されるものとなる、態様６１の方法。
６３．抑制ｑＰＣＲによるポリヌクレオチドのライブラリー定量のためのキットであって、
少なくとも１５０ヌクレオチドで隔てられた、離間した逆位リピートを含むライブラリー定量標品と、
逆位リピートのうち一つの少なくとも８ヌクレオチドと同一の配列を含むプライマーと、を含むキット。
６４．プライマーが、マスターミックスおよびポリメラーゼの存在下、１サイクル当たり１．７５以上の効率で、ライブラリー定量標品を増幅することができるが、１サイクル当たり１．５以下の効率で、５０ヌクレオチド以下で離間した逆位リピートを含むサンプルポリヌクレオチドを増幅するものとなる、態様６３のキット。
６５．プライマーが、マスターミックスおよびポリメラーゼの存在下、５０ヌクレオチド以下を離間した逆位リピートを含むポリヌクレオチドよりも、０．２５以上のサイクル効率で、２００ヌクレオチド以上を離間した逆位リピートを含むポリヌクレオチドを増幅することができる、態様６４のキット。
６６．ライブラリー定量標品が、逆位リピートを含むシークエンシングアダプターを含む、態様６３のキット。
６７．離間した逆位リピートを導入するアダプターをさらに含む、態様６３に記載のキット。
６８．ライブラリー調製および定量のためのキットであって、
少なくとも８ヌクレオチド長の逆位リピートを提供するアダプターと、
逆位リピートの少なくとも８ヌクレオチドと同一の配列を含むプライマーと、を含むキット。
６９．プライマーが、マスターミックスおよびポリメラーゼの存在下、５０ヌクレオチド以下を離間した逆位リピートを含むサンプルポリヌクレオチドよりも、０．２５以上のサイクル効率で、２００ヌクレオチド以上を離間した逆位リピートを含むサンプルポリヌクレオチドを増幅することができる、態様６８のキット。
７０．プライマーが、マスターミックスおよびポリメラーゼの存在下、１サイクル当たり１．８以上の効率で、ライブラリー定量標品を増幅することができるが、１サイクル当たり１．５以下の効率で、５０ヌクレオチド以下で離間した逆位リピートを含むサンプルポリヌクレオチドを増幅するものとなる、態様６８のキット。
７１．離間した逆位リピートと同一の配列が、プライマーの３’末端にある、態様６３または６８のキット。
７２．ポリヌクレオチドに相補的ではないが、以前のＰＣＲサイクルで産生された長いアンプリコンよりも短いアンプリコンの抑制を増加させる５’配列を、プライマーが含む、態様６３または６８または７１のキット。
７３．５’配列は、少なくとも６ヌクレオチド長である、態様７２のキット。
７４．プライマーが、離間した逆位リピートを含むポリヌクレオチドの抑制ＰＣＲに十分である、態様６３または６８のキット。
７５．離間した逆位リピートの少なくとも８ヌクレオチドと同一の配列を含むがプライマーとは異なる５’配列を含む、異なるプライマーをさらに含む、態様６３または６８のキット。
７６．アダプターがサンプルバーコードを含む、態様６８のキット。
７７．アダプターが二重インデックスを含み、
アダプターを有して産生されたライブラリー調製済みポリヌクレオチドは、離間した逆位リピートを含む、態様６８または７６のキット。
７８．マイクロ流体デバイス上の核酸を濃縮するためのビーズをさらに含む、態様６８のキット。
７９．３’ポリ－Ｔ配列を含むオリゴヌクレオチドが、ビーズに結合される、態様７８のキット。
８０．標的ヌクレオチド配列のビーズベースの濃縮のためのマイクロ流体デバイスをさらに含む、態様６８、６９、または７０のキット。
８１．マイクロ流体デバイスが、多段階シークエンシングライブラリー調製のための一連の反応部位を有する、態様８０のキット。
８２．逆転写のための試薬をさらに含む、態様６８または８０のキット。
８３．受動参照色素をさらに含む、態様６３または６８のキット
８４．ｑＰＣＲを実施するためのＰＣＲマスターミックスをさらに含む、態様６３または６８のキット。
８５．方法の態様１～６２のいずれか一つを実施するためのキット。
８６．抑制ｑＰＣＲに基づくライブラリーの正規化を含む方法。
８７．抑制ｑＰＣＲを含む方法。
８８．抑制ｑＰＣＲによって正規化されたライブラリーをシークエンシングすることを含む方法。
８９．態様１～６２のいずれか一つの抑制ｑＰＣＲに基づいて正規化されたサンプルのプール。
９０．スプリントハイブリダイゼーション産物を処理する方法であって、
ａ）第一のプローブおよび第二のプローブを標的核酸にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション産物を形成し、第一のプローブの３’－ＯＨ末端が第二のプローブの５’－ＰＯ４末端に隣接し、第一のプローブおよび第二のプローブのうち少なくとも一つが結合部分を含む、ハイブリダイズすることと、
ｂ）結合部分を固体支持体に特異的に結合することによって、ハイブリダイゼーション産物を捕捉することと、を含む方法。
９１．標的核酸が標的ＲＮＡである、態様１の方法。
９２．標的ＲＮＡがゲノムウイルスＲＮＡである、態様２の方法。
９３．標的ＲＮＡが哺乳類遺伝子転写物である、態様３の方法。
９４．固体支持体がビーズを含む、態様９０～９３のいずれか一つの方法。
９５．固体支持体が、マイクロ流体デバイスのカラム上にある、態様９０から９４のいずれか一つの方法。
９６．ハイブリダイゼーション産物を捕捉した後にハイブリダイゼーション産物をライゲーションすることをさらに含む、態様９０～９５のいずれか一つの方法。
９７．ライゲーション産物を固体支持体から分離することをさらに含む、方法態様９６。
９８．第一のプローブおよび第二のプローブのうち少なくとも一つが、サンプルバーコードを含む、態様９０～９５のいずれか一つの方法。
９９．第一のプローブおよび第二のプローブのうちの少なくとも一つが、サンプルバーコードを含む、態様９６または９７の方法。
１００．捕捉の工程ｂ）の前または後に、異なるサンプル由来のハイブリダイゼーション産物を組み合わせて、サンプルのプールを形成する、態様９９の方法。
１０１．サンプルのプールを別々の反応体積に分離することによって、異なるサンプルの標的核酸を検出することをさらに含み、サンプルバーコードプライマーを使用した、異なる反応体積における異なるサンプルのライゲーション産物のＰＣＲ増幅をさらに含む、態様１００の方法。
１０２．ＰＣＲ増幅がアレイＩＦＣ上である、態様１０１の方法。
１０３．ライゲーション産物のＰＣＲ増幅によって標的核酸を検出することをさらに含む、態様９０～９９のいずれか一つの方法。
１０４．ＰＣＲ増幅が定量的ＰＣＲである、態様１０２または１０３の方法。
１０５．ＰＣＲ増幅がエンドポイントＰＣＲである、態様１０２または１０３の方法。
１０６．スプリントライゲーション産物を検出する方法であって、
ａ）第一のプローブおよび第二のプローブを標的核酸にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション産物を形成し、第一のプローブの３’－ＯＨ末端が前記第二のプローブの５’－ＰＯ４末端に隣接している、ハイブリダイズすることと、
ｂ）第一のプローブと第二のプローブとをライゲーションしてライゲーション産物を形成することと、
ｃ）ライゲーション産物の存在を検出することと、を含む方法。
１０７．ハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物を固体支持体上に捕捉することをさらに含む、態様１０６の方法。
１０８．ライゲーションの工程ｂ）の前に、ハイブリダイゼーション産物が固体支持体上に捕捉される、態様１０７の方法。
１０９．ライゲーション産物が、固体支持体上に捕捉される、態様１０７の方法。
１１０．固体支持体がビーズを含む、態様１０７～１０９のいずれかの方法。
１１１．ビーズがマイクロ流体デバイス上にあるか、またはビーズが前記捕捉後にマイクロ流体デバイス上に装填される、態様１１０の方法。
１１２．マイクロ流体デバイス内のライゲーション産物のＰＣＲ増幅をさらに含む、態様１１１の方法。
１１３．第一のプローブが、その５’末端上に結合部分を含み、および／または第二のプローブが、その３’末端上に結合部分を含む、態様１０７～１１２のいずれかの方法。
１１４．結合部分がビオチンまたはその誘導体であり、固体支持体がアビジンまたはストレプトアビジンを含む、態様１１３の方法。
１１５．ライゲーション産物を固体支持体から分離することをさらに含む、態様１１４の方法。
１１６．固体支持体からのライゲーション産物の分離が、マイクロ流体デバイス上であり、固体支持体が、マイクロ流体デバイス上のカラム中のビーズである、態様１１５の方法。
１１７．検出の工程ｃ）が、ＰＣＲ増幅による、態様１０６～１１６のいずれか一つの方法。
１１８．ＰＣＲ増幅がエンドポイントＰＣＲである、態様１１７の方法。
１１９．ＰＣＲ増幅が定量的ＰＣＲである、態様１１７の方法。
１２０．ＰＣＲ増幅がアレイＩＦＣ上である、態様１１７から１２０のいずれか一つの方法。
１２１．第一のプローブおよび第二のプローブのうち少なくとも一つが、サンプルバーコードを含む、態様１～１１６のいずれか一つの方法。
１２２．異なるサンプル由来のハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物をプールすることをさらに含む、態様１２１の方法。
１２３．ＰＣＲによってプールされたライゲーション産物を予備増幅することをさらに含む、態様１２２の方法。
１２４．複数の反応部位内にプールを分離すること、および異なる反応部位中の異なるサンプルのライゲーション産物を検出することをさらに含み、検出の工程ｃ）が、ＰＣＲ増幅のためのサンプルバーコードプライマーを使用することを含む、態様１２２または１２３の方法。
１２５．検出の工程ｃ）が、サンプルバーコードにハイブリダイズする第一のプライマーと、ライゲーション産物の標的特異的配列またはバーコードをハイブリダイズする第二のプライマーとを使用するｑＰＣＲを含み、異なる標的ＲＮＡおよび異なるサンプル由来の複数のライゲーション産物が、別々の反応部位で検出される、態様１２４の方法。
１２６．ＰＣＲ増幅がエンドポイントＰＣＲである、態様１２４または１２５の方法。
１２７．ＰＣＲ増幅が定量的ＰＣＲである、態様１２４または１２５の方法。
１２８．検出の工程ｃ）が、プールされたサンプル中のライゲーション産物のシークエンシングによる、態様１２２の方法。
１２９．標的核酸が標的ＲＮＡである、態様１０６～１２８のいずれか一つの方法。
１３０．標的ＲＮＡがウイルスＲＮＡである、態様１２９の方法。
１３１．標的ＲＮＡが哺乳類遺伝子転写物である、態様１２９の方法。
１３２．複数の異なる標的核酸が、工程ａ）で二つのプローブの固有の対によってそれぞれハイブリダイズされ、その後、工程ｂ）で各プローブ対がハイブリダイゼーションされて、異なるライゲーション産物が形成される、態様１０６から１３１のいずれか一つの方法。
１３３．異なる反応部位におけるｑＰＣＲにより、異なる標的核酸からライゲーション産物を検出することをさらに含む、態様１３２の方法。
１３４．異なる反応部位が、アレイ集積化流体回路上にある、態様１３３の方法。
１３５．異なる反応部位中の異なるサンプルバーコードプライマーを用いて、異なるサンプルからライゲーション産物を別々に検出することをさらに含む、態様１３４の方法。
１３６．マイクロ流体デバイス中の固体支持体上のハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物を捕捉することをさらに含む、態様１０６～１３５のいずれか一つの方法。
１３７．マイクロ流体デバイスのアレイ中の別々の反応部位において、異なるサンプルおよび／または標的ＲＮＡのライゲーション産物を増幅することをさらに含む、態様１３６の方法。
１３８．第一および第二のプローブのうち少なくとも一つが、ＤＮＡプローブである、態様１０６～１３７のいずれか一つの方法。
１３９．標的核酸がＲＮＡであり、方法が標的ＲＮＡの逆転写を含まない、態様１０６～１３８のいずれか一つの方法。
１４０．スプリントライゲーション検出キットであって、
それぞれが標的核酸にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション産物を形成する、第一のプローブおよび第二のプローブを含み、
第一のプローブの３’－ＯＨ端部が、第二のプローブの５’－ＰＯ４端部に隣接し、
第一のプローブが、その５’末端上に結合部分を含み、第二のプローブが、その３’末端上に結合部分を含む、キット。
１４１．標的核酸が標的ＲＮＡである、態様１４０のキット。
１４２．標的ＲＮＡがウイルスＲＮＡである、態様１４１のキット。
１４３．標的ＲＮＡが哺乳類遺伝子転写物である、態様１４３のキット。
１４４．結合部分が、ビオチンまたはその誘導体である、態様１４０～１４３のいずれか一つのキット。
１４５．結合部分を特異的に結合する固体支持体をさらに含む、態様１４０から１４４のいずれか一つのキット。
１４６．リガーゼをさらに含む、態様１４０～１４５のいずれか一つのキット。
１４７．捕捉されたハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物を固体支持体から分離するための試薬をさらに含む、態様１４０～１４６のいずれか一つのキット。
１４８．ＰＣＲ条件下でライゲーション産物を特異的に増幅する複数のプライマーをさらに含む、態様１４０～１４７のいずれか一つのキット。
１４９．少なくとも一部のプライマーが、サンプルバーコードプライマーである、態様１４８のキット。
１５０．それぞれ異なるサンプルバーコードを含む複数の分離されたプローブを含む、態様１４９のキット。
１５１．異なる標的ＲＮＡにそれぞれハイブリダイズする複数のプローブ対を含み、任意選択的に、異なるプローブ対が混合物である、態様１４０～１５０のいずれか一つのキット。
１５２．異なる標的ＲＮＡから形成されるライゲーション産物を特異的に増幅する標的特異的プライマーをさらに含み、任意選択的に、標的特異的プライマーが混合物である、態様１５１のキット。
１５３．ハイブリダイゼーション産物またはハイブリダイゼーション産物から形成されるライゲーション産物のビーズベースの濃縮のためのカラムを含むマイクロ流体デバイスをさらに含む、態様１４０～１５２のいずれか一つのキット。
１５４．マイクロ流体デバイスが、ライゲーション産物の多段階サンプル処理のための一連の反応部位を含む、態様１５３のキット。
１５５．マイクロ流体デバイスが、一連の反応部位の下流に反応部位のアレイをさらに含み、アレイ中の各反応部位は、異なるアッセイ入口からの試薬と、異なる処理済みサンプルを混合するように構成される、態様１５３または１５４のキット。
１５６．アレイＩＦＣをさらに含む、態様１４０～１５２のいずれか一つのキット。
捕捉ベースの濃縮
態様は、スプリントハイブリダイゼーション産物またはスプリントライゲーション産物の固体支持体上の捕捉を含む。固体支持体は、ビーズ、マイクロ流体デバイス上のカラム（例えば、ビーズを詰め込まれた）、マトリックス、または平面アレイを含みうる。ビーズは、任意の適切な材料であってもよく、例えば、本明細書に別記されるような材料であってもよい。
固体支持体（例えば、ビーズ）は、プローブ（例えば、一方または両方のプローブによってハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物に組み込まれる）の結合部分を特異的に結合するように官能基化されてもよい。ある態様では、結合は、親和性または共有結合によってもよい。例えば、プローブは、ビオチンまたはその誘導体を含んでもよく、ビーズは、アビジンまたはストレプトアビジンを含んでもよい（またはその逆もありうる）。ある態様では、結合は、チオール反応性化学、アミン反応性化学、またはクリック化学（例えば、ＴＣＯとテトラジンとの間、またはＤＢＣＯとアジドの間の）を介するなどの共有結合でありうる。したがって、結合部分は、親和性試薬もしくは分析物、または共有結合部分であってもよい。あるいは、プローブは、標的核酸へのハイブリダイゼーションの前にビーズに付着され、ビーズ上でのハイブリダイゼーション産物の捕捉を可能にしうる。あるいは、プローブは、固体支持体（例えば、ビーズ）によって提供されるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするアンカー配列を含んでいてもよい。
プローブは、結合部分（例えば、ライゲーションされていない端部に付加される）を有してもよい。このようなプローブは、固体支持体からの分離を（例えば、シークエンシングまたはＰＣＲによる予備増幅および／または検出の前に）可能にする切断部位を有してもよい。
ハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物のビーズベースの捕捉は、「チューブ内」で（すなわち、個々のチューブ内またはマイクロウェルプレート内など、マイクロ流体デバイスから離れて）行われてもよい。このような捕捉の後、マイクロ流体デバイス上の追加の処理のために、ビーズをマイクロ流体カラム内に流してもよい。ある態様では、ビーズは、マイクロ流体デバイス上のカラム内に装填されてもよく、ハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物は、カラムを通って流れて産物を濃縮しうる。マイクロ流体デバイスは、本明細書に別途考察され、図３または図４に示されるなど、カラムおよび下流のサンプル処理部位を含んでいてもよい。ライゲーションは、チューブ内で発生してもよいし、捕捉されたハイブリダイゼーション産物がマイクロ流体デバイス内にある場合には、マイクロ流体デバイス内で行われてもよい。
態様は、上述のように、ハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物に結合したビーズを提供することを含みうる。そのような産物は、付加処理前（例えば、ハイブリダイゼーション産物の場合はライゲーション前、予備増幅前、および／または検出のためのＰＣＲ増幅前）にビーズから分離されうる。分離は、化学的または酵素的な切断、例えば、ＵＤＧ（ＵＮＧとも称される）によるプローブ上でのｄＵの切断、および／またはＡＰＥ１などのエンドヌクレアーゼによる切断によって媒介されうる。このようなプローブは、ＤＮＡ（例えば、結合部分の近位のｄＵ配列以外）を含んでいてもよい。あるいはまたはさらに、分離は熱によって媒介されてもよい。あるいは、分離は、ビーズ上のアビジンまたはストレプトアビジンに結合されたデスチオビオチン結合部分の遊離ビオチンによる置換などの置換による場合がある（またはその逆もありうる）。あるいは、またはさらに、プローブおよび／またはビーズは、ハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物をビーズの表面から離間させるためのリンカー（例えば、ＰＥＧリンカー）を含んでいてもよい。
本明細書にさらに記載されるように、サンプルは、捕捉の前または後に、サンプルバーコード付与され、プールされてもよい。上記捕捉方法および試薬は、本明細書に別記される用途など、スプリントライゲーション以外の用途の捕捉に使用されうる。
バーコード付きスプリントライゲーションプローブおよびプーリング
ある態様では、一つまたは複数のスプリントライゲーションプローブは、サンプルバーコードなどのバーコードを含んでいてもよい。このようなプローブは、図１０Ａのハイブリダイゼーション産物に示されており、任意選択的に、本明細書に記載の結合部分および／または追加の構成要素を含んでいてもよい。
サンプルバーコードは、５～３０ヌクレオチド、例えば１０～２５ヌクレオチドなどの長さでありうる。サンプルバーコードは、標的核酸へのハイブリダイゼーション部位の側面に位置するようにライゲーション産物に組み込まれうる。バーコード化されたサンプル（例えば、バーコード化されたハイブリダイゼーション産物またはライゲーション産物）は、ライゲーション、捕捉、予備増幅、および／または検出（例えば、シークエンシングまたはｑＰＣＲなどのＰＣＲによる）などの特定の工程の前にプールされうる。ＰＣＲによる検出は、プールされたサンプル（例えば、プーリング後に捕捉、ライゲーションおよび／または増幅されているサンプル）を別々の反応体積に分離すること、および異なる反応体積のサンプルバーコードプライマーを用いて異なるサンプルからライゲーション産物を別々に検出することを含みうる。サンプルバーコードプライマーは、サンプルバーコードまたはその逆相補体にハイブリダイズしうる。ある態様では、分離は、ＩＦＣアレイの反応部位内であってもよく、異なるサンプルバーコードプライマーが、異なるアッセイ入口を介してアレイに流れ込んでもよい。アッセイバーコードまたは標的核酸配列（またはその相補体）に結合するアッセイ特異的プライマーを、例えば、サンプルバーコードプライマーと組み合わせて使用して、別々の反応部位で標的とサンプルとの異なる組合せを検出してもよい。ＰＣＲによる検出のためのアレイＩＦＣおよびサンプルバーコードは、米国特許出願公開第２０１００１２００３８号に記載されており、その全体が参照により組み込まれる。プールされたサンプルは、チューブ中で調製され、サンプル入口から直接的にアレイに流れ込んでもよいし、図３または図４に示すようなカラムおよび／または処理部位を含むユニットセルから流れてもよい。
サンプルバーコード付与および／またはプーリングは、本明細書に記載の捕捉などの他の態様と組み合わされてもよい。
マイクロ流体自動化および並列処理
図１２は、アレイ集積化流体回路（ＩＦＣ）の概略図である。示されるように、複数のサンプル入口１２０２Ａ～Ｘは、サンプルチャンバ（黒色のボックス）にサンプルを提供する。複数のアッセイ入口１２０４Ａ～Ｙは、アッセイチャンバ（白色のボックス）にアッセイ試薬（例えば、プライマーと、任意選択的な追加のＰＣＲ成分、例えばポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および／または補助因子など）を提供する。アレイへのサンプル入口は、ユーザから装填されたウェルから直接的であってもよいし、または図３もしくは図４に示すように、カラムおよび／またはサンプル前処理部位の下流であってもよい。ある態様では、アッセイ入口は、異なる標的特異的プライマーを提供しうる。
このようなアレイは、図３または図４に示すユニットセルなど、サンプルの捕捉および／または処理のためにユニットセルと（流体連通で）統合されてもよい。あるいは、図３または図４に示すマイクロ流体デバイスから得られた、または任意のマイクロ流体デバイスから離れてチューブ内で調製されたサンプルを採集して、別々のアレイＩＦＣに入力してもよい。
アレイＩＦＣは、サンプルおよびアッセイのフローチャネルが互いを通過できるように、複数の層を有してもよい。アレイＩＦＣは、エラストマー製であってもよく（例えば、ＰＤＭＳなどのエラストマーを含んでいてよい）、フローチャネル内の膜を偏向させるよう制御チャネル（図示せず）に印加される圧力を通じて制御されるエラストマー弁をさらに有していてもよい。弁は、それぞれのチャンバ内にサンプルおよび／またはアッセイを含有するように破線のフローチャネルに沿って配置されうる（例えば、混合後の後方の汚染を防止する）。弁は、混合（例えば、界面のない拡散による）を制御するために、アッセイチャンバのサンプルの対の間に配置されうる。好適なアレイアーキテクチャの詳細な説明は、米国特許出願公開第２０１００１２００３８号および第２０１４０１９３８９６号に見出され得、どちらも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある態様では、アッセイ入口は、本明細書に記載されるように形成されたスプリントライゲーション産物を増幅するためのプライマーを提供しうる。あるいは、またはさらに、アッセイ入口は、サンプルのプール内の特定のサンプル由来のライゲーション産物上で、サンプルバーコード配列（またはその逆相補体）を結合するサンプルバーコードプライマーを提供しうる。このようなサンプルバーコードは、スプリントライゲーションプローブによって組み込まれてもよく、サンプルは、サンプル入口を介してアレイに提供される前にプールされうる。例えば、８個のサンプルが、４８個の異なるサンプル入口のそれぞれに対してプールされ、８個の異なるアッセイ入口がそれぞれ、異なるサンプルからのライゲーション産物を増幅する場合に、４８×８（すなわち、３８６）個の異なるサンプルがアレイ内でアッセイされうる。そのため、アッセイ入口は、検出された標的および／またはサンプルの数を増加させうる。そのため、アレイデバイスは、少なくとも１２個、少なくとも２４個、少なくとも４８個、または少なくとも９６個の別々のサンプル入口を備えてもよい。さらに、少なくとも４個、少なくとも８個、少なくとも１２個、または少なくとも２４個の異なるサンプルバーコードが、異なるアッセイ入口を通って流されうる。そのため、サンプル入口よりも多くのサンプルがアッセイされうる。例えば、少なくとも３８６個の異なるサンプルが、アレイ中でアッセイされうる。アレイフットプリントは、１００平方センチメートル未満、例えば２０平方センチメートル未満、または１０平方センチメートル未満でありうる。ある態様では、異なる反応部位が、異なるサンプルから異なる標的を検出するように、異なる標的特異的プライマーも、異なるアッセイ入口に流される。
ライゲーション産物の検出
スプリントライゲーション産物の検出は、シークエンシング（例えば、サンプルバーコードおよびプールサンプルの）によってもよいし、ＰＣＲ増幅（例えば、エンドポイントＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ）によってもよい。シークエンシングのためのライブラリー調製の方法は公知であり、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイス上で実施されてもよい。あるいは、ＰＣＲ産物を定量して、サンプルのプールに添加するサンプル（例えば、サンプルライブラリー）の量を決定してもよい。定量は、定量的ＰＣＲまたは“ｑＰＣＲ”など、ＰＣＲの間に実施されうる。ｑＰＣＲでは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の存在量は、染料インジケータ（ｄｓＤＮＡインターカレート染料など）を用いて複数のサイクルにわたって測定され、増幅曲線の線形相を用いて、増幅された標的の開始量を計算する。他の定量化の形態としては、エンドポイント検出（例えば、染料または標的特異的プローブなどによって、設定された数のラン後に増幅された標的の量を測定する）またはデジタルＰＣＲが挙げられる。
したがって、チューブ内またはアレイＩＦＣ上のライゲーション産物のＰＣＲは、標的核酸の検出および任意選択的に定量を可能にしうる。上述のように、一つまたは複数のプローブは、ライゲーション産物が片側または両側にサンプルバーコードを有するように、サンプルバーコードを有していてもよい。次いで、ＰＣＲ増幅は、本明細書に記載されるサンプルのプール内の特定のサンプルからライゲーション産物を選択的に増幅するなどのための、一つまたは複数のサンプルバーコード特異的プライマーを伴う場合がある。あるいは、またはさらに、少なくともいくつかのプライマーは、特定の標的核酸からのライゲーション産物の検出を可能にするように、標的特異的でありうる。
スプリントライゲーションキット
ある態様では、並行サンプル処理用キットは、本明細書に記載のスプリントライゲーション法のための試薬を含みうる。このようなキットは、本明細書の任意の実施形態に記載される二つのスプリントライゲーションプローブを有していてもよく、任意選択的に、ライゲーション産物を形成するためのリガーゼ、ライゲーション産物を増幅するためのプライマー、および／または追加の試薬を、さらに含んでいてもよい。スプリントライゲーションキットは、本明細書に記載される一つまたは複数のマイクロ流体デバイスをさらに含みうる。
マイクロ流体自動化および並列処理
マイクロ流体デバイス、熱制御、および／またはマイクロ流体デバイスのイメージングにおいて流体流を制御するためのシステムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８００８８９５２号に記載される。例えば、システムは、以下のうち一つまたは複数の工程を実施しうる：
ｉ）複数のサンプルをマイクロ流体デバイスの反応チャンバ内に流すこと、
ｉｉ）上記複数のサンプル由来の鋳型核酸を増幅すること、および
ｉｉｉ）増幅反応を検出すること。
本システムは、以下のうち一つまたは複数を含みうる：
エラストマー製マイクロ流体デバイス内の弁を作動させるための、およびエラストマー製マイクロ流体デバイスの複数の反応チャンバ内にサンプルを導入するための、圧力を印加するための自動圧力源であって、エラストマー製マイクロ流体デバイスが、上記自動圧力源にアクセス可能なキャリアを含む、自動圧力源、
エラストマー製マイクロ流体デバイスのキャリアの一部分と嵌合するように構成された熱プラテン、ならびに
光源、光学レンズシステム、および検出器アレイカメラを含む光学撮像システム。
例えば、自動圧力源、熱プラテン、および光学撮像システムは、単一のプラットフォームの一部である。
本システムは、複数の反応チャンバの少なくともいくつかを互いに隔てていてもよい。マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意のデバイスであってもよく、本システムは、本明細書に記載される任意の方法を実施しうる。
ある態様では、アレイマイクロ流体デバイス（例えば、アレイＩＦＣ）は、本明細書に記載のスプリントライゲーション産物（すなわち、その標的）の検出などに、使用されうる。ある態様では、アレイＩＦＣは、本明細書に記載のカラムおよび／または処理部位を含むユニットセルと（流体連通で）統合されていてもよい。
図１２は、アレイ集積化流体回路（ＩＦＣ）の概略図である。示されるように、複数のサンプル入口１２０２Ａ～Ｘは、サンプルチャンバ（黒色のボックス）にサンプルを提供する。複数のアッセイ入口１２０４Ａ～Ｙは、アッセイチャンバ（白色のボックス）にアッセイ試薬（例えば、プライマーと、任意選択的な追加のＰＣＲ成分、例えばポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および／または補助因子など）を提供する。アレイへのサンプル入口は、ユーザから装填されたウェルから直接的であってもよいし、または図３もしくは図４に示すように、カラムおよび／またはサンプル前処理部位の下流であってもよい。ある態様では、アッセイ入口は、異なる標的特異的プライマーを提供しうる。
集積型ワークフローとマイクロ流体デバイス
上述のように、集積化マイクロ流体デバイスは、それゆえに、反応部位のアレイと、複数のサンプル処理部位を含む複数のサンプル処理ユニットセルとを含んでいてもよく、ユニットセルは、複数の異なる試薬入口と流体連通しており、アレイへのサンプル入口は、複数のユニットセルの複数のサンプル処理部位の下流にある。
複数の試薬入口は、各ユニットセルに共通のチャネルを共有してもよい。マイクロ流体デバイスは、ユニットセルの処理部位を装填するために使用される試薬入口を制御するように構成されたマルチプレクサを含みうる。
複数のサンプル処理部位は、複数のループおよび／またはチャンバを含みうる。各ユニットセルは、サンプル入口チャネル、廃液出口チャネル、追加試薬入口、および／または追加のカラムのうちの一つまたは複数をさらに含む。
各ユニットセルは、ユニットセルを制御するように構成された複数の弁を含みうる。複数の弁は、サンプルおよび試薬をユニットセル内の異なる位置に送達するように構成されてもよい。複数の弁は、サンプル処理場所を単独で設置し、または互いに連通して設置するように構成されうる。複数の弁は、異なる位置で混合を駆動するように構成されうる。複数の弁は、ユニットセルからサンプルまたは試薬溶液の流れを向けるように構成される。例えば、ユニットセルは、蠕動式ポンプ（例えば、連続した一連の弁によって画定される）を含む。
個々のユニットセルは、ビーズを保持するように構成された少なくとも一つのカラムをさらに含む。カラムは、流体が流れるが穴よりも大きなビーズが保持されうる、複数の開口部を提供するふるい構造を含みうる。ある態様では、ユニットセルは、直列および／または並列に配置されるカラムなど、少なくとも二つのカラムを含む。例えば、ユニットセルは、サンプル／ビーズ入口チャネルによって供給される第一のカラム（例えば、血清浄化などのクリーンアップのための）を含んでいてもよく、さらに、例えば図１７に示すように、複数のカラムを並列に含みうる（例えば、それぞれが、ビーズ入口によって供給され、複数の下流サンプル処理部位と連通する）。複数のカラムを有するユニットセルは、本明細書にさらに記載されるように、異なる標的生体分子の濃縮に使用されうる。
反応部位のアレイの個々の反応部位はそれぞれ、アッセイチャンバおよびサンプルチャンバを含みうる。サンプル入口チャネルは、サンプルチャンバにサンプルを提供し、アッセイ入口は、例えば図１２に示すように、アッセイチャンバにアッセイ試薬を提供しうる。
マイクロ流体デバイスは、サンプル入口フローチャネルおよびアッセイ入口フローチャネルが互いを通過するように、複数の層を含みうる。マイクロ流体デバイスは、エラストマー製マイクロ流体デバイスであり、例えば、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を含みうる。デバイスのエラストマー弁は、流れチャネルと制御チャネルとの交差によって画定されており、作動力に応答して流れチャネル内に偏向されうるか、または流れチャネルから引き戻されうるエラストマー膜によって隔てられている。
マイクロ流体デバイスは、少なくとも１２個のユニットセル、少なくとも２４個のユニットセル、少なくとも４８個のユニットセル、または少なくとも９６個のユニットセルを含む。マイクロ流体デバイスのアレイは、ユニットセルと比較して、少なくとも３回、少なくとも８回、少なくとも１６回、または少なくとも２４回、反応部位の数をさらに含みうる。例えば、各ユニットセルは、少なくとも３個、少なくとも８ｋ、少なくとも１６個、または少なくとも２４個の異なる反応部位に供給されてもよい。異なる反応部位はそれぞれ、異なる試薬入口によって供給されてもよい。
ユニットセルは、本明細書にさらに記載される細胞捕捉部位（例えば、カラムの代わりに）を含む。
ある態様では、ユニットセルの下流のアレイは、デジタルアレイ、すなわち、デジタルＰＣＲによる単一の標的の定量を可能にする段階希釈を提供するアレイであってもよい。
ある態様では、集積化マイクロ流体デバイスは、反応部位のアレイと、複数のサンプル処理部位を含む複数のサンプル処理ユニットセルとを含んでいてもよく、ユニットセルは、複数の異なる試薬入口と流体連通しており、アレイへのサンプル入口は、複数のユニットセルの複数のサンプル処理部位の下流にある。このようなマイクロ流体デバイスは図１７に示されており、ユニットセルの下流の反応部位のアレイを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
図１７は、図３のものと類似した概略図であり、ビーズを保持するための複数のカラム１７１０と、特にサンプルの望ましくない成分を枯渇させるためのクリーンアップカラム１７１０ａと、異なる標的分子を捕捉するための複数の捕捉カラム１７１０ｂとを有する、例示的なユニットセルを示す。ビーズおよびサンプルは、第一の入口１７０４を通って、クリーンアップカラム１７１０ａに流れ込みうる。異なる捕捉ビーズが、一つまたは複数のビーズ入口１７０８を通して、異なる捕捉カラム１７１０ｂ内に装填されてもよい。
ある態様では、アッセイ入口は、本明細書に記載されるように形成されたスプリントライゲーション産物を増幅するためのプライマーを提供しうる。あるいは、またはさらに、アッセイ入口は、サンプルのプール内の特定のサンプル由来のライゲーション産物上で、サンプルバーコード配列（またはその逆相補体）を結合するサンプルバーコードプライマーを提供しうる。このようなサンプルバーコードは、スプリントライゲーションプローブによって組み込まれてもよく、サンプルは、サンプル入口を介してアレイに提供される前にプールされうる。例えば、８個のサンプルが、４８個の異なるサンプル入口のそれぞれに対してプールされ、８個の異なるアッセイ入口がそれぞれ、異なるサンプルからのライゲーション産物を増幅する場合に、４８×８（すなわち、３８６）個の異なるサンプルがアレイ内でアッセイされうる。そのため、アッセイ入口は、検出された標的および／またはサンプルの数を増加させうる。
例えば、方法は、ビーズをユニットセルのカラム内に装填すること、およびビーズ上にサンプル（すなわち、タンパク質、抗体、ＲＮＡ、ウイルス粒子などのサンプルの生体分子）を捕捉すること（例えば、ビーズをカラム内に装填する前または後に）を含みうる。本明細書で論じるように、ビーズは、一つまたは複数のタンパク質（例えば、標的血清タンパク質またはウイルス抗原に対する抗体などの抗体）およびオリゴヌクレオチド（例えば、ウイルスＲＮＡなどの標的ＲＮＡにハイブリダイズする）を含みうる（例えば、その表面上に存在しうる）。追加の工程は、洗浄緩衝液がカラム内のビーズの上と廃棄出口内とを流れるように、ビーズを洗浄することを含みうる。任意選択的に、レポーター、例えば、標的生体分子に結合するオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体、または標的生体分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブなどを、ビーズ上に流してもよい。追加の工程は、ビーズから溶出すること、例えば、溶出緩衝液をカラム内のビーズ上に流すこと、および任意選択的に、蠕動式ポンプを用いてループの周りに緩衝液を渡すなどによって、溶出緩衝液をビーズ間にわたってさらに循環させることなどを含みうる。なお、任意の工程でのサンプル処理部位間にわたる混合は、蠕動式ポンプによって駆動されうる。ある態様では、溶出は、例えば制限酵素、ＲＮａｓｅ、または本明細書にさらに記載されるようなウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）などによって、ビーズへの生体分子の付着を分解することを含みうる。溶出された生体分子は、予備増幅マスターミックス（例えば、全ゲノム増幅、全トランスクリプトーム増幅、またはマルチプレックス化標的予備増幅を提供する）と混合されうる。予備増幅前、または増予備幅と同じ工程で、逆転写、近接アッセイ（近接伸長もしくはライゲーションなど）、またはゲノムＤＮＡの調製などのサンプル調製工程。ある態様では、一つまたは複数の酵素（例えば、プロテアーゼ）は、予備増幅の前に、または以降の検出工程の前に、阻害または分解されてもよい。ある態様では、予備増幅は実施されない。次いで、処理されたサンプルは、同じマイクロ流体デバイスの反応部位のアレイ内に通されうるが、例えば、図１２に示すように、サンプル入口を通って、ユニットセルから異なる反応部位の複数のサンプルチャンバ内に通過しうる。サンプルの異なる標的は、例えば、サンプル調製中に産生した産物のＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ）によって、異なる反応部位間にわたって検出されうる。
アレイＩＦＣは、サンプルおよびアッセイのフローチャネルが互いを通過できるように、複数の層を有してもよい。アレイＩＦＣは、エラストマー製であってもよく（例えば、ＰＤＭＳなどのエラストマーを含んでいてよい）、フローチャネル内の膜を偏向させるよう制御チャネル（図示せず）に印加される圧力を通じて制御されるエラストマー弁をさらに有していてもよい。弁は、それぞれのチャンバ内にサンプルおよび／またはアッセイを含有するように破線のフローチャネルに沿って配置されうる（例えば、混合後の後方の汚染を防止する）。弁は、混合（例えば、界面のない拡散による）を制御するために、アッセイチャンバのサンプルの対の間に配置されうる。好適なアレイアーキテクチャの詳細な説明は、米国特許出願公開第２０１００１２００３８号および第２０１４０１９３８９６号に見出され得、どちらも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
スプリントライゲーション用途などの特定の態様では、対象のマイクロ流体ワークフローは、以下の工程のうちの一つまたは複数を含みうる。
１．共有入口からユニットセルのカラム内にビーズを装填する
２．サンプルを（例えば、独立した入口から）捕捉する
３．ビーズを（例えば、共有入口から）洗浄する
４．第一のチャンバに（例えば、共有入口から）溶出する
５．予備増幅マスターミックスを第二のチャンバに（例えば、共有入口から）装填する
６．アンプリコンを予備増幅からサンプルチャンバに装填する
７．アッセイミックス（ＰＣＲミックス、プライマー、および／またはプローブ）をアッセイチャンバに装填する
８．サンプルチャンバの画分（すなわち、少なくとも内容物の画分）を、アッセイチャンバ内のアッセイミックスと混合する
例えば、マイクロ流体デバイス上でアッセイを行う方法は、以下のそれぞれを含みうる：
共有入口からユニットセルのカラム内にビーズを装填すること、
ビーズ上に対象サンプル生体分子を捕捉すること、
ビーズを洗浄すること、
捕捉された生体分子を第一のチャンバ内に溶出すること、
予備増幅マスターミックスを第二のチャンバに装填すること、
予備増幅反応を行うこと、
予備増幅反応からサンプルチャンバ内にアンプリコンを装填すること、
アッセイミックスをアッセイチャンバ内に装填すること、および
サンプルチャンバおよびアッセイチャンバの内容物の少なくとも一画分を混合すること。
マイクロ流体デバイスは、上述のように、集積化マイクロ流体マイクロ流体デバイスであってもよい。
捕捉（ビーズ上へのサンプル生体分子の捕捉）の工程は、ビーズをカラム上に装填する工程の前でも後でもよい。ビーズを洗浄することは、カラム内のビーズ上に洗浄緩衝溶液を流すことを含みうるか、またはビーズを洗浄緩衝溶液と混合してビーズを溶液から分離し（例えば、ビーズは磁気ビーズである）、その後ビーズをカラム上に装填することを含みうる。ある態様では、サンプルの異なる標的生体分子に結合するビーズは、カラムに装填する前に組み合わされて、マルチプレックス化サンプル処理と、任意選択的にはマイクロ流体デバイスのアレイにおける各サンプル中の異なる標的の下流での検出とを可能にしうる。
このように、対象の方法およびマイクロ流体デバイスは、ユニットセルのカラムにおける所定の核酸配列または他の標的の固相ビーズベースの捕捉；ユニットセルのサンプル処理部位における統合的な洗浄、溶出、および予備増幅；ならびに各サンプルに対する複数の反応部位間にわたる特定の標的の検出（例えば、ｑＰＣＲによる）によって、標的サンプルの濃縮を可能にしうる。
標的ヌクレオチド配列の捕捉および／または検出
アッセイミックスは、ＰＣＲミックス、プライマー、およびプローブのうち少なくとも一つを含みうる。予備増幅マスターミックスは、標的がウイルスＲＮＡなどのＲＮＡである場合などに、逆転写酵素およびポリメラーゼを含みうる。逆転写および予備増幅は、同じ工程で行われてもよい。
予備増幅マスターミックスは、複数の異なる標的ヌクレオチド配列に対するプライマー対を含みうる。各標的ヌクレオチド配列の存在は、混合工程の後にＰＣＲ（ｑＰＣＲなど）によって検出されてもよい。複数の異なる標的ヌクレオチド配列は、ウイルスＲＮＡ配列であってもよい。
本方法は、例えばＰＣＲ（例えば、エンドポイントＰＣＲまたはｑＰＣＲ）などによって、混合工程後に対象生体分子の存在を検出することをさらに含みうる。
あるいは、またはさらに、検出はシークエンシングによってもよい。例えば、本方法は、混合の工程の後に増幅すること、および異なるサンプル由来の増幅産物をシークエンシング前にプールすることをさらに含みうる。予備増幅されたサンプルは、ｑＰＣＲにより定量され、シークエンシング工程の前にプール用に正規化されうる。本方法は、例えば、ユニットセルの同じまたは異なるカラムを使用するなど、予備増幅の前および後のビーズのクリーンアップ工程をさらに含みうる。本方法は、混合の工程の後、およびプーリングの前に、サンプルインデックス付与をさらに含みうる。図１５は、ＲＮＡシークエンシング調製（Ａ）およびＤＮＡシークエンシング調製（Ｂ）のための例示的な装填スキームを示す概略図である。
ビーズは、標的ウイルス粒子（例えば、ウイルス抗原）、ウイルスＲＮＡ、哺乳類ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、タンパク質（例えば、抗体）、または任意の他の標的とする対象生体分子に特異的に結合しうる。例えば、本明細書では、ビーズは、例えば、前立腺特異的抗原または他のがんバイオマーカーなど、ウイルス抗原または哺乳類タンパク質に結合する抗体（例えば、ビーズの表面上に提示される）などの親和性試薬を含まむ。他の適切な親和性試薬としては、アビジンまたはビオチン、アプタマー、ＭＨＣまたはペプチド－ＭＨＣなどの四量体、ＴＣＲなどの受容体などが挙げられる。ある態様では、ビーズは、本明細書にさらに記載される標的ヌクレオチド配列を特異的に結合するｓｓＤＮＡなどの核酸を含みうる。
図１６Ａは、チップ上のオリゴヌクレオチド検出（ウイルスＲＮＡの検出など）のための例示的な装填スキームを示す概略図を示す。なお、アレイは、一つまたは複数の標的ウイルスＲＮＡ配列が、本明細書に記載されるｑＰＣＲによって検出できるように、サンプル処理ユニットセルの下流であってもよい。
ある態様では、対象生体分子は、一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を含む。例えば、ビーズは、一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を特異的にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ配列により官能基化される。一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列は、ウイルスポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ配列、またはウイルスＲＮＡ配列であってもよい。例えば、ウイルスＲＮＡ配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡ配列であってもよく、例えば、一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列は、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のうち少なくとも二つを含み、本方法は、別々の反応部位においてＮ１、Ｎ２、およびＮ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のうち少なくとも二つを検出することを含みうる。あるいは、またはさらに、ウイルスＲＮＡ配列は、インフルエンザＲＮＡ配列であってもよく、例えば、一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列は、別々の反応部位に、少なくともＨ３Ｎ２インフルエンザＲＮＡ配列とＨ１Ｎ１インフルエンザＲＮＡ配列とを含み、本方法は、別々の反応部位に、少なくともＨ３Ｎ２インフルエンザＲＮＡ配列とＨ１Ｎ１インフルエンザＲＮＡ配列とを検出することを含みうる。本明細書で別記されるように、反応部位は、サンプルチャンバおよびアッセイチャンバを含む。
ある態様では、ユニットセルは、異なる対象生体分子（例えば、異なる標的タンパク質またはヌクレオチド配列）を捕捉するビーズをそれぞれ装填された複数のカラムを含みうる。
サンプルタンパク質の捕捉および／または検出
がんマーカーまたは病原体に対する抗体などのサンプルタンパク質が、本明細書に記載されるように捕捉、処理、および／または検出されうる。
図１６Ｂは、タンパク質（がんマーカー、ウイルス抗原、またはウイルス抗原に対する抗体など）の検出のためのサンプル調製に用いる例示的な装填スキームを示す概略図を提供する。なお、一つまたは複数の標的タンパク質が（例えば、本明細書に記載の免疫ｑＰＣＲによって）検出されうるように、アレイはサンプル処理ユニットセルの下流であってもよく、その場合、採集溶液が必要でないことがある。シークエンシングが検出方法ではない場合、タグ化緩衝液が必要でないことがある。
ビーズがウイルス粒子に結合する抗体を含む特定の態様では、本方法は、本明細書にさらに記載されるウイルスＲＮＡを検出することをさらに含んでいてもよいし、本方法は、ウイルス粒子の検出をさらに含んでいてもよい（例えば、本明細書にさらに記載される免疫ＰＣＲによって）。例えば、オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体は、ウイルス粒子に結合されてもよく、オリゴヌクレオチドはＰＣＲによって増幅されうる（例えば、ｑＰＣＲによって検出されうる）。
希少種のマイクロ流体検出は、類似のチューブベースまたはマイクロウェルプレートベースのアッセイと比較して、競合的アッセイ感度を提供するために、多くの場合、高価で汚染し易いサンプル調製を要することがある。これらのサンプル調製工程の代替として、マイクロ流体デバイス内に統合された固相サンプル濃縮は、いくつかのワークフロー（例えば、ｍＲＮＡおよび細菌ゲノムのシークエンシング）に十分であることが実証されている。同様の方法を使用し、固相捕捉を用いて、ウイルス粒子の存在を濃縮することができる。本明細書に記載されるように、ウイルス粒子は、生体分子にコンジュゲートされたビーズ（固相）を用いて捕捉することができ、この生体分子は、対象ウイルス粒子の対応する生体分子を特異的に標的とする。例えば、抗原－抗体相互作用または受容体－リガンド相互作用。次いで、ビーズを用いて、ウイルス集団の含量を非常に小さな体積に濃縮することができ、この体積は、サンプルから答えまで（ｓａｍｐｌｅ－ｔｏ－ａｎｓｗｅｒ）を（例えば、３時間未満で）完結させる単一のデバイス内ですべて行うｑＰＣＲによる、ナノからマイクロリットルスケールの自動検出に用いることができる。
ビーズがウイルス抗原（例えば、ウイルス全体、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１および／もしくはＳ２などその一部分）を含む特定の態様では、ウイルス抗原に結合するサンプル抗体の存在が検出されうる。例えば、血清、血漿、全血、唾液、または鼻腔スワブからの抗体が、カラム内のこのようなビーズの上に通されうる。次いで、オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体は、サンプル抗体に結合され得、次いで、オリゴヌクレオチドが検出されうる（例えば、免疫ＰＣＲワークフローなどにおけるｑＰＣＲによって、またはシークエンシングによって）。ある態様では、本方法は、ＩｇＧおよびＩｇＭなどの異なる抗体タイプを検出すること（例えば、抗体タイプに特異的に結合する二次抗体の免疫ＰＣＲによって）を含みうる。ある態様では、ユニットセルの別々のカラムはそれぞれ、異なるウイルス抗原を提示するビーズを含み、例えば、各異なるウイルス抗原は、異なる株由来である（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１および／またはＳ２タンパク質ドメインの異なる変異）。本方法は、血清ベースのクリーンアップなどのクリーンアップに第一のカラムを使用して、精製血清サンプル（本明細書にさらに記載されるような）を産生することをさらに含みうる。本方法は、異なるウイルス抗原を提示するビーズをそれぞれが含む別々のカラム間で、精製されたサンプルを分割することをさらに含みうる。このように異なる抗体タイプおよび／または異なるウイルス抗原に対する抗体が、ユニットセルにおいて検出されてもよいし（例えば、異なる色プローブを用いて）、ユニットセルの下流の異なる反応部位において検出されてもよい。検出は、特定の二次抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーを使用した、ｑＰＣＲなどのＰＣＲによってもよい。
ビーズは、サンプルと共有される入口からユニットセルのカラム内に装填されてもよい（例えば、ビーズは、サンプルの前に装填できるか、またはビーズ上に既に捕捉されたサンプル生体分子などとの混合で装填されうる）。対象サンプル生体分子は、タンパク質を含みうる。対象生体分子は、カラム内に装填されたビーズ上にサンプルを流すことによって捕捉されてもよいし、対象生体分子は、ビーズをカラム内に装填する前にビーズをサンプルと混合することによって捕捉されてもよい。サンプルタンパク質は、ビーズに結合された抗体によってビーズ上に捕捉されてもよい。本方法は、ビーズ上に捕捉されたサンプルタンパク質に抗体を結合させることをさらに含み、その際に、抗体はオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている。ある態様では、サンプルは、血液（例えば、血清、血漿、または全血）、唾液、または鼻腔スワブでありうる。サンプルが血清である場合、本方法は、ユニットセルの第一のカラムでの血清クリーンアップ工程をさらに含みうる。サンプルタンパク質が抗体である場合、ビーズは、ウイルス抗原などの抗原を提示しうる。例えば、ウイルス抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１および／またはＳ２タンパク質ドメインもしくはそのペプチドなどのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原でありうる。別の例では、ウイルス抗原はインフルエンザ抗原である。ある態様では、ユニットセルは、異なるウイルス抗原を提示するビーズをそれぞれが装填された複数のカラムを含む。例えば、異なるウイルス抗原は、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１および／またはＳ２ドメインの変異体もしくはそのペプチドなど、同じウイルスのバリアントを含む。本方法は、抗体を免疫ＰＣＲによって検出することをさらに含みうる。本方法は、ウイルス抗原に特異的な少なくともＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体を別々に検出することを含みうる。
本方法は、免疫ＰＣＲまたは近接アッセイなどによって、マイクロ流体デバイスの複数の反応部位におけるタンパク質の存在を検出することを含みうる。例えば、本方法は、オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体のオリゴヌクレオチドにｓｓＤＮＡ相補体をハイブリダイズさせることを含み得、オリゴヌクレオチドの切断（分解）をさらに含みうる。例えば、抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドは、ウラシルを含み、分解は、ウラシルＤＮＡ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）による。
ある態様では、複数の異なるタンパク質が、複数の異なるサンプルのそれぞれについて検出される。検出の工程は、ユニットセル、またはユニットセルの下流の反応部位のアレイにおける、ｑＰＣＲなどのＰＣＲを含みうる。ある態様では、サンプルタンパク質は、前立腺特異的抗原（例えば、ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ ｐ２ＰＳＡ、および／またはＰＳＡの他のアイソフォーム）などのがんバイオマーカーであり、ビーズは、がんバイオマーカーに対する抗体を含む。他の態様では、サンプルタンパク質は、抗体（例えば、ウイルス抗原に対する）であり、ビーズは、抗体によって特異的に結合された抗原を含む。
本方法はさらに、マイクロ流体デバイスから離れて精製血清サンプルを産生するために、血清クリーンアップなどのビーズベースのクリーンアップを行うことを含みうる。このように、ユニットセルは少なくとも二つのカラムを含み、この場合、さらに別のサンプル処理を行う前に、少なくとも二つのカラムのうちの一つがクリーンアップに使用される。ある態様では、血清ベースのクリーンアップは、ビーズへの結合により、ＩｇＧおよびアルブミンのうち少なくとも一つを枯渇させる。例えば、ＰｕｒｅＰｒｏｔｅｏｍｅビーズなど、ＩｇＧを捕捉するためのヒト血清アルブミンおよび／またはプロテインＧに特異的な抗体を有するビーズが使用されうる。
ある態様では、ユニットセルの別々のカラムを用いて、同じサンプルから別々の対象生体分子を濃縮する。例えば、第一のカラムは、クリーンアップ（例えば、精製血清サンプルを産生するための血清ベースのクリーンアップ）に使用されてもよく、方法は、異なる対象生体分子をそれぞれが濃縮する別々のカラム間で精製サンプルを分割することをさらに含んでいてもよく、対象生体分子は、次いで、ＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ）を介して、カラムの下流のサンプル処理部位または反応部位で検出されてもよい。あるいは、処理されたサンプルが採集され、反応部位のアレイを含む別々のマイクロ流体デバイス上でランされてもよい。ワークフローは、免疫ＰＣＲ、近接アッセイ、または逆転写ＲＮＡ標的について実施されてもよい。
対象出願の血清学的方法は、ウイルスなどの病原体に対する抗体を検出することを含みうる。一例では、抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２－２スパイクタンパク質のＳ１ドメインまたはＳ２ドメインなど、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対するものであってもよい。そのため、対象の方法のためのサンプルは、以下によって調製されうる：
・ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、ＰＢＳ）を用いて、サンプル当たり１００～２００ＫのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原ビーズをブロッキングする。
・攪拌しながら、室温で１時間インキュベートする（１５００ｒｐｍ）。
・洗浄溶液（１×ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０）により洗浄する。
・チューブ／プレート磁気分離器を使用するか、または遠心分離によって、溶液からビーズを分離する。
・各ビーズペレットを２～４×１０６ビーズ／ｍＬの濃度に達するように希釈する。
・ビーズを各チューブまたは各ウェルに分注する。
・標的抗体（スパイクインサンプル用）または試験サンプルと共にインキュベートする。
・標的抗体の希釈（Ｂｅｔｈｙｌ由来の抗ＲＢＤまたはＳｉｎｏ由来の抗Ｓｐｉｋｅ Ｓ１）または試験サンプルを加える。
・室温で２時間、１５００ｒｐｍでインキュベートする。
・洗浄溶液で洗浄し、チューブ／プレート磁気分離器を用いて、または遠心分離によって、溶液からビーズを分離する。
・次いで、ビーズを、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスに装填し、サンプル処理してもよい。
本明細書に別記されるように、図１７は、図３のものと類似した概略図であり、ビーズを保持するための複数のカラム１７１０と、特にサンプルの望ましくない成分を枯渇させるためのクリーンアップカラム１７１０ａと、異なる標的分子を捕捉するための複数の捕捉カラム１７１０ｂとを有する、例示的なユニットセルを示す。ビーズおよびサンプルは、第一の入口１７０４を通って、クリーンアップカラム１７１０ａに流れ込みうる。異なる捕捉ビーズが、一つまたは複数のビーズ入口１７０８を通して、異なる捕捉カラム１７１０ｂ内に装填されてもよい。
図１８は、図１７のクリーンアップカラム１７１０ａで実施されうる、例示的なクリーンアップ工程を示す。具体的には、図１８は、血清からのＩｇＧおよびアルブミンの枯渇を示す。
図１９は、図１７の捕捉カラム１７１０ｂおよび一連の処理部位１７１４のうちの一つで実施される、捕捉、サンプル調製、およびＰＣＲ増幅の一例を示す。具体的には、図１９は、標的タンパク質に抗体を提示するビーズによる標的サンプルタンパク質の捕捉、ビーズの洗浄、ビーズにより捕捉されたタンパク質へのオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体の結合および洗浄を示す。図１９はさらに、相補的オリゴヌクレオチドのアニーリング、オリゴヌクレオチドの溶出（抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの一つまたは複数のウラシルのＵＤＧによる開裂を介した）を示す。溶出されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲにより、本明細書に記載されるｑＰＣＲなどによる直接的な検出が可能になるか、または増幅された産物をシークエンシングすることができる（例えば、サンプルはマイクロ流体デバイスでインデックス付与され、プールされ、シークエンシングされる）。概して、免疫ＰＣＲまたは近接アッセイを用いて、標的サンプルタンパク質を検出してもよい。
対象出願のバイオマーカー検出方法は、例えば、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原、例えば、総ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、およびｐｒｏ－２－ＰＳＡ）などの特定のバイオマーカーの自動検出を含みうる。これらのバイオマーカーは、ＦＤＡにより承認された指標である前立腺ヘルスインデックス（ＰＨＩ）の式で使用されて、血清サンプルから前立腺がんのリスクを測定する／前立腺がんを潜在的に特定する。免疫ｑＰＣＲは、これらの標的バイオマーカーのそれぞれを特異的に検出する抗体を用いて、本明細書に記載のマイクロ流体ワークフローにおいてこれらの特定のバイオマーカーに対する定量的出力を提供するように適合されうるが、標的バイオマーカーは、抗体－ＤＮＡタグと結合されており、ＤＮＡタグは、切り離されて、ＰＣＲを用いて定量することができる。例えば、このようなワークフローは、図３または図１７に示すマイクロ流体デバイスを使用してもよく、任意選択的に、例えば図１２に示すようなアレイと統合されていてもよい。そのため、血清サンプル入力の後に、オンチップ血清クリーンアップ、標的捕捉、およびＰＣＲが続いてもよい。オンチップ血清クリーンアップは、自動化された方法でオンチップでサンプルクリーンアップが実行されるため、ＩＦＣを装填する前にサンプルを扱う必要性を低減しうる。清浄になった血清サンプルは、三つのＰＳＡバイオマーカーの存在を検出するために分割されうる。ＩＦＣ上のユニット当たり一つのサンプル入力は、自動化された方法で、特定の各ＰＳＡ ＰＨＩバイオマーカーに対して３つの異なるＰＳＡ出力を提供する。ＰＣＲ希釈出力のセットは、これら３つの異なるＰＳＡ出力のそれぞれに対して、個別におよび定量的に検出されて、ＰＨＩ計算に使用できる（例えば、計算は、マイクロ流体ワークフローを実行しＰＣＲ希釈出力を収集するソフトウェアによって、ユーザに提示されうる）。
本明細書にさらに記載されるように、抗体サンドイッチアッセイタイプ形式は、標的捕捉抗体（例えば、対象出願のビーズ上）および汎用の二次抗体（例えば、ＰＳＡに結合する）を含みうる。免疫ＰＣＲでは、抗体は一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡのどちらかにコンジュゲートされてもよく、ＤＮＡが抗体に付加したままである間に、または切断された後に、ＰＣＲを実施することができる。例えば 標的捕捉抗体は、ビオチン化され、ストレプトアビジンビーズに結合されてもよく、サンプルがビーズ上に流れ、ＰＳＡバイオマーカーがビーズに結合され、一本鎖オリゴヌクレオチド配列によりタグ付けされた二次抗体がＰＳＡバイオマーカーに結合され、上記一本鎖オリゴヌクレオチド配列に対する相補体が上記二次抗体上のタグに結合されて二本鎖ＤＮＡタグを産生し、上記二本鎖ＤＮＡタグが上記抗体から分離され、上記二本鎖ＤＮＡ上でＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ）が実施される。
このように、対象の方法は、検出および定量のための改変型免疫ｑＰＣＲ、ＰＨＩ標的タンパク質パネルのコンジュゲートビーズ－Ａｂ捕捉、統合されたワークフローのための単一のマイクロ流体デバイス、マルチプレックス化ビーズ捕捉セットアップ、各サンプル入力を有するミディアムスループットのうちの一つまたは複数を含んでいてよく、マイクロ流体デバイス上で自動マルチバイオマーカーパネル出力、および／またはビーズ捕捉の連続ステージを生じる。上記の例はＰＳＡバイオマーカーに関するものであるが、任意の適切なバイオマーカーがこの方法によって分析され得ることが理解されるものとなる。
ビーズベースの精製
１ラウンドまたは複数ラウンドのビーズクリーンアップ（サンプル生体分子のビーズベースの精製）は、本明細書に記載のいずれかの方法で実施されうる。ビーズベースの精製（または「クリーンアップ」）とは、概して、そのような共通タンパク質（例えば、ＩｇＧ、アルブミンなど）またはオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡ）などの生体分子のクラスの濃縮または除去を指す。態様は、少なくとも２ラウンドのビーズベースの精製（例えば、オリゴヌクレオチドの）を含む。例えば、対象の方法は、増幅反応前に１ラウンドのオリゴヌクレオチド（例えば、サンプルオリゴヌクレオチド）のビーズベースの精製と、増幅反応後に別ラウンドのビーズベースの精製（例えば、増幅産物の）とを実施することを含みうる。増幅反応は、本明細書に記載の任意の反応であってよく、例えば、シークエンシング調製のための予備増幅反応でありうる。
ビーズベース精製のラウンドは、ビーズ上でポリヌクレオチドを捕捉すること、捕捉緩衝液によりビーズを洗浄すること、アルコールによりビーズを洗浄すること、およびエラストマーデバイスの一つまたは複数のＰＤＭＳ層を通じてアルコールを蒸発させることを含みうる。ある態様では、アルコールはエタノールである。ある態様では、ビーズはＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその両方を抽出する。
図１３は、対象出願の例示的なエラストマー製マイクロ流体デバイスおよび例示的な装填スキームの画像であり、図２のものといくつかの点で類似しているが、廃棄出口１３０４、サンプルおよびビーズ入口１３０６、溶出緩衝液入口１３０８、エタノール入口１３１０、ＰＣＲミックス入口１３１２、採集出口１３１２、採集緩衝液入口１３１４、および捕捉緩衝液（洗浄緩衝液としても使用される）入口１３１６を示すマーキングが重ねられている。このような装填スキームは、複数ラウンドのビーズクリーンアップ（増幅反応の前および後など）などのビーズクリーンアップのために使用されうる。
図１４は、図３のものと類似した概略図であり、例えば図１３の装填スキームなどにあるような、入口から、出口、およびユニットセル内の流れの方向を示す。個別の工程は、本明細書にさらに記載される。
ビーズクリーンアップ方法は、以下の工程のうち一つまたは複数を含みうる：
１．サンプルを予め装填されているビーズを（例えば、カラムを通してサンプルを流し、結合していないサンプルを廃棄出口へ流すことによって）捕捉する。
２．ビーズを捕捉緩衝液により洗浄する。
３．ビーズをエタノールにより洗浄する。
４．ビーズを（例えば、加熱下で）乾燥する。
５．処理部位内に溶出する（例えば、入口から捕捉部位を通して第一のサンプル処理部位内に溶出緩衝液を流すことによって）。
６．任意選択的に、捕捉緩衝液を用いてサンプルおよびビーズをサンプル入口内に再懸濁し、工程１から５を、別のクリーンアップのラウンドで繰り返す。
７．増幅ミックスを第二のサンプル処理部位に添加し、第一のサンプル処理部位でサンプルと混合する。
８．サンプルを増幅する（例えば、ＰＣＲ増幅）。
９．捕捉緩衝液を用いて、サンプルおよびビーズをサンプル入口内に再懸濁する。
１０．増幅後のビーズのクリーンアップで、工程１から５を繰り返す。
１１．任意選択的に、捕捉緩衝液を用いてサンプルおよびビーズをサンプル入口内に再懸濁し、工程１から５を、別のクリーンアップのラウンドで繰り返す。
１２．カラムを通して（例えば、ユニットセル全体を通して）、および採集出口内に、採集緩衝液を流す。
採集された増幅サンプルは、ライブラリー調製およびシークエンシングに十分な純度でありうる。ある態様では、増幅工程は、採集されたサンプルをプールする前に、正規化のためのサンプルインデックス付与および／またはｑＰＣＲを含む。
細胞の捕捉、処理、検出
ある態様では、アレイＩＦＣは、複数のサンプル処理部位（例えば、チャンバおよび／またはループ）を含むユニットセルと統合されていてもよく、ここでは、ユニットセルは、細胞捕捉部位を（例えば、本明細書に記載の任意のこのような実施形態のカラムの代わりに）さらに含む。細胞捕捉部位は、一つまたは複数のバイパスチャネルを含みうる。例えば、ユニットセルは、アーキテクチャを含んでいてもよく、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０２９６１９６号に記載されるように使用されてもよい。一部の単一細胞の処理は、特異的な標的の増幅、全ゲノムの増幅、全トランスクリプトームの増幅、リアルタイムＰＣＲの調製、コピー数の変動、予備増幅、および／またはｍＲＮＡシークエンシングの調製が含まれうる。ある態様では、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５０１３２７４３号に記載されるように、単一の細胞が捕捉され（単離され）、溶解され、次いで細胞のタンパク質および／またはＲＮＡが検出されうる。対象出願の文脈では、次いで、細胞捕捉部位を含むユニットセルに捕捉された細胞が溶解されてもよく、任意選択的に、逆転写、タンパク質標的を検出するための近接アッセイ（例えば、近接伸長もしくはライゲーション）、および／または予備増幅（例えば、全ゲノム増幅、ｇＤＮＡの標的マルチプレックス化予備増幅、ｃＤＮＡまたは近接伸長産物など）などの一つまたは複数の追加の反応に供されてから、処理済みのサンプルは、同じマイクロ流体デバイスの反応部位のアレイ内に流され、その際に、異なるＲＮＡ標的、ＤＮＡ標的、および／またはタンパク質標的はそれぞれ、別々の反応部位で検出されてもよい。
細胞捕捉部位は、サイズに基づいて細胞を選択的に捕捉しうる。例えば、直径５ミクロン以下の細胞は、１０ミクロン超の細胞が捕捉される効率の５％未満（例えば、１％未満）で捕捉される。細胞捕捉部位は、その表面上の対応する抗原を発現する細胞への捕捉部位で固定化された抗体の結合（例えば、Ｔ細胞もしくはＢ細胞またはそのサブセットなどの免疫細胞型など、特定の細胞型について濃縮するように）など、親和性結合に基づいて、細胞を選択的に捕捉してもよい。個々のユニットセルは、例えば図１２に示すように、複数の反応部位を含むアレイアーキテクチャのサンプル入口チャネルと流体連通していてもよい。ある態様では、捕捉された細胞は、第一の工程で溶解されてもよい。細胞溶解は、ユニットセルおよび／または反応部位のアレイの状況で、本明細書に記載のいずれかの反応に続いてもよい。例えば、溶解後、細胞由来のＲＮＡが逆転写されて予備増幅されてもよいし、ゲノムＤＮＡが処理されて予備増幅されてもよい。予備増幅は、例えば、それぞれが異なる標的ヌクレオチド配列を増幅する少なくとも４つの異なるプライマー対とのマルチプレックス化反応を介してなどで、標的とされうる。処理された細胞溶解物（例えば、予備増幅された細胞溶解物）は、反応部位のアレイのサンプル入口内に流されてもよく、異なる標的ヌクレオチド配列は、異なるプライマー対および／または異なる標的特異的プローブを用いて、異なる反応部位で検出されてもよい。
例えば、単一細胞のワークフローは、複数の細胞からの個々の細胞が、マイクロ流体デバイスの異なるユニットセル中の個々の捕捉部位で捕捉されるように、複数の細胞をマイクロ流体デバイスを通して流すこと；マイクロ流体デバイスの個々の捕捉部位で、複数の捕捉された個々の細胞を溶解すること；複数の個々の溶解細胞上、マイクロ流体デバイス内で逆転写を行って、それぞれの個々の細胞と関連する逆転写産物を産生すること；任意選択的に、逆転写により産生されるｃＤＮＡのマルチプレックス化予備増幅を実施すること；マイクロ流体デバイスのアレイ内の複数の反応部位にわたってユニットセルの内容物を分割すること；マイクロ流体デバイス内でＰＣＲ、例えばｑＰＣＲを実施して、異なる反応部位で異なる標的（例えば、異なる逆転写産物）を検出することを含みうる。
あるいは、またはさらに、単一の細胞ワークフローは、複数の細胞からの個々の細胞が、マイクロ流体デバイスの異なるユニットセル中の個々の捕捉部位で捕捉されるように、複数の細胞をマイクロ流体デバイスを通して流すこと；マイクロ流体デバイスの個々の捕捉部位で、複数の捕捉された個々の細胞を溶解すること；近接伸長プローブが標的分析物に結合する条件下、存在すれば細胞溶解物中で結合する条件下で、細胞溶解物を、約１５℃から約５０℃のインキュベーション温度で、約５分から約６時間の時間の長さで、結合反応において二つ以上の近接伸長プローブと共にインキュベートすること；上記結合反応を、ポリメラーゼを含む伸長ミックスと共にインキュベートすることであって、近接伸長プローブのハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド成分が、ポリメラーゼによって伸長されて、伸長産物を産生する、インキュベートすること；マイクロ流体デバイスのアレイ内の複数の反応部位間にわたってユニットセルの内容物を分割すること；マイクロ流体デバイス内でＰＣＲ、例えばｑＰＣＲを実施して、異なる反応部位で異なる標的（例えば、異なる近接伸長産物）を検出すること含みうる。
集積型ワークフロー用キット
対象出願はまた、上記方法のいずれかを実施するためのキットを含む。例えば、キットは、実施形態のいずれか一つのマイクロ流体デバイスを含んでいてもよく、および／または上記方法のいずれか一つの方法を実施するための一つまたは複数の試薬を含んでいてもよい。そのような試薬は、ＲＮａｓｅ阻害剤、逆転写酵素、ポリメラーゼ、予備増幅ミックス（例えば、異なる標的ヌクレオチド配列を特異的に増幅する複数のプライマー対を含む）、本明細書に記載の対象サンプル生体分子を特異的に捕捉するビーズ、プライマー、プローブ、オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体、それらのコンジュゲートされる抗体からオリゴヌクレオチドを切断する酵素、または対象出願の方法を実施するための任意の他の適切な試薬のうち、一つまたは複数から選択されうる。
サンプルバーコード付与方法
サンプルバーコード付与（すなわち、サンプルのタグ付け、またはコード化）は、サンプルのスループットを増加させうるが、残りのプライマー（例えば、標的がほとんどまたは全くないサンプル由来の）は、クロストークを作り出し、偽陽性および／またはさらに高いバックグラウンドをもたらしうる。このようなクロストークを低減するための方法およびキットを本明細書で論じる。
図２０は、対象出願のマルチプレックスサンプルバーコード付与のワークフローを示す。具体的には、異なるサンプルからの標的ヌクレオチド配列は、逆転写され（ＲＮＡの場合）、サンプルタグ（すなわち、サンプルバーコード配列）を組み込む反応において予備増幅することができる。異なるサンプルからの予備増幅混合物をプールし、マイクロ流体デバイスの単一の入口上に装填し、次いで、異なるチャンバ（異なる反応部位）に分割することができ、このチャンバでは、異なるサンプルタグを有する標的ヌクレオチド配列が選択的に増幅される。このようなワークフローにより、所与のサンプル入口の数についてマイクロ流体デバイス上に装填できるサンプルの数が増加した。各サンプルタグ付き標的ヌクレオチド配列の特異的な検出によって、少なくとも一つが標的ヌクレオチド配列に対して陽性である場合には、すべてのサンプルを個別に再試する必要性が避けられる。各反応部位は、予備増幅されたサンプルの混合物、標的特異的プローブ（例えば、標的へ結合すると蛍光を発する）、特定のサンプルの反応産物を選択的に増幅するサンプルバーコードプライマー、およびリバースプライマー（例えば、標的特異的であるか、または複数の標的がサンプルに対して検出される場合など、予備増幅反応の間に組み込まれた標的バーコードに特異的である）を有する。
図２１は、サンプルがバーコード付与されず、混合後に別々の反応部位に分割されない、単純なＤｏｒｆｍａｎプーリング法を示す。標的ヌクレオチド配列に対してサンプルのプールが陽性である場合、個々のサンプルを再試験するには、追加の工程および試薬が必要である。
図２２は、４つのサンプルが混合された（Ａ）際の、または８つのサンプルが混合された（Ｂ）際の、マルチプレックスサンプルバーコード付与（ｍｐｅ）法およびＤｏｒｆｍａｎプーリング（ｐｅ）法の効率を示す。効率の増加により、サンプルの扱いの減少、試薬の減少、およびマイクロ流体デバイスで使用される空間の減少が可能になる。
図２３は、図２０のマルチプレックス化サンプルバーコード付与アプローチを使用した際に、クロストークが発生する機構を示す。具体的には、残りのタグ付き標的特異的プライマーは、サンプルが混合された後、別のサンプルからのタグ付き標的ヌクレオチド配列と反応し、バックグラウンドをもたらしうる。
図２４は、陰性サンプル（すなわち、標的ヌクレオチド配列を有しないサンプルＢ）由来の残りプライマーが、サンプルが一緒に混合された後に、陽性サンプル（サンプルＡ）由来の予備増幅された標的ヌクレオチド配列と反応し、バックグラウンド（例えば、サンプルＢ中の標的を検出するための反応部位のより低いサイクル閾値（ＣＴ）につながる）をもたらす、反応スキームを提供する。プローブは、残りのプライマーと競合しない。
図２５は、標的特異的プローブが、予備増幅された標的ヌクレオチド配列に結合するための残りのプライマー（すなわち、本明細書では、タグ付き標的特異的プライマーとも称される、バーコード付き標的特異的プライマー）と競合し、クロストークを低減する、反応スキームを提供する。
図２６は、四サンプルのセットの三連でのｑＰＣＲ曲線を示し、一番目のサンプル（黒線）が陽性であり、他のサンプルが標的ヌクレオチド配列に対して陰性である。
図２６は、図２４のスキーム下、四サンプルのセットの三連でのｑＰＣＲ曲線を示し、一番目のサンプル（黒線）が陽性であり、他のサンプルが標的ヌクレオチド配列に対して陰性である。
図２７は、図２５のスキーム下、四サンプルのセットの三連でのｑＰＣＲ曲線を示し、一番目のサンプル（黒線）が陽性であり、他のサンプルが標的ヌクレオチド配列に対して陰性であり、図２６と比較して陰性サンプルについて２のＣＴ増加があることを明示している。
ある態様では、複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのアッセイ方法は、
ａ）別々のサンプルＳ中のそれぞれの標的ヌクレオチド配列を逆転写および予備増幅して、各サンプルからタグ付き標的ヌクレオチド配列を産生することであって、
サンプルＳのうち少なくとも一つが、標的ヌクレオチド配列を含み、
タグ付き標的ヌクレオチド配列が、サンプルタグおよび標的ヌクレオチド配列を含み、
予備増幅が、サンプルタグおよび標的特異的配列を含む、タグ付き標的特異的プライマーを用いて行われ、
標的特異的配列が、標的ヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする、逆転写および予備増幅すること；
ｂ）サンプルＳのそれぞれのタグ付き標的ヌクレオチド配列を混合して、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物を産生すること；
ｃ）混合物を複数の反応部位に分割すること；
ｄ）各反応部位に異なるプライマー対を添加すること；
ｅ）各反応部位の異なるサンプルからタグ付き標的ヌクレオチド配列を増幅することであって、異なる各プライマー対が、異なるサンプルタグにハイブリダイズするプライマーを含む、増幅すること；および／または
ｆ）増幅されたタグ付き標的核酸の存在を、標的特異的配列の少なくとも一部を含むがサンプルタグを含まない蛍光標的特異的プローブを用いて、ｑＰＣＲにより検出すること；を含み、
増幅の工程ｅは、標的特異的プローブの存在下である。
より大まかには、複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのアッセイ方法は、
ａ）少なくとも一つのタグ付き標的特異的プライマーを用いて、タグ付き標的ヌクレオチド配列を産生するコード反応に、各サンプルＳを別々に供することであって、サンプルＳの少なくとも一つは、標的ヌクレオチド配列を含み（すなわち、標的ヌクレオチド配列の鎖にハイブリダイズする）、タグ付き標的ヌクレオチド配列は、サンプルタグおよび標的ヌクレオチド配列を含む、供すること；
ｂ）サンプルＳのそれぞれのタグ付き標的ヌクレオチド配列を混合して、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物を産生すること；
ｃ）混合物を複数の反応部位に分割すること；
ｄ）異なるプライマー対を異なる反応部位に添加することであって、異なる各プライマー対が、異なるサンプルタグにハイブリダイズしてタグ付き標的ヌクレオチド配列を特定のサンプルから増幅するプライマーを含む、添加すること；
ｅ）標的特異的プローブの存在下でサンプルＳのうち少なくとも一つからタグ付き標的ヌクレオチド配列を増幅することであって、標的特異的プローブが、標的特異的プライマーの標的特異的配列の少なくとも一部と同一の配列を含むがサンプルタグを含まない、増幅することと；および／または
ｆ）タグ付き標的ヌクレオチドの存在を検出することを含みうる。
標的特異的プローブは、標的特異的プライマーの標的特異的配列の少なくとも６ヌクレオチド（例えば、少なくとも１２ヌクレオチド長、または少なくとも１８ヌクレオチド長、例えば６～３０ヌクレオチド長など）と同一の配列を含みうる。あるいは、またはさらに、タグ付き標的ヌクレオチド配列は、少なくとも４ヌクレオチド長（例えば、少なくとも６ヌクレオチド長、少なくとも１２ヌクレオチド長、または少なくとも１８ヌクレオチド長、例えば６～３０ヌクレオチド長など）であるサンプルタグを含みうる。あるいは、またはさらに、標的特異的配列は、少なくとも６ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１２ヌクレオチド長、または少なくとも１８ヌクレオチド長、例えば６～３０ヌクレオチド長など）である。あるいは、またはさらに、標的ヌクレオチド配列は、少なくとも５０ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１００ヌクレオチド長、少なくとも１５０ヌクレオチド長、例えば、５０～３００ヌクレオチド長でもしくはその間など）であってもよい。
ある態様では、工程ａ）は、サンプルタグを含むが標的ヌクレオチド配列を含まないタグ付きプライマーによる反応を含み、その際に例えば、このタグ付きプライマーは、タグ付き標的特異的プライマーよりも高い濃度である。
タグを含まずかつ標的ヌクレオチド配列の一部分に対する逆相補体である標的特異的プライマーを使用してもよい（例えば、タグ付き標的ヌクレオチド配列を逆転写および／または増幅するため）。工程ａ）は、標的特異的プライマーを用いて標的ヌクレオチド配列を逆転写することをさらに含みうる。
ある態様では、タグ付き標的特異的プライマーは、ウラシルを含み、例えば、本方法は、ウラシルＮ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）を、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物に添加して、残りのタグ付き標的特異的プライマーを分解することをさらに含む。
ある態様では、サンプルＳの少なくとも一つは、標的ヌクレオチド配列を含み、サンプルＳの少なくとも一つは、標的ヌクレオチド配列を含まない。
方法は、工程ａ）の前に、標的特異的プライマーを用いて、タグ付き標的ヌクレオチド配列を逆転写することをさらに含みうる。あるいは、工程ａ）は、タグ付き標的ヌクレオチド配列を（例えば、同じ反応で）予備増幅することを含みうる。
ある態様では、工程ｅ）は、少なくとも二連で行われてもよい。ある態様では、サンプルＳの少なくとも一つは、標的ヌクレオチド配列を含まない。検出の工程ｆ）は、例えば、エンドポイントＰＣＲまたはｑＰＣＲなどのＰＣＲによる場合がある。検出がｑＰＣＲによる場合、標的ヌクレオチド配列を含まないサンプルに対しプライマー対が特異的である反応部位では、標的特異的プローブ（例えば、タグ付き標的特異的プライマーを用いたその完成体）は、ＣＴを少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、または少なくとも６増加させうる。例えば、標的ヌクレオチド配列を含まないサンプルに対しプライマー対が特異的である反応部位と、標的ヌクレオチド配列を含まないサンプルに対しプライマー対が特異的である異なる反応部位との間で、標的特異的プローブの存在により、ｄＣＴが少なくとも１、２、４、または６のｄＣＴで増加し、例えば、２０％のｄＣＴの増加または４０％のｄＣＴの増加などがある。ある態様では、標的特異的プローブは、残りのタグ付き標的特異的プライマーのタグ付き標的ヌクレオチド配列への結合を少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％減少させうる。ある態様では、プローブは、混合物中の残りのタグ付き標的特異的プローブを少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍上回りうる。
ある態様では、検出の工程ｆ）は、標的特異的プローブからのシグナルを検出することを含む。例えば、プローブは、フルオロフォアおよび任意選択的にさらにクエンチャーを含んでいてもよく、例えば、プローブが標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズされない際にフルオロフォアがクエンチされ、ハイブリダイズするとプローブが蛍光を発するようにしてもよい。
方法工程のいずれも、対象出願のマイクロ流体デバイス上で行われてもよい。ある態様では、最小工程ｅ）およびｆ）は、反応部位のアレイを含むアレイマイクロ流体デバイス上で実施される。例えば、少なくとも工程ｃ）からｆ）は、反応部位のアレイを含むアレイマイクロ流体デバイス上で実施される。別の例では、工程工程ａ）からｆ）のすべては、サンプル処理ユニットセルおよび反応部位のアレイを含む集積化マイクロ流体デバイス上で実施される。そのような集積化マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意の実施形態であってもよい。例えば、デバイスの反応部位のアレイの個々の反応部位は、サンプル入口と試薬入口との固有の組合せを含みうる。ある態様では、工程ｃ）は、工程ｂ）の混合物をアレイマイクロ流体デバイスのサンプル入口内に流すことを含む。ある態様では、マイクロ流体デバイスへの入口の数は、デバイスまたはキャリアの基体、小さなチャネルを通して流体を駆動するために必要な圧力、および／またはマイクロ流体デバイスにおける入口チャネルとのデバイスのキャリア内のウェルの配置など、物理的な制約に基づいて制限されうる。そのため、高密度アレイ（例えば、１平方センチメートルにわたって２００個超の反応部位を含む）は、異なるサンプルを各反応部位に方向付けるのに十分な入口を有しない場合がある。そのため、対象出願のサンプルバーコード付与により、サンプルバーコード付与されたサンプルをプールし、同じチャネルを通してそれを流し、異なる反応部位に異なるサンプルバーコードを有する標的の存在を検出することが可能になりうる。
ある態様では、標的特異的プローブは、標識を含まない（例えば、蛍光シグナルを提供しない競合プローブである）。そのような態様では、検出の工程ｆ）は、標的特異的ヌクレオチド配列との結合についてタグ付き標的特異的プライマーと競合しない、標識化標的特異的プローブによる。例えば、検出の工程ｆ）は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどのインターカレート色素による。
ある態様では、サンプルＳの数は、少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも８個、または少なくとも１６個、例えば、４個から８個の間の数である。
サンプルバーコード付与の方法には、工程ｄの複数の反応部位に分かれる単一のチャネルを通して、工程ｃ由来のタグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物を流すことがさらに含まれうる。例えば、単一チャネルは、複数の反応部位へのサンプル入口であってもよく、例えば、本明細書に記載のサンプルチャンバおよびアッセイチャンバを含む各反応部位であってもよい。複数の反応部位は、アレイマイクロ流体デバイスの別々の場所であり、本方法は、タグ付き標的核酸を検出する工程ｅの前に、反応部位を互いに流体的に単離することをさらに含んでもよい。
ある態様では、同じサンプル中の異なる標的ヌクレオチド配列Ｔは、同じサンプルタグによりタグ付けされるが、別々の反応部位で検出される。タグ付き標的ヌクレオチド配列は、サンプルタグと標的特異的タグとの固有の組み合わせを含みうる。例えば、工程ａ）は、標的特異的タグを含むがサンプルタグを含まない標的特異的リバースプライマーをさらに含みうる。反応部位は、１プライマーをサンプルタグに、１プライマーを標的特異的タグに用いて、特定のサンプルから特定の標的を増幅してもよい。反応部位は、１プライマー（例えば、リバースプライマー）をサンプルタグに、１プライマーを標的ヌクレオチド配列に用いて、特定のサンプルから特定の標的を増幅してもよい。任意選択的にさらに、各標的は、標的特異的プローブにより検出される。工程ｅ）は、例えば、Ｓ×Ｔの各組合せが別々の反応部位で増幅されるように、サンプルタグおよび標的特異的タグの特定の組合せに特異的なプライマー対を用いて、各反応部位を装填することを含みうる。ある態様では、Ｔは少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも６でありうる。ある態様では、標的ヌクレオチド配列は、ウイルスＲＮＡ配列（例えば、インフルエンザまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡ配列）などのウイルスヌクレオチド配列である。例えば、異なる標的ヌクレオチド配列Ｔは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＲＮＡ配列およびＨ１Ｎ１インフルエンザＲＮＡ配列を含む。あるいは、またはさらに、異なる標的ヌクレオチド配列Ｔは、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のうちの少なくとも二つを含む。
本明細書に記載されるように、サンプルは、血液サンプル（例えば、血清、血漿、もしくは全血）、唾液、鼻腔スワブなど、または固形組織に由来する、任意の生体サンプルでありうる。
シークエンシングおよび／またはＰＣＲ検出のためのサンプルバーコード付与
クロストークはまた、混合およびシークエンシング前のサンプルインデックス付与（バーコード付与）の際に、特に、インデックス付きサンプルの混合後に増幅工程がある際に発生しうる。複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのアッセイ方法は、
ａ）少なくとも一つのタグ付き標的特異的プライマーを用いて、タグ付き標的ヌクレオチド配列を産生するコード反応に、各サンプルＳを別々に供することであって、サンプルＳのうち少なくとも一つは、標的ヌクレオチド配列を含み、タグ付き標的ヌクレオチド配列は、サンプルタグおよび標的ヌクレオチド配列を含むこと；
ｂ）サンプルＳのそれぞれのタグ付き標的ヌクレオチド配列を混合して、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物を産生すること；
ｃ）標的特異的プローブの存在下でサンプルＳのうち少なくとも一つからタグ付き標的ヌクレオチド配列を増幅することであって、標的特異的プローブが、標的特異的プライマーの標的特異的配列の少なくとも一部と同一の配列を含むがサンプルタグを含まない、増幅することと；および／または
ｄ）タグ付き標的ヌクレオチドの存在を検出することを含みうる。
ある態様では、検出の工程ｄ）は、増幅されたタグ付き標的ヌクレオチド配列をシークエンシングすることによる。コードの工程ａ）は、シークエンシングアダプター配列をタグ付き標的ヌクレオチド配列に組み込むことを含みうる。工程ａ）は、サンプル処理ユニットセルを含むマイクロ流体デバイス上で実施されてもよく、タグ付き標的ヌクレオチド配列は、混合の工程ｂ）の前にマイクロ流体デバイスから収集されてもよい。あるいは、または追加的に、検出の工程ｄ）は、ＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ）を含む。
サンプルバーコード付与のためのキット
対象出願はまた、上記方法のいずれかを実施するためのキットを含む。例えば、キットは、実施形態のいずれか一つのマイクロ流体デバイスを含んでいてもよく、および／または上記方法のいずれか一つの方法を実施するための一つまたは複数の試薬を含んでいてもよい。そのような試薬は、ＲＮａｓｅ阻害剤、逆転写酵素、ポリメラーゼ、予備増幅ミックス（例えば、異なる標的ヌクレオチド配列を特異的に増幅する複数のプライマー対を含む）、本明細書に記載の対象サンプル生体分子を特異的に捕捉するビーズ、プライマー、プローブ、オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体、それらのコンジュゲートされる抗体からオリゴヌクレオチドを切断する酵素、または対象出願の方法を実施するための任意の他の適切な試薬のうち、一つまたは複数から選択されうる。
複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのキットは：
サンプルＳのそれぞれに対するタグ付き標的特異的プライマーであって、各タグ付き標的特異的プライマーが、サンプルタグおよび標的特異的配列を含む、タグ付き標的特異的プライマーと、
標的特異的配列の少なくとも一部を含む標的特異的プローブとを含み、
タグ付き標的特異的プライマーおよびプローブのそれぞれは、別々の区画内にある。
キットはさらに、鎖置換ポリメラーゼ（例えば、増幅反応中にプローブを置換する）、逆転写酵素、およびＲＮａｓｅ阻害剤、または任意の緩衝液、マスターミックス、もしくは対象の方法のための他の構成要素のうち、一つまたは複数を含みうる。
ある態様では、タグ付き標的特異的プライマーは、サンプルタグを含まない標的特異的リバースプライマーと混合される。リバースプライマーは、標的特異的タグを含みうる。リバースプライマーは、タグ付き標的特異的プライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列鎖の逆相補体をハイブリダイズするものとなる。ある用途では、リバースプライマーは、ｍＲＮＡ標的特異的配列にハイブリダイズして、逆転写を可能にする。
キットはさらに、異なるサンプルタグにそれぞれハイブリダイズする異なるプライマーＳのセットを含んでいてもよく、異なるプライマーＳのそれぞれは、別々の区画内にある。異なるプライマーＳの少なくとも一部は、標的特異的リバースプライマーとの混合であってもよい。キットはさらに、標的特異的リバースプライマーを含み、その場合に例えば、標的特異的リバースプライマーは、サンプルタグを含まない。
キットのプローブおよび／またはプライマーは、本明細書の方法について記載された態様のいずれかであってもよい。キットは、対象出願の任意の態様のマイクロ流体デバイスをさらに含みうる。マイクロ流体デバイスは、およびエラストマー製デバイスである。マイクロ流体デバイスは、複数の反応部位を含むアレイデバイスであってもよく、例えば、個々の反応部位が、サンプル入口と試薬入口との固有の組合せを含む。ある態様では、例えば、ビーズに結合された複数のサンプルが混合され、マイクロ流体デバイス上で（例えば、本明細書に記載のスプリントライゲーションワークフローによって）コードされた産物のコード反応および／または増幅が行われる場合に、マイクロ流体デバイスは、サンプル処理ユニットセルをさらに含む。
３プライマーサンプルバーコード付与
サンプルバーコード付与におけるクロストークを低減するための別のアプローチは、本明細書に記載される三つのプライマーのアプローチである。
図２８は、クロストークを低減するための別のアプローチを示し、ここでは、ＵＤＧは、残りのプライマーを分解するために用いられ（上）、プローブ（ＧＳＰ）は、残りのプライマーと競合しない。あるいは、またはさらに、タグ付き標的特異的プライマーの濃度は、標的特異的ではないタグプライマーの濃度を下回るものとすることができ、その結果、タグ付きプライマーが取る。タグ付きプライマーは、標的特異的ではないため、混合後にクロストークを作り出すことを予想されないものとなる。
ある態様では、複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのアッセイ方法は、
ａ）少なくとも一つのタグ付き標的特異的プライマーを用いて、タグ付き標的ヌクレオチド配列を産生するコード反応に、各サンプルＳを別々に供することであって、サンプルＳのうち少なくとも一つは、標的ヌクレオチド配列を含む、供すること；
ｂ）サンプルＳのそれぞれのタグ付き標的ヌクレオチド配列を混合して、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物を産生すること；
ｃ）混合物を複数の反応部位に分割すること；
ｄ）異なるプライマー対を異なる反応部位に添加することであって、異なる各プライマー対が、異なるサンプルタグにハイブリダイズするプライマーを含む、添加すること；
ｅ）各反応部位中の異なるサンプルからタグ付き標的ヌクレオチド配列を増幅すること；および／または
ｆ）タグ付き標的ヌクレオチドの存在を検出すること；を含みえて、
工程ａ）は、サンプル特異的タグを含むが標的ヌクレオチド配列を含まないタグ付きプライマーとの反応を含む。
タグ付けされたプライマーは、タグ付き標的特異的プライマーよりも高い（例えば、少なくとも５倍高い、少なくとも１０倍高い、または少なくとも２０倍高い）濃度でありうる。本方法は、タグを含まずかつ標的ヌクレオチド配列の一部分に対する逆相補鎖である、標的特異的プライマーを含みうる。工程ａ）は、標的特異的プライマーを使用して標的ヌクレオチド配列を逆転写することをさらに含みうる。タグ付き標的特異的プライマーは、ウラシルを含んでいてもよく、例えば、本方法は、タグ付き標的特異的プライマーを切断（すなわち、分解）するために、ウラシルＤＮＡ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）を、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物に添加することをさらに含む。
したがって、複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのキットは、
サンプルＳのそれぞれに対するタグ付き標的特異的プライマーであって、各タグ付き標的特異的プライマーが、サンプル特異的タグおよび標的特異的配列を含む、タグ付き標的特異的プライマーと、
サンプル特異的タグを含むが標的ヌクレオチド配列を含まない、タグ付きプライマーと、を含みうる。

Claims (240)

  1. 集積化マイクロ流体デバイスであって、
    反応部位のアレイと、
    複数のサンプル処理部位を含む複数のサンプル処理ユニットセルであって、ユニットセルが、複数の異なる試薬入口と流体連通している、複数のサンプル処理ユニットセルとを備え、
    前記アレイへのサンプル入口が、前記複数のユニットセルの前記複数のサンプル処理部位の下流にある、デバイス。
  2. 前記複数の試薬入口が、各ユニットセルに共通のチャネルを共有する、請求項１に記載のデバイス。
  3. 前記ユニットセルの処理部位を装填するために使用される試薬入口を制御するように構成されたマルチプレクサをさらに備える、請求項１または２に記載のデバイス。
  4. 前記複数のサンプル処理部位が、複数のループを備える、請求項１～３のいずれか一項に記載のデバイス。
  5. 前記複数のサンプル処理部位が、複数のチャンバを備える、請求項１～４のいずれか一項に記載のデバイス。
  6. 各ユニットセルが、サンプル入口チャネルをさらに備える、請求項１～５のいずれか一項に記載のデバイス。
  7. 各ユニットセルが、廃棄出口チャネルをさらに備える、請求項１～６のいずれか一項に記載のデバイス。
  8. 各ユニットセルが、前記ユニットセルを制御するように構成された複数の弁を備える、請求項１～７のいずれか一項に記載のデバイス。
  9. 前記複数の弁が、サンプルおよび試薬を前記ユニットセル内の異なる位置に送達するように構成される、請求項８に記載のデバイス。
  10. 前記複数の弁が、サンプル処理場所を単独で設置し、または互いに連通して設置するように構成される、請求項８または９に記載のデバイス。
  11. 前記複数の弁が、異なる位置での混合を駆動するように構成される、請求項８～１０のいずれか一項に記載のデバイス。
  12. 前記複数の弁が、前記ユニットセルからサンプルまたは試薬溶液の流れを方向付けるように構成される、請求項８～１１のいずれか一項に記載のデバイス。
  13. 前記ユニットセルが、蠕動ポンプを備える、請求項１～１２のいずれか一項に記載のデバイス。
  14. 個々のユニットセルが、ビーズを保持するように構成された少なくとも一つのカラムをさらに備える、請求項１～１３のいずれか一項に記載のデバイス。
  15. 前記カラムが、複数の開口部を提供するふるい構造を備え、前記複数の開口部を通って、流体が流れるが、前記穴よりも大きなビーズが保持されうる、請求項１４に記載のデバイス。
  16. 個々のユニットセルが、少なくとも二つのカラムを備える、請求項１４または１５に記載のデバイス。
  17. 前記反応部位のアレイの個々の反応部位が、アッセイチャンバおよびサンプルチャンバを備える、請求項１～１６のいずれか一項に記載のデバイス。
  18. サンプル入口が、前記サンプルチャンバにサンプルを提供し、アッセイ入口が、前記アッセイチャンバにアッセイ試薬を提供する、請求項１７に記載のデバイス。
  19. サンプル入口フローチャネルおよびアッセイ入口フローチャネルが互いに通過するように、前記マイクロ流体デバイスが多層を備える、請求項１８に記載のデバイス。
  20. 前記マイクロ流体デバイスが、エラストマー製マイクロ流体デバイスである、請求項１～１９のいずれか一項に記載のデバイス。
  21. 前記マイクロ流体デバイスがＰＤＭＳを含む、請求項２０に記載のデバイス。
  22. 前記エラストマー製デバイスが複数の弁を備える、請求項２０または２１に記載のデバイス。
  23. 個々の弁が、流れチャネルと制御チャネルとの交差によって画定されており、作動力に応答して流れチャネルに偏向されうるか、または前記流れチャネルから引き戻されうるエラストマー膜によって、前記流れチャネルと前記制御チャネルとが隔てられている、請求項２２に記載のデバイス。
  24. 前記マイクロ流体デバイスが、少なくとも２４個のユニットセルを備える、請求項１～２３のいずれか一項に記載のデバイス。
  25. 前記ユニットセルが細胞捕捉部位を備え、任意選択的に前記細胞捕捉部位が、サイズ選択によって循環腫瘍細胞を捕捉するように構成される、請求項１～２４のいずれか一項に記載のデバイス。
  26. 集積化マイクロ流体デバイスであって、
    複数のサンプル処理部位を含む複数のサンプル処理ユニットセルであって、ユニットセルが、複数の異なる試薬入口と流体連通している、複数のサンプル処理ユニットセルとを備え、
    個々のユニットセルは、複数のカラムを含み、第一のカラムは、複数のカラムの上流の位置であり、前記複数のカラムのそれぞれは、別々のサンプル処理部位のセットを含む、デバイス。
  27. 請求項１～２６のいずれかに記載の集積化マイクロ流体デバイスを使用する方法であって、
    共有入口からユニットセルのカラム内にビーズを装填すること、
    サンプルを捕捉すること、
    ビーズを洗浄すること、
    第一のチャンバ内に溶出すること、
    予備増幅マスターミックスを第二のチャンバに装填すること、
    予備増幅からサンプルチャンバ内にアンプリコンを装填すること、
    アッセイミックスをアッセイチャンバ内に装填すること、および
    前記サンプルチャンバおよびアッセイチャンバの内容物の少なくとも一画分を混合すること、のうち一つまたは複数の工程を含む方法。
  28. マイクロ流体デバイス上でアッセイを行う方法であって、
    共有入口からユニットセルのカラム内にビーズを装填すること、
    前記ビーズ上に対象サンプル生体分子を捕捉すること、
    前記ビーズを洗浄すること、
    捕捉された生体分子を第一のチャンバ内に溶出すること、
    予備増幅マスターミックスを第二のチャンバに装填すること、
    予備増幅反応を行うこと、
    予備増幅反応からサンプルチャンバ内にアンプリコンを装填すること、
    アッセイミックスをアッセイチャンバ内に装填すること、および
    前記サンプルチャンバおよびアッセイチャンバの内容物の少なくとも一画分を混合すること、を含む方法。
  29. 前記マイクロ流体デバイスが、請求項１～２６のいずれか一項に記載の集積化マイクロ流体デバイスである、請求項２７または２８に記載の方法。
  30. 前記捕捉の工程が、前記装填の工程の後である、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記ビーズを洗浄することが、前記カラム内の前記ビーズ上に洗浄緩衝溶液を流すことを含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記捕捉の工程が、前記装填の工程の前である、請求項２７または２８に記載の方法。
  33. 前記ビーズを洗浄することが、前記ビーズを洗浄緩衝溶液と混合し、前記ビーズを前記溶液から分離することを含み、前記ビーズが磁気ビーズである、請求項３２に記載の方法。
  34. 複数の標的生体分子が前記サンプルユニットセルに濃縮されるように、前記ビーズが、前記サンプル中の異なる標的生体分子に特異的に結合する異なるビーズを含む、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記予備増幅マスターミックスが、逆転写酵素およびポリメラーゼを含む、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 逆転写および予備増幅が、同じ工程で実施される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記予備増幅マスターミックスが、複数の異なる標的ヌクレオチド配列に対するプライマー対を含む、請求項２７～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 各標的ヌクレオチド配列の存在が、混合の工程後にＰＣＲによって検出される、請求項２７～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記混合の工程後に、前記対象生体分子の存在を検出することをさらに含む、請求項２７～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 検出がＰＣＲによる、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ＰＣＲがｑＰＣＲである、請求項４０に記載の方法。
  42. 検出がシークエンシングによる、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記混合の工程後に増幅し、シークエンシング前に異なるサンプルから前記増幅生成物をプールすることをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 予備増幅されたサンプルがｑＰＣＲによって定量され、シークエンシングの工程の前にプーリングのために正規化される、請求項４３に記載の方法。
  45. サンプルをプールする前に、およびシークエンシングの前に、固有のサンプルバーコードプライマーのセットを各ユニットセルに流すことによってサンプルにインデックス付与することをさらに含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記予備増幅の前および後にビーズクリーンアップ工程をさらに含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. ウイルス粒子が前記ビーズと関連付けられている、請求項２７～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記ビーズが親和性試薬を含む、請求項２７～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記親和性試薬が抗体である、請求項２７～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記対象生体分子が、一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を含む、請求項２７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記ビーズが、前記一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を特異的にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ配列により官能基化される、請求項２７～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、ウイルスポリヌクレオチド配列を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、ＲＮＡ配列を含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、ウイルスＲＮＡ配列を含む、請求項５１に記載の方法。
  55. 前記ウイルスＲＮＡ配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ配列である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のうち少なくとも二つを含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 別々の反応部位において、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のうち少なくとも二つを検出することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 反応部位が、サンプルチャンバおよびアッセイチャンバを含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ウイルスＲＮＡ配列がインフルエンザＲＮＡ配列である、請求項５４に記載の方法。
  60. 前記一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、別々の反応部位に少なくともＨ３Ｎ２インフルエンザＲＮＡ配列とＨ１Ｎ１インフルエンザＲＮＡ配列とを含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 別々の反応部位において、少なくとも前記Ｈ３Ｎ２インフルエンザＲＮＡ配列と前記Ｈ１Ｎ１インフルエンザＲＮＡ配列とを検出することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 反応部位が、サンプルチャンバおよびアッセイチャンバを含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 異なる対象生体分子を捕捉するビーズをそれぞれ装填された複数のカラムをユニットセルが含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記ビーズが核酸を含む、請求項２７～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記ビーズが、ウイルス粒子に結合する抗体を含む、請求項２７～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. ウイルスＲＮＡを検出することをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 免疫ＰＣＲによって前記ウイルス粒子の存在を検出することをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記ビーズがウイルス抗原を含む、請求項２７～６４のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記ビーズが、前記ウイルス抗原を含むウイルス粒子を含む、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記サンプル生体分子が、前記ウイルス抗原に対する抗体であり、前記サンプル由来の抗体の前記ウイルス抗原への結合をさらに含む、請求項６８または６９に記載の方法。
  71. 免疫ＰＣＲによって前記ウイルス抗原に対する抗体の存在を検出することをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記ウイルス抗原に結合された前記サンプル由来の前記抗体にオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体を結合させることをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
  73. 前記検出の工程が、前記オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体のオリゴヌクレオチドを検出することを含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記検出の工程がｑＰＣＲである、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記検出工程が、異なる抗体タイプを検出することを含む、請求項６８～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記異なる抗体タイプが、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む、請求項７５に記載の方法。
  77. ユニットセルの別々のカラムがそれぞれ、異なるウイルス抗原を提示するビーズを含む、請求項６８～７７のいずれか一項に記載の方法。
  78. 各異なるウイルス抗原が、前記ウイルスの異なる株、バリアント、または変異体由来である、請求項７７に記載の方法。
  79. 精製された血清サンプルを産生するために血清ベースのクリーンアップ用に第一のカラムを使用することをさらに含み、任意選択的に、前記血清ベースのクリーンアップが、ビーズに結合することによりＩｇＧおよびアルブミンのうち少なくとも一つを枯渇させる、請求項６８～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 異なるウイルス抗原を提示するビーズをそれぞれ含む別々のカラム間で、前記精製された血清サンプルを分割することをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 異なる各ウイルス抗原に対するサンプル抗体が、前記異なるウイルス抗原を提示するビーズを含む前記カラムの下流のサンプル処理部位で検出される、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記ユニットセルが、少なくとも二つのカラムを含み、前記二つのカラムのうちの一つが、血清ベースのクリーンアップに使用される、請求項２７～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 共有入口からユニットセルの前記カラム内にビーズを装填することと、前記ビーズ上に対象サンプル生体分子を捕捉することと、を含み、前記対象生体分子がタンパク質を含む、請求項２７～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記カラム内に装填された前記ビーズ上にサンプルを流すことによって、前記対象生体分子が捕捉される、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記ビーズを前記カラムに装填する前に、前記ビーズをサンプルと混合することによって、前記対象生体分子が捕捉される、請求項８３に記載の方法。
  86. 前記タンパク質が、前記ビーズに結合された抗体によって前記ビーズ上で捕捉される、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記ビーズ上に捕捉された前記タンパク質に抗体を結合させることをさらに含み、前記抗体がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている、請求項８３～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記抗体が、血清、血漿、全血、唾液、または鼻腔スワブ由来である、請求項８３～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記抗体が、血清由来であり、前記ユニットセルの第一のカラムにおける血清クリーンアップ工程をさらに含む、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記タンパク質が、前記ビーズによって提示されるウイルス抗原に特異的な抗体である、請求項８３～８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記ウイルス抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原であり、任意選択的に、前記ウイルス抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質またはそのペプチドである、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記ウイルス抗原がインフルエンザ抗原である、請求項９０に記載の方法。
  93. 異なるウイルス抗原を提示するビーズをそれぞれ装填されている複数のカラムを、ユニットセルが含み、任意選択的に、前記異なるウイルス抗原が、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質変異体またはそのペプチドである、請求項９０に記載の方法。
  94. 前記マイクロ流体デバイスの複数の反応部位における前記サンプルタンパク質の存在を検出することをさらに含む、請求項８３～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 免疫ＰＣＲによって前記サンプルタンパク質を検出することをさらに含む、請求項８３～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 免疫ＰＣＲが、前記オリゴヌクレオチドに相補的なｓｓＤＮＡにハイブリダイズすることをさらに含む、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記オリゴヌクレオチドを切断することをさらに含む、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記抗体にコンジュゲートされた前記オリゴヌクレオチドが、ウラシルを含み、切断が、ウラシルＮ－グリコシラーゼ（ＵＮＧ）によるものである、請求項９７に記載の方法。
  99. 複数の異なるタンパク質は、複数の異なるサンプルのそれぞれに対して検出される。
  100. 検出が前記ユニットセル内であるか、または検出が前記ユニットセルの下流の反応部位のアレイ内である、請求項９９に記載の方法。
  101. 検出がｑＰＣＲによる、請求項９５～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記サンプルタンパク質が、がんバイオマーカーを含む、請求項９５～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記サンプルタンパク質が、前立腺特異的抗原を含む、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記ユニットセルが、少なくとも二つのカラムを含み、前記方法が、血清ベースのクリーンアップを実施して、精製された血清サンプルを前記マイクロ流体デバイスから離れて産生することをさらに含む、請求項９５～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. ユニットセルの別々のカラムが、同じサンプルから別々の対象生体分子を濃縮するために使用され、前記方法が任意選択的に、異なる対象生体分子をそれぞれ濃縮する別々のカラム間で、前記精製された血清サンプルを分割することをさらに含む、請求項９５～１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 各対象生体分子が、前記カラムの下流のサンプル処理部位で検出される、請求項９５～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記マイクロ流体デバイスの複数の反応部位における前記タンパク質の存在を検出することをさらに含む、請求項９５～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記オリゴヌクレオチドの存在を検出することが、免疫ＰＣＲを含む、請求項１０６または１０７に記載の方法。
  109. 前記オリゴヌクレオチドの存在を検出することが、近接伸長またはライゲーションなどの近接アッセイを含む、請求項９４から１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 少なくとも１ラウンドのビーズベースの精製を実施することをさらに含む、請求項２７～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. オリゴヌクレオチドの少なくとも２ラウンドのビーズベースの精製を実施することをさらに含む、請求項１１０に記載の方法。
  112. 増幅反応の前にオリゴヌクレオチドのビーズベース精製のラウンドを、および前記増幅反応の後にビーズベース精製の別のラウンドを実施することを含む、請求項１１１に記載の方法。
  113. ビーズベースの精製のラウンドが、ビーズ上にポリヌクレオチドを捕捉することと、前記ビーズを捕捉緩衝液で洗浄することと、前記ビーズをアルコールで洗浄することと、前記エラストマー製デバイスの一つまたは複数のＰＤＭＳ層を通して前記アルコールを蒸発させることとを含む、請求項１１０～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記アルコールは、エタノールである、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記マイクロ流体デバイスのＰＤＭＳを通して前記アルコールが透過して前記ビーズを乾燥させることをさらに含む、請求項１１３または１１４に記載の方法。
  116. 前記方法が、スプリントライゲーションを含む、請求項２７～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. 請求項２７～１１６のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
    請求項１～２６のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス、および
    請求項２７～１１６のいずれか一項に記載の方法を実施するための一つまたは複数の試薬、を含むキット。
  118. 前記キットが、逆転写酵素を含む、請求項１１７に記載のキット。
  119. 前記キットが、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む、請求項１１７または１１８に記載のキット。
  120. 前記一つまたは複数の試薬が、ポリメラーゼを含む、請求項１１７～１１９のいずれか一項に記載のキット。
  121. 前記一つまたは複数の試薬が、異なる標的ヌクレオチド配列を特異的に増幅する複数のプライマー対を含む予備増幅ミックスを含む、請求項１１７～１２０のいずれか一項に記載のキット。
  122. 前記一つまたは複数の試薬が、対象サンプル生体分子を特異的に捕捉するビーズを含む、請求項１１７～１２１のいずれか一項に記載のキット。
  123. 前記生体分子が、一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を含む、請求項１２２に記載のキット。
  124. 前記一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、ウイルスＲＮＡを含む、請求項１２３に記載のキット。
  125. 前記一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、複数の異なる標的ヌクレオチド配列を含む、請求項１２４に記載のキット。
  126. 前記一つまたは複数の試薬が、異なるＲＮＡ配列をそれぞれ選択的に増幅するプライマー対をさらに含む、請求項１１７～１２１のいずれか一項に記載のキット。
  127. 前記一つまたは複数の試薬が、異なるＲＮＡ配列をそれぞれ検出する標的特異的蛍光プローブをさらに含む、請求項１１７～１２６のいずれか一項に記載のキット。
  128. 前記蛍光プローブがクエンチャーを含む、請求項１２７に記載のキット。
  129. 前記一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のうち少なくとも二つを含む、請求項１２５～１２８のいずれか一項に記載のキット。
  130. 前記一つまたは複数の試薬が、前記マイクロ流体デバイスの別々の反応部位において、前記Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のうちの少なくとも二つを選択的に増幅するプライマー対をさらに含む、請求項１２５～１２９のいずれか一項に記載のキット。
  131. 前記一つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が、別々の反応部位に少なくともＨ３Ｎ２インフルエンザＲＮＡ配列とＨ１Ｎ１インフルエンザＲＮＡ配列とを含む、請求項１２５～１３０のいずれか一項に記載のキット。
  132. 前記一つまたは複数の試薬が、前記マイクロ流体デバイスの別々の反応部位で、少なくとも前記Ｈ３Ｎ２インフルエンザＲＮＡ配列および前記Ｈ１Ｎ１インフルエンザＲＮＡ配列を選択的に増幅するプライマー対をさらに含む、請求項１３１に記載のキット。
  133. 前記一つまたは複数の試薬が、親和性試薬を含むビーズを含み、任意選択的に、前記親和性試薬が抗体である、請求項１１７から１３２のいずれか一項に記載のキット。
  134. 前記親和性試薬が、ウイルス抗原に特異的に結合する、請求項１３３に記載のキット。
  135. 前記一つまたは複数の試薬が、ウイルス抗原を含むビーズを含み、任意選択的に、前記ウイルス抗原が、スパイクＳ１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質ドメインである、請求項１１７～１３４のいずれか一項に記載のキット。
  136. 前記一つまたは複数の試薬が、前記対象生体分子に対する抗体をさらに含む、請求項１１７～１３５のいずれか一項に記載のキット。
  137. 前記対象生体分子に対する前記抗体が、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている、請求項１３６に記載のキット。
  138. 前記一つまたは複数の試薬が、前記オリゴヌクレオチドを増幅するためのプライマーをさらに含む、請求項１３７に記載のキット。
  139. 前記一つまたは複数の試薬が、前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするｓｓＤＮＡプローブをさらに含む、請求項１３に記載のキット。
  140. 前記オリゴヌクレオチドを切断する酵素をさらに含む、請求項１３９に記載のキット。
  141. ＵＮＧおよび前記オリゴヌクレオチド中の前記酵素が、ウラシルを含む、請求項１４０に記載のキット。
  142. 前記一つまたは複数の試薬が、ビーズに結合することによってＩｇＧおよびアルブミンのうち少なくとも一つに特異的に結合するビーズを含む、請求項１１７～１４１のいずれか一項に記載のキット。
  143. ライブラリー正規化の方法であって、
    ａ．複数のサンプルからアリコートを取得することであって、前記サンプルが、離間した逆位リピートを含むポリヌクレオチドを含む、取得すること、
    ｂ．工程ａの前記アリコートに対し抑制ＰＣＲを行うこと、
    ｃ．工程ｂからの増幅産物を定量すること、
    ｄ．前記複数のサンプルをプールして、工程ｃの前記定量に基づいて正規化されたライブラリーを形成すること、
    前記プールされた複数のサンプルが、工程ｂの前記抑制ＰＣＲを受けていない、方法。
  144. 抑制ｑＰＣＲによるポリヌクレオチドのライブラリー定量のためのキットであって、前記キットが、
    少なくとも１５０ヌクレオチドで隔てられた、離間した逆位リピートを含むライブラリー定量標品と、
    前記逆位リピートのうち一つの少なくとも８ヌクレオチドと同一の配列を含むプライマーと、を含む、キット。
  145. 複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのアッセイ方法であって、
    ａ）別々のサンプルＳ中のそれぞれの標的ヌクレオチド配列を逆転写および予備増幅して、各サンプルからタグ付き標的ヌクレオチド配列を産生することであって、
    前記サンプルＳのうち少なくとも一つが、前記標的ヌクレオチド配列を含み、
    前記タグ付き標的ヌクレオチド配列が、サンプルタグおよび標的ヌクレオチド配列を含み、
    予備増幅が、サンプルタグおよび標的特異的配列を含む、タグ付き標的特異的プライマーを用いて行われ、
    前記標的特異的配列が、前記標的ヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズすることと；
    ｂ）前記サンプルＳのそれぞれの前記タグ付き標的ヌクレオチド配列を混合して、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物を産生する、混合することと；
    ｃ）前記混合物を複数の反応部位に分割することと；
    ｄ）各反応部位に異なるプライマー対を添加することと；
    ｅ）各反応部位の異なるサンプルから前記タグ付き標的ヌクレオチド配列を増幅することであって、異なる各プライマー対が、異なるサンプルタグにハイブリダイズするプライマーを含む、増幅することと；
    ｆ）前記増幅されたタグ付き標的核酸の存在を、前記標的特異的配列の少なくとも一部を含むがサンプルタグを含まない蛍光標的特異的プローブを用いて、ｑＰＣＲにより検出することと、を含み、
    増幅の工程ｅが、前記標的特異的プローブの存在下である、方法。
  146. 複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのアッセイ方法であって、
    ａ）少なくとも一つのタグ付き標的特異的プライマーを用いて、タグ付き標的ヌクレオチド配列を産生するコード反応に、各サンプルＳを別々に供することであって、前記サンプルＳのうち少なくとも一つは、前記標的ヌクレオチド配列を含み、前記タグ付き標的ヌクレオチド配列は、サンプルタグおよび標的ヌクレオチド配列を含む、供すること；
    ｂ）前記サンプルＳのそれぞれの前記タグ付き標的ヌクレオチド配列を混合して、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物を産生すること；
    ｃ）前記混合物を複数の反応部位に分割すること；
    ｄ）異なるプライマー対を異なる反応部位に添加することであって、異なる各プライマー対が、異なるサンプルタグにハイブリダイズしてタグ付き標的ヌクレオチド配列を特定のサンプルから増幅するプライマーを含む、添加すること；
    ｅ）標的特異的プローブの存在下で前記サンプルＳのうち少なくとも一つから前記タグ付き標的ヌクレオチド配列を増幅することであって、前記標的特異的プローブが、前記標的特異的プライマーの標的特異的配列の少なくとも一部と同一の配列を含むがサンプルタグを含まない、増幅すること；および
    ｆ）前記タグ付けされた標的ヌクレオチドの存在を検出すること、を含む方法。
  147. 前記標的特異的プローブが、前記標的特異的プライマーの標的特異的配列の少なくとも６ヌクレオチドと同一の配列を含む、請求項１４５または１４６に記載の方法。
  148. 前記標的特異的プローブが、前記標的特異的プライマーの標的特異的配列の少なくとも１０ヌクレオチドと同一の配列を含む、請求項１４７に記載の方法。
  149. 前記タグ付き標的ヌクレオチド配列が、少なくとも６ヌクレオチド長であるサンプルタグと、少なくとも６ヌクレオチド長である標的ヌクレオチド配列とを含む、請求項１４５～１４８のいずれか一項に記載の方法。
  150. 前記タグ付き標的ヌクレオチド配列が、少なくとも８ヌクレオチド長であるサンプルタグと、少なくとも１２ヌクレオチド長である標的ヌクレオチド配列とを含む、請求項１４９に記載の方法。
  151. 前記標的特異的配列が、少なくとも６ヌクレオチド長である、請求項１４５～１５０のいずれか一項に記載の方法。
  152. 前記標的特異的配列が、少なくとも１２ヌクレオチド長である、請求項１５１に記載の方法。
  153. 工程ａが、前記サンプルタグを含むが前記標的ヌクレオチド配列を含まないタグ付きプライマーとの反応を含む、請求項１４５～１５２のいずれか一項に記載の方法。
  154. 前記タグ付けされたプライマーが、前記タグ付き標的特異的プライマーよりも高い濃度である、請求項１５３に記載の方法。
  155. 前記タグを含まずかつ前記標的ヌクレオチド配列の一部分に対する逆相補鎖である、標的特異的プライマーをさらに含む、請求項１５３または１５４に記載の方法。
  156. 工程ａが、前記標的特異的プライマーを使用して前記標的ヌクレオチド配列を逆転写することをさらに含む、請求項１５４に記載の方法。
  157. 前記タグ付き標的特異的プライマーが、ウラシルを含む、請求項１４５～１５５のいずれか一項に記載の方法。
  158. ウラシルＮ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）を、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物に添加することをさらに含む、請求項１５７に記載の方法。
  159. 前記サンプルＳのうち少なくとも一つが、前記標的ヌクレオチド配列を含み、前記サンプルＳのうち少なくとも一つが、前記標的ヌクレオチド配列を含まない、請求項１４５～１５８のいずれか一項に記載の方法。
  160. 工程ａ）の前に、標的特異的プライマーを用いて、前記タグ付き標的ヌクレオチド配列を逆転写することをさらに含む、請求項１４５～１５９のいずれか一項に記載の方法。
  161. 工程ａが、前記タグ付き標的ヌクレオチド配列を予備増幅することを含む、請求項１４５～１６０のいずれか一項に記載の方法。
  162. 工程ａが、サンプルに対して複数のタグ付き標的ヌクレオチド配列を産生するコード反応である、請求項１４５～１６１のいずれか一項に記載の方法。
  163. 工程ｅが少なくとも二連で実施される、請求項１４５～１６２のいずれか一項に記載の方法。
  164. 前記サンプルＳのうち少なくとも一つが、前記標的ヌクレオチド配列を含まない、請求項１４５～１６３のいずれか一項に記載の方法。
  165. 検出の工程ｆ）がＰＣＲによる、請求項１４５～１６４のいずれか一項に記載の方法。
  166. 検出の工程ｆ）がｑＰＣＲによる、請求項１６５に記載の方法。
  167. 前記標的特異的プローブが、前記標的ヌクレオチド配列を含まないサンプルに前記プライマー対が特異的である反応部位において、前記ＣＴを少なくとも２増加させる、請求項１６６に記載の方法。
  168. 前記ＣＴが少なくとも４増加する、請求項１６７に記載の方法。
  169. 前記標的ヌクレオチド配列を含まないサンプルに対し前記プライマー対が特異的である反応部位と、前記標的ヌクレオチド配列を含まないサンプルに対し前記プライマー対が特異的である異なる反応部位との間で、前記標的特異的プローブの存在により前記ｄＣＴが少なくとも２０％増加する、請求項１６６、１６７または１６８に記載の方法。
  170. 検出の工程ｆ）が、エンドポイントＰＣＲによる、請求項１６５に記載の方法。
  171. 検出の工程ｆ）が、前記標的特異的プローブからのシグナルを検出することを含む、請求項１４５～１７０のいずれか一項に記載の方法。
  172. 前記プローブがフルオロフォアを含む、請求項１７１に記載の方法。
  173. 前記プローブがクエンチャーを含む、請求項１７２に記載の方法。
  174. 前記プローブがハイブリダイズされていない際に、前記フルオロフォアがクエンチされる、請求項１７３に記載の方法。
  175. 少なくとも工程ｅ）およびｆ）が、反応部位のアレイを含むアレイマイクロ流体デバイス上で実施される、請求項１４５～１７４のいずれか一項に記載の方法。
  176. 少なくとも工程ｃ）からｆ）が、反応部位のアレイを含むアレイマイクロ流体デバイス上で実施される、請求項１７５に記載の方法。
  177. 工程ａ）からｆ）が、サンプル処理ユニットセルおよび反応部位のアレイを含む集積化マイクロ流体デバイス上で実施される、請求項１４５から１７４のいずれか一項に記載の方法。
  178. 前記マイクロ流体デバイスが、請求項１から２６のいずれか一項に記載されるデバイスである、請求項１７７に記載の方法。
  179. 前記反応部位のアレイの個々の反応部位が、サンプル入口と試薬入口との固有の組合せを含む、請求項１７７または１７８に記載の方法。
  180. 工程ｃ）が、工程ｂ）の混合物を前記アレイマイクロ流体デバイスのサンプル入口内に流すことを含む、請求項１７９に記載の方法。
  181. 前記標的特異的プローブが、工程ｅ）で、異なるサンプルタグを含むタグ付き標的ヌクレオチド配列に対するタグ付き標的特異的プライマーの結合を、少なくとも５０％減少させる、請求項１４５～１８０のいずれか一項に記載の方法。
  182. 前記標的特異的プローブが標識を含まない、請求項１４５～１８１のいずれか一項に記載の方法。
  183. 検出の工程ｆ）が、前記標的特異的ヌクレオチド配列との結合について前記タグ付き標的特異的プライマーと競合しない、標識化標的特異的プローブを伴う、請求項１８２に記載の方法。
  184. 検出の工程ｆ）が、インターカレート染料であって、任意選択的に前記染料がＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎである、請求項１８２に記載の方法。
  185. Ｓが少なくとも２つである、請求項１８４に記載の方法。
  186. Ｓが少なくとも４つである、請求項１８５に記載の方法。
  187. 工程ｄの複数の反応部位に分割する単一のチャネルを通して、工程ｃ由来のタグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物を流すことをさらに含む、請求項１４５～１８６のいずれか一項に記載の方法。
  188. 前記複数の反応部位が、アレイマイクロ流体デバイスの別々の場所である、請求項１８７に記載の方法。
  189. 前記タグ付き標的核酸を検出する工程ｅの前に、前記反応部位を互いに流体的に隔てることをさらに含む、請求項１８８に記載の方法。
  190. 前記同じサンプル中の異なる標的ヌクレオチド配列Ｔが、同じサンプルタグによりタグ付けされるが別々の反応部位で検出される、請求項１４５～１８９のいずれか一項に記載の方法。
  191. 前記タグ付き標的ヌクレオチド配列が、サンプルタグと標的特異的タグとの固有の組合せを含む、請求項１９０に記載の方法。
  192. 工程ａ）が、前記標的特異的タグを含むが前記サンプルタグを含まない標的特異的リバースプライマーをさらに含む、請求項１９１に記載の方法。
  193. 反応部位が、１プライマーを前記サンプルタグに、１プライマーを前記標的特異的タグに用いて、特定のサンプルから特定の標的を増幅する、請求項１９１または１９２に記載の方法。
  194. 反応部位が、１プライマーを前記サンプルタグに、１プライマーを前記標的ヌクレオチド配列に用いて、特定のサンプルから特定の標的を増幅する、請求項１９１に記載の方法。
  195. 各標的が、標的特異的プローブにより検出される、請求項１９０から１９４のいずれか一項に記載の方法。
  196. 各反応部位で増幅する工程ｅ）が、サンプルタグおよび標的特異的タグの特定の組合せに特異的なプライマー対を伴い、前記Ｓ×Ｔの組合せのそれぞれが別々の反応部位で増幅される、請求項１９０～１９５のいずれか一項に記載の方法。
  197. Ｔが少なくとも３である、請求項１９０～１９５のいずれか一項に記載の方法。
  198. 前記異なる標的ヌクレオチド配列Ｔが、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＲＮＡ配列およびＨ１Ｎ１インフルエンザＲＮＡ配列を含む、請求項１９０～１９７のいずれか一項に記載の方法。
  199. 前記異なる標的ヌクレオチド配列Ｔが、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のうち少なくとも二つを含む、請求項１９０～１９８のいずれか一項に記載の方法。
  200. 前記標的ヌクレオチド配列が、ウイルスヌクレオチド配列である、請求項１９０～１９９のいずれか一項に記載の方法。
  201. 前記標的ヌクレオチド配列がウイルスＲＮＡ配列である、請求項２００に記載の方法。
  202. 前記ウイルスＲＮＡ配列が、インフルエンザウイルスＲＮＡ配列である、請求項２０１に記載の方法。
  203. 前記ウイルスＲＮＡ配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡ配列である、請求項２０１に記載の方法。
  204. 前記サンプルが、血液サンプル、唾液サンプル、または鼻腔スワブである、請求項１９０～２０３のいずれか一項に記載の方法。
  205. 前記サンプルが、固体組織サンプルに由来する、請求項１９０～２０３のいずれか一項に記載の方法。
  206. 複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのアッセイ方法であって、
    ａ）少なくとも一つのタグ付き標的特異的プライマーを用いて、タグ付き標的ヌクレオチド配列を産生するコード反応に、各サンプルＳを別々に供することであって、前記サンプルＳのうち少なくとも一つは、前記標的ヌクレオチド配列を含み、前記タグ付き標的ヌクレオチド配列は、サンプルタグおよび標的ヌクレオチド配列を含む、供すること；
    ｂ）サンプルＳのそれぞれのタグ付き標的ヌクレオチド配列を混合して、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物を産生すること；
    ｃ）標的特異的プローブの存在下で前記サンプルＳのうち少なくとも一つから前記タグ付き標的ヌクレオチド配列を増幅することであって、前記標的特異的プローブが、前記標的特異的プライマーの標的特異的配列の少なくとも一部と同一の配列を含むがサンプルタグを含まない、増幅すること；および
    ｄ）前記タグ付き標的ヌクレオチドの存在を検出することを含む、方法。
  207. 検出の工程ｄ）が、前記増幅されたタグ付き標的ヌクレオチド配列をシークエンシングすることによる、請求項２０６に記載の方法。
  208. コードの工程ａ）が、シークエンシングアダプター配列を前記タグ付き標的ヌクレオチド配列に組み込むことを含む、請求項２０７に記載の方法。
  209. 工程ａ）が、サンプル処理ユニットセルを含むマイクロ流体デバイス上で実施される、請求項２０６、２０７、または２０８のいずれか一項に記載の方法。
  210. 前記タグ付き標的ヌクレオチド配列が、混合の工程ｂ）の前に前記マイクロ流体デバイスから収集される、請求項２０９に記載の方法。
  211. 検出の工程ｄ）がｑＰＣＲによる、請求項２０６～２１０のいずれか一項に記載の方法。
  212. 複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのキットであって、前記キットが、
    サンプルＳのそれぞれに対するタグ付き標的特異的プライマーであって、各タグ付き標的特異的プライマーが、サンプルタグおよび標的特異的配列を含む、タグ付き標的特異的プライマーと、
    前記標的特異的配列の少なくとも一部を含む標的特異的プローブとを含み、
    前記タグ付き標的特異的プライマーおよび前記プローブのそれぞれが、別々の区画内にある、キット。
  213. 鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、請求項２１２に記載のキット。
  214. 逆転写酵素をさらに含む、請求項２１２または２１３に記載のキット。
  215. 前記タグ付き標的特異的プライマーが、サンプルタグを含まない標的特異的リバースプライマーと混合されている、請求項２１２～２１４のいずれか一項に記載のキット。
  216. 前記リバースプライマーが標的特異的タグを含む、請求項２１５に記載のキット。
  217. 異なるサンプルタグにそれぞれハイブリダイズする異なるプライマーＳのセットをさらに含み、前記異なるプライマーＳのそれぞれが別々の区画内にある、請求項２１５または２１６に記載のキット。
  218. 前記異なるプライマーＳのうち少なくとも一部が、標的特異的リバースプライマーと混合されている、請求項２１７に記載のキット。
  219. 標的特異的リバースプライマーをさらに含む、請求項２１２～２１８のいずれか一項に記載のキット。
  220. 前記標的特異的リバースプライマーが、サンプルタグを含まない、請求項２１８または２１９に記載のキット。
  221. 前記標的特異的プローブが、前記標的特異的プライマーの標的特異的配列の少なくとも６ヌクレオチドと同一の配列を含む、請求項２１２から２２０のいずれか一項に記載のキット。
  222. 前記標的特異的プローブが、前記標的特異的プライマーの標的特異的配列の少なくとも１０ヌクレオチドと同一の配列を含む、請求項２２１に記載のキット。
  223. 前記タグ付き標的ヌクレオチド配列が、少なくとも６ヌクレオチド長であるサンプルタグと、少なくとも６ヌクレオチド長である標的ヌクレオチド配列とを含む、請求項２１２～２２２のいずれか一項に記載のキット。
  224. 前記タグ付き標的ヌクレオチド配列は、少なくとも８ヌクレオチド長のサンプルタグと、少なくとも１２ヌクレオチド長の標的ヌクレオチド配列とを含む、請求項２２３に記載のキット。
  225. 前記標的特異的配列が、少なくとも６ヌクレオチド長である、請求項２１２～２２４のいずれか一項に記載のキット。
  226. 前記標的特異的配列が、少なくとも１２ヌクレオチド長である、請求項２２５に記載のキット。
  227. 前記プローブがフルオロフォアを含む、請求項２１２～２２６のいずれか一項に記載のキット。
  228. 前記プローブがクエンチャーを含む、請求項２２７に記載のキット。
  229. 前記プローブがハイブリダイズされていないとき、前記フルオロフォアがクエンチされる、請求項２２８に記載のキット。
  230. マイクロ流体デバイスをさらに含む、請求項２１２～２２９のいずれか一項に記載のキット。
  231. 前記マイクロ流体デバイスが、およびエラストマー製デバイスである、請求項２３０に記載のキット。
  232. 前記マイクロ流体デバイスが、複数の反応部位を含むアレイデバイスである、請求項２３０または２３１に記載のキット。
  233. 個々の反応部位が、サンプル入口および試薬入口の固有の組合せを含む、請求項２３２に記載のキット。
  234. 複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのアッセイ方法であって、
    ａ）少なくとも一つのタグ付き標的特異的プライマーを用いて、タグ付き標的ヌクレオチド配列を産生するコード反応に、各サンプルＳを別々に供することであって、前記サンプルＳのうち少なくとも一つは、前記標的ヌクレオチド配列を含む、供すること；
    ｂ）前記サンプルＳのそれぞれの前記タグ付き標的ヌクレオチド配列を混合して、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物を作製すること；
    ｃ）混合物を複数の反応部位に分割すること；
    ｄ）異なるプライマー対を異なる反応部位に添加することであって、異なる各プライマー対が、異なるサンプルタグにハイブリダイズするプライマーを含む、添加すること；
    ｅ）各反応部位中の異なるサンプルから前記タグ付き標的ヌクレオチド配列を増幅すること；
    ｆ）前記タグ付き標的ヌクレオチドの存在を検出すること；を含み、
    工程ａ）が、前記サンプル特異的タグを含むが前記標的ヌクレオチド配列を含まないタグ付きプライマーとの反応を含む、方法。
  235. 前記タグ付けされたプライマーが、前記タグ付き標的特異的プライマーよりも高い濃度である、請求項２３４に記載の方法。
  236. 前記タグを含まずかつ前記標的ヌクレオチド配列の一部分に対する逆相補鎖である、標的特異的プライマーをさらに含む、請求項２３４または２３５に記載の方法。
  237. 工程ａが、前記標的特異的プライマーを用いて前記標的ヌクレオチド配列を逆転写することをさらに含む、請求項２３６に記載の方法。
  238. 前記タグ付き標的特異的プライマーが、ウラシルを含む、請求項２３４～２３７のいずれか一項に記載の方法。
  239. ウラシルＤＮＡ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）を、タグ付き標的ヌクレオチド配列の混合物に添加することをさらに含む、請求項２３８に記載の方法。
  240. 複数のサンプル中の少なくとも一つの標的核酸を検出するためのキットであって、
    サンプルＳのそれぞれに対するタグ付き標的特異的プライマーであって、各タグ付き標的特異的プライマーが、サンプル特異的タグおよび標的特異的配列を含む、タグ付き標的特異的プライマーと、
    前記サンプル特異的タグを含むが前記標的ヌクレオチド配列を含まない、タグ付きプライマーと、を含むキット。
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