JP5330830B2 - ポリメラーゼ反応のために核酸を活性化する方法 - Google Patents

ポリメラーゼ反応のために核酸を活性化する方法 Download PDF

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Description

本発明は、核酸、特にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、ポリメラーゼ反応、特に鎖置換反応のために活性化する方法に関する。
核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性とは、本発明の意味では、ポリメラーゼ反応と理解され、遊離３'−ＯＨ末端でのヌクレオチドのポリマー化によって相補鎖がテンプレートの役割を果たす。遊離３'−ＯＨ末端からおそらく３'にある鎖はそれによって置換されうるか（鎖置換反応、下記参照）、または、これはまたポリメラーゼの５'−３'エキソヌクレアーゼ活性によっても切断され、および新しく合成された鎖で置換されうる（たとえばニック置換反応で）。
鎖置換反応（ＳＤＲ）は、オリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ反応を開始できる方法であり、それによって反応中に二本鎖核酸の「古い」鎖の剥離（「鎖置換」）が、もう一方の「古い」（相補）鎖へのオリゴヌクレオチドの結合を可能にするためにもう一方の「古い」鎖によって影響されうる。その反応に重要なのは開始であり、それによってさまざまな方法を区別することができる：
（Ａ）二本のハイブリダイズした核酸鎖（たとえばＤＮＡ鎖）の分離が、９５℃での熱変性によって起こりうる。これらの温度では、二本のＤＮＡ鎖は明らかに互いに分離し、そのためオリゴヌクレオチドが、変性した（たとえば互いに分離した）ＤＮＡ鎖へ結合しうる。ＳＤＲの開始はその時に起こりうる（たとえばゲノミファイ・キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ−Ｋｉｔ）の手順書、アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ）、ドイツ、フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）ｉ．Ｂｒ．）。にもかかわらず、この方法は重要な欠点を有する：９５℃への加熱は、たとえば脱プリンまたは鎖切断による、ＤＮＡへの損傷に繋がる（（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）Ｔ．，オオスミ（Ｏｈｓｕｍｉ）Ｓ．，マキノ（Ｍａｋｉｎｏ），Ｋ．（１９９４）、オリゴデオキシリボヌクレオチドにおける脱プリンおよび非プリン部位鎖切断に関する力学的研究（Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｕｒｉｎｉｃ ｓｉｔｅ ｃｈａｉｎ ｂｒｅａｋａｇｅ ｉｎ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（２３）： ４９９７−５００３）。
（Ｂ）二本のハイブリダイズした核酸鎖（ＤＮＡ鎖）の分離はまた、アルカリ変性によって起こりうる（レプリ−ｇ（ＲＥＰＬＩ−ｇ）キットの手順書、キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））。しかし、これは、アルカリの添加後にアルカリを中和しなければならないという欠点を有する。これはピペッティング段階の追加、および反応環境の変化を意味する。
（Ｃ）次の方法は、鎖分離の達成を試みるのでなく、個々の鎖切断に、ポリメラーゼ反応を開始できるその３'−ＯＨ末端で挿入するエンドヌクレアーゼを利用する（例．たとえばＵＳ６，８８４，５８６）。
（ｄ）最後に、四番目の方法は、たとえばノトミ（Ｎｏｔｏｍｉ）Ｔ．，オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）Ｈ．，マスブチ（Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ）Ｈ．，ヨネカワ（Ｙｏｎｅｋａｗａ）Ｔ．，ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）Ｋ．，アミノ（Ａｍｉｎｏ）Ｎ．，ハセ（Ｈａｓｅ）Ｔ．（２０００）、ＤＮＡのループ媒介性等温増幅（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５； ２８（１２）：Ｅ６３によって記載される通り、変性を利用しない。しかし、おそらくＤＮＡに含まれる個々の鎖切断がＳＤＲでの伸長に用いられるため、これは明らかにより悪い結果に繋がる。
したがって本発明の課題は、上記の先行技術の欠点を有しない、核酸、特にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の、鎖置換反応のための活性化の方法を特定することである。本発明は、
（ａ）核酸を温度５５℃から８０℃へ加熱、
（ｂ）核酸をポリメラーゼが活性に実質的低下を示さない温度へ冷却、および
（ｃ）ポリメラーゼの核酸への添加によってポリメラーゼ反応を開始
：の段階を含むポリメラーゼ反応のために核酸を活性化する方法によってこの課題を達成する。
使用するポリメラーゼは熱不安定性または熱安定性でありうる。熱安定性ポリメラーゼを使用する際には、ポリメラーゼ反応のために核酸を活性化する本発明に記載の方法は代替的に、
（ａ）核酸を熱安定性ポリメラーゼと共に温度５５℃から８０℃へ加熱
：の段階を含みうる。
本発明の他の有利な実施形態を、請求項、説明、実施例および図面に示す。
下記に、使用する用語の一部をよりよく説明する。
鎖置換反応（ＳＤＲ）：鎖置換反応はここでは、鎖置換活性を有するポリメラーゼが用いられるか，または鎖置換を可能にする反応条件が用いられる、すべての反応を意味すると理解される。これらの例は、ちょうど多置換増幅（ＭＤＡ）またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）のような鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および、たとえば制限支援ＲＣＡ（ＲＣＡ−ＲＣＡ）またはネステッドプライマーを用いるＭＤＡ、線形および指数鎖置換反応またはやはりヘリカーゼ依存性増幅のような、これらの反応のすべての従属形である（例．たとえば欧州特許出願番号２００５０１１２６３９、２００５００７４８０４、２００５００６９９３９および２００５００６９９３８、およびワング（Ｗａｎｇ）Ｇ．，マーハー（Ｍａｈｅｒ）Ｅ．，ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）Ｃ．，チン（Ｃｈｉｎ）Ｌ．，レオ（Ｌｅｏ）Ｃ．，カウル（Ｋａｕｒ）Ｍ．，ズー（Ｚｈｕ）Ｐ．，ルック（Ｒｏｏｋ）Ｍ．，ウォルフェ（Ｗｏｌｆｅ）Ｊ．Ｌ．，マクリジオルゴス（Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ） Ｇ．Ｍ．（２００４），試料分解に強いＤＮＡ増幅法（ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏｌｅｒａｎｔ ｔｏ ｓａｍｐｌｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．Ｎｏｖ；１４（１１）：２３５７−２３６６； ミラ（Ｍｉｌｌａ）Ｍ．Ａ．，スピアーズ（Ｓｐｅａｒｓ）Ｐ．Ａ．，ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）Ｒ．Ｅ．，ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）Ｇ．Ｔ．（１９９８），鎖置換増幅における制限酵素ＡｖａＩおよびｅｘｏ−Ｂｓｔ ポリメラーゼの使用（Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ＡｖａＩ ａｎｄ ｅｘｏ−Ｂｓｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｍａｒ；２４（３）：３９２−３９６；ナガミネ（Ｎａｇａｍｉｎｅ）Ｋ．，ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）Ｋ．，オオツカ（Ｏｈｔｓｕｋａ）Ｋ．，ハセ（Ｈａｓｅ）Ｔ．，ノトミ（Ｎｏｔｏｍｉ）Ｔ．（２００１），非変性テンプレートを用いるループ媒介性等温増幅反応（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｎｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ），Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．４７（９）：１７４２−１７４３；ノトミ（Ｎｏｔｏｍｉ）他２００１（上記参照）；ラージ（Ｌａｇｅ）Ｊ．Ｍ．，リーモン（Ｌｅａｍｏｎ）Ｊ．Ｈ．，ペヨヴィク（Ｐｅｊｏｖｉｃ）Ｔ．，ハマン（Ｈａｍａｎｎ）Ｓ．，レーシー（Ｌａｃｅｙ）Ｍ．，ディロン（Ｄｉｌｌｏｎ）Ｄ．，セグレーブス（Ｓｅｇｒａｖｅｓ）Ｒ．，ボスブリンク（Ｖｏｓｓｂｒｉｎｃｋ）Ｂ．，ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ）Ａ．，ピンケル（Ｐｉｎｋｅｌ）Ｄ．，アルバートソン（Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ）Ｄ．Ｇ．，コスタ（Ｃｏｓｔａ）Ｊ．，リザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）Ｐ．Ｍ．（２００３），高分枝鎖置換増幅およびアレイＣＧＨを用いる低分子ＤＮＡ試料における遺伝子変化の全ゲノム分析（Ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｍａｌｌ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｒｒａｙ−ＣＧＨ），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３（２）：２９４−３０７； および Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｍ．，Ｘｕ Ｙ．，Ｋｏｎｇ Ｈ．（２００４），ヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅（Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｅｎｄｅｎｔ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ），ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．５（８）：７９５−８００）。
鎖置換ポリメラーゼ：鎖置換を実行できるすべてのポリメラーゼは鎖置換ポリメラーゼである。これらの例は、ｐｈｉ２９−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、Ｃｐ−１−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、ＰＲＤ１−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、ｐｈｉ１５−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、ｐｈｉ２１−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、ＰＺＥ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、ＰＺＡ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、Ｎｆ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、Ｍ２Ｙ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、Ｂ１０３−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、ＳＦ５−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、ＧＡ−１−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、Ｃｐ−５−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、Ｃｐ−７−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、ＰＲ４−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、ＰＲ５−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、ＰＲ７２２−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、Ｌ１７−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）ＤＮＡ−ポリメラーゼ、ベント（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、ディープベント（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼＩＩＩシステムおよびＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼのような酵素である。鎖置換ポリメラーゼはまた、変異形、たとえばいわゆるエキソマイナス変異体（すなわちエキソヌクレアーゼ活性無し）として存在しうる。
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は生物内に天然に存在するが、しかしＤＮＡはまた生物外にも存在可能であり、または生物に加えられた可能性がある。ＤＮＡの長さは変化しうる。ＤＮＡは変異によって改変されうる。ＤＮＡ塩基は修飾されうる。核酸は，塩基アナログ（たとえばまた非プリンまたは非ピリミジンアナログ）またはヌクレオチドアナログ（たとえばＰＮＡ）を含みうる。ＤＮＡは、たとえばタンパク質またはアミノ酸のような付属物を含みうる。
本発明は、したがって、核酸（特に二本鎖ＤＮＡ）を鎖置換反応のために活性化する方法に関し、よって方法は下記の段階を含む：（ａ）核酸を（従来法に比較して、中等度の）温度５５℃から８０℃へ加熱；（ｂ）核酸をポリメラーゼが活性に実質的低下を示さない温度へ冷却；および（ｃ）鎖置換反応をポリメラーゼの核酸への添加によって開始。現在までに使用されている方法で用いられる９５℃の高温は、上記の通り、使用される核酸（たとえばＤＮＡ）が鎖切断および脱プリンによって相当に損傷されるために負の作用を有するが、本発明に記載の方法を用いて回避されうる。同様に不利な付随状況を伴うアルカリ処理による二本鎖核酸の分離もまた、新しい方法を用いて見送ることができる。本発明に記載の方法はしたがって、使用する核酸を保存しながら鎖置換反応を準備および実施する可能性を提供する。本発明に記載の方法は、好ましくは熱不安定性ポリメラーゼが使用されるようになるならば採用される。本発明の場合では、ポリメラーゼが６５℃での１０分間の処理後に初期活性の最大２０％の活性しか有しないならば、すなわちポリメラーゼが少なくとも８０％不活性化されているならば、ポリメラーゼは熱不安定性と呼ばれる。
上記の変異体は、好ましくは熱不安定性ポリメラーゼが使用されるようになるならば採用される。しかし、少なくとも、最高８０℃、好ましくは最高７０℃、および特に好ましくは最高６５℃までの短時間加熱を特記すべき活性の損失無しに耐える熱安定性ポリメラーゼが使用されるならば、これは段階（ａ）で既に添加でき、およびポリメラーゼの添加前の反応物の冷却は省略できる。代替法はしたがって、段階（ａ）核酸を（従来法に比較して、中等度の）温度５５℃から８０℃へ加熱を含む。本発明の意味では、熱安定性ポリメラーゼは、すべての非熱不安定性ポリメラーゼを意味すると理解される。
細胞または単離ＤＮＡが加熱される中等度の温度は、５５℃ないし８０℃、好ましくは６０℃ないし７０℃および特に好ましくは６５℃である。細胞のＤＮＡの加熱は、たとえばＳＤＲ反応混合物中で直接起こりうる。
本発明は、中等度の加熱段階による、鎖置換反応のための核酸（特にＤＮＡ）の活性化を記載する。本発明に記載の方法は、単離された核酸（ＤＮＡ）および熱不安定性鎖置換ポリメラーゼの使用の部分として下記の部分段階を同様に含む：（１）核酸（ＤＮＡ）を中等度に高い温度へ加熱する。（２）核酸（ＤＮＡ）を冷却し、それによって冷却処理後の温度の最高温度は、ポリメラーゼがその活性をまだ明らかに失わない温度でありうる。核酸は好ましくは温度４℃から４５℃へ、特に好ましくは１５℃から４２℃の領域へ、および真に特に好ましくは２５℃から３７℃の領域へ冷却される。（３）ＳＤＲ反応は（熱不安定性）ポリメラーゼの添加によって開始される。
熱不安定性ポリメラーゼが使用されるならば、上記の変異体は好ましくはその後に用いられる。しかし熱安定性ポリメラーゼが使用されるならば、これは段階（１）で既に添加されうる。
本発明に記載の方法は、純粋なまたは精製されたＤＮＡだけでなく、細胞の結合にまだ含まれているＤＮＡにも使用されうる。細胞の結合にまだ含まれているＤＮＡの、および熱不安定性鎖置換ポリメラーゼの使用のための方法は、同様に下記の部分段階を有する：（１）核酸（ＤＮＡ）を中等度の高温へ加熱する。（２）ＤＮＡを含む細胞を冷却し、それによって冷却処理後の温度は、ポリメラーゼがその活性をまだ明らかに失わない温度が最高温度でありうる。（３）ＳＤＲ反応はポリメラーゼの添加によって開始される。
両方の方法において、熱不安定性鎖置換ポリメラーゼはまた、熱安定性鎖置換ポリメラーゼに交換されうる。ひいては部分段階（１）はそのポリメラーゼを用いて直接実施されうる。
本発明は実施例によって下記により詳細に記載される。
実施例１
本実施例は、単純な温度活性化段階によって、全血から開始するＳＤＲ（ここでは多置換増幅、ＭＤＡ）が可能になり、ＤＮＡ収量およびＤＮＡ品質に関しては先行技術に記載の反応（対照反応）と同等であるのを示す。
本発明に記載の反応：ＭＤＡ反応はレプリ−ｇ（ＲＥＰＬＩ−ｇ）試薬（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））を用いて実施した。ＥＤＴＡまたはクエン酸で安定化した、必要に応じて０．５、１および２μｌの全血を、１２．５μｌの４ｘ反応混合物（これはランダム配列を有するオリゴヌクレオチド、反応緩衝溶液およびｄＮＴＰを含む）および水で体積３９．５μｌとし、および次いで６５℃へ加熱した。室温（約２０〜２５℃）へ冷却後、レプリ−ｇキットからのＤＮＡポリメラーゼを加えた。反応を次いで３０℃にて６時間実施した。
先行技術に記載の対照反応：ＭＤＡ反応はレプリ−ｇ（ＲＥＰＬＩ−ｇ）試薬（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））を用いて実施した：ＥＤＴＡで安定化した全血０．５μｌを、２．５μｌのリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ、キアゲン社のレプリ−ｇキットより）で置換した。続いて、３．５μｌの新たに加えた変性緩衝溶液（３６０ ｍＭ ＫＯＨ、９ ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ ｍＭ ＤＴＴ）をそれに加え、および氷上で１０分間インキュベートした。混合物をインキュベート後に溶液Ｂ（レプリ−ｇキット）で中和した。混合物を、レプリ−ｇキットからの４ｘ反応混合物１２．５μｌ（これはランダム配列を有するオリゴヌクレオチド、反応緩衝溶液およびｄＮＴＰを含む）および蒸留水で体積４９．５μｌとした。その後、レプリ−ｇキットからのＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを加えた。反応を次いで３０℃にて６時間実施した。
反応終了時に、ＤＮＡ濃度をピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）を用いて取扱説明書に従って測定した（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）、米国オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ））。ＭＤＡ−ＤＮＡ １０ ｎｇをリアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のために加えた。４つの異なる遺伝子座を、増幅における提示について調べた：
（ａ）Ｓａｔという配列
（プライマー配列：
Ｓａｔ１．１ ＴＣＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＡＴＴＧＣＡＴ および
Ｓａｔ１．２ ＧＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＣＣＣＡＡ
（ｂ）β−アクチン遺伝子由来配列
プライマー１ ＧＴＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧ
プライマー２ ＧＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＧＴＧ
（ｃ）「１００４」という遺伝子座から生じる配列
（試験： ＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＡＣ，
プライマー１： ＧＴＣＴＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＴＧ，
プライマー２： ＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＴＧＡＣＧ） および
（ｄ）「６９９」という遺伝子座から生じる配列
（試験： ＴＧＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＴＴ，
プライマー１： ＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＡＴＣＴＧ，
プライマー２： ＡＧＡＣＡＧＴＡＴＧＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＡＣＣＣ）。
リアルタイムＰＣＲ反応は、クオンティテクト・マスターミックス（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））で取扱説明書に従って実施した。
増幅されたＤＮＡ中の遺伝子座の提示は、Ｃｔ値（閾サイクル＝Ｃｔ）で測定した。Ｃｔ値は、そこまでに蛍光シグナルが最初に測定できる、リアルタイムＰＣＲでのＰＣＲサイクルである。試験におけるある配列の相対頻度は、ゆえにＣｔ値によって確定されうる。たとえば、Ｃｔ値が比較試験よりも１サイクル小さいならば、この値は、測定された配列について試験分析中のＤＮＡの開始量が対照分析中よりも約２倍多いことに相当する。
実施例１の結果は下記の通り要約されうる：（１）本発明に記載の６５℃段階によってＤＮＡが活性化された反応からの収量は、対照反応からの収量と同等である。（２）血液０．５μｌが添加されるならば、増幅されたＤＮＡにおける配列の提示もまた同等である。Ｓａｔ遺伝子座の配列だけが対照反応より低い。（３）０．５μｌより大きい量は、６５℃活性化を用いるＭＤＡ反応に対して阻害的作用を有する。これはより高いＣｔ値（すなわち増幅されたＤＮＡにおける当該配列のより悪い提示）に見ることができる。
実施例１から反応の収量を図式的に図１に示す。図２は実施例１からのリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を示す。
実施例２
この実施例は、温度活性化段階中の低すぎる温度はＳＤＲ中に生じるＤＮＡの品質を損ないうることを示す役割を果たす。
本発明に記載の反応：ＭＤＡ反応はレプリ−ｇ（ＲＥＰＬＩ−ｇ）試薬（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））を用いて実施した：ＥＤＴＡで安定化した全血０．５μｌを、４ｘ反応混合物１２．５μｌ（これはランダム配列を有するオリゴヌクレオチド、反応緩衝溶液およびｄＮＴＰを含む）および水で体積３９．５μｌとし、およびさまざまな温度（３０、４０、４５、５０、５５、６０および６５℃）によって活性化した。室温（約２０〜２５℃）へ冷却後、レプリ−ｇキットからのＤＮＡポリメラーゼを加えた。反応を次いで３０℃にて６時間実施した。
先行技術に記載の対照反応：ＭＤＡ反応はレプリ−ｇ（ＲＥＰＬＩ−ｇ）試薬（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））を用いて実施した：ＥＤＴＡで安定化した全血０．５μｌを、２．５μｌのＰＢＳ（レプリ−ｇキット）で置換した。続いて、３．５μｌの新たに加えた変性緩衝溶液（３６０ ｍＭ ＫＯＨ、９ ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ ｍＭ ＤＴＴ）をそれに加え、および氷上で１０分間インキュベートした。混合物をインキュベート後に溶液Ｂ（レプリ−ｇキット）で中和した。混合物を、レプリ−ｇキットからの４ｘ反応混合物１２．５μｌ（これはランダム配列を有するオリゴヌクレオチド、反応緩衝溶液およびｄＮＴＰを含む）および蒸留水で体積４９．５μｌとした。その後、レプリ−ｇキットからのＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを加えた。反応を次いで３０℃にて６時間実施した。
反応終了後に、ＤＮＡ濃度をピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）を用いて取扱説明書に従って測定した（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））。ＭＤＡ−ＤＮＡ １０ ｎｇをリアルタイムＰＣＲのために添加した。２つの異なる遺伝子座を、増幅における提示について調べた：
（ａ）「１００４」という遺伝子座から生じる配列
（試験： ＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＡＣ，
プライマー１： ＧＴＣＴＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＴＧ および
プライマー２： ＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＴＧＡＣＧ）、および
（ｂ）「６９９」という遺伝子座から生じる配列
（試験： ＴＧＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＴＴ，
プライマー１： ＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＡＴＣＴＧ，
プライマー２： ＡＧＡＣＡＧＴＡＴＧＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＡＣＣＣ）。
リアルタイムＰＣＲ反応は、クオンティテクト・マスターミックス（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））で取扱説明書に従って実施した。
増幅されたＤＮＡ中の遺伝子座の提示は、Ｃｔ値（閾サイクル＝Ｃｔ）で測定した。Ｃｔ値は、そこまでに蛍光シグナルが最初に測定できる、リアルタイムＰＣＲでのＰＣＲサイクルである。試験におけるある配列の相対頻度は、ゆえにＣｔ値によって確定されうる。たとえば、Ｃｔ値が比較試験よりも１サイクル小さいならば、この値は、測定された配列について試験分析中のＤＮＡの開始量が対照分析中よりも約２倍多いことに相当する。
実施例２の結果は下記の通り要約されうる：（１）本発明に記載の３０から６５℃段階によってＤＮＡが活性化された反応からの収量は、対照反応と同等である。（２）活性化が６０または６５℃にて実施される場合、増幅されたＤＮＡにおける配列の提示もまた対照反応よりもいくらか悪いだけである。６０℃を下回る鎖置換反応のためのＤＮＡの活性化では、観察された配列の提示はより悪化する。
実施例２から反応の収量を図式的に図３に示す。図４は実施例２からのリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を示す。
実施例３
この実施例では、特定の温度限界内でＳＤＲ前の単純な温度活性化は、先行技術に記載の反応（対照反応）と比較して、ＳＤＲ中に生じるＤＮＡの品質に影響しないことが示される。
本発明に記載の反応：ＭＤＡ反応はレプリ−ｇ（ＲＥＰＬＩ−ｇ）試薬（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））を用いて実施した。ＥＤＴＡで安定化した全血０．５μｌを、４ｘ反応混合物１２．５μｌ（これはランダム配列を有するオリゴヌクレオチド、反応緩衝溶液およびｄＮＴＰを含む）および水で体積３９．５μｌとし、およびさまざまな温度（６０、６５、および７０℃）によって活性化した。反応組成物を室温（約２０〜２５℃）へ冷却後、レプリ−ｇキットからのＤＮＡポリメラーゼを加えた。反応を次いで３０℃にて６時間実施した。
先行技術に記載の対照反応：ＭＤＡ反応はレプリ−ｇ（ＲＥＰＬＩ−ｇ）試薬（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））を用いて実施した：ＥＤＴＡで安定化した全血０．５μｌを、２．５μｌのＰＢＳ（レプリ−ｇキット）で置換した。続いて、３．５μｌの新たに加えた変性緩衝溶液（３６０ ｍＭ ＫＯＨ、９ ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ ｍＭ ＤＴＴ）をそれに加え、および氷上で１０分間インキュベートした。混合物をインキュベート後に溶液Ｂ（レプリ−ｇキット）で中和した。混合物を、レプリ−ｇキットからの４ｘ反応混合物１２．５μｌ（これはランダム配列を有するオリゴヌクレオチド、反応緩衝溶液およびｄＮＴＰを含む）および蒸留水で体積４９．５μｌとした。その後、レプリ−ｇキットからのＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを加えた。反応を３０℃にて６時間実施した。
反応終了後に、ＤＮＡ濃度をピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）を用いて取扱説明書に従って測定した（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））。ＭＤＡ−ＤＮＡ １０ ｎｇをリアルタイムＰＣＲのために添加した。４つの異なる遺伝子座を、増幅における提示について調べた：
（ａ）「１００４」という遺伝子座から生じる配列
（試験： ＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＡＣ，
プライマー１： ＧＴＣＴＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＴＧ，
プライマー２： ＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＴＧＡＣＧ） および
（ｂ）「６９９」という遺伝子座から生じる配列
（試験： ＴＧＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＴＴ，
プライマー１： ＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＡＴＣＴＧ，
プライマー２： ＡＧＡＣＡＧＴＡＴＧＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＡＣＣＣ）。
ｃ）Ｓａｔという配列
（プライマー配列：
Ｓａｔ１．１ ＴＣＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＡＴＴＧＣＡＴ および
Ｓａｔ１．２ ＧＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＣＣＣＡＡ
（ｄ）β−アクチン遺伝子由来配列
プライマー１ ＧＴＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧ
プライマー２ ＧＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＧＴＧ
リアルタイムＰＣＲ反応は、クオンティテクト・マスターミックス（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））で取扱説明書に従って実施した。
増幅されたＤＮＡ中の遺伝子座の提示は、Ｃｔ値（閾サイクル＝Ｃｔ）で測定した。Ｃｔ値は、そこまでに蛍光シグナルが最初に測定できる、リアルタイムＰＣＲでのＰＣＲサイクルである。試験におけるある配列の相対頻度は、ゆえにＣｔ値によって確定されうる。たとえば、Ｃｔ値が比較試験よりも１サイクル小さいならば、この値は、測定された配列について試験分析中のＤＮＡの開始量が対照分析中よりも約２倍多いことに相当する。
結果は下記の通り要約されうる。増幅されたＤＮＡにおける配列の提示は、活性化が６０℃、６５℃または７０℃にて実施される場合、対照反応よりも本発明に従った調製物で部分的により良好である。
図５は、実施例３からＳＤＲ反応由来のＤＮＡのリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を示す。
実施例４
本実施例は、単純な温度活性化段階によって、単離されたゲノムＤＮＡから開始するＳＤＲ（ここでは多置換増幅、ＭＤＡ）が可能になり、ＤＮＡ収量およびＤＮＡ品質に関しては先行技術に記載の反応（対照反応）と同等であるのを示す役割を果たす。
本発明に記載の反応：ＭＤＡ反応はレプリ−ｇ（ＲＥＰＬＩ−ｇ）試薬（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））を用いて実施した。ヒト細胞由来ゲノムＤＮＡの溶液２．５μｌ（濃度：４ｎｇ／μｌ）を、４ｘ反応混合物１２．５μｌ（これはランダム配列を有するオリゴヌクレオチド、反応緩衝溶液およびｄＮＴＰを含む）および水で体積３９．５μｌとし、および６５℃でのインキュベート段階によって活性化した。反応組成物を室温（約２０〜２５℃）へ冷却後、レプリ−ｇキットからのＤＮＡポリメラーゼを加えた。反応を３０℃にて６時間実施した。
先行技術に記載の対照反応：ＭＤＡ反応はレプリ−ｇ（ＲＥＰＬＩ−ｇ）試薬（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））を用いて実施した。ヒト細胞由来ゲノムＤＮＡ ２．５μｌ（濃度： ４ ｎｇ／μｌ）を、２．５μｌの新たに加えた変性緩衝溶液（５０ ｍＭ ＫＯＨ，１．２５ ｍＭ ＥＤＴＡ）で置換し、および３分間室温にてインキュベートした。混合物をインキュベート後に溶液Ｂ（レプリ−ｇキット）の１：１０希釈で中和した。混合物を、レプリ−ｇキットからの４ｘ反応混合物１２．５μｌ（これはランダム配列を有するオリゴヌクレオチド、反応緩衝溶液およびｄＮＴＰを含む）および蒸留水で体積４９．５μｌとした。その後、レプリ−ｇキットからのＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを加えた。反応を３０℃にて６時間実施した。
反応終了後に、ＤＮＡ濃度をピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）を用いて取扱説明書に従って測定した（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））。ＭＤＡ−ＤＮＡ １０ ｎｇをリアルタイムＰＣＲのために添加した。１遺伝子座を、増幅における提示について調べた：
（ａ）「１００４」という遺伝子座から生じる配列
（試験： ＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＡＣ，
プライマー１： ＧＴＣＴＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＴＧ，
プライマー２： ＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＴＧＡＣＧ）。
リアルタイムＰＣＲ反応は、クオンティテクト・マスターミックス（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））で取扱説明書に従って実施した。
増幅されたＤＮＡ中の遺伝子座の提示は、Ｃｔ値（閾サイクル＝Ｃｔ）で測定した。Ｃｔ値は、そこまでに蛍光シグナルが最初に測定できる、リアルタイムＰＣＲでのＰＣＲサイクルである。試験におけるある配列の相対頻度は、ゆえにＣｔ値によって確定されうる。たとえば、Ｃｔ値が比較試験よりも１サイクル小さいならば、この値は、測定された配列について試験分析中のＤＮＡの開始量が対照分析中よりも約２倍多いことに相当する。
結果は、ＤＮＡが６５℃段階によって活性化された反応からの収量は、先行技術に従った対照のほぼ２倍高かったというものであった。増幅されたＤＮＡにおける配列の提示は、本発明に従った試験および対照試験で同等であった。
実施例４から反応の収量を図式的に図６に示す。図７は実施例４からのリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を示す。
実施例５
この実施例では、漸増温度での単純な変性段階によって、特定配列がＳＤＲ（ここでは多置換反応）でもう増幅され得ないことを示す。
試験反応：ＭＤＡ反応はレプリ−ｇ（ＲＥＰＬＩ−ｇ）試薬（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））を用いて実施した：単離されたＤＮＡ１０ｎｇを、温度７５℃、８５℃または９５℃にて１０分間インキュベートした。代替的に、対照反応においてアルカリ変性がＫＯＨ緩衝溶液中で実施された。ＫＯＨを用いる化学変性後、ＭＤＡ反応条件に影響しないように溶液を中和した。熱処理または化学変性に続いて、ＤＮＡを含む溶液を、４ｘ反応混合物１２．５μｌ（これはランダム配列を有するオリゴヌクレオチド、反応緩衝溶液およびｄＮＴＰを含む）および水で体積３９．５μｌとした。その後、レプリ−ｇキットからのＤＮＡポリメラーゼを反応混合物に加えた。反応を３０℃にて６時間実施した。
反応終了後に、ＤＮＡ濃度をピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）を用いて取扱説明書に従って測定した（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））。ＭＤＡ−ＤＮＡ １０ ｎｇをリアルタイムＰＣＲのために添加した。２つの異なる遺伝子座を、増幅における提示について調べた：
（ａ）１００４という遺伝子座から生じる配列
（試験： ＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＡＣ，
プライマー１： ＧＴＣＴＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＴＧ，
プライマー２： ＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＴＧＡＣＧ） および
（ｂ）６９９という遺伝子座から生じる配列
（試験： ＴＧＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＴＴ，
プライマー１： ＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＡＴＣＴＧ，
プライマー２： ＡＧＡＣＡＧＴＡＴＧＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＡＣＣＣ）。
リアルタイムＰＣＲ反応は、クオンティテクト・マスターミックス（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））で取扱説明書に従って実施した。
増幅されたＤＮＡ中の遺伝子座の提示は、Ｃｔ値（閾サイクル＝Ｃｔ）で測定した。Ｃｔ値は、そこまでに蛍光シグナルが最初に測定できる、リアルタイムＰＣＲでのＰＣＲサイクルである。試験におけるある配列の相対頻度は、ゆえにＣｔ値によって確定されうる。たとえば、Ｃｔ値が比較試験よりも１サイクル小さいならば、この値は、測定された配列について試験分析中のＤＮＡの開始量が対照分析中と比較して約２倍多いことに相当する。
結果：
（１）ＤＮＡの熱処理での温度漸増によって、漸増的に高いＣＴ値が測定される。
（２）両方の遺伝子座は熱処理に際して異なる挙動を示す：遺伝子座６９９の場合、７５℃または９５℃での処理の値を比較すると、９．６サイクルのＣｔシフトが測定できた。いずれにしろ、遺伝子座１００４の場合、別の５サイクルのＣｔシフトが測定される。すなわちリアルタイムＰＣＲのために統一量の増幅産物（１０ｎｇ）に導入されたにもかかわらず、ＤＮＡの熱処理での温度漸増によって、ＭＤＡ増幅産物中で測定される遺伝子座はますます悪化した。
９．６または５サイクルのＣｔシフトは、７５℃にて処理されたＤＮＡと比較して、増幅前に９５℃に加熱された、配列６９９または１００４それぞれの７８０＊または３０＊倍少ないＤＮＡ増幅産物の提示に相当する（＊これらの値はリアルタイムＰＣＲの各サイクルで１複製が起こるという事実に基づく）。
図８は実施例５からのリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を示す。
実施例６
この実施例は、ＳＤＲ（ここでは多置換増幅）において可能な限り良好な配列提示を達成するため、どの温度で最適な温度活性化段階が起こるかを示す。
試験反応：ＭＤＡ反応はレプリ−ｇ（ＲＥＰＬＩ−ｇ）試薬（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））を用いて実施した：単離されたＤＮＡ１０ｎｇを、さまざまな温度にて５分間インキュベートした。代替的に、ＤＮＡは（１）ＫＯＨの添加、（２）ＤＮＡのＫＯＨ溶液中で５分間のインキュベート、および（３レプリ−ｇ反応のためのアルカリ性溶液の中和から成る多段階反応での対照反応で調製された。
熱処理または化学変性の後、ＤＮＡを含む溶液をレプリ−ｇ反応で増幅した。反応を３３℃にて８時間実施した。
反応終了後に、ＤＮＡ濃度をピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）を用いて取扱説明書に従って測定した（モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））。ＭＤＡ−ＤＮＡ １０ ｎｇをリアルタイムＰＣＲのために添加した。２つの異なる遺伝子座を、増幅における提示について調べた：
（ａ）１１／１２という遺伝子座から生じる配列
（プライマー１： ＴＴＴＣＴＧＴＡＡＣＡＧＣＴＡＡＧＧＡＣ，
プライマー２： ＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＡＣ） および
（ｂ）６６５という遺伝子座から生じる配列
（プライマー１： ＣＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＣＣＴＡＴＡＴＡＣ，
プライマー２： ＧＴＡＧＡＡＡＡＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＴＡＣ．
リアルタイムＰＣＲ反応は、クオンティテクト・マスターミックス（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））で取扱説明書に従って実施した。
増幅されたＤＮＡ中の遺伝子座の提示は、Ｃｔ値（閾サイクル＝Ｃｔ）で測定した。Ｃｔ値は、そこまでに蛍光シグナルが最初に測定できる、リアルタイムＰＣＲでのＰＣＲサイクルである。試験におけるある配列の相対頻度は、ゆえにＣｔ値によって確定されうる。たとえば、Ｃｔ値が比較試験よりも１サイクル小さいならば、この値は、測定された配列について試験分析中のＤＮＡの開始量が対照分析中よりも約２倍多いことに相当する。
結果：
（１）ＤＮＡの熱処理での温度漸増によって、漸増的に高いＣＴ値が測定される。
（２）ＣＴ最小値（つまりここで調べた遺伝子座の最良の提示）は温度６５℃から８５℃での熱処理で見られる。
（３）これらの遺伝子座では、ＫＯＨによる参照処理よりも良好なＣｔ値が温度６５〜８５℃にて測定された。
（４）ＫＯＨによる参照処理よりも悪いＣＴ値が８５℃にて既に測定された比較実施例５から、最適処理温度は細胞内のゲノムの遺伝子座に依存すると推論できる。
図９は実施例６から遺伝子座１１／１２のリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を示す。図１０は実施例６から遺伝子座６６５のリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を示す。
実施例１からの反応の収量； 実施例１からのリアルタイムＰＣＲのＣｔ値； 実施例２からの反応の収量； 実施例２からのリアルタイムＰＣＲのＣｔ値； 実施例３からのリアルタイムＰＣＲのＣｔ値； 実施例４からの反応の収量； 実施例４からのリアルタイムＰＣＲのＣｔ値； 実施例５からのリアルタイムＰＣＲのＣｔ値； 実施例６から遺伝子座１１／１２のリアルタイムＰＣＲのＣｔ値； 実施例６から遺伝子座６６５のリアルタイムＰＣＲのＣｔ値。

Claims (8)

  1. （ａ）ＤＮＡを温度６０℃〜８０℃へ加熱、
    （ｂ）温度４〜４５℃へ冷却、および
    （ｃ）ポリメラーゼのＤＮＡへの添加によって鎖置換反応を開始
    ：の段階を含む、鎖置換反応のための二本鎖ＤＮＡを活性化する方法であって、
    ここで段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）において、アルカリ処理がされない、方法。
  2. 段階（ｃ）でのポリメラーゼが熱不安定性ポリメラーゼである点で特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
  3. 鎖置換反応が多置換反応である点で特徴づけられる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 段階（ａ）でのＤＮＡが温度６０℃〜７０℃へ加熱される点で特徴づけられる、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
  5. ＤＮＡが水溶液中に精製された形で存在する点で特徴づけられる、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
  6. 段階（ｂ）でのＤＮＡが温度１５℃〜４２℃へ冷却される点で特徴づけられる、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
  7. 段階（ｂ）でのＤＮＡが温度２５〜３７℃へ冷却される点で特徴づけられる、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
  8. 段階（ａ）でのＤＮＡが温度６５℃へ加熱される点で特徴づけられる、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
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