KR102436270B1

KR102436270B1 - 메틸화된 dna 분석에 의한 폐 종양의 검출

Info

Publication number: KR102436270B1
Application number: KR1020187035020A
Authority: KR
Inventors: 하팀 알라위; 그라함 피. 리드가드; 마리아 지아코우모파울러스; 데이비드 에이. 알퀴스트; 윌리엄 알. 테일러; 더글라스 마호니
Original assignee: 이그젝트 싸이언스 디블롭먼트 컴패니, 엘엘씨; 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치
Priority date: 2016-05-05
Filing date: 2017-03-28
Publication date: 2022-08-25
Also published as: US11028447B2; CN116064796A; AU2017260630B2; US20170335401A1; CA3022911A1; CN109563546B; CN109563546A; WO2017192221A1; EP3452616A1; AU2023248106A1; KR20190004768A; EP3452616A4; US10385406B2; AU2017260630A8; AU2017260630A1; US20210262042A1; US20190330702A1

Abstract

폐 신생물 선별을 위한 기술 및 특히, 비배타적으로, 폐암의 존재를 검출하기 위한 방법, 조성물, 및 관련 용도가 여기에 제공된다.

Description

메틸화된 DNA 분석에 의한 폐 종양의 검출

본 출원은 미국 가출원 일련 번호 제62/332,295호(2016.5.5. 출원) 및 제62/462,677호(2017.2.23. 출원)에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각은 참조로 여기에 수록된다.

발명의 분야

종양 검출에 관한 기술, 특히 비배타적으로, 폐암과 같은 신생물을 검출하기 위한 방법, 조성물, 및 관련 용도에 관한 기술이 제공된다.

발명의 배경

폐암은 미국에서 여전히 최고의 암 살인자로 남아 있으며, 효과적인 선별 방법이 절실히 필요하다. 폐암만으로 매년 221,000명이 사망한다. DNA 메틸화 프로파일링은 암이 있는 DNA 프로모터 영역에서 독특한 패턴을 나타냈으며 폐 악성종양의 검출에 상당한 적용가능성이 있다. 그러나, 최적의 판별 마커와 마커 패널이 필요하다.

발명의 개요

여기에는 정상 폐 조직 및 양성 결절에서 음성으로 남아있는 동안 모든 유형의 폐암에 대해 극히 높은 판별을 달성하는 조직에서 분석된 메틸화된 메틸화 마커의 집합체가 제공된다. 상기 집합체로부터 선택된 마커는 단독으로 또는 패널에서, 예를 들어, 양성 결절로부터 악성종양의 폐암 선별 또는 판별에 적용되면서, 혈액 또는 체액을 특성화하기 위하여 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 패널로부터의 마커는 한 가지 유형의 폐암을 다른 것과 구별시키기 위해 사용되며, 예를 들어, 폐 선암종 또는 대세포암종의 존재를 폐 소세포암종의 존재로부터 구별하기 위해, 또는 혼합 병리학 암종을 검출하기 위해 사용된다. 여기에는 대상체로부터 채취한 샘플로부터 검출될 때 높은 신호-대-잡음비 및 낮은 백그라운드 수준을 제공하는 마커를 선별하는 기술이 제공된다.

BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1, NKX6 _2, FAM59B , DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1, MAX_ chr8 .145, MAX_ chr10 .225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B, DOCK2 , MAX_ chr19 .163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2, ARHGEF4 , CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA_22, FLJ45983 , DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX. chr12 .526, BCL2L11 , OPLAH, PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8 , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14 , FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2_Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX , S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15 , ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터 선택된 주석을 갖는 메틸화 마커 및/또는 마커의 패널(예컨대, 염색체 영역)은 폐암 샘플에서 얻은 메틸화 마커의 메틸화 상태를 정상(비-암성) 샘플에서의 대응 마커와 비교함으로써 연구에서 확인되었다.

여기서 기술되듯이, 이 기술은 폐암에 대한 높은 판별 및, 일부 구체예에서, 폐암 유형 사이의 판별을 갖는 다수의 메틸화 마커 및 그 서브세트(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 이상의 마커들의 세트들)를 제공한다. 실험은 예컨대, 암 선별 또는 진단을 위하여 생물학적 샘플을 특성화하기 위한 목적으로 높은 특이성 및 선택성을 제공하기 위한 높은 신호 대 잡음비와 낮은 백그라운드 수준을 제공하는 마커를 식별하기 위해 후보 마커에 선택 필터를 적용했다. 예를 들어, 아래에서 기술되듯이, 8개 마커, SLC12A8 , KLHDC7B , PARP15 , OPLAH , BCL2L11, MAX. chr12 .526, HOXB2 , 및 EMX1의 조합의 메틸화 분석은 시험된 모든 암 조직에 대해 98.5% 민감도(134/136 암), 및 100% 특이성을 나타냈다. 또 다른 구체예에서, 패널 6개 마커(SHOX2 , SOBP , ZNF781 , CYP26C1 , SUCLG2 , 및 SKI는 ROC를 나타냈음)는 93% 특이성에서 92.2%의 민감도를 나타냈고, 4개 마커(ZNF781, BARX1, EMX1, 및 HOXA9)의 패널은 96%의 전체 민감도 및 94%의 특이성을 나타냈다.

따라서, 본 출원에서는 대상체로부터 획득된 샘플을 처리하는 방법에 관한 기술이 제공되며, 상기 방법은 샘플에서 하나 이상의 마커 유전자의 메틸화 상태를 분석하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 메틸화 마커의 메틸화 상태는 샘플 내에서 메틸화된 마커 및 기준 마커의 양을 측정하고, 샘플 내에서 메틸화된 마커의 양을 기준 마커의 양과 비교하여 샘플 내에서 메틸화 마커에 대한 메틸화 상태를 결정함으로써 결정된다. 발명을 특정 응용 또는 응용들에 한정하지 않으면서, 상기 방법은, 예컨대, 메틸화 마커의 메틸화 상태가 신생물을 갖지 않는 대상체에서 분석된 해당 마커의 메틸화 상태와 상이할 때, 폐암이 있거나 있는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻은 샘플을 특성화하는 용도를 발견한다. 바람직한 구체예에서, 메틸화 마커는 BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1, ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B , DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_chr10.226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_ chr10 .225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX.chr16.50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_ chr19 .163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9, TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1, PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4 , SHOX2 , EMX1 , HOXB2 , MAX.chr12.526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8 , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14, FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX , S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15, ZDHHC1, 및 ZNF329로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 기술은 복수의 마커를 분석하는 것을 포함하는데, 예컨대, 2개 내지 21개 마커, 바람직하게는 2개 내지 8개 마커, 바람직하게는 4개 내지 6개 마커들의 메틸화 상태를 분석하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 상기 방법은 SLC12A8 , KLHDC7B , PARP15 , OPLAH , BCL2L11 , MAX.chr12.526, HOXB2 , EMX1 , CYP26C1 , SOBP , SUCLG2 , SHOX2 , ZDHHC1 , NFIX , FLJ45983, HOXA9 , B3GALT6, ZNF781 , SP9, BARX1 , 및 SKI로부터 선택된 둘 이상의 마커의 메틸화 상태의 분석을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, SLC12A8 , KLHDC7B , PARP15 , OPLAH, BCL2L11 , MAX. chr12 .526, HOXB2 , 및 EMX1을 포함하는 마커들의 세트의 메틸화 상태의 분석을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은, ZNF781 , BARX1 , 및 EMX1로 구성된 그룹; SHOX2 , SOBP , ZNF781 , CYP26C1 , SUCLG2 , 및 SKI로 구성된 그룹; SLC12A8 , KLHDC7B , PARP15 , OPLAH , BCL2L11 , MAX. chr12 .526, HOXB2 , 및 EMX1로 구성된 그룹; SHOX2 , SOBP , ZNF781 , BTACT , CYP26C1 , 및 DLX4로 구성된 그룹; 및 SHOX2, SOBP , ZNF781 , CYP26C1 , SUCLG2 , 및 SKI로 구성된 그룹으로부터 선택된 마커들의 세트의 메틸화 상태의 분석을 포함한다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 메틸화 마커는 ZNF781 , BARX1 , 및 EMX1로부터 선택된 그룹을 포함하며, SOBP 및/또는 HOXA9을 더욱 포함한다.

상기 기술은 평가된 메틸화 상태에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서 샘플 내에서 메틸화 마커의 메틸화 상태를 평가하는 것은 하나의 염기의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플 내에서 마커의 메틸화 상태를 분석하는 것은 복수의 염기에서 메틸화 정도를 결정하는 것을 포함한다. 더욱이, 일부 구체예에서 마커의 메틸화 상태는 마커의 정상 메틸화 상태에 비하여 마커의 증가된 메틸화를 포함한다. 일부 구체예에서, 마커의 메틸화 상태는 마커의 정상 메틸화 상태에 비하여 마커의 감소된 메틸화를 포함한다. 일부 구체예에서, 마커의 메틸화 상태는 마커의 정상 메틸화 상태에 비하여 마커의 메틸화의 상이한 패턴을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 기술은 대상체에서 폐 신생물을 보고하는 기록을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

a) 대상체로부터 획득된 샘플 내에서 BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4, MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B , DIDO1 , MAX_Chr1.110, AGRN , SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_ chr10 .225, PRDM14, ANGPT1 , MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_ chr19 .163, ZNF132, MAX chr19 .372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR, GRIN2D , MATK , BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX. chr12 .526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8 , BHLHE23, CAPN2 , FGF14 , FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX , S1PR4, SKI, SUCLG2 , TBX15 , ZDHHC1 , 및 ZNF329로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 메틸화된 메틸화 마커 유전자의 양에 대하여 대상체로부터의 샘플을 분석하는 단계;

b) 상기 샘플 내에서 기준 마커의 양에 대하여 상기 샘플을 분석하는 단계;

c) 상기 샘플 내에서 상기 적어도 하나의 메틸화된 메틸화 마커의 양을 상기 기준 마커의 양과 비교하여 상기 샘플 내에서 상기 적어도 하나의 메틸화 마커에 대한 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및

d) 상기 샘플 내에서 상기 적어도 하나의 마커 유전자에 대한 메틸화 상태를 보고하는 기록을 생성하는 단계, 여기서 상기 메틸화 마커의 메틸화 상태는 상기 대상체에서 폐 신생물의 존재 또는 부존재를 나타냄.

일부 구체예에서, 샘플은 적어도 2개의 마커에 대하여 분석되며, 바람직하게는 상기 적어도 2개의 메틸화된 마커 유전자는 SLC12A8 , KLHDC7B , PARP15 , OPLAH , BCL2L11, MAX. chr12 .526, HOXB2 , EMX1 CYP26C1 , SOBP , SUCLG2 , SHOX2 , ZDHHC1 , NFIX, FLJ45983 , HOXA9 , B3GALT6 , ZNF781 , SP9, BARX1 , 및 SKI로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 방법은, ZNF781 , BARX1 , 및 EMX1로 구성된 그룹; SHOX2 , SOBP , ZNF781 , CYP26C1 , SUCLG2 , 및 SKI로 구성된 그룹; SLC12A8, KLHDC7B , PARP15 , OPLAH , BCL2L11 , MAX. chr12 .526, HOXB2 , 및 EMX1로 구성된 그룹; SHOX2 , SOBP , ZNF781 , BTACT , CYP26C1 , 및 DLX4로 구성된 그룹; 및 SHOX2, SOBP , ZNF781 , CYP26C1 , SUCLG2 , 및 SKI로 구성된 그룹으로부터 선택된 마커들의 세트의 메틸화 상태의 분석을 포함한다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 메틸화 마커는 ZNF781 , BARX1 , 및 EMX1로부터 선택된 그룹을 포함하며, SOBP 및/또는 HOXA9을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 메틸화 마커들은, 상기 하나 이상의 마커의 메틸화 상태가 폐 선암종, 대세포암종, 편평 세포 암종, 또는 소세포암종 중 단지 하나를 나타내도록 선택된다. 또 다른 구체예에서, 메틸화 마커들은, 상기 하나 이상의 마커의 메틸화 상태가 폐 선암종, 대세포암종, 편평 세포 암종, 및 소세포암종 중 둘 이상을 나타내도록 선택된다. 또 다른 구체예에서, 메틸화 마커들은, 상기 하나 이상의 마커의 메틸화 상태가 폐 선암, 대세포암종, 편평 세포 암종, 소세포암종, 일반 비-소세포 폐암, 및/또는 미정의 폐 암종 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 나타내도록 선택된다.

일부 구체예에서 분석을 위하여 사용되는 방법은 대상체로부터 DNA를 포함하는 샘플을 획득하는 단계, 및 상기 샘플로부터 획득된 DNA를 상기 획득된 DNA에서 비메틸화된 시토신 잔기를 선택적으로 변형시키는 시약으로 처리하여 변형된 잔기를 생성하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서 상기 시약은 바이설파이트(bisulfite) 시약을 포함한다.

일부 구체예에서 샘플 내에서 메틸화 마커의 메틸화 상태를 분석하는 것은 하나의 염기의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하며, 한편 또 다른 구체예에서 분석은 복수의 염기에서 메틸화의 정도를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서 마커의 메틸화 상태는, 예컨대 마커가 비-암성 샘플에서 나타남에 따라, 마커의 정상 메틸화 상태에 비하여 마커의 증가된 또는 감소된 메틸화를 포함하며, 한편 일부 구체예에서 마커의 메틸화 상태는 마커의 정상 메틸화 상태에 비하여 마커의 메틸화의 상이한 패턴을 포함한다. 바람직한 구체예에서 상기 기준 마커는 메틸화된 기준 마커이다.

상기 기술은 특정 샘플 유형에 한정되지 않는다. 예를 들어, 일부 구체예에서 상기 샘플은 조직 샘플, 혈액 샘플, 혈장 샘플, 혈청 샘플, 또는 가래 샘플이다. 특정 바람직한 구체예에서 조직 샘플은 폐 조직을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서, 상기 샘플은 혈장으로부터 분리된 DNA를 포함한다.

상기 기술은 샘플로부터 DNA를 분석하는 특정 방법에 한정되지 않는다. 예를 들어, 일부 구체예에서 분석은 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분광법, 메틸화 특이성 뉴클레아제, 질량-기반 분리, 및/또는 표적 포획을 사용하는 것을 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서 상기 분석은 플랩 엔도뉴클레아제 분석을 사용하는 것을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서 샘플 DNA 및/또는 기준 마커 DNA는 바이설파이트-전환되며 DNA의 메틸화 수준을 결정하기 위한 분석은 메틸화-특이성 PCR, 정량적 메틸화-특이성 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱, 플랩 엔도뉴클레아제 분석(예컨대, QUARTS 플랩 엔도뉴클레아제 분석), 및/또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR의 사용을 포함하는 기술에 의해 달성된다.

상기 기술은 또한 키트를 제공한다. 예를 들어, 일부 구체예에서 상기 기술은 키트를 제공하며, 이는 a) 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부분은 BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4, MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B , DIDO1 , MAX_Chr1.110, AGRN , SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_ chr10 .225, PRDM14, ANGPT1 , MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_ chr19 .163, ZNF132, MAX chr19 .372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR, GRIN2D , MATK , BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX. chr12 .526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8 , , BHLHE23, CAPN2 , FGF14 , FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX , S1PR4, SKI, SUCLG2 , TBX15 , ZDHHC1 , 및 ZNF329로 구성된 군으로부터 선택되는 마커에 특이적으로 혼성화된다. 바람직한 구체예에서, 마커에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드의 상기 일부분은 메틸화 마커를 포함하는 바이설파이트-처리된 DNA에 특이적으로 혼성화된다. 일부 구체예에서, 상기 키트는 적어도 하나의 추가 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 추가 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부분은 기준 핵산에 특이적으로 혼성화된다. 일부 구체예에서 상기 키트는 적어도 2개의 추가 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 일부 구체예에서, 상기 키트는 바이설파이트 시약을 더욱 포함한다.

특정 구체예에서 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부분은 SLC12A8 , KLHDC7B , PARP15, OPLAH , BCL2L11 , MAX. chr12 .526, HOXB2 , EMX1 , CYP26C1 , SOBP , SUCLG2 , SHOX2, ZDHHC1 , NFIX , FLJ45983 , HOXA9 , B3GALT6 , ZNF781 , SP9, BARX1 , 및 SKI로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커에 특이적으로 혼성화된다. 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 올리고뉴클레오티드의 세트를 포함하며, 이들 각각은 마커들의 세트 내의 하나의 마커에 혼성화되며, 상기 마커들의 세트는 ZNF781 , BARX1, 및 EMX1로 구성된 그룹; SHOX2 , SOBP , ZNF781 , CYP26C1 , SUCLG2 , 및 SKI로 구성된 그룹; SLC12A8 , KLHDC7B , PARP15 , OPLAH , BCL2L11 , MAX. chr12 .526, HOXB2 , 및 EMX1로 구성된 그룹; SHOX2 , SOBP , ZNF781 , BTACT , CYP26C1 , 및 DLX4로 구성된 그룹; 및 SHOX2 , SOBP , ZNF781 , CYP26C1 , SUCLG2 , 및 SKI로 구성된 그룹으로부터 선택된 마커들의 세트의 메틸화 상태의 분석을 포함한다. 특정 구체예에서, 메틸화 마커들의 세트는 ZNF781 , BARX1 , 및 EMX1로부터 선택된 그룹을 포함하며, SOBP 및/또는 HOXA9을 더욱 포함한다.

일부 구체예에서, 키트 중의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 폐 암종, 예컨대, 폐 선암종, 대세포암종, 편평 세포 암종, 또는 소세포암종 중 단지 하나의 유형을 나타내는 메틸화 마커(들)에 혼성화되도록 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 폐 선암종, 대세포암종, 편평 세포 암종, 및 소세포암종 중 둘 이상을 나타내는 메틸화 마커(들)에 혼성화되도록 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 폐 선암종, 대세포암종, 편평 세포 암종, 소세포암종, 및/또는 미확인 폐 암종 중 어느 하나, 또는 임의 조합을 나타내는 메틸화 마커(들)에 혼성화되도록 선택된다.

바람직한 구체예에서, 키트에 제공되는 올리고뉴클레오티드(들)는 포획 올리고뉴클레오티드, 한 쌍의 핵산 프라이머, 핵산 프로브, 및 침습성 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드(들)는 상기 메틸화 마커(들)를 포함하는 바이설파이트-처리된 DNA에 특이적으로 혼성화된다.

일부 구체예에서 키트는 고체 지지체, 예컨대 자성 비드 또는 입자를 더욱 포함한다. 바람직한 구체예에서, 고체 지지체는 하나 이상의 포획 시약, 예컨대 상기 하나 이상의 마커 유전자를 보완하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

상기 기술은 또한 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일부 구체예에서 상기 기술은 BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1, NKX6 _2, FAM59B , DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1, MAX_ chr8 .145, MAX_ chr10 .225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B, DOCK2 , MAX_ chr19 .163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2, ARHGEF4 , CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA_22, FLJ45983 , DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX. chr12 .526, BCL2L11 , OPLAH, PARP15 , KLHDC7B , SLC12a , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14 , FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2_Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX , S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15 , ZDHHC1 , 및 ZNF329로 구성된 군으로부터 선택되는 표적 핵산 및 상기 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드의 복합체를 포함하는 혼합물, 예컨대 반응 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 표적 핵산은 바이설파이트-전환된 표적 핵산이다. 바람직한 구체예에서, 상기 혼합물은 SLC12A8 , KLHDC7B , PARP15 , OPLAH, BCL2L11 , MAX. chr12 .526, HOXB2 , EMX1 , CYP26C1 , SOBP , SUCLG2 , SHOX2 , ZDHHC1, NFIX , FLJ45983 , HOXA9 , B3GALT6 , ZNF781 , SP9, BARX1 , 및 SKI로 구성된 군으로부터 선택되는 표적 핵산 및 상기 표적 핵산(전환되지 않거나 또는 바이설파이트-전환된)에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드의 복합체를 포함한다. 혼합물 중의 올리고뉴클레오티드는 비제한적으로 포획 올리고뉴클레오티드, 한 쌍의 핵산 프라이머, 혼성화 프로브, 가수분해 프로브, 플랩 분석 프로브, 및 침습성 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함한다.

일부 구체예에서, 혼합물 중의 표적 핵산은 아래의 SEQ ID NOS로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다: 1, 6, 11, 16, 21, 28, 33, 38, 43, 48, 53, 58, 63, 68, 73, 78, 86, 91, 96, 101, 106, 111, 116, 121, 126, 131, 136, 141, 146, 151, 156, 161, 166, 171, 176, 181, 186, 191, 196, 201, 214, 219, 224, 229, 234, 239, 247, 252, 257, 262, 267, 272, 277, 282, 287, 292, 298, 303, 308, 313, 319, 327, 336, 341, 346, 351, 356, 361, 366, 371, 384, 및 403.

일부 구체예에서, 상기 혼합물은 아래의 SEQ ID NOS로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 바이설파이트-전환된 표적 핵산을 포함한다: 2, 7, 12, 17, 22, 29, 34, 39, 44, 49, 54, 59, 64, 69, 74, 79, 87, 92, 97, 102, 107, 112, 117, 122, 127, 132, 137, 142, 147, 152, 157, 162, 167, 172, 177, 182, 187, 192, 197, 202, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 248, 253, 258, 263, 268, 273, 278, 283, 288, 293, 299, 304, 309, 314, 320, 328, 337, 342, 347, 352, 357, 362, 367, 372, 385, 및 404.

일부 구체예에서, 상기 혼합물 중의 올리고뉴클레오티드는 리포터 분자를 포함하며, 바람직한 구체예에서, 리포터 분자는 형광체(fluorophore)를 포함한다. 일부 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 플랩 시퀀스(flap sequence)를 포함한다. 일부 구체예에서 상기 혼합물은 하나 이상의 FRET 카세트; FEN-1 엔도뉴클레아제 및/또는 열안정성 DNA 중합효소, 바람직하게는 박테리아 DNA 중합효소를 더욱 포함한다.

정의

본 기술의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 문구가 이하에서 정의된다. 추가적인 정의는 상세한 설명을 통해 제시된다.

명세서 및 청구범위 전체에서, 아래의 용어는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 여기에 명백하게 관련된 의미를 취한다. 여기에 사용된 "하나의 구체예에서"라는 문구는, 그럴 수도 있으나, 반드시 동일한 구체예를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 여기에 사용된 "또 다른 구체예에서"라는 문구는, 그럴 수도 있으나, 반드시 상이한 구체예를 지칭하는 것은 아니다. 따라서, 이하에서 설명되는 바와 같이, 본 발명의 다양한 구체예는 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않으면서 용이하게 결합될 수 있다.

추가로, 여기에서 사용되는 용어 "또는"은 포괄적인 "또는" 연산자이고, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 용어 "및/또는"과 동등하다. "기반한"이라는 용어는 배타적인 것이 아니며, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 설명되지 않은 추가 요소를 기반으로 하는 것을 허용한다. 또한, 명세서 전체에 걸쳐, 부정관사("a", "an") 및 정관사("the")의 의미는 복수 참조를 포함한다. "내에서(in)"의 의미는 "내에서(in)"및 "에서(on)"를 포함한다.

본 출원의 청구항에서 사용되는 전이부 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 In re Herz , 537 F .2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 ( CCPA 1976)에서 논의되듯이, 청구항의 범위를 청구된 발명의 특정 물질 또는 단계 그리고 "기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계"로 한정한다. 예를 들어, 개시된 요소로 "본질적으로 구성되는" 조성물은, 비록 존재하지만 오염물질이 순수 조성물, 즉 개시된 성분으로 "구성되는" 조성물과 비교하여 개시된 조성물의 기능을 변경시키지 않는 수준에서, 개시되지 않은 오염물질을 함유할 수도 있다.

여기서 사용되듯이, "메틸화"는 시토신의 위치 C5 또는 N4에서의 시토신 메틸화, 아데닌의 N6 위치, 또는 또 다른 유형의 핵산 메틸화를 지칭한다. 시험관 내 증폭 DNA는 일반적으로 메틸화되지 않는데 왜냐하면 전형적인 시험관 내 DNA 증폭 방법이 증폭 주형(amplification template)의 메틸화 패턴을 유지하지 않기 때문이다. 그렇지만, "비메틸화된 DNA" 또는 "메틸화된 DNA"는 자신의 원래 주형이 각각 비메틸화되었거나 메틸화된 증폭 DNA를 또한 지칭할 수 있다.

따라서, 여기서 사용되듯이 "메틸화된 뉴클레오티드" 또는 "메틸화된 뉴클레오티드 염기"는 뉴클레오티드 염기에서 메틸 원자단의 존재를 지칭하며, 한편 메틸 원자단은 인식된 전형적인 뉴클레오티드 염기에는 존재하지 않는다. 예를 들어, 시토신은 자신의 피리미딘 고리에 메틸 원자단을 함유하지 않으나, 5-메틸시토신은 자신의 피리미딘 고리의 5번 위치에서 메틸 원자단을 함유한다. 그러므로, 시토신은 메틸화된 뉴클레오티드가 아니며 5-메틸시토신은 메틸화된 뉴클레오티드이다. 또 다른 예에서, 티민은 자신의 피리미딘 고리의 5번 위치에서 메틸 원자단을 함유하며; 그렇지만, 본 출원의 목적을 위하여, 티민은 DNA에 존재할 때 메틸화된 뉴클레오티드로 간주되지 않는데 왜냐하면 티민은 DNA의 전형적인 뉴클레오티드 염기이기 때문이다.

여기서 사용되듯이, "메틸화된 핵산 분자"는 하나 이상의 메틸화된 뉴클레오티드를 함유하는 핵산 분자를 지칭한다.

여기서 사용되듯이, 핵산 분자의 "메틸화 상태", "메틸화 프로파일", 및 "메틸화 상태"는 핵산 분자 내 하나 이상의 메틸화된 뉴클레오티드 염기의 존재 또는 부존재를 지칭한다. 예를 들어, 메틸화된 시토신을 함유하는 백산 분자는 메틸화된 것으로 간주된다(예컨대, 핵산 분자의 메틸화 상태는 메틸화된 것이다). 어떠한 메틸화된 뉴클레오티드도 함유하지 않는 핵산 분자는 비메틸화된 것으로 간주된다. 일부 구체예에서, 비록 동일 유전자 또는 분자의 다른 유전자자리(locus)에서 메틸화될지라고, 특정 유전자자리(예컨대, 특정 단일 CpG 디뉴클레오티드의 유전자자리) 또는 유전자자리의 특정 조합에서 메틸화되지 않는 경우, 핵산은 "비메틸화된" 것으로 특징될 수 있다.

특정 핵산 서열(예컨대, 여기에 개시된 유전자 마커 또는 DNA 영역)의 메틸화 상태는 서열 내 모든 염기의 메틸화 상태를 나타낼 수 있거나 또는 서열 내의 염기들(예컨대, 하나 이상의 시토신)의 서브세트의 메틸화 상태를 나타낼 수 있거나, 또는 메틸화가 일어나는 서열 내에서 위치의 정확한 정보를 제공하거나 제공하지 않으면서 서열 내의 지역 메탈화 밀도에 관한 정도를 나타낼 수 있다. 여기서 사용되듯이, 용어 "마커 유전자" 및 "마커"는, 마커 영역이 DNA의 코딩 영역에 있는지 여부와 상관 없이 질환, 예컨대, 암과 관련된 DNA를 지칭하는 것으로 상호 교환적으로 사용된다. 마커는 예컨대 조절 부위, 인접 부위, 유전자간 부위, 등을 포함할 수 있다.

핵산 분자 내에서 뉴클레오티드 유전자자리의 메틸화 상태는 핵산 분자 내의 특정 유전자자리에서의 메틸화된 뉴클레오티드의 존재 또는 부존재를 지칭한다. 예를 들어, 핵산 분자 내 7번째 뉴클레오티드에서의 시토신의 메틸화 상태는, 핵산 분자 내 7번째 뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드가 5-메틸시토신일 때 메틸화된다. 유사하게, 핵산 분자 내 7번째 뉴클레오티드에서의 시토신의 메틸화 상태는, 핵산 분자 내 7번째 뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드가 시토신(5-메틸시토신이 아님)일 때 비메틸화된다.

메틸화 상태는 선택사항으로서 "메틸화 값"(예컨대, 메틸화 빈도, 분율, 비율, 백분율, 등을 나타냄)에 의해 나타나거나 제시될 수 있다. 메틸화 값은, 예를 들어, 메틸화 의존성 제한 효소로 제한 분해 후 존재하는 무손상 핵산의 양을 정량화하거나 또는 바이설파이트 반응 후 증폭 프로파일을 비교하거나 또는 바이설파이트-처리된 핵산 및 처리안된 핵산의 서열을 비교함으로써 생성될 수 있다. 따라서, 값, 예컨대, 메틸화 값은 메틸화 상태를 나타내며 따라서 유전자자리의 여러 사본에 걸쳐 메틸화 상태의 정량적 지표로서 사용될 수 있다. 이는 샘플 내 서열의 메틸화 상태를 임계값 또는 기준값과 비교하는 것이 바람직할 때 특히 유용하다.

여기서 사용되듯이, "메틸화 빈도" 또는 "메틸화 백분율(%)"은 분자 또는 유전자자리가 비메틸화된 경우의 수와 비교하여 분자 또는 유전자자리가 메틸화된 경우의 수를 지칭한다.

이와 같이, 메틸화 상태는 핵산(예컨대, 게놈 서열)의 메틸화 상태를 설명한다. 또한, 메틸화 상태는 메틸화와 관련하여 특정 게놈 유전자자리에서의 핵산 단편의 특성을 지칭한다. 이러한 특성은, 비제한적으로, 해당 DNA 서열 중의 시토신(C) 잔기가 메틸화되는지 여부, 메틸화된 C 잔기(들)의 위치, 핵산 의 특정 영역에 걸쳐 메틸화된 C의 빈도 또는 백분율, 및 예컨대 대립유전자의 기원의 차이로 인한 메틸화의 대립적인 차이를 포함한다. 용어 "메틸화 상태", "메틸화 프로파일", 및 "메틸화 상태"는 또한 생물학적 샘플에서 핵산의 특정 영역 전반에서 메틸화된 C 또는 비메틸화된 C의 상대 농도, 절대 농도, 또는 패턴을 지칭한다. 예를 들어, 핵산 서열 내의 시토신(C) 잔기(들)가 메틸화되면 이는 "과메틸화된" 또는 "증가된 메틸화"를 갖는 것으로 지칭되며, 한편 DNA 서열 내의 시토신(C) 잔기(들)가 메틸화되지 않으면 이는 "저메틸화된" 또는 "감소된 메틸화"를 갖는 것으로 지칭된다. 유사하게, 핵산 서열 내의 시토신(C) 잔기(들)가 또 다른 핵산 서열(예컨대, 상이한 부위 또는 상이한 개체, 등)과 비교하여 메틸화되면 해당 서열은 상기 또 다른 핵산 서열과 비교하여 과메틸화된 또는 증가된 메틸화를 갖는 것으로 간주된다. 그 대신에, DNA 서열 내의 시토신(C) 잔기(들)가 또 다른 핵산 서열(예컨대, 상이한 부위 또는 상이한 개체, 등)과 비교하여 메틸화되지 않으면 해당 서열은 상기 또 다른 핵산 서열과 비교하여 저메틸화된 또는 감소된 메틸화를 갖는 것으로 간주된다. 또한, 용어 "메틸화 패턴"은 여기서 사용되듯이 핵산의 영역 전반에서 메틸화된 및 비메틸화된 뉴클레오티드의 집합 부위를 지칭한다. 메틸화된 및 비메틸화된 뉴클레오티드의 수가 영역 전반에서 동일하거나 유사하지만 메틸화된 및 비메틸화된 뉴클레오티드의 위치가 상이한 경우, 두 핵산은 동일하거나 유사한 메틸화 빈도 또는 메틸화 백분율을 갖지만 상이한 메틸화 패턴을 갖는다. 서열들은 이들이 메틸화의 정도(예컨대, 하나가 다른 것에 비하여 증가된 또는 감소된 메틸화를 갖음), 빈도, 또는 패턴에서 상이할 때, "상이하게 메틸화되는" 또는 "메틸화의 차이"를 갖거나 "상이한 메틸화 상태"를 갖는 것으로 언급된다. 용어 "차별적 메틸화"는 암 음성 샘플에서 핵산 메틸화의 수준 또는 패턴과 비교하여 암 양성 샘플에서 핵산 메틸화의 수준 또는 패턴의 차이를 지칭한다. 이는 또한 수술 후 암이 재발한 환자 대 재발하지 않은 환자 사이의 수준 또는 패턴의 차이를 지칭할 수도 있다. 차별적 메틸화 및 DNA 메틸화의 특정 수준 또는 패턴은, 예컨대 일단 정확한 컷-오프 또는 예측 특성이 정의되면, 예후 및 예측 바이오마커이다.

메틸화 상태 빈도는 개체들의 개체군 또는 단일 개체로부터의 샘플을 묘사하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%의 메틸화 상태 빈도를 갖는 뉴클레오티드 유전자자리는 50%의 경우에서 메틸화되고 50%의 경우에서 비메틸화된다. 이러한 빈도는 예를 들어, 개체들의 개체군 또는 핵산의 모음에서 뉴클레오티드 유전자자리 또는 핵산 영역이 메틸화되는 정도를 설명하도록 사용될 수 있다. 따라서, 핵산 분자의 제1 개체군 또는 집합군이 핵산 분자의 제2 개체군 또는 집합군과 메틸화가 상이한 경우, 제1 개체군 또는 집합군의 메틸화 상태 빈도는 제2 개체군 또는 집합군의 메틸화 상태 빈도와 상이할 것이다. 이러한 빈도는 또한 예를 들어, 개체들의 단일 개체에서 뉴클레오티드 유전자자리 또는 핵산 영역이 메틸화되는 정도를 설명하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 빈도는 조직 샘플로부터의 세포 그룹이 뉴클레오티드 유전자자리 또는 핵산 영역에서 메틸화되거나 비메틸화되는 정도를 설명하도록 사용될 수 있다.

여기서 사용되듯이 "뉴클레오티드 유전자자리(nucleotide locus)"는 핵산 분자 내에서 뉴클레오티드의 위치를 지칭한다. 메틸화된 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 유전자자리는 핵산 분자 내에서 메틸화된 뉴클레오티드의 위치를 지칭한다.

전형적으로, 인간 DNA의 메틸화는 인접한 구아닌 및 시토신을 포함하는 디뉴클레오티드 서열 상에서 일어나며 여기서 시토신은 구아닌의 5'에 위치한다(또한 CpG 디뉴클레오티드 서열로 지칭된다). CpG 디뉴클레오티드 내의 대부분의 시토신은 인간 게놈에서 메틸화되지만, 그렇지만 일부는 CpG 섬으로 알려진 특정 CpG 디뉴클레오티드 풍부 게놈 영역에서 비메틸화로 잔류한다(참조, 예컨대, Antequera, et al. (1990) Cell 62: 503-514).

여기서 사용되듯이, "CpG 섬"은 전체 게놈 DNA에 비하여 증가된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 게놈 DNA의 G:C-풍부 영역을 지칭한다. CpG 섬은 길이에서 적어도 100개, 200개, 또는 그 이상의 염기쌍일 수 있으며, 여기서 영역의 G:C 함량은 적어도 50%이며 예상 빈도에 대한 관측된 CpG 빈도의 비율은 0.6이며; 일부 경우에 있어서, CpG 섬은 길이에서 적어도 500개 염기쌍일 수 있으며, 여기서 영역의 G:C 함량은 적어도 55%이며) 예상 빈도에 대한 관측된 CpG 빈도의 비율은 0.65이다. 예상 빈도에 대한 관측된 CpG 빈도는 Gardiner-Garden et al (1987) J. Mol . Biol. 196: 261-281에서 제공된 방법에 따라 계산될 수 있다. 예를 들면, 예상 빈도에 대한 관측된 CpG 빈도는 공식 R = (A X B) / (C X D)에 따라 계산될 수 있으며, 여기서 R은 예상 빈도에 대한 관측된 CpG 빈도의 비율이며, A는 분석된 서열에서 CpG 디뉴클레오티드의 수이며, B는 분석된 서열에서 뉴클레오티드의 전체 수이며, C는 분석된 서열에서 C 뉴클레오티드의 전체 수이며, 그리고 D는 분석된 서열에서 G 뉴클레오티드의 전체 수이다. 메틸화 상태는 전형적으로 CpG 섬에서, 예컨대 프로모터 영역에서 결정된다. 그럼에도 인간 게놈의 또 다른 서열이 CpA 및 CpT와 같은 DNA 메틸화가 쉽다는 것을 이해할 것이다(참조 Ramsahoye (2000) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97: 5237-5242; Salmon 및 Kaye (1970) Biochim . Biophys . Acta . 204. 340-351; Grafstrom (1985) Nucleic Acids Res. 13. 2827-2842; Nyce (1986) Nucleic Acids Res. 14. 4353-4367; Woodcock (1987) Biochem . Biophys . Res. Commun . 145. 888-894).

여기서 사용되듯이, "메틸화-특이성 시약"은 핵산 분자의 메틸화 상태의 작용으로 핵산 분자의 뉴클레오티드를 변형시키는 시약을 지칭하거나, 또는 메틸화-특이성 시약은 핵산 분자의 메틸화 상태를 반영하는 방식으로 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 변형시킬 수 있는 화합물 또는 조성물 또는 또 다른 시약을 지칭한다. 이러한 시약으로 핵산 분자를 처리하는 방법은, 필요한 경우 추가 단계와 결합되어, 핵산 분자를 이러한 시약과 접촉시켜 뉴클레오티드 서열의 원하는 변화를 달성하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 비메틸화된 뉴클레오티드(예컨대, 각각 비메틸화된 시토신)이 상이한 뉴클레오티드로 변형되는 방식으로 적용될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 이러한 시약은 비메틸화된 시토신 뉴클레오티드를 제거하여 데옥시 우라실 잔기를 생성할 수 있다. 예시적인 시약은 바이설파이트 시약이다.

용어 "바이설파이트 시약"은 메틸화된 및 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드 서열을 구별하기 위하여 여기서 개시된 바와 같이 유용한, 바이설파이트, 디설파이트, 하이드로젠 설파이트, 또는 이들의 조합을 포함하는 시약을 지칭한다. 상기 처리 방법은 해당 분야에 공지되어 있다(예컨대, PCT/EP2004/011715 및 WO 2013/116375, 이들 각각은 그 전체가 여기에 참조로 수록된다). 일부 구체예에서, 바이설파이트 처리는 예컨대 비제한적으로 n-아킬렌글리콜 또는 디에틸렌 글리콜 디메틸 에테르(DME)과 같은 변성 용매의 존재에서, 또는 디옥산 또는 디옥산 유도체의 존재에서 수행된다. 일부 구체예에서 변성 용매는 1% 내지 35%(v/v)의 농도로 사용된다. 일부 구체예에서, 바이설파이트 반응은 비제한적으로 크로만 유도체, 예컨대, 6-하이드록시-2,5,7,8,-테트라메틸크로만 2-카르복실릭 애시드 또는 트리하이드록시벤존 애시드 및 그 유도체, 예컨대 갈산(Gallic acid)과 같은 제거제(scavenger)의 존재에서 수행된다(참조: PCT/EP2004/011715, 이는 그 전체가 여기에 참조로 수록된다). 특정 바람직한 구체예에서, 바이설파이트 반응은, 예컨대 WO 2013/116375에 개시된 바와 같이, 암모늄 하이드로젠 설파이트로 처리하는 것을 포함한다.

메틸화-특이성 시약에 의한 핵산 뉴클레오티드 서열의 변화는 또한 각각의 메틸화된 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드로 변형되는 핵산 분자를 유발할 수 있다.

용어 "메틸화 분석"은 핵산의 서열 내에서 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드 서열의 메틸화 상태를 결정하기 위한 모든 분석을 지칭한다.

여기서 사용되듯이, 주어진 마커(또는 함께 사용되는 마커의 세트)의 "민감도"는 신생물성 샘플과 비-신생물성 샘플을 구별하는 임계값 이상인 DNA 메틸화 값을 보고하는 샘플의 백분율을 지칭한다. 일부 구체예에서, 양성은 임계값 이상인 DNA 메틸화 값(예컨대, 질병과 관련된 범위)을 보고하는 조직검사-확진 신생물로서 정의되며, 거짓 음성은 임계값 이하인 DNA 메틸화 값(예컨대, 질병과 관련 없는 범위)을 보고하는 조직검사-확진 신생물로서 정의된다. 그러므로, 민감도의 수치는 알려진 질병 샘플로부터 획득된 주어진 마커에 대한 DNA 메틸화 측정치가 질병-관련 측정치의 범위 내에 있을지 여부에 대한 확률을 반영한다. 여기서 정의되듯이, 계산된 민감도 수치의 임상적 관련성은 주어진 마커가 그 상태의 피험자에게 적용될 때 임상 상태의 존재를 검출할 확률의 추정치를 나타낸다.

여기서 사용되듯이, 주어진 마커(또는 함께 사용되는 마커의 세트)의 "특이성"은 신생물성 샘플과 비-신생물성 샘플을 구별하는 임계값 이하인 DNA 메틸화 값을 보고하는 비-신생물성 샘플의 백분율을 지칭한다. 일부 구체예에서, 음성은 임계값 이하인 DNA 메틸화 값(예컨대, 질병과 관련 없는 범위)을 보고하는 조직검사-확진 비-신생물성 샘플로서 정의되며, 거짓 양성은 임계값 이상인 DNA 메틸화 값(예컨대, 질병과 관련된 범위)을 보고하는 조직검사-확진 비-신생물성 샘플로서 정의된다. 그러므로, 특이성의 수치는 알려진 비-신생물성 샘플로부터 획득된 주어진 마커에 대한 DNA 메틸화 측정치가 질병-관련 없는 측정치의 범위 내에 있을지 여부에 대한 확률을 반영한다. 여기서 정의되듯이, 계산된 특이성 수치의 임상적 관련성은 주어진 마커가 그 상태가 없는 환자에게 적용될 때 임상 상태의 부존재를 검출할 확률의 추정치를 나타낸다.

여기서 사용되듯이, "선택된 뉴클레오티드"는 핵산 분자에서 4개의 일반적으로 발생하는 뉴클레오티드(DNA에 대한 C, G, T, 및 A, 그리고 RNA에 대한 C, G, U, 및 A) 중 하나의 뉴클레오티드를 지칭하며, 일반적으로 발생하는 뉴클레오티드의 메틸화된 유도체를 포함할 수 있으며(예컨대, C가 선택된 뉴클레오티드인 경우, 메틸화된 및 비메틸화된 C 둘 모두가 선택된 뉴클레오티드의 의미에 포함된다), 한편 메틸화된 선택된 뉴클레오티드는 전형적으로 메틸화된 뉴클레오티드를 특이적으로 지칭하며 비메틸화된 선택된 뉴클레오티드는 전형적으로 비메틸화된 형태로 발생하는 뉴클레오티드를 특이적으로 지칭한다.

용어 "메틸화-특이성 제한 효소" 또는 "메틸화-민감성 제한 효소"는 인식 부위의 메틸화 상태에 따라 핵산을 선택적으로 소화하는 효소를 지칭한다. 인식 부위가 메틸화되지 않거나 헤미-메틸화된(hemi-methylated) 경우 특이적으로 절단하는 제한 효소의 경우, 인식 부위가 메틸화된 경우에는 절단이 일어나지 않거나 상당히 감소된 효과로 일어날 것이다. 인식 부위가 메틸화된 경우 특이적으로 절단하는 제한 효소의 경우, 인식 부위가 메틸화되지 않은 경우에는 절단이 일어나지 않거나 상당히 감소된 효과로 일어날 것이다. 인식 서열이 CG 디뉴클레오티드(예를 들어 CGCG 또는 CCCGGG와 같은 인식 서열)를 함유하는 메틸화-특이성 제한 효소가 바람직하다. 일부 구체예에서 이러한 디뉴클레오티드 중의 시토신이 탄소 원자 C5에서 메틸화되는 경우 절단하지 않는 제한 효소가 더욱 바람직하다.

용어 "프라이머"는 예컨대 제한적 소화로부터의 핵산 단편으로 자연적으로 발생하거나 또는 합성적으로 생성되며, 핵산 주형 가닥에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 상태(예컨대, 뉴클레오티드 및 DNA 중합효소와 같은 유도제의 존재에서, 그리고 적절한 온도 및 pH에서)에 놓일 때 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 프라이머는 최대 증폭 효율을 위하여 바람직하게는 단일 가닥이며, 그러나 그 대신에 이중 가닥일 수도 있다. 이중 가닥인 경우, 프라이머는 연장 산물을 제조하기 위하여 사용되기 이전에 먼저 그 가다을 분리하도록 처리된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 유도제의 존재에서 연장 산물의 합성을 시작하기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 원천, 및 방법의 사용을 포함한 많은 요인에 따라 달라진다.

용어 "프로브"는 정제된 제한 소화에서 자연적으로 발생하거나, 또는 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의해 합성으로 생성되며, 관심있는 또 다른 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드(예컨대, 뉴클레오티드의 서열)를 지칭한다. 프로브는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 프로브는 특정 유전자 서열의 검출, 확인, 및 분리에 유용한다(예컨대, "포획 프로브"). 본 발명에서 사용되는 모든 프로브는, 일부 구체예에서, "리포터 분자"로 표지될 수 있으며, 따라서 비제한적으로 효소(예컨대, ELISA, 뿐만 아니라 효소-기반 조직화학 분석법), 형광, 방사성 및 발광 시스템을 포함하여, 임의의 검출 시스템에서 검출가능한 것으로 고려된다. 본 발명은 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지에 한정되도록 의도되지 않는다.

용어 "표적"은, 여기서 사용되듯이, 예컨대 프로브 결합, 증폭, 분리, 포획, 등에 의해 다른 핵산으로부터 분류하고자 하는 핵산을 지칭한다. 예를 들면, 중합효소 연쇄 반응에 관련하여 사용될 때, "표적"은 중합효소 연쇄 반응을 위하여 사용되는 프라이머에 의해 결합되는 핵산의 영역을 지칭하며, 한편 표적 DNA가 증폭되지 않는 분석, 예컨대, 일부 구체예에서 침습성 절단 분석법에서 사용될 때, 표적은 프로브와 침습성 올리고뉴클레오티드(예컨대, 침입자(INVADER) 올리고뉴클레오티드)가 결합하여 침습성 절단 구조를 형성하는 부위를 포함하며, 이에 따라 표적 핵산의 존재가 검출될 수 있다. "분절"은 표적 서열 내의 핵산의 영역으로서 정의된다.

용어 "마커"는, 여기서 사용되듯이, 예컨대, 마커 물질의 존재, 부존재, 또는 상태(예컨대, 메틸화 상태)에 기초하여, 정상 세포(비-암성 세포)로부터 비-정상 세포(예컨대, 암 세포)를 구별하기 위하여 사용될 수 있는 물질(예컨대, 핵산 또는 핵산 영역, 또는 단백질)을 지칭한다. 여기서 사용되듯이 마커의 "정상" 메틸화는 정상 세포, 예컨대, 비-암성 세포에서 전형적으로 발견되는 메틸화 정도를 지칭한다.

용어 "신생물"은 여기서 사용되듯이 조직의 임의적인 새로운 비정상적 성장을 지칭한다. 따라서, 신생물은 전암성 신생물 또는 악성 신생물일 수 있다.　

용어 "신생물-특이성 마커"는, 여기서 사용되듯이, 신생물의 존재를 나타내기 위하여 사용될 수 있는 임의 생물학적 물질 또는 요소를 지칭한다. 생물학적 물질의 예는 비제한적으로, 핵산, 폴리펩티드, 탄수화물, 지방산, 세포 성분(예컨대, 세포막 및 미토콘드리아), 및 전체 세포를 포함한다. 일부 경우에, 마커는 특정 핵산 영역(예컨대, 유전자, 유전자 내 영역, 특정 유전자자리, 등)이다. 마커인 핵산의 영역은 예컨대, "마커 유전자", "마커 영역", "마커 서열", "마커 유전자 자리" 등으로 언급될 수 있다.　

용어 "샘플"은 가장 넓은 의미로 사용된다. 한 가지 의미에서 이는 동물 세포나 조직을 의미할 수 있다. 다른 의미에서, 이는 생물학적 및 환경적 샘플뿐만 아니라 모든 출처에서 얻은 표본 또는 배양물을 의미한다. 생물학적 샘플은 식물 또는 동물(사람 포함)에서 얻을 수 있으며 유체, 고체, 조직, 및 기체를 포함한다. 환경적 샘플은 표면 물질, 토양, 물, 및 산업 샘플과 같은 환경 물질을 포함한다. 이들 실시예는 본 발명에 적용 가능한 샘플 유형을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

여기서 사용되듯이, 용어 "환자" 또는 "대상체(subject)"는 기술이 제공하는 다양한 검사를 받는 생물체를 지칭한다. 용어 "대상체"는 동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 대상체는 영장류이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 대상체는 인간이다. 또한 진단 방법과 관련하여, 바람직한 대상체는 척추동물 대상체이다. 바람직한 척추동물은 온혈동물이며, 바람직한 온혈 척추동물은 포유동물이다. 바람직한 포유동물은 가장 바람직하게는 인간이다. 여기서 사용되듯이, 용어 "대상체'는 인간 및 동물 대상체 둘 모두를 포함한다. 따라서, 수의학적 치료 용도가 여기에 제공된다. 이와 같이, 본 기술은 인간과 같은 포유동물, 뿐만 아니라 시베리아 호랑이와 같이 멸종 위기에 처하여 중요한 포유동물; 경제적 중요도에서, 인간에 의해 소비되기 위해 농장에서 자란 동물과 같은 포유동물; 및/또는 애완동물이나 동물원에서 길러지는 동물과 같이 인간에게 사회적으로 중요한 동물의 진단을 위하여 제공된다. 이러한 동물의 예는 비제한적으로, 고양이 및 개와 같은 육식동물; 피그(pig), 호그(hog), 및 멧돼지(wild boar)를 비롯한 돼지(swine); 캐틀(cattle), 옥슨(oxen), 양, 기린, 사슴, 염소, 들소(bison), 및 낙타와 같은 반추동물(ruminant) 및/또는 유제류(ungulate); 기각류(pinniped); 및 말(horse)을 포함한다. 따라서, 또한 비제한적으로 가축용 돼지, 반추동물, 유제류, 말(경주마 포함) 등을 포함하는 가축의 진단 및 치료가 제공된다. 여기에 개시된 주제는 대상체의 폐암을 진단하기 위한 시스템을 더욱 포함한다. 시스템은 생물학적 샘플이 수집된 대상체에서 폐암의 위험성을 스크리닝하거나 폐암을 진단하는데 사용될 수 있는 상업용 키트로서 제공될 수 있다. 본 기술에 따라 제공되는 예시적인 시스템은 여기에 기술된 마커의 메틸화 상태를 평가하는 것을 포함한다.

핵산의 문맥에서 용어 "증폭하기" 또는 "증폭"은 소량의 폴리뉴클레오티드(예컨대, 단일 폴리뉴클레오티드 분자)로부터 전형적으로 시작하는, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부분의 다중 복제물의 생산을 지칭하며, 여기서 증폭 생성물 또는 증폭산물은 일반적으로 검출가능하다. 폴리뉴클레오티드의 증폭은 다양한 화학적 및 효소적 과정을 포함한다. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 리가아제 연쇄 반응(LCR; 예컨대, 미국 특허 제5,494,810호 참조; 여기에 그 전체가 참조로 수록됨) 동안 표적 또는 주형 DNA 분자의 하나 또는 수 개의 복제물로부터 다중 DNA 복제물의 생성은 증폭의 형태이다. 증폭의 또 다른 유형은 비제한적으로, 대립유전자-특이성 PCR(참조, 예컨대, 미국 특허 제5,639,611호; 여기에 그 전체가 참조로 수록됨), 어셈블리 PCR(참조, 예컨대, 미국 특허 제5,965,408호; 여기에 그 전체가 참조로 수록됨), 헬리케이스-의존성 증폭(참조, 예컨대, 미국 특허 제7,662,594호; 여기에 그 전체가 참조로 수록됨), 핫-스타트(hot-start) PCR(참조, 예컨대, 미국 특허 제5,773,258호 및 제5,338,671호; 각각이 그 전체가 여기에 참조로 수록됨), 서열간-특이성 PCR, 역 PCR(참조, 예컨대, Triglia, et al.(1988) Nucleic Acids Res., 16:8186; 여기에 그 전체가 참조로 수록됨), 결합-중재 PCR (참조, 예컨대, Guilfoyle, R. et al., Nucleic Acids Research, 25:1854-1858 (1997); 미국 특허 제5,508,169호; 이들 각각이 그 전체가 여기에 참조로 수록됨), 메틸화-특이성 PCR(참조, 예컨대, Herman, et al., (1996) PNAS 93(13) 9821-9826; 여기에 그 전체가 참조로 수록됨), 미니프라이머 PCR, 다중 결합-의존성 프로브 증폭(참조, 예컨대, Schouten, et al., (2002) Nucleic Acids Research 30(12): e57; 여기에 그 전체가 참조로 수록됨), 다중 PCR(참조, 예컨대, Chamberlain, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(23) 11141-11156; Ballabio, et al., (1990) Human Genetics 84(6) 571-573; Hayden, et al., (2008) BMC Genetics 9:80; 이들 각각이 그 전체가 여기에 참조로 수록됨), 중첩(nested) PCR, 중첩-연장(overlap-extension) PCR (참조, 예컨대, Higuchi, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(15) 7351-7367; 여기에 그 전체가 참조로 수록됨), 실시간 PCR (참조, 예컨대, Higuchi, et al., (1992) Biotechnology 10:413-417; Higuchi, et al., (1993) Biotechnology 11:1026-1030; 이들 각각이 그 전체가 여기에 참조로 수록됨), 역전사 PCR(참조, 예컨대, Bustin, S.A. (2000) J. Molecular Endocrinology 25:169-193; 여기에 그 전체가 참조로 수록됨), 고체상 PCR, 열 비대칭 인터레이스드 PCR(thermal asymmetric interlaced PCR), 및 터치다운(Touchdown) PCR(참조, 예컨대, Don, et al., Nucleic Acids Research (1991) 19(14) 4008; Roux, K. (1994) Biotechniques 16(5) 812-814; Hecker, et al., (1996) Biotechniques 20(3) 478-485; 이들 각각이 그 전체가 여기에 참조로 수록됨)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 증폭은 또한 디지털 PCR을 사용하여 달성될 수 있다(참조, 예컨대, Kalinina, et al., Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997); Vogelstein 및 Kinzler, Proc Natl Acad Sci USA. 96; 9236-41, (1999); 국제 특허 공개 제WO05023091A2호; 미국 특허 출원 공개 제20070202525호; 이들 각각은 그 전체가 여기에 참조로 수록됨).

용어 "중합효소 연쇄 반응" ("PCR")은 K.B. Mullis 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 및 제4,965,188호의 방법을 지칭하며, 이는 클로닝 또는 정제 없이, 게놈 또는 또 다른 DNA 또는 RNA의 혼합물에서 표적 서열의 분절의 농도를 증가시키는 방법을 기술한다. 표적 서열을 증폭하기 위한 이러한 공정은 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 과량을 목적하는 표적 서열을 함유하는 DNA 혼합물에 도입하고, 그 다음에 DNA 중합효소 존재에서 열 순환의 정확한 서열이 뒤따르는 것으로 구성된다. 2개의 프라이머는 이중 가닥 표적 서열의 각각의 가닥을 상보시킨다. 증폭을 유효하게 하기 위해, 혼합물이 변성되고 프라이머가 그 후 표적 분자 내에서 그들의 상보적 서열에 어닐링된다. 어닐링 후, 프라이머는 새로운 쌍의 상보적 가닥을 형성하도록 중합효소로 연장된다. 변성, 프라이머 어닐링, 및 중합효소 연장의 단계들은 여러 번 반복되어(즉, 변성, 어닐링 및 연장은 하나의 "사이클"을 구성하며, 다수의 "사이클"이 존재할 수 있음) 원하는 표적 서열의 증폭된 분절의 고 농도를 획득할 수 있다. 원하는 표적 서열의 증폭된 분절의 길이는 서로에 대하여 프라이머의 상대적 위치에 의해 결정되며, 따라서 이러한 길이는 제어가능한 파라미터이다. 공정의 반복적인 측면으로 인해, 이 방법은 "중합효소 연쇄 반응"( "PCR")으로 불린다. 표적 서열의 원하는 증폭된 분절이 혼합물에서 우세한 서열이 되기 때문에(농도 관점에서), 이들은 "PCR 증폭"되고 "PCR 산물"또는 "증폭산물"이라고 불린다. 해당 분야의 통상의 기술자들은 용어 "PCR"이 예컨대 실시간 PCR, 중첩 PCR, 역전사 PCR (RT-PCR), 단일 프라이머 및 임의 프라이밍 PCR(arbitrarily primed PCR) 등을 사용하여 원래 기술된 방법의 많은 변형체를 포함함을 이해할 것이다.

여기서 사용되듯이, 용어 "핵산 검출 분석"은 해당 핵산의 뉴클레오티드 조성을 결정하는 모든 방법을 지칭한다. 핵산 검출 분석은, 비제한적으로, DNA 시퀀싱 방법, 프로브 혼성화 방법, 구조 특이성 절단 분석(예컨대, 칩입자(INVADER) 분석, (Hologic, Inc.) 그리고 예컨대, 미국 특허 제5,846,717호, 제5,985,557호, 제5,994,069호, 제6,001,567호, 제6,090,543호, 및 제6,872,816호; Lyamichev et al., Nat. Biotech., 17:292 (1999), Hall et al., PNAS, USA, 97:8272 (2000), 및 미국 특허 제9,096,893호에 기술되며, 이들 각각은 모든 목적을 위하여 여기에 그 전체가 참조로 수록됨); 효소 불일치 절단 방법(예컨대, Variagenics, 미국 특허 제6,110,684호, 제5,958,692호, 제5,851,770호, 여기에 그 전체가 참조로 수록됨); 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 앞서 기술됨; 분지형 혼성화 방법(예컨대, Chiron, 미국 특허 제5,849,481호, 제5,710,264호, 제5,124,246호, 및 제5,624,802호, 여기에 그 전체가 참조로 수록됨); 롤링 써클 복제(rolling circle replication)(예컨대, 미국 특허 제6,210,884호, 제6,183,960호 및 제6,235,502호, 여기에 그 전체가 참조로 수록됨); NASBA (예컨대, 미국 특허 제5,409,818호, 여기에 그 전체가 참조로 수록됨); 분자 비콘 기술 (예컨대, 미국 특허 제6,150,097호, 여기에 그 전체가 참조로 수록됨); E-센서 기술 (Motorola, 미국 특허 제6,248,229호, 제6,221,583호, 제6,013,170호, 및 제6,063,573호, 여기에 그 전체가 참조로 수록됨); 싸이클링 프로브 기술(예컨대, 미국 특허 제5,403,711호, 제5,011,769호, 및 제5,660,988호, 여기에 그 전체가 참조로 수록됨); 데이드 버링(Dade Behring) 신호 증폭 방법(예컨대, 미국 특허 제6,121,001호, 제6,110,677호, 제5,914,230호, 제5,882,867호, 및 제5,792,614호, 여기에 그 전체가 참조로 수록됨); 리가아제 연쇄 반응(예컨대, Baranay Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 189-93 (1991)); 및 샌드위치 혼성화 방법(예컨대, 미국 특허 제5,288,609호, 여기에 그 전체가 참조로 수록됨)를 포함한다.

일부 구체예에서, 표적 핵산은 증폭되고(예컨대, PCR에 의해) 증폭된 핵산은 침습성 절단 분석을 사용하여 동시에 검출된다. 증폭 분석과 결합하여 검출 분석(예컨대, 침습성 절단 분석)을 수행하기 위하여 구성된 분석은 미국 특허 제9,096,893호에 기술되며, 여기서 그 전체가 모든 목적을 위하여 참조로 수록된다. 또 다른 증폭 플러스 침습성 절단 검출 구성은 QuARTS 방법으로 불리며, 예컨대, 미국 특허 제8,361,720호; 제8,715,937호; 제8,916,344호; 및 제9,212,392호에 기술되며, 이들 각각은 여기서 그 전체가 모든 목적을 위하여 참조로 수록된다. 용어 "침습성 절단 구조"는 여기서 사용되듯이, i) 표적 핵산, ii) 상류 핵산(예컨대, 침습성 또는 "침입자(INVADER)" 올리고뉴클레오티드), 및 iii) 하류 핵산(예컨대, 프로브)을 포함하는 절단 구조를 지칭하며, 여기서 상류 및 하류 핵산은 표적 핵산의 연속 영역을 어닐링하며, 상류 핵산의 3' 부분과 하류 핵산과 표적 핵산 사이에서 형성된 이중가닥 사이에 중첩이 형성된다. 중첩은 상류 및 하류 핵산으로부터의 하나 이상의 염기가 표적 핵산 염기에 대하여 동일한 위치를 차지할 때 일어나며, 상류 핵산의 중첩 염기(들)가 표적 핵산과 상보적인지 여부에 관계 없으며, 이들 염기가 천연 염기인지 비-천연 염기인지 여부에 관계 없다. 일부 구체예에서, 하류 이중가닥에 중첩하는 상류 핵산의 3' 부분은 방향족 고리 구조와 같은 비-염기 화학 원자단이며, 예컨대 이는 예를 들면 미국 특허 제6,090,543에 개시되며, 여기서 그 전체가 참조로 수록된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 핵산은 예컨대, 핵산 스템-루프와 같은 공유 결합을 통해 또는 비-핵산 화학 결합(예컨대, 다중-탄소 사슬)을 통해 서로 부착될 수 있다. 여기서 사용되듯이, 용어 "플랩 엔도뉴클레아제 분석"은 전술한 바와 같이 "침입자(INVADER)" 침습성 절단 분석 및 QuARTS 분석을 포함한다.

용어 "프로브 올리고뉴클레오티드" 또는 "플랩 올리고뉴클레오티드"는 플랩 분석에 대하여 사용될 때, 침습성 올리고뉴클레오티드의 존재에서 표적 핵산과 상호작용하여 절단 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.

용어 "침습성 올리고뉴클레오티드"는 프로브와 표적 핵산 사이의 혼성화 영역에 이웃한 위치에서 표적 핵산에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 지칭하며, 여기서 침습성 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 프로브와 표적 사이의 혼성화 영역과 중첩하는 부분(예컨대, 화학적 원자단, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드)을 포함한다. 침습성 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오티드는 표적에서 뉴클레오티드와 염기 쌍을 이루거나 이루지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 침습성 올리고뉴클레오티드는, 표적 가닥에 어닐링되는 프로브 올리고뉴클레오티드 부분의 5' 말단에 위치한 서열과 실질적으로 동일한 서열을 3' 말단에 함유한다.

용어 "플랩 엔도뉴클레아제" 또는 "FEN"은, 여기서 사용되듯이, 핵산의 또 다른 가닥에 의해 대체되는 가닥들 중 하나에서 단일 가닥 5' 오버행, 즉 플랩을 함유하는 이중가닥을 갖는 DNA 구조에서 구조-특이성 엔도뉴클레아제로서 작용하는 핵산분해 효소, 전형적으로 5' 뉴클레아제의 부류를 지칭한다(예컨대, 따라서 단일과 이중-가닥 DNA 사이의 접합부에서 중첩 뉴클레오티드가 존재함). FEN은 단일과 이중 가닥 DNA의 접합부에서 포스포디에스테르 결합의 가수분해 절단을 촉진하여, 오버행, 즉 플랩을 방출한다. 플랩 엔도뉴클레아제는 세스카(Ceska) 및 세버스(Savers)에 의해 검토되었다(Trends Biochem. Sci. 1998 23:331-336) 및 Liu et al (Annu. Rev. Biochem. 2004 73: 589-615; 여기에 그 전체가 참조로 수록됨). FEN은 개별 효소, 다중-서브유닛 효소이거나, 또 다른 효소 또는 단백질 복합체(예컨대, DNA 중합효소)의 활성으로 존재할 수 있다.

플랩 엔도뉴클레아제는 열안정성일 수 있다. 예를 들어, 보관용 호열성 생물(archival thermophiles organism)로부터의 FEN-1 플랩 엔도뉴클레아제는 전형적으로 열안정성이다. 여기서 사용되듯이, 용어 "FEN-1"은 진핵 생물 또는 고세균 생물로부터의 비-중합효소 플랩 엔도뉴클레아제를 지칭한다. 참조, 예컨대, WO 02/070755, 및 Kaiser M.W., et al. (1999) J. Biol. Chem., 274:21387, 이는 모든 목적을 위하여 여기에 그 전체가 참조로 수록된다.

여기서 사용되듯이, 용어 "절단된 플랩"은 플랩 분석의 절단 산물인 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.　

용어 "카세트"는, 플랩 절단 반응에 대하여 사용될 때, 예컨대, 플랩 절단 분석에서 형성된 제1 즉 첫번째 절단 구조에서, 플랩 또는 프로브 올리고뉴클레오티드의 절단에 반응하여 검출가능한 신호를 발생하도록 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 조합을 지칭한다. 바람직한 구체예에서, 카세트는 플랩 올리고뉴클레오티드의 절단에 의해 생성된 비-표적 절단 산물에 혼성화하여 제2 중첩 절단 구조를 형성하며, 이에 따라 카세트는 동일 효소, 예컨대 FEN-1 엔도뉴클레아제에 의해 절달될 수 있다.

일부 구체예에서, 카세트는 헤어핀 부분(즉, 카세트 올리고뉴클레오티드의 한 부분이 반응 조건 하에서 동일한 올리고뉴클레오티드의 제2 부분에 혼성화하여 이중가닥을 형성하는 영역)을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 구체예에서, 카세트는 반응 조건 하에서 이중가닥을 형성할 수 있는 상보적인 부분을 포함하는 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 카세트는 표지, 예컨대 형광체를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 카세트는 FRET 효과를 발생하는 표지된 원자단을 포함한다.

여기서 사용되듯이, 용어 "FRET"는 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer)을 지칭하는데, 이 과정에서 원자단(예컨대, 형광체)이 예컨대 자신들 사이에서, 또는 형광체로부터 비-형광체(예컨대, 소광체 분자)로 에너지를 전달한다. 일부 상황에서, FRET는 단거리(예컨대, 약 10nm 이하) 쌍극자-쌍극자 상호작용을 통해 저-에너지 억셉터(acceptor) 형광체로 에너지를 전달하는 여기된 도너(donor) 형광체를 포함한다. 또 다른 상황에서, FRET는 도너로부터의 형광 에너지 손실 및 억셉터 형광체에서의 형광 증가를 포함한다. 또 다른 형태의 FRET에서, 에너지는 여기된 도너 형광체로부터 비-형광 분자(즉, "어두운" 소광 분자)로 교환될 수 있다. FRET는 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 공개되어 있다(참조, 예컨대, Stryer et al., 1978, Ann. Rev. Biochem., 47:819; Selvin, 1995, Methods Enzymol., 246:300; Orpana, 2004 Biomol Eng 21, 45-50; Olivier, 2005 Mutant Res 573, 103-110, 이들 각각은 그 전체가 참조로 여기에 수록된다).

대표적인 플랩 검출 분석에서, 침습성 올리고뉴클레오티드 및 플랩 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산에 혼성화되어 전술한 바와 같은 중첩을 갖는 제1 복합체를 생성한다. 짝이 없는 "플랩"이 플랩 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 포함된다. 제1 복합체는 플랩 엔도뉴클레아제, 예컨대, FEN-1 엔도뉴클레아제에 대한 기질이며, 이는 플랩 올리고뉴클레오티드를 절단하여 5' 플랩 부분을 방출한다. 제2 반응에서, 방출된 5' 플랩 산물은 FRET 카세트에서 침습성 올리고뉴클레오티드로 작용하여 플랩 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 구조를 다시 생성하며, 이에 따라 FRET 카세트가 절단된다. 형광체와 소광체(quencher)가 FRET 카세트의 절단에 의해 분리될 때, 백그라운드 형광 상부의 검출가능한 형광 신호가 생성된다.

용어 "실시간"은 핵산 증폭 또는 신호 증폭의 검출과 관련하여 여기서 사용되듯이 반응이 진행되는 동안, 예컨대, 배양 또는 열 싸이클링 동안 반응에서의 생성물 또는 신호의 누적의 검출 또는 측정을 지칭한다. 이러한 검출 또는 측정은 연속적으로 일어날 수 있거나, 또는 증폭 반응의 진행 동안 복수의 별도 시점에서 일어날 수 있거나, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들면, 중합효소 연쇄 반응에서, 검출(예컨대, 형광의 검출)은 열 싸이클링의 전부 또는 일부 동안 연속적으로 일어날 수 있거나, 또는 하나 이상의 싸이클 동안 하나 이상의 시점에서 일시적으로 발생할 수 있다. 일부 구체예에서, PCR 또는 QuARTS 반응의 실시간 검출은 복수의 싸이클 각각에서, 또는 모든 싸이클에서, 동일 시점(예컨대, 싸이클에서 시점, 또는 싸이클에서 온도 단계)에서 형광의 수준을 결정함으로써 달성된다. 증폭의 실시간 검출은 또한 증폭 반응 "동안" 검출로 지칭될 수도 있다.

여기서 사용되듯이, 용어 "정량적 증폭 데이터 세트"는 표적 샘플, 예컨대 표적 DNA의 정량적 증폭 동안 얻어진 데이터를 의미한다. 정량적 PCR 또는 QuARTS 분석의 경우, 정량적 증폭 데이터 세트는 증폭 동안, 예컨대, 복수의, 또는 모든 열 싸이클 동안, 얻은 형광 값의 집합이다. 정량 증폭을 위한 데이터는 반응의 특정 시점에서 수집된 데이터에 국한되지 않으며, 형광은 각 싸이클의 불연속 시점에서 또는 각 싸이클 전반에서 연속적으로 측정될 수 있다.

약어 "Ct" 및 "Cp"는 실시간 PCR 및 PCR+침입자(INVADER) 분석 동안 수집된 데이터와 관련하여 여기서 사용되듯이 신호(예컨대, 형광 신호)가 양의 신호를 나타내는 소정의 임계 값과 교차하는 을 지칭한다. 다양한 방법이 신호 대 농도의 결정요인으로 사용되는 임계값을 계산하기 위하여 사용되었으며, 이 값은 일반적으로 "교차 임계값"(Ct) 또는 "교차점"(Cp)으로 표현된다. Cp 값 또는 Ct 값 중 하나는 분석 또는 샘플에서 변이체 및/또는 비-변이체 성분의 백분율의 결정을 위한 실시간 신호의 분석을 위해 여기에 제시된 방법의 구체예에서 사용될 수 있다.

여기서 사용되듯이, 용어 "키트"는 물질을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 나타낸다. 반응 분석과 관련하여, 이러한 전달 시스템은 반응 시약(예컨대, 적절한 용기에서 올리고뉴클레오티드, 효소, 등) 및/또는 지지 물질(예컨대, 분석을 수행하기 위한 완충제, 서면 설명서 등)을 한 위치에서 다른 위치로 저장, 수송, 또는 전달하는 것을 허용하는 시스템을 포함한다. 예를 들면, 키트는 관련 반응 시약 및/또는 지지 물질을 함유한 하나 이상의 밀폐용기(예컨대, 상자)를 포함한다. 여기서 사용되듯이, 용어 "단편화된 키트"는 각각 전체 키트 성분의 하위부분을 함유하는 둘 이상의 분리된 용기를 포함하는 전달 시스템을 의미한다. 용기는 의도된 수령인에게 함께 또는 개별적으로 전달될 수 있다. 예를 들면, 제1 용기는 분석에 사용하기 위한 효소를 함유할 수 있는 한편, 제2 용기는 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다.

용어 "시스템"은 특정 목적을 위해 사용되는 물품의 집합을 의미한다. 일부 구체예에서, 물품은 예컨대, 물품, 종이, 또는 기록가능한 매체(예컨대, DVD, CD, 플래시 드라이브 등)에 제공된 정보로서 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 구체예에서, 설명서는 사용자를 온라인 위치, 예컨대, 웹싸이트로 안내한다.

여기서 사용되듯이, 용어 "정보"는 사실 또는 데이터의 집합을 지칭한다. 비제한적으로 인터넷을 포함하여 컴퓨터 시스템을 사용하여 저장되거나 처리되는 정보와 관련하여, 이러한 용어는 임의 형식(예컨대, 아날로그, 디지털, 광학, 등)으로 저장되는 모든 데이터를 지칭한다. 여기서 사용되듯이, 용어 "대상체에 관한 정보"는 대상체(예컨대, 인간, 식물, 또는 동물)와 관련된 사실 또는 데이터를 지칭한다. 용어 "게놈 정보"는 비제한적으로 핵산 서열, 유전자, 백분율 메틸화, 대립유전자 빈도, RNA 발현 수준, 단백질 발현, 유전자형과 관련된 표현형 등을 포함하는 게놈과 관련된 정보를 지칭한다. "대립유전자 빈도 정보"는 비제한적으로 대립유전자 동일성, 대립유전자의 존재와 대상체(예컨대, 인간 대상체)의 특성 사이의 통계적 상관관계, 개체 또는 개체군에서의 대립유전자의 존재 또는 부존재, 하나 이상의 특정 특성을 갖는 개체에 존재하는 대립유전자의 백분율 가능성 등을 포함하는 대립유전자 빈도에 관련된 사실 또는 데이터를 지칭한다.

도면의 설명
도 1은 미전환 형태 및 바이설파이트-전환된 형태의 마커 표적 영역의 개략도를 나타낸다. 바이설파이트-전환된 표적 DNA의 검출을 위한 플랩 분석 프라이머 및 프로브가 제시된다.
도 2-5는 실시예 2에 개시된 폐 암종과 관련된 마커를 선택하기 위한, 감소된 표현 바이설파이트 시퀀싱(Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS) 결과를 비교하는 표를 제공하며, 각 행은 표시된 마커 영역(염색체 및 시작 및 정지 위치에 의해 식별됨)에 대한 평균값을 나타낸다. 각 조직 유형(정상(Norm), 선암(Ad), 대세포암종(LC), 소세포암종(SC), 편평 세포 암종(SQ) 및 미정의된 암(UND)이 정상 대상체(WBC 또는 BC)로부터의 버피 코트 샘플(buffy coat sample)의 평균 메틸화에 대하여 비교됨)에 대한 평균 메틸화 비율이 각 영역에 대하여 제시되며, 각 영역에서 확인된 유전자 및 트랜스크립트(transcripts)가 표시된다.
도 2는 폐 선암과 관련된 마커를 선택하기 위하여 RRBS 결과를 비교하는 표를 제공한다.
도 3은 폐 대세포암종과 관련된 마커를 선택하기 위하여 RRBS 결과를 비교하는 표를 제공한다.
도 4는 폐 소세포암종과 관련된 마커를 선택하기 위하여 RRBS 결과를 비교하는 표를 제공한다.
도 5는 폐 편평 세포 암종과 관련된 마커를 선택하기 위하여 RRBS 결과를 비교하는 표를 제공한다.
도 6은 대응하는 SEQ ID NOS와 함께, 분석 표적 및 검출 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열의 표를 제공한다.
도 7은 마커 SHOX2 , SOBP , ZNF781 , BTACT , CYP26C1 , 및 DLX4를 사용하여, 실시예 3의 데이터의 6-마커 로지스틱 피트를 나타내는 그래프를 제공한다. ROC 곡선 분석은 0.973의 곡선 아래 면적(AUC)을 나타낸다.
도 8은 마커 SHOX2 , SOBP , ZNF781 , CYP26C1 , SUCLG2 , 및 SKI를 사용하여, 실시예 3의 데이터의 6-마커 로지스틱 피트를 나타내는 그래프를 제공한다. ROC 곡선 분석은 0.97982의 곡선 아래 면적(AUC)을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

DNA, 예컨대, 메틸화된 DNA의 검출 및 정량화를 위한 분석에서의 사용을 위한 핵산 마커의 선택과 관련된 기술, 및 핵산 검출 분석에서의 마커의 용도가 여기서 제공된다. 특히, 상기 기술은 폐암을 검출하기 위한 메틸화 분석의 사용에 관한 것이다.

다양한 구체예의 상세한 설명에서, 설명의 목적으로, 개시된 구체예들의 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항들이 제시된다. 그러나, 해당 분야의 통상의 기술자는 이러한 다양한 구체예가 이러한 특정 세부사항의 유무에 관계없이 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 다른 경우, 구조 및 장치는 블록 다이어그램 형태로 표시된다. 또한, 해당 분야의 통상의 기술자는 방법이 제시되고 수행되는 특정 순서는 예시적인 것이며 이들 순서는 변경될 수 있으며 여기서 개시된 다양한 구체예의 사상 및 범위 내에 머물러 있다는 것을 쉽게 알 수 있다.

일부 구체예에서, 마커는 100개 이하의 염기의 영역이거나, 마커는 500개 이하의 염기의 영역이거나, 마커는 1000개 이하의 염기의 영역이거나, 마커는 5000개 이하의 염기의 영역이거나, 또는 일부 구체예에서, 마커는 하나의 염기이다. 일부 구체예에서 마커는 높은 CpG 밀도 프로모터에 있다.

상기 기술은 샘플 유형에 한정되지 않는다. 예를 들면, 일부 구체예에서 샘플은 대변 샘플, 조직 샘플, 가래, 혈액 샘플(예컨대, 혈장, 혈청, 전혈), 배설물, 또는 소변 샘플이다.

또한, 이 기술은 메틸화 상태를 결정하는데 사용되는 방법에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서 분석은 메틸화 특이성 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분광법, 메틸화 특이성 뉴클레아제, 질량-기반 분리, 또는 표적 포획을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 분석은 메틸화 특이성 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 이 기술은 메틸화 상태를 결정하기 위한 대규모 병행 시퀀싱(예컨대, 차세대 시퀀싱), 예컨대, 합성에 의한 시퀀싱, 실시간(예컨대, 단일-분자) 시퀀싱, 비드 에멀젼 시퀀싱, 나노공극 시퀀싱 등을 사용한다.

이 기술은 차별적으로 메틸화된 영역(differentially methylated region, DMR)을 검출하기 위한 시약을 제공한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드가 제공되며, 상기 올리고뉴클레오티드는, BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4 , MAX.chr8.124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B , DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN, SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_ chr10 .225, PRDM14 , ANGPT1, MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_ chr19 .163, ZNF132 , MAX chr19.372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK, BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX.chr12.526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8 , , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14, FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX , S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15, ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역, 바람직하게는 서브세트 SLC12A8 , KLHDC7B , PARP15 , OPLAH , BCL2L11 , MAX. chr12 .526, HOXB2 , EMX1, CYP26C1 , SOBP , SUCLG2 , SHOX2 , ZDHHC1 , NFIX , FLJ45983 , HOXA9 , B3GALT6 , ZNF781, SP9, BARX1 , 및 SKI로부터 선택된 마커; 또는 ZNF781 , BARX1 , 및 EMX1로 구성된 그룹; SHOX2 , SOBP , ZNF781 , CYP26C1 , SUCLG2 , 및 SKI로 구성된 그룹; SLC12A8, KLHDC7B , PARP15 , OPLAH , BCL2L11 , MAX. chr12 .526, HOXB2 , 및 EMX1로 구성된 그룹; SHOX2 , SOBP , ZNF781 , BTACT , CYP26C1 , 및 DLX4로 구성된 그룹; 또는 SHOX2, SOBP , ZNF781 , CYP26C1 , SUCLG2 , 및 SKI로 구성된 그룹을 정의하는 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 마커에 상보적인 서열을 포함한다.

키트 구체예가 제공되며, 예컨대, 키트는 바이설파이트 시약; 및 BARX1 , LOC100129726, SPOCK2 , TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B, DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_chr10.225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_chr19.163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1, ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4, SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX. chr12 .526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8, , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14 , FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX, S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15 , ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터, 바람직하게는 전술한 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하고, 암(예컨대, 폐암)을 갖지 않는 대상체와 관련된 메틸화 상태를 갖는 대조군 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 바이설파이트 시약 및 여기에 개시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 바이설파이트 시약; 및 이러한 염색체 영역으로부터의 서열을 포함하고 폐암을 갖는 대상체와 관련된 메틸화 상태를 갖는 대조군 핵산을 포함한다.

이 기술은 조성물(예컨대, 반응 혼합물)의 구체예와 관련이 있다. 일부 구체예에서 BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1, NKX6 _2, FAM59B , DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1, MAX_ chr8 .145, MAX_ chr10 .225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B, DOCK2 , MAX_ chr19 .163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2, ARHGEF4 , CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA_22, FLJ45983 , DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX. chr12 .526, BCL2L11 , OPLAH, PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8 , , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14 , FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2_Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX , S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15 , ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터, 바람직하게는 전술한 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 핵산, 및 바이설파이트 시약을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구체예는 BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1, ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B , DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_chr10.226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_ chr10 .225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX.chr16.50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_ chr19 .163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9, TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1, PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX.chr12.526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8 , , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14, FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX , S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15, ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터, 바람직하게는 전술한 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 핵산, 및 여기에 개시된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예는 BARX1 , LOC100129726, SPOCK2 , TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B, DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_chr10.225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_chr19.163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1, ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4, SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX. chr12 .526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8, , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14 , FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX, S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15 , ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터, 바람직하게는 전술한 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 핵산, 및 메틸화-민감성 제한 효소를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예는 BARX1, LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6_2, FAM59B , DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1 , MAX_chr8.145, MAX_ chr10 .225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2, MAX_ chr19 .163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4, CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983, DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX. chr12 .526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B, SLC12A8 , , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14 , FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3, NFIX , S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15 , ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터, 바람직하게는 전술한 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 핵산, 및 중합효소를 포함하는 조성물을 제공한다.

추가적인 관련 방법 구체예가 대상체로부터 획득한 샘플에서 신생물(예컨대, 폐 암종)을 선별하기 위하여 제공되며, 예컨대, 방법은 BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2, TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B , DIDO1, MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_chr10.225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_chr19.163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1, ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4, SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX. chr12 .526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8, , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14 , FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX, S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15 , ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터, 바람직하게는 전술한 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역에서 염기를 포함하는 샘플 내에서 마커의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 대상체 샘플로부터의 마커의 메틸화 상태를 폐암을 갖지 않는 대상체로부터의 정상 대조군 샘플로부터의 마커의 메탈화 상태에 대하여 비교하는 단계; 및 대상체 샘플 및 정상 대조군 샘플의 메틸화 상태의 차이의 신뢰 구간 및/또는 p 값을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 신뢰 구간은 90%, 95%, 97.5%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 99.99%이며 p 값은 0.1, 0.05, 0.025, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 또는 0.0001이다. 방법의 일부 구체예는 BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4 , MAX.chr8.124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B , DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN, SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_ chr10 .225, PRDM14 , ANGPT1, MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_ chr19 .163, ZNF132 , MAX chr19.372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK, BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX.chr12.526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8 , , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14, FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX , S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15, ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터, 바람직하게는 전술한 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 핵산을 바이설파이트 시약과 반응시켜 바이설파이트-반응된 핵산을 생성하는 단계; 상기 바이설파이트-반응된 핵산을 시퀀싱시켜 상기 바이설파이트-반응된 핵산의 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계; 상기 바이설파이트-반응된 핵산의 상기 뉴클레오티드 서열을 폐암을 갖지 않는 대상체로부터의 염색체 영역을 포함하는 핵산의 뉴클레오티드 서열과 비교하여 이들 두 서열들의 차이를 식별하는 단계; 및 차이가 존재하는 경우 신생물을 갖는 것으로 대상체를 식별하는 단계를 제공한다.

대상체로부터 획득한 샘플에서 폐암을 선별하기 위한 시스템이 이 기술에 의해 제공된다. 시스템의 예시적인 구체예는 예컨대 대상체로부터 획득한 샘플에서 폐암을 선별하기 위한 시스템을 포함하며, 상기 시스템은 샘플의 메틸화 상태를 결정하도록 구성된 분석 성분, 상기 샘플의 메틸화 상태를 데이터베이스에 기록된 대조군 샘플 또는 기준 샘플 메틸화 상태와 비교하도록 구성된 소프트웨어 성분, 및 사용자에게 암-관련 메틸화 상태를 경보하도록 구성된 경보 성분을 포함한다. 경보는 일부 구체예에서 여러 분석(예컨대, 여러 마커, 예컨대, BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2, TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B , DIDO1, MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_chr10.225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_chr19.163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1, ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4, SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX. chr12 .526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8, , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14 , FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX, S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15 , ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터, 바람직하게는 전술한 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역의 메틸화 상태를 결정하는 단계, 및 여러 결과를 기반으로 하여 보고하기 위해 값 또는 결과를 계산하는 단계)으로부터의 결과를 받는 소프트웨어 성분에 의해 결정된다. 일부 구체예는 값 또는 결과를 계산하기 위하여 사용하거나 및/또는 사용자(예컨대, 의사, 간호사, 임상의 등)에게 보고하기 위한 경보를 위하여 여기에 제공된 BARX1 , LOC100129726, SPOCK2 , TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B, DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_chr10.225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_chr19.163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1, ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4, SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX. chr12 .526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8, , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14 , FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX, S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15 , ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터, 바람직하게는 전술한 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역과 각각 관련된 가중치 파라미터의 데이터베이스를 제공한다. 일부 구체예에서 여러 분석으로부터의 모든 결과가 보고되며 일부 구체예에서 하나 이상의 결과가 대상체의 폐암 위험을 나타내는 다중 분석의 하나 이상의 결과의 조합에 기초하여 점수, 값, 또는 결과를 제공하는데 사용된다.

시스템의 일부 구체예에서, 샘플은 BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4 , MAX.chr8.124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B , DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN, SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_ chr10 .225, PRDM14 , ANGPT1, MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_ chr19 .163, ZNF132 , MAX chr19.372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK, BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX.chr12.526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8 , , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14, FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX , S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15, ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터, 바람직하게는 전술한 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서 시스템은 핵산을 분리하기 위한 성분, 즉 예컨대 대변 샘플을 수집하기 위한 성분과 같은 샘플 수집용 성분을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 시스템은 BARX1, LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6_2, FAM59B , DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_ chr10 .226, ZMIZ1 , MAX_chr8.145, MAX_ chr10 .225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX. chr16 .50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2, MAX_ chr19 .163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9 , TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4, CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1 , PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983, DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX. chr12 .526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B, SLC12A8 , , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14 , FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3, NFIX , S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15 , ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터, 바람직하게는 전술한 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 데이터베이스는 폐암을 갖지 않는 대상체로부터의 핵산 서열을 포함한다. 또한 핵산, 예컨대 핵산 세트가 제공되며, 각각의 핵산은 BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671, ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B , DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_chr10.226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_ chr10 .225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX.chr16.50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_ chr19 .163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9, TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1, PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX.chr12.526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8 , , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14, FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX , S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15, ZDHHC1 , 및 ZNF329로부터, 바람직하게는 전술한 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 서열을 포함한다.

관련 시스템 구체예는 개시된 핵산 세트 및 상기 핵산 세트와 관련된 핵산 서열의 데이터베이스를 포함한다. 일부 구체예는 바이설파이트 시약을 더욱 포함한다. 그리고, 일부 구체예는 핵산 시퀀서를 더욱 포함한다.

특정 구체예에서, 인간 대상체로부터 획득된 샘플을 특성화시키는 방법이 제공되며, 이는 a) 인간 대상체로부터 샘플을 획득하는 단계; b) 상기 샘플 중의 하나 이상의 마커의 메틸화 상태를 분석하는 단계, 여기서 상기 마커는 아래 마커 그룹으로부터: BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1 , ZNF671, ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B , DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_chr10.226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_ chr10 .225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX.chr16.50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_ chr19 .163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9, TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1, PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX.chr12.526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8 , , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14, FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX , S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15, ZDHHC1 , 및 ZNF329 , 바람직하게는 전술한 마커의 서브세트 중 임의 것으로부터 선택된 주석을 갖는 염색체 영역 중의 염기를 포함함; 및 c) 분석된 마커의 메틸화 상태를 신생물을 갖지 않는 대상체에서 분석된 마커의 메틸화 상태와 비교하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 기술은 생물학적 샘플에서 여기서 확인된 하나 이상의 마커의 존재 및 메틸화 상태를 평가하는 것과 관련된다. 이들 마커는 여기서 논의된 바와 같이 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역(DMR)을 포함한다. 메틸화 상태는 상기 기술의 구체예에서 평가된다. 따라서, 여기에 제공된 기술은 유전자의 메틸화 상태가 측정되는 방법에 제한되지 않는다. 예를 들면, 일부 구체예에서 메틸화 상태는 게놈 스캐닝 방법에 의해 측정된다. 예를 들면, 하나의 방법은 제한 랜드마크 게놈 스캐닝(Kawai et al. (1994) Mol . Cell. Biol . 14. 7421-7427)을 포함하며 또 다른 실시예는 메틸화-민감성 임의 프라이밍 PCR을 포함한다(Gonzalgo et al. (1997) Cancer Res. 57. 594-599). 일부 구체예에서, 특정 CpG 부위에서의 메틸화 패턴의 변화는 메틸화-민감성 제한 효소로 게놈 DNA를 분해시킨 후 관심 영역의 서던 분석(Southern analysis)(소화-서던 방법)에 의해 모니터링된다. 일부 구체예에서, 메틸화 패턴의 변화를 분석하는 것은 PCR 증폭 이전에 메틸화-민감성 제한 효소로 게놈 DNA를 분해하는 것을 포함하는 PCR-기반 공정을 포함한다(Singer-Sam et al. (1990) Nucl . Acids Res. 18. 687). 또한, 메틸화 분석에 대한 출발점으로서 DNA의 바이설파이트 처리를 이용하는 또 다른 기술이 보고되었다. 이는 메틸화-특이성 PCR(MSP)(Herman et al. (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93: 9821-9826) 및 바이설파이트-전환된 DNA로부터 증폭된 PCR 산물의 제한 효소 분해를 포함한다(Sadri 및 Hornsby (1996) Nucl . Acids Res. 24. 5058-5059; 및 Xiong 및 Laird (1997) Nucl . Acids Res. 25. 2532-2534). PCR 기술은 유전자 돌연변이의 검출(Kuppuswamy et al. (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88: 1143-1147) 및 대립유전자-특이성 발현의 정량화를 위하여 개발되었다(Szabo 및 Mann (1995) Genes Dev . 9. 3097-3108; 및 Singer-Sam et al. (1992) PCR Methods Appl. 1. 160-163). 이러한 기술은 내부 프라이머를 사용하며, 이는 PCR-생성된 주형에 어닐링하고 분석될 단일 뉴클레오티드의 5'를 즉시 종결시킨다. "정량적 Ms-SNuPE 분석"을 사용하는 방법이 미국 특허 제7,037,650호 개시된 바와 같이 일부 구체예에서 사용된다.

메틸화 상태를 평가할 때, 메틸화 상태는 종종 해당 특정 부위를 포함하는 샘플 중의 DNA의 전체 개체군에 비하여 특정 부위에서(예컨대, 단일 뉴클레오티드에서, 특정 영역 또는 유전자자리에서, 더 긴 관심 서열, 예컨대 최대 ~100-bp, 200-bp, 500-bp, 1000-bp 의 DNA 서브서열 또는 그 이상에서) 메틸화된 DNA의 개별 가닥의 분율 또는 백분율로서 표현된다. 전통적으로, 미메틸화된 핵산의 양은 캘리브레이터를 이용한 PCR에 의해 결정된다. 그런 다음, 알려진 양의 DNA를 바이설파이트 처리하고 생성된 메틸화-특이성 서열을 실시간 PCR 또는 또 다른 지수 증폭(exponential amplification), 예컨대 QuARTS 분석을 사용하여 결정한다(예컨대, 미국 특허 제8,361,720호; 제8,715,937호; 제8,916,344호; 및 제9,212,392호에 의해 제공된 바와 같음).

예를 들면, 일부 구체예에서 방법은 외부 표준을 사용하여 비메틸화된 표적에 대한 표준 곡선을 생성하는 단계를 포함한다. 표준 곡선은 적어도 두 개의 점으로 구성되며 비메틸화된 DNA의 실시간 Ct 값을 알려진 정량 표준과 연관시킨다. 그런 다음, 메틸화된 표적에 대한 제2 표준 곡선이 적어도 두 개의 지점과 외부 표준으로 구성된다. 이러한 제2 표준 곡선은 메틸화된 DNA에 대한 Ct를 알려진 정량 표준과 연관시킨다. 다음으로, 메틸화된 및 비메틸화된 개체군에 대하여 시험 샘플 Ct 값을 결정하고, DNA의 게놈 등가물을 처음 두 단계에 의해 생성된 표준 곡선으로부터 계산한다. 관심 부위에서의 메틸화의 백분율을 개체군에서 DNA의 전체 양에 대한 메틸화된 DNA의 양으로부터, 예컨대, (메틸화된 DNA의 수) / (메틸화된 DNA의 수 + 비메틸화된 DNA의 수) X 100으로부터 계산한다.

또한, 상기 방법을 실시하기 위한 조성물 및 키트가 여기에 제공된다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 하나 이상의 마커에 특이적인 시약(예컨대, 프라이머, 프로브)이 단독으로 또는 세트로(예컨대, 복수의 마커를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍의 세트) 제공된다. 검출 분석을 수행하기 위한 추가 시약이 또한 제공될 수 있다(예컨대, 효소, 완충액, QuARTS, PCR, 시퀀싱, 바이설파이트, 또는 또 다른 분석을 수행하기 위한 양성 및 음성 대조군). 일부 구체예에서, 방법을 수행하기 위해 필수적이거나, 충분하거나, 또는 유용한 하나 이상의 시약을 함유하는 키트가 제공된다. 또한 시약을 함유하는 반응 혼합물이 제공된다. 또한, 반응 혼합물을 완성하기 위해 서로에게 및/또는 시험 샘플에 첨가될 수 있는 복수의 시약을 함유하는 마스터 혼합 시약 세트가 제공된다.

이들 분석 기술에 적합한 DNA 분리 방법은 해당 분야에 공지되어 있다. 특히, 일부 구체예는 미국 특허 출원 번호 제13/470,251호 ("Isolation of Nucleic Acids")에 개시된 바와 같이 핵산의 분리를 포함하며, 이는 그 전체가 여기에 참조로 수록된다.

게놈 DNA는 상업적으로 입수 가능한 키트의 사용을 포함하여, 임의적인 수단에 의해 분리될 수 있다. 간략하게, 관심있는 DNA가 세포막에 의해 캡슐화되는 경우, 생물학적 샘플은 효소적, 화학적 또는 기계적 수단에 의해 파괴되고 용해되어야 한다. 그 후 DNA 용액은, 예컨대 단백질분해효소 K에 의한 분해에 의해, 단백질 및 또 다른 오염물질을 제거할 수 있다. 게놈 DNA는 그 후 용액으로부터 회수된다. 이는 염석(salting out), 유기 추출(organic extraction), 또는 고체상 지지체에 대한 DNA의 결합을 포함하여 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 방법의 선택은 시간, 비용, 및 필요한 DNA 양을 포함한 여러 요소의 영향을 받을 것이다. 신생물성 물질 또는 전-신생물성 물질을 포함하는 모든 임상 샘플 유형은 본 방법에서의 사용에 적합하며, 예컨대, 세포주, 조직학 슬라이드, 생검(biopsies), 파라핀-내장 조직, 체액, 대변, 결장 유출물, 소변, 혈장, 혈청, 전혈, 분리된 혈액 세포, 혈액으로부터 분리된 세포, 및 이들의 조합이다.

이 기술은 샘플을 준비하는데 사용되는 방법에 국한되지 않으며 시험을 위한 핵산을 제공한다. 예를 들면, 일부 구체예에서, DNA는 미국 특허 출원 번호 제61/485386에 개시된 바에 따라 직접 유전자 포획을 사용하거나 또는 관련 방법에 의해 대변 샘플 또는 혈액 또는 혈장 샘플로부터 분리된다.

이 기술은 폐암과 관련되거나 또는 폐암이 없음을 확인하기 위해 검사될 수있는 모든 샘플의 분석과 관련된다. 예를 들면, 일부 구체예에서 샘플은 환자로부터 얻은 조직 및/또는 생물학적 유체를 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 분비물을 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 가래, 혈액, 혈청, 혈장, 위 분비물, 폐 조직 샘플, 폐 세포 또는 대변에서 회수한 폐 DNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 인간이다. 이러한 샘플은 통상의 기술자에게 자명한 바와 같이 해당 업계에 공지된 많은 수단에 의해 획득될 수 있다.

I. 폐암을 검출하기 위한 메틸화 분석

후보 메틸화된 DNA 마커를 선택된 폐암 케이스 및 폐 대조군 조직의 비편향적 전체 메틸롬 시퀀싱(unbiased whole methylome sequencing)에 의해 식별하였다. 최고 마커 후보자는 255명의 독립 환자와 119명의 대조군에서 더욱 평가되었으며, 그 중 37명은 양성 결절이었고, 136명은 모든 폐암 아형을 포함했다. 환자 조직 샘플에서 추출한 DNA를 바이설파이트로 처리한 후, 후보 마커 및 β-액틴(ACTB)을 정규화 유전자로서 정량적 대립유전자-특이성 실시간 표적 및 신호 증폭(QuARTS 증폭)에 의해 분석하였다. QuARTS 분석 화학은 메틸화된 마커 선택 및 선별에 대해 높은 차별을 산출합니다.

개별 마커 후보자의 수신자 조작자 특성 분석에서, 곡선 아래 영역(AUC)은 0.512 내지 0.941의 범위였다. 100% 특이성에서, 8개 메틸화 마커(SLC12A8 , KLHDC7B, PARP15 , OPLAH , BCL2L11 , MAX.12.526, HOXB2 , 및 EMX1)의 조합된 패널은 폐암의 모든 아형에서 98.5%의 민감도를 산출하였다. 또한, 8개 마커 패널을 사용하여, 양성 폐 결절은 거짓 양성을 나타내지 않았다.

II. 메틸화 검출 분석 및 키트

여기에 개시된 마커는 다양한 메틸화 검출 분석에 사용된다. 5-메틸시토신의 존재에 대하여 핵산을 분석하기 위한 가장 빈번하게 사용되는 방법은 DNA 중의 5-메틸시토신의 검출을 위한, Frommer, et al.에 의해 개시된 바이설파이트 방법 또는 그 변형에 기반한다(Frommer et al. (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89: 1827-31 모든 목적을 위하여 그 전체가 여깅 참조로 명백하게 수록된다). 5-메틸시토신을 매핑하는 바이설파이트 방법은 5-메틸시토신이 아닌 시토신이 하이드로젠 설파이트 이온(또한 바이설파이트로 알려져 있음)과 반응한다는 관찰에 기초한다. 반응은 일반적으로 다음 단계에 따라 수행된다: 먼저, 시토신이 하이드로젠 설파이트와 반응하여 설폰화된 시토신을 형성한다. 다음에, 설폰화된 반응 중간체의 자발적인 탈아민화가 설폰화된 우라실을 산출한다. 마지막으로, 설폰화된 우라실이 알칼리 조건 하에서 탈설폰화되어 우라실을 형성한다. 우라실 염기가 아데닌과 쌍을 이루고(따라서 티민처럼 행동함) 한편 5-메틸시토신 염기가 구아닌과 쌍을 이루기 때문에(따라서 시토신처럼 행동함) 검출이 가능하다. 이는 예컨대 바이설파이트 게놈 시퀀싱(Grigg G, & Clark S, Bioessays (1994) 16: 431-36; Grigg G, DNA Seq. (1996) 6: 189-98), 예컨대, 미국 특허 제5,786,146호에 개시된 메틸화-특이성 PCR(MSP), 또는 서열-특이성 프로브 절단, 예컨대, QuARTS 플랩 엔도뉴클레아제 분석(참조, 예컨대, Zou et al. (2010) "Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology" Clin Chem 56: A199; 및 미국 특허 제8,361,720호; 제8,715,937호; 제8,916,344호; 및 제9,212,392호)을 포함하는 분석의 이용에 의해, 메틸화된 시토신을 비-메틸화된 시토신과 구별하는 것을 가능하게 한다.

일부 통상적인 기술은 분석될 DNA를 아가로오스 매트릭스로 둘러싸는 단계, 이에 의해 상기 DNA의 확산 및 재생을 방지하는 단계(단지 바이설파이트만이 단일-가단 DNA와 반응함), 및 침전 및 정제 단계를 신속한 투석으로 교체하는 단계를 포함한다(Olek A, et al. (1996) "A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis" Nucleic Acids Res. 24. 5064-6). 따라서 방법의 유용성과 민감도를 나타내도록, 메틸화 상태에 대해 개별 세포를 분석하는 것이 가능하다. 5-메틸시토신을 검출하기 위한 전통적인 방법의 개요가 Rein, T., et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26. 2255에 의해 제시된다.

바이설파이트 기술은 전형적으로 바이설파이트 처리된 후 공지된 핵산의 짧은, 특정 단편을 증폭시키는 단계, 그 후 시퀀싱에 의한(Olek & Walter (1997) Nat. Genet. 17. 275-6) 또는 프라이머 연장 반응(Gonzalgo & Jones (1997) Nucleic Acids Res. 25. 2529-31; WO 95/00669; 미국 특허 제6,251,594호)에 의한 생성물을 분석하여 개별 시토신 위치를 분석하는 단계를 포함한다. 일부 방법은 효소 분해를 사용한다(Xiong & Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25. 2532-4). 혼성화에 의해 검출이 또한 해당 분야에 개시되어 있다(Olek et al., WO 99/28498). 또한, 개별 유전자에 관한 메틸화 검출을 위한 바이설파이트 기술의 사용이 개시되어 있다(Grigg & Clark (1994) Bioessays 16: 431-6; Zeschnigk et al. (1997) Hum Mol Genet. 6. 387-95; Feil et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22. 695; Martin et al. (1995) Gene 157: 261-4; WO 9746705; WO 9515373).

다양한 메틸화 분석 과정이 본 기술에 따르는 바이설파이트 처리와 결합되어 사용될 수 있다. 이러한 분석은 핵산 서열 내의 하나 또는 복수의 CpG 디뉴클레오티드(예컨대, CpG 섬)의 메틸화 상태의 결정을 위하여 허용된다. 이러한 분석은 다른 기술 중에서, 바이설파이트-처리된 핵산의 시퀀싱, PCR (서열-특이성 증폭에 대하여), 사우던 블롯 분석(Southern blot analysis), 및 메틸화-민감성 제한 효소의 사용을 포함한다.

예를 들면, 게놈 시퀀싱은 바이설파이트 처리를 사용함에 의해 메틸화 패턴 및 5-메틸시토신 분포의 분석을 위하여 단순화되었다(Frommer et al. (1992) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 89: 1827-1831). 또한, 바이설파이트-전환된 DNA로부터 증폭된 PCR 산물의 제한 효소 분해가 메틸화 상태를 평가하기 위하여 사용되며, 예컨대 Sadri & Hornsby (1997) Nucl . Acids Res. 24. 5058-5059에 개시되거나 또는 COBRA(결합 바이설파이트 제한 분석)로서 알려진 방법에 포함된 것과 같다(Xiong & Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25. 2532-2534).

COBRA™ 분석은 소량의 게놈 DNA에서 특정 유전자자리에서 DNA 메틸화 수준을 결정하는데 유용한 정량적 메틸화 분석이다(Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). 간략하게, 제한 효소 분해는 소듐 바이설파이트-처리된 DNA의 PCR 산물에서 메틸화-의존성 서열 차이를 밝히는데 사용된다. 메틸화-의존성 서열 차이는 Frommer et al.에 의해 개시된 과정에 따르는 표준 바이설파이트 처리에 의해 게놈 DNA 내로 먼저 도입된다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). 바이설파이트 전환된 DNA의 PCR 증폭이 그 후 해당 CpG 섬에 대하여 특이적인 프라이머를 사용하여 수행되고, 그 후 제한 엔도뉴클레아제 분해, 겔 전기영동, 및 특이적, 표지된 혼성화 프로브를 사용하는 검출이 후속된다. 원본 DNA 샘플의 메틸화 수준은 DNA 메틸화 수준의 넓은 스펙트럼에 걸쳐 선형적 정량 방식으로 분해된 및 분해되지 않은 PCR 산물의 상대적인 양에 의해 표시된다. 또한, 이 기술은 미세절개된 파라핀-내장 조직 샘플로부터 얻어진 DNA에 신뢰성있게 적용될 수 있다.

COBRA™ 분석을 위한 전형적인 시약(예컨대, 전형저인 COBRA™-기반 기트에서 발견될 수 있음)은 비제한적으로 다음을 포함한다: 특정 유전자자리를 위한 PCR 프라이머(예컨대, 특정 유전자, 마커, 유전자의 영역, 마커의 영역, 바이설파이트 처리된 DNA 서열, CpG 섬, 등); 제한 효소 및 적절한 완충액; 유전자-혼성화 올리고뉴클레오티드; 대조군 혼성화 올리고뉴클레오티드; 올리고뉴클레오티드 프로브를 위한 키나아제 표지 키트; 및 표지된 뉴클레오티드. 또한, 바이설파이트 전환 시약은 다음을 포함할 수 있다: DNA 변성 완충액; 설폰화 완충액; DNA 회수 시약 또는 키트(예컨대, 침전, 한외여과, 친화적 칼럼); 탈설폰화 완충액; 및 DNA 회수 성분.

"메티라이트™(MethyLight ™)" (형광-기반 실시간 PCR 기술) (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999), Ms-SNuPE ™ (메틸화-민감성 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장) 반응(Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997), 메틸화-특이성 PCR ("MSP"; Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; 미국 특허 제5,786,146호), 및 메틸화된 CpG 섬 증폭 ("MCA"; Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999)과 같은 분석이 단독으로 또는 이들 방법 중 하나 이상과 결합되어 사용된다.

"헤비메틸™(HeavyMethyl ™)" 분석, 기술은 바이설파이트-처리된 DNA의 메틸화-특이성 증폭에 기반한 메틸화 차이를 평가하기 위한 정량적 방법이다. 증폭 프라이머들 사이의, 또는 이에 의해 커버링되는 CpG 위치를 커버링하는 메틸화-특이성 블록킹 프로브("블록커")는 핵산 샘플의 메틸화-특이성 선택적 증폭을 가능하게 한다.

용어 "헤비메틸™ 메티라이트™(HeavyMethyl ™ MethyLight ™)" 분석은 메티라이트™(MethyLight ™) 분석의 변형인 헤비메틸™ 메티라이트™(HeavyMethyl ™ MethyLight ™) 분석을 지칭하며, 여기서 메티라이트™(MethyLight ™) 분석은 증폭 프라이머들 사이의 CpG 위치를 커버링하는 메탈화 특이성 블록킹 프로브와 조합된다. 헤비메틸(HeavyMethyl ™) 분석은 또한 메틸화 특이성 증폭 프라이머와 조합되어 사용될 수도 있다.

헤비메틸™(HeavyMethyl ™) 분석을 위한 전형적인 시약(예컨대 전형적인 메티라이트™(MethyLight ™)-기반 키트에서 발견될 수 있음)은 비제한적으로 다음을 포함할 수도 있다: 특정 유전자자리를 위한 PCR 프라이머(예컨대, 특정 유전자, 마커, 유전자의 영역, 마커의 영역, 바이설파이트 처리된 DNA 서열, CpG 섬, 또는 바이설파이트 처리된 DNA 서열 또는 CpG 섬, 등); 블록킹 올리고뉴클레오티드; 최적화된 PCR 완충액 및 데옥시뉴클레오티드; 및 Taq 중합효소.

MSP(메틸화-특이성 PCR)은 메틸화-민감성 제한 효소의 사용과 무관하게, CpG 섬 내의 거의 모든 그룹의 CpG 부위의 메틸화 상태를 평가할 수 있다(Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; 미국 특허 제5,786,146호). 간략하게, DNA는 소듐 바이설파이트에 의해 변형되고, 이는 메틸화된 시토신이 아닌 비메틸화된 시토신을 우라실로 전환시키고, 후속하여 생성물을 메틸화된 DNA 대 비메틸화된 DNA에 대하여 특이적인 프라이머로 증폭시킨다. MSP는 단지 소량의 DNA만을 필요로하며, 주어진 CpG 섬 유전자자리의 0.1% 메틸화된 대립유전자에 대하여 민감하며, 파라핀-내장 샘플로부터 추출된 DNA에 대하여 수행될 수 있다. MSP 분석을 위한 전형적인 시약(예컨대, 전형적인 MSP-기반 키트에서 발견될 수 있음)은 비제한적으로 다음을 포함한다: 특정 유전자자리를 위한 메틸화된 및 비메틸화된 PCR 프라이머(예컨대, 특정 유전자, 마커, 유전자의 영역, 마커의 영역, 바이설파이트 처리된 DNA 서열, CpG 섬, 등); 최적화된 PCR 완충액 및 데옥시뉴클레오티드, 그리고 특정 프로브.

메티라이트™(MethyLight ™) 분석은 PCR 단계 후에 더 이상의 조작을 필요로 하지 않는 형광-기반 실시간 PCR(예컨대, TaqMan®)을 사용하는 고-처리량 정량적 메틸화 분석이다(Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999). 간략하게, 메티라이트™(MethyLight ™) 과정은 표준 절차에 따라, 소듐 바이설파이트 반응에서, 메틸화-의존성 서열 차이의 혼합 풀로 전환되는 게놈 DNA의 혼합 샘플로 시작된다(바이설파이트 공정은 비메틸화된 시토신 잔기를 우라실로 전환시킴). 형광-기반 PCR은 그 후 "편향적(biased)" 반응에서, 예컨대, 알려진 CpG 디뉴클레오티드를 중첩하는 PCR 프라이머에 의해 수행된다. 서열 식별은 증폭 과정의 수준 및 형광 검출 과정의 수준 둘 모두에서 일어난다.

메티라이트™(MethyLight ™) 분석은 핵산, 예컨대, 게놈 DNA 샘플에서 메틸화 패턴에 대한 정량적 시험으로서 사용되며, 여기서 서열 식별은 프로브 혼성화 수준에서 일어난다. 정량적 버전에서, PCR 반응은 특정한 추정 메틸화 부위와 중첩하는 형광 프로브의 존재하에 메틸화 특이성 증폭을 제공한다. 입력 DNA의 양에 대한 비편향적 대조군이 프라이머 또는 프로브 모두가 CpG 디뉴클레오티드를 중첩하지 않는 반응에 의해 제공된다. 대신에, 게놈 메틸화에 대한 정성 시험은 편향된 PCR 풀을 알려진 메틸화 부위를 커버링하지 않는 대조군 올리고뉴클레오티드(예컨대, 헤비메틸™(HeavyMethyl ™) 및 MSP 기술의 형광-기반 버전) 또는 잠재적 메틸화 부위를 커버링하는 올리고뉴클레오티드로 프로빙(probing)하여 달성된다.

메티라이트™(MethyLight ™) 과정은 임의의 적절한 프로브에 의해 사용된다(예컨대 "TaqMan®" 프로브, Lightcycler® 프로브, 등). 예를 들면, 일부 적용에서 이중-가닥 게놈 DNA는 소듐 바이설파이트에 의해 처리되고 예컨대, MSP 프라이머 및/또는 헤비메틸™(HeavyMethyl ™) 블록커 올리고뉴클레오티드에 의한 TaqMan® 프로브 및 TaqMan® 프로브를 사용하는 두 세트의 PCR 반응 중 하나에 적용시킨다. TaqMan® 프로브는 형광 "리포터" 및 "소광체(quencher)" 분자로 이중 표지되고 비교적 높은 GC 함량 영역에 특화되로록 설계되어 이에 따라 포워드 또는 리버스 프라이머에 비하여 PCR 싸이클에서 약 10℃ 더 높은 온도에서 용해된다. 이것은 TaqMan® 프로브가 PCR 어닐링/연장 단계 동안 완전히 혼성화된 상태로 유지되도록 한다. Taq 중합효소가 PCR 동안 새로운 가닥을 효소적으로 합성함에 따라, 어닐링된 TaqMan® 프로브에 최종적으로 도달한다. Taq 중합효소 5′ 에서 3′ 엔도뉴클레아제 활성은, TaqMan® 프로브를 분해하여, 실시간 형광 검출 시스템을 사용하는 소취되지 않은 신호(unquenched signal)의 정량적 검출을 위하여 형광 리포터 분자를 방출함으로써, TaqMan® 프로브를 대체할 것이다.

메티라이트™(MethyLight ™) 분석을 위한 전형적인 시약(예컨대, 전형적인 메티라이트™(MethyLight ™)-기반 키트에서 발견될 수 있음)은 비제한적으로 다음을 포함한다: 특정 유전자자리를 위한 PCR 프라이머(예컨대, 특정 유전자, 마커, 유전자의 영역, 마커의 영역, 바이설파이트 처리된 DNA 서열, CpG 섬, 등); TaqMan® 또는 Lightcycler® 프로브; 최적화된 PCR 완충액 및 데옥시뉴클레오티드; 및 Taq 중합효소.

QM ™ (정량적 메틸화) 분석은 게놈 DNA 샘플에서 메틸화 패턴에 대한 대안적인 정량적 시험이며, 여기서 서열 식별은 프로브 혼성화 수준에서 일어난다. 이러한 정량적 버전에서, PCR 반응은 특정한 추정 메틸화 부위와 중첩하는 형광 프로브의 존재하에 비편향적 증폭을 제공한다. 입력 DNA의 양에 대한 비편향적 대조군이 프라이머 또는 프로브 모두가 CpG 디뉴클레오티드를 중첩하지 않는 반응에 의해 제공된다. 대신에, 게놈 메틸화에 대한 정성 시험은 편향된 PCR 풀을 알려진 메틸화 부위를 커버링하지 않는 대조군 올리고뉴클레오티드(헤비메틸™(HeavyMethyl ™) 및 MSP 기술의 형광-기반 버전) 또는 잠재적 메틸화 부위를 커버링하는 올리고뉴클레오티드로 프로빙(probing)하여 달성된다.

QM ™ 과정은 증폭 과정에서 임의의 적절한 프로브, 예컨대, "TaqMan®" 프로브, Lightcycler® 프로브와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 이중-가닥 게놈 DNA는 소듐 바이설파이트로 처리되고 비편향된 프라이머 및 TaqMan® 프로브에 적용된다. TaqMan® 프로브는 형광 "리포터" 및 "소광체(quencher)" 분자로 이중 표지되고 비교적 높은 GC 함량 영역에 특화되로록 설계되어 이에 따라 포워드 또는 리버스 프라이머에 비하여 PCR 싸이클에서 약 10℃ 더 높은 온도에서 용해된다. 이것은 TaqMan® 프로브가 PCR 어닐링/연장 단계 동안 완전히 혼성화된 상태로 유지되도록 한다. Taq 중합효소가 PCR 동안 새로운 가닥을 효소적으로 합성함에 따라, 어닐링된 TaqMan® 프로브에 최종적으로 도달한다. Taq 중합효소 5′ 에서 3′ 엔도뉴클레아제 활성은, TaqMan® 프로브를 분해하여, 실시간 형광 검출 시스템을 사용하는 소취되지 않은 신호(unquenched signal)의 정량적 검출을 위하여 형광 리포터 분자를 방출함으로써, TaqMan® 프로브를 대체할 것이다. QM ™ 분석을 위한 전형적인 시약(예컨대, 전형저인 QM ™-기반 기트에서 발견될 수 있음)은 비제한적으로 다음을 포함한다: 특정 유전자자리를 위한 PCR 프라이머(예컨대, 특정 유전자, 마커, 유전자의 영역, 마커의 영역, 바이설파이트 처리된 DNA 서열, CpG 섬, 등); TaqMan® 또는 Lightcycler® 프로브; 최적화된 PCR 완충액 및 데옥시뉴클레오티드; 및 Taq 중합효소.

Ms-SNuPE ™ 기술은 DNA의 바이설파이트 처리, 및 후속하는 단일-뉴클레오티드 프라이머 연장을 기반으로 하는, 특정 CpG 부위에서 메틸화 차이를 평가하기 위한 정량적 방법이다(Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997). 간단히 말하면, 게놈 DNA는 소듐 바이설파이트와 반응하여 비메틸화된 시토신을 우라실로 전환시키며 한편 5-메틸시토신은 변하지 않은 상태로 남겨 둔다. 이후 원하는 표적 서열의 증폭이 바이설파이트-전환된 DNA에 특이적이 PCR 프라이머를 사용하여 수행되고, 산출된 생성물이 분리되고 관심 대상의 CpG 부위에서의 메틸화 분석을 위한 주형으로서 사용된다. 소량의 DNA가 분석될 수 있으며(예컨대, 미세절개된 병리학적 섹션) CpG 부위에서의 메틸화 상태를 결정하기 위하여 제한 효소의 사용을 피한다.

Ms-SNuPE ™ 분석을 위한 전형적인 시약(예컨대, 전형저인 Ms-SNuPE ™-기반 기트에서 발견될 수 있음)은 비제한적으로 다음을 포함한다: 특정 유전자자리를 위한 PCR 프라이머(예컨대, 특정 유전자, 마커, 유전자의 영역, 마커의 영역, 바이설파이트 처리된 DNA 서열, CpG 섬, 등); 최적화된 PCR 완충액 및 데옥시뉴클레오티드; 겔 추출 키트; 양성 대조군 프라이머; 특정 유전자자리를 위한 Ms-SNuPE ™ 프라이머; 반응 완충액 (Ms-SNuPE 반응을 위한); 및 표지된 뉴클레오티드. 또한, 바이설파이트 전환 시약은 다음을 포함할 수 있다: DNA 변성 완충액; 설폰화 완충액; DNA 회수 시약 또는 키트(예컨대, 침전, 한외여과, 친화적 칼럼); 탈설폰화 완충액; 및 DNA 회수 성분.

감소된 표현 바이설파이트 시퀀싱(Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS)은 핵산의 바이설파이트 처리로 시작하여 모든 비메틸화된 시토신을 우라실로 전환시키고, 후속하여 제한 효소 분해(예컨대, MspI과 같은 CG 서열을 포함하는 부위를 인식하는 효소에 의함) 및 어댑터 리간드에 커플링된 후 단편의 완전한 시퀀싱이 이어진다. 제한 효소의 선택은 CpG 고밀도 영역에 대한 단편을 풍부하게 하여, 분석 중에 여러 유전자 위치에 매핑될 수 있는 중복 서열의 수를 감소시킨다. 이와 같이, RRBS는 시퀀싱을 위한 제한 단편의 서브세트를 선택함으로써(예컨대, 분취용 겔 전기영동을 사용하는 크기 선택에 의함) 핵산 샘플의 복잡성을 감소시킨다. 전체-게놈 바이설파이트 시퀀싱과 달리, 제한 효소 분해에 의해 생성된 모든 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드에 대한 DNA 메틸화 정보를 포함한다. 이와 같이, RRBS는 이러한 영역에서 제한 효소 절단 부위의 높은 빈도와 함께 프로모터, CpG 섬, 및 기타 게놈 특징에 대한 샘플을 풍부하게 하여 하나 이상의 게놈 유전자자리의 메틸화 상태를 평가하는 분석법을 제공한다.

RRBS에 대한 전형적인 프로토콜은 핵산 샘플을 MspI과 같은 제한 효소로 분해하고, 오버행 및 A-테일링을 채우고, 어댑터를 연결하고, 바이설파이트 전환 및 PCR을 수행하는 단계를 포함한다. 참조, 예컨대, et al. (2005) "Genome-scale DNA methylation mapping of clinical samples at single-nucleotide resolution" Nat Methods 7: 133-6; Meissner et al. (2005) "Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis" Nucleic Acids Res. 33. 5868-77.

일부 구체예에서, 정량적 대립유전자-특이성 실시간 표적 및 신호 증폭(QuARTS) 분석이 메틸화 상태를 평가하는데 사용된다. 각각의 QuARTS 분석에서 세 가지 반응이 순차적으로 일어나는데, 첫 번째 반응에서 증폭(반응 1) 및 표적 프로브 절단(반응 2); 두 번째 반응에서 FRET 절단 및 형광 신호 발생(반응 3)을 포함한다. 표적 핵산이 특정 프라이머로 증폭될 때, 플랩 서열을 갖는 특정 검출 프로브는 앰플리콘(amplicon)에 느슨하게 결합한다. 표적 결합 부위에서 특정 침습성 올리고뉴클레오티드의 존재는 5' 뉴클레아제, 예컨대, FEN-1 엔도뉴클레아제가 검출 프로브와 플랩 서열 사이를 절단에 의해 플랩 서열을 방출하도록 한다. 플랩 서열은 대응하는 FRET 카세트의 비-헤어핀 부분에 대하여 상보적이다. 따라서, 플랩 서열은 FRET 카세트에서 침습성 올리고뉴클레오티드로서 작용하고 FRET 카세트 형광체와 형광 신호를 생성하는 소광체 사이에서 절단을 일으킨다. 절단 반응은 표적마다 여러 개의 프로브를 절단할 수 있으므로 플랩 당 여러 형광체를 방출하여, 지수 신호 증폭을 제공한다. QuARTS는 상이한 염료의 FRET 카세트를 사용하여 단일 반응 웰에서 여러 타겟을 검출할 수 있다. 참조, 예컨대, Zou et al. (2010) "Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology" Clin Chem 56: A199), 및 미국 특허 제8,361,720호; 제8,715,937호; 제8,916,344호; 및 제9,212,392호, 이들 각각은 여기서 그 전체가 모든 목적을 위하여 참조로 수록됨.

일부 구체예에서, 바이설파이트-처리된 DNA는 정량화되기 전에 정제된다. 이는 예컨대 Microcon ™ 컬럼(밀리포어(Millipore™)에 의해 제조됨)에 의한 한외여과(ultrafiltration)와 같은 해당 업계에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 정제는 수정된 제조자 프로토콜에 따라 수행된다(참조, 예컨대, PCT/EP2004/011715, 이는 그 전체가 참조로 수록됨). 일부 구체예에서, 바이설파이트 처리된 DNA는 고체 지지체, 예컨대, 자성 비드에 결합되고, DNA가 지지체에 결합되어 있는 동안 탈설폰화 및 세척이 일어난다. 이러한 구체예의 예가 예컨대, WO 2013/116375 및 미국 특허 제9,315,853호에서 제공된다. 특정 바람직한 구체예에서, 지지체-결합된 DNA는 탈설폰산 및 지지체 상에서의 세척 직후에 메틸화 분석을 위한 준비가 되어있다. 일부 구체예에서, 탈설폰화된 DNA는 분석 전에 지지체로부터 용리된다.

일부 구체예에서, 처리된 DNA의 단편을 본 발명에 따르는 프라이머 올리고뉴클레오티드의 세트(예컨대, 도 1 참조) 및 증폭 효소를 사용하여 증폭시킨다. 여러 DNA 분절의 증폭은 하나의 동일한 반응 용기 내에서 동시에 수행될 수 있다. 전형적으로, 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 수행된다.

이들 분석 기술에 적합한 DNA 분리 방법은 해당 분야에 공지되어 있다. 특히, 일부 구체예는 미국 특허 제9,000,146호 및 제9,163,278호에 개시된 바와 같이 핵산의 분리를 포함하며, 이들 각각은 그 전체가 참조로 여기에 수록된다.

일부 구체예에서, 여기에 개시된 마커는 대변 샘플에서 수행되는 QUARTS 분석에 사용된다. 일부 구체예에서, DNA 샘플을 제조하는 방법, 특히 작은 부피(예컨대, 100 마리크로리터 미만, 60 마이크로리터 미만)에서 고순도, 저-풍부 핵산을 포함하고, DNA 샘플을 시험하기 위하여 사용되는 분석(예컨대, PCR, 침입자(INVADER), QuARTS 분석, 등)을 방해하는 물질이 실질적으로 및/또는 유효하게 없는 DNA 샘플을 제조하는 방법이 제공된다. 이러한 DNA 샘플은 환자로부터 획득한 샘플에 존재하는 유전자, 유전자 변이체(예컨대, 대립유전자), 또는 유전자 변형(예컨대, 메틸화)의 활성, 발현, 또는 양의 존재를 정성적으로 검출하거나, 정량적으로 측정하는 진단 분석에서 사용된다. 예를 들면, 일부 암은 특정 돌연변이 대립유전자 또는 특정 메틸화 상태의 존재와 상호연관되며, 따라서 그러한 돌연변이 대립유전자 또는 메틸화 상태를 검출 및/또는 정량화하는 것은 암의 진단 및 치료에 예측적 가치를 갖는다.

많은 귀중한 유전자 마커는 샘플에서 극히 적은 양으로 존재하며 그러한 마커를 만드는 많은 사건은 드물다. 결과적으로, PCR과 같은 민감한 검출 방법조차도 분석의 검출 역치를 충족시키거나 대체하기에 충분한 양의 저-풍부 표적을 제공하기 위한 많은 양의 DNA를 요구한다. 더욱이, 심지어 적은 양의 억제 물질의 존재도 이러한 적은 양의 표적을 검출하는 이들 분석의 정확성 및 정밀도를 손상시킨다. 따라서, 그러한 DNA 샘플을 생산하기 위한 부피 및 농도의 필수적인 관리를 제공하는 방법이 여기에 제공된다.

일부 구체예에서, 샘플은 혈액, 혈청, 혈장 또는 타액을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 인간이다. 이러한 샘플은 통상의 기술자에게 자명한 바와 같이 해당 업계에 공지된 많은 수단에 의해 획득될 수 있다. 세포가 없는 또는 실질적으로 세포가 없는 샘플은 샘플을 비제한적으로 원심분리 및 여과를 포함하는 해당 업계의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 기술에 적용함으로써 수득될 수 있다. 일반적으로 샘플을 얻기 위해 침습적인 기술을 사용하지 않는 것이 바람직하지만, 조직 균질액, 조직 절편, 및 생검 표본과 같은 샘플을 얻는 것이 여전히 바람직할 수 있다. 이 기술은 샘플을 준비하는데 사용되는 방법에 국한되지 않으며 시험을 위한 핵산을 제공한다. 예를 들면, 일부 구체예에서, DNA는 예컨대 미국 특허 번호 제8,808,990호 및 제9,169,511호, 그리고 WO 2012/155072에 개시된 바와 같이, 직접 유전자 포획을 사용하거나 또는 관련 방법에 의해 대변 샘플 또는 혈액 또는 혈장 샘플로부터 분리된다.

마커 분석은 하나의 테스트 샘플 내에 추가 마커를 사용하여 별도로 또는 동시에 수행할 수 있다. 예를 들어, 여러 마커를 여러 샘플을 효율적으로 처리하고 잠재적으로 더 큰 진단 및/또는 예후 정확도를 제공하기 위해 하나의 테스트로 결합할 수 있다. 또한, 해당 분야의 통상의 기술자는 동일한 대상체로부터의 다수의 샘플을 테스팅하는 가치(예를 들면, 연속적인 시점에서)를 인식할 것이다. 이러한 일련의 시료에 대한 시험은 시간이 지남에 따라 마커 메틸화 상태의 변화를 확인할 수 있다. 메틸화 상태의 변화, 뿐만 아니라 메틸화 상태 변화의 부재는, 비제한적으로, 사건 발생으로부터의 대략적인 시간의 확인, 회수가능한 조직의 존재 및 양, 약물 요법의 적절성, 다양한 치료법의 효과, 및 미래 사건의 위험을 포함하여 대상체 결과의 확인을 포함하는, 질병 상태에 관한 유용한 정보를 제공할 수 있다.

바이오 마커의 분석은 다양한 물리적 형식으로 수행 될 수 있다. 예를 들면, 미세역가판의 사용 또는 자동화는 많은 수의 시험 샘플의 처리를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 그 대신에, 단일 샘플 형식이, 예를 들면, 외래 수송 또는 응급실 설정에서, 즉각적인 치료 및 적시의 진단을 촉진하기 위해 개발될 수 있다.

기술의 구체예가 키트의 형태로 제공되는 것으로 고려된다. 키트는 여기에 개시된 조성물, 장치, 기구 등의 구체예 및 키트 사용을 위한 설명서를 포함한다. 이러한 설명서는 예컨대 샘플 채취 및 샘플로부터 핵산을 제조하기 위하여, 샘플로부터 분석물을 준비하기 위한 적절한 방법을 기술한다. 키트의 각 성분들은 적절한 용기 또는 포장으로 포장되고(예컨대, 바이알, 상자, 블리스 터 팩, 앰플, 항아리(jars), 병, 튜브 등), 성분들은 편리한 저장, 운송, 및/또는 키트 사용자의 사용을 위항 적절한 용기(예컨대, 상자 또는 상자들)에 함께 포장된다. 액체 성분(예컨대, 완충액)이 사용자에 의해 재구성되도록 동결건조된 형태로 제공될 수 있는 것으로 이해된다. 키트는 키트의 성능을 평가, 검증, 및/또는 보증하기 위한 대조군 또는 기준을 포함할 수 있다. 예를 들면, 샘플에 존재하는 핵산의 양을 분석하기 위한 키트는 비교를 위한 동일 또는 다른 핵산의 공지된 농도를 포함하는 대조군, 일부 구체예에서, 예를 들어, 대조군 핵산에 특이적인 검출 시약(예컨대, 프라이머)을 포함할 수도 있다. 키트는 임상 환경에서 사용하기에 적합하고, 사용자의 가정에서 사용하기에 적합하다. 키트의 성분은, 일부 구체예에서, 샘플로부터 핵산 용액을 준비하기 위한 시스템의 기능을 제공한다. 일부 구체예에서, 시스템의 특정 성분이 사용자에 의해 제공된다.

III. 응용

일부 구체예에서, 진단 분석은 개체의 질병이나 질환의 존재를 확인한다. 일부 구체예에서, 질병은 암(예컨대, 폐암)이다. 일부 구체예에서, 비정상 메틸화가 폐암과 관련되는 마커(예컨대, 표 1에 나열된 마커로부터 선택되는 하나 이상의 마커, 또는 바람직하게는 BARX1 , LOC100129726 , SPOCK2 , TSC22D4 , MAX. chr8 .124, RASSF1, ZNF671 , ST8SIA1 , NKX6 _2, FAM59B , DIDO1 , MAX_ Chr1 .110, AGRN , SOBP , MAX_chr10.226, ZMIZ1 , MAX_ chr8 .145, MAX_ chr10 .225, PRDM14 , ANGPT1 , MAX.chr16.50, PTGDR _9, ANKRD13B , DOCK2 , MAX_ chr19 .163, ZNF132 , MAX chr19 .372, HOXA9, TRH , SP9, DMRTA2 , ARHGEF4 , CYP26C1 , ZNF781 , PTGDR , GRIN2D , MATK , BCAT1, PRKCB _28, ST8SIA _22, FLJ45983 , DLX4 , SHOX2, EMX1 , HOXB2 , MAX.chr12.526, BCL2L11 , OPLAH , PARP15 , KLHDC7B , SLC12A8 , , BHLHE23 , CAPN2 , FGF14, FLJ34208 , B3GALT6 , BIN2 _Z, DNMT3A , FERMT3 , NFIX , S1PR4 , SKI, SUCLG2 , TBX15, ZDHHC1 , 및 ZNF329 중 하나 이상)가 사용된다. 일부 구체예에서, 분석은 기준 유전자의 검출을 더욱 포함한다(예컨대, β-액틴, ZDHHC1 , B3GALT6 . 참조, 예컨대, 미국 특허 출원 제14/966,617호(2015.12.11.출원), 및 미국 특허 출원 제62/364,082호(2016.07.19.출원), 이들 각각은 모든 목적을 위하여 참조로 여기에 수록된다).

일부 구체예에서, 기술은 환자(예컨대, 폐암 환자, 초기 폐암 환자, 또는 폐암 발생 가능 환자)를 치료하는데 적용되며, 방법은 여기에 제공된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태를 결정하는 단계 및 상기 메틸화 상태를 결정한 결과에 기초하여 환자에게 치료를 적용하는 단계를 포함한다. 치료는 약학 화합물, 백신의 투여, 수술 수행, 환자의 영상처리, 또 다른 테스트 수행일 수 있다. 바람직하게는, 상기 용도는 임상적 선별 방법, 예후 평가 방법, 치료 결과를 모니터링하는 방법, 특정한 치료적 처리에 가장 반응할 가능성이 큰 환자를 확인하는 방법, 환자 또는 대상체를 영상처리하는 방법 , 및 약물 선별 및 개발을 위한 방법에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 대상체에서 폐암을 진단하는 방법에서 적용되는 기술이 제공된다. 용어 "진단하기" 및 "진단"은 여기서 사용되듯이 통상의 기술자가 대상체가 특정 질병 또는 질환으로 고통받고 있는지 또는 미래에 특정 질병 또는 질환을 앓을지 여부를 평가하고 심지어 결정할 수 있는 방법을 의미한다. 통상의 기술자는 예를 들면 바이오 마커와 같은 하나 이상의 진단 지표에 기초하여 진단을 하고, 그 메틸화 상태는 질환의 존재, 중증도 또는 부재를 나타낸다.

진단과 함께, 임상적 암 예후는 가장 효과적인 치료법을 계획하기 위해 암의 공격성과 종양 재발의 가능성을 결정하는 것과 관련이 있다. 더욱 정확한 예후가 이루어지거나 암 발병의 잠재적 위험조차도 평가할 수 있다면, 환자를 위하여 적절한 치료법, 경우에 따라 덜 심한 치료법을 선택할 수 있다. 암 바이오마커의 평가(예컨대, 메틸화 상태 평가하기)는, 예후가 우수하거나 및/또는 암 발생 위험이 낮아서 치료가 필요 없거나 제한적인 치료가 필요한 대상체를, 암 발생 가능성이 있거나 또는 암 재발을 겪어서 더욱 집중적인 치료가 이익이 되는 대상체와 분리시키는데 유용하다.

따라서, "진단하기" 또는 "진단하는 것"은, 여기에 사용되듯이, 여기에 개시된 진단 바이오마커의 측정에 기초하여, 암 발명의 위험을 결정하거나 임상적 결과(의학적 치료와 상관없이)를 예측하기 위해 제공할 수 있는 예후를 결정하는 것, 적절한 치료(또는 어떤 치료가 효과적인지 여부)를 선택하는 것, 또는 현재 치료 및 치료의 잠재적인 변화를 모니터링하는 것을 더욱 포함한다.

또한, 기술의 일부 구체예에서, 시간에 따라 바이오마커의 여러 번의 결정이 이루어져서 진단 및/또는 예후를 촉진할 수 있다. 바이오마커의 일시적 변화는 임상적 결과를 예측하고, 폐암의 진행을 모니터링하고, 및/또는 암에 대한 적절한 치료법의 효능을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 이러한 구체예에서 예를 들면, 효과적인 치료 과정 동안 시간 경과에 따라 생물학적 샘플에서 여기에 개시된 하나 이상의 바이오마커(및 모니터링되는 경우, 하나 이상의 추가적인 바이오마커) 의 메틸화 상태의 변화를 관찰하는 것이 예상될 수 있다.

기술은 대상체에서 암의 예방 또는 치료를 개시할지 또는 계속할지를 결정하는 방법에 또한 적용된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 시간의 경과에 따라 대상체로부터 일련의 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 상기 일련의 생물학적 샘플을 분석하여 각 생물학적 샘플에서 여기에 개시된 적어도 하나의 바이오마커의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및 각 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 바이오마커의 메틸화 상태의 측정가능한 변화를 비교하는 단계를 포함한다. 시간 경과에 따른 바이오마커의 메틸화 상태의 변화는 암 발병 위험성을 예측하고, 임상 결과를 예측하고, 암의 예방 또는 치료를 개시할지 또는 계속할지를 결정하고, 그리고 현재의 치료법이 효과적으로 암을 치료하는지 여부를 판단하는데 사용될 수있다. 예를 들면, 제1 시점은 치료의 개시 이전에 선택될 수 있고, 제2 시점은 치료의 개시 후 어느 시점에서 선택될 수 있다. 메틸화 상태는 상이한 시점으로부터 취한 각각의 샘플 및 언급된 정성적 및/또는 정량적 차이에서 측정될 수 있다. 상이한 샘플로부터의 바이오마커 수준의 메틸화 상태의 변화는 대상체에서 폐 발명 위험성, 예후, 치료 효능 결정, 및/또는 암의 진행과 상관관계가 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 초기 단계에서, 예를 들면, 질병의 증상이 나타나기 전에, 질병의 치료 또는 진단을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 임상 단계에서 질병의 치료 또는 진단을 위한 것이다.

전술한 바와 같이, 일부 구체예에서 하나 이상의 진단 또는 예후적 바이오마커의 다중 결정이 이루어질 수 있고, 마커의 일시적인 변화가 진단 또는 예후를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 진단 마커는 초기 시간에 결정될 수 있고, 다시 한번 두 번째 시간에 결정될 수 있다. 이러한 구체예에서, 초기 시간으로부터 두 번째 시간으로의 마커의 증가가 암의 특정 유형 또는 중증도, 또는 주어진 예후를 진단할 수 있다. 유사하게, 초기 시간으로부터 두 번째 시간으로의 마커의 감소가 암의 특정 유형 또는 중증도, 또는 주어진 예후를 나타낼 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 마커의 변화 정도는 암의 중증도 및 향후 부작용과 관련될 수 있다. 통상의 기술자는, 특정 구체예에서 여러 시점에서 동일 바이오마커를 비교 측정할 수 있지만, 주어진 바이오마커를 한 시점에서 측정할 수 있고, 두 번째 시점에서 두 번째 바이오마커를 측정할 수 있고, 이들 마커의 비교가 진단 정보를 제공할 수 있음을 이해할 것이다.

여기서 사용되듯이, 어구 "예후를 결정하는"이란 통상의 기술자가 대상체에서 질환의 경과 또는 결과를 예측할 수 있는 방법을 지칭한다. 용어 "예후"는 100 % 정확도로 질환의 경과 또는 결과를 예측하는 능력을 의미하지 않으며, 심지어 바이오마커의 메틸화 상태에 따라 주어진 경과 또는 결과가 예측 가능하게 다소 발생할 가능성이 높다는 것을 의미한다. 대신에, 통상의 기술자는 용어 "예후"가 특정 경과 또는 결과가 발생할 확률이 크다는 것을 지칭하며; 즉, 경과 또는 결과가 질환을 나타내지 않는 개체와 비교할 때, 주어진 질환을 나타내는 대상체에서 발생할 가능성이 더 크다는 것을 지칭하는 것으로 이해할 것이다. 예를 들면, 질환을 나타내지 않는 대상체에서, 주어진 결과의 기회(예컨대, 폐암으로 고통받는)는 매우 낮을 것이다.

일부 구체예에서, 통계 분석은 예후 지표와 불리한 결과에 대한 경향을 연관시킨다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 암이 없는 환자로부터 획득된 정상 대조군 샘플의 것과 상이한 메틸화 상태는 통계적 유의 수준으로 결정되듯이, 대조군 샘플의 메틸화 상태와 더욱 유사한 수준의 대상체보다 대상제가 암을 앓을 가능성이 더 크다는 신호일 수 있다. 또한, 기준 수준으로부터의 메틸화 상태의 변화는 대상체 예후의 반영일 수 있으며, 메틸화 상태의 변화 정도는 부작용의 심각도와 관련될 수 있다. 통계적 유의성은 종종 두 개 이상의 개체군을 비교하고 신뢰 구간 및/또는 p 값을 결정하여 결정된다. 참조, 예컨대, Dowdy 및 Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983, 그 전체가 여기에 참조로 수록됨. 본 발명의 특허대상의 예시적인 신뢰 구간은 90%, 95%, 97.5%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 및 99.99%이며, 한편 예시적인 p 값은 0.1, 0.05, 0.025, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 및 0.0001이다.

또 다른 구체예에서, 여기에 개시된 예후 또는 진단용 바이오마커의 메틸화 상태의 임계 변화 정도가 확립될 수 있고, 생물학적 샘플에서의 바이오마커의 메틸화 상태의 변화 정도는 단순히 메틸화 상태의 임계 변화 정도와 비교된다. 여기에 제시된 바이오마커에 대한 메틸화 상태의 바람직한 임계 변화는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 50%, 약 75%, 약 100%, 및 약 150%이다. 또 다른 구체예에서, "노모그램"이 달성될 수 있는데, 이에 의해 예후 또는 진단 지표(바이오마커 또는 바이오마커의 조합)의 메틸화 상태가 주어진 결과에 대한 관련 처분과 직접 관련된다. 통상의 기술자는 이러한 측정의 불확실도가 마커 농도의 불확실도와 동일하다는 것을 이해하면서 두 개의 수치 값을 관련시키는 노모그램의 사용에 대해 알고있는데, 왜냐하면 개체군 평균이 아니라 개별 샘플 측정이 참조되기 때문이다.

일부 구체예에서, 대조군 샘플을 생물학적 샘플과 동시에 분석하여, 생물학적 샘플로부터 수득된 결과를 대조군 샘플로부터 수득된 결과와 비교할 수 있다. 또한, 생물학적 샘플에 대한 분석 결과가 비교될 수 있는 표준 곡선이 제공될 수 있다는 것이 고려된다. 이러한 표준 곡선은, 분석 단위, 예컨대 형광 표지가 사용되는 경우, 형광 신호 강도의 함수로서 바이오 마커의 메틸화 상태를 나타낸다. 여러 공여자로부터 채취한 샘플을 사용하여, 정상 조직에서의 하나 이상의 바이오마커의 대조군 메틸화 상태뿐만 아니라, 폐암이 있는 공여자로부터 채취한 조직에서의 하나 이상의 바이오마커의 "위험 수준"에 대한 표준 곡선이 제공될 수 있다.

일부 구체예에서, 대조군 메틸화 상태와 비교할 때, 샘플 중의 적어도 하나의 바이오마커의 메틸화 상태에 측정가능한 차이가 있다면, 대상체는 폐암을 갖는 것으로 진단된다. 반대로, 메틸화 상태의 변화가 생물학적 샘플에서 확인되지 않으면, 폐암이 없거나, 암의 위험이 없거나, 암 위험이 낮은 것으로 확인될 수 있다. 이와 관련하여, 폐암 또는 그 위험을 갖는 대상체는 실질적으로 암이 없거나 또는 그 위험이 적은 대상체와 구별될 수 있다. 폐암을 발병할 위험이 있는 대상체는 더욱 집중적인 및/또는 정기적인 선별검사 일정에 배치될 수 있다. 반면, 실질적으로 위험이 없는 대상체는, 미래 선별검사, 예를 들면, 본 기술에 따라 실시되는 선별검사가 대상체에서 폐암의 위험이 있음을 나타낼 때까지 선별검사를 받지 않을 수 있다.

상기 기술한 바와 같이, 본 기술의 방법의 구체예에 따라, 하나 이상의 바이오마커의 메틸화 상태의 변화를 검출하는 것은 정성적 결정일 수 있거나 또는 정량적 결정일 수 있다. 이와 같이, 폐암이 있거나 폐렴이 발생할 위험이 있는 것으로 대상체를 진단하는 단계는, 특정 임계치 측정이 이루어짐을 나타내며, 예컨대, 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 바이오마커의 메틸화 상태가 소정의 대조군 메틸화 상태와 다르다는 것을 나타낸다. 방법의 일부 구체예에서, 대조군 메틸화 상태는 바이오마커의 임의의 측정가능한 메틸화 상태이다. 대조군 샘플이 생물학적 샘플과 동시에 테스트되는 방법의 또 다른 구체예에서, 소정의 메틸화 상태는 대조군 샘플에서의 메틸화 상태이다. 방법의 또 다른 구쳬예에서, 소정의 메틸화 상태는 표준 곡선에 기초하고 및/또는 표준 곡선에 의해 식별된다. 방법의 또 다른 구체예에서, 소정의 메틸화 상태는 특정 상태 또는 상태의 범위이다. 이와 같이, 소정의 메틸화 상태는 실시되는 방법의 구체예 및 원하는 특이성 등에 부분적으로 기초하여, 해당 분야의 통상의 기술자에게 명백할 수 있고, 허용가능한 한계 내에서 선택될 수 있다.

일부 구체예에서, 폐암이 있거나 있는 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플이 1종 이상의 메틸화 마커 및 폐암, 예컨대, 비-소세포(선암, 대세포암종, 편평 세포 암종) 및 소세포암종의 상이한 유형들을 구별하는 데이터를 제공하는 적절한 분석 방법을 사용하여 선별된다. 참조, 예컨대, 마커 참조 번호(ref. #) AC27 (도 2; PLEC), 이는 선암 및 소세포암종에서 고도로 메틸화되나(정상 버피 코트의 해당 유전자자리에서 평균 메틸화와 비교하여 평균 메틸화로 제시됨), 대세포 또는 편평 세포 암종에서는 그렇지 않음; 마커 참조 번호(ref. #) AC23 (도 2; ITPRIPL1), 이는 그 밖의 다른 샘플 유형에서보다 선암에서 더욱 고도로 메틸화됨; 마커 참조 번호(ref. #) LC2 (도 3; DOCK2)), 이는 그 밖의 다른 샘플 유형에서보다 대세포암종에서 더욱 고도로 메틸화됨; 마커 ref # SC221 (도 4; ST8SIA4), 이는 그 밖의 다른 샘플 유형에서보다 소세포암종에서 더욱 고도로 메틸화됨; 및 마커 참조 번호(ref. #) SQ36 (도 5, DOK1), 이는 그 밖의 다른 샘플 유형에서보다 편평 세포 암종에서 더욱 고도로 메틸화됨.

여기에 개시된 바와 같이 선택된 메틸화 마커가 단독으로 또는 조합으로(예컨대, 패널에서) 사용되어 그 결과 대상체의 샘플 분석이 폐 신생물의 존재를 제시할 수 있으며 또한 폐암 유형, 예컨대, 소세포암종 대 비-소세포암종을 구별할 수 있는 충분한 정보를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 마커 또는 마커의 조합은 또한 선종, 대세포암종, 및 편평 세포 암종을 구별하고; 및/또는 미확인되거나 또는 혼합된 질환의 암종을 특징짓기에 충분한 데이터를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 메틸화 마커 또는 이들의 조합은, 데이터를 차별화하지 않고, 존재하는 폐암의 유형에 관계없이 양성 결과(즉, 폐 신생물의 존재를 나타내는 결과)를 제공하도록 선택된다.

최근 몇 년 동안, 전이성 종양 세포를 나타내는 순환 상피 세포가 암이 있는 많은 환자의 혈액에서 검출될 수 있다는 것이 명백해졌다. 희소 세포의 분자 프로파일링은 생물학적 및 임상적 연구에서 중요하다. 응용분야는 질병 예후 및 맞춤 치료를 위해 암 환자의 말초 혈액에서 순환 상피 세포 (CEpCs)의 특성화에서 다양하다(참조 예컨대, Cristofanilli M, et al. (2004) N Engl J Med 351:781-791; Hayes DF, et al. (2006) Clin Cancer Res 12:4218-4224; Budd GT, et al., (2006) Clin Cancer Res 12:6403-6409; Moreno JG, et al. (2005) Urology 65:713-718; Pantel et al., (2008) Nat Rev 8:329-340; 및 Cohen SJ, et al. (2008) J Clin Oncol 26:3213-3221). 따라서, 본 문헌의 구체예는 혈장 또는 전혈에서 메틸화된 마커의 존재를 확인함으로써 대상체에서 전이 암의 존재를 검출하는 조성물 및 방법을 제공한다.

실험 실시예

실시예 1

샘플 준비 방법

DNA 분리 및 QUARTS 분석을 위한 방법

다음은 분석 전에 DNA 분리를 위한 예시적인 방법, 및 본 기술의 구체예에 따라 사용될 수 있는 예시적인 QUARTS 분석을 제공한다. 혈액 및 다양한 조직 샘플에서 DNA에 QuARTS 기술을 적용하는 방법에 대해서 본 실시예에서 설명되지만, 이 기술은 다른 실시예에서 제시되는 바와 같이, 또 다른 핵산 샘플에도 쉽게 적용될 수 있다.

세포와 혈장으로부터 DNA 분리

세포주의 경우, 게놈 DNA는 예를 들면 "Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit (Promega Corp., Madison, WI)"를 사용하여 세포 조절 배지에서 분리될 수 있다. 키트 프로토콜에 따라, 1 mL의 세포 조절 배지(cell conditioned media, CCM)를 혈장 대신 사용하고, 키트 절차에 따라 처리한다. 용리 부피는 100 μL이고, 이 중 70 μL를 일반적으로 바이설파이트 전환에 사용한다.

4 mL의 혈장 샘플로부터 DNA를 분리하기 위한 예시적인 절차는 다음과 같다:

● 4 mL 혈장 샘플에, 300 μL의 단백질분해효소 K(20mg/mL)를 첨가하고 혼합한다.

● 1 μg/μL의 피쉬(Fish) DNA 3 μL를 상기 혈장-단백질분해효소 K 혼합물에 첨가한다.

● 2 mL의 혈장 용해 완충액을 혈장에 첨가한다.

혈장 용해 완충액은 다음과 같다:

- 4.3M 구아니딘 티오시아네이트

- 10% IGEPAL CA-630 (옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시)에탄올, 측쇄)

(45 mL의 4.8 M 구아니딘 티오시아네이트와 혼합된 5.3g의 IGEPAL CA-630)

● 혼합물을 500 rpm에서 흔들면서 55℃에서 1 시간 동안 배양한다.

● 3 mL의 혈장 용해 완충액 및 혼합물을 첨가한다.

● 200 μL 자석 실리카 결합 비드(16 μg의 비드/μL} 및 혼합물을 다시 첨가한다.

● 2 mL의 100% 이소프로판올 및 혼합물을 첨가한다.

● 500 rpm에서 흔들면서 30℃에서 30 분 동안 배양한다.

● 튜브를 자석 위에 놓고 비드가 모이도록 한다. 흡입하고 상청액을 버린다.

● 750μL GuHCl-EtOH를 결합 비드 및 혼합물을 함유하는 용기에 첨가한다.

GuHCl-EtOH 세척 완충액은 다음과 같다:

- 3M GuHCl (구아니딘 하이드로클로라이드)

- 57% EtOH (에틸 알코올)

● 400 rpm에서 1 분 동안 흔든다.

● 샘플을 딥 웰 플레이트 또는 2 mL 미세원심분리 튜브로 옮긴다.

● 튜브를 자석 위에 놓고 10 분 동안 비드가 모이도록 한다. 흡입하고 상청액을 버린다.

● 1000 μL 세척 완충액(10 mM Tris HCl, 80% EtOH)을 비드에 첨가하고, 흔들면서 30℃에서 3 분 동안 배양한다.

● 500 μL 세척 완충액을 비드에 첨가하고, 흔들면서 30℃에서 3 분 동안 배양한다.

● 250 μL 세척 완충액을 첨가하고 흔들면서 30℃에서 3 분 동안 배양한다.

● 튜브를 자석 위에 놓고 비드가 모이도록 한다. 흡입하고 남아 있는 완충액을 버린다.

● 흔들면서 70℃에서 15 분 동안 비드를 건조시킨다.

● 125 μL 용리 완충액(10 mM Tris HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA)을 비드에 첨가하고 흔들면서 65℃에서 25 분 동안 배양한다.

● 튜브를 자석 위에 놓고 10 분 동안 비드가 모이도록 한다.

● 흡입하고 DNA를 함유하는 상청액을 새로운 용기 또는 튜브에 옮긴다.

바이설파이트 전환

I. 암모늄 하이드로젠 설파이트를 사용하는 DNA의 설폰화

1. 각각의 튜브에, 64 μL DNA, 7 μL 1 N NaOH, 및 0.2 mg/mL BSA와 0.25 mg/mL의 피쉬 DNA를 함유하는 9 μL의 담체 용액을 혼합한다.

2. 42℃에서 20 분 동안 배양한다.

3. 120 μL의 45% 암모늄 하이드로젠 설파이트를 첨가하고 66℃에서 75 분 동안 배양한다.

4. 4℃에서 10 분 동안 배양한다.

II. 자석 비드를 이용하는 탈설폰화

재료

● 자석 비드(프로메가 마그네실 파라마그네틱 파티클(Promega MagneSil Paramagnetic Particles), 프로메가(Promega) 카탈로그 번호 AS1050, 16 μg/μL).

● 결합 완충액: 6.5-7 M 구아니딘 하이드로클로라이드.

● 전환-후 세척 완충액: 10 mM Tris HCl이 있는 80% 에탄올 (pH 8.0).

● 탈설폰화 완충액: 70% 이소프로필 알코올, 0.1 N NaOH가 탈설폰화 완충액에 대하여 선택되었음.

샘플을 실질적으로 아래에 설명된 바와 같은 온도와 혼합 속도에서 샘플을 혼합하거나 배양하기 위한 임의의 적절한 장치 또는 기술을 사용하여 혼합시킨다. 예를 들면, 써모믹서(Thermomixer)(에펜도르프(Eppendorf))가 샘플을 혼합하거나 배양하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 탈설폰화는 다음과 같다:

1. 비드 스톡을 보텍싱 보틀(vortexing bottle)을 사용하여 1 분 동안 완전히 혼합한다.

2. 50 μL의 비드를 분취하여 2.0 mL에 넣는다(예컨대, USA 사이언티픽(Scientific)으로부터 구입).

3. 750 μL의 결합 완충액을 비드에 첨가한다.

4. 단계 I로부터 얻은 150 μL의 설폰화된 DNA를 첨가한다.

5. 혼합한다(예컨대, 1000 RPM으로 30℃에서 30 분 동안).

6. 튜브를 자석 스탠드 위에 놓고 5 분 동안 그대로 둔다. 스탠드 위에 튜브를 그대로 두고, 상청액을 제거하여 버린다.

7. 1,000 μL의 세척 완충액을 첨가한다. 혼합한다(예컨대, 1000 RPM으로 3℃에서 30 분 동안).

8. 튜브를 자석 스탠드 위에 놓고 5 분 동안 그대로 둔다. 스탠드 위에 튜브를 그대로 두고, 상청액을 제거하여 버린다.

9. 250 μL의 세척 완충액을 첨가한다. 혼합한다(예컨대, 1000 RPM으로 3℃에서 30 분 동안).

10. 자석 랙 위에 튜브를 놓고, 1 분 후에 상청액을 제거하여 버린다.

11. 200 μL의 탈설폰화 완충액을 첨가한다. 혼합한다(예컨대, 1000 RPM으로 5℃에서 30 분 동안).

12. 자석 랙 위에 튜브를 놓고, 1 분 후에 상청액을 제거하여 버린다.

13. 250 μL의 세척 완충액을 첨가한다. 혼합한다(예컨대, 1000 RPM으로 3℃에서 30 분 동안).

14. 자석 랙 위에 튜브를 놓고, 1 분 후에 상청액을 제거하여 버린다.

15. 250 μL의 세척 완충액을 튜브에 첨가한다. 혼합한다(예컨대, 1000 RPM으로 3℃에서 30 분 동안).

16. 자석 랙 위에 튜브를 놓고, 1 분 후에 상청액을 제거하여 버린다.

17. 모든 튜브를 30℃에서 뚜껑을 열고 15 분 동안 배양한다.

18. 튜브를 자석 랙으로부터 제거하고 70 μL의 용리 완충액을 비드에 직접 첨가한다.

19. 용리 완충액으로 비드를 배양한다(예컨대, 1000 RPM으로 40℃에서 45 분 동안).

20. 튜브를 자석 랙 위에 약 1 분 동안 놓고; 상청액을 제거하여 보관한다.

전환된 DNA가 그 후 검출 분석, 예컨대, 아래에 설명된 바와 같이, 사전-증폭 및/또는 플랩 엔도뉴클레아제 분석에 사용된다.

또한 참조 미국 특허 출원 번호 제62/249,097호(2015.10.30. 출원); 제15/335,111호 및 제15/335,096호(둘 모두 2016.10.26. 출원); 및 국제 출원 번호 제PCT/US16/58875호(2016.10.26. 출원), 이들 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참조로 여기에 수록된다.

QuARTS 분석

QuARTS 기술은 중합효소-기반 표적 DNA 증폭 과정과 침습성 절단-기반 신호 증폭 과정을 결합한다. 이 기술은 예컨대 미국 특허 제8,361,720호; 제8,715,937호; 제8,916,344호; 및 제9,212,392호에 기술되며, 이들 각각은 여기서 그 전체가 위하여 참조로 수록된다. QuARTS 반응에 의해 생성된 형광 신호는 실시간 PCR과 유사한 방식으로 모니터링되며 샘플에서 표적 핵산의 양을 정량할 수 있다.

예시적인 QuARTS 반응은 전형적으로, 대략 400-600 nmol/L(예컨대, 500 nmol/L)의 각각의 프라이머 및 검출 프로브, 대략 100 nmol/L의 침습성 올리고뉴클레오티드, 대략 600-700 nmol/L의 각각의 FRET 카세트(예컨대 Hologic, Inc.에 의해 상업적으로 공급되는 FAM; 예컨대 BioSearch Technologies에 의해 상업적으로 공급되는 HEX; 및 예컨대 BioSearch Technologies에 의해 상업적으로 공급되는 Quasar 670), 6.675 ng/μL FEN-1 엔도뉴클레아제(예컨대, Cleavase® 2.0, Hologic, Inc.), 30 μL 반응 부피 중의 1 유닛 Taq DNA 중합효소(예컨대, GoTaq® DNA 중합효소, Promega Corp., Madison ,WI), 10 mmol/L 3-(n-모폴리노) 프로판설폰산(MOPS), 7.5 mmol/L MgCl₂, 및 250 μmol/L의 각각의 dNTP를 포함한다. 예시적인 QuARTS 싸이클링 조건은 아래 표에 제시되는 바와 같다. 일부 응용예에서, 정량 싸이클(C_q)의 분석은 샘플 중의 표적 DNA 가닥(예컨대, 사본 수)의 초기 수의 척도를 제공한다.

대용량 바이설파이트 -전환된 DNA의 멀티플렉스 표적 사전-증폭

입력 샘플의 바이설파이트-처리된 DNA의 대부분 또는 전부를 사전-증폭하기 위해, 대용량의 처리된 DNA를 단일, 대용량 멀티플렉스 증폭 반응에 사용될 수 있다. 예를 들면, DNA는, 예를 들면 전술한 바와 같이 맥스웰 프로메가(Maxwell Promega) 혈액 키트 # AS1400을 사용하여, 세포주(예컨대, DFCI032 세포주 (선암); H1755 세포주(신경내분비)로부터 추출된다. DNA는 전술한 바와 같이 바이설파이트 전환된다.

사전-증폭은, 예를 들면, 7.5 mM MgCl₂, 10 mM MOPS, 0.3 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.8 mM KCl, 0.1 μg/μL BSA, 0.0001% Tween-20, 0. 0001% IGEPAL CA-630, 250 μM 각각의 dNTP, 올리고뉴클레오티드 프라이머, (예컨대, 12개 표적, 12개 프라이머 쌍/24개 프라이머에 대해, 등몰량으로(비제한적으로 예컨대, 200-500 nM 범위의 각각의 프라이머를 포함), 또는 상이한 표적 영역의 증폭 효율성을 균형잡기 위해 조정된 개별 프라이머 농도로), 0.025 유닛/μL HotStart GoTaq 농도, 및 20 내지 50 부피%의 바이설파이트-처리된 표적 DNA(예컨대, 50 μL 반응 혼합물의 10 μL의 표적 DNA, 또는 125 μL 반응 혼합물의 50 μL의 표적 DNA)를 함유하는 반응 혼합물에서 수행된다. 열 싸이클링 시간 및 온도는 반응 및 증폭 용기의 부피에 적합하도록 선택된다. 예를 들면, 반응은 다음과 같이 순환될 수 있다:

열 싸이클링 이후, 사전-증폭 반응의 분취량(예컨대, 10 μL)을 피쉬 DNA가 있거나 또는 없이, 10 mM Tris, 0.1 mM EDTA에서 500 μL로 희석한다. 희석된 사전-증폭된 DNA의 분취량(예컨대, 10 μL)을 예컨대 전술한 바와 같이 QuARTS PCR-플랩 분석에서 사용한다. 또한 참조 미국 특허 출원 번호 제62/249,097호(2015.10.30. 출원); 출원 번호 제15/335,096호(2016.10.26. 출원), 및 제PCT/US16/58875호(2016.10.26. 출원), 이들 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참조로 여기에 수록된다.

실시예 2

메틸화 마커의 선택 및 시험

마커 선택 공정:

감소된 표현 바이설파이트 시퀀싱(Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS) 데이터를 16개 선암 폐암, 11개 대세포 폐암, 14개 소세포 폐암, 24개 편형 세포 폐암, 및 18개 비-암 폐의 조직에서 획득하였을 뿐만 아니라 버피 코트 샘플의 RRBS 결과를 26명의 건강한 환자로부터 얻었다.

인간 게놈 서열의 바이설파이트-전환된 형태로 정렬한 후에, 각각의 CpG 섬에서의 평균 메틸화를 각각의 샘플 유형(즉, 조직 또는 버피 코트)에 대해 계산하고, 마커 영역을 하래 기준에 따라 선택하였다:

● 영역은 50개 이상의 염기 쌍이 되도록 선택되었다.

● QuARTS 플랩 분석 설계를 위하여, 영역은 a) 프로브 영역, b) 포워드 프라이머 결합 영역, 및 c) 리버스 프라이머 결합 영역의 각각에서 최소 1개의 메틸화된 CpG를 갖도록 선택되었다. 포워드 및 리버스 프라이머에 대하여, 메틸화된 CpG가 프라이머의 3'-말단에 가깝지만, 3' 종결 뉴클레오티드는 아닌 것이 바람직하다. 예시적인 플랩 엔도뉴클레아제 분석 올리고뉴클레오티드가 도 1에 제시된다.

● 바람직하게는, 관심 영역의 임의의 CpG에서의 버피 코트 메틸화는 > 0.5% 보다 크지 않다.

● 바람직하게는, 관심 영역의 암 조직 메틸화는 > 10%이다.

● 조직 분석을 위하여 설계된 분석에서, 관심 영역의 정상 조직 메틸화는 바람직하게는 <0.5%이다.

상이한 폐암 조직 유형에 대한 RRBS 데이터가 도 2-5에 제시된다. 위의 기준에 따라, 도 1에 도시된 바와 같이, 아래 표에 나타낸 마커가 선택되고 QuARTS 플랩 분석이 그들을 위해 설계되었다.

버피 코트와의 교차 반응을 위해 선택된 마커 분석하기.

1) 버피 코트 선별

전술한 목록의 마커를 건강한 환자의 혈액 10 mL에서 얻은 버피 코트에서 추출한 DNA에서 선별하였다. DNA를 프로메가 맥스웰 RSC 시스템(Promega Maxwell RSC system)(Promega Corp., Fitchburg, WI)을 사용하여 추출하고 지모 EZ DNA 메틸화(Zymo EZ DNA Methylation™) 키트(Zymo Research, Irvine, CA)를 사용하여 전환시켰다. 바이설파이트-전환된 β-액틴 DNA("BTACT")와의 바이플렉스 반응을 이용하고, 대략 40,000개 가닥의 표적 게놈 DNA를 사용하여, 샘플을 전술한 바와 같은 QuARTS 플랩 엔도뉴클레아제 분석을 사용하여 시험해서 교차 반응성을 시험하였다. 그렇게 함으로써, 3개의 마커에 대한 분석은 중요한 교차 반응성을 보였다:

2) 조직 선별

264개 조직 샘플을 아래 표 2에 제시한 바와 같이, 여러 상업적 및 비-상업적 공급원으로부터 수득하였다(Asuragen, BioServe, ConversantBio, Cureline, Mayo Clinic, M D Anderson, 및 PrecisionMed).

조직 절편은 조직 병리학자에 의해 검사되었으며, 조직병리학적으로 뚜렷한 병변을 감싸서 마이크로-절개를 지시했다. 총 핵산 추출은 프로메가 맥스웰 RCS 시스템(Promega Maxwell RSC system)을 사용하여 수행하였다. 포르말린-고정, 파라핀-내장(FFPE) 슬라이드를 긁어낸 후 Maxwell® RSC DNA FFPE 키트(#AS1450)를 사용하여 RNase 처리 단계를 건너 뛰고 제조사의 절차를 사용하여 DNA를 추출하였다. 동일한 절차가 FFPE 컬(FFPE curl)에 사용되었다. 냉동 펀치 생검 샘플의 경우, 맥스웰 RSC 블러드 DNA 키트(Maxwell® RSC Blood DNA kit)(#AS1400)가 포함된 RSC DNA FFPE 키트의 용해 완충액을 사용하는 수정된 절차를 RNase 단계를 생략하고 사용하였다. 샘플을 10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 8.5에서 용리시키고 10 uL를 사용하여 6개 멀티플렉스 PCR 반응을 설정하였다.

아래 멀티플렉스 PCR 프라이머 혼합물을 10X 농도(10X=2 μM 각 프라이머)에서 만들었다:

● 아래 마커들 각각으로 구성된 멀티플렉스 PCR 반응 1: BARX1, LOC100129726, SPOCK2, TSC22D4, PARP15, MAX.chr8.145105646-145105653, ST8SIA1_22, ZDHHC1, BIN2_Z, SKI, DNMT3A, BCL2L11, RASSF1, FERMT3, 및 BTACT.

● 아래 마커들 각각으로 구성된 멀티플렉스 PCR 반응 2: ZNF671, ST8SIA1, NKX6-2, SLC12A8, FAM59B, DIDO1, MAX_Chr1.110, AGRN, PRKCB_28, SOBP, 및 BTACT.

● 아래 마커들 각각으로 구성된 멀티플렉스 PCR 반응 3: MAX.chr10.22624430-22624544, ZMIZ1, MAX.chr8.145105646-145105653, MAX.chr10.22541891-22541946, PRDM14, ANGPT1, MAX.chr16.50875223-50875241, PTGDR_9, ANKRD13B, DOCK2, 및 BTACT.

● 아래 마커들 각각으로 구성된 멀티플렉스 PCR 반응 4: MAX.chr19.16394489-16394575, HOXB2, ZNF132, MAX.chr19.37288426-37288480, MAX.chr12.52652268-52652362, FLJ45983, HOXA9, TRH, SP9, DMRTA2, 및 BTACT.

● 아래 마커들 각각으로 구성된 멀티플렉스 PCR 반응 5: EMX1, ARHGEF4, OPLAH, CYP26C1, ZNF781, DLX4, PTGDR, KLHDC7B, GRIN2D, chr17_737, 및 BTACT.

● 아래 마커들 각각으로 구성된 멀티플렉스 PCR 반응 6: TBX15, MATK, SHOX2, BCAT1, SUCLG2, BIN2, PRKAR1B, SHROOM1, S1PR4, NFIX, 및 BTACT.

각각의 멀티플렉스 PCR 반응은 0.2μM 반응 완충액, 0.2μM 각 프라이머, 0.05μM 핫스타트 고(Hotstart Go) Taq(5U/μL)의 최종 농도로 설정되었으며, 50μL의 최종 반응 부피를 위하여 10μL의 DNA 주형과 혼합된 40 μL의 마스터 혼합물을 산출하였다.

멀티플렉스 PCR에 대한 열 프로파일은 5 분 동안 95°의 사전-배양 단계, 95°에서 30 초 동안, 64°에서 30 초 동안, 72°에서 30 초 동안의 10회 증폭 싸이클, 및 추가 과정까지 유지된 4°의 냉각 단계를 수반하였다. 일단 멀티플렉스 PCR이 완료되면, PCR 생성물을 20ng/μL의 피쉬 DNA 희석액(예컨대, 물 또는 완충액에서, 참조로 여기에 수록된 미국 특허 제9,212,392호 참조)을 사용하여 1:10으로 희석하고 10μL의 희석된 증폭 샘플을 각 QuARTS 분석 반응에 사용하였다.

각각의 QuARTS 분석은 2개의 메틸화 마커와 기준 유전자로서 BTACT로 구성된 삼중가닥 형태로 구성되었다.

● 멀티플렉스 PCR 생성물 1로부터, 아래 7개 삼중가닥 QuARTS 분석을 수행하였다: (1) BARX1, LOC100129726, BTACT; (2) SPOCK2, TSC22D4, BTACT; (3) PARP15, MAXchr8145105646-145105653, BTACT; (4) ST8SIA1_22, ZDHHC1, BTACT; (5) BIN2_Z, SKI, BTACT; (6) DNMT3A, BCL2L11, BTACT; (7) RASSF1, FERMT3, 및 BTACT.

● 멀티플렉스 PCR 생성물 2로부터, 아래 5개 삼중가닥 QuARTS 분석을 수행하였다: (1) ZNF671, ST8SIA1, BTACT; (2) NKX6-2, SLC12A8, BTACT; (3) FAM59B, DIDO1, BTACT; (4) MAX_Chr1110, AGRN, BTACT; (5) PRKCB_28, SOBP, 및 BTACT.

● 멀티플렉스 PCR 생성물 3으로부터, 아래 5개 삼중가닥 QuARTS 분석을 수행하였다: (1) MAXchr1022624430-22624544, ZMIZ1, BTACT; (2) MAXchr8145105646-145105653, MAXchr1022541891-22541946, BTACT; (3) PRDM14, ANGPT1, BTACT; (4) MAXchr1650875223-50875241, PTGDR_9, BTACT; (5) ANKRD13B, DOCK2, 및 BTACT.

● 멀티플렉스 PCR 생성물 4로부터, 아래 5개 삼중가닥 QuARTS 분석을 수행하였다: (1) MAXchr1916394489-16394575, HOXB2, BTACT; (2) ZNF132, MAXchr1937288426-37288480, BTACT; (3) MAXchr1252652268-52652362, FLJ45983, BTACT; (4) HOXA9, TRH, BTACT; (5) SP9, DMRTA2, 및 BTACT.

● 멀티플렉스 PCR 생성물 5로부터, 아래 5개 삼중가닥 QuARTS 분석을 수행하였다: (1) EMX1, ARHGEF4, BTACT; (2) OPLAH, CYP26C1, BTACT; (3) ZNF781, DLX4, BTACT; (4) PTGDR, KLHDC7B, BTACT; (5) GRIN2D, chr17_737, 및 BTACT.

● 멀티플렉스 PCR 생성물 6으로부터, 아래 5개 삼중가닥 QuARTS 분석을 수행하였다: (1) TBX15, MATK, BTACT; (2) SHOX2, BCAT1, BTACT; (3) SUCLG2, BIN2, BTACT; (4) PRKAR1B, SHROOM1, BTACT; (5) S1PR4, NFIX, 및 BTACT.

3) 데이터 분석:

조직 데이터 분석을 위해, 정상 조직에서 <0.5% 메틸화 및 암 조직에서 >10% 메틸화를 갖는 RRBS 기준에 따라 선택된 마커가 포함되었다. 이는 추가 분석을 위하여 51개 마커를 산출하였다.

마커 민감도를 결정하기 위해, 다음을 수행하였다:

1. 각각의 마커에 대한 % 메틸화를 특정 마커에 대하여 획득된 가닥 값을 ACTB(β-액틴)의 가닥 값으로 나누어서 계산하였다.

2. 각각의 마커에 대한 최대 %메틸화를 정상 조직에서 결정하였다. 이는 100% 특이성으로 정의된다.

3. 각 마커에 대한 암 조직 양성은 그 마커에 대한 최대 정상 조직 % 메틸화보다 큰 암 조직의 수로 결정되었다.

51개 마커에 대한 민감도가 아래에 제시된다.

마커의 조합이 특이성 및 민감도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 8개 마커, SLC12A8 , KLHDC7B , PARP15 , OPLAH , BCL2L11 , MAX. chr12 .526, HOXB2, 및 EMX1의 조합은 시험된 모든 암 조직에 대해 98.5% 민감도(134/136 암), 및 100% 특이성을 나타냈다.

일부 구체예에서, 예컨대, 특정 암 유형 또는 유형의 조합에 대하여 민감도 및 특이성을 나타내는 마커를 사용하여, 특정 유형의 폐암 조직, 예컨대, 선암, 대세포암종, 편평 세포 암종, 또는 소세포암종과 관련된 민감하고 특이적인 검출을 위하여 마커들이 선택된다.

조직에서 분석된 메틸화된 DNA 마커의 이러한 패널은 정상 폐 조직 및 양성 결절에서 음성으로 남아있는 동안 모든 유형의 폐암에 대해 극히 높은 판별을 달성한다. 이러한 마커들의 패널에 대한 분석은 혈액 또는 체액-기반 검사에 또한 적용될 수 있으며, 예컨대 폐암 선별 및 양성 결절로부터 악성종양의 식별에 적용될 수 있다.

실시예 3

혈장 샘플에 대하여 30개- 마커 세트의 시험

실시예 2의 마커 목록으로부터, 30개 마커를 295명의 대상체(64명의 폐암, 231명의 정상 대조군)의 혈장 샘플에서 얻은 DNA를 시험하는데 사용하기 위해 선택하였다. DNA를 각 대상체의 2 mL의 혈장으로부터 추출하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 바이설파이트로 처리했다. 바이설파이트-전환된 DNA의 분취량을 실시예 1에 기재된 바와 같이 2개의 멀티플렉스 QuARTS 분석에서 사용하였다. 분석을 위하여 선택된 마커는 다음과 같다:

1. BARX1

2. BCL2L11

3. BIN2_Z

4. CYP26C1

5. DLX4

6. DMRTA2

7. DNMT3A

8. EMX1

9. FERMT3

10. FLJ45983

11. HOXA9

12. KLHDC7B

13. MAX.chr10.22624430-22624544

14. MAX.chr12.52652268-52652362

15. MAX.chr8.124173236-124173370

16. MAX.chr8.145105646-145105653

17. NFIX

18. OPLAH

19. PARP15

20. PRKCB_28

21. S1PR4

22. SHOX2

23. SKI

24. SLC12A8

25. SOBP

26. SP9

27. SUCLG2

28. TBX15

29. ZDHHC1

30. ZNF781

표적 서열, 바이설파이트 전환된 표적 서열, 및 이들 마커에 대한 분석 올리고뉴클레오티드는 도 1에 제시된 바와 같았다. 각각의 전환된 표적에 대하여 사용된 프라이머 및 플랩 올리고뉴클레오티드(프로브)는 다음과 같았다:

^* B3GALT6 마커는 암 메틸화 마커 및 기준 표적으로서 사용된다. 참조 미국 특허 출원 번호 제62/364,082호(2016.7.19. 출원), 이는 그 전체가 여기에 참조로 수록됨.

^† 제브라피쉬(zebrafish) 기준 DNA에 대하여 참조 미국 특허 출원 번호 제62/364,049호(2016.7.19. 출원), 이는 그 전체가 여기에 참조로 수록됨.

전술한 바와 같이 혈장으로부터 제조된 DNA를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 2회 멀티플렉스된 사전-증폭 반응에서 증폭시켰다. 멀티플렉스 사전-증폭 반응은 다음의 마커 조합을 증폭시키기 위한 시약을 포함하였다.

사전-증폭에 이어서, 사전-증폭된 혼합물의 분취량을 10 mM Tris HCl, 0.1 mM EDTA에서 1:10으로 희석하고, 그 후 실시예 1에서 기재한 바와 같이 삼중가닥 QuARTS PCR-플랩 분석에서 분석하였다. 그룹 1 삼중가닥 반응은 멀티플렉스 혼합물 1으로부터의 사전-증폭된 재료를 사용하였고, 그룹 2 반응은 멀티플렉스 혼합물 2로부터의 사전-증폭된 재료를 사용하였다. 삼중가닥 조합은 다음과 같다:

그룹 1:

ZF_RASSF1-B3GALT6-BTACT (ZBA 삼중가닥)

BARX1-SLC12A8-BTACT (BSA2 삼중가닥)

PARP15-MAX.chr8.124-BTACT (PMA 삼중가닥)

SHOX2-ZDHHC1-BTACT (SZA2 삼중가닥)

BIN2_Z-SKI-BTACT (BSA 삼중가닥)

DNMT3A-BCL2L11-BTACT (DBA 삼중가닥)

TBX15-FERMT3-BTACT (TFA 삼중가닥)

PRKCB_28-SOBP-BTACT (PSA2 삼중가닥)

그룹 2:

ZF_RASSF1-B3GALT6-BTACT (ZBA 삼중가닥)

MAX.chr8.145-MAX_chr10.226-BTACT (MMA2 삼중가닥)

MAX.chr12.526-FLJ45983-BTACT (MFA 삼중가닥)

HOXA9-EMX1-BTACT (HEA 삼중가닥)

SP9-DMRTA2-BTACT (SDA 삼중가닥)

OPLAH-CYP26C1-BTACT (OCA 삼중가닥)

ZNF781-DLX4-BTACT (ZDA 삼중가닥)

SUCLG2-KLHDC7B-BTACT (SKA 삼중가닥)

S1PR4-NFIX-BTACT (SNA 삼중가닥)

각각의 삼중가닥 두문자는 각 유전자 이름의 첫 글자를 사용한다(예를 들면, HOXA9-EMX1-BTACT의 조합 = "HEA"). 두문자가 마커의 상이한 조합에 대하여 또는 또 다른 실험에서 반복되는 경우, 해당 두문자를 갖는 두 번째 그룹은 숫자 2를 포함한다. 위에 나열된 삼중가닥 각각의 구성원에 대한 FRET 카세트에 사용된 염료 리포터는 각각 FAM-HEX-Quasar670이다.

표적 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 사용하여 정량적 반응을 보정하였다. 각각의 캘리브레이터 플라스미드에 대하여, 피쉬 DNA 희석제(10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA 중의 20 ng/mL 피쉬 DNA)에서 μl 당 10 내지 10⁶ 카피의 표적 가닥을 갖는, 일련의 10X 캘리브레이터 희석액 스톡을 제조하였다. 삼중가닥 반응에 대하여, 삼중가닥의 표적 각각을 포함하는 플라스미드를 갖는 조합된 스톡이 사용되었다. μL 당 1x10⁵ 카피로 각각의 플라스미드를 갖는 혼합물을 제조하고 1:10 희석 시리즈를 생성하는데 사용하였다. 미지 샘플의 가닥을 Cp 대 로그(플라스미드의 가닥)를 플로팅하여 생성된 표준 곡선을 사용하여 역으로 계산하였다.

수신기 작동 특성(ROC) 곡선 분석을 사용하여, 각 마커에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하고 아래 표에 어퍼 95 Pct 커버리지 간격(Upper 95 Pct Coverage Interval)으로 정렬하여 나타낸다.

마커는 암 환자의 샘플과 정상 대상체의 샘플을 구별하는데 매우 잘 작동한다(위의 ROC 표 참조). 마커를 조합하여 사용하면 민감도가 향상된다. 예를 들면, 데이터의 로지스틱 적합(logistic fit) 및 6-마커 적합(six-marker fit)을 사용하여, ROC 곡선 분석은 AUC = 0.973을 나타낸다.

6-마커 적합을 사용하여, 92.2%의 민감도가 93% 특이성에서 획득된다. 함께하여 최상의 피트를 산출하는 6개 마커의 그룹은 SHOX2 , SOBP , ZNF781 , BTACT , CYP26C1, 및 DLX4(도 7 참조)이었다. SHOX2 , SOBP , ZNF781 , CYP26C1 , SUCLG2 , 및 SKI를 사용하여 0.97982의 AUC를 갖는 ROC를 얻었다(도 8 참조).

실시예 4

두 번째 독립적인 연구 그룹의 보관 혈장을 맹검 방식(blinded fashion)으로 검사했다. 각 그룹의 폐암 사례와 대조군(명백하게 건강한 흡연자)은 연령과 성별에 따라 균형을 이뤘다(23명 사례, 80명 대조군). 실시예 1에 기재된 바와 같이 멀티플렉스 PCR 및 이어서 QuARTS(정량적 대립유전자-특이성 실시간 표적 및 신호 증폭) 분석을 사용하여, 혈장으로부터 추출된 DNA에 대한 메틸화된 DNA 마커의 포스트-바이설파이트 정량화를 수행하였다. 실시예 3의 상위 개별 메틸화된 마커들을 폐암 검출을 위한 최적의 마커 패널을 확인하기 위해 본 실험에서 시험하였다(2 ml/환자).

결과: 13개의 고성능 메틸화된 DNA 마커가 분석되었다(CYP26C1 , SOBP , SUCLG2, SHOX2 , ZDHHC1 , NFIX , FLJ45983 , HOXA9 , B3GALT6 , ZNF781 , SP9, BARX1 , 및 EMX1). 데이터는 두 가지 방법, 즉 로지스틱 회귀 적합(logistic regression fit)과 회귀 분할 트리 접근법(regression partition tree approach)을 사용하여 분석되었다. 로지스틱 적합 모델은 0.96의 AUC 및 91%의 전체 민감도 및 90% 특이성을 갖는 4개-마커 패널( ZNF781 , BARX1 , EMX1 , 및 SOBP)을 확인하였다. 회귀 분할 트리 접근법을 사용한 데이터 분석은 0.96의 AUC 및 96%의 전체 민감도 및 94% 특이성을 갖는 4개-마커(ZNF781, BARX1, EMX1, 및 HOXA9)를 확인하였다. 두 가지 접근법 모두에서, B3GALT6는 전체 DNA 입력의 표준 마커로 사용되었다. 혈장에서 분석된 메틸화된 DNA 마커의 이들 패널은 모든 유형의 폐암에 대해 높은 민감도와 특이성을 나타냈다.

실시예 5

폐암 구별

전술한 방법을 사용하여, 특정 유형의 폐암과 관련된 메틸화를 검출하는데 고성능을 나타내는 메틸화 마커가 선택된다.

폐암을 갖는 것으로 의심되는 대상체에 대하여, 샘플, 예컨대 혈장 샘플을 수집하고, DNA를 상기 샘플로부터 분리하고 예컨대 실시예 1에 개시된 바와 같이 바이설파이트 시약으로 처리한다. 전환된 DNA를, 상이한 메틸화 마커 또는 메틸화 마커의 조합에 대한 상이한 확인가능한 신호를 제공하도록 구성된, 실시예 1에 기재된 바와 같은 멀티플렉스 PCR 및 이어서 QuARTS 플랩 엔도뉴클레아제 분석을 사용하여 분석하여, 대상체의 하나 이상의 상이한 유형의 폐 암종(예컨대, 선암, 대세포암종, 편평 세포 암종, 및/또는 소세포암종)의 존재를 특이적으로 확인하도록 구성된 데이터 세트를 제공하였다. 바람직한 구체예에서, 폐 암종의 존재를 나타내는 분석 결과의 존재 또는 부재를 나타내고, 존재하는 경우, 하나 이상의 확인된 유형의 폐 암종의 존재를 더 나타내는 리포트가 생성된다. 대상체로부터의 샘플은 일정 기간 또는 치료 과정 동안 수집되고, 분석 결과는 암 병리의 변화를 모니터링하기 위해 비교된다.

상이한 유형의 폐암에 민감한 마커 및 마커 패널은 존재하는 암의 유형 분류, 혼합 병리의 확인, 및/또는 시간이 지남에 따라 및/또는 치료에 대한 반응으로 암 진행을 모니터링하는데 사용된다.

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기술된 조성물, 방법 및 기술의 용도의 다양한 변형 및 변화가 개시된 기술의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 해당 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 기술이 특정한 예시적인 실시예와 관련하여 기술되었지만, 청구된 본 발명이 그러한 특정 실시예에 부당하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 약리학, 생화학, 의학, 또는 관련 분야의 통상의 기술자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> EXACT SCIENCES CORPORATION MAYO FOUNDATION FOR MEDICAL EDUCATION AND RESEARCH <120> DETECTION OF LUNG NEOPLASIA BY ANALYSIS OF METHYLATED DNA <130> EXCT-34810/WO-1/ORD <150> US 62/332,295 <151> 2016-05-05 <150> US 62/462,677 <151> 2017-02-23 <160> 404 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gttcccggaa cggcctcttg ggggcgttcc agccccacgg acccgcaggg agtccccgcc 60 gcaatttgca tggggctcat ttgcatgacc ccgccccgcg cgggagtcgg gggcgc 116 <210> 2 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 gttttcggaa cggttttttg ggggcgtttt agttttacgg attcgtaggg agttttcgtc 60 gtaatttgta tggggtttat ttgtatgatt tcgtttcgcg cgggagtcgg gggcgt 116 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 ggcgttttag ttttacggat tcg 23 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 acaaataaac cccatacaaa ttacgac 27 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial 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gtttttgtcg ttatcgtatt atgttttgtt tttattttcg 60 ttttagcgtt ttttgcgggg ttcgcgtttt tagttgtatt tcggtttgcg ggtttt 116 <210> 183 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 183 tcgttcgttt ttgtcgttat cg 22 <210> 184 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 184 aaccgaaata caactaaaaa cgc 23 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 185 ccacggacgc gaaccccgca a 21 <210> 186 <211> 108 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 186 ggaaggctgc agcgagagat ttacatattc atccgagctt aaggaagccg cgataatgca 60 ggtacagccc gaaacccacg cccccagacc ttatctgcgc gccccgcc 108 <210> 187 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 187 ggaaggttgt agcgagagat ttatatattt attcgagttt aaggaagtcg cgataatgta 60 ggtatagttc gaaatttacg tttttagatt ttatttgcgc gtttcgtt 108 <210> 188 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 188 ttcgagttta aggaagtcg 19 <210> 189 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tagggtttgg 60 ttcgagttta ggggtagcga ggggcgtttg cggatgcggt tttttgtgcg gtataatatt 120 <210> 269 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 269 gttcgagttt aggggtagcg 20 <210> 270 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 270 ccgcacaaaa aaccgca 17 <210> 271 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 271 ccacggacga tccgcaaacg c 21 <210> 272 <211> 55 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 272 ccggagcact cgccgctgcg cgccctgaag ccgctggcgg taggcggccc tcgag 55 <210> 273 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 273 tcggagtatt cgtcgttgcg cgttttgaag tcgttggcgg taggcggttt tcgag 55 <210> 274 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 274 ggagtattcg tcgttgcg 18 <210> 275 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 275 cgaaaaccgc ctaccgc 17 <210> 276 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> 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agagcgcggg ccgtgggaag tttctc 96 <210> 352 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 352 ggagttttta gttttacgcg ggtatacgta gggtgggtgg ttacgttcgt agggttcgcg 60 agcgcggcgt agagcgcggg tcgtgggaag tttttt 96 <210> 353 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 353 gtagggtggg tggttacg 18 <210> 354 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 354 aacttcccac gacccgc 17 <210> 355 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 355 cgccgagggt tcgtagggtt 20 <210> 356 <211> 127 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 356 ggcgccgcca ttgcggtcct cattttgctg ctggtgggtt gggctacagc aggcctctgg 60 agccacacca gggcacggga gtgggtgcag ggaccgtcac cgcgccttca cacgcaccat 120 agtgccc 127 <210> 357 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 357 ggcgtcgtta ttgcggtttt tattttgttg ttggtgggtt gggttatagt aggtttttgg 60 agttatatta gggtacggga gtgggtgtag ggatcgttat cgcgttttta tacgtattat 120 agtgttt 127 <210> 358 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 358 tggagttata ttagggtacg gga 23 <210> 359 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 359 acactataat acgtataaaa acgcgata 28 <210> 360 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 360 ccacggacga acgatcccta c 21 <210> 361 <211> 140 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 361 ggcggcgagg ggcgcgtccg cgggtgggtt tcacctgggt ggtgggcatg tcgggcccgc 60 tagggcgagg gtctggccag gggcgtagtt ctcctggtgg gtggggacgc tccgtggcga 120 ttggggtcac tcctctgagg 140 <210> 362 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 362 ggcggcgagg ggcgcgttcg cgggtgggtt ttatttgggt ggtgggtatg tcgggttcgt 60 tagggcgagg gtttggttag gggcgtagtt tttttggtgg gtggggacgt ttcgtggcga 120 ttggggttat ttttttgagg 140 <210> 363 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 363 ggtggtgggt atgtcgg 17 <210> 364 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 364 ccaatcgcca cgaaacg 17 <210> 365 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 365 ccacggacgg gttcgttagg g 21 <210> 366 <211> 117 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 366 ccgtgggcgc ggacagctgc cgggagcggc aggcgtctcg atcggggacg caggcacttc 60 cgtccctgca gagcatcaga cgcgtctcgg gacactgggg acaacatctc ctccgcg 117 <210> 367 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 367 tcgtgggcgc ggatagttgt cgggagcggt aggcgtttcg atcggggacg taggtatttt 60 cgtttttgta gagtattaga cgcgtttcgg gatattgggg ataatatttt tttcgcg 117 <210> 368 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 368 gttgtcggga gcggtagg 18 <210> 369 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 369 ccaatatccc gaaacgcgtc t 21 <210> 370 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 370 ccacggacgg cgtttcgatc g 21 <210> 371 <211> 120 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 371 aagctgcgcc cggagacgtg ggagcgttct cttgttttcc gagtgcgcgg actcatcggg 60 tcacagttta tgcttttatg acgcggtgag tccagccact gattcctaac ggtttagagt 120 <210> 372 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 372 aagttgcgtt cggagacgtg ggagcgtttt tttgtttttc gagtgcgcgg atttatcggg 60 ttatagttta tgtttttatg acgcggtgag tttagttatt gatttttaac ggtttagagt 120 <210> 373 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 373 cgtttttttg tttttcgagt gcg 23 <210> 374 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 374 tcaataacta aactcaccgc gtc 23 <210> 375 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 375 ccacggacgg cggatttatc g 21 <210> 376 <211> 224 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 376 ctctgacctg agtctccttt ggaactctgc aggttctatt tgctttttcc cagatgagct 60 ctttttctgg tgtttgtctc tctgactagg tgtctaagac agtgttgtgg gtgtaggtac 120 taacactggc tcgtgtgaca aggccatgag gctggtgtaa agcggccttg gagtgtgtat 180 taagtaggtg cacagtaggt ctgaacagac tccccatccc aaga 224 <210> 377 <211> 224 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 377 ttttgatttg agtttttttt ggaattttgt aggttttatt tgtttttttt tagatgagtt 60 ttttttttgg tgtttgtttt tttgattagg tgtttaagat agtgttgtgg gtgtaggtat 120 taatattggt ttgtgtgata aggttatgag gttggtgtaa agtggttttg gagtgtgtat 180 taagtaggtg tatagtaggt ttgaatagat tttttatttt aaga 224 <210> 378 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 378 ccatgaggct ggtgtaaag 19 <210> 379 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 379 ctactgtgca cctacttaat acac 24 <210> 380 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 380 cgccgagggc ggccttggag 20 <210> 381 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 381 gtgtttgttt ttttgattag gtgtttaaga 30 <210> 382 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 382 ctttacacca acctcataac cttatc 26 <210> 383 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 383 gacgcggaga tagtgttgtg g 21 <210> 384 <211> 139 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 384 ggccacacag gcccactctg gccctctgag cccccggcgg acccagggca ttcaaggagc 60 ggctctgggc tgccagcgca ggcctccgcg caaacacagc aggctggaag tggcgctcat 120 caccggcacg tcttcccag 139 <210> 385 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 385 ggttatatag gtttattttg gttttttgag ttttcggcgg atttagggta tttaaggagc 60 ggttttgggt tgttagcgta ggttttcgcg taaatatagt aggttggaag tggcgtttat 120 tatcggtacg tttttttag 139 <210> 386 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 386 ggtttatttt ggttttttga gttttcgg 28 <210> 387 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 387 tccaacctac tatatttacg cgaa 24 <210> 388 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 388 ccacggacgg cggatttagg g 21 <210> 389 <211> 171 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 389 tccacgtggt gcccactctg gacaggtgga gcagagggaa ggtggtggca tggtggggag 60 ggtggcctgg aggacccgat tggctgagtg taaaccagga gaggacatga ctttcagccc 120 tgcagccaga cacagctgag ctggtgtgac ctgtgtggag agttcatctg g 171 <210> 390 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 390 tttatcgtgg tgtttatttt ggataggtgg agtagaggga aggtggtgcg tatggtgggc 60 gagcgcgtgc gtttggagga tttcgattgg ttgacgtgta aattaggacg aggatatgat 120 ttttagtttt gtagttagat atagttgagt tggtgtgatt tgtgtggaga gtttatttgg 180 <210> 391 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 391 cgcatggtgg gcgag 15 <210> 392 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 392 acacgtcagc caatcggg 18 <210> 393 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 393 gacgcggagg cgcgtgcgcc 20 <210> 394 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 394 tgcgtatggt gggcgag 17 <210> 395 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 395 cctaatttac acgtcaacca atcgaa 26 <210> 396 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 396 gacgcggagg cgcgtgcgtt t 21 <210> 397 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 397 ccacggacgg cgcgtgcgtt t 21 <210> 398 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 398 agccggtttt ccggctgaga cctcggcg 28 <210> 399 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 399 agccggtttt ccggctgaga cctcggcg 28 <210> 400 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 400 agccggtttt ccggctgaga ctccgcgtc 29 <210> 401 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 401 agccggtttt ccggctgaga cgtccgtgg 29 <210> 402 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 402 agccggtttt ccggctgaga ggacgcgc 28 <210> 403 <211> 108 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 403 ggaaggaaat tgcgggttcc cgtctgcctt gtctccagct tctctgctga agcccggtag 60 cagtgaatgc gcgctgactt tcagcgacga ctcctggaag caacgcca 108 <210> 404 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 404 ggaaggaaat tgcgggtttt cgtttgtttt gtttttagtt tttttgttga agttcggtag 60 tagtgaatgc gcgttgattt ttagcgacga tttttggaag taacgtta 108

Claims

샘플을 처리하는 방법에 있어서, 상기 방법은 다음 단계들:
a) EMX1, GRIN2D, ANKRD13B, ZNF671, BARX1, LOC100129726, SPOCK2, TSC22D4, MAX.chr8.124, RASSF1, ST8SIA1, NKX6_2, FAM59B, DIDO1, MAX_Chr1.110, AGRN, SOBP, MAX_chr10.226, ZMIZ1, MAX_chr8.145, MAX_chr10.225, PRDM14, ANGPT1, MAX.chr16.50, PTGDR_9, DOCK2, MAX_chr19.163, ZNF132, MAX chr19.372, HOXA9, TRH, SP9, DMRTA2, ARHGEF4, CYP26C1, ZNF781, PTGDR, MATK, BCAT1, PRKCB_28, ST8SIA_22, FLJ45983, DLX4, SHOX2, HOXB2, MAX.chr12.526, BCL2L11, OPLAH, PARP15, KLHDC7B, SLC12A8, BHLHE23, CAPN2, FGF14, FLJ34208, B3GALT6, BIN2_Z, DNMT3A, FERMT3, NFIX, S1PR4, SKI, SUCLG2, TBX15, 및 ZNF329로 이루어진 군으로부터 선택되는 복수의 메틸화 마커들(methylation markers)의 양에 대하여 대상체로부터의 샘플을 분석하는 단계로서, 상기 복수의 메틸화 마커들은 ZNF781, BARX1 및 EMX1 으로 이루어진 군을 포함하는 것인, 단계;
b) 기준 마커의 양에 대하여 상기 샘플을 분석하는 단계;
c) 상기 샘플 내에서 상기 복수의 메틸화 마커들의 양을 상기 기준 마커의 양과 비교하여 상기 샘플 내에서 상기 복수의 메틸화 마커들에 대한 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및 선택사항으로서
d) 상기 샘플 내에서 상기 복수의 메틸화 마커들에 대한 메틸화 상태를 보고하는 기록을 생성하는 단계;를 포함하고,
상기 대상체는 폐 신생물(lung neoplasm)을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 분석은, 상기 샘플로부터 획득된 DNA를 상기 획득된 DNA에서 비메틸화된 시토신 잔기(unmethylated cytosine residues)를 선택적으로 변형시키는 시약으로 처리하여 변형된 잔기를 생성하는 단계를 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 복수의 메틸화 마커들은 SLC12A8, KLHDC7B, PARP15, OPLAH, BCL2L11, MAX.chr12.526, HOXB2, CYP26C1, SOBP, SUCLG2, SHOX2, NFIX, FLJ45983, HOXA9, B3GALT6, SP9, 및 SKI로 구성된 군으로부터 선택되는 메틸화 마커를 더 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 복수의 메틸화 마커들은 3개 내지 21개의 마커들, 또는 3개 내지 8개의 마커들, 또는 4개 내지 6개의 마커들을 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 1에 있어서, ZNF781, BARX1 및 EMX1로 이루어진 군을 포함하는 상기 복수의 메틸화 마커들이 SOBP 및 HOXA9 중 하나 이상을 더 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 시약은 바이설파이트 시약(bisulfite reagent)을 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 샘플에서 메틸화 마커의 메틸화 상태를 분석하는 단계는 하나의 염기의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 샘플에서 메틸화 마커의 메틸화 상태를 분석하는 단계는 복수의 염기에서 메틸화의 정도를 결정하는 단계를 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 메틸화 마커의 메틸화 상태는 하나 이상의 정상 샘플에서 동일한 메틸화 마커의 메틸화 상태에 비하여 메틸화 마커의 증가된 또는 감소된 메틸화를 포함하거나, 메틸화 마커의 메틸화 상태는 하나 이상의 정상 샘플에서 동일한 메틸화 마커의 메틸화의 패턴에 비하여 메틸화의 상이한 패턴을 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 기준 마커는 메틸화된 기준 마커인 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 샘플은 조직 샘플, 혈액 샘플, 혈청 샘플, 또는 가래 샘플인 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 조직 샘플은 폐 조직을 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 샘플은 혈장 샘플인 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 샘플은 혈장으로부터 분리된 DNA인 것인, 샘플을 처리하는 방법.
삭제
하기 단계들을 포함하는, 폐 신생물을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터 획득된 혈장 샘플을 분석하는 방법:
a) 혈장 샘플을:
i) 프로테아제; 및
ii) 제1 용해 시약(first lysis reagent)으로서, 상기 제1 용해 시약은 다음을 포함하는, 제1 용해 시약:
- 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate); 및
- 비-이온성 세제;
와 혼합시켜 혼합물을 형성하는 단계로서 여기서 단백질이 상기 프로테아제에 의해 분해되는 것인, 단계;
b) 단계 a)의 혼합물에 다음 성분:
iii) 실리카 입자, 및
iv) 제2 용해 시약으로서, 상기 제2 용해 시약은 다음을 포함하는, 제2 용해시약:
- 구아니딘 티오시아네이트;
- 비-이온성 세제; 및
- 이소프로필 알코올;
을, DNA가 상기 실리카 입자에 결합되는 조건 하에서 첨가하는 단계;
c) 상기 b)의 혼합물로부터 결합된 DNA를 갖는 실리카 입자를 분리하는 단계;
d) 결합된 DNA를 갖는 분리된 실리카 입자에 제1 세척 용액을 첨가하는 단계로서, 상기 제1 세척 용액은 A) 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride) 또는 구아니딘 티오시아네이트, 및 B) 에틸 알코올을 포함하는 것인, 단계;
e) 결합된 DNA를 갖는 실리카 입자를 상기 제1 세척 용액으로부터 분리하는 단계;
f) 결합된 DNA를 갖는 분리된 실리카 입자에 제2 세척 용액을 첨가하는 단계로서, 상기 제2 세척 용액은 완충액 및 에틸 알코올을 포함하는 것인, 단계;
g) 결합된 DNA를 갖는 세척된 실리카 입자를 상기 제2 세척 용액으로부터 분리하는 단계; 및
h) 단계 g)에서 분리된 결합된 DNA를 갖는 세척된 실리카 입자로부터 DNA를 용리하는 단계;
i) 용리된 DNA를 복수의 메틸화된 메틸화 마커들의 양에 대하여 그리고 상기 용리된 DNA에서 기준 마커의 양에 대하여 분석하는 단계;
j) 상기 DNA에서 상기 복수의 메틸화된 메틸화 마커들의 양을 기준 마커의 양과 비교하여 상기 혈장 샘플에서 상기 복수의 메틸화 마커들에 대한 메틸화 상태를 결정하는 단계로서, 이 때 상기 복수의 메틸화 마커들이 ZNF781, BARX1 및 EMX1 으로 이루어진 군을 포함하는 것인, 단계; 및 선택사항으로서
k) 상기 혈장 샘플에서 상기 복수의 메틸화 마커들에 대한 메틸화 상태를 보고하는 기록을 생성하는 단계.
청구항 16에 있어서, 상기 복수의 메틸화 마커들은 GRIN2D, ANKRD13B, ZNF671, LOC100129726, SPOCK2, TSC22D4, MAX.chr8.124, RASSF1, ST8SIA1, NKX6_2, FAM59B, DIDO1, MAX_Chr1.110, AGRN, SOBP, MAX_chr10.226, ZMIZ1, MAX_chr8.145, MAX_chr10.225, PRDM14, ANGPT1, MAX.chr16.50, PTGDR_9, DOCK2, MAX_chr19.163, ZNF132, MAX chr19.372, HOXA9, TRH, SP9, DMRTA2, ARHGEF4, CYP26C1, PTGDR, MATK, BCAT1, PRKCB_28, ST8SIA_22, FLJ45983, DLX4, SHOX2, HOXB2, MAX.chr12.526, BCL2L11, OPLAH, PARP15, KLHDC7B, SLC12A8, BHLHE23, CAPN2, FGF14, FLJ34208, B3GALT6, BIN2_Z, DNMT3A, FERMT3, NFIX, S1PR4, SKI, SUCLG2, TBX15, 및 ZNF329로 이루어진 군으로부터 선택된 메틸화 마커를 더 포함하는 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.
청구항 17에 있어서, ZNF781, BARX1 및 EMX1 으로 이루어진 군을 포함하는 상기 복수의 메틸화 마커들은 SOBP 및 HOXA9 중 하나 이상을 더 포함하는 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.
청구항 16 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, 분석은 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분광법, 메틸화 특이성 뉴클레아제(methylation specific nuclease), 질량-기반 분리, 또는 표적 포획을 사용하는 것을 포함하는 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.
청구항 19에 있어서, 분석은 플랩 엔도뉴클레아제 분석(flap endonuclease assay)을 사용하는 것을 포함하는 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.
청구항 16 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, 분석은 상기 마커 DNA 및 상기 기준 핵산을 전환시키는 바이설파이트를 포함하는 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.
청구항 21에 있어서, 하나 이상의 메틸화 마커들의 메틸화 수준을 결정하는 단계는 메틸화-특이성 PCR, 정량적 메틸화-특이성 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱(quantitative bisulfite pyrosequencing), 플랩 엔도뉴클레아제 분석, 및 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR로 구성된 군으로부터 선택되는 기술에 의해 달성되는 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.
청구항 16 또는 청구항 17에 있어서, 상기 분석은 다음을 포함하는 과정에 의해 PCR 사전-증폭 및 PCR-플랩 분석을 사용하여 여러 DNA 메틸화 마커를 분석하는 것을 포함하는, 혈장 샘플을 분석하는 방법:
a) PCR 증폭 시약을 포함하는 제1 반응 혼합물에서 복수의 상이한 DNA 메틸화 마커 표적 영역을 포함하는 바이설파이트-처리된 DNA를 제공하는 단계로서, 여기서 상기 PCR 증폭 시약은 다음을 포함하는 것인, 단계:
i) 상기 샘플에 존재하는 경우, 상기 바이설파이트-처리된 DNA로부터의 상기 복수의 상이한 표적 영역을 증폭하기 위한 복수의 상이한 프라이머 쌍;
ii) 열안정성 DNA 중합효소;
iii) dNTP; 및
iv) Mg⁺⁺를 포함하는 완충액
b) 상기 제1 반응 혼합물을 열 싸이클링 조건에 노출시키는 단계로서, 여기서 복수의 상이한 DNA 메틸화 마커 표적 영역은, 샘플에 존재하는 경우, 증폭되어 사전-증폭된 혼합물을 생성하고, 상기 열 싸이클링 조건은 증폭을 지수 범위에서 유지하는 복수의 열 싸이클 또는 20회 미만 또는 15회 미만 또는 10회 또는 그 미만의 열 싸이클에 한정되는 것인, 단계;
c) 상기 사전-증폭된 혼합물을 복수의 PCR-플랩 분석 반응 혼합물로 분할하는 단계로서, 여기서 각각의 PCR-플랩 분석 반응 혼합물은 다음을 포함하는 것인 단계:
i) 상기 단계 a) i)의 복수의 상이한 프라이머 쌍으로부터 선택된 추가 양의 프라이머 쌍;
ii) 열안정성 DNA 중합효소;
iii) dNTP;
iv) 상기 Mg⁺⁺를 포함하는 완충액
v) 플랩 엔도뉴클레아제;
vi) 플랩 올리고뉴클레오티드, 및
vi) 상기 플랩 올리고뉴클레오티드의 일부분에 상보적인 영역을 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드;
및
d) PCR-플랩 분석 반응 동안 상기 바이설파이트-처리된 DNA로부터의 하나 이상의 상이한 DNA 메틸화 마커 표적 영역의 증폭을 검출하는 단계.
청구항 23에 있어서, 상기 바이설파이트-처리된 DNA는 적어도 1 mL 또는 적어도 5 mL 또는 적어도 10 mL의 혈장 샘플로부터 제조되며, 단계 b의 증폭 반응에서 복수의 상이한 DNA 메틸화 마커 표적 영역을 포함하는 상기 바이설파이트-처리된 DNA의 부피는 증폭 반응물의 전체 부피의 적어도 20 내지 50%인 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.
하기를 포함하는, 폐 신생물을 검출하는데 사용하기 위한 키트:
a) 복수의 올리고뉴클레오티드들로서, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드들 의 적어도 일부분은 EMX1, GRIN2D, ANKRD13B, ZNF671, BARX1, LOC100129726, SPOCK2, TSC22D4, MAX.chr8.124, RASSF1, ST8SIA1, NKX6_2, FAM59B, DIDO1, MAX_Chr1.110, AGRN, SOBP, MAX_chr10.226, ZMIZ1, MAX_chr8.145, MAX_chr10.225, PRDM14, ANGPT1, MAX.chr16.50, PTGDR_9, DOCK2, MAX_chr19.163, ZNF132, MAX chr19.372, HOXA9, TRH, SP9, DMRTA2, ARHGEF4, CYP26C1, ZNF781, PTGDR, MATK, BCAT1, PRKCB_28, ST8SIA_22, FLJ45983, DLX4, SHOX2, HOXB2, MAX.chr12.526, BCL2L11, OPLAH, PARP15, KLHDC7B, SLC12A8, BHLHE23, CAPN2, FGF14, FLJ34208, B3GALT6, BIN2_Z, DNMT3A, FERMT3, NFIX, S1PR4, SKI, SUCLG2, TBX15, 및 ZNF329 로 구성된 군으로부터 선택되는 복수의 메틸화 마커들에 특이적으로 혼성화되고, 여기서 상기 복수의 메틸화 마커들 중 각각의 메틸화 마커는 상기 복수의 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화되고, 상기 복수의 메틸화 마커들은 ZNF781, BARX1 및 EMX1 으로 이루어진 군을 포함하는 것인, 복수의 올리고뉴클레오티드들; 및
b) 적어도 하나의 추가 올리고뉴클레오티드로서, 여기서 상기 추가 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부분은 기준 핵산에 특이적으로 혼성화되는 것인, 적어도 하나의 추가 올리고뉴클레오티드.
청구항 25에 있어서, 상기 각각의 올리고뉴클레오티드의 일부분은 상기 메틸화 마커를 포함하는 바이설파이트-처리된 DNA에 특이적으로 혼성화되는 것인, 키트.
청구항 25 또는 청구항 26에 있어서, 상기 키트는 적어도 2개의 추가 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인, 키트.
청구항 25 또는 청구항 26에 있어서, 상기 키트는 바이설파이트를 더욱 포함하는 것인, 키트.
청구항 25 또는 청구항 26에 있어서, SLC12A8, KLHDC7B, PARP15, OPLAH, BCL2L11, MAX.chr12.526, HOXB2, CYP26C1, SOBP, SUCLG2, SHOX2, NFIX, FLJ45983, HOXA9, B3GALT6, SP9, 및 SKI로 이루어진 군으로부터 선택되는 메틸화 마커에 특이적으로 혼성화되는 부분을 포함하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는, 키트.
청구항 25 또는 청구항 26에 있어서, 상기 복수의 메틸화 마커들은 3개 내지 21개의 마커들, 또는 3개 내지 8개의 마커들, 또는 4개 내지 6개 마커들을 포함하는 것인, 키트.
삭제
청구항 25에 있어서, ZNF781, BARX1, 및 EMX1로 이루어진 군을 포함하는 상기 복수의 메틸화 마커들이 SOBP 및 HOXA9 중 하나 이상을 더 포함하는 것인, 키트.
청구항 25 또는 청구항 26에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드들은 포획 올리고뉴클레오티드, 한 쌍의 핵산 프라이머, 핵산 프로브, 및 침습성 올리고뉴클레오티드(invasive oligonucleotide) 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, 키트.
청구항 25 또는 청구항 26에 있어서, 상기 키트는 고체 지지체(solid support)를 더 포함하는 것인, 키트.
청구항 34에 있어서, 상기 고체 지지체는 자석 비드(magnetic bead)인 것인, 키트.
청구항 35에 있어서, 상기 고체 지지체는 하나 이상의 포획 시약을 포함하는 것인, 키트.
청구항 36에 있어서, 상기 포획 시약은 상기 하나 이상의 메틸화 마커에 상보적인 올리고뉴클레오티드인 것인, 키트.
복수의 복합체들을 포함하는 반응 혼합물을 포함하는, 폐 신생물 검출에 사용하기 위한 조성물로서,
상기 복합체 각각은, EMX1, GRIN2D, ANKRD13B, ZNF671, BARX1, LOC100129726, SPOCK2, TSC22D4, MAX.chr8.124, RASSF1, ST8SIA1, NKX6_2, FAM59B, DIDO1, MAX_Chr1.110, AGRN, SOBP, MAX_chr10.226, ZMIZ1, MAX_chr8.145, MAX_chr10.225, PRDM14, ANGPT1, MAX.chr16.50, PTGDR_9, DOCK2, MAX_chr19.163, ZNF132, MAX chr19.372, HOXA9, TRH, SP9, DMRTA2, ARHGEF4, CYP26C1, ZNF781, PTGDR, MATK, BCAT1, PRKCB_28, ST8SIA_22, FLJ45983, DLX4, SHOX2, HOXB2, MAX.chr12.526, BCL2L11, OPLAH, PARP15, KLHDC7B, SLC12a, BHLHE23, CAPN2, FGF14, FLJ34208, B3GALT6, BIN2_Z, DNMT3A, FERMT3, NFIX, S1PR4, SKI, SUCLG2, TBX15, 및 ZNF329로 구성된 군으로부터 선택되는 표적 핵산 및 상기 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
상기 복수의 복합체들은 ZNF781, BARX1 및 EMX1로 이루어진 표적 핵산들의 군을 포함하는 복합체들을 포함하는 것인, 조성물.
청구항 38에 있어서, 상기 표적 핵산은 바이설파이트-전환된 표적 핵산인 것인, 조성물.
청구항 38 또는 청구항 39에 있어서, 상기 반응 혼합물은 SLC12A8, KLHDC7B, PARP15, OPLAH, BCL2L11, MAX.chr12.526, HOXB2, CYP26C1, SOBP, SUCLG2, SHOX2, NFIX, FLJ45983, HOXA9, B3GALT6, SP9, 및 SKI로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 핵산, 및 상기 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드의 복합체를 더 포함하는 것인, 조성물.
청구항 38 또는 청구항 39에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 포획 올리고뉴클레오티드, 한 쌍의 핵산 프라이머, 혼성화 프로브, 가수분해 프로브, 플랩 분석 프로브, 및 침습성 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, 조성물.
청구항 38에 있어서, 상기 표적 핵산은 아래의 SEQ ID NOS로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것인, 조성물: 1, 6, 11, 16, 21, 28, 33, 38, 43, 48, 53, 58, 63, 68, 73, 78, 86, 91, 96, 101, 106, 111, 116, 121, 126, 131, 136, 141, 146, 151, 156, 161, 166, 171, 176, 181, 186, 191, 196, 201, 214, 219, 224, 229, 234, 239, 247, 252, 257, 262, 267, 272, 277, 282, 287, 292, 298, 303, 308, 313, 319, 327, 336, 341, 351, 356, 361, 366, 371, 384, 및 403.
청구항 39에 있어서, 상기 바이설파이트-전환된 표적 핵산은 아래의 SEQ ID NOS로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것인, 조성물: 2, 7, 12, 17, 22, 29, 34, 39, 44, 49, 54, 59, 64, 69, 74, 79, 87, 92, 97, 102, 107, 112, 117, 122, 127, 132, 137, 142, 147, 152, 157, 162, 167, 172, 177, 182, 187, 192, 197, 202, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 248, 253, 258, 263, 268, 273, 278, 283, 288, 293, 299, 304, 309, 314, 320, 328, 337, 342, 352, 357, 362, 367, 372, 385, 및 404.
청구항 38 또는 청구항 39에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 리포터 분자를 포함하는 것인, 조성물.
청구항 44에 있어서, 상기 리포터 분자는 형광체를 포함하는 것인, 조성물.
청구항 38 또는 청구항 39에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 플랩 서열을 포함하는 것인, 조성물.
청구항 38 또는 청구항 39에 있어서, 하나 이상의 FRET 카세트; FEN-1 엔도뉴클레아제 및 열안정성 DNA 중합효소를 더 포함하는 것인, 조성물.
복수의 올리고뉴클레오티드들을 포함하는 키트를 사용하여, 샘플을 처리하는 방법으로서,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드들의 적어도 일부분은 EMX1, GRIN2D, ANKRD13B, ZNF671, BARX1, LOC100129726, SPOCK2, TSC22D4, MAX.chr8.124, RASSF1, ST8SIA1, NKX6_2, FAM59B, DIDO1, MAX_Chr1.110, AGRN, SOBP, MAX_chr10.226, ZMIZ1, MAX_chr8.145, MAX_chr10.225, PRDM14, ANGPT1, MAX.chr16.50, PTGDR_9, DOCK2, MAX_chr19.163, ZNF132, MAX chr19.372, HOXA9, TRH, SP9, DMRTA2, ARHGEF4, CYP26C1, ZNF781, PTGDR, MATK, BCAT1, PRKCB_28, ST8SIA_22, FLJ45983, DLX4, SHOX2, HOXB2, MAX.chr12.526, BCL2L11, OPLAH, PARP15, KLHDC7B, SLC12A8, BHLHE23, CAPN2, FGF14, FLJ34208, B3GALT6, BIN2_Z, DNMT3A, FERMT3, NFIX, S1PR4, SKI, SUCLG2, TBX15, 및 ZNF329로 이루어진 군으로부터 선택되는 복수의 메틸화 마커들에 특이적으로 혼성화되되, 상기 복수의 메틸화 마커들은 ZNF781, BARX1 및 EMX1 으로 이루어진 군을 포함하는 것이고, 상기 복수의 메틸화 마커들 중 각각의 메틸화 마커는 상기 복수의 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화되고,
상기 방법은 다음 단계들:
a) EMX1, GRIN2D, ANKRD13B, ZNF671, BARX1, LOC100129726, SPOCK2, TSC22D4, MAX.chr8.124, RASSF1, ST8SIA1, NKX6_2, FAM59B, DIDO1, MAX_Chr1.110, AGRN, SOBP, MAX_chr10.226, ZMIZ1, MAX_chr8.145, MAX_chr10.225, PRDM14, ANGPT1, MAX.chr16.50, PTGDR_9, DOCK2, MAX_chr19.163, ZNF132, MAX chr19.372, HOXA9, TRH, SP9, DMRTA2, ARHGEF4, CYP26C1, ZNF781, PTGDR, MATK, BCAT1, PRKCB_28, ST8SIA_22, FLJ45983, DLX4, SHOX2, HOXB2, MAX.chr12.526, BCL2L11, OPLAH, PARP15, KLHDC7B, SLC12A8, BHLHE23, CAPN2, FGF14, FLJ34208, B3GALT6, BIN2_Z, DNMT3A, FERMT3, NFIX, S1PR4, SKI, SUCLG2, TBX15, 및 ZNF329로 구성된 군으로부터 선택되는 복수의 메틸화 마커들의 양에 대하여 대상체로부터의 샘플을 분석하는 단계로서, 상기 복수의 메틸화 마커들은 ZNF781, BARX1 및 EMX1 으로 이루어진 군을 포함하는 것인, 단계;
b) 기준 마커의 양에 대하여 상기 샘플을 분석하는 단계;
c) 상기 샘플 내에서 상기 상기 복수의 메틸화 마커들의 양을 상기 기준 마커의 양과 비교하여 상기 샘플 내에서 상기 복수의 메틸화 마커들에 대한 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및 선택사항으로서
d) 상기 샘플 내에서 상기 복수의 메틸화 마커들에 대한 메틸화 상태를 보고하는 기록을 생성하는 단계;를 포함하고,
상기 대상체는 폐 신생물을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 48에 있어서, 상기 상기 분석은, 상기 샘플로부터 획득된 DNA를 상기 획득된 DNA에서 비메틸화된 시토신 잔기를 선택적으로 변형시키는 시약으로 처리하여 변형된 잔기를 생성하는 단계를 포함하고, 상기 키트는 획득된 DNA에서 비메틸화된 시토신 잔기를 선택적으로 변형시키는 시약을 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 48 또는 청구항 49에 있어서, 상기 복수의 메틸화 마커들은 SLC12A8, KLHDC7B, PARP15, OPLAH, BCL2L11, MAX.chr12.526, HOXB2, CYP26C1, SOBP, SUCLG2, SHOX2, NFIX, FLJ45983, HOXA9, B3GALT6, SP9, 및 SKI로 구성된 군으로부터 선택되는 메틸화 마커를 더 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 48 또는 청구항 49에 있어서, 상기 복수의 메틸화 마커들은 3개 내지 21개의 마커들, 또는 3개 내지 8개의 마커들, 또는 4개 내지 6개의 마커들을 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
삭제
청구항 48에 있어서, ZNF781, BARX1, 및 EMX1로 이루어진 군을 포함하는 상기 상기 복수의 메틸화 마커들이 SOBP 및 HOXA9 중 하나 이상을 더 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 49에 있어서, 상기 시약은 바이설파이트 시약을 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 48 또는 청구항 49에 있어서, 샘플에서 메틸화 마커의 메틸화 상태를 분석하는 단계는 하나의 염기의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 48 또는 청구항 49에 있어서, 샘플에서 메틸화 마커의 메틸화 상태를 분석하는 단계는 복수의 염기에서 메틸화의 정도를 결정하는 단계를 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 48 또는 청구항 49에 있어서, 메틸화 마커의 메틸화 상태는 하나 이상의 정상 샘플에서 동일한 메틸화 마커의 메틸화 상태에 비하여 메틸화 마커의 증가된 또는 감소된 메틸화를 포함하거나, 메틸화 마커의 메틸화 상태는 하나 이상의 정상 샘플에서 동일한 메틸화 마커의 메틸화의 패턴에 비하여 메틸화의 상이한 패턴을 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 48 또는 청구항 49에 있어서, 상기 기준 마커는 메틸화된 기준 마커인 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 48 또는 청구항 49에 있어서, 상기 샘플은 조직 샘플, 혈액 샘플, 혈청 샘플, 또는 가래 샘플인 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 59에 있어서, 상기 조직 샘플은 폐 조직을 포함하는 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 48 또는 청구항 49에 있어서, 상기 샘플은 혈장 샘플인 것인, 샘플을 처리하는 방법.
청구항 48 또는 청구항 49에 있어서, 상기 샘플은 혈장으로부터 분리된 DNA인 것인, 샘플을 처리하는 방법.
삭제
복수의 올리고뉴클레오티드들을 포함하는 키트를 사용하여, 폐 신생물을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터 획득된 혈장 샘플을 분석하는 방법으로서,
상기 키트는 복수의 메틸화 마커들에 특이적으로 혼성화되는 복수의 올리고뉴클레오티드들을 포함하고,
상기 혈장 샘플을 분석하는 방법은 다음 단계를 포함하는, 혈장 샘플을 분석하는 방법:
a) 혈장 샘플을:
i) 프로테아제; 및
ii) 하기 성분을 포함하는 제1 용해 시약:
- 구아니딘 티오시아네이트; 및
- 비-이온성 세제;
와 혼합시켜 혼합물을 형성하는 단계로서, 여기서 단백질이 상기 프로테아제에 의해 분해되는 것인, 단계;
b) 단계 a)의 혼합물에 다음:
iii) 실리카 입자, 및
iv) 다음을 포함하는 제2 용해시약:
- 구아니딘 티오시아네이트;
- 비-이온성 세제; 및
- 이소프로필 알코올;
을 DNA가 상기 실리카 입자에 결합되는 조건 하에서 첨가하는 단계;
c) 상기 b)의 혼합물로부터, 결합된 DNA를 갖는 실리카 입자를 분리하는 단계;
d) 결합된 DNA를 갖는 분리된 실리카 입자에 제1 세척 용액을 첨가하는 단계로서, 상기 제1 세척 용액은 A) 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 티오시아네이트, 및 B) 에틸 알코올을 포함하는 것인, 단계;
e) 결합된 DNA를 갖는 실리카 입자를 상기 제1 세척 용액으로부터 분리하는 단계;
f) 결합된 DNA를 갖는 분리된 실리카 입자에, 제2 세척 용액을 첨가하는 단계로서, 상기 제2 세척 용액은 완충액 및 에틸 알코올을 포함하는 것인, 단계;
g) 결합된 DNA를 갖는 세척된 실리카 입자를 상기 제2 세척 용액으로부터 분리하는 단계; 및
h) 단계 g)에서 분리된 결합된 DNA를 갖는 세척된 실리카 입자로부터 DNA를 용리하는 단계;
i) 용리된 DNA를 복수의 메틸화된 메틸화 마커들의 양에 대하여 그리고 상기 용리된 DNA에서 기준 마커의 양에 대하여 분석하는 단계;
j) 상기 DNA에서 상기 복수의 메틸화된 메틸화 마커들의 양을 기준 마커의 양과 비교하여 상기 혈장 샘플에서 상기 복수의 메틸화 마커들에 대한 메틸화 상태를 결정하는 단계로서, 이때 상기 복수의 메틸화 마커들은 ZNF781, BARX1, 및 EMX1로 구성된 군을 포함하는 것인, 단계; 및 선택사항으로서
d) 상기 혈장 샘플에서 상기 적어도 하나의 메틸화 마커에 대한 메틸화 상태를 보고하는 기록을 생성하는 단계.
청구항 64에 있어서, 상기 복수의 메틸화 마커들은 GRIN2D, ANKRD13B, ZNF671, LOC100129726, SPOCK2, TSC22D4, MAX.chr8.124, RASSF1, ST8SIA1, NKX6_2, FAM59B, DIDO1, MAX_Chr1.110, AGRN, SOBP, MAX_chr10.226, ZMIZ1, MAX_chr8.145, MAX_chr10.225, PRDM14, ANGPT1, MAX.chr16.50, PTGDR_9, DOCK2, MAX_chr19.163, ZNF132, MAX chr19.372, HOXA9, TRH, SP9, DMRTA2, ARHGEF4, CYP26C1, PTGDR, MATK, BCAT1, PRKCB_28, ST8SIA_22, FLJ45983, DLX4, SHOX2, HOXB2, MAX.chr12.526, BCL2L11, OPLAH, PARP15, KLHDC7B, SLC12A8, BHLHE23, CAPN2, FGF14, FLJ34208, B3GALT6, BIN2_Z, DNMT3A, FERMT3, NFIX, S1PR4, SKI, SUCLG2, TBX15, 및 ZNF329로 구성된 군으로부터 선택된 메틸화 마커를 추가로 포함하는 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.
청구항 64 또는 청구항 65에 있어서, 분석은 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분광법, 메틸화 특이성 뉴클레아제, 질량-기반 분리, 또는 표적 포획을 사용하는 것을 포함하는 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.
청구항 66에 있어서, 분석은 플랩 엔도뉴클레아제 분석을 사용하는 것을 포함하는 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.
청구항 67에 있어서, 분석은 상기 마커 DNA 및 상기 기준 핵산을 전환시키는 바이설파이트를 포함하는 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.
청구항 68에 있어서, 하나 이상의 메틸화 마커의 메틸화 수준을 결정하는 단계는 메틸화-특이성 PCR, 정량적 메틸화-특이성 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱, 플랩 엔도뉴클레아제 분석, 및 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR로 구성된 군으로부터 선택되는 기술에 의해 달성되는 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.
청구항 69에 있어서, 상기 분석은 다음을 포함하는 과정에 의해 PCR 사전-증폭 및 PCR-플랩 분석을 사용하여 여러 DNA 메틸화 마커를 분석하는 것을 포함하는 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법:
a) PCR 증폭 시약을 포함하는 제1 반응 혼합물에서 복수의 상이한 DNA 메틸화 마커 표적 영역을 포함하는 바이설파이트-처리된 DNA를 제공하는 단계, 여기서 상기 PCR 증폭 시약은 다음을 포함함:
i) 상기 샘플에 존재하는 경우, 상기 바이설파이트-처리된 DNA로부터의 상기 복수의 상이한 표적 영역을 증폭하기 위한 복수의 상이한 프라이머 쌍;
ii) 열안정성 DNA 중합효소;
iii) dNTP; 및
iv) Mg⁺⁺를 포함하는 완충액
b) 상기 제1 반응 혼합물을 열 싸이클링 조건에 노출시키는 단계, 여기서 복수의 상이한 DNA 메틸화 마커 표적 영역은, 샘플에 존재하는 경우, 증폭되어 사전-증폭된 혼합물을 생성하고, 상기 열 싸이클링 조건은 증폭을 지수 범위에서 유지하는 복수의 열 싸이클 또는 20회 미만 또는 15회 미만 또는 10회 또는 그 미만의 열 싸이클에 한정됨;
c) 상기 사전-증폭된 혼합물을 복수의 PCR-플랩 분석 반응 혼합물로 분할하는 단계로서, 여기서 각각의 PCR-플랩 분석 반응 혼합물은 다음을 포함하는 것인, 단계:
i) 상기 단계 a) i)의 복수의 상이한 프라이머 쌍으로부터 선택된 추가 양의 프라이머 쌍;
ii) 열안정성 DNA 중합효소;
iii) dNTP;
iv) 상기 Mg⁺⁺를 포함하는 완충액
v) 플랩 엔도뉴클레아제;
vi) 플랩 올리고뉴클레오티드, 및
vi) 상기 플랩 올리고뉴클레오티드의 일부분에 상보적인 영역을 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드;
및
d) PCR-플랩 분석 반응 동안 상기 바이설파이트-처리된 DNA로부터의 하나 이상의 상이한 DNA 메틸화 마커 표적 영역의 증폭을 검출하는 단계.
청구항 70에 있어서, 상기 바이설파이트-처리된 DNA는 적어도 1 mL 또는 적어도 5 mL 또는 적어도 10 mL의 혈장 샘플로부터 제조되며, 단계 b의 증폭 반응에서 복수의 상이한 DNA 메틸화 마커 표적 영역을 포함하는 상기 바이설파이트-처리된 DNA의 부피는 증폭 반응물의 전체 부피의 적어도 20 내지 50%인 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.
청구항 65에 있어서, ZNF781, BARX1 및 EMX1 로 이루어진 군을 포함하는 상기 복수의 메틸화 마커들이 SOBP 및 HOXA9 중의 하나 이상을 더 포함하는 것인, 혈장 샘플을 분석하는 방법.