JP2015516814A - 標的化されたdnaの濃縮および配列決定 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書における「組成物」は、少なくとも1つ以上のデオキシリボ核酸分子(DNA分子)を含む水溶液である。好ましくは、組成物は、複合溶液、すなわち、対象となるDNA配列(標的配列)と対象とならないさらなるDNA配列(望ましくない配列)とを含む溶液である。当業者には明らかであるように、望ましくない配列は、通常、標的配列よりはるかに豊富であり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15桁以上の差がある。
本明細書に記載する方法は、非標識RNAプローブを使用して対象となるゲノム領域(標的領域)を選択的に濃縮する点がこれまでの方法と異なる。かかる標的化濃縮は、後続の配列決定工程に特に有用である。なぜなら、標的配列のみが解析に付され、それによってDNAバラストの数桁の有意な低減が助長されるからである。
Claims (15)
- 組成物中のデオキシリボ核酸(DNA)の1つ以上の標的配列を濃縮するための方法であって、前記方法は:
(a)1つ以上のデオキシリボ核酸(DNA)分子を含む組成物を提供する工程、
(b)前記1つ以上のDNA分子に1つ以上の標的特異的リボ核酸(RNA)ハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイズさせ、それによって1つ以上のRNA/DNAハイブリッドを形成させる工程、
(c)前記RNA/DNAハイブリッドを、かかるRNA/DNAハイブリッドに特異的である1つ以上の抗体で捕捉し、それによって1つ以上のRNA/DNA/抗体ハイブリッドを形成させる工程、
(d)前記1つ以上のRNA/DNA/抗体ハイブリッドを単離する工程、
(e)前記1つ以上のRNA/DNA/抗体ハイブリッドのうちの前記1つ以上のDNA分子を必要に応じて増幅する工程、および
(f)前記RNA/DNA/抗体ハイブリッドの前記DNA分子または増幅産物を配列決定する工程
を含み、前記配列決定する工程が、好ましくは次世代配列決定によって行われるものである、方法。 - 前記標的配列が、コード領域(エクソン)の群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記コード領域が、代謝遺伝子、調節遺伝子および癌遺伝子の群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記組成物中の前記DNA分子が、次世代配列決定用のDNA断片ライブラリであり、場合により、前記ライブラリ中のDNA断片が、末端ユニバーサルアダプター配列を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記DNA分子が、DNA断片ライブラリから成り、
(a)前記ライブラリ中の前記DNAが、断片化され、サイズ選択され、続いて必要に応じて、二本鎖平滑末端断片を生じさせるようにまたはA−オーバーハングを有する末端を生じさせるようにそれぞれ末端修復されており、かつ
(b)前記断片が、同一の隣接配列を有する断片ライブラリを生じさせるように二本鎖または部分的に二本鎖のアダプターオリゴヌクレオチドにライゲートされている、
請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - RNAプローブが、未修飾かつ未標識である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記RNAプローブが、合成されたRNAプローブ、転写されたDNAプローブであるか、または生物学的試料から単離され、精製される、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記抗体が固体表面に、好ましくは磁性粒子に結合される、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記抗体が磁性粒子に結合される場合、前記単離する工程が、磁場を用いて行われ、そして単離された前記RNA/DNA/抗体ハイブリッドを洗浄することを場合により含む、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記DNA分子が、単離された前記RNA/DNA/抗体ハイブリッド上で直接増幅される、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記増幅する工程が、前記ユニバーサルアダプター配列を結合するプライマーを用いて行われる、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- RNAが、配列決定前に酵素的に消化される、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- DNA/RNAハイブリッド分子に特異的である抗体、およびさらに1つ以上の標的特異的RNAハイブリダイゼーションプローブを含む、キットであって、前記抗体は、場合により磁性粒子に結合される、キット。
- 前記RNAハイブリダイゼーションプローブが、コード領域(エクソン)の群から選択される標的配列に特異的である、請求項13に記載のキット。
- 前記コード領域が、代謝遺伝子、調節遺伝子および癌遺伝子の群から選択される、請求項14に記載のキット。
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