JP5914346B2 - 非メチル化核酸の選択的蓄積 - Google Patents
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Description
(1)DNA、好ましくはゲノムDNAが、メチル化依存性ヌクレアーゼを用いて消化される。
(2)消化後、増幅法、好ましくはランダムプライムド配列増幅法(random-primedsequence amplification method)によってDNAが複製され、その結果、非メチル化DNAセグメントのみ、即ち切断されなかったセグメントのみが、複製され得る。増幅結果は、メチル化依存性ヌクレアーゼによって先に切断されたセグメント以外の複製DNAである。従って、該方法により、メチル化されない配列部分が選択的に蓄積及び複製される。
(3)任意に、その後、本発明の方法によって選択及び増幅されたDNAにおいて、配列セグメントのコピー数の定量解析を実施することが可能である。
(i)少なくとも1つの部位でメチル化されているDNAを含む試料を提供する工程、
(ii)メチル化依存性ヌクレアーゼで上記試料におけるDNAを処理する工程、及び
(iii)メチル化依存性ヌクレアーゼを用いて切断されたDNA断片を増幅する工程。
technique)である。他の好適なPCR法では、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いてDNAを切断した結果又は超音波処理の結果として形成されたDNA断片に例えば、プライマー結合部位を結合させる。さらに好適なPCR法では、第一の工程において、3'末端でランダムプライマー結合をもたらすが、それらの5'末端を用いて特異的プライマー結合部位を導入するプライマーが用いられる。その後、PCRが、特異的プライマー結合部位にハイブリダイズするプライマーを用いて行われる。この原理は、本発明によるRPSAでも実施され得る。
(iv)増幅されたDNAの少なくとも1つの配列セグメントを検出する工程。
DNAポリメラーゼ、
メチル化依存性ヌクレアーゼ、
任意に、増幅反応のためのバッファー(例えば、緩衝物質、dNTP、及び/又はプライマーを含有する)、
任意に、上記メチル化依存性ヌクレアーゼによるメチル化配列セグメントのエンドヌクレアーゼ的切断のためのバッファー。
DNAポリメラーゼ、
メチル化依存性ヌクレアーゼ、
任意に、増幅反応のためのバッファー(例えば、緩衝物質、dNTP、及び/又はプライマーを含有する)、
任意に、上記メチル化依存性ヌクレアーゼによるメチル化配列セグメントのエンドヌクレアーゼ的切断のためのバッファー。
ゲノムDNA(「gDNA」と示す)は、非メチル化及びメチル化ゲノムセグメントからなる。メチル化部位は、図1において「m」で示される。第一の工程では、gDNAの核酸分解切断を行い、その後、メチル化依存性ヌクレアーゼ(図中、「McrBC」で示す)によってメチル化配列セグメントが認識される。第二の工程では、切断されたDNAが増幅される。この例示的実施形態では、全ゲノム増幅(whole genome amplification)が実施される(図中、WGAで示される)。増幅されたDNA分子の集合が示されている(「WGA増幅DNA」)。切断されたDNAフラグメントの末端領域よりも、その中央領域から、より多くのアンプリコンが生成されることが明らかに認められる。この結果は、メチル化部位の正確な位置を必ずしも知る必要がないという利点となる。ある領域を解析に選択すると、解析された配列領域がメチル化部位の近くにのみある場合にメチル化についての報告がされ得る。このような解析は、どれ程強く特定の部位がメチル化されているかを示すことはできない(即ち、ゲノム中の配列が、例えば35%程度にメチル化されているか否かを示すことはできない)が、一般に、解析された配列の近くにメチル化された領域があるか否かを単に示す。従って、本解析は、好ましくは、全域的なメチル化パターンを決定するために用いられる。
実験の説明:
キアアンプ(QIAampキット(キアゲン(QIAGEN))を用いて、HepG2細胞からゲノムDNAを単離した。1μgのDNAを、McrBC酵素を含有する反応混合物に移した。本反応混合物(「+McrBC反応混合物」)は、1μgのDNA、0.5U/μLのMcrBC(NEB)、1×NEB2バッファー(NEB)、100ng/μLのBSA、及び1mMのGTPを含有していた。さらなる反応混合物(「−McrBC反応混合物」)は、McrBC酵素を含まないが、他は同一の成分を含有していた。両反応混合物は、37℃で2時間インキュベートし、その後65℃、20分で不活化した。その後、WGA反応のため、反応混合物から10ngを取り出した。WGA反応は、精製DNAのためのREPLI−g Midiプロトコルに従って、REPLI−g Midi試薬を用いて実施した。WGAを、30℃、8時間で実施した後、65℃、5分間で不活化した。WGAを行った後、配列出現を測定するため、リアルタイムPCR解析を実施した。ここでは、3つの異なるゲノム遺伝子座を解析した。解析のためのプライマーは表1に公表されている。
表2において、WGA反応3及び4(「+McrBC反応混合物」)についてのCT値(遺伝子座a及び遺伝子座b)は、WGA反応1及び2(「−McrBC反応混合物」)のものよりも大きいことが分かる。CT値がより高いこと(デルタCT値からも明らか)は、配列出現がより低いことを示唆する。このことは、遺伝子座a及び遺伝子座bが、WGA1及び2よりもWGA3及び4に、より低濃度で存在することを意味する。WGA3及びWGA4において遺伝子座a及び遺伝子座bがより低濃度であることかる、McrBC酵素がこれらの遺伝子座の近傍でDNAを加水分解的に切断したことが明らかになる。McrBCは、DNA中の酵素認識部位がメチル化されている場合にのみ切断するため、DNAが遺伝子座a及びbの近傍でメチル化されていたことが推測され得る。
実験の説明:
キアアンプ(QIAamp)キット(キアゲン(QIAGEN))を用いて、HepG2細胞、及び4つの異なる試験対象由来の血液から、ゲノムDNAを単離した。1μgのDNAを、McrBC酵素を含有する反応混合物に移した。本反応混合物(「+McrBC反応混合物」)は、1μgのDNA、0.5U/μLのMcrBC (NEB)、1×NEB2バッファー(NEB)、100ng/μLのBSA、及び1mMのGTPを含有していた。別の反応混合物(「−McrBC反応混合物」)は、McrBC酵素を含まないが、同一の成分を含有していた。両反応混合物は、37℃で2時間インキュベートし、その後65℃、20分間で不活化した。その後、WGA反応のため、反応混合物から10ngを取り出した。WGA反応は、精製DNAのためのREPLI−g Midiプロトコルに従って、REPLI−g Midi試薬を用いて実施した。WGAを、30℃、8時間で実施した後、65℃、5分間で不活化した。WGAを行った後、配列出現を測定するため、リアルタイムPCR解析を実施した。ここでは、3つの異なるゲノム遺伝子座を解析した。解析のためのプライマーを表4に公表する。
デルタCT値の表から、B1〜B4を比較した場合、デルタCT値が類似することが分かる。例えば、遺伝子座bについてのデルタCT値は2.5と3.5の間である。対照的に、HepG2細胞由来のゲノムDNAの場合は、遺伝子座bのデルタCT値は、ドナーB1〜B4由来の血液のデルタCT値と際立って異なる。このことは、HepG2細胞が、試験対象B1〜B4由来の血液と比較して、異なるメチル化パターンを有することを示している。遺伝子座fの場合、血液よりもHepG2細胞において、より低いデルタCT値が見られるが、このことは、血液では遺伝子座fの部位又はその近傍の部位においてより強度にメチル化されていることを示す。
Claims (12)
- ゲノムDNAの非メチル化配列を選択的に増幅するための方法であって、以下の工程を含み、工程(ii)及び(iii)が同時に実施される、上記方法:
(i)少なくとも1つの部位でメチル化されているゲノムDNAを含む試料を提供する工程、
(ii)メチル化依存性ヌクレアーゼで上記試料におけるゲノムDNAを処理して、処理されたDNAを作製する工程、及び
(iii)試料中に含まれる処理されたDNAを、鎖置換活性を示すポリメラーゼを用いて多置換増幅(MDA)において増幅して、増幅DNAを形成する工程。 - 以下のさらなる工程を含む、請求項1に記載の方法:
(iv)増幅されたDNAの少なくとも1つの配列セグメントを検出する工程。 - 上記検出が、増幅されたDNAの少なくとも1つの配列セグメントの定量を含む、請求項2に記載の方法。
- ハイブリダイゼーションを介した方法を用いることにより、増幅されたDNAの1以上の配列セグメントの検出が実施される、請求項3に記載の方法。
- 定量リアルタイムPCRを用いることにより、増幅されたDNAの1以上の配列セグメントの検出が実施される、請求項4に記載の方法。
- マイクロアレイに基づく方法を用いることにより、増幅されたDNAの1以上の配列セグメントの検出が実施される、請求項4に記載の方法。
- 配列決定法を用いることにより、増幅されたDNAの1以上の配列セグメントの検出が実施される、請求項3に記載の方法。
- メチル化依存性ヌクレアーゼで処理された上記試料におけるDNAの1以上の配列セグメントの量が、メチル化依存性ヌクレアーゼで処理されていない対照試料におけるDNAの当該配列セグメントの量と比較される、請求項1から7の何れか1項に記載の方法。
- 上記メチル化依存性ヌクレアーゼが、McrBC、McrA、DpnI、BisI、BlsI、GlaI、GluI、MalI、及びPcsIからなる群から選択される、請求項1から8の何れか1項に記載の方法。
- 工程(i)、(ii)及び(iii)からなる、請求項1から9の何れか1項に記載の方法。
- ゲノムDNAの非メチル化配列セグメントを選択的に調製するための、請求項1から10の何れか1項に記載の方法の使用。
- ゲノムDNAにおいて全域的なメチル化パターンを解析するための、請求項1から10の何れか1項に記載の方法の使用。
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