JP2019076100A - 多重メチル化特異的増幅システムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】多重増幅反応を行うためのシステムおよび方法、特に、DNA配列を変更することなく継承し、その後除去することができるDNAの化学的修飾の1つの型であるDNAメチル化にかかる、多重メチル化特異的増幅システムおよび方法の提供。【解決手段】a)標的核酸を、メチル化特異的検出試薬で処理することと、b)前記標的核酸内の複数の核酸セグメントを同時に増幅して、複数のアンプリコンを生成することと、c)前記複数のアンプリコンを検出することとを含む方法。【選択図】図1
Description
本出願は、2013年3月14日に出願された仮特許出願第61/782,370号に基づく優先権を主張し、この出願の全体が本明細書に参照により組み込まれる。
本発明は、多重増幅反応を行うためのシステムおよび方法に関する。特に、本発明は、多重メチル化特異的増幅システムおよび方法に関する。
DNAメチル化は、DNA配列を変更することなく継承し、その後除去することができるDNAの化学的修飾の1つの型である。この結果、DNAメチル化はエピジェネティックコードの一部である(Jaenisch & Bird.2003)Nature Genetics,33,245、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。)。DNAメチル化は、DNA核酸塩基にメチル基を付加することを含む。最も一般的な例では、メチル基がシトシンのピリミジン環の5番目の炭素に付加される。シトシンのメチル化は、一般的に、遺伝子発現を低下させる効果を有する。
メチル化は、自己/非自己の同定のための全てのウイルスの共通の能力である。シトシンの5位でのDNAメチル化が、全ての脊椎動物において見出されている。成人体細胞組織においては、DNAメチル化は、典型的には、CpGジヌクレオチドの環境において生じ、非CpGメチル化が胚性幹細胞では優勢である(Dodge et al.(2002)Gene 289(1−2):41−48.,Haines et al.(2001)Developmental Biology 240(2):585−598、これらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)。植物では、シトシンは、対称的に(CpGまたはCpNpG)と非対称的に(CpNpNp)の両方でメチル化される。ヒトにおける長期間の記憶の保存は、DNAメチル化によって調節することができる(Miller & Sweatt.(2007−03−15)Neuron 53(6):857−869.,Powell & Devin.(2008)New Scientist、これらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)。
哺乳動物では、DNAメチル化は、正常な発達に必須であり、インプリンティング、X染色体不活性化、反復エレメントおよび発癌の抑制を含む多くの主要な工程と関連している。全てのCpGの60から90%は哺乳動物でメチル化される(Tucker.(2001)Neuron.30(3):649−52、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。)。CpGは、多くの遺伝子の5’調節領域に存在する「CpGアイランド」と呼ばれるクラスターにグループ化されている。癌などの多くの疾患過程において、遺伝子プロモーターのCpGアイランドは、遺伝性の転写サイレンシングをもたらす異常な過剰メチル化を獲得する。
メチル化検出アッセイの感度および頑強性を向上させるための方法が必要とされている。
Jaenisch & Bird.(2003)Nature Genetics,33,245
Dodge et al.(2002)Gene 289(1−2):41−48
Haines et al.(2001)Developmental Biology 240(2):585−598
Miller & Sweatt.(2007−03−15)Neuron 53(6):857−869
Powell & Devin.(2008)New Scientist
Tucker.(2001)Neuron.30(3):649−52
本発明は多重増幅反応を行うためのシステムおよび方法に関する。特に、本発明は多重メチル化特異的増幅システムおよび方法を多重化することに関する。
例えば、幾つかの実施形態では、本発明は、a)標的核酸をメチル化特異的検出試薬で処理すること、b)標的核酸内の複数(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、2〜30、2〜20、3〜20、3〜15、4〜20、5〜20、6〜20、8〜20、10〜20など)の核酸セグメントを同時に増幅して、複数のアンプリコンを生成すること、およびc)複数のアンプリコンを検出することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、標的核酸はCpGアイランドを含む。幾つかの実施形態では、標的核酸は遺伝子のプロモーター領域である。幾つかの実施形態では、メチル化特異的試薬は、亜硫酸水素塩である。幾つかの実施形態では、同時増幅は、単一の反応容器(例えば、ウェル、チューブなど)で実施される。幾つかの実施形態では、核酸標的はGCリッチである。幾つかの実施形態では、亜硫酸水素塩は、非メチル化シトシン残基と反応してウラシルに変換し、メチル化シトシン残基とは反応せず、5−メチルシトシンとして残す。幾つかの実施形態では、増幅はPCRである。幾つかの実施形態では、検出は、複数の核酸プローブとアンプリコンとを接触させることを含む。幾つかの実施形態では、核酸プローブは検出可能な標識を含む。幾つかの実施形態では、プローブの全てが同一の標識を含む。幾つかの実施形態では、標識は蛍光標識であるが、他の標識も考えられる。幾つかの実施形態では、増幅および検出はリアルタイムPCR増幅および検出を含む。幾つかの実施形態では、検出は、例えば、質量分析、配列決定またはハイブリダイゼーションから選択される核酸検出技術を含む。
本発明のさらなる実施形態は、a)標的核酸をメチル化特異的検出試薬で処理すること、b)標的核酸内の少なくとも5つの核酸セグメントを同時に増幅して、複数のアンプリコンを生成すること、およびc)複数のアンプリコンを検出することを含む方法を提供する。
本発明の追加の実施形態は、a)標的核酸をメチル化特異的検出試薬で処理すること、b)標的核酸内の少なくとも10個の核酸セグメントを同時に増幅して、複数のアンプリコンを生成すること、およびc)複数のアンプリコンを検出することを含む方法を提供する。
幾つかの実施形態では、本発明は、a)メチル化特異的検出試薬で処理された標的核酸内の複数の核酸セグメントを同時に増幅して、複数のアンプリコンを生成すること、およびb)アンプリコンを検出することを含む、核酸を増幅する方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、a)プロモーター核酸をメチル化特異的検出試薬で処理すること、b)標的核酸内の複数(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、2〜30、2〜20、3〜20、3〜15、4〜20、5〜20、6〜20、8〜20、10〜20など)の核酸セグメントを同時に増幅して、複数のアンプリコンを生成すること、およびc)複数のアンプリコンを検出することを含む方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、a)標的核酸を亜硫酸水素塩で処理すること、b)標的核酸内の複数(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、2〜30、2〜20、3〜20、3〜15、4〜20、5〜20、6〜20、8〜20、10〜20など)の核酸セグメントを同時に増幅して、複数のアンプリコンを生成すること、およびc)複数のアンプリコンを検出することを含む方法を提供する。
なおさらなる実施形態では、本発明は、a)標的核酸をメチル化特異的検出試薬で処理すること、b)標的核酸内の複数(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、2〜30、2〜20、3〜20、3〜15、4〜20、5〜20、6〜20、8〜20、10〜20など)の核酸セグメントを同時にPCR増幅して、複数のアンプリコンを生成すること、およびc)複数のアンプリコンを検出することを含む方法を提供する。
幾つかの実施形態では、本発明は、a)標的核酸をメチル化特異的検出試薬で処理すること、b)標的核酸内の複数(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、2〜30、2〜20、3〜20、3〜15、4〜20、5〜20、6〜20、8〜20、10〜20など)の核酸セグメントを同時に増幅して、複数のアンプリコンを生成すること、およびc)同じ標識を含む複数の核酸プローブを用いて、複数のアンプリコンを検出することを含む方法を提供する。
幾つかの実施形態では、本発明は、メチル化特異的な多重増幅反応を行うのに必要で十分なまたは有用な試薬(例えば、プライマー、プローブ、亜硫酸水素塩、緩衝液など)を含むシステム、組成物またはキットを提供する。
追加の実施形態は、本明細書に含まれる教示に基づいて当業者に明らかであろう。
本発明は、システムおよび多重増幅反応を行うための方法に関する。特に、本発明は、多重メチル化特異的増幅システムおよび方法に関する。
定義
本技術の理解を容易にするために、多くの用語および語句は、以下に定義される。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって記載されている。
本技術の理解を容易にするために、多くの用語および語句は、以下に定義される。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって記載されている。
本明細書で使用する場合、「a」または「an」または「the」は、1つまたは1つ以上を意味し得る。例えば、「a」部品は、1つの部品または複数の部品を意味し得る。
本明細書で使用する用語「標識」は、検出可能な(好ましくは定量可能な)効果を提供するために使用することができる任意の原子または分子を指し、これは、核酸またはタンパク質に結合させることができる。標識としては、これらに限定されないが、染料;32Pなどの放射性標識;ビオチンなどの結合部分;ジゴキシゲニンなどのハプテン;発光性、リン光性または蛍光性部分;蛍光色素単独または蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)により発光スペクトルを抑制しまたはシフトさせることができる部分との組合せなどが挙げられる。標識は、蛍光、放射能、比色、重量測定、X線回折もしくは吸収、磁性、酵素活性などによって検出可能なシグナルを提供することもできる。標識は、荷電部分(正または負電荷)であってもよく、または代替的に、中性電荷されていてもよい。標識は、標識を含む配列が検出可能である限り、核酸またはタンパク質配列を含むことができ、またはこれらからなることができる。
用語「プライマー」は、精製された制限消化物中のように天然に存在するか、合成的に製造されるかにかかわらず、オリゴヌクレオチドであって、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下(例えば、核酸とDNAポリメラーゼなどの誘導剤の存在下、または適切な温度およびpH)に置かれたとき、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅における最大効率のために、好ましくは1本鎖であるが、代わりに2本鎖であることもできる。2本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、この鎖を分離するために最初に処理される。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成のプライミングのために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源および方法の使用を含む多くの因子に依存するであろう。
ポリメラーゼ連鎖反応に関して使用されるときの用語「標的」は、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーが結合する核酸領域を指す。従って、「標的」は他の核酸配列から選別されることが求められる。「セグメント」は、標的配列内の核酸の領域として定義される。
本明細書で使用する場合、用語「対象」および「患者」は、犬、猫、鳥、家畜、特に哺乳動物、好ましくはヒトなどの任意の動物を指す。
本明細書で使用する場合、用語「感度」は、アッセイ(例えば、方法、テスト)の性能の統計的尺度として定義され、真陽性と偽陰性の合計で真陽性の数を割ることによって計算される。
本明細書で使用する場合、用語「特異性」は、アッセイ(例えば、方法、テスト)の性能の統計的尺度として定義され、真の陰性と偽陽性の合計で真陰性の数を割ることによって計算される。
本明細書で使用する場合、用語「アンプリコン」は、増幅反応によって生成される核酸を指す。アンプリコンは、典型的には2本鎖DNAであるが、RNAおよび/またはDNA:RNAであってもよい。アンプリコンは、サンプル核酸に相補的なDNAを含む。幾つかの実施形態では、プライマーペアは、サンプル核酸からアンプリコンを生成するように構成されている。このように、任意の所定のアンプリコンの塩基組成は、プライマーペア、プライマーペアの相補体、およびアンプリコンを生成するために増幅された試料核酸の領域を含むことができる。当業者には、設計されたプライマーペア配列のアンプリコンへの組み込みによっては、プライマー結合部位およびこの相補部位において天然の配列が交換され得ることが理解される。特定の実施形態では、プライマーを用いて標的領域の増幅後、得られるプライマー配列を有するアンプリコンは、その後の分析(例えば、塩基組成の決定)のために使用される。幾つかの実施形態では、アンプリコンはさらに、その後の分析に適合する長さを含む。
核酸の文脈における用語「増幅する」または「増幅」は、典型的には少量のポリヌクレオチド(例えば、単一のポリヌクレトチド分子と同じく少ない。)から開始する、増幅産物またはアンプリコンは一般的に検出可能である、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部の複数のコピーの生産を指す。ポリヌクレオチドの増幅は、種々の化学的および酵素的工程を包含する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはリガーゼ連鎖反応(LCR)中の、標的または鋳型DNA分子の1つまたは少数のコピーからの複数のDNAコピーの生成が、増幅の形態である。増幅は出発分子の厳密な複製に限定されるものではない。例えば、逆転写(RT)−PCRを使用して、サンプル中のRNAの限定された量からの複数のcDNA分子の生成は、増幅の1つの形態である。さらに、転写工程中の単一のDNA分子からの複数のRNA分子の生成もまた増幅の1つの形態である。
本明細書で使用する場合、用語「サンプル」は、この最も広い意味で使用される。ある意味では、生物学的および環境的供給源を含む任意の供給源から得られた代表的な部分または培養物を含むことを意味する。生物学的サンプルは、動物(ヒトを含む)から得られてもよく、流体、固体、組織および気体を包含し得る。生物学的サンプルは、血漿、血清などの血液生成物を含む。環境サンプルは、表面物質、土、泥、スラッジ、バイオフィルム、水および産業サンプルなどの環境材料を含む。しかしながら、このような例は、本発明に適用できるサンプルの種類を限定するものとして解釈されるべきではない。
技術の実施形態
本明細書の開示は特定の例示された実施形態を指すが、これらの実施形態は、例としてであって限定として提示されるものではないことを理解すべきである。
本明細書の開示は特定の例示された実施形態を指すが、これらの実施形態は、例としてであって限定として提示されるものではないことを理解すべきである。
本開示の実施形態は、多重メチル化特異的PCRのためのシステムおよび方法を提供する。幾つかの実施形態では、システムおよび方法は、特定のメチル化標的(例えば、プロモーターまたは他の核酸、例えばCpGアイランド)のために、複数(例えば、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、20以上など)のアンプリコンを利用する。幾つかの実施形態では、2と30の間、2と20の間、2と15の間、2と10の間、5と30の間、5と20の間、5と10の間または5と10の間のアンプリコンが単一の反応で生成される。幾つかの実施形態では、アンプリコンは重複し、または重複しない。
本開示の実施形態は図1に示されている。他のメチル化特異的検出もしくは同定の試薬または方法を利用することができるが、本開示は、亜硫酸水素塩PCRで示されている。黒の実線(上)はDNA標的の配列を表す。中央のセグメント化された黒い線は、非メチル化C’のU’への変換および断片化につながる亜硫酸水素塩処理が後に続く配列を表す。短い線のそれぞれは、標的の配列に対して固有のアンプリコンを表す。ボトムラインは、標的核酸の異なる領域を標的とするアンプリコンを表す。
幾つかの実施形態では、各アンプリコンは、検出可能な標識(例えば、蛍光標識プローブまたはプライマー)で検出される。幾つかの実施形態では、それぞれ固有のアンプリコンを検出するための標識は同じである。例えば、幾つかの実施形態では、蛍光または他の標識を有するプローブは、PCR法(例えば、リアルタイムPCR)の分析のために使用される。本開示は、10個のアンプリコンの検出に限定されるものではないが、図1では、10個の固有のアンプリコンが示されている。
幾つかの実施形態では、全ての反応は、単一のチューブまたは反応容器または容積(例えば、ウェル、チャネルなど)で実施される。幾つかの実施形態では、所定のプロモーターのために選択されたアンプリコンは、連続し、重複し、または重複と連続の組合せである。幾つかの実施形態では、アッセイは自動化される(例えば、ロボットを使用して)。
本開示は、特定のメチル化の検出または増幅の方法に限定されない。例示的なメチル化特異的検出法、増幅法および検出方法が以下に記載される。さらなる方法が、本明細書で記載されるシステムおよび方法で使用することができる。
I.メチル化検出技術
幾つかの実施形態では、本開示は、メチル化DNAを検出するためのシステムおよび方法を提供する(例えば、多重化された検出)。例示的なメチル化特異的検出および増幅する方法が以下に記載される。
幾つかの実施形態では、本開示は、メチル化DNAを検出するためのシステムおよび方法を提供する(例えば、多重化された検出)。例示的なメチル化特異的検出および増幅する方法が以下に記載される。
A.メチル化特異的検出
幾つかの実施形態では、メチル化分析は、亜硫酸水素塩変換またはメチル化感受性制限酵素(MSRE)を利用する。亜硫酸水素塩変換方法は、配列決定、プライマー−プローブ、プライマー−ゲル、またはプライマー−アレイ分析を利用する。
幾つかの実施形態では、メチル化分析は、亜硫酸水素塩変換またはメチル化感受性制限酵素(MSRE)を利用する。亜硫酸水素塩変換方法は、配列決定、プライマー−プローブ、プライマー−ゲル、またはプライマー−アレイ分析を利用する。
5−メチルシトシンについてDNAを分析するための1つの方法は、亜硫酸水素塩とシトシンの特異的反応に基づいており、シトシンは、その後のアルカリ加水分解の際に、この塩基ペア挙動でチミジンに対応するウラシルに変換される。5−メチルシトシンは、これらの条件下では未修正のままである。従って、このハイブリダイゼーション挙動でシトシンと本来区別することができないメチルシトシンが、例えば、増幅およびハイブリダイゼーションまたは配列決定によって、今や検出することができるように、元のDNAが変換される。これらの技術は、今や利点をこの完全に取れる塩基ペア形成に基づいている。
5−メチルシトシンを検出する方法の概要は、次の調査論文:Rein,T.,DePamphilis,M.L.,Zorbas,H.,Nucleic Acids Res.1998,26,2255から収集することができる。
亜硫酸水素塩技術は既知の遺伝子の短い特異的断片を含み、この断片は、亜硫酸水素塩処理後に増幅され、完全に配列決定される(Olek,A.and Walter,J.,Nat Genet.1997,17,275−276)か、プライマー伸長(Gonzalgo,M.L.,and Jones,P.A.,Nucl.Acids Res.1997,25,2529−2531,WO9500669)または酵素消化反応(Xiong,Z.and Laird,P.W.,Nucl.Acids.Res.1997,25,2532−2534)によって個々のシトシンの位置が検出される。さらに、ハイブリダイゼーションによる検出も記載されている(Olek et al.,WO99/28498)。
個々の遺伝子におけるメチル化検出のための亜硫酸水素塩技術の使用を扱ったさらなる刊行物は、Xiong,Z.and Laird,P.W.(1997),Nucl.Acids Res.25,2532;Gonzalgo,M.L.and Jones,P.A.(1997),Nucl.Acids Res.25,2529;Grigg,S.and Clark,S.(1994),Bioassays 16,431;Zeschnik,M.et al.(1997),Human Molecular Genetics 6,387;Teil,R.et al.(1994),Nucl.Acids Res.22,695;Martin,V.et al.(1995),Gene 157,261;WO9746705;WO9515373およびWO45560であり、これらの全体は本明細書に参照により組み込まれる。DNAサンプル中のシトシンメチル化を検出するための亜硫酸水素塩技術を使用することが7,524,629に記載されており、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。
メチル化状態を決定するための追加の方法が、例えば、M.et al.(2006)British Journal of Cancer.94:661−671;Yoshiura,K.et al.1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92:7416−7419;Lind,G.E.et al.(2004)Molecular Cancer 3:28;Kumagai,T.et al.(2007)Int.J.Cancer.121:656−665;Hennig,G.et al.(1996)J.Biol.Chem.271(1):595−602;Marchevsky,A.M.et al.(2004).Journal of Molecular Diagnostics 6:28−36;Reinhold,W.C.et al.(2007).Mol.Cancer.Ther.6:391−403;Hu,X−C.et al.(2002)Life Sciences 71:1397−1404;またはNakata,S.et al.(2006)Cancer 106(10):2190−2199に記載されており、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。市販のキットも、腫瘍細胞におけるプロモーターメチル化状態の決定のために利用できる (例えば、Promoter Methylation PCR kit,from Panomics,Redwood City,Calif.)。
種々のメチル化アッセイ手順は、当技術分野で知られており、本技術による亜硫酸水素塩処理と組み合わせて使用することができる。これらのアッセイは、核酸配列内の1つのまたは複数のCpGジヌクレオチド(例えば、CpGアイランド)メチル化状態の決定を可能にする。このようなアッセイは、他の技術の中で、亜硫酸水素塩処理された核酸の配列決定、PCR(配列特異的増幅のための)、サザンブロット解析およびメチル化感受性制限酵素の使用を含む。
「HeavyMethyl」(商標)アッセイの技術は、亜硫酸水素塩処理したDNAのメチル化特異的増幅に基づいてメチル化の差異を評価するための定量的な方法である。増幅プライマー間のまたは増幅プライマーでカバーされるCpG位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブ(「ブロッカー」)は、核酸サンプルのメチル化特異的選択的増幅を可能にする。
用語「HeavyMethyl(商標)MethyLight(商標)」アッセイは、MethyLight(商標)アッセイの変形であるHeavyMethyl(商標)MethyLight(商標)アッセイを指し、そこではMethyLight(商標)アッセイは、増幅プライマー間のCpG位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わされている。HeavyMethyl(商標)アッセイはまた、メチル化特異的増幅プライマーと組み合わせて使用することができる。
HeavyMethyl(商標)分析のための典型的な試薬(例えば、典型的なMethyLight(商標)系キットに見られるような)としては、これらに限定されないが、特定の遺伝子座(例えば、特定遺伝子、マーカー、DMR、遺伝子領域、マーカー領域、亜硫酸水素塩処理されたDNA配列、CpGアイランド、または亜硫酸水素塩処理されたDNA配列もしくはCpGアイランドなど)、ブロッキングオリゴヌクレオチド、最適化PCR緩衝液とデオキシヌクレオチド、およびTaqポリメラーゼを挙げることができる。
用語「MSP」(メチル化特異的PCT)は、Herman et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821−9826および米国特許第5,786,146号に記載された当該技術分野で認識されたメチル化アッセイである。
MSP(メチル化特異的PCR)は、メチル化感受性制限酵素の使用(Herman et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:9821−9826,1996;米国特許第5,786,146号)とは独立して、CpGアイランド内のCpG部位の実質的に任意のグループのメチル化状態を評価することができる。簡単に言えば、非メチル化ではあるがメチル化されないシトシンをウラシルに変換する亜硫酸水素ナトリウムによってDNAが修正され、この生成物は、その後、非メチル化DNAに対してメチル化に特異的なプライマーを用いて増幅される。MSPは少量のDNAのみを必要とし、所定のCpGアイランド座の0.1%メチル化対立遺伝子に感受性であり、パラフィン包埋サンプルから抽出したDNAに対して行うことができる。MSP分析のための典型的な試薬(例えば、典型的なMSP系キットに見られるような)としては、これらに限定されないが、特定の遺伝子座のためのメチル化および非メチル化PCRプライマー(例えば、特定の遺伝子、マーカー、DMR、遺伝子領域、マーカー領域、亜硫酸水素塩処理されたDNA配列、CpGアイランドなど)、最適化PCR緩衝液とデオキシヌクレオチド、および特異的プローブを挙げることができる。
MethyLight(商標)アッセイは、PCR工程の後のさらなる操作を必要としない蛍光系リアルタイムPCR(例えば、TaqMan(R)を利用したハイスループット定量的メチル化アッセイである(Eads et al.,Cancer Res.59:2302−2306,1999)。簡単に言えば、MethyLight(商標)方法は、標準的な手順(亜硫酸水素塩は非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する。)によって、亜硫酸水素ナトリウム反応で、メチル化依存性配列の差異の混合プールに変換されるゲノムDNAの混合サンプルで始まる。蛍光系PCRは、例えば、既知のCpGジヌクレオチドとオーバーラップするPCRプライマーとの「バイアスされた」反応において行われる。配列の識別は、増幅工程のレベルと蛍光検出工程のレベルの両方で起こる。
MethyLight(商標)アッセイは、配列識別がプローブハイブリダイゼーションのレベルで起こる、核酸、例えば、ゲノムDNAサンプル中のメチル化パターンの定量試験として使用される。定量的なバージョンでは、PCR反応は、特定の推定メチル化部位とオーバーラップする蛍光プローブの存在下でのメチル化特異的増幅を提供する。インプットDNA量のバイアスされていない制御が、プライマーやプローブのいずれも任意のCpGジヌクレオチドを覆うことがない反応によって提供される。または、ゲノムメチル化のための定性的試験は、既知のメチル化部位をカバーしないコントロールオリゴヌクレオチド(例えば、HeavyMethyl(商標)およびMSP技術の蛍光系バージョン)または潜在的なメチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドのいずれかで、バイアスされたPCRプールをプロービングすることによって達成される。
MethyLight(商標)方法は、例えば、任意の適切なプローブ(例えば、「TaqMan(R)」プローブ、LightCycler(R)プローブなど)とともに使用される。例えば、幾つかの適用では、2本鎖ゲノムDNAを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、TaqMan(R)プローブを用いたPCR反応の2つのセット、例えば、MSPプライマーおよび/またはHeavyMethylブロッカーオリゴヌクレオチドとTaqMan(R)プローブ、の1つに付される。TaqMan(R)プローブは、蛍光「レポーター」分子と「クエンチャー」分子で2重標識され、フォワードプライマーまたはリバースプライマーよりもPCRサイクルで約10℃高い温度で溶融するように、相対的に高いGC含量領域に特異的であるように設計されている。これによって、TaqMan(R)プローブは、PCRのアニーリング/伸長工程の間に完全にハイブリダイズしたまま残ることができる。Taqポリメラーゼが酵素的にPCRの間に新規な鎖を合成するので、これは最終的にアニールTaqMan(R)プローブにいたる。Taqポリメラーゼ5’−3’エンドヌクレアーゼ活性5が、次いで、TaqMan(R)プローブを消化して、リアルタイム蛍光検出システムを使用する、この消光シグナルの定量的検出のための蛍光レポーター分子を放出することによって、TaqMan(R)プローブを置換する。
MethyLight(商標)分析のための典型的な試薬(例えば、典型的なMethyLight(商標)系キットに見られるような)としては、これらに限定されないが、特定の遺伝子座のためのPCRプライマー(例えば、特定の遺伝子、マーカー、DMR、遺伝子領域、マーカー領域、亜硫酸水素塩処理されたDNA配列、CpGアイランドなど)、TaqMan(R)またはLightcycler(R)プローブ、最適化PCR緩衝液とデオキシヌクレオチド、およびTaqポリメラーゼを挙げることができる。
B.増幅
幾つかの実施形態では、メチル化特異的検出に続いてまたは同時に、核酸が増幅される。核酸増幅技術の例示的で非限定的な例としては、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、転写媒介増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、および核酸配列に基づく増幅(NASBA)が挙げられる。当業者は、特定の増幅技術(例えばPCR)は、RNAが増幅の前にDNAに逆転写される必要があり(例えば、RT−PCR)、他方、他の増幅技術は直接RNA(例えば、TMAおよびNASBA)を増幅することを、認識するであろう。
幾つかの実施形態では、メチル化特異的検出に続いてまたは同時に、核酸が増幅される。核酸増幅技術の例示的で非限定的な例としては、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、転写媒介増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、および核酸配列に基づく増幅(NASBA)が挙げられる。当業者は、特定の増幅技術(例えばPCR)は、RNAが増幅の前にDNAに逆転写される必要があり(例えば、RT−PCR)、他方、他の増幅技術は直接RNA(例えば、TMAおよびNASBA)を増幅することを、認識するであろう。
一般的にPCRと呼ばれるポリメラーゼ連鎖反応(米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号および第4,965,188号、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)は、複数の変性サイクル、逆鎖へのプライマーペアのアニーリング、および標的核酸配列のコピー数を指数関数的に増加させるプライマー伸長を用いる。RT−PCRと呼ばれる変形では、mRNAから相補性DNA(cDNA)を作製するために逆転写酵素(RT)が使用され、次いで、DNAの複数のコピーを生成するために、cDNAはPCRによって増幅される。PCRの他の種々の置換については、例えば、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号;Mullis et al.,Meth.Enzymol.155:335(1987);およびMurakawa et al.,DNA7:287(1988)が参照され、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。
一般にTMAと呼ばれる転写媒介増幅(米国特許第5,480,784号および第5,399,491号、これらのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。)は、実質的に一定の温度、イオン強度およびpHの条件下で標的核酸配列の複数のコピーを自己触媒的に合成し、そこでは、標的配列の複数のRNAコピーが自己触媒的に追加コピーを生成する。例えば、米国特許第5,399,491号および第5,824,518号が参照され、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。米国特許出願公開第2006/0046265号(この全体が本明細書に参照により組み込まれる。)に記載された変形では、TMAは、TMA工程の感度と精度を向上させるために、ブロッキング部分、終止部分および他の修飾部分の使用を必要に応じて組み込む。
一般的にLCRと呼ばれるリガーゼ鎖反応(Weiss,R.,Science 254:1292(1991)、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。)は、標的核酸の隣接領域にハイブリダイズする相補性DNAオリゴヌクレオチドの2つのセットを用いる。DNAオリゴヌクレオチドは、検出可能な2本鎖の連結オリゴヌクレオチド生成物を生産するために、熱変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの反復サイクルにおいてDNAリガーゼによって共有結合的に連結される。
一般にSDAと呼ばれる鎖置換増幅(Walker,G.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:392−396(1992);米国特許第5,270,184号および第5,455,166号、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)は、標的配列の反対の鎖に対するプライマー配列のアニーリングペア、半ホスホロチオエートプライマー伸長生成物を生成するためのdNTPαSの存在下でのプライマー伸長、半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介性ニッキング、および既存の鎖を置換し、プライマーアニーリング、ニッキングおよび鎖置換の次のラウンドのための鎖を生成し、生成物の幾何学的増幅をもたらすためのニックの3’末端からのポリメラーゼ媒介プライマー伸長のサイクルを用いる。好熱性SDA(tSDA)は、本質的に同じ方法(欧州特許第0684315号)で、より高い温度で好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを用いる。
他の増幅方法としては、例えば、一般にNASBAと呼ばれる核酸配列に基づく増幅(米国特許第5,130,238号、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。);一般にQβレプリカーゼと呼ばれる、プローブ分子自体を増幅するためRNAレプリカーゼを用いる方法(Lizardi et al.,BioTechnol.6:1197(1988)、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。);転写に基づく増幅法(Kwoh et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173 (1989));および自己持続配列複製(Guatelli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874(1990)、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)が挙げられる。既知の増幅方法のさらなる議論については、Persing,David H.,「In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques」in Diagnostic Medical Microbiology:Principles and Applications(Persing et al.,Eds.),pp.51−87(American Society for Microbiology,Washington,DC(1993)が参照される。
幾つかの実施形態では、増幅は等温増幅法である。幾つかの実施形態では、当業者によって認識されるように、増幅方法は、固相増幅、ポロニー増幅、コロニー増幅、エマルジョンPCR、ビーズRCA、表面RCA、表面SDAなどである。幾つかの実施形態では、DNA分子の一端のみによって、溶液中のまたは適切なマトリックスに係留される遊離DNA分子の増幅を生じる増幅方法が用いられる。幾つかの実施形態では、両方のPCRプライマーが表面に付着される、ブリッジPCRに依存する方法(例えば、WO2000/018957、米国特許第7,972,820号および第7,790,418号、Adessi et al.,Nucleic Acids Research(2000):28(20):E87が参照され、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)が用いられる。幾つかのケースでは、本発明の方法は、同一のアンプリコンの空間クラスタリングを維持する多重増幅を意味する「ポリメラーゼコロニー技術」または「ポロニー」を創製することができる(Harvard Molecular Technology Group and Lipper Center for Computational Genetics websiteが参照される。)。これらとしては、例えば、インシュートポロニー(Mitra and Church,Nucleic Acid Research 27,e34,Dec.15,1999)、インシュートローリングサークル増幅(RCA)(Lizardi et al.,Nature Genetics 19,225,July 1998))、ブリッジPCR(米国特許第5,641,658号)、ピコタイターPCR(Leamon et al.,Electrophoresis 24,3769,November 2003)およびエマルジョンPCR(Dressman et al.,PNAS100,8817,Jul.22,2003)が挙げられる。
本発明の実施形態で使用するのに適した核酸ポリメラーゼの例としては、これらに限定されないが、DNAポリメラーゼ(クレノウフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ)、種々の熱安定性細菌(Taq、VENT、のPfu、TFL DNAポリメラーゼなど)において同定されクローン化された熱安定性DNAポリメラーゼ(Perler F.B.et al.,Adv.Protein Chem.1996,48:377−435)、並びにこれらの遺伝的に修飾された誘導体(TaqGold、VENTexo、Pfu exo)が挙げられる。好ましくは、コロニープライマー伸長のために用いられる核酸ポリメラーゼは、プライマーと鋳型のハイブリダイゼーションがテンプレートの不完全または誤った増幅を回避するのに十分に特異的となる温度で安定なものである。
増幅溶液は、好ましくは、ヌクレオチド前駆体として、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、例えば、天然に発生する、または、例えば蛍光もしくは放射性基で修飾されて非天然で発生する、dATP、dTTP、dCTP、dGTPを含む。核酸の検出可能性および/または機能的多様性を増加させるために、合成的に修飾された多種多様な核酸が、化学的および生物学的方法のために開発されている。これらの官能化/修飾分子は、最近見直されているように(Thum O et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2001,40(21):3990−3993)、天然の重合酵素と完全に互換性があることができ、天然の対応の塩基ペアおよび複製特性を維持している。
増幅溶液のその他の成分は、核酸ポリメラーゼの選択によって追加され、これらは本質的に、各ポリメラーゼの活性を支持するのに有効であると当技術分野で知られている化合物に対応している。ジメチルスルホキシド(DMSO)、ウシ血清アルブミン(BSA)、トリトンX−100またはMgCl2のような化合物の濃度は、最適な増幅を有するのに重要であると従来技術において良く知られており、従って、以下に示す実施例に基づいて、本発明の方法のためのこのような濃度を、操作者は容易に調整することができる。
幾つかの実施形態では、増幅反応は、標的の複数のセグメントを増幅する。幾つかの実施形態では、セグメントはオーバーラップしていない。幾つかの実施形態では、セグメントは、1つ以上のヌクレオチドによってオーバーラップしている。幾つかの実施形態では、アンプリコンがずらされている。幾つかの実施形態では、アンプリコンは、連続している。
幾つかの実施形態では、増幅反応が、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45または50、またはこれ以上のアンプリコンを生成する。幾つかの実施形態では、2と30の間、2と20の間、2と15の間、2と10の間、5と30の間、5と20の間、5と10の間または5と10の間のアンプリコンを、単一の反応で、生成する。
幾つかの実施形態では、核酸標的は、遺伝子、遺伝子のプロモーター領域または他の核酸である。幾つかの実施形態では、標的はCpGアイランドを含む。
C.検出
幾つかの実施形態では、増幅された核酸は、核酸への標識プローブの結合によって検出される。幾つかの実施形態では、検出はリアルタイム検出(例えば、増幅と同時)である。「リアルタイム」での増幅工程の評価は、増幅反応の間に連続的または定期的に反応混合物中のアンプリコンの量を決定し、決定された量を用いてサンプル中に最初に存在する標的配列の量を計算することを含む。リアルタイム増幅に基づくサンプル中に存在する初期標的配列の量を決定するための種々の方法は、当該技術分野で良く知られている。これらとしては、米国特許第6,303,305号および第6,541,205号に開示されている方法が挙げられ、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。リアルタイム増幅に基づくものではないが、サンプル中に最初に存在する標的配列の量を決定するための別の方法が米国特許第5,710,029号に開示されており、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。
幾つかの実施形態では、増幅された核酸は、核酸への標識プローブの結合によって検出される。幾つかの実施形態では、検出はリアルタイム検出(例えば、増幅と同時)である。「リアルタイム」での増幅工程の評価は、増幅反応の間に連続的または定期的に反応混合物中のアンプリコンの量を決定し、決定された量を用いてサンプル中に最初に存在する標的配列の量を計算することを含む。リアルタイム増幅に基づくサンプル中に存在する初期標的配列の量を決定するための種々の方法は、当該技術分野で良く知られている。これらとしては、米国特許第6,303,305号および第6,541,205号に開示されている方法が挙げられ、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。リアルタイム増幅に基づくものではないが、サンプル中に最初に存在する標的配列の量を決定するための別の方法が米国特許第5,710,029号に開示されており、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。
増幅生成物は、ステム−ループ構造を有する大部分の種々の自己ハイブリダイズプローブの使用によりリアルタイムで検出することができる。このような自己ハイブリダイズプローブは、これらが異なる検出可能なシグナルを発するように、プローブが標的配列へのハイブリダイゼーションを介して自己ハイブリダイズ状態または変更された状態にあるかどうかに依存して、標識される。非限定的な例として、「分子トーチ」は、自己相補性の別個の領域(「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」と呼ばれる。)であって、連結領域(例えば、非ヌクレオチドリンカー)によって連結され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする別個の領域を含む自己ハイブリダイズプローブの一種である。好ましい実施形態では、分子トーチは、長さが1から約20塩基であり、鎖置換条件下で増幅反応に存在する標的配列へのハイブリダイゼーションのためにアクセス可能な標的結合ドメイン中の1本鎖塩基領域を含む。鎖置換条件下で、完全にまたは部分的に相補性の、分子トーチの2つ相補性領域のハイブリダイゼーションは、標的結合ドメインに存在する1本鎖領域に結合して標的閉鎖ドメインの全部または部分を置換する標的配列の存在下の場合を除いて、支持される。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的配列にハイブリダイズした場合より自己ハイブリダイズした場合の方が、異なる信号がより生成され、これによって、非ハイブリダイズ化分子トーチの存在下で試験サンプル中のプローブ:標的二重鎖の検出が可能になるように配置された検出可能標識または相互作用標識ペア(例えば、発光/消光剤)を含む。分子トーチおよび種々のタイプの相互作用標識ペアは米国特許第6,534,274号に開示されており、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。
自己相補性を有する検出プローブの別の例は「分子ビーコン」である。分子ビーコンとしては、標的相補性配列を有する核酸分子、増殖反応中に存在する標的配列の非存在下で閉じたコンホメーションにプローブを保持する親和性ペア(または核酸アーム)、およびプローブが閉じたコンホメーションにある場合に相互作用する標識ペアが挙げられる。標的配列と標的相補性配列とのハイブリダイゼーションは、親和性ペアのメンバーを分離し、これによって、開いたコンホメーションにプローブをシフトさせる。開いたコンホメーションへのシフトは、例えば、蛍光体と消光剤(例えば、DABCYLとEDANS)であり得る標識ペアの減少した相互作用により、検出可能である。分子ビーコンは米国特許第5,925,517号および第6,150,097号に開示されており、これらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。
他の自己ハイブリダイズプローブは、当業者に良く知られている。非限定的な例として、米国特許第5,928,862号(この全体が本明細書に参照により組み込まれる。)に開示されるような相互作用標識を有するプローブ結合ペアが、本発明での使用に適合されるかもしれない。1塩基多型(SNP)を検出するために用いられるプローブシステムも本発明に利用することができるかもしれない。追加の検出システムとしては、この全体が本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願公開第2005/0042638号に開示されるような「分子スイッチ」が挙げられる。インターカレーティング色素および/または蛍光色素を含むものなどの他のプローブもまた、本発明における増幅生成物の検出に有用である。例えば、米国特許第5,814,447号が参照される(この全体が本明細書に参照により組み込まれる。)。
幾つかの実施形態では、キャピラリー電気泳動(CE)は、核酸断片を分析するために利用される。キャピラリー電気泳動の間に、核酸(例えば、PCR反応の生成物)は、ポリマーを充填したキャピラリー内に動電気的に注入される。蛍光DNA断片がサイズによって分離され、レーザー/カメラシステムによって検出されるように、高電圧が印加される。幾つかの実施形態では、Life Technogies(Grand Island,NY)からのCEシステムが断片サイジングのために利用される(例えば、米国特許第6,706,162号および米国特許第8,043,493号が参照され、これらのそれぞれの全体が本明細書の参照により組み込まれる。)。
幾つかの実施形態では、検出方法において利用されるプローブおよび/またはプライマーが標識される。幾つかの実施形態では、プローブ/プライマーがビオチン化され、タグ結合試薬はストレプトアビジンビーズなどのストレプトアビジン試薬である。ビオチン化プライマーを含む複製された核酸鎖(例えば、ビオチン化プライマーの伸長から生じるプライマー伸長生成物)をストレプトアビジンビーズと接触させることによって単離される。タグ付けされたプライマーとタグ結合剤との任意の組合せを利用することができる。他の適切な例としては、ハプテン化プライマーとビーズ、または抗体もしくはハプテンに結合した他の抗原結合タンパク質が挙げられる。適当なハプテンとしては、これらに限定されないが、ピラゾール、特にニトロピラゾール;ニトロフェニル化合物;ベンゾフラゾン;トリテルペン;尿素およびチオ尿素、特にフェニル尿素、およびさらにより具体的には、フェニルチオ尿素;本明細書ではロテノイドとも呼ばれるロテノンおよびロテノン誘導体;オキサゾールおよびチアゾール、特にオキサゾールおよびチアゾールスルホンアミド;クマリンおよびクマリン誘導体;ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体により例示されるシクロリグナン;およびこれらの組合せが挙げられる。ハプテンの特定の例としては、これらに限定されないが、2,4−ジニトロフェニル(DNP)、ビオチン、フルオレセイン誘導体(FITC、TAMRA、テキサスレッドなど)、ジゴキシゲニン(DIG)、5−ニトロ−3−ピラゾールカルバミド(ニトロピラゾール、NP)、4,5−ジメトキシ−2−ニトロシンナミド(ニトロシンナミド、NCA)、2−(3,4−ジメトキシフェニル)−キノリン−4−カルバミド(フェニルキノロン、DPQ)、2,1,3−ベンズオキサジアゾール−5−カルバミド(ベンゾフラザン、BF)、3−ヒドロキシ−2−キノキサリンカルバミド(ヒドロキシキノキサリン、HQ)、4−(ジメチルアミノ)アゾベンゼン−4’−スルホンアミド(DABSYL)、ロテノンイソオキサゾリン(Rot)、(E)−2−(2−(2−オキソ−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[b][1,4]ジアゼピン−4−イル)フェノジ)アセトアミド(ベンゾジアゼピン、BD)、7−(ジエチルアミノ)−2−オキソ−2H−クロメン−3−カルボン酸(クマリン343、CDO)、2−アセトアミド−4−メチル−5−チアゾールスルホンアミド(チアゾールスルホンアミド)およびp−メトキシフェニルピラゾポドフィルアミド(Podo)が挙げられる。
幾つかの実施形態では、核酸が検出され、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる米国特許第7,108,974号、第8,017,743号および第8,017,322号に記載される質量分析法(例えば,Abbott PLEX−ID system,Abbot Ibis Biosciences,Abbott Park,Illinois)を用いて固有の塩基組成シグネチャーの同定(BCS)によって特徴付けられる。
幾つかの実施形態では、核酸配列決定法が検出のために利用される。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される技術は、第二世代(別名Next Generationまたは Next−Gen)、第三世代(別名Next−Next−Gen)または第四世代(別名N3−Gen)配列決定技術で使用できることが見出されており、この技術としては、これらに限定されないが、パイロシーケンシング、シークエンシング・バイ・ライゲーション、単一分子シークエンシング、シーケンス・バイ・合成(SBS)、大規模並列クローン、大規模並列単一分子SBS、大規模並列単一分子リアルタイム、大規模並列単一分子リアルタイムナノ細孔技術などが挙げられる。MorozovaとMarraが、Genomics,92:255(2008)でこのような幾つかの技術のレビユーを提供しており、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。当業者は、RNAは細胞内でより安定でなくヌクレアーゼ攻撃に対してより受けやすいため、実験的に、RNAは通常、配列決定の前にDNAに逆転写されることを認識するであろう。
多くのDNA配列決定技術が当該技術分野で知られており、蛍光に基づく配列決定方法(例えば、Birren et al.,Genome Analysis:Analyzing DNA,1,Cold Spring Harbor,N.Y.が参照され、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。)が挙げられる。幾つかの実施形態では、技術は、当該技術分野で理解されている自動配列決定技術で使用できることが見出されている。幾つかの実施形態では、本技術は、区分けされたアンプリコンの並列配列決定(Kevin McKernan et al.、PCT公開番号WO2006084132、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。)で使用できることが見出されている。幾つかの実施形態では、この技術は、平行オリゴヌクレオチド伸長(例えば、Macevicz et al.、米国特許第5,750,341号およびMacevicz et al.、米国特許第6,306,597号が参照され、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)で使用できることが見出されている。本技術が使用できることが見出されている追加の配列決定技術の例としては、チャーチポロニー技術(Mitra et al.,2003,Analytical Biochemistry 320,55−65;Shendure et al.,2005 Science 309,1728−1732;米国特許第6,432,360号、第6,485,944号および第6,511,803号、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)、454ピコタイターパイロシーケンシング技術(Margulies et al.,2005 Nature 437,376−380;米国特許公開第2005/0130173号、これらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)、Sokexa単一塩基付加技術(Bennett et al.,2005,Pharmacogenomics,6,373−382;米国特許第6,787,308号および第6,833,246号、これらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)、Lynx大規模並列シグネチャー配列決定技術(Brenner et al.,(2000).Nat.Biotechnol.18:630−634;米国特許第5,695,934号、第5,714,330号、これらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)、およびAdessiPCRコロニー技術(Adessi et al.(2000).Nucleic Acid Res.28,E87およびWO00018957、これらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)が挙げられる。
次世代配列決定(NGS)方法は、古い配列決定方法に比べて低コストを目標に大規模並列で高スループット技術を共通の特徴として共有している(例えば、Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641−658,2009;MacLean et al.,Nature Rev.Microbiol.,7:287−296が参照され、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)。NGS方法は、典型的にテンプレート増幅を使用するものとそうでないものに広く分けることができる。増幅を必要とする方法としては、454技術プラットフォームとしてロシュにより市販されているパイロシーケンシング(例えば、GS 20およびGS FLX)、イルミナにより市販されているSolexaプラットフォーム、およびアプライドバイオシステムズにより市販されているサポートオリゴヌクレオチドライゲーションと検出(SOLiD)プラットフォームが挙げられる。単一分子配列決定としても知られている非増幅アプローチは、Helicos BioSciencesにより市販されているHeliScopeプラットフォーム、およびVisiGen、Oxford Nanopore Technologies Ltd.、Life Technologies/Ion TorrentおよびPacific Biosciencesによりそれぞれ市販されている注目技術プラットフォームによって例示される。
パイロシーケンシング(Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641−658,2009;MacLean et al.,Nature Rev.Microbiol.,7:287−296;米国特許第6,210,891および第6,258,568号、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)では、テンプレートDNAが断片化され、末端修復され、アダプターに連結され、クローンアダプターに相補的なオリゴヌクレオチドを保持するビーズで単一のテンプレート分子を捕捉することによってインシュートでクローン的に増幅される。単一のテンプレートタイプを保持する各ビーズは、油中水型マイクロベシクルに区画され、テンプレートは、エマルジョンPCRと呼ばれる技術を用いてクローン的に増幅される。エマルジョンは増幅後に破壊され、ビーズは、配列決定反応の間にフローセルとして機能ピコタイタープレートの個々のウェルに堆積される。4つのdNTP試薬のそれぞれの順序付けられた反復導入が、配列決定酵素およびルシフェラーゼなどの発光レポーターの存在下でフローセルに起こる。適切なdNTPが配列決定プライマーの3’末端に付加される場合には、得られるATPの産生により、CCDカメラを用いて記録されるウェル内の発光の破壊が引き起こされる。400塩基以上の長さの読み取りを達成することが可能であり、106配列の読み取りを達成することができ、配列の最大5億塩基ペア(Mb)までの読み取りが結果として達成される。
Solexa/Illuminaプラットフォーム(Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641−658,2009;MacLean et al.,Nature Rev.Microbiol.,7:287−296;米国特許第6,833,246号、第7,115,400号および第6,969,488号、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)では、配列決定データは、より短い長さの読み取りの形態で作製される。この方法では、1本鎖断片化DNAは末端修復されて、5’−リン酸化平滑末端を生成し、続いて、単一A塩基が断片の3’末端にクレノウ媒介的に付加される。A−添加は、オリゴヌクレオチドアンカーでちりばめられるフローセルの表面上にテンプレートアダプター分子を捕捉するためにその後に使用されるT−オーバーハングアダプターオリゴヌクレオチドの付加を容易にする。アンカーはPCRプライマーとして使用されるが、テンプレートの長さと他の近くのアンカーオリゴヌクレオチドへの近さのため、PCRによる伸長は、分子のアーチ形成に至り、隣接するアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、フローセルの表面上にブリッジ構造を形成する。DNAのこれらのループは変性され切断される。フォワード鎖はその後、可逆色素ターミネーターを用いて配列決定される。取り込まれたヌクレオチドの配列は、dNTP添加の次のサイクルの前に除去される蛍光体およびブロックのそれぞれで、ポスト取込み蛍光を検出することによって決定される。配列の読み取り長さは、分析ランあたり10億の塩基ペアを超える全体のアウトプットで、36ヌクレオチドから50以上ヌクレオチドの範囲である。
SOLiD技術(Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641−658,2009;MacLean et al.,Nature Rev.Microbiol.,7:287−296;米国特許第5,912,148号および第6,130,073号、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)を用いる核酸分子の配列決定もまた、テンプレートの断片化、オリゴヌクレオチドアダプターの連結、ビーズへ結合、およびエマルジョンPCRによるクローン増幅を含む。これに続いて、テンプレートを保持するビーズが、ガラスフローセルの誘導体化表面上に固定化され、アダプターオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーがアニール化される。しかし、このプライマーは、3’伸長のために利用するよりもむしろ、2つのプローブ特異的塩基続いて6縮重塩基と4蛍光ラベルの1つを含むインターロゲイションプローブへの連結のための5’リン酸基を提供するのに使用される。SOLiDシステムでは、インターロゲイションプローブは、各プローブの3’末端に2つの塩基と5’末端に4つの蛍光体との16の可能な組合せを有する。蛍光体の色、従って各プローブの同一性は、特定化された色−空間コードスキームに対応する。プローブアニーリング、ライゲーションおよび蛍光体検出の複数のラウンド(通常は7)は、その後に、変性、次いで、初期プライマーに対して1つの塩基でオフセットされるプライマーを用いた配列決定の第二ラウンドが続いている。この方法では、テンプレート配列はコンピュータで再構成することができ、テンプレート塩基は2度インターロゲーションされて、高い精度が得られる。配列の読み取りの長さは、平均で35個のヌクレオチドであり、全体のアウトプットは、配列決定ランあたり40億の塩基を超える。
特定の実施形態では、技術は、ナノ細孔配列決定(例えば、Astier et al.,J.Am.Chem.Soc.2006 Feb 8;128(5)1705−10が参照され、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。)で使用できることが見出されている。ナノ細孔配列決定の背後にある理論は、ナノ細孔が導電性流体中に浸漬されて電位(電圧)がこれに印加されたときに起こるものに関係している。これらの条件下で、ナノ細孔を通るイオンの伝導による僅かな電流を観察することができ、電流の量は、ナノ細孔の大きさに非常に敏感である。核酸の各塩基がナノ細孔を通過すると、4つの塩基のそれぞれとは異なるナノ細孔を通る電流の大きさの変化が起こり、これにより、決定されるべきDNA分子の配列が可能にされる。
特定の実施形態では、技術は、Helicos BioSciencesによるHeliScope(Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641−658,2009;MacLean et al.,Nature Rev.Microbiol.,7:287−296;米国特許第7,169,560号、第7,282,337号、第7,482,120号、第7,501,245号、第6,818,395号、第6,911,345号および第7,501,245号、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)での使用に見出される。テンプレートDNAが断片化され、蛍光標識を有する最終的なアデノシンにより3’末端でポリアデニル化される。変性化ポリアデニル化テンプレート断片は、フローセルの表面上のポリ(dT)のオリゴヌクレオチドに連結される。捕捉されたテンプレート分子の最初の物理的な位置は、CCDカメラによって記録され、その後、標識が切断され、洗い流される。配列決定は、ポリメラーゼおよび蛍光標識されたdNTP試薬の一連の添加によって達成される。取込み事象は、dNTPに対応する蛍光体信号を生じ、信号は、dNTP添加の各ラウンドの前に、CCDカメラによって捕捉される。配列の読み取り長さは、分析ランあたり10億の塩基ペアを超える全体のアウトプットで、25から50ヌクレオチドの範囲である。
Ion Torrent技術は、DNAの重合の間に放出される水素イオンの検出に基づくDNA配列決定方法である(例えば、Science 327(5970):1190(2010);米国特許出願公開第2009/0026082号、第2009/0127589号、第2010/0301398号、第2010/0197507号、第2010/0188073号および第2010/0137143号が参照され、これらの全ては全ての目的のために本明細書に参照により組み込まれる。)。マイクロウェルは、配列決定されるテンプレートDNA鎖を含む。マイクロウェルの層の下は、過敏性ISFETのイオンセンサである。全ての層は、エレクトロニクス産業において使用されるものと同様のCMOSの半導体チップ内に含まれている。dNTPが成長する相補性鎖に組み込まれたときに、水素イオンが放出され、過敏性イオンセンサをトリガーされる。ホモポリマー反復がテンプレート配列中に存在する場合、複数のdNTP分子は単一サイクル中に組み込まれる。これは、放出された水素の対応する数と、比例してより高い電子信号につながる。この技術は、修飾ヌクレオチドまたは光学部品が使用されない点で、他の配列決定技術とは異なる。Ion Torrentシーケンサーの塩基あたりの精度は、ランあたり100Mb以下の生成で、50塩基の読み取りについては99.6%以下である。読み取り長さは100塩基ペアである。長さが5反復のホモポリマーについての精度は98%以下である。イオン半導体配列決定利点は、迅速な配列決定速度と低先行の運用コストである。
本技術は、Stratos Genomics,Inc.によって開発された別の核酸配列決定アプローチで使用できることが分っており、本技術はXpandomersの使用を含む。この配列決定工程は、典型的には、テンプレート指向合成によって生産される娘鎖を提供することを含む。娘鎖は、一般的に、個々のサブユニットがテザー、少なくとも1つのプローブまたは核酸塩基残基および選択的に切断可能な結合を含む、標的核酸の全てまたは一部の連続ヌクレオチド配列に対応する配列に結合された複数のサブユニットを含む。選択的に切断可能な結合が切断されて、娘鎖の複数のサブユニットよりも長い長さのXpandomerを得る。Xpandomerは、典型的には、標的核酸の全てまたは一部の連続するヌクレオチド配列に対応する配列における遺伝情報を解析するためのテザーおよびレポーターエレメントを含む。Xpandomerのレポーターエレメントが次いで検出される。Xpandomerに基づくアプローチに関するさらなる詳細は、例えば、2008年6月19日に出願された「拡張によるハイスループット核酸配列決定」と題する米国特許出願公開第2009/0035777号に記載されており、この全体が本明細書に参照により組み込まれる。
他の最新の単一分子配列決定法は、VisiGenプラットフォーム(Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641−58,2009;米国特許第7,329,492号、米国特許出願第11/671956号および第11/781166号、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。)を用いる合成によるリアルタイムの配列決定を含み、VisiGenプラットフォームでは、固定化されプライムされたDNAテンプレートが蛍光修飾されたポリメラーゼおよび蛍光アクセプター分子を用いる鎖拡張に供されて、塩基添加時の検出可能な蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を生じる。
幾つかの実施形態では、検出方法はハイブリダイゼーションアッセイを利用する。核酸ハイブリダイゼーション技術の例示的な非限定的な例としては、これらに限定されないがマイクロアレイが挙げられ、マイクロアレイは、これに限定されないが、DNAマイクロアレイ(例えば、cDNAマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ)を含む。遺伝子チップ、DNAチップまたはバイオチップとして一般的に知られているDNAマイクロアレイは、数千の遺伝子の発現レベルを同時にプロファイリングしモニターする目的でアレイを形成する固体表面(例えば、ガラス、プラスチックまたはシリコンチップ)に付着した微細なDNAスポットの集合である。固定されたDNAセグメントは、この数千が単一のDNAマイクロアレイに使用することができるプローブとして知られている。マイクロアレイは、疾患細胞と正常細胞との遺伝子発現を比較することにより疾患遺伝子または転写物を同定するために用いることができる。これらに限定されないが、スライドガラス上への僅かに尖ったピンでの印刷、予め用意されたマスクを用いたフォトリソグラフィ、動的マイクロミラーデバイスを用いたフォトリソグラフィ、インクジェット印刷、または微小電極アレイ上の電気化学を含む種々の技術を用いて、マイクロアレイを組み立てて製造することができる。
サザンおよびノーザンブロット法をそれぞれ特定のDNAまたはRNA配列を検出するために用いられる。サンプルから抽出されたDNAまたはRNAは、断片化され、マトリックスゲル上で電気泳動的に分離され、膜フィルターに転写される。フィルターに結合したDNAまたはRNAは、目的の配列に相補性の標識プローブとのハイブリダイゼーションに付される。フィルターに結合したハイブリダイズしたプローブが検出される。手順の変形は、逆ノーザンブロットであり、逆ノーザンブロットでは、膜に固定されている基質核酸が単離されたDNA断片の集合であり、プローブが組織から抽出され標識されたRNAである。
1つの例示的な検出方法であるハイブリダイゼーション保護アッセイ(HPA)は、標的配列に化学発光オリゴヌクレオチドプローブ(例えば、アクリジニウムエステル(AE)標識プローブ)をハイブリダイズし、ハイブリダイズしていないプローブ上に存在する化学発光標識を選択的に加水分解し、照度計中の残りのプローブから生産される化学発光を測定することを含む。例えば、米国特許第5,283,174号、およびNorman C.Nelson et al.,Nonisotopic Probing,Blotting,and Sequencing,ch.17(Larry J.Kricka ed.,2d ed.1995)が参照され、これらのそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれる。
D.分析
幾つかの実施形態では、コンピュータに基づく分析プログラムを用いて、検出アッセイ(例えば、核酸のメチル化レベル)によって生成された生データをエンドユーザ(例えば、医療従事者)のための予測値のデータに変換される。ユーザは、任意の適切な手段を用いて予測データにアクセスすることができる。このように、幾つかの好ましい実施形態では、本発明は、遺伝学や分子生物学の訓練を受けた可能性が高くないユーザが生データを理解する必要がないというさらなる利益を提供する。データは、この最も有用な形でエンドユーザに直接提示される。ユーザは、次いで、有用な情報(例えば、医療診断、研究またはスクリーニングにおける。)を決定するために情報をすぐに利用することができる。
幾つかの実施形態では、コンピュータに基づく分析プログラムを用いて、検出アッセイ(例えば、核酸のメチル化レベル)によって生成された生データをエンドユーザ(例えば、医療従事者)のための予測値のデータに変換される。ユーザは、任意の適切な手段を用いて予測データにアクセスすることができる。このように、幾つかの好ましい実施形態では、本発明は、遺伝学や分子生物学の訓練を受けた可能性が高くないユーザが生データを理解する必要がないというさらなる利益を提供する。データは、この最も有用な形でエンドユーザに直接提示される。ユーザは、次いで、有用な情報(例えば、医療診断、研究またはスクリーニングにおける。)を決定するために情報をすぐに利用することができる。
本発明は、アッセイを実施する研究室から情報を受け、プロセッシングし、情報をそこへ伝送することができる任意の方法を企図しており、医療関係者および対象者に情報を提供する。例えば、本発明の幾つかの実施形態では、サンプル(例えば、血液、細胞または組織試料)は対象者から得られ、世界の任意の部分に(例えば、対象者が居住する国とは異なる国に)に位置するプロファイリングサービス(例えば、医療施設の研究室、ゲノムプロファイリング事業など)に提出されて、生データを生成する。サンプルが組織または他の生物学的サンプルを含む場合は、対象者が医療センターを訪問してサンプルを採取し、プロファイリングセンターに送付する、または対象者がサンプル自体を収集し(例えば、口腔粘膜検体採取)、これをプロファイリングセンターへ直接送付することもできる。サンプルが予め定められた生物学的情報を含む場合、情報を対象者によって直接プロファイリングセンターへ送付することもできる(例えば、情報を含む情報カードをコンピュータでスキャンしてもよく、データは、電子通信システムを用いてプロファイリングセンターのコンピュータに伝送することができる。)。プロファイリングサービスにより受信されると、サンプルが処理され、対象者の所望の情報のための特定のプロファイル(例えば、メチル化データ)が作製される。
データは、次いで、エンドユーザ(例えば、医療従事者)による解釈に適した形式で用意される。例えば、生データを提供するよりもむしろ、用意された形式は、対象者のために結論や評価を表すことができる(例えば、癌の発症リスクまたは癌の可能性が表される。)。データは、任意の適切な方法によってユーザに表示することができる。例えば、幾つかの実施態様では、プロファイリングサービスにより、ユーザのために印刷またはコンピュータのモニター上に表示することができるレポートが作製される。
幾つかの実施形態では、情報は、最初に局地の医療施設または地域の施設で分析される。生データは、その後、さらなる分析のために中央プロセッシング施設に送られ、および/またはユーザに有用な情報に変換される。中央プロセッシング施設は、プライバシーの利点(全てのデータは、一様なセキュリティプロトコールを有する中央施設に保存される。)、スピードおよびデータ分析の均一性を提供する。中央プロセッシング施設は、その後、対象者の治療後のデータの運命を制御することができる。例えば、電子通信システムを用いて、中央施設は、エンドユーザへのデータを対象者または研究者に提供することができる。
E.システムおよびキット
幾つかの実施形態では、本発明は、核酸の増幅および/または分析のためのキットおよびシステムを提供する。幾つかの実施形態では、キットは、必要十分な、または分析のために有用であり、メチル化核酸の分析および検出に必要十分な、または有用な検出試薬(例えば、プライマー、プローブ、固体支持体、試薬、対照、説明書など)を含む。例えば、幾つかの実施形態では、キットは、標的の複数のアンプリコンの増幅のためのプライマーペアを含む。幾つかの実施形態では、キットは、複数の標識されたプローブ(例えば、同じまたは異なる標識を含む。)を含む。幾つかの実施形態では、キットは、メチル化特異的検出のための試薬(例えば、亜硫酸水素塩試薬)を含む。幾つかの実施形態では、システムは、自動化されたサンプルおよび試薬ハンドリング装置(例えば、ロボット)を含む。
幾つかの実施形態では、本発明は、核酸の増幅および/または分析のためのキットおよびシステムを提供する。幾つかの実施形態では、キットは、必要十分な、または分析のために有用であり、メチル化核酸の分析および検出に必要十分な、または有用な検出試薬(例えば、プライマー、プローブ、固体支持体、試薬、対照、説明書など)を含む。例えば、幾つかの実施形態では、キットは、標的の複数のアンプリコンの増幅のためのプライマーペアを含む。幾つかの実施形態では、キットは、複数の標識されたプローブ(例えば、同じまたは異なる標識を含む。)を含む。幾つかの実施形態では、キットは、メチル化特異的検出のための試薬(例えば、亜硫酸水素塩試薬)を含む。幾つかの実施形態では、システムは、自動化されたサンプルおよび試薬ハンドリング装置(例えば、ロボット)を含む。
II.使用
本明細書に記載されるシステムおよび方法は、様々な研究、スクリーニングおよび診断用途に使用できることが分かっている。幾つかの実施形態では、上記した多重メチル化特異的増幅法は、対象者における疾患に対する体質を予測するために、対象者における疾患を診断するために、対象者における疾患の再発の可能性を予測するために、疾患を有する対象の予後を提供するために、または特定の療法での治療のための疾患を有する対象を選択するために、利用される。これらの工程は、好ましくは、対象者からのゲノムDNAサンプルを準備すること、および上記した工程によって、ゲノムDNAサンプルの所定領域のメチル化状態を検出することを含む。幾つかの実施形態では、ゲノムDNAの所定領域の5−ヒドロキシメチルシトシンおよび/または5−メチルシトシンのメチル化の基準メチル化状態へのレベルの変化(例えば、より高いまたはより低いレベル)は、対象者の疾患に対する体質の指標、対象者が疾患を持っていることの指標、対象者における疾患の再発の可能性の指標、対象者の生存の指標、および対象者が特定の療法での治療のための候補者であることの指標からなる群から選択される指標を提供する。
本明細書に記載されるシステムおよび方法は、様々な研究、スクリーニングおよび診断用途に使用できることが分かっている。幾つかの実施形態では、上記した多重メチル化特異的増幅法は、対象者における疾患に対する体質を予測するために、対象者における疾患を診断するために、対象者における疾患の再発の可能性を予測するために、疾患を有する対象の予後を提供するために、または特定の療法での治療のための疾患を有する対象を選択するために、利用される。これらの工程は、好ましくは、対象者からのゲノムDNAサンプルを準備すること、および上記した工程によって、ゲノムDNAサンプルの所定領域のメチル化状態を検出することを含む。幾つかの実施形態では、ゲノムDNAの所定領域の5−ヒドロキシメチルシトシンおよび/または5−メチルシトシンのメチル化の基準メチル化状態へのレベルの変化(例えば、より高いまたはより低いレベル)は、対象者の疾患に対する体質の指標、対象者が疾患を持っていることの指標、対象者における疾患の再発の可能性の指標、対象者の生存の指標、および対象者が特定の療法での治療のための候補者であることの指標からなる群から選択される指標を提供する。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、メチル化された遺伝子プロモーターを標的としている。遺伝子プロモーターは、しばしば、癌患者においてメチル化されており、このメチル化が、関連遺伝子の転写の阻害に関連することが示されている。遺伝子プロモーターは、約500塩基から1000塩基を超えるまでの大きさで変動することができる。PCRアッセイを利用する幾つかの実施形態では、アンプリコンのサイズは、通常、100塩基対以下である。従って、幾つかの実施形態では、幾つかのアンプリコンは、特定の遺伝子プロモーターまたは他の標的核酸の標的とされる。幾つかの実施形態では、複数のアンプリコンが、単一のPCR反応ウェルまたはチューブで作製される。幾つかの実施形態では、シグナル伝達分子(例えば、蛍光体)の同じタイプが、それぞれ固有のプローブのために使用される。これにより、単一のアンプリコンに関連していた単一のプローブを使用する増幅反応に対してシグナルの増加がもたらされ、従って、単一のアンプリコンを利用する方法に比べてアッセイ感度の増加につながる。幾つかの実施形態では、非相補性DNAの両方の固有の鎖が天然の2本鎖DNAの亜硫酸水素塩変換によって生成される。
本明細書に記載されるシステムおよび方法は、メチル化検出アッセイの任意の数に使用できることが見出されている。幾つかの実施形態では、多重方法は、疾患(例えば、癌)を検出するためのプロモーターのメチル化アッセイに用いられる。
上記の明細書で言及した全ての刊行物および特許は、本明細書に全ての目的のためにこの全体が参照により組み込まれる。記載される組成物、方法および技術の使用の様々な修飾および変形が、記載されるような技術の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。技術は特定の例示的な実施形態に関連して記載されてきたが、特許請求の範囲に記載される本発明は、かかる特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際、関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するための記載された様式の種々の修飾が、以下の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
Claims (24)
- a)標的核酸を、メチル化特異的検出試薬で処理することと、
b)前記標的核酸内の複数の核酸セグメントを同時に増幅して、複数のアンプリコンを生成することと、
c)前記複数のアンプリコンを検出することと
を含む方法。 - 前記標的核酸が、遺伝子のプロモーター領域である、請求項1に記載の方法。
- 前記メチル化特異的検出試薬が、亜硫酸水素塩である、請求項1に記載の方法。
- 前記同時増幅を、単一反応容器で実施する、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸が、GCリッチである、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸が、CpGアイランドを含む、請求項5に記載の方法。
- 亜硫酸水素塩が、非メチル化シトシン残基と反応し、その後、ウラシル残基に変換する、請求項3に記載の方法。
- 亜硫酸水素塩が、非メチル化シトシン残基と反応せず、これらを5−メチルシトシンとして残す、請求項3に記載の方法。
- 前記増幅がPCRである、請求項1に記載の方法。
- 前記検出が、前記アンプリコンを複数の核酸プローブと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸プローブが、検出可能な標識を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記複数の核酸プローブが同じ標識を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記標識が蛍光標識である、請求項11または12に記載の方法。
- 前記増幅および検出が、リアルタイムPCR増幅および検出を含む、請求項4から13のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記検出が、質量分析、配列決定およびハイブリダイゼーションからなる群から選択される核酸検出技術を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のアンプリコンが少なくとも5つのアンプリコンを含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のアンプリコンが少なくとも10個のアンプリコンを含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸を増幅する方法であって、
a)メチル化特異的検出試薬で処理した標的核酸内の複数の核酸セグメントを同時に増幅して、複数のアンプリコンを生成することと、
b)前記複数のアンプリコンを検出することと
を含む、核酸を増幅する方法。 - a)メチル化特異的検出試薬で標的核酸を処理することと、
b)前記標的核酸内の複数の核酸セグメントを同時に増幅して、複数のアンプリコンを生成することと、
c)前記アンプリコンを複数の核酸プローブと接触させて、前記複数のアンプリコンを検出することと
を含む方法。 - a)標的核酸の増幅のための複数のプライマーペアと、
b)前記複数のプライマーペアで増幅されたアンプリコンに特異的に結合する複数の核酸プローブと、
c)メチル化特異的検出試薬と
を含むキット。 - 検出可能な標識を含む、請求項20に記載のキット。
- 前記複数の核酸プローブは同じ標識を含む、請求項21に記載のキット。
- 前記標識が蛍光標識である、請求項20または21に記載のキット。
- 前記メチル化特異的試薬が亜硫酸水素塩である、請求項18に記載のキット。
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