JP7090793B2

JP7090793B2 - 次世代配列決定用途向けのホルムアミド非含有標的濃縮組成物

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Publication number: JP7090793B2
Application number: JP2021504328A
Authority: JP
Inventors: グエン，デュイリン; クシュワハ，ガリマ; メーレンカンプ，シンシア; チョイ，ジョナサン・エス; レイターマン，デニス
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2039-07-26
Also published as: US20210285034A1; CN112534061A; WO2020021084A1; JP2021531795A; EP3830286A1

Description

本発明は、核酸分析の分野、より具体的には、核酸配列決定ワークフロー内での核酸ハイブリッド形成に関する。

核酸ハイブリッド形成実験では、ホルムアミドを使用して二本鎖核酸の変性を促進し、一本鎖核酸鎖による二次構造の形成を最小限にする。ホルムアミドはまた、不完全な（部分的に誤対合のある）核酸二重鎖を不安定にすること、およびハイブリッド形成後の洗浄中にこのような二重鎖の破壊を促進することにより、ハイブリッド形成の特異性を上昇させるためにも必要である。ホルムアミドは毒性があり、危険であると考えられているので、幅広い臨床使用における実験用製品ではホルムアミドの使用が忌避されている。ホルムアミドの非毒性の代替物が必要とされている。適切な置き換えは、変性を促進すること、およびハイブリッド形成の特異性を上昇させることという特性を備えていなければならない。加えて、ホルムアミド置き換えの存在は、核酸配列決定などの下流のいかなる適用にも干渉しないことがある。本発明は、次世代の核酸配列決定用途に適したホルムアミド置き換えを開示している。

本発明は、ホルムアミドを使用せずに標的濃縮ステップを含む試料調製および配列決定ワークフローである。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、炭酸エチレン、ピロリドン、または第一級アミドから選択される置き換え溶媒が使用される。

一実施形態では、本発明は、核酸の溶液中の標的核酸を濃縮する方法であって、試料溶液中の核酸を分離するステップと、試料溶液を、結合部分に連結された１つ以上の一本鎖ハイブリッド形成プローブを含み、かつジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、炭酸エチレン、ピロリドンまたは第一級アミドから選択される溶媒をさらに含むホルムアミド非含有ハイブリッド形成溶液と接触させるステップと、試料核酸とプローブとの間のハイブリッドの形成を促進する条件下で、試料をインキュベートするステップと、結合部分を捕捉することによりハイブリッドを分離するステップとを含む、方法である。ピロリドンまたはアミドは、

から選択される構造を有しており、式中、Ｒ１は、Ｈ、メチル、プロピル、またはヒドロキシエチルであり、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立してＨまたはメチルであり、Ｒ４は、Ｈ、プロピルまたはイソブチルであり、例えば、ピロリドンまたはアミドは、２－ピロリドン、Ｎ－メチル－ピロリドン、Ｎ－ヒドロキシエチルピロリドン、アセトアミド、Ｎ－メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、プロピオンアミド、イソブチルアミドから選択される。

一実施形態では、本発明は、合成による単一分子配列決定によって配列決定されるべき標的核酸を濃縮する方法であって、試料溶液中の核酸を分離するステップと、核酸をアダプターに共役させるステップであって、アダプターが、ユニバーサルプライマー結合部位および配列決定プライマー結合部位を含む、ステップと、適応した標的核酸をユニバーサルプライマーで増幅して標的アンプリコンを形成するステップと、試料を、結合部分に連結された１つ以上の一本鎖ハイブリッド形成プローブを含み、かつジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、炭酸エチレン、ピロリドンまたは第一級アミドから選択される溶媒をさらに含むホルムアミド非含有ハイブリッド形成溶液と接触させるステップと、標的アンプリコンとプローブとの間のハイブリッドの形成を促進する条件下で試料をインキュベートするステップと、結合部分を捕捉することによりハイブリッドを分離し、ハイブリッドからアンプリコンを放出するステップとを含む、方法である。いくつかの実施形態では、ピロリドンまたはアミドは、

一実施形態では、本発明は、標的核酸を配列決定する方法であって、試料溶液中の核酸を分離するステップと、核酸をアダプターに共役させるステップであって、アダプターが、ユニバーサルプライマー結合部位および配列決定プライマー結合部位を含む、ステップと、適応した標的核酸をユニバーサルプライマーで増幅して標的アンプリコンを形成するステップと、試料を、結合部分に連結された１つ以上の一本鎖ハイブリッド形成プローブを含み、かつジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、炭酸エチレン、ピロリドンまたは第一級アミドから選択される溶媒をさらに含むおよびさらに含むホルムアミド非含有ハイブリッド形成溶液と接触させるステップと、標的アンプリコンとプローブとの間のハイブリッドの形成を促進する条件下で試料をインキュベートするステップと、結合部分を捕捉することによってハイブリッドを分離するステップと、ハイブリッドからアンプリコンを放出し、配列決定プライマー結合部位に結合している配列決定プライマーを伸長させることによって、アンプリコンを配列決定するステップとを含む、方法である。いくつかの実施形態では、ピロリドンまたはアミドは、

から選択される構造を有しており、式中、Ｒ１は、Ｈ、メチル、プロピル、またはヒドロキシエチルであり、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立してＨまたはメチルであり、Ｒ４は、Ｈ、プロピルまたはイソブチルであり、例えば、ピロリドンまたはアミドは、２－ピロリドン、Ｎ－メチル－ピロリドン、Ｎ－ヒドロキシエチルピロリドン、アセトアミド、Ｎ－メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、プロピオンアミド、イソブチルアミドから選択される。いくつかの実施形態では、配列決定は、ホルムアミド含有溶液を利用する方法と同等の性能特性を特徴とし、該特性は、標的での読み取り、重複排除深度、エラー率、均一性、およびＧＥ回収から選択される。例えば、特性は標的での読み取りであり、標的での読み取りは約７０％以上である。別の実施形態では、特性は重複排除深度であり、重複排除深度は２５００以上である。さらに別の実施形態では、特性はエラー率であり、エラー率は０．０４以下である。別の実施形態では、特性は均一性であり、均一性は約２．５である。別の実施形態では、特性はゲノム等価回収であり、ゲノム等価回収は０．２５以上である。

一実施形態では、本発明は、合成による単一分子配列決定によって配列決定されるべき標的核酸を濃縮するためのキットであって、試料溶液中の核酸を分離するための試薬、核酸をアダプターに共役させるための試薬であって、アダプターが、ユニバーサルプライマー結合部位および配列決定プライマー結合部位を含む、試薬、適応した標的核酸をユニバーサルプライマーで増幅して標的アンプリコンを形成するための試薬、増幅した適応標的核酸を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、炭酸エチレン、ピロリドンまたは第一級アミドから選択される溶媒を含むハイブリッド形成溶液中の結合部分に連結された１つ以上の一本鎖ハイブリッド形成プローブにハイブリッド形成させるための試薬を含む、キットである。いくつかの実施形態では、ピロリドンまたはアミドは、

から選択される構造を有しており、式中、Ｒ１は、Ｈ、メチル、プロピル、またはヒドロキシエチルであり、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立してＨまたはメチルであり、Ｒ４は、Ｈ、プロピルまたはイソブチルであり、例えば、ピロリドンまたはアミドは、２－ピロリドン、Ｎ－メチル－ピロリドン、Ｎ－ヒドロキシエチルピロリドン、アセトアミド、Ｎ－メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、プロピオンアミド、イソブチルアミドから選択される。いくつかの実施形態において、ハイブリッド形成緩衝液中のＤＭＳＯ濃度は、１５％、１８％、２０％、２３％、２５％、２８％、３０％、および３２％から選択される。

標的での読み取りの％によって測定した、配列決定ワークフローにおける２０％のホルムアミド置き換えのある新規ハイブリッド形成緩衝液の性能を示している。重複排除深度によって測定した、配列決定ワークフローにおける２０％のホルムアミド置き換えのある新規ハイブリッド形成緩衝液の性能を示している。均一性によって測定した、配列決定ワークフローにおける２０％のホルムアミド置き換えのある新規ハイブリッド形成緩衝液の性能を示している。エラー率によって測定した、配列決定ワークフローにおける２０％のホルムアミド置き換えのある新規ハイブリッド形成緩衝液の性能を示している。ゲノム等価回収によって測定した、配列決定ワークフローにおける２０％のホルムアミド置き換えのある新規ハイブリッド形成緩衝液の性能を示している。標的での読み取りの％によって測定した、配列決定ワークフローにおけるホルムアミド置き換えの力価のある新規ハイブリッド形成緩衝液の性能を示している。重複排除深度によって測定した、配列決定ワークフローにおけるホルムアミド置き換えの力価のある新規ハイブリッド形成緩衝液の性能を示している。均一性によって測定した、配列決定ワークフローにおけるホルムアミド置き換えの力価のある新規ハイブリッド形成緩衝液の性能を示している。ゲノム等価回収によって測定した、配列決定ワークフローにおけるホルムアミド置き換えの力価のある新規ハイブリッド形成緩衝液の性能を示している。標的での読み取りの％によって測定した、配列決定ワークフローにおける新規ＤＭＳＯ含有ハイブリッド形成緩衝液の性能を示している。重複排除深度によって測定した、配列決定ワークフローにおける新規ＤＭＳＯ含有ハイブリッド形成緩衝液の性能を示している。均一性によって測定した、配列決定ワークフローにおける新規ＤＭＳＯ含有ハイブリッド形成緩衝液の性能を示している。

定義
以下の定義は、本開示を理解する上で支援するものである。

「試料」という用語は、標的核酸を含有する、または含有すると推定されるいずれかの組成物を指す。該用語には、個体から分離された組織または体液の試料、例えば、皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血球、器官および腫瘍、およびまた個体から採取した細胞から確立したインビトロ培養物の試料も含まれ、ホルマリン固定／パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）およびそこから分離した核酸を含む。試料にはまた、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含有する無細胞血液画分などの無細胞材料も含まれてもよい。

「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および、これらの下位区分（ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）を含むヌクレオチドのポリマー（例えば、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドであって、天然および非天然の両方）を指す。核酸は一本鎖または二本鎖であってよく、概して５’－３’ホスホジエステル結合を含有することになるが、いくつかの場合では、ヌクレオチド類似体が他の結合を有していることがある。核酸には、天然の塩基（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシル、およびチミジン）および非天然の塩基が含まれることができる。非天然塩基のいくつかの例には、例えば、Ｓｅｅｌａｅｔａｌ．，（１９９９）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ８２：１６４０において説明されている非天然塩基が含まれる。非天然塩基は、特定の機能、例えば、核酸二重鎖の安定性の上昇、ヌクレアーゼ消化の抑制、またはプライマー伸長もしくは鎖重合の遮断を有することができる。

「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、相互交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の核酸である。オリゴヌクレオチドは、より短いポリヌクレオチドを説明するために時折使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知のいずれかの適切な方法によって、例えば、Ｎａｒａｎｇｅｔａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０－９９、Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９－１５１、Ｂｅａｕｃａｇｅｅｔａｌ．（１９８１）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２２：１８５９－１８６２、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉｅｔａｌ．（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５－３１９１において説明されるような直接的な化学合成を包含する方法によって調製される。

「ハイブリッド形成」という用語は、二重鎖（二本鎖核酸）を形成するための相補的な核酸の対形成を指す。ハイブリッド形成およびハイブリッド形成の強度（例えば、二重鎖の安定性）は、核酸間の相補性の程度、核酸のＧＣ含有量、ならびにハイブリッド形成の厳密性および関与する洗浄条件を含む複数の要因によって影響される。

「厳密な条件」または「高厳密性条件」という用語は、高安定性の二重鎖のみが形成されるハイブリッド形成条件を指す。高厳密性条件には、通常、低塩および高温のうちの１つ以上が含まれる。例えば、４２℃の従来の高厳密性ハイブリッド形成緩衝液には、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸が含有されていることがある。

「厳密な洗浄」という用語は、低濃度の塩または高濃度の界面活性剤を連続的に含有する洗浄緩衝液を用いた、ハイブリッド形成後の高温での洗浄を指す。厳密な洗浄の条件には、約４２℃を超える温度が含まれることがある。厳密な洗浄緩衝液組成物は、通常、約０．１Ｍ未満の塩を含有することになる。例えば、４２℃での従来の高厳密性のハイブリッド形成後洗浄は、０．２×ＳＳＣ（０．０３ＭＮａＣｌ、０．００３Ｍクエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミドを含有し、その後５５℃で０．１×ＳＳＣを用いて洗浄する。

「プライマー」という用語は、標的核酸における配列（「プライマー結合部位」）とハイブリッド形成し、かつこのような合成に適した条件下で核酸の相補鎖に沿った合成の開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。

「アダプター」という用語は、別の配列に追加の特性をもたらすために該配列に付加することができるヌクレオチド配列を意味する。アダプターは、通常、一本鎖もしくは二本鎖であることができるオリゴヌクレオチドであり、または一本鎖部分および二本鎖部分の両方を有していてもよい。

「ライゲーション」という用語は、ある分子の５’－リン酸基が別の分子の３’－ヒドロキシル基と反応する２つの核酸鎖を結合する縮合反応を指す。ライゲーションは通常、リガーゼまたはトポイソメラーゼによって触媒される酵素反応である。ライゲーションは、２つの一本鎖を結合して１つの一本鎖分子を生成することができる。ライゲーションはまた、各々が二本鎖分子に属する２本の鎖を結合する、したがって、２つの二本鎖分子を結合することもできる。ライゲーションはまた、二本鎖分子の両方の鎖を別の二本鎖分子の両方の鎖に結合する、したがって２つの二本鎖分子を結合することもできる。ライゲーションはまた、二本鎖分子内の鎖の両端を結合する、したがって二本鎖分子においてニックを修復することもできる。

「バーコード」という用語は、検出および同定することができる核酸配列を指す。バーコードは、さまざまな核酸に組み込むことができる。バーコードは十分に長く、例えば、２、５、２０ヌクレオチドであり、それにより試料では、バーコードを組み込んでいる核酸をバーコードによって識別または群分けすることができる。

「多重識別子」または「ＭＩＤ」という用語は、標的核酸の供給源（例えば、核酸が由来する試料）を識別するバーコードを指す。同じ試料からのすべてまたは実質的にすべての標的核酸は、同じＭＩＤを共有することになる。異なる供給源または試料からの標的核酸は、同時に混合および配列決定することができる。ＭＩＤを使用して、配列の読み取りを、標的核酸の出自である個々の試料に割り当てることができる。

「固有の分子識別子」または「ＵＩＤ」という用語は、付着している核酸を識別するバーコードを指す。同じ試料からのすべてまたは実質的にすべての標的核酸は、異なるＵＩＤを有することになる。元々の同じ標的核酸に由来するすべてまたは実質的にすべての後代（例えば、アンプリコン）は、同じＵＩＤを共有することになる。

「ユニバーサルプライマー」および「ユニバーサルプライミング結合部位」または「ユニバーサルプライミング部位」という用語は、異なる標的核酸に（通常、インビトロでの付加を経て）存在するプライマーおよびプライマー結合部位を指す。ユニバーサルプライミング部位は、アダプターを使用するか、または５’部分にユニバーサルプライミング部位を有する標的特異的（非ユニバーサル）プライマーを使用して、複数の標的核酸に付加される。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライミング部位に結合し、そこからプライマー伸長を指示することができる。

「標的配列」、「標的核酸」または「標的」という用語は、検出または分析されるべき試料中の核酸配列の一部を指す。標的という用語は、標的配列のすべての変異体、例えば、突然変異体の１つ以上の変異体および野生型変異体を含む。

「増幅」という用語は、標的核酸の追加のコピーを作製するプロセスを指す。増幅は、２つ以上のサイクル、例えば、指数関数的増幅の複数のサイクルを有することができる。増幅はまた、１サイクルしかないことがある（標的核酸の単一コピーを作製）。コピーは、追加の配列、例えば、増幅に使用されるプライマーに存在する配列を有することがある。

「配列決定」という用語は、標的核酸中のヌクレオチドの配列を決定するいずれかの方法を指す。「次世代配列決定」、「超並列配列決定」、および「超並列単一分子シーケンシング」は、分離された個々の核酸（または核酸アンプリコン）の集団全体の並列配列決定を指すために相互交換可能に使用される。

本発明は、配列決定が超並列単一分子配列決定とも称される次世代配列決定である核酸配列決定ワークフローを含む。いくつかの実施形態では、ワークフローは、核酸分離、配列決定用ライブラリーの調製、標的濃縮および配列決定のステップを含む。標的濃縮のステップは新規であり、配列決定プロセスと互換性のある（阻害または干渉しない）ホルムアミド代替物の使用を包含する、新規のホルムアミド非含有の組成物の使用および方法を含む。ホルムアミド代替物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、炭酸エチレン、ピロリドン、または第一級アミドなどの溶媒から選択される。ピロリドンまたは第一級アミドは、

から選択される構造を有しており、式中、Ｒ１は、Ｈ、メチル、プロピル、またはヒドロキシエチルであり、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立してＨまたはメチルであり、かつＲ４は、Ｈ、プロピルまたはイソブチルである。いくつかの実施形態において、ピロリドンまたはアミドは、２－ピロリドン、Ｎ－メチル－ピロリドン、Ｎ－ヒドロキシエチルピロリドン、アセトアミド、Ｎ－メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、プロピオンアミド、イソブチルアミドから選択される。

本発明は、試料中の標的核酸を検出することを含む。いくつかの実施形態では、試料は、対象または患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、例えば生検によって、対象または患者に由来する固形組織または固形腫瘍の断片を含むことができる。試料はまた、体液（例えば、尿、痰、血清、血漿またはリンパ液、唾液、痰、汗、涙、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹水、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液、および／または糞便の試料）も含むことができる。試料は、腫瘍細胞が存在することができる全血または血液画分を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料、特に液体試料は、無細胞腫瘍ＤＮＡまたは腫瘍ＲＮＡを含む無細胞のＤＮＡまたはＲＮＡなどの無細胞材料を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料は、無細胞試料、例えば、無細胞腫瘍ＤＮＡまたは腫瘍ＲＮＡが存在する無細胞血液由来試料である。他の実施形態では、試料は、培養試料、例えば、感染性試剤または感染性試剤に由来する核酸を含有するか、または含有すると疑われる培養物または培養上清である。いくつかの実施形態では、感染性試剤は、細菌、原生動物、ウイルス、またはマイコプラズマである。

標的核酸は、試料中に存在することができる、関心対象の核酸である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、遺伝子または遺伝子断片である。他の実施形態では、標的核酸は、一塩基多型もしくは一塩基変異体（ＳＮＶのＳＮＰ）を含む遺伝子変異体、例えば、多型、または、例えば、遺伝子融合をもたらす遺伝子再配列を含有している。いくつかの実施形態では、標的核酸は、バイオマーカーを含む。他の実施形態では、標的核酸は、特定の生物の特徴であり、例えば、病原性生物の同定、または病原性生物の特徴、例えば、薬物感受性もしくは薬物耐性を支援する。さらに他の実施形態では、標的核酸は、ヒト対象の特徴であり、例えば、対象の固有のＨＬＡ遺伝子型またはＫＩＲ遺伝子型を定義するＨＬＡ配列またはＫＩＲ配列である。さらに他の実施形態では、試料中のすべての配列は、例えば、ショットガンゲノム配列決定における標的核酸である。

いくつかの実施形態では、配列決定ワークフローは、標的核酸を増幅するステップを含む。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはオリゴヌクレオチドプライマーを利用するいずれかの他の方法によるものであることができる。さまざまなＰＣＲ条件は、ＰＣＲＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，ａｎｄＪ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ編，１９９５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）の第１４章ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ，ａｎｄＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０）において説明されている。

増幅は、標的特異的配列および後続のステップに必要とされる人工配列（アダプター配列）を含む二部増幅プライマーを利用することができる。いくつかの実施形態では、定義された標的または標的核酸のグループが調査されている。このような実施形態では、標的特異的増幅プライマーを使用することができる。プライマーは、３’部分の標的特異的配列および５’部分のアダプター配列から構成される二部構造を有することができる。通常、標的特異的プライマーは、別個のオリゴヌクレオチドの対として使用され、例えば、順方向および逆方向プライマーである。５’部分はまた、ユニバーサルプライマーによる増幅を可能にするためのユニバーサルプライマー結合部位を含むこともできる。５’部分はまた、配列決定プライマー、例えば、プラットフォーム特異的配列決定プライマーを用いた配列決定を可能にするための配列決定プライマー結合部位を含むこともできる。

いくつかの実施形態では、配列決定ワークフローは、ライブラリー調製のステップを含む。ライブラリーの調製は、アダプターのライゲーションから始まる。アダプターは、プライマー伸長、ＰＣＲ増幅、またはライゲーションのいずれかによって、標的核酸内へと導入される。いくつかの実施形態では、プライマー伸長は単一の回である。他の実施形態では、プライマー伸長は、複数のサイクル、例えば、ＰＣＲ増幅（前の節で明らかにしたような）を経る。得られた標的核酸は、アダプター配列に隣接する標的配列を含む。いくつかの実施形態において、アダプターは、下流のステップのためのプライマー結合部位、例えば、増幅プライマー結合部位および配列決定プライマー結合部位を含有している。

アダプターライゲーションは、平滑末端ライゲーション、またはより効率的な付着末端ライゲーションであることができる。いくつかの実施形態では、標的核酸またはアダプターは、鎖充填、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによって３’末端を伸長して５’オーバーハングを除去するか、または３’オーバーハングを３’－５’－エキソヌクレアーゼ活性で消化することによって、平滑末端にされることができる。いくつかの実施形態では、平滑末端アダプターおよび標的核酸は、例えばＤＮＡポリメラーゼまたは末端トランスフェラーゼによるアダプターの３’末端への単一のヌクレオチドの、および標的核酸の３’末端に相補的な単一のヌクレオチドの付加によって、付着性にすることができる。さらに他の実施形態では、アダプターおよび標的核酸は、制限エンドヌクレアーゼでの消化によって付着末端（オーバーハング）を獲得し得る。後者の選択肢は、制限酵素認識部位を含有することが公知である公知の標的配列にとってより有利である。先の実施形態の各々において、アダプター分子は、以下にさらに説明される合成アダプターオリゴヌクレオチドの設計によって、所望の末端（平滑一塩基伸長または多塩基オーバーハング）を獲得することができる。いくつかの実施形態では、アダプター分子は、インビトロ合成人工配列である。他の実施形態では、アダプター分子は、所望の二次構造を有することが公知のインビトロで合成された天然配列である。さらに他の実施形態では、アダプター分子は、分離した天然分子または分離した非天然分子である。

配列決定ワークフローのいくつかの実施形態では、アダプターは、１つ以上のバーコードを含む。バーコードは、試料が混合（多重化）される試料の源を同定するために使用される多重試料ＩＤ（ＭＩＤ）であってもよい。バーコードはまた、各元の分子およびその後代を同定するために使用される固有分子ＩＤ（ＵＩＤ）としても機能する。バーコードはまた、ＵＩＤとＭＩＤとの組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、単一のバーコードが、ＵＩＤおよびＭＩＤの両方として使用される。いくつかの実施形態では、各バーコードは、所定の配列を含む。他の実施形態では、バーコードは、ランダム配列を含む。バーコードは１～２０ヌクレオチド長であり得る。

本発明の方法は、新規の標的濃縮ステップを含む。濃縮は、１つ以上の標的特異的プローブへのハイブリッド形成を介して標的配列を捕捉することによって行うことができる。いくつかの実施形態では、ハイブリッド形成プローブは、複数の遺伝子座からの複数のエキソン、イントロン、もしくは調節配列を標的とする１つ以上の配列、または少なくとも１つの単一の遺伝子座の完全な配列を含み、該遺伝子座は、約１００ｋｂ～約１Ｍｂの大きさを有する。

いくつかの実施形態では、配列決定ワークフローの新規ハイブリッド形成溶液は、Ｍａｔｔｈｉｅｓｅｎ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，（２０１２）ＦａｓｔａｎｄＮｏｎ－ＴｏｘｉｃＩｎＳｉｔｕＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｏｕｔＢｌｏｃｋｉｎｇｏｆＲｅｐｅｔｉｔｉｖｅＳｅｑｕｅｎｃｅｓＰＬｏＳＯＮＥ，７：ｅ４０６７５または米国特許第９，３０３，２８７号において説明される溶媒を含む。いくつかの実施形態では、ホルムアミドの置き換えは、Ｈａｎｓｅｎ，Ｃｈａｒｌｅｓ（２００７）．ＨａｎｓｅｎＳｏｌｕｂｉｌｉｔｙＰａｒａｍｅｔｅｒｓ：Ａｕｓｅｒ’ｓｈａｎｄｂｏｏｋ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ．ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌａ：ＣＲＣＰｒｅｓｓにおいて説明されているように、そのハンセン溶解度パラメータに基づいて選択される極性非プロトン性溶媒である。パラメータは、溶媒のある特定のエネルギー特性を測定し、ＭＰａ^０．５で表される。具体的には、溶媒は、そのＤパラメータが１７．７～２２．０ＭＰａ^０．５であった場合に選択され、Ｐパラメータは、１３～２３ＭＰａ^０．５、およびＨパラメータは３～１３ＭＰａ^０．５である。

いくつかの実施形態では、配列決定ワークフローの新規のハイブリッド形成溶液は、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｒ．ｅｔａｌ．（２００１）ＴｈｅｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙｌｏｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔａｍｉｄｅｓ．Ｎ．Ａ．Ｒ．２９：２３７７において説明される溶媒を含む。いくつかの実施形態において、ホルムアミドの置き換えは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、炭酸エチレン、ピロリドンおよび第一級アミドから選択される溶媒である。いくつかの実施形態では、ピロリドンまたはアミドは、

から選択される構造を有しており、式中、Ｒ１は、Ｈ、メチル、プロピル、またはヒドロキシエチルであり、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立してＨまたはメチルであり、かつＲ４は、Ｈ、プロピルまたはイソブチルである。いくつかの実施形態では、溶媒は、２－ピロリドン、Ｎ－メチル－ピロリドン、Ｎ－ヒドロキシエチルピロリドン、アセトアミド、Ｎ－メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、プロピオンアミド、イソブチルアミドから選択される。

試料中の核酸は、一本鎖であるか、または変性して、本発明によるホルムアミド置き換えを含有する新規のハイブリッド形成緩衝液中で一本鎖標的特異的プローブと接触する。プローブは、ハイブリッド形成複合体が形成された後、親和性捕捉部分を提供することによって該複合体が捕捉されるように、親和性捕捉部分に対するリガンドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、親和性捕捉部分はアビジンまたはストレプトアビジンであり、リガンドはビオチンである。リガンド捕捉部分の他の例には、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニンおよび６ＨＩＳ／ニッケルが含まれる。いくつかの実施形態では、該捕捉部分は、固体支持体に結合している。固体支持体は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）磁気ビーズなどの超常磁性球状ポリマー粒子または磁気ガラス粒子、などの懸濁粒子を含むことができる。

本発明の実施形態では、変性した（例えば、一本鎖の）核酸分子を含有する試料は、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有するホルムアミド非含有ハイブリッド形成緩衝液に曝露される。

プローブは通常、遺伝子座ごとに１つ以上の捕捉プローブを使用して、１つ以上のゲノム遺伝子座を標的にする。いくつかの実施形態では、プローブは、癌関連遺伝子およびを含む腫瘍関連遺伝子座のパネルなど、疾患関連遺伝子のパネルを標的とする。いくつかの実施形態では、パネルには、腫瘍プロファイリングのための標的とされるパネル、拡大腫瘍プロファイリングのための拡張パネル、および縦断的腫瘍負荷モニタリングのための監視パネル（ＲｏｃｈｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，Ｃａｌ）から選択されるＡＶＥＮＩＯｃｔＤＮＡパネルが含まれる。プローブは、溶液中に存在することもあれば、ビーズまたはマイクロアレイなどの固体支持体に結合していることもある。プローブは、標的核酸配列にハイブリッド形成する（すなわち、捕捉する）。その後のハイブリッド形成後の洗浄により、ハイブリッド形成されていない核酸、例えば、ゲノムの過剰なプローブおよび非ハイブリッド形成領域、またはその他の非標的サンプル核酸が、ハイブリッド形成された標的配列から分離される。いくつかの実施形態では、ハイブリッド形成洗浄は、低塩および高温の片方または両方を含む厳密な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、洗浄は、標準のかつ厳密な洗浄緩衝液中で４７℃または室温で行われる。

いくつかの実施形態では、本発明は、核酸配列決定によって試料中の標的核酸を検出することを含む。本発明の方法によって捕捉されたすべての核酸を含む複数の核酸を配列決定することができる。

いくつかの実施形態では、配列決定は、ＨｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑおよびＮｅｘｔＳｅｇ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌ．）を含むイルミナプラットフォームなどの合成方法による高処理量単一分子配列決定によるものである。配列決定方法およびプラットフォームの他の例には、合成による配列決定ＨｅｌｉｃｏｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）、いずれもＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の、ライゲーションによる配列決定（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標））、およびイオン半導体配列決定（例えば、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（商標））、ＳＭＲＴ技術を利用したＰａｃｉｆｉｃＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓプラットフォーム（ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，Ｃａｌ．）またはＯｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）もしくはＲｏｃｈｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（ＳａｎｔａＣｌａｒａ，Ｃａｌ．）によって製造されるものなど、ナノポア技術を利用するプラットフォーム、および合成による配列決定を包含するまたは包含しないその他の既存のまたは将来のＤＮＡ配列決定技術が含まれる。配列決定ステップでは、プラットフォーム特異的配列決定プライマーを利用することができる。これらのプライマーについての結合部位は、本明細書に説明する本発明の方法において、すなわち、アダプターまたは増幅プライマーの一部であることによって導入することができる。

いくつかの実施形態では、新規のホルムアミド非含有溶液を利用する方法は、配列決定に関連する性能特性を特徴とする。特性は、標的での読み取り、重複排除深度、エラー率、均一性、およびゲノム等価回収から選択される。図１、図２、図３、および図４に示すように、ハイブリッド形成溶液中にホルムアミド置き換えが２０％存在するとき、該特性は、ハイブリッド形成溶液を含有するホルムアミドの特性と同等以上である。一態様では、標的での読み取り特性は、標的領域（パネルによって定義）に対して読み取ったマッピングのいずれかの部分を用いてマッピングされた読み取りの百分率として決定される。図１に示すように、標的での読み取りは、ホルムアミド含有ハイブリッド形成緩衝液および新規のホルムアミド非含有ハイブリッド形成緩衝液の両方について約７０％以上である。一態様では、重複排除深度特性は、重複排除後に測定された標的での読み取りの平均深度として決定される。図２に示すように、重複排除深度は、ホルムアミド含有ハイブリッド形成緩衝液および新規のホルムアミド非含有ハイブリッド形成緩衝液の両方について２５００以上である。一態様では、均一性特性は、第９０／第１０の比、または第９０百分位数塩基区間変量／第１０百分位数塩基区間変量の比として決定される。図３に示すように、ホルムアミド含有ハイブリッド形成緩衝液および新規のホルムアミド非含有ハイブリッド形成緩衝液の両方についての均一性は、２．５以上である。一態様では、エラー率特性は、非参照対立遺伝子を有するすべての読み取り内でのすべての塩基の百分率として決定され、計算は、１）少なくとも２００の合計読み取り深度を有する位置（バーコード重複排除後）、および２）非参照塩基の対立遺伝子の割合が最大で５％である。図４に示すように、ホルムアミド含有ハイブリッド形成緩衝液および新規のホルムアミド非含有ハイブリッド形成緩衝液の両方についてのエラー率は、０．００５％以下である。一態様では、ＧＥ（ゲノム等価）回収特性は、回収されたゲノム等価物の数として決定される。図５に示すように、ホルムアミド含有ハイブリッド形成緩衝液および新規のホルムアミド非含有ハイブリッド形成緩衝液の両方についてのＧＥ（ゲノム等価）回収は、０．２～０．３である。図６，図７、図８および図９によって示すように、ハイブリッド形成溶液中でホルムアミド置き換え量を滴定すると、性能特性がホルムアミド含有ハイブリッド形成溶液と同等以上である最適なものを見つけることができる。

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の標的濃縮および配列決定法を実施するためのキットである。キットは、スルホラン、炭酸エチレン、ピロリドンまたは第一級アミドから選択される溶媒、および以下の１つ以上を含むホルムアミド非含有ハイブリッド形成溶液を含む：アダプター、ユニバーサル増幅プライマー、ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ）、ポリヌクレオチドキナーゼ、および増幅ポリメラーゼまたは配列決定ポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ。いくつかの実施形態において、キットはまた、Ｔ５エキソヌクレアーゼなどの５’－３’活性を有するエキソヌクレアーゼを含む。

実施例１．ホルムアミド置き換えの炭酸プロピレン、スルホラン、および２－ピロリドンを使用した配列決定ワークフロー

簡単に説明すると、この例では、ＡＶＥＮＩＯｃｔＤＮＡアッセイ（ＲｏｃｈｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，Ｃａｌ．）により配列決定ワークフローを行ったが、標的捕捉プロトコルのハイブリッド形成ステップでは、ホルムアミドを炭酸プロピレン、スルホラン、および２－ピロリドンから選択される非プロトン性溶媒のうちの１つと置き換えたことを例外とした。捕捉されたライブラリーは、イルミナＮｅｘｔＳｅｑ５００（Ｉｌｕｍｉｎａ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌ．）で配列決定した。ホルムアミド置き換えの存在下で捕捉したライブラリーの配列決定結果は、ホルムアミド対照に匹敵する、水対照よりも大幅に良好な結果を実証した。ワークフローには、ＤＮＡ断片化、アダプターライゲーションおよびＰＣＲ増幅を含むライブラリー調製、標的濃縮、ハイブリッド形成後の浄化、および配列決定のステップが含まれていた。

ＤＮＡ断片化ステップは、製造元の推奨によりＫＡＰＡＦｒａｇＫｉｔ（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｒｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）を使用して行った。簡単に説明すると、１００ｎｇのＮＡ１２８７８ゲノムＤＮＡを（ＫＲ１１４１）を使用して３７℃で酵素で断片化し、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。ＤＮＡは、Ｑｕｂｉｔの断片化品質を使用して定量し、ＨｉｇｈＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒＫｉｔで評価した。

ライブラリー調製ステップでは、３０ｎｇの断片化ＮＡ１２８７８を利用した。ＡＶＥＮＩＯキットのユニバーサルアダプター溶液１０μｌを各試料に添加し、１６℃で１６～１８時間ライゲートした。ライゲートしたＤＮＡを、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、ＰＣＲ増幅において使用した。

ＰＣＲステップでは、バーコード固有のユニバーサルプライマーおよび以下の温度プロファイルを利用した。

ライゲートしたＤＮＡを増幅したものを、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、標的濃縮ステップにおいて使用した。そのステップの前に、Ｑｕｂｉｔを使用してライブラリーを定量し、ＨｉｇｈＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒＫｉｔでライブラリー断片の大きさを評価した。

標的濃縮ステップでは、３０μｌのアダプターライゲーション試料を利用した。反応には、ＡＶＥＮＩＯキットからのＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、および濃縮オリゴを含めており、製造元のプロトコルにより行ったが、ハイブリッド形成溶液に以下のうちの１つを含めたことを例外とした。

試料を以下の温度プロファイルに供した。

ハイブリッド形成洗浄ステップでは、４７℃および室温で標準のかつ厳密なＡＶＥＮＩＯハイブリッド形成洗浄緩衝液を利用した。ハイブリッド形成した核酸をストレプトアビジンビーズに捕捉し、ＰＣＲ増幅ステップにおいて使用した。

ＰＣＲ増幅ステップでは、ストレプトアビジンビーズに結合した２０μＬのＤＮＡを利用した。ＰＣＲ反応混合物を添加した後、反応を以下の温度プロファイルに供した。

ＰＣＲ産物は、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。ＤＮＡの量および質は、ＱｕｂｉｔおよびＨｉｇｈＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒＫｉｔを使用して評価した。次に、ＰＣＲ産物は、製造元のプロトコルにより、ＮｅｘｔＳｅｑ５００／５５０で配列決定した。

結果を図１，図２、図３、図４および図５に示す。

実施例２．滴定したホルムアミド置き換え物である炭酸プロピレン、スルホラン、および２－ピロリドンを使用した配列決定ワークフロー

この例では、配列決定ワークフローを実施例１に置いて説明したとおり行ったが、以下の濃度の以下のホルムアミド置き換えを使用したことを例外とした。

結果を図６、図７、図８および図９に示す。

実施例３．ホルムアミド置き換えＤＭＳＯを使用した配列決定ワークフロー
簡単に説明すると、ＡＶＥＮＩＯ腫瘍組織ＤＮＡアッセイ（ＲｏｃｈｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，Ｃａｌ．）により行ったが、標的捕捉プロトコルのハイブリッド形成ステップにおいて、ホルムアミドをＤＭＳＯに置き換えたことを例外とした。捕捉されたライブラリーは、イルミナＮｅｘｔＳｅｑ５００（Ｉｌｕｍｉｎａ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌ．）で配列決定し、ＤＭＳＯの存在下で捕捉したライブラリーの配列決定結果は、ホルムアミド対照に匹敵する、水対照よりも大幅に良好な結果を実証した。ワークフローには、ＤＮＡ研磨、ＤＮＡ断片化、アダプターライゲーションおよびＰＣＲ増幅を含むライブラリー調製、標的濃縮、ハイブリッド形成後の浄化、ハイブリッド形成後の増幅および配列決定を含むステップが含まれていた。

ＤＮＡ研磨ステップは、製造元の説明書によりＡＶＥＮＩＯ腫瘍組織ＤＮＡキットに含まれるＤＮＡ研磨酵素を利用した。実施例１に説明したように、ＤＮＡ断片化ステップを行った。Ａ－テーリングおよびアダプターライゲーションを含むライブラリー調製ステップは、本質的に、細胞株ＨＤ７８９（ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙ）からの２０ｎｇのゲノムＤＮＡを利用した実施例１において説明したように行った。ＡＶＥＮＩＯキットのユニバーサルアダプターのライゲーションは、１６℃で１６～１８時間行った。ライゲートしたＤＮＡを、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、ＰＣＲ増幅において使用した。増幅は、実施例１において列挙した温度プロファイルを利用した。

標的濃縮ステップでは、３０μｌのアダプターライゲーション試料を利用した。反応には、ＡＶＥＮＩＯキットのハイブリッド形成補助物質、浄化ビーズ、および濃縮オリゴが含まれており、製造元のプロトコルにより行ったが、ハイブリッド形成溶液に２０％ホルムアミド（対照）または以下の濃度のＤＭＳＯが含まれていることを例外とした。１５％、１８％、２０％、２３％、２５％、２８％、３０％、３２％、３８％および４０％。

試料を以下の温度プロファイルに供した。

ハイブリッド形成洗浄ステップでは、５５℃および室温で標準のかつ厳密なＡＶＥＮＩＯハイブリッド形成洗浄緩衝液を利用した。ハイブリッド形成した核酸をストレプトアビジンビーズに捕捉し、ＰＣＲ増幅ステップにおいて使用した。捕捉後のＰＣＲ増幅は、実施例１において説明したように行った。

ＤＭＳＯ濃度：１５％、１８％、２０％、２３％、２５％、２８％、３０％、３２％、３５％、３８％および４０％についての結果を図１０、図１１、および図１２に示す（が例外として、３５％、３８％、および４０％のＤＭＳＯを用いた条件からは、配列データは取得できなかった）。

Claims

核酸の溶液中の標的核酸を濃縮する方法であって、
ａ．試料溶液中の核酸を分離するステップと、
ｂ．前記試料溶液を、結合部分に連結された１つ以上の一本鎖ハイブリッド形成プローブを含み、かつ２－ピロリドンをさらに含むホルムアミド非含有ハイブリッド形成溶液と接触させるステップと、
ｃ．前記試料核酸と前記プローブとの間のハイブリッドの形成を促進する条件下で、前記試料をインキュベートするステップと、
ｄ．前記結合部分を捕捉することにより前記ハイブリッドを分離するステップとを含む、方法。
合成による単一分子配列決定によって配列決定されるべき標的核酸を濃縮する方法であって、
ａ．試料溶液中の核酸を分離するステップと、
ｂ．前記核酸をアダプターに共役させるステップであって、前記アダプターが、ユニバーサルプライマー結合部位および配列決定プライマー結合部位を含む、ステップと、
ｃ．前記適応した標的核酸をユニバーサルプライマーで増幅して標的アンプリコンを形成するステップと、
ｄ．前記試料を、結合部分に連結された１つ以上の一本鎖ハイブリッド形成プローブを含み、かつ２－ピロリドンをさらに含むホルムアミド非含有ハイブリッド形成溶液と接触させるステップと、
ｅ．前記標的アンプリコンと前記プローブとの間のハイブリッドの形成を促進する条件下で、前記試料をインキュベートするステップと、
ｆ．前記結合部分を捕捉することにより前記ハイブリッドを分離するステップと、
ｇ．前記ハイブリッドからアンプリコンを放出するステップとを含む、方法。
標的核酸を配列決定する方法であって、
ａ．試料溶液中の核酸を分離するステップと、
ｂ．前記核酸をアダプターに共役させるステップであって、前記アダプターが、ユニバーサルプライマー結合部位および配列決定プライマー結合部位を含む、ステップと、
ｃ．前記適応した標的核酸をユニバーサルプライマーで増幅して標的アンプリコンを形成するステップと、
ｄ．前記試料を、結合部分に連結された１つ以上の一本鎖ハイブリッド形成プローブを含み、かつ２－ピロリドンをさらに含むホルムアミド非含有ハイブリッド形成溶液と接触させるステップと、
ｅ．前記標的アンプリコンと前記プローブとの間のハイブリッドの形成を促進する条件下で、前記試料をインキュベートするステップと、
ｆ．前記結合部分を捕捉することにより前記ハイブリッドを分離するステップと、
ｇ．前記ハイブリッドからアンプリコンを放出し、前記配列決定プライマー結合部位に結合している配列決定プライマーを伸長させることによって、前記アンプリコンを配列決定するステップとを含む、方法。