JPH0874B2 - 遺伝子発現を検出および変調するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド - Google Patents
遺伝子発現を検出および変調するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドInfo
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Description
発明の分野 本発明はアンチセンスオリゴヌクレチオド治療、診断
および研究試薬に有用なヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレ
チオドの設計、合成および応用に関するものである。ヌ
クレアーゼ分解に耐性であり、DNAおよびRNAの活性を変
調できるピリミジン修飾オリゴヌクレチオドが提供され
る。本発明の修飾オリゴヌクレチオドを使用するタンパ
ク質生産の変調法も提供される。
および研究試薬に有用なヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレ
チオドの設計、合成および応用に関するものである。ヌ
クレアーゼ分解に耐性であり、DNAおよびRNAの活性を変
調できるピリミジン修飾オリゴヌクレチオドが提供され
る。本発明の修飾オリゴヌクレチオドを使用するタンパ
ク質生産の変調法も提供される。
感染性疾患状態を含む哺乳動物の身体状態の多くがタ
ンパク質によって引き起こされることが知られている。
そのようなタンパク質は、直接的またはそれらの酵素機
能を介して、動物および人間の多くの疾患の主要な割合
を占める。 古典的な治療法はそれらのタンパク質での相互作用に
注目し、それらの疾患の発生または機能を広げる疾患の
緩和に努力して来た。しかしながら最近、それらタンパ
ク質の合成を指示する分子、細胞内RNA、との相互反応
によりそのようなタンパク質の実際の生産を緩和する試
みがなされた。タンパク質の生産に干渉することによ
り、最大の効果および最小の副作用の治療結果を生じる
ことが期待された。特定の遺伝子発現を阻害する研究の
ひとつは、アンチセンス剤としてのオリゴヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチド類似体の使用である。 アンチセンス法とは比較的短いオリゴヌクレオチドの
単鎖mRNAまたは単鎖DNAへのハイブリダイゼーションに
より、これら細胞内核酸の正常、必須な機能が破壊され
る。ハイブリダイゼーションはRNAのワトソン−クリッ
ク塩基対または単鎖DNAへのオリゴヌクレオチドの配列
特異的水素結合である。このような塩基対は互いに相補
的であると言う。核酸機能の崩壊を導く自然発生的な出
来事がCohenによりオリゴヌクレオチド：遺伝子発現の
アンチセンス阻害剤（Oligonucleotide:Antisense Inhi
bitor of Gene Expression）（CRC社、ボカ ラトンFL1
989:CRC Press,Inc.,Boca Raton、FL,1989）で述べられ
ている。これらの著者はふたつの可能な終結反応のタイ
プを提案する。第１は、ハイブリダイゼーション制止は
オリゴヌクレオチド阻害剤が結合した標的核酸中での終
結反応を示し、これは単純な立体障害により本質的なタ
ンパク質（多くの場合リボゾームである）の核酸への結
合を妨害する。メチルホスホネートオリゴヌクレオチ
ド；ミラーおよびテスオ（P.S.Miller＆P.O.P.Ts′O,）
Anti−Cancer Drug Design Vo1.2,pp.117−128（198
7）；およびα−アノマーオリゴヌクレオチド、コーエ
ン編集（Cohen J.S.）オリゴヌクレオチド：遺伝子発現
のアンチセンス阻害剤（Oligonucleotide:Antisence In
hibitor of Gene Expression）（CRC社、ボカ ラトンF
L1989）はハイブリダイゼーション制止により核酸機能
が破壊されると思われる、徹底的に研究されたふたつの
アンチセンス剤である。 アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する第二のタイ
プの終結反応は、細胞内RNaseHによる標的RNAの酵素的
開裂が関与する。オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチド類似体は、これらはデオキシリボ型でなければ
ならないが、標的RNAとハイブリダイズし、そしてこの
二重鎖はRNaseH酵素を活性化してRNA鎖を開裂し、すな
わちRNAの正常機能を破壊する。ホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドはアンチセンス剤の顕著な例であり、
このタイプのアンチセンス終結反応により作用する。 注目すべき研究が治療を目的とするアンチセンス剤と
してのオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類
似体の応用に対して向けられている。診断、研究試薬お
よび有力な治療剤としてのオリゴヌクレオチドの応用に
はオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体
が大量に合成できること、細胞膜を通過することまたは
細胞により取り込まれること、標的RNAまたはDNAに適当
にハイブリダイズすること、および核酸の機能を引き続
き終結または破壊することが必要である。このような重
要な機能はヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチ
ドの初期耐性に依存する。 天然に発生するオリゴヌクレオチドおよび存在するオ
リゴヌクレオチド類似体のこれらの目的のための、特に
アンチセンス治療のための重大な欠点は、今後“ヌクレ
アーゼ”という細胞内および細胞外に局在する、偏在す
る種々の核酸溶解（nucleolytic）酵素による投与した
オリゴヌクレオチドの酵素的分解である。非修飾オリゴ
ヌクレオチドはヌクレアーゼにより迅速に分解されるの
で有用な治療薬にはなりそうもない。オリゴヌクレオチ
ドをヌクレアーゼ耐性にするための修飾はそれゆえに大
いなる要望である。 ヌクレアーゼ耐性を増大するためのオリゴヌクレオチ
ドの修飾はこれまで糖−リン酸骨格上で一般的に行わ
れ、特にリン原子上で行われた。ホスホロチオエート、
メチルホスホネート、ホスホアミダイトおよびホスホト
リエステル（リン酸メチル化DNA）は種々の水準のヌク
レアーゼ耐性を有すると報告されている。しかし特異的
DNAまたはRNAヘアンチセンスオリゴヌクレオチドが正確
に結合する能力はアンチセンス法においては基本であ
り、修飾リンオリゴヌクレオチドは種々の程度のヌクレ
アーゼ耐性を提供するが、一般的に劣ったハイブリダイ
ゼーション特性に悩まされる。 この低質なハイブリダイゼーションの理由の一つはリ
ン原子のプロキラルな性質によるものかもしれない。修
飾リンオリゴヌクレオチドの内部リン原子上の修飾は、
RpおよびSp立体異性体を生じる。立体規則性オリゴヌク
レオチド（すべてがRpまたはSpリン酸結合）の実際の合
成は知られていないから、修飾リン原子をもつオリゴヌ
クレオチドはn2個の異性体を有する（ｎはオリゴヌクレ
オチドの長さまたは塩基の数に等しい）。さらにリン原
子上の修飾はホスホジエステル結合について不自然な嵩
を有し、糖−リン酸骨格の配置、および結果的に二重鎖
の安定性に干渉する。リン原子修飾の効果は、同じ標的
に対する非修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイズに
比して標的核酸への低質なハイブリダイゼーションを引
き起こす。 オリゴヌクレオチドが相補的核酸に結合する相対能力
は、特定のハイブリダイゼーション複合体の溶解温度を
測定することにより比較できる。溶解温度（Tm）はダブ
ルヘリックスの物理性質の特徴であるが、コイル（バブ
リダイズしていない）に対して50％ヘリックスが存在す
る時の温度を表す。TmはUVスペクトルを使用してハイブ
リダイゼーションの形成および崩壊（溶解）を決定する
ことにより測定される。ハイブリダイゼーション中に起
こる塩基スタッキングはUV吸収の減少を伴う（濃色効
果）。結果として、UV吸収の減少はより高いTmを指示す
る。高いTmほど鎖の結合力がより強い。非−ワトソン−
クリック塩基対はTmに関し強い不安定効果をもつ。結
局、塩基対の絶対的な正確さは、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドの標的RNAへの至適な結合が得られることが
必要なようである。 メチルホスホネートおよびホスホロチオエートのハイ
ブリダイゼーション特性の重大な減少が報告された:Coh
en,J.S.,編集オリゴヌクタレオチド：遺伝子発現のアン
チセンス阻害剤（Oligonucleotide:Antisense Inhibito
rs of Gene Expression,（CRC出版社、Boca Raton FL,1
989）。さらにメチルホスホネートはRNAと形成する二重
鎖において終結反応であるRNase Hによる分解を活性化
せず、かわりにリゾホーム上に局在するヘリックス溶解
活性によって打ち消され得るハイブリダイゼーション制
止により作用する点に欠点がある。ホスホロチオエート
は多くのヌクレアーゼに高度に耐性である。しかしなが
ら、ホスホロチオエートは典型的には非−アンチセンス
型作用を表し、特に非特異的結合による種々の酵素の阻
害を表す。配列−特異的オリゴヌクレオチドによる酵素
阻害は、アンチセンス化学療法の種々の基礎を危うくす
る。 それゆえに、ヌクレアーゼに耐性を示すように、RNas
e H終結反応を活性化するために、ならびに適当な強さ
および正確さでその標的RNA（またはDNA）とにハイブリ
ダイズする修飾されたオリゴヌクレオチドはアンチセン
スオリゴヌクレオチド診断、治療および研究のために大
いに望まれている。 発明の目的 発明の主要な目的はアンチセンスオリゴヌクレオチド
診断、研究試薬および治療において使用されるオリゴヌ
クレオチド類似体を提供することである。 発明のさらなる目的はDNAまたはRNAの活性を変調する
に効果的なオリゴヌクレチオド類似体を提供することで
ある。 発明のもうひとつの目的は、所望しない、または毒性
の副反応を引き起こすことが少ないと思われるオリゴヌ
クレオチド類似体を提供することである。 さらに発明のもうひとつの目的は、動物の身体状態、
特に疾患状態をアッセイするための研究および診断法お
よび物質を提供することである。 発明のさらなる目的はDNAおよびRNAの活性の変調を通
じて疾患の処置に関する治療および研究法および物質を
提供することである。 これらのおよび他の目的は本明細書および付髄する請
求の範囲の吟味により当業者に明らかなものとなろう。 発明の概要 本発明によれば、ヌクレアーゼ分解に耐性があり、な
らびにDNAおよびRNAの活性を変調する組成物が提供され
る。これらの組成物は、そのなかに修飾されたピリミジ
ン塩基を包含するオリゴヌクレオチドを含み、その標的
部分はDNAおよびRNAの単鎖または二重鎖のあらかじめ選
択されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイゼー
ションできる。ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドは、
単鎖DNAおよびRNAを認識して二重鎖を形成するか、また
は二重鎖DNAおよびRNAと三重鎖を形成する。 ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、結合基を介
して共に連結した核酸塩基の鎖からなる。ヌクレアーゼ
耐性オリゴヌクレオチドの標的部分は約５から約50核酸
塩基の長さの範囲でよい。しかし本発明の好適な様態に
よれば15塩基長の標的配列が至適と思われる。 本発明のピリミジン修飾オリゴヌクレオチドはチミ
ン、ウラシルまたはシトシンのようなピリミジンまたは
グアニンまたはアデニンのようなプリン、またはそれら
の修飾物である塩基を含み、選択配列中に配置される。
このような塩基の糖部分は、デオキシリボまたはリボー
ス糖であってよい。塩基を結合する基はともに通常の糖
リン酸核酸骨格であってよいが、ホスホロチオエート、
メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミ
デートのようなアルキルホスホネート、またはピリミジ
ン修飾オリゴヌクレオチド特性をさらに増大するに有用
な他の修飾骨格で修飾されることができる。例えば、ホ
スホジエステル結合は炭素またはエーテル結合に置き換
える事もできる。 本発明の他の好適様態によれば、標的部分はオリゴヌ
クレオチドの類似体であり、ここで少なくともピリミジ
ン塩基、チミン、シトシンまたはウラシルのひとつが修
飾されと核酸塩基に置換されており、これはワトソン−
クリック水素−結合塩基対則（ＴとＡ、ＣとＧおよびＵ
とＡ）に対して正確であり、さらにオリゴヌクレオチド
に対してヌクレアーゼ耐性を付与する。ピリミジン塩基
または複数のピリミジン塩基の修飾は好ましくはピリミ
ジン環の５または６位で起こる。別法では、ひとつまた
はひとつ以上のピリミジン塩基がピリミジン環の５およ
び６位の双方で修飾されてもよい。 ５および６位で起こり得る置換にはピリミジンの５お
よび６位の炭素原子についてヘテロ原子の付加、または
メチル、ヒドロキシル、エーテル、アルコール、ベンジ
ルまたはフェニル基の付加を含んでもよい。修飾はまた
ニトロ基、チオール基、ハロゲン基またはフルオロカー
ボン基を含むハロカーボン基を含むことができる。択一
的に、修飾はピリミジン環の５および６位への基質の融
合を介して形成される炭素環または複素環であってもよ
い。５および６位で起こる付加は同じであってもなくて
もよい。 生成した新規オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分
解に耐性であり、野生型（DNA−DANおよびRNA−DNA）二
重鎖およびホスホロチオエート、メチルホスホネート、
ホスホアミダイトおよびホスホトリエステルを含有する
現在知られているリン修飾オリゴヌクレオチドアンチセ
ンス二重鎖に比してより高質のハイブリダイゼーション
特性を示す。本発明は生物によるタンパク質生産を変調
する方法も対象とし、生物を前述の考察に従って配合さ
れた組成物に接触させることから成る。変調されるべき
RNAまたはDNA部分は予め選択され、形成が変調されるタ
ンパク質をコードするDNAまたはRNA部分を含むようにす
ることが好ましい。採用されるべき組成物の標的部分
は、すなわち、DNAまたはRNAの予め選択された部分と相
補的になるように選択され、これはその部分に関するア
ンチセンスオリゴヌクレオチドとなる。 本発明はまた所望しないタンパク質を生産することに
よって特徴付けられる疾患をもつ生物の処置法も対象と
する。この方法は生物を前述の考察による組成物と接触
させることから成る。組成物は好ましくは生産が抑制さ
れるタンパク質をコードするメッセンジャーRNAと特異
的に結合するために設計されたものである。 本発明はさらに生物体または細胞中で異常RNA分子ま
たは正常RNA分子の異常または不適当な発現の存在また
は不存在を検出するための診断法を対象とする。 本発明はまた研究および診断の目的のためにRNAの選
択的結合に関する方法も対象とする。このような選択的
な強い結合は、そのようなRNAまたはDNAがヌクレアーゼ
分解耐性で既知のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチド類似体よりも強く且つより正確にハイブリダイ
ゼーションする、本発明の組成物と相互作用することに
よって達成される。 好適な様態の詳細な説明 本発明によるRNAまたはDNA分子の活性変調のために有
用な組成物は、一般的に標的配列のオリゴヌクレオチド
を含有する修飾ピリミジンから成り、これはDNAまたはR
NA分子の単鎖または二重鎖の予め選択されたヌクレオチ
ド配列と特異的にハイブリダイズし、それはヌクレアー
ゼ耐性である。 一般的に合成が最終的に変調または全く抑制されるタ
ンパク質の生産のためのDNAまたはRNA配列、またはそれ
に関与するDNAまたはRNA配列を選択することが望まれ
る。組成物の標的部分は一般的にオリゴヌクレオチド類
似体である。既知の方法論の固相状態合成を介して簡便
に合成さる、相補的になるかまたはRNAまたはDNAの予め
選択されたヌクレオチド配列と少なくとも特異的にハイ
ブリダイズし得るようになる。核酸合成機は市販されて
おり、その使用法は一般的に当業者が所望するであろう
ほぼ任意の妥当な長さのオリゴヌクレオチドを生成する
に効果的であると知られている。 本発明の文脈において、“オリゴヌクレオチド”とい
う用語は天然に存在する塩基からの特別配列中に形成さ
れた複数の連結したヌクレオチド単位、および天然のホ
スホジエステル結合によるヌクレオチド内結合を介した
ペントフルノシル糖基を言う。これらのヌクレオチド単
位はグアニン、アデニン、シトシン、チミンまたはウラ
シルのような核酸塩基であり得る。糖基はデオキシリボ
ースまたはリボース糖であってよい。この用語は天然に
存在するまたは天然に存在するサブユニットからの合成
種の双方を言う。 用語としての“オリゴヌクレオチド類似体”は、本発
明との関連において、オリゴヌクレオチドと同様に機能
するが天然には存在しない部分を有する一部分を言う。
オリゴヌクレオチド類似体は改変された糖部分または糖
−内結合を有し、例えばホスホロチオエートおよび当業
界にて知られた他の硫黄含有種である。オリゴヌクレオ
チド類似体は改変された塩基単位または本発明の精神と
一致する他の修飾も含むことができ、ならびに特にその
ような修飾において、特定オリゴヌクレオチドのアンチ
セン治療、診断または研究試薬使用を利用するために、
オリゴヌクレオチド組成物のヌクレアーゼ耐性を増加で
きる。 本発明のいくつかの態様においては、組成物のヌクレ
アーゼ耐性を増加させるためのに、ヌクレオチド塩基の
ある部分が置換され、一方オリゴヌクレオチド結合能の
完全さが維持されることが一般的に好ましい。そのよう
な置換は、ひとつまたはひとつ以上のピリミジン環の５
または６位においてピリミジン環のこれらの位置の炭素
原子をヘテロ原子に置換することにより生じ得る。択一
的に、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性はピリミ
ジン環の５および６位に置換基を付加することにより増
加できる。 置換基は、メチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコ
ール、エステル、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオー
ル、チオアルコキシ、ハロゲン、ハロカーボン、または
融合炭素環又はヘテロ原子含有種であり得る。本発明の
幾つかの好適な態様によれば、、ピリミジン環の置換は
５または６または５および６双方のアザであり得る。本
発明の他の好適な態様によれば、５または６位に付加さ
れる置換基はひとつまたはそれ以上のニトロー、メチル
ー、ブロモー、イオドー、クロロー、フルオロー、トリ
フルオロー、トリフルオロメチルー、2,4−ジニトロフ
ェニルー、メルカプトー、またはメチルメルカプトー基
であり得る。ヌクレアーゼ耐性に対する使用のために好
適でもある他の付加はエーテル、チオエーテル、アルコ
ールおよびHS−C,MeS−Ｃ−のようなチオアルコール、O
H−Ｃ−,MeO−Ｃ−,HOCH2−Ｃ−およびピリミジン環の
５または６位を介して融合されたシクロペンチル、シク
ロヘキシルおよびイミダソ環であり得る。したがって、
本発明のいくつかの好適な態様には修飾されたピリミジ
ン塩基または構造： を有する塩基が包含され、 ここでＸ＝OHまたはNH2,およびＡおよびＢは同じかま
たは異なっていてもよく、ならびにＣ−低級アルキル、
N,C−CF3,C−F,C−Cl,C−Br,C−I,C−フルオロカーボン
を含むＣ−ハロカーボン、Ｃ−NO2,C−OCF3,C−SH,C−S
CH3,C−OH,C−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−CH2−OH,C−CH2S
H,C−CH2SCH3,C−CH2OCH3,C−NH2,C−CH2NH2,C−アルキ
ル−NH2,C−ベンジル、Ｃ−アリール、Ｃ−置換アリー
ル、Ｃ−置換ベンジル；またはＡおよびＢのひとつが上
記のものであり、他がＣ−H;またはＡおよびＢが一緒に
ＡおよびＢを介してピリミジン環に融合した炭素環また
は複素環の部分である。ＡおよびＢのひとつまたは双方
がＣ−低級アルキル、Ｃ−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−OH,C
−フェニル、Ｃ−ベンジル、Ｃ−ニトロ、Ｃ−チオー
ル,C−ハロカーボン、またはＣ−ハロゲンであることが
好ましい。他の好適な態様によれば、少なくともＡおよ
びＢのひとつがＣ−ハロゲンまたはＣ−フルオロカーボ
ン、特にＣ−トリフルオロメチルを含むＣ−ハロカーボ
ンである。他のフルオロカーボンはＣ−Ｃ（CF3）3,C−
CF2−CF3,およびＣ−CF2−CF2−CF3である。ハロゲンは
フッ素、臭素、塩素およびヨウ素を含む。その他の好適
な態様によればＡおよびＢのうちひとつまたは双方は窒
素原子である。Ａが窒素原子であることがなお一層好ま
しい。他の態様によれば、ＡはＣ−CH3,またはＣ−CF3
且つＢは窒素、またはＡはＣ−Br且つＢは窒素である。 少なくともひとつの修飾ピリミジンが該オリゴヌクレ
オチド類似体の一つの末端に存在することが好ましく、
特に該オリゴヌクレオチドの３′末端が好ましい。他の
好適な態様によれば、オリゴヌクレオチドは該オリゴヌ
クレオチドの３′末端に最高３つの修飾ピリミジンを含
有する。他の態様において少なくとも約１％の該ピリミ
ジンが修飾される。他の態様によれば大量の修飾、例え
ば少なくとも該ピリミジンの約10％以上、すなわち25
％,50％でさえも、または実質的に該ピリミジンの全部
を有することが好ましい。 修飾ピリミジンに結合した糖部分はリボースまたはデ
オキシリボース糖のいずれかであってよい。修飾ピリミ
ジンの糖結合基はホスホロチオエート、メチルホスホネ
ート、ホスホアミダイト、ホスホトリエステルを含むア
ルキルホスホネートまたはリン酸アルキレート構造にも
修飾されることができる。他の態様において、オリゴヌ
クレオチド類似体は、炭素またはエーテル結合に置換さ
れた修飾ピリミジンの糖結合基を有することができる。 治療のためには、薬学的に受容できるキャリアー中に
オリゴヌクレオチド類似体が調製されることが便利であ
る。 本発明のいくつかの態様によれば、さらに修飾された
ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドを採用することが好
ましい。この意味において、ピリミジン修飾オリゴヌク
レオチド類似体とは一般的に天然のオリゴヌクレオチド
と同様であるが、ひとつまたはそれ以上の有意な方法で
修飾されたものを言う。 そのような修飾は発明の糖骨格において起こる。ピリ
ミジン修飾オリゴヌクレチオドの標的配列がメッセンジ
ャーRNAおよびDNAが存在する（これは全組成物の標的で
ある）細胞の細胞内空間に浸透する能力を増強すること
が好ましい。それゆえにオリゴヌクレオチドが細胞内空
間に浸透しやすくするために一般的にオリゴヌクレオチ
ドに修飾を施して、実質的に天然の形態よりも少ないイ
オン性であることが好ましい。この目的を達成するため
の現存する、または今後開発されるであろう方法は本発
明の実施に従い採用されるであろう。現在ではホスホジ
エステル結合への置換が好ましいと見いだされている
が、この置換は天然に存在する結合よりもより少ないイ
オン性であるばかりでなく、実質的に非−キラル性であ
る。理解されることであろうが、ホスホジエステル結合
のリン原子は“プローキラル”である。メチルホスホネ
ートおよびホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドに
おいて行われるようなリン位での修飾は、本質的にキラ
ル構造を生じる。キラリティーは各々のキラル中心で細
胞内分子と異なる反応をするであろうふたつの異性体を
生じる。このような未分離の異性体混合物は生成した組
成物が細胞内空間へ運搬されることを阻害、または特異
的標的であるRNAまたはDNAに対するハイブリダイゼーシ
ョンの親和性または特異性を減少させ得る。すなわち、
すべて、またはいくつかのホスホジエステル結合の代わ
りに実質的に非−イオン性、実質的に非−キラルな実在
物を採用することが好ましい。この目的に関して、短鎖
アルキルまたはシクロアルキル構造、特にC2−C4構造が
好ましい。酸素官能性のひとつの除去を含む糖構造の修
飾はそのような実質的に非−キラル、非−イオン性の置
換体をこの位置に導入することを可能とする。 本発明の目的を達成するために、Ｓ−P,Me−P,MeO−
ＰまたはH2N−Ｐ（これはホスホロチオエート、メチル
ホスホネート、ホスホトリエステルまたはホスホアミダ
イト）をＯ−Ｐ（ホスホジエステル結合）と置換するこ
とが意図される。これらの置換の幾つかの場合は、ピリ
ミジン修飾オリゴヌクレオチド特性を増強するものと思
われる。 本発明の組成物の標的部分は、好ましくは５から約50
塩基単位を有するオリゴヌクレオチド類似体である。よ
り好ましくは、このような官能性は８から約40塩基単位
を有し、そしてさらに好ましくは約12から約20塩基単位
が採用されるべきである。約15塩基単位を有するオリゴ
ヌクレオチド類似体は本発明の特定の態様の実施に好ま
しい。 標的部分は変調のために選択されたRNAまたはDNAの予
め選択されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイ
ズできるように適合される。本発明のひとつまたはそれ
以上の態様の実施のために特に適するオリゴヌクレオチ
ド類似体は、修飾されたリボースまたはデオキシリボー
スピリミジンのひとつまたはそれ以上のサブユニットか
ら成る。ピリミジン環の５または６位で起こり得る置換
はメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコール、ベン
ジルまたはフェニル基の付加を含んで良い。この修飾は
ニトロ基、チオール基またはハロゲン基の付加も含むこ
とができる。択一的に、この修飾は５および６位に融合
した炭素環またはヘテロ原子含有環であ得る。５および
６位に起こる付加は同じであってもなくても良い。 これらの修飾された塩基は互いに結合し、ならびに糖
結合基を介してオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチド類似体の残部と結合する。結合基はここに記載さ
れた構造の任意のものでよく、オリゴヌクレオチドの糖
部分と結合でき、本発明の組成物の標的部分を形成す
る。これらの糖結合基はホスホジエステル構造またはそ
のような誘導体から成ることが好ましい。ホスホジエス
テル構造の誘導体には、硫黄、メチル、メチル酸化物ま
たは酸素についてはアミン基を含むことができる。糖リ
ン酸核酸骨格はホスホロチオエート、メチルホスホネー
ト、ホスホアミダイトまたはホスホトリエステル部分と
して修飾できる。ホスホジエステル結合または炭素また
はエーテル結合に置換されることもできる。 本発明の他の態様によれば、結合部分は、修飾したピ
リミジンと修飾オリゴヌクレオチドの３′終結末端との
直接的な付着を可能とするように考案された。すなわち
ブロモメチルケト基のようなエステル前駆体は、ジメト
キシトリチル基（ジメトキシトリフェニルメチル基）で
５′−ヒドロキシ保護を有する修飾されたピリミジンヌ
クレオチドの３′−ヒドロキシルに付加でき、必要であ
れば例えばヌクレオシドのシトシン系についてはベンゾ
レート保護基のような適当な保護基で保護されたピリミ
ジン複数環である。もし標的配列が終結３′−チミンま
たは−シトシン塩基を有するならば、ブロモメチルケト
リンカーを含有する所望の修飾チミンまたはシトシン塩
基は、３′−ヒドロキシル基を介して結合した正常ヌク
レオチドを含有する調節ポアーガラス（CGP）固体支持
体へ付着させるための第一単量体として利用できる。修
飾したピリミジンとCPGに付着したヌクレオシドろ付着
させるエステル結合に感受性の塩基は通常の濃水酸化ア
ンモニウム条件下で開裂でき、これはCGP支持体からオ
リゴヌクレオチドを回収するために利用される。これは
修飾したチミンまたはシトシンをその３′−末端に有す
る修飾オリゴヌクレオチドを可能にするであろう。 核酸溶解酵素によるオリゴヌクレオチドの開裂には、
酵素−基質複合体、またはとくにヌクレアーゼ−オリゴ
ヌクレオチド複合体の形成が必要である。ヌクレアーゼ
酵素は適当な付着に関してオリゴヌクレオチド上に局在
する特異的結合部位が必要である。ヌクレアーゼがオリ
ゴヌクレオチドに付着しないようにもしオリゴヌクレオ
チド結合部位が除去されたり隠されたりすると、ヌクレ
アーゼ耐性オリゴヌクレオチドが生じる。配列−特異的
回文的二重鎖DNAを開裂する制限エンドヌクレアーゼの
場合は、特定の結合部位、例えばプリン環の３−および
７−位の窒素原子が結合部位として必要であると同定さ
れている。これらの部位をひとつまたはそれ以上の除去
またはヌクレアーゼが認識配列中のこれらの特別な位置
へ接近することを妨害することにより、特異的ヌクレア
ーゼに対する種々の水準の耐性が提供された。 不規則な構造−活性関連性に関する研究が行われ、適
当なハイブリダイゼーション特性を維持するヌクレアー
ゼ耐性アンチセンスオリゴヌクレオチドが見いだされ
た。チミンおよびシトシンのリボヌクレオシドおよびデ
オキシリボヌクレオシドの５−および／または６−位に
対する一連の修飾が行われた。これらの修飾ヌクレオシ
ドは配列−特異的オリゴヌクレオチドに固相核酸合成を
通じて挿入された。新規アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドはそれらのヌクレアーゼによる分解耐性能力および修
飾していない親のオリゴ−ヌクレオチドに比較してのハ
イブリダイゼーション特性がアッセイされた。なぜなら
核酸ピリミジン位置の５−および６−位の好適な態様が
選択された末端修飾およびこれらの位置でのアザ／デア
ザのような環修飾は、必要なワトソン−クリック塩基対
水素結合パターンに立体的に干渉するとは思われないか
らである。しかしながら、環系においてすでに発見され
た電気的変化はそのような見かけは重要ではない複素環
変化から生じる。これらの電気的変化は二極モーメント
を芳香族系に加え、ならびに／または存在する二極モー
メントの方向および強さを変えることができる。PKa強
度は電気的摂動により影響されるであろう。アザ／デア
ザでの末端または環変化は環系の求電子性および求核性
を変化させて（ヌクレアーゼの分解活性のためにはオリ
ゴヌクレオチドの核酸塩基に対して共有結合形成が要求
されるが）、ヌクレアーゼが作用しないようにできる。 構造活性の関連性を研究している中、ピリミジン、チ
ミン、シトシンおよびウラシルの５−および／または６
−位における末端およびアザ／デアザ修飾がヌクレアー
ゼ耐性を提供し、これはヌクレアーゼ耐性であると知ら
れているホスホロチオエートに匹敵し、さらに修飾した
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性は未
修飾の親オリゴヌクレオチドと同様かより良かった。 本発明のいくつかの態様において、ピリミジン核塩基
の修飾は修飾されるべきアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの約50％となるであろう（４つのうちの２つの塩基が
可能である）。６−アザ−チミンおよび６−アザ−シト
シン（15塩基のうちの８）に置換されたすべてのチミン
およびシトシンを有する修飾配列は、未修飾の親配列に
比べてTmが約10％低いヌクレアーゼ耐性を表した。ヌク
レアーゼ耐性および結合安定性の好適な組み合わせは、
オリゴヌクレオチドの３′−末端に１から３の修飾ピリ
ミジンを配置することから生じる。 本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、診断、治療、
研究試薬として、およびキットに使用できる。治療のた
めの使用に関し、オリゴヌクレオチド類似体はあるタン
パク質によって生じた疾患にかかっている動物に投与さ
れる。そのような疾患にかかっていると疑われる患者に
その疾患の症状を減少するのに効果のあるオリゴヌクレ
オチド類似体の量を投与することが好ましい。そのよう
な処置法に関する至適な投与量および処置計画を決定す
ることは当業者に既知の範囲内である。 本発明の治療剤は経口、静脈内または筋肉内のように
内部適用されることが好ましい。経皮、局所または損傷
部内などの投与の他の形態も有用である。座薬中の包含
物としても有用である。薬学的に受容できるキャリアー
もある態様においては有用である。 実施例 実施例１ ６−アザ−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメチ
ル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプロピルホ
スホアミジチル）チミジンの合成、即ち ６−メチル−２−（５′−０−ジメトキシトリフェニ
ルメチル−３′−０−β−シアノエチルジイソプロピル
ホスホアミジチル−２′−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ
−ペントフラノシル）−1,2,4−トリアジン−3,5（2H、
4H）−ジオン A.6−メチル−3,5−ビス（トリメチルシロキシ）−1,2,
4−トリアジンの合成 濃縮器および乾燥管に取り付けられた丸底フラスコ中
（50ml）の６−アザチミン（アルドリッチ化学社から購
入）（5.0g、39.4mmol）、ヘキサメチルジシラザン（HM
DS）（15ml），およびクロロトリメチルシラン（TMSC
l）（0.5ml）混合物を油浴中にて加熱（150℃）により
還流する;NH4Clを白色粉末として濃縮器中に回収する。
透明な溶液が得られた時（〜１時間）、過剰のHMDS/TMS
Clを30℃／トル（浴温度100℃）で蒸留により除去し
た。残渣油は真空下（0.1トル）の乾燥で結晶化し6.57g
（61％）の６−メチル−3,5−ビス（トリメチルシロキ
シ）−１、２、４−トリアジンを得た、mp43℃。 B.2−（２デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β
−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−６メチル−1,2,
4−トリアジン−３、５（2H、4H）−ジオンの合成 乾燥CHCl3（300ml）中の６−メチル−3,5−ビス（ト
リメチルシロキシ）−1,2,4−トリアジン（4.0g,14.7mm
ol）および２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイ
ル−ａ−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロライド
（4.8g12.4mmol）を無水状態で室温で撹拌した。Cul
（2.4g,12.4mol）をこの溶液に加え、生成したスラリー
を３時間環境温度で撹拌し、このとき薄相トロマトグラ
フィー（TLC）にて反応が完了した事が示された。混合
物を飽和水性NaHCO3（200ml）で処理し、15分間撹拌
し、CH3Clで洗浄した（２×50ml）セライトのパットを
通して濾過した。有機相を飽和NaCl（200ml）で洗い、
乾燥（MgSO4）および濃縮して粘着性の残渣を得た。こ
の物質は本質的にTLCで１スポットであった。EtOAc/ヘ
キサン（1:1）を使用して短いシリカゲルカラムを通し
て迅速な濾過を行い、所望の幾つかの化合物の画分を得
た。EtOHからの残渣の結晶化は白色針状の生成物を与え
た:3.64g（63％）、mp170℃。第二群は濾過物より回収
した（730mg,12.6％）。 C.6−アザチミジン［２−（２−デオキシ−β−Ｄ−エ
リスロ−ペントフラノシル）−６メチル−1,2,4−トリ
アジン−３、５（2H、4H））−ジオン］の合成 無水MeOH（15ml）中のブロックされたヌクレオシド、
２−（２−デオキシ−３、５、−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイ
ル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−６−メチ
ル−1,2,4−トリアジン−３、５（2H、4H）−ジオン、
上記（480mg,1mmol）に乾燥NaOMe（50mg）を加え、室温
で攪拌した。１時間後のTLCはトルオイル基の完全脱ブ
ロッキングを示した。溶液を1mlのDowex−50（水素型）
イオン交換樹脂を添加することにより中性にした。懸濁
液を濾過し、濾過物を乾燥するまで減圧下で蒸発させ
た。残渣を水（3ml）に溶解し、CHCl3で洗浄した（３×
5ml）。水性相は凍結乾燥させ、堅い泡（hard foam）を
与え、さらに0.1トルの真空デシケーター中でP2O5上で
乾燥させた。化合物は96％の収率で得られ（230mg）文
献値と比較した時、例えばUV,NMR,TLCおよびmpが同一で
あった。 D.2−［２−デオキシ−５′−（４、４′−ジメトキシ
トリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−
６−メチル−1,2,4−トリアジン−３、５（2H、4H）−
ジオンの合成（６−アザチミジン５′−DMT） 上記のように合成した乾燥ピリジン（100ml）中のア
ザチミジン（2.43g,10mmol）の攪拌した溶液に、4,4′
−ジメトキシトリチルクロライド（4.06g、12mmol）お
よび４−ジメチルアミノピリジン（120mg,1mmol）を室
温で加えた。生成した黄色い溶液を６時間室温で攪拌
し、この時TLCでは反応が完了したことを示した。MeOH
（10ml）を加え溶液を真空で濃縮した。残渣をCH2Cl
2（200ml）に溶解し、飽和NaHCO3（100ml）、次いで飽
和NaCl（100ml）で抽出し、次ぎに乾燥した（MgSO4）。
濾過物および洗浄物を混合し、濃縮して粘着性の残渣を
得、EtOAc/トリエチルアミン（99/1）を使用してシリカ
ゲルクロクトグラフィーで溶出にし精製した。適当な分
画がプールされ、濃縮されて白色泡（3.82g70％）を得
た:1H NMR（CDCl3）6.56（t,1H,C1,H）および他のプロ
トン。 E.2−［２−デオキシ−５′−（４、４′ジメトキシト
リチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−６
−メチル−1,2,4−トリアジン−３、５（2H、4H）−ジ
オン３′−Ｏ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエ
チル−ホスホアミダイトの合成 上記合成６−アザチミジン５′−DMT,の攪拌した溶液
に（乾燥THF50ml中の1.63g3mmol）、ジイソプロピルエ
チルアミン（1.56ml,9mmol）を加え、溶液を０℃に冷却
した。塩化N,N−ジ−イソプロピル−β−シアノエチル
ホスホンアミド（1.42ml,6mmol）を滴下により上記溶液
に15分間にわたって加えた。反応混合物を次ぎに室温で
２時間攪拌した。酢酸エチル（100ml,1％のトリエチル
アミンを含有する）を加え、溶液を飽和NaCl溶液（２×
100ml）で洗浄した。有機相を乾燥（HgSO4）し、溶媒を
真空下で除去し、粘着性残渣を得た。精製物をEtOAc/ト
リエチルアミン（99/1V/V）を使用するシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーで溶出し精製した。適当な画分を
プールし濃縮して白色泡1.41g（66％）を得た;1H NMR
（CDCl3）δ6.65（m,l,C1H）、10.2（brs,l,NH）および
他のプロトン。 ６−アザ−ピリミジンの他の種類は６−アザ−２′−
デオキシシチジン（６−Aza dC）,6−アザ−２′−デオ
キシウリジン（６−Aza dU）,6−アザ−５−メチルシチ
ジン（６−Aza−５−メチルＣ）,6−アザ−５−ブロモ
ウリジン（６−アザ−５−ブロモＵ）,5−フルオロシチ
ジン（５−フルオロＣ）および５−ブロモシチジン（５
−ブロモＣ）を含む手順を使用して合成できる。加え
て、５−アザウリジンは開始物質1,3,5,−トリアジン−
2,4（1H,3H）−ジオン（シグマ化学）から同様に合成で
きる。 実施例２ ５−および／または６−修飾チミンおよびシトシン２′
−デオキシリボヌクレオシド−５′−DMT−３′−ホス
ホアミダイトからオリゴヌクレオチドへの転換法 表ＩはCGP支持体上でのDNA合成手順に関して示してい
る。５−および／または６−修飾チミン、シトシン５′
−ジメトキシトロフェニルメチル−２′−デオキシリボ
ヌクレオシドの合成前に、すなわち一般的に複素環およ
び／または糖において修飾を有する任意のヌクレオシド
を、そのような修飾ヌクレオシドをオリゴヌクレオチド
配列の各３′末端に付着するためにCPG支持体に結合し
たヌクレオシドの５′−ヒドロキシルへ結合させる事が
できる。 あるアンチセンスオリゴヌクレオチドの終結３′−位
に存在するであろう修飾したチミジンまたは２′−デオ
キシシチジンは、それらの５′−DMT（シトシン４−エ
キソサイクリックアミノはヘンゾイル化されている）に
より保護され、ピリジンおよびジメチルアミノピリジン
中でトリフルオロ酢酸／ブロモ酢酸混合無水物で50℃で
５時間処理される。溶液を減圧下で蒸発させ、酢酸エチ
ルに溶解した薄いシロップとしシリカゲルのカラムに通
す。均一の画分を集めて、乾燥するまで蒸発させた。10
mlのアセトニトリル溶液、10マイクロモルの３′−０−
ブロモメチルエステル修飾ピリミジンヌクレオシドおよ
び1mlのピリジン／ジメチルアミノピリジン（1:1）をゆ
っくりと（60から90秒）１マイクロモルのCPGチミジン
のカラム（遊離の５′−ヒドキシル基を与えるための標
準的条件にしたがった酸処理を予め行ったもの：アプラ
イドバイオシステムズ社）に注入して通す。CPGカラム
に結合した他のヌクレオシドも採用できるであろう。溶
出液を集めて、カラムに再び注入して通す。この工程を
３度繰り返す。CGPカラムを10mlのアセトニトリルでゆ
っくりと洗浄し、次にABI380B核酸合成機につける。表
Ｉに記載されたオリゴヌクレオチド合成が今開始され
る。CGP支持体からチミジンエステル結合を開裂する濃
水酸化アンモニウム脱保護の標準条件は、ピリミジン修
飾ヌクレオシドCPGヌクレオシドに始めに結合したチミ
ジンとを連結するエステル結合も開裂する。 DNAの標準的合成は表Ｉにしたがって、支持体上の１
−10マイクロモルのヌクレオシドを使用して、CPG LCAA
上で完了できる。ヌクレオシドに結合したポリマーはア
プライドバイオシステム社から購入した。合成は自動合
成機（ABI380B）を使用して連続流（3.0−3.5ml/min）
で完了した。ホスホアミダイトの縮合は乾燥窒素下で行
った。合成の完了時に、オリゴヌクレオチド開裂および
脱保護を濃アンモニアで55℃、24時間処理して行った。
最終生産物の純度および大きさはポリアクリルアミドゲ
ルの電気泳動的分析で確認した。 合成サイクルは４つの基本的な工程が組合わされてい
る:1）５′−ジメトキシトリチル保護基を除去するため
の酸処理;2）DNAについてのヌクレオシド−３′−ジイ
ソプロピルホスホアミダイトでのポリマー結合ヌクレオ
シドの縮合、および３）酸化、アセトニトリル中のヨー
ドおよび水を使用してホスファイト結合をホスフェイト
結合に変換する；および４）無水酢酸でのキャッピング
およびDMAPでの未反応部位のブロックオフ（block of
f）および残存湿度の除去。 自動合成機により所望の配列を集成させた後、最終生
産物をポリマーから開裂させ、脱保護し単離した。 脱保護はポリマー支持体を水酸化アンモニウム（NH4O
H）で55℃,20時間処理することにより行った。粗物質は
HPLC上のトリチル−により精製した。脱トリチル化は３
％酢酸エチル続いて酢酸エチルでの抽出で行った。精製
は塩化ナトリウム／エタノール沈殿（２×）およびHPCL
により行った。すべての上記混合配列は試料のリン酸転
移（kinasing）および大きさの測定により特性決定し
た。 実施例３ 以下に掲げる６−アザ−チミン−修飾オリゴヌクレオ
チドの合成は実施例２に従って行われ、５−および／ま
たは６−修飾チミンまたはシトシン５′−ジメトキシト
リフェニルメチル−２′−デオキシリボヌクレオシド
の、CPGに結合したヌクレオシドの５′ヒドロキシルへ
の付着が提供された。実施例１において提供された方法
に従って合成されたホスホアミダイトは以下の配列を有
するオリゴヌクレオチドに含有され、それらのヌクレア
ーゼ耐性特性ゆえに有用である。 実施例４ 以下に掲げる６−アザ−シトシン−修飾オリオヌクレ
オチドの合成は実施例２に従って行われ、５−および／
または６−修飾チミンおよびシトシン２′−デオキシリ
ボヌクレオシド−５−DMP−３′−ホスホアミダイトオ
リゴヌクレオチド中へ転換法が提供された。実施例１に
おいて特定された方法に従って合成されたホスホアミダ
イトはヌクレアーゼ耐性を増加させるために以下の配列
野生型塩基から置換される。 実施例５ ５−および／または６−位修飾チミンの対応するチミ
ジンへの転換（デオキシリボシレーション） チミン類似体を、たとえばヘキサメチルジシラザン
（HMDS）および酸触媒（即ち、塩化アンモニウム）のよ
うな種々の標準的条件下でトリメチルシリル化し、次に
3,5−０−ジトルオイル−２−デオキシ−ａ−Ｄ−エリ
スロ−ペントフラノシルクロライドで種々のルイス酸触
媒（即ち、塩化第二スズ、ヨード、ホウ素、テトラフル
オホウ酸塩等）の存在下において処理した。特異的な方
法が最近フレスコス（J.N.Freskos）により記載された,
Nucleosides＆Nucleotides,8:1075−1076（1989），こ
れには銅（Ｉ）ヨウ化物が触媒として採用されている。 実施例６ ６−アザ−５−ブロモ−５′−０−（ジメトキシトリ
フェニルメチル）−３′−０−（β−シアノエチルジイ
ソプロピルホスホアミジチル）−２′−デオキシウリジ
ンの合成、即ち６−ブロモ−２−（５′−Ｏ−［ジメト
キシトリフェニルメチル］−３−０−［β−シアノエチ
ルジイソプロピルホスホアミジチル］−２′−デオキシ
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−1,2,4−ト
リアジン−3,5−（2H,4H）−ジオン 必要な複素環、６−ブロモ−1,2,3−トリアジン−3,5
（2H,4H）−ジオンをクリステスク（C.Cristescu）,Re
v.Roumanie Chim.20:1287（1975）に従って調製した。
この物質のデオキシリボシレーションおよび引き続きの
DMTおよびアミダイト化学は、実施例1,2および５に説明
したように行った。 実施例７ ５−および／または６−位修飾チミジンの対応する
２′デオキシシチジンへの転換（ピリミジン型４−ケト
基から４−アミノ基への化学転換） 修飾チミジン型の３′,5′−糖水酸基を、トルオイ
ル、ベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイル、アセチル、イ
ソブチル、トリフルオロアセチル等で、酸クロライドま
たは無水物、およびピリジン／ジメチルアミノピリジン
溶媒および触媒を使用して保護する。保護されたヌクレ
オシドはピリジンまたは他の適当な塩基性溶媒中の塩化
チオニルまたは塩化ホスホリルで塩素化する。ピリミジ
ン型４−塩素基はつぎにメタノール中のアンモニウムで
置換される。糖水酸基の脱保護もまた起こる。アミノ基
は標準的な２段階の完全ベンジレーションによりベンゾ
イル化され（糖水酸基およびアミノ基ならびにアシル基
は水酸化ナトリウム溶液により選択的に除去される。択
一的に、ヌクレオシドをクロロトリメチルシランで第一
に処理するin situ工程および引き続きアシレーション
から糖水酸基を保護するための塩基を採用できる。もう
ひとつの転換法はピリミジン型４−塩素基を1,2,4−ト
リアゾロ基（DNA合成機上にオリゴヌクレオチド合成を
通じて完全に維持され、オリゴヌクレオチドをCPG支持
体から除去し複数環の脱保護をおこなう水酸化アンモニ
ウム工程中のアンモニウムにより置き換えられる）で置
換する。さらに多くの場合、ピリジン型４−塩素基は単
に記載され、オリゴヌクレオチド合成の最後に置換され
るものとして利用され得る。５−アザ−シチジンおよび
５−ニトロ−シチジンはそのウリジン類似体に従って得
ることができる。同様に、４−クロロ−５−メチルメル
カプトシチジンは記載のごとく合成される。 実施例８ ６−アザ−５−ブロモ−５′−０−（ジメトキシトリ
フェニルメチル）−３′−０−（β−シアノエチルジイ
ソプロピルホスホアミジチル）−２′−デオキシシチジ
ンの合成、即ち５−アミノ−６−ブロモ−２−（５′−
０−ジメトキシトリフェニルメチル−３′−０−β−シ
アノエチルジイソプロピルホスホアミジチル−２′−デ
オキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフルオロシル）−1,
2,4−トリアジン−３（2H）−オン この単量体はデオキシリホシル化６−ブロモ−1,2,3
−トリアジン−3,5（2H、4H）−ジオン（実施例７に従
う）を実施例５による２′−デオキシシチジン類似体へ
の転換により調製される。 実施例９ 1.5−トリフルオロ−５′−０−（ジメトキシトリフェ
ニルメチル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプ
ロピルホスホアミジチル）−２′−デオキシウリジンの
合成、即ち１−（５′−［４、４′−ジメトキシトリチ
ル］−２′−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラ
ノシル）5,5,5−トリフルオロチミン トリフロオロチミジン（1,2.0g），（PCR社、グラン
スビル、FLから購入）を２度ピリジンと共蒸発させ、つ
いで無水ピリジン（100ml）中にアルゴン雰囲気下で溶
解した。4,4′−ジメチルアミノピリジン（50mg）およ
び4,4′−ジメトキシトリチルクロライド（2.74g）を連
続的に溶液に加えて、次に室温で６時間攪拌した。反応
混合物を100mlの水で処理しジエチルエーテル（４×100
ml）で繰り返し抽出した。エーテル抽出物をプールし、
硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し次に蒸発させオレ
ンジガムを得た。このガムはトルエンと共蒸発させ（３
×25ml）次に酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン
（49/49/2,V/V）を溶出液として使用する120mgのシリカ
ゲルカラム上でクロマトグラフィーを行った。適当な画
分をプールし、蒸発させて0.77gの（19％）の固形泡を
得た。1H−NMR（DMSO−d6）δ8.05（s,1H,H−６）;7.4
−6.7（2m,13H,芳香族）;6.05（t,1H,H−１′）。 2.1−（５′−［4,4′−ジメトキシトリチル］−２′−
デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−5,
5,5−トリフルオロチミン−３′−０−N,N−ジイソプル
ピル−β−シアノエチルホスホアノダイト（３）の合成 無水THF中の５−トリフルオロ−５′−０−（ジメト
キシトリフェニルメチル）−３′−０−（β−シアノエ
チルジイソプロピルホスホアミジチル）−２′−デオキ
シウリジン、即ち１−（５′−［4,4′−ジメトキシト
リチル］−２′−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペント
フラノシル）−5,5,5−トリフルオロチミン（２）（0.7
0g,1.2mMol）攪拌溶液中に、ジイソプロピルエチルアミ
ン（1.0ml）をアルゴン雰囲気下で加えた。この溶液
に、塩化N,N−ジイソプロピルシアノエチルホスホアミ
ダイ（0.33ml,1.44mMol）を５分間にわたって滴下し
た。この混合物を室温で３時間攪拌した。この終わりの
時に、反応混合物を乾燥するまで真空で蒸発させ、生成
した粘性残渣をCH2Cl2（75ml）に溶解した。溶液を飽和
NaHC03（２×35ml）および塩水（35ml）で洗浄した。有
機相を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過およ
び真空で蒸発させ無色のガムを得た。この物質をCHCl3/
トリエチルアミン（99/1,V/V）を溶出液として使用する
60gのシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行っ
た。適当な画分をプールし、蒸発させて無色泡を得た
（0.6g,67％）。1H−NMR（DMSO−d6）δ8.15（s,1H,H−
６）;7.4−6.8（1m,13H,芳香族）;6.05（t,1H,H−
１′）。このホスホアミダイトは引き続き実施例２に説
明したオリゴヌクレオチド中に包含された。幾つかの例
は次のとおりである。 実施例10 ５−フルオロ−５′−０−（ジメトキシトリフェニル
メチル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプルピ
ルホスホアミジチル）−２′−デオキシウリジンをグレ
ンリサーチ社（Glenresearch Corporation）から購入し
た。これは以前オリゴヌクレオチドに挿入された。ハー
ベナー（J.F.Harbener）Proceedings of National Acad
emy of Science of the U.S.A.,85:1735−1739（198
8）。幾つかの例を以下に掲げる。 実施例11 ５−ブロモ−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメ
チル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプロピル
ホスホアミジチル）−２′−デオキシウリジン（これは
グレンリサーチ社から購入）を実施例２に説明した手順
にしたがって合成する間に、オリゴヌクレオチド中に挿
入した。 実施例12 ５−ブロモ−２′−デオキシシチジン−修飾オリゴヌ
クレオチド（以下に掲げる）の合成は実施例２に説明し
た方法で達成した。 実施例13 ５−メチル−２′−デオキシシチジン−修飾オリゴヌ
クレオチド（以下に掲げる）の合成は実施例２に説明し
た方法で、野生型シチジン塩基を５−メチル−２′デオ
キシシチジン（これはグレンリサーチ社から購入した）
に置換して達成した。 実施例14 ５−イオド−２′−デオキシウリジン−修飾オリゴヌ
クレオチド（以下に掲げる）の合成は実施例２に説明し
た方法で、野生型ウリジン塩基を５−イオド−２′デオ
キシウリジン（これはグレンリサーチ社から購入した）
に置換して達成した。 実施例15 ５−イオド−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメ
チル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプロピル
ホスホアミジチル）−２′−デオキシシチジンの合成は
実施例２および７に説明された方法を利用して達成され
た。 実施例16 ５−クロロ−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメチ
ル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプロピルホ
スホアミジチル）−２′−デオキシウリジンの合成 ５−クロロウラシルはアルドリッチ化学社から入手で
きる。この物質は実施例1,2および５に説明された方法
をに従って表題のホスホアミダイトに転換される。 実施例17 ５−クロロ−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメ
チル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプロピル
ホスホアミジチル）−２′−デオキシシチジンの合成は
実施例２および７に説明された方法に従って達成され
た。 実施例18 ５−ニトロ−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメチ
ル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプロピルホ
スホアミジチル）−２′−デオキシウリジンの合成 ５−ニトロウラシルはアルドリッチ化学社から入手で
きる。この物質は実施例1,2および５に説明された方法
に従って表題のホスホアミダイトに転換される。 実施例19 ５−（2,4−ジニトロフェニルメルカプト−５′−０−
（ジメトキシトリフェニルメチル）−３′−０（β−シ
アノエチルジイソプロピルアミノホスフィニル）−２′
−デオキシウリジンの合成 ５−メルカプト−２′−デオキシウリジン（Foxらの
方法、Journal of the American Chemical Society81:1
78（1959）によって得た）を等量の水素化ナトリウムお
よび2,4−ジニトロフェニルフルオライドで処理するこ
とにより2,4−ジニトロフェニルスルフィニル誘導体に
転換する。この物を質実施例１に説明されたように５′
−DMT3′−ホスホアミダイトに転換する。 実施例20 ４−クロロ−５−（2,4−ジニトロフェニルメルカプト
−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３′
−０−（ｂ−シアノエチルジイソプロピルアミノホスフ
ィニル）−２′−デオキシシチジンの合成 ５−メルカプト−２′−デオキシウリジン（Foxらの
方法、Journal of the American Chemical Society81:1
78（1959）によって得た）を等量の水素化ナトリウムお
よび2,4−ジニトロフェニルフルオライドで処理して2,4
−ジニトロフェニルスルフィニル誘導体に転換する。こ
の物質をアセチル化、塩素化および実施例１および５に
説明されたように５′−DMT−３′−ホスホアミダイト
に転換する。 実施例21 ５−メチルメルカプト−５′−０−（ジメトキシトリフ
ェニルメチル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソ
プロピルアミノホスフィル）−２′−デオキシウリジン
の合成 ５−メルカプト−２′−デオキシウリジン（Foxらの
方法、Journal of the American Chemical Society81:1
78（1959）によって得た）を等量の水素化ナトリウムお
よびヨウ化メチルで処理してメチル誘導体に転換する。
この物質を実施例１に説明された方法に記載されたよう
に５′−DMT−３′−ホスホアミダイトに転換する。 実施例22 ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドがそれらの相補的
RNAまたはDNA配列にハイブリダイズする能力を熱溶解分
析で決定した。RNA相補体はT7RNAポリメラーゼで合成
し、DNAの鋳型−プロモーター（tmplate−promoter）は
アプライドバイオシステム社の380Bで合成した。RNA種
はFPLC（LKB−ファルマシア社）を使用してイオン交換
により精製した。天然アンチオリゴヌクレオチドまたは
ピリミジン修飾を特異的位置に含有するアンチセンスオ
リゴヌクレオチドのいずれもRNAまたはDNA相補体のいず
れかを化学量論的濃度で添加され、二重鎖がランダムコ
イルに転移する時の濃色効果（260nm）をギルホードレ
スポンス分光光度計で監視された。これらの測定は10mM
Naリン酸、pH7.4,0,1mM EDTA、およびNaClで0.1Mから
1.0Mの10のイオン強度を作成した緩衝液中で行われた。
データは1/Tm対1n［Ct］のグラフ表示され、ここで［C
t］は全オリゴヌクレオチド濃度であった。この分析か
ら熱力学的パラメーターが決定された。特定のこれらの
結果を表IIに表す。 表II 修飾に関する融解温度（Tm）データ ５′から３′への修飾部を読むオリゴヌクレオチド
５′TCC AGG TGT CGG CAT C3′の１から16位のピリミジ
ン修飾のTm（℃） ６−Aza T162.81562.07,958.21,7,9,1554.56−Aza dC
263.02,359.810,1151.06−Me dU163.21562.57,955.71,
7,9,1552.35,6−DiMe dU1560.37,954.71,7,9,1552.55−
Iodo dU163.51563.37,7,9,1561.55−Bromo dU163.5156
3.37,963.31,7,9,1561.55−Fluoro dU163.21563.27,96
5.01,7,9,1563.75−Bromo dC10,1165.82,3,10,11,1368.
05−Me dC10,1165.32,3,10,11,1367.0 形成されたヘテロ二重鎖の二重安定性に関して得られ
た情報に基づいて修飾ピリミジンのオリゴヌクレオチド
中への配置は、そのヘリックス安定性効果に関して評価
された。ハイブリッドの安定性を劇的に変える修飾は、
自由エネルギー（デルタＧ）の減少を表し、そしてアン
チセンスオリゴヌクレオチドとしてのそれらの有用性に
関して決定された。このような安定性関するレトロスペ
クティブな研究を表IIIに示す。 表III 二重鎖安定性および特異性に関するピリミジン修飾の効
果 化合物安定性 対特異性 対DNA 標的DNA 標的天然
DNA0＋4.26−Aza T＋0.6＋3.76−Aza dC＋1.9＋6.06
−Me dU＋1.3＋3.05,6−DiMe dU＋1.1＋1.55−Iodo dU
＋0.3−５−Bromo dU−0.3＋4.95−Fluoro dU−0.2＋4.
45−Bromo dC−0.1＋6.55−Methyl dC−0.2＋6.3 ピリミジン修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが特
異的に標的mRNAにハイブリダイズする能力は、全細胞性
RNAの存在下で精製標的mRNAのノーザンブロット分析に
より示された。標的mRNAは、T7RNAポリメラーゼプロモ
ーターから下流に位置する標的mRNAに関するcDNAを含有
するベクターから合成された。合成されたmRNAはアガロ
ースゲル電気泳動ならびに適当な支持体膜（すなわちニ
トロセルロース）に転写された。支持体膜はブロックさ
れ．、［32P］−標識アンチセンスオリゴヌクレオチド
を使用してプローブとされた。 ストリンジェンシー（stringency）はブロットを複製
し、上昇温度または減少イオン強度の洗浄バッファーの
いずれかで洗浄して測定された。オートラジオグラフィ
ーはヘテロ二重鎖形成の存在を評価するために行い、な
らびにオートラジオグラムはレーザーテンシトメーター
（LKB−Pharmacia社）により定量した。 ハイブリッド形成の特異性は、標準法にて全細胞性RNA
の単離およびそのアガロース電気泳動による分析によ
り、膜転写および標識ピリミジン修飾オリゴヌクレオチ
ドによるプロービングにより決定した。非修飾アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドに関するストリンジェンシーは
予め決定され、ならびに使用された条件は標識mRNAのみ
がピリミジン修飾オリゴヌクレオチドとヘテロ二重鎖を
形成できものであった。 実施例23 天然、ホスホロチオエートおよびピリミジン修飾オリ
ゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを種々の濃度の
胎児ウシ血清（FSC）または成人ヒト血清を含有する培
地中でそれらの血清ヌクレアーゼ耐性に関して評価され
た。標識したオリゴヌクレオチドは種々の時間インキュ
ベーションされ、プロテアーゼＫで処理されて次に20％
ポリアクリルアミド−尿素変性ゲル電気泳動、引き続き
オートラジオグラフィーで分析された。オートラジオグ
ラムは、レーザーデンシトメトリーで定量した。修飾の
位置およびオリゴヌクレオチドの既知の長さに基づき、
特定のピリミジン修飾によりヌクレアーゼ分解に関する
効果を決定することが可能である。細胞質ヌクレアーゼ
についてはHL60細胞系を使用した。ミトコンドリア上澄
後を分画遠心分離によって調製し、標識オリゴヌクレオ
チドをこの上澄中で種々の時間インキュベーションし
た。インキュベーションの後、オリゴヌクレオチドは、
血清核酸溶解分解に関して上記に概述されたように評価
された。オートラジオイグラフィーの結果は、非修飾、
ホスホロチオエートおよびピリミジン修飾オリゴヌクレ
オチドの比較用に定量された。 特別なヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアー
ゼ、３′,5′−エキソ−および５′,3′−エキソヌクレ
アーゼ）に対する天然、ピリミジン修飾オリゴヌクレオ
チドの耐性の評価がなされ、分解に対する修飾の正確な
効果が決定された。修飾されたオリゴヌクレオチドを種
々の選択されたヌクレアーゼに特異的で明確な反応緩衝
液中でインキュベーションした。プロテアーゼＫで生成
物を処理した後に尿素が添加され、尿素含有20％ポリア
クリルアミドゲルの分析がなされた。ゲル生成物はステ
インズオール（Steins All:シグマ化学社）を使用して
染色することにより視覚化された。レーザーデンシトメ
トリーは、分解の程度を定量するために使用された。ピ
リミジン修飾の効果は特別なヌクレアーゼに関して行な
われ、血清および細胞質系から得た結果と比較された。 そのような試験のひとつにおいて、約1mg/mlの修飾ピ
リミジン関連オリゴヌクレオチドを37℃で、熱活性化10
％FSCを補給したDMED中でインキュベーションした。種
々の時間点において、アリコートが分取され、等量の9M
尿素/1xTBE緩衝中で混合され、−20℃で凍結された。試
料をポリアクリルアミド電気泳動（20％PA/7M尿素）で
分析しステインズオール試薬にて視覚化し、LKBレーザ
ーデンシトメーターを使用する定量に供した。ピークの
積算は完全長のオリゴヌクレオチドを表し、およびｎ−
１オリゴヌクレオチドを作成した。％分解を、試料の時
間０と比較することにより各時間に関して計算した。デ
ータをグラフ化し、修飾オリゴヌクレオチドのＴ1/2に
関するグラフでの推定を天然非修飾オリゴヌクレオチド
との比較により行った。６−aza T含有オリゴヌクレオ
チドを利用して、そのような６−aza T修飾オリゴヌク
レオチドが核酸溶解分解に対するより大きな耐性を示す
ことが分かった。６−アザＴ化合物に関して、修飾の数
を増加させるとFCS中での分解に対する安定性が増大し
た。さらに、最良の結果は、６−aza Tを３′−末端キ
ャップとして使用した時に得られた。そのような３′−
末端キャップを含有するオリゴヌクレオチドは、天然オ
リゴヌクレオチドを比較して３′−５′エキソ核酸溶解
分解からの保護を与えた。Ｔ1/2は天然オリゴヌクレオ
チドの20分から修飾オリゴヌクレオチドに関する４時間
のＴ1/2に増加した。これはFCS存在下におけるオリゴヌ
クレオチドの分解の感受性を12倍減少させたことを表し
た。この試験結果はFSC、これは天然非修飾オリゴヌク
レオチドを３′末端から分解すると知られているが、３
つの６−aza Tブロックを適当な基質として認識しない
ことを示唆する。このような認識の欠如は修飾オリゴヌ
クレオチドの加水分解をおおいに減少させる。 実施例24 リボリクレアーゼＨ活性 標的mRNAのRNaseによる開裂は、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの阻害効果をおおいに増大させる。現在で
は大腸菌RNaseHは、DNA−RNAヘテロ二重鎖のDNA部分上
のたった３から４個の非修飾残基結合部位がRNAの開裂
を引き出すために必要であると思われている。この試験
に関し、各Ｔヌクレオチドを置換した６−aza Tを有す
る5LO mRNA（５′−AAA TAG TGT TGC TGA TCT TGA C−
３′）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドかRNas
eH試験に関して利用された。試験オリゴヌクレオチドの
中で、６−aza Tを含むように修飾された後は、２天然
塩基より離れないようにし−即ち、オリゴヌクレオチド
は大腸菌RNaseHによる認識を実証すべきである。天然相
補的DNA（５′AAA TAG TGT TGC TGA TCT TGA C−３′）
を比較の目的で合成した。５−LO mRNA（2.5kb）をin v
itro合成した。天然DNA（AAA TAG TGT TGC TGA TCT TGA
C）および６−aza T含有修飾オリゴヌクレオチド（AAA
TAG TGT TGC TGA TCT TGA C）、（双方とも５−LO mRN
Aに対するアンチセンスDNAである）を自動DNA合成で合
成した。各々の天然および修飾オリオヌクレオチドが３
倍モル過剰量の存在下でmRNAを30分間、60℃で加熱し、
天然オリゴヌクレオチドを対照に使用した。インキュベ
ーション後、溶液を37℃にゆっくりと冷却し、RNase H
（大腸菌）を添加した。RNase H処理溶液を37℃で30分
間静置した。分解生成物は1.2％アガロース／ホルムア
ルデヒド電気泳動で分析し、および定量のためにエチジ
ウムブロマイドで視覚化した。この結果は、RNase H
（大腸菌）が，天然のまたは６−aza Tを含有する修飾D
NAのいずれかに結合したmRNAを同等の効力で認識かつ開
裂できることを示している。
ンパク質によって引き起こされることが知られている。
そのようなタンパク質は、直接的またはそれらの酵素機
能を介して、動物および人間の多くの疾患の主要な割合
を占める。 古典的な治療法はそれらのタンパク質での相互作用に
注目し、それらの疾患の発生または機能を広げる疾患の
緩和に努力して来た。しかしながら最近、それらタンパ
ク質の合成を指示する分子、細胞内RNA、との相互反応
によりそのようなタンパク質の実際の生産を緩和する試
みがなされた。タンパク質の生産に干渉することによ
り、最大の効果および最小の副作用の治療結果を生じる
ことが期待された。特定の遺伝子発現を阻害する研究の
ひとつは、アンチセンス剤としてのオリゴヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチド類似体の使用である。 アンチセンス法とは比較的短いオリゴヌクレオチドの
単鎖mRNAまたは単鎖DNAへのハイブリダイゼーションに
より、これら細胞内核酸の正常、必須な機能が破壊され
る。ハイブリダイゼーションはRNAのワトソン−クリッ
ク塩基対または単鎖DNAへのオリゴヌクレオチドの配列
特異的水素結合である。このような塩基対は互いに相補
的であると言う。核酸機能の崩壊を導く自然発生的な出
来事がCohenによりオリゴヌクレオチド：遺伝子発現の
アンチセンス阻害剤（Oligonucleotide:Antisense Inhi
bitor of Gene Expression）（CRC社、ボカ ラトンFL1
989:CRC Press,Inc.,Boca Raton、FL,1989）で述べられ
ている。これらの著者はふたつの可能な終結反応のタイ
プを提案する。第１は、ハイブリダイゼーション制止は
オリゴヌクレオチド阻害剤が結合した標的核酸中での終
結反応を示し、これは単純な立体障害により本質的なタ
ンパク質（多くの場合リボゾームである）の核酸への結
合を妨害する。メチルホスホネートオリゴヌクレオチ
ド；ミラーおよびテスオ（P.S.Miller＆P.O.P.Ts′O,）
Anti−Cancer Drug Design Vo1.2,pp.117−128（198
7）；およびα−アノマーオリゴヌクレオチド、コーエ
ン編集（Cohen J.S.）オリゴヌクレオチド：遺伝子発現
のアンチセンス阻害剤（Oligonucleotide:Antisence In
hibitor of Gene Expression）（CRC社、ボカ ラトンF
L1989）はハイブリダイゼーション制止により核酸機能
が破壊されると思われる、徹底的に研究されたふたつの
アンチセンス剤である。 アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する第二のタイ
プの終結反応は、細胞内RNaseHによる標的RNAの酵素的
開裂が関与する。オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチド類似体は、これらはデオキシリボ型でなければ
ならないが、標的RNAとハイブリダイズし、そしてこの
二重鎖はRNaseH酵素を活性化してRNA鎖を開裂し、すな
わちRNAの正常機能を破壊する。ホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドはアンチセンス剤の顕著な例であり、
このタイプのアンチセンス終結反応により作用する。 注目すべき研究が治療を目的とするアンチセンス剤と
してのオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類
似体の応用に対して向けられている。診断、研究試薬お
よび有力な治療剤としてのオリゴヌクレオチドの応用に
はオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体
が大量に合成できること、細胞膜を通過することまたは
細胞により取り込まれること、標的RNAまたはDNAに適当
にハイブリダイズすること、および核酸の機能を引き続
き終結または破壊することが必要である。このような重
要な機能はヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチ
ドの初期耐性に依存する。 天然に発生するオリゴヌクレオチドおよび存在するオ
リゴヌクレオチド類似体のこれらの目的のための、特に
アンチセンス治療のための重大な欠点は、今後“ヌクレ
アーゼ”という細胞内および細胞外に局在する、偏在す
る種々の核酸溶解（nucleolytic）酵素による投与した
オリゴヌクレオチドの酵素的分解である。非修飾オリゴ
ヌクレオチドはヌクレアーゼにより迅速に分解されるの
で有用な治療薬にはなりそうもない。オリゴヌクレオチ
ドをヌクレアーゼ耐性にするための修飾はそれゆえに大
いなる要望である。 ヌクレアーゼ耐性を増大するためのオリゴヌクレオチ
ドの修飾はこれまで糖−リン酸骨格上で一般的に行わ
れ、特にリン原子上で行われた。ホスホロチオエート、
メチルホスホネート、ホスホアミダイトおよびホスホト
リエステル（リン酸メチル化DNA）は種々の水準のヌク
レアーゼ耐性を有すると報告されている。しかし特異的
DNAまたはRNAヘアンチセンスオリゴヌクレオチドが正確
に結合する能力はアンチセンス法においては基本であ
り、修飾リンオリゴヌクレオチドは種々の程度のヌクレ
アーゼ耐性を提供するが、一般的に劣ったハイブリダイ
ゼーション特性に悩まされる。 この低質なハイブリダイゼーションの理由の一つはリ
ン原子のプロキラルな性質によるものかもしれない。修
飾リンオリゴヌクレオチドの内部リン原子上の修飾は、
RpおよびSp立体異性体を生じる。立体規則性オリゴヌク
レオチド（すべてがRpまたはSpリン酸結合）の実際の合
成は知られていないから、修飾リン原子をもつオリゴヌ
クレオチドはn2個の異性体を有する（ｎはオリゴヌクレ
オチドの長さまたは塩基の数に等しい）。さらにリン原
子上の修飾はホスホジエステル結合について不自然な嵩
を有し、糖−リン酸骨格の配置、および結果的に二重鎖
の安定性に干渉する。リン原子修飾の効果は、同じ標的
に対する非修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイズに
比して標的核酸への低質なハイブリダイゼーションを引
き起こす。 オリゴヌクレオチドが相補的核酸に結合する相対能力
は、特定のハイブリダイゼーション複合体の溶解温度を
測定することにより比較できる。溶解温度（Tm）はダブ
ルヘリックスの物理性質の特徴であるが、コイル（バブ
リダイズしていない）に対して50％ヘリックスが存在す
る時の温度を表す。TmはUVスペクトルを使用してハイブ
リダイゼーションの形成および崩壊（溶解）を決定する
ことにより測定される。ハイブリダイゼーション中に起
こる塩基スタッキングはUV吸収の減少を伴う（濃色効
果）。結果として、UV吸収の減少はより高いTmを指示す
る。高いTmほど鎖の結合力がより強い。非−ワトソン−
クリック塩基対はTmに関し強い不安定効果をもつ。結
局、塩基対の絶対的な正確さは、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドの標的RNAへの至適な結合が得られることが
必要なようである。 メチルホスホネートおよびホスホロチオエートのハイ
ブリダイゼーション特性の重大な減少が報告された:Coh
en,J.S.,編集オリゴヌクタレオチド：遺伝子発現のアン
チセンス阻害剤（Oligonucleotide:Antisense Inhibito
rs of Gene Expression,（CRC出版社、Boca Raton FL,1
989）。さらにメチルホスホネートはRNAと形成する二重
鎖において終結反応であるRNase Hによる分解を活性化
せず、かわりにリゾホーム上に局在するヘリックス溶解
活性によって打ち消され得るハイブリダイゼーション制
止により作用する点に欠点がある。ホスホロチオエート
は多くのヌクレアーゼに高度に耐性である。しかしなが
ら、ホスホロチオエートは典型的には非−アンチセンス
型作用を表し、特に非特異的結合による種々の酵素の阻
害を表す。配列−特異的オリゴヌクレオチドによる酵素
阻害は、アンチセンス化学療法の種々の基礎を危うくす
る。 それゆえに、ヌクレアーゼに耐性を示すように、RNas
e H終結反応を活性化するために、ならびに適当な強さ
および正確さでその標的RNA（またはDNA）とにハイブリ
ダイズする修飾されたオリゴヌクレオチドはアンチセン
スオリゴヌクレオチド診断、治療および研究のために大
いに望まれている。 発明の目的 発明の主要な目的はアンチセンスオリゴヌクレオチド
診断、研究試薬および治療において使用されるオリゴヌ
クレオチド類似体を提供することである。 発明のさらなる目的はDNAまたはRNAの活性を変調する
に効果的なオリゴヌクレチオド類似体を提供することで
ある。 発明のもうひとつの目的は、所望しない、または毒性
の副反応を引き起こすことが少ないと思われるオリゴヌ
クレオチド類似体を提供することである。 さらに発明のもうひとつの目的は、動物の身体状態、
特に疾患状態をアッセイするための研究および診断法お
よび物質を提供することである。 発明のさらなる目的はDNAおよびRNAの活性の変調を通
じて疾患の処置に関する治療および研究法および物質を
提供することである。 これらのおよび他の目的は本明細書および付髄する請
求の範囲の吟味により当業者に明らかなものとなろう。 発明の概要 本発明によれば、ヌクレアーゼ分解に耐性があり、な
らびにDNAおよびRNAの活性を変調する組成物が提供され
る。これらの組成物は、そのなかに修飾されたピリミジ
ン塩基を包含するオリゴヌクレオチドを含み、その標的
部分はDNAおよびRNAの単鎖または二重鎖のあらかじめ選
択されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイゼー
ションできる。ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドは、
単鎖DNAおよびRNAを認識して二重鎖を形成するか、また
は二重鎖DNAおよびRNAと三重鎖を形成する。 ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、結合基を介
して共に連結した核酸塩基の鎖からなる。ヌクレアーゼ
耐性オリゴヌクレオチドの標的部分は約５から約50核酸
塩基の長さの範囲でよい。しかし本発明の好適な様態に
よれば15塩基長の標的配列が至適と思われる。 本発明のピリミジン修飾オリゴヌクレオチドはチミ
ン、ウラシルまたはシトシンのようなピリミジンまたは
グアニンまたはアデニンのようなプリン、またはそれら
の修飾物である塩基を含み、選択配列中に配置される。
このような塩基の糖部分は、デオキシリボまたはリボー
ス糖であってよい。塩基を結合する基はともに通常の糖
リン酸核酸骨格であってよいが、ホスホロチオエート、
メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミ
デートのようなアルキルホスホネート、またはピリミジ
ン修飾オリゴヌクレオチド特性をさらに増大するに有用
な他の修飾骨格で修飾されることができる。例えば、ホ
スホジエステル結合は炭素またはエーテル結合に置き換
える事もできる。 本発明の他の好適様態によれば、標的部分はオリゴヌ
クレオチドの類似体であり、ここで少なくともピリミジ
ン塩基、チミン、シトシンまたはウラシルのひとつが修
飾されと核酸塩基に置換されており、これはワトソン−
クリック水素−結合塩基対則（ＴとＡ、ＣとＧおよびＵ
とＡ）に対して正確であり、さらにオリゴヌクレオチド
に対してヌクレアーゼ耐性を付与する。ピリミジン塩基
または複数のピリミジン塩基の修飾は好ましくはピリミ
ジン環の５または６位で起こる。別法では、ひとつまた
はひとつ以上のピリミジン塩基がピリミジン環の５およ
び６位の双方で修飾されてもよい。 ５および６位で起こり得る置換にはピリミジンの５お
よび６位の炭素原子についてヘテロ原子の付加、または
メチル、ヒドロキシル、エーテル、アルコール、ベンジ
ルまたはフェニル基の付加を含んでもよい。修飾はまた
ニトロ基、チオール基、ハロゲン基またはフルオロカー
ボン基を含むハロカーボン基を含むことができる。択一
的に、修飾はピリミジン環の５および６位への基質の融
合を介して形成される炭素環または複素環であってもよ
い。５および６位で起こる付加は同じであってもなくて
もよい。 生成した新規オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分
解に耐性であり、野生型（DNA−DANおよびRNA−DNA）二
重鎖およびホスホロチオエート、メチルホスホネート、
ホスホアミダイトおよびホスホトリエステルを含有する
現在知られているリン修飾オリゴヌクレオチドアンチセ
ンス二重鎖に比してより高質のハイブリダイゼーション
特性を示す。本発明は生物によるタンパク質生産を変調
する方法も対象とし、生物を前述の考察に従って配合さ
れた組成物に接触させることから成る。変調されるべき
RNAまたはDNA部分は予め選択され、形成が変調されるタ
ンパク質をコードするDNAまたはRNA部分を含むようにす
ることが好ましい。採用されるべき組成物の標的部分
は、すなわち、DNAまたはRNAの予め選択された部分と相
補的になるように選択され、これはその部分に関するア
ンチセンスオリゴヌクレオチドとなる。 本発明はまた所望しないタンパク質を生産することに
よって特徴付けられる疾患をもつ生物の処置法も対象と
する。この方法は生物を前述の考察による組成物と接触
させることから成る。組成物は好ましくは生産が抑制さ
れるタンパク質をコードするメッセンジャーRNAと特異
的に結合するために設計されたものである。 本発明はさらに生物体または細胞中で異常RNA分子ま
たは正常RNA分子の異常または不適当な発現の存在また
は不存在を検出するための診断法を対象とする。 本発明はまた研究および診断の目的のためにRNAの選
択的結合に関する方法も対象とする。このような選択的
な強い結合は、そのようなRNAまたはDNAがヌクレアーゼ
分解耐性で既知のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチド類似体よりも強く且つより正確にハイブリダイ
ゼーションする、本発明の組成物と相互作用することに
よって達成される。 好適な様態の詳細な説明 本発明によるRNAまたはDNA分子の活性変調のために有
用な組成物は、一般的に標的配列のオリゴヌクレオチド
を含有する修飾ピリミジンから成り、これはDNAまたはR
NA分子の単鎖または二重鎖の予め選択されたヌクレオチ
ド配列と特異的にハイブリダイズし、それはヌクレアー
ゼ耐性である。 一般的に合成が最終的に変調または全く抑制されるタ
ンパク質の生産のためのDNAまたはRNA配列、またはそれ
に関与するDNAまたはRNA配列を選択することが望まれ
る。組成物の標的部分は一般的にオリゴヌクレオチド類
似体である。既知の方法論の固相状態合成を介して簡便
に合成さる、相補的になるかまたはRNAまたはDNAの予め
選択されたヌクレオチド配列と少なくとも特異的にハイ
ブリダイズし得るようになる。核酸合成機は市販されて
おり、その使用法は一般的に当業者が所望するであろう
ほぼ任意の妥当な長さのオリゴヌクレオチドを生成する
に効果的であると知られている。 本発明の文脈において、“オリゴヌクレオチド”とい
う用語は天然に存在する塩基からの特別配列中に形成さ
れた複数の連結したヌクレオチド単位、および天然のホ
スホジエステル結合によるヌクレオチド内結合を介した
ペントフルノシル糖基を言う。これらのヌクレオチド単
位はグアニン、アデニン、シトシン、チミンまたはウラ
シルのような核酸塩基であり得る。糖基はデオキシリボ
ースまたはリボース糖であってよい。この用語は天然に
存在するまたは天然に存在するサブユニットからの合成
種の双方を言う。 用語としての“オリゴヌクレオチド類似体”は、本発
明との関連において、オリゴヌクレオチドと同様に機能
するが天然には存在しない部分を有する一部分を言う。
オリゴヌクレオチド類似体は改変された糖部分または糖
−内結合を有し、例えばホスホロチオエートおよび当業
界にて知られた他の硫黄含有種である。オリゴヌクレオ
チド類似体は改変された塩基単位または本発明の精神と
一致する他の修飾も含むことができ、ならびに特にその
ような修飾において、特定オリゴヌクレオチドのアンチ
セン治療、診断または研究試薬使用を利用するために、
オリゴヌクレオチド組成物のヌクレアーゼ耐性を増加で
きる。 本発明のいくつかの態様においては、組成物のヌクレ
アーゼ耐性を増加させるためのに、ヌクレオチド塩基の
ある部分が置換され、一方オリゴヌクレオチド結合能の
完全さが維持されることが一般的に好ましい。そのよう
な置換は、ひとつまたはひとつ以上のピリミジン環の５
または６位においてピリミジン環のこれらの位置の炭素
原子をヘテロ原子に置換することにより生じ得る。択一
的に、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性はピリミ
ジン環の５および６位に置換基を付加することにより増
加できる。 置換基は、メチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコ
ール、エステル、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオー
ル、チオアルコキシ、ハロゲン、ハロカーボン、または
融合炭素環又はヘテロ原子含有種であり得る。本発明の
幾つかの好適な態様によれば、、ピリミジン環の置換は
５または６または５および６双方のアザであり得る。本
発明の他の好適な態様によれば、５または６位に付加さ
れる置換基はひとつまたはそれ以上のニトロー、メチル
ー、ブロモー、イオドー、クロロー、フルオロー、トリ
フルオロー、トリフルオロメチルー、2,4−ジニトロフ
ェニルー、メルカプトー、またはメチルメルカプトー基
であり得る。ヌクレアーゼ耐性に対する使用のために好
適でもある他の付加はエーテル、チオエーテル、アルコ
ールおよびHS−C,MeS−Ｃ−のようなチオアルコール、O
H−Ｃ−,MeO−Ｃ−,HOCH2−Ｃ−およびピリミジン環の
５または６位を介して融合されたシクロペンチル、シク
ロヘキシルおよびイミダソ環であり得る。したがって、
本発明のいくつかの好適な態様には修飾されたピリミジ
ン塩基または構造： を有する塩基が包含され、 ここでＸ＝OHまたはNH2,およびＡおよびＢは同じかま
たは異なっていてもよく、ならびにＣ−低級アルキル、
N,C−CF3,C−F,C−Cl,C−Br,C−I,C−フルオロカーボン
を含むＣ−ハロカーボン、Ｃ−NO2,C−OCF3,C−SH,C−S
CH3,C−OH,C−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−CH2−OH,C−CH2S
H,C−CH2SCH3,C−CH2OCH3,C−NH2,C−CH2NH2,C−アルキ
ル−NH2,C−ベンジル、Ｃ−アリール、Ｃ−置換アリー
ル、Ｃ−置換ベンジル；またはＡおよびＢのひとつが上
記のものであり、他がＣ−H;またはＡおよびＢが一緒に
ＡおよびＢを介してピリミジン環に融合した炭素環また
は複素環の部分である。ＡおよびＢのひとつまたは双方
がＣ−低級アルキル、Ｃ−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−OH,C
−フェニル、Ｃ−ベンジル、Ｃ−ニトロ、Ｃ−チオー
ル,C−ハロカーボン、またはＣ−ハロゲンであることが
好ましい。他の好適な態様によれば、少なくともＡおよ
びＢのひとつがＣ−ハロゲンまたはＣ−フルオロカーボ
ン、特にＣ−トリフルオロメチルを含むＣ−ハロカーボ
ンである。他のフルオロカーボンはＣ−Ｃ（CF3）3,C−
CF2−CF3,およびＣ−CF2−CF2−CF3である。ハロゲンは
フッ素、臭素、塩素およびヨウ素を含む。その他の好適
な態様によればＡおよびＢのうちひとつまたは双方は窒
素原子である。Ａが窒素原子であることがなお一層好ま
しい。他の態様によれば、ＡはＣ−CH3,またはＣ−CF3
且つＢは窒素、またはＡはＣ−Br且つＢは窒素である。 少なくともひとつの修飾ピリミジンが該オリゴヌクレ
オチド類似体の一つの末端に存在することが好ましく、
特に該オリゴヌクレオチドの３′末端が好ましい。他の
好適な態様によれば、オリゴヌクレオチドは該オリゴヌ
クレオチドの３′末端に最高３つの修飾ピリミジンを含
有する。他の態様において少なくとも約１％の該ピリミ
ジンが修飾される。他の態様によれば大量の修飾、例え
ば少なくとも該ピリミジンの約10％以上、すなわち25
％,50％でさえも、または実質的に該ピリミジンの全部
を有することが好ましい。 修飾ピリミジンに結合した糖部分はリボースまたはデ
オキシリボース糖のいずれかであってよい。修飾ピリミ
ジンの糖結合基はホスホロチオエート、メチルホスホネ
ート、ホスホアミダイト、ホスホトリエステルを含むア
ルキルホスホネートまたはリン酸アルキレート構造にも
修飾されることができる。他の態様において、オリゴヌ
クレオチド類似体は、炭素またはエーテル結合に置換さ
れた修飾ピリミジンの糖結合基を有することができる。 治療のためには、薬学的に受容できるキャリアー中に
オリゴヌクレオチド類似体が調製されることが便利であ
る。 本発明のいくつかの態様によれば、さらに修飾された
ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドを採用することが好
ましい。この意味において、ピリミジン修飾オリゴヌク
レオチド類似体とは一般的に天然のオリゴヌクレオチド
と同様であるが、ひとつまたはそれ以上の有意な方法で
修飾されたものを言う。 そのような修飾は発明の糖骨格において起こる。ピリ
ミジン修飾オリゴヌクレチオドの標的配列がメッセンジ
ャーRNAおよびDNAが存在する（これは全組成物の標的で
ある）細胞の細胞内空間に浸透する能力を増強すること
が好ましい。それゆえにオリゴヌクレオチドが細胞内空
間に浸透しやすくするために一般的にオリゴヌクレオチ
ドに修飾を施して、実質的に天然の形態よりも少ないイ
オン性であることが好ましい。この目的を達成するため
の現存する、または今後開発されるであろう方法は本発
明の実施に従い採用されるであろう。現在ではホスホジ
エステル結合への置換が好ましいと見いだされている
が、この置換は天然に存在する結合よりもより少ないイ
オン性であるばかりでなく、実質的に非−キラル性であ
る。理解されることであろうが、ホスホジエステル結合
のリン原子は“プローキラル”である。メチルホスホネ
ートおよびホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドに
おいて行われるようなリン位での修飾は、本質的にキラ
ル構造を生じる。キラリティーは各々のキラル中心で細
胞内分子と異なる反応をするであろうふたつの異性体を
生じる。このような未分離の異性体混合物は生成した組
成物が細胞内空間へ運搬されることを阻害、または特異
的標的であるRNAまたはDNAに対するハイブリダイゼーシ
ョンの親和性または特異性を減少させ得る。すなわち、
すべて、またはいくつかのホスホジエステル結合の代わ
りに実質的に非−イオン性、実質的に非−キラルな実在
物を採用することが好ましい。この目的に関して、短鎖
アルキルまたはシクロアルキル構造、特にC2−C4構造が
好ましい。酸素官能性のひとつの除去を含む糖構造の修
飾はそのような実質的に非−キラル、非−イオン性の置
換体をこの位置に導入することを可能とする。 本発明の目的を達成するために、Ｓ−P,Me−P,MeO−
ＰまたはH2N−Ｐ（これはホスホロチオエート、メチル
ホスホネート、ホスホトリエステルまたはホスホアミダ
イト）をＯ−Ｐ（ホスホジエステル結合）と置換するこ
とが意図される。これらの置換の幾つかの場合は、ピリ
ミジン修飾オリゴヌクレオチド特性を増強するものと思
われる。 本発明の組成物の標的部分は、好ましくは５から約50
塩基単位を有するオリゴヌクレオチド類似体である。よ
り好ましくは、このような官能性は８から約40塩基単位
を有し、そしてさらに好ましくは約12から約20塩基単位
が採用されるべきである。約15塩基単位を有するオリゴ
ヌクレオチド類似体は本発明の特定の態様の実施に好ま
しい。 標的部分は変調のために選択されたRNAまたはDNAの予
め選択されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイ
ズできるように適合される。本発明のひとつまたはそれ
以上の態様の実施のために特に適するオリゴヌクレオチ
ド類似体は、修飾されたリボースまたはデオキシリボー
スピリミジンのひとつまたはそれ以上のサブユニットか
ら成る。ピリミジン環の５または６位で起こり得る置換
はメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコール、ベン
ジルまたはフェニル基の付加を含んで良い。この修飾は
ニトロ基、チオール基またはハロゲン基の付加も含むこ
とができる。択一的に、この修飾は５および６位に融合
した炭素環またはヘテロ原子含有環であ得る。５および
６位に起こる付加は同じであってもなくても良い。 これらの修飾された塩基は互いに結合し、ならびに糖
結合基を介してオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチド類似体の残部と結合する。結合基はここに記載さ
れた構造の任意のものでよく、オリゴヌクレオチドの糖
部分と結合でき、本発明の組成物の標的部分を形成す
る。これらの糖結合基はホスホジエステル構造またはそ
のような誘導体から成ることが好ましい。ホスホジエス
テル構造の誘導体には、硫黄、メチル、メチル酸化物ま
たは酸素についてはアミン基を含むことができる。糖リ
ン酸核酸骨格はホスホロチオエート、メチルホスホネー
ト、ホスホアミダイトまたはホスホトリエステル部分と
して修飾できる。ホスホジエステル結合または炭素また
はエーテル結合に置換されることもできる。 本発明の他の態様によれば、結合部分は、修飾したピ
リミジンと修飾オリゴヌクレオチドの３′終結末端との
直接的な付着を可能とするように考案された。すなわち
ブロモメチルケト基のようなエステル前駆体は、ジメト
キシトリチル基（ジメトキシトリフェニルメチル基）で
５′−ヒドロキシ保護を有する修飾されたピリミジンヌ
クレオチドの３′−ヒドロキシルに付加でき、必要であ
れば例えばヌクレオシドのシトシン系についてはベンゾ
レート保護基のような適当な保護基で保護されたピリミ
ジン複数環である。もし標的配列が終結３′−チミンま
たは−シトシン塩基を有するならば、ブロモメチルケト
リンカーを含有する所望の修飾チミンまたはシトシン塩
基は、３′−ヒドロキシル基を介して結合した正常ヌク
レオチドを含有する調節ポアーガラス（CGP）固体支持
体へ付着させるための第一単量体として利用できる。修
飾したピリミジンとCPGに付着したヌクレオシドろ付着
させるエステル結合に感受性の塩基は通常の濃水酸化ア
ンモニウム条件下で開裂でき、これはCGP支持体からオ
リゴヌクレオチドを回収するために利用される。これは
修飾したチミンまたはシトシンをその３′−末端に有す
る修飾オリゴヌクレオチドを可能にするであろう。 核酸溶解酵素によるオリゴヌクレオチドの開裂には、
酵素−基質複合体、またはとくにヌクレアーゼ−オリゴ
ヌクレオチド複合体の形成が必要である。ヌクレアーゼ
酵素は適当な付着に関してオリゴヌクレオチド上に局在
する特異的結合部位が必要である。ヌクレアーゼがオリ
ゴヌクレオチドに付着しないようにもしオリゴヌクレオ
チド結合部位が除去されたり隠されたりすると、ヌクレ
アーゼ耐性オリゴヌクレオチドが生じる。配列−特異的
回文的二重鎖DNAを開裂する制限エンドヌクレアーゼの
場合は、特定の結合部位、例えばプリン環の３−および
７−位の窒素原子が結合部位として必要であると同定さ
れている。これらの部位をひとつまたはそれ以上の除去
またはヌクレアーゼが認識配列中のこれらの特別な位置
へ接近することを妨害することにより、特異的ヌクレア
ーゼに対する種々の水準の耐性が提供された。 不規則な構造−活性関連性に関する研究が行われ、適
当なハイブリダイゼーション特性を維持するヌクレアー
ゼ耐性アンチセンスオリゴヌクレオチドが見いだされ
た。チミンおよびシトシンのリボヌクレオシドおよびデ
オキシリボヌクレオシドの５−および／または６−位に
対する一連の修飾が行われた。これらの修飾ヌクレオシ
ドは配列−特異的オリゴヌクレオチドに固相核酸合成を
通じて挿入された。新規アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドはそれらのヌクレアーゼによる分解耐性能力および修
飾していない親のオリゴ−ヌクレオチドに比較してのハ
イブリダイゼーション特性がアッセイされた。なぜなら
核酸ピリミジン位置の５−および６−位の好適な態様が
選択された末端修飾およびこれらの位置でのアザ／デア
ザのような環修飾は、必要なワトソン−クリック塩基対
水素結合パターンに立体的に干渉するとは思われないか
らである。しかしながら、環系においてすでに発見され
た電気的変化はそのような見かけは重要ではない複素環
変化から生じる。これらの電気的変化は二極モーメント
を芳香族系に加え、ならびに／または存在する二極モー
メントの方向および強さを変えることができる。PKa強
度は電気的摂動により影響されるであろう。アザ／デア
ザでの末端または環変化は環系の求電子性および求核性
を変化させて（ヌクレアーゼの分解活性のためにはオリ
ゴヌクレオチドの核酸塩基に対して共有結合形成が要求
されるが）、ヌクレアーゼが作用しないようにできる。 構造活性の関連性を研究している中、ピリミジン、チ
ミン、シトシンおよびウラシルの５−および／または６
−位における末端およびアザ／デアザ修飾がヌクレアー
ゼ耐性を提供し、これはヌクレアーゼ耐性であると知ら
れているホスホロチオエートに匹敵し、さらに修飾した
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性は未
修飾の親オリゴヌクレオチドと同様かより良かった。 本発明のいくつかの態様において、ピリミジン核塩基
の修飾は修飾されるべきアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの約50％となるであろう（４つのうちの２つの塩基が
可能である）。６−アザ−チミンおよび６−アザ−シト
シン（15塩基のうちの８）に置換されたすべてのチミン
およびシトシンを有する修飾配列は、未修飾の親配列に
比べてTmが約10％低いヌクレアーゼ耐性を表した。ヌク
レアーゼ耐性および結合安定性の好適な組み合わせは、
オリゴヌクレオチドの３′−末端に１から３の修飾ピリ
ミジンを配置することから生じる。 本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、診断、治療、
研究試薬として、およびキットに使用できる。治療のた
めの使用に関し、オリゴヌクレオチド類似体はあるタン
パク質によって生じた疾患にかかっている動物に投与さ
れる。そのような疾患にかかっていると疑われる患者に
その疾患の症状を減少するのに効果のあるオリゴヌクレ
オチド類似体の量を投与することが好ましい。そのよう
な処置法に関する至適な投与量および処置計画を決定す
ることは当業者に既知の範囲内である。 本発明の治療剤は経口、静脈内または筋肉内のように
内部適用されることが好ましい。経皮、局所または損傷
部内などの投与の他の形態も有用である。座薬中の包含
物としても有用である。薬学的に受容できるキャリアー
もある態様においては有用である。 実施例 実施例１ ６−アザ−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメチ
ル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプロピルホ
スホアミジチル）チミジンの合成、即ち ６−メチル−２−（５′−０−ジメトキシトリフェニ
ルメチル−３′−０−β−シアノエチルジイソプロピル
ホスホアミジチル−２′−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ
−ペントフラノシル）−1,2,4−トリアジン−3,5（2H、
4H）−ジオン A.6−メチル−3,5−ビス（トリメチルシロキシ）−1,2,
4−トリアジンの合成 濃縮器および乾燥管に取り付けられた丸底フラスコ中
（50ml）の６−アザチミン（アルドリッチ化学社から購
入）（5.0g、39.4mmol）、ヘキサメチルジシラザン（HM
DS）（15ml），およびクロロトリメチルシラン（TMSC
l）（0.5ml）混合物を油浴中にて加熱（150℃）により
還流する;NH4Clを白色粉末として濃縮器中に回収する。
透明な溶液が得られた時（〜１時間）、過剰のHMDS/TMS
Clを30℃／トル（浴温度100℃）で蒸留により除去し
た。残渣油は真空下（0.1トル）の乾燥で結晶化し6.57g
（61％）の６−メチル−3,5−ビス（トリメチルシロキ
シ）−１、２、４−トリアジンを得た、mp43℃。 B.2−（２デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β
−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−６メチル−1,2,
4−トリアジン−３、５（2H、4H）−ジオンの合成 乾燥CHCl3（300ml）中の６−メチル−3,5−ビス（ト
リメチルシロキシ）−1,2,4−トリアジン（4.0g,14.7mm
ol）および２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイ
ル−ａ−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシルクロライド
（4.8g12.4mmol）を無水状態で室温で撹拌した。Cul
（2.4g,12.4mol）をこの溶液に加え、生成したスラリー
を３時間環境温度で撹拌し、このとき薄相トロマトグラ
フィー（TLC）にて反応が完了した事が示された。混合
物を飽和水性NaHCO3（200ml）で処理し、15分間撹拌
し、CH3Clで洗浄した（２×50ml）セライトのパットを
通して濾過した。有機相を飽和NaCl（200ml）で洗い、
乾燥（MgSO4）および濃縮して粘着性の残渣を得た。こ
の物質は本質的にTLCで１スポットであった。EtOAc/ヘ
キサン（1:1）を使用して短いシリカゲルカラムを通し
て迅速な濾過を行い、所望の幾つかの化合物の画分を得
た。EtOHからの残渣の結晶化は白色針状の生成物を与え
た:3.64g（63％）、mp170℃。第二群は濾過物より回収
した（730mg,12.6％）。 C.6−アザチミジン［２−（２−デオキシ−β−Ｄ−エ
リスロ−ペントフラノシル）−６メチル−1,2,4−トリ
アジン−３、５（2H、4H））−ジオン］の合成 無水MeOH（15ml）中のブロックされたヌクレオシド、
２−（２−デオキシ−３、５、−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイ
ル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−６−メチ
ル−1,2,4−トリアジン−３、５（2H、4H）−ジオン、
上記（480mg,1mmol）に乾燥NaOMe（50mg）を加え、室温
で攪拌した。１時間後のTLCはトルオイル基の完全脱ブ
ロッキングを示した。溶液を1mlのDowex−50（水素型）
イオン交換樹脂を添加することにより中性にした。懸濁
液を濾過し、濾過物を乾燥するまで減圧下で蒸発させ
た。残渣を水（3ml）に溶解し、CHCl3で洗浄した（３×
5ml）。水性相は凍結乾燥させ、堅い泡（hard foam）を
与え、さらに0.1トルの真空デシケーター中でP2O5上で
乾燥させた。化合物は96％の収率で得られ（230mg）文
献値と比較した時、例えばUV,NMR,TLCおよびmpが同一で
あった。 D.2−［２−デオキシ−５′−（４、４′−ジメトキシ
トリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−
６−メチル−1,2,4−トリアジン−３、５（2H、4H）−
ジオンの合成（６−アザチミジン５′−DMT） 上記のように合成した乾燥ピリジン（100ml）中のア
ザチミジン（2.43g,10mmol）の攪拌した溶液に、4,4′
−ジメトキシトリチルクロライド（4.06g、12mmol）お
よび４−ジメチルアミノピリジン（120mg,1mmol）を室
温で加えた。生成した黄色い溶液を６時間室温で攪拌
し、この時TLCでは反応が完了したことを示した。MeOH
（10ml）を加え溶液を真空で濃縮した。残渣をCH2Cl
2（200ml）に溶解し、飽和NaHCO3（100ml）、次いで飽
和NaCl（100ml）で抽出し、次ぎに乾燥した（MgSO4）。
濾過物および洗浄物を混合し、濃縮して粘着性の残渣を
得、EtOAc/トリエチルアミン（99/1）を使用してシリカ
ゲルクロクトグラフィーで溶出にし精製した。適当な分
画がプールされ、濃縮されて白色泡（3.82g70％）を得
た:1H NMR（CDCl3）6.56（t,1H,C1,H）および他のプロ
トン。 E.2−［２−デオキシ−５′−（４、４′ジメトキシト
リチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−６
−メチル−1,2,4−トリアジン−３、５（2H、4H）−ジ
オン３′−Ｏ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエ
チル−ホスホアミダイトの合成 上記合成６−アザチミジン５′−DMT,の攪拌した溶液
に（乾燥THF50ml中の1.63g3mmol）、ジイソプロピルエ
チルアミン（1.56ml,9mmol）を加え、溶液を０℃に冷却
した。塩化N,N−ジ−イソプロピル−β−シアノエチル
ホスホンアミド（1.42ml,6mmol）を滴下により上記溶液
に15分間にわたって加えた。反応混合物を次ぎに室温で
２時間攪拌した。酢酸エチル（100ml,1％のトリエチル
アミンを含有する）を加え、溶液を飽和NaCl溶液（２×
100ml）で洗浄した。有機相を乾燥（HgSO4）し、溶媒を
真空下で除去し、粘着性残渣を得た。精製物をEtOAc/ト
リエチルアミン（99/1V/V）を使用するシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーで溶出し精製した。適当な画分を
プールし濃縮して白色泡1.41g（66％）を得た;1H NMR
（CDCl3）δ6.65（m,l,C1H）、10.2（brs,l,NH）および
他のプロトン。 ６−アザ−ピリミジンの他の種類は６−アザ−２′−
デオキシシチジン（６−Aza dC）,6−アザ−２′−デオ
キシウリジン（６−Aza dU）,6−アザ−５−メチルシチ
ジン（６−Aza−５−メチルＣ）,6−アザ−５−ブロモ
ウリジン（６−アザ−５−ブロモＵ）,5−フルオロシチ
ジン（５−フルオロＣ）および５−ブロモシチジン（５
−ブロモＣ）を含む手順を使用して合成できる。加え
て、５−アザウリジンは開始物質1,3,5,−トリアジン−
2,4（1H,3H）−ジオン（シグマ化学）から同様に合成で
きる。 実施例２ ５−および／または６−修飾チミンおよびシトシン２′
−デオキシリボヌクレオシド−５′−DMT−３′−ホス
ホアミダイトからオリゴヌクレオチドへの転換法 表ＩはCGP支持体上でのDNA合成手順に関して示してい
る。５−および／または６−修飾チミン、シトシン５′
−ジメトキシトロフェニルメチル−２′−デオキシリボ
ヌクレオシドの合成前に、すなわち一般的に複素環およ
び／または糖において修飾を有する任意のヌクレオシド
を、そのような修飾ヌクレオシドをオリゴヌクレオチド
配列の各３′末端に付着するためにCPG支持体に結合し
たヌクレオシドの５′−ヒドロキシルへ結合させる事が
できる。 あるアンチセンスオリゴヌクレオチドの終結３′−位
に存在するであろう修飾したチミジンまたは２′−デオ
キシシチジンは、それらの５′−DMT（シトシン４−エ
キソサイクリックアミノはヘンゾイル化されている）に
より保護され、ピリジンおよびジメチルアミノピリジン
中でトリフルオロ酢酸／ブロモ酢酸混合無水物で50℃で
５時間処理される。溶液を減圧下で蒸発させ、酢酸エチ
ルに溶解した薄いシロップとしシリカゲルのカラムに通
す。均一の画分を集めて、乾燥するまで蒸発させた。10
mlのアセトニトリル溶液、10マイクロモルの３′−０−
ブロモメチルエステル修飾ピリミジンヌクレオシドおよ
び1mlのピリジン／ジメチルアミノピリジン（1:1）をゆ
っくりと（60から90秒）１マイクロモルのCPGチミジン
のカラム（遊離の５′−ヒドキシル基を与えるための標
準的条件にしたがった酸処理を予め行ったもの：アプラ
イドバイオシステムズ社）に注入して通す。CPGカラム
に結合した他のヌクレオシドも採用できるであろう。溶
出液を集めて、カラムに再び注入して通す。この工程を
３度繰り返す。CGPカラムを10mlのアセトニトリルでゆ
っくりと洗浄し、次にABI380B核酸合成機につける。表
Ｉに記載されたオリゴヌクレオチド合成が今開始され
る。CGP支持体からチミジンエステル結合を開裂する濃
水酸化アンモニウム脱保護の標準条件は、ピリミジン修
飾ヌクレオシドCPGヌクレオシドに始めに結合したチミ
ジンとを連結するエステル結合も開裂する。 DNAの標準的合成は表Ｉにしたがって、支持体上の１
−10マイクロモルのヌクレオシドを使用して、CPG LCAA
上で完了できる。ヌクレオシドに結合したポリマーはア
プライドバイオシステム社から購入した。合成は自動合
成機（ABI380B）を使用して連続流（3.0−3.5ml/min）
で完了した。ホスホアミダイトの縮合は乾燥窒素下で行
った。合成の完了時に、オリゴヌクレオチド開裂および
脱保護を濃アンモニアで55℃、24時間処理して行った。
最終生産物の純度および大きさはポリアクリルアミドゲ
ルの電気泳動的分析で確認した。 合成サイクルは４つの基本的な工程が組合わされてい
る:1）５′−ジメトキシトリチル保護基を除去するため
の酸処理;2）DNAについてのヌクレオシド−３′−ジイ
ソプロピルホスホアミダイトでのポリマー結合ヌクレオ
シドの縮合、および３）酸化、アセトニトリル中のヨー
ドおよび水を使用してホスファイト結合をホスフェイト
結合に変換する；および４）無水酢酸でのキャッピング
およびDMAPでの未反応部位のブロックオフ（block of
f）および残存湿度の除去。 自動合成機により所望の配列を集成させた後、最終生
産物をポリマーから開裂させ、脱保護し単離した。 脱保護はポリマー支持体を水酸化アンモニウム（NH4O
H）で55℃,20時間処理することにより行った。粗物質は
HPLC上のトリチル−により精製した。脱トリチル化は３
％酢酸エチル続いて酢酸エチルでの抽出で行った。精製
は塩化ナトリウム／エタノール沈殿（２×）およびHPCL
により行った。すべての上記混合配列は試料のリン酸転
移（kinasing）および大きさの測定により特性決定し
た。 実施例３ 以下に掲げる６−アザ−チミン−修飾オリゴヌクレオ
チドの合成は実施例２に従って行われ、５−および／ま
たは６−修飾チミンまたはシトシン５′−ジメトキシト
リフェニルメチル−２′−デオキシリボヌクレオシド
の、CPGに結合したヌクレオシドの５′ヒドロキシルへ
の付着が提供された。実施例１において提供された方法
に従って合成されたホスホアミダイトは以下の配列を有
するオリゴヌクレオチドに含有され、それらのヌクレア
ーゼ耐性特性ゆえに有用である。 実施例４ 以下に掲げる６−アザ−シトシン−修飾オリオヌクレ
オチドの合成は実施例２に従って行われ、５−および／
または６−修飾チミンおよびシトシン２′−デオキシリ
ボヌクレオシド−５−DMP−３′−ホスホアミダイトオ
リゴヌクレオチド中へ転換法が提供された。実施例１に
おいて特定された方法に従って合成されたホスホアミダ
イトはヌクレアーゼ耐性を増加させるために以下の配列
野生型塩基から置換される。 実施例５ ５−および／または６−位修飾チミンの対応するチミ
ジンへの転換（デオキシリボシレーション） チミン類似体を、たとえばヘキサメチルジシラザン
（HMDS）および酸触媒（即ち、塩化アンモニウム）のよ
うな種々の標準的条件下でトリメチルシリル化し、次に
3,5−０−ジトルオイル−２−デオキシ−ａ−Ｄ−エリ
スロ−ペントフラノシルクロライドで種々のルイス酸触
媒（即ち、塩化第二スズ、ヨード、ホウ素、テトラフル
オホウ酸塩等）の存在下において処理した。特異的な方
法が最近フレスコス（J.N.Freskos）により記載された,
Nucleosides＆Nucleotides,8:1075−1076（1989），こ
れには銅（Ｉ）ヨウ化物が触媒として採用されている。 実施例６ ６−アザ−５−ブロモ−５′−０−（ジメトキシトリ
フェニルメチル）−３′−０−（β−シアノエチルジイ
ソプロピルホスホアミジチル）−２′−デオキシウリジ
ンの合成、即ち６−ブロモ−２−（５′−Ｏ−［ジメト
キシトリフェニルメチル］−３−０−［β−シアノエチ
ルジイソプロピルホスホアミジチル］−２′−デオキシ
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−1,2,4−ト
リアジン−3,5−（2H,4H）−ジオン 必要な複素環、６−ブロモ−1,2,3−トリアジン−3,5
（2H,4H）−ジオンをクリステスク（C.Cristescu）,Re
v.Roumanie Chim.20:1287（1975）に従って調製した。
この物質のデオキシリボシレーションおよび引き続きの
DMTおよびアミダイト化学は、実施例1,2および５に説明
したように行った。 実施例７ ５−および／または６−位修飾チミジンの対応する
２′デオキシシチジンへの転換（ピリミジン型４−ケト
基から４−アミノ基への化学転換） 修飾チミジン型の３′,5′−糖水酸基を、トルオイ
ル、ベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイル、アセチル、イ
ソブチル、トリフルオロアセチル等で、酸クロライドま
たは無水物、およびピリジン／ジメチルアミノピリジン
溶媒および触媒を使用して保護する。保護されたヌクレ
オシドはピリジンまたは他の適当な塩基性溶媒中の塩化
チオニルまたは塩化ホスホリルで塩素化する。ピリミジ
ン型４−塩素基はつぎにメタノール中のアンモニウムで
置換される。糖水酸基の脱保護もまた起こる。アミノ基
は標準的な２段階の完全ベンジレーションによりベンゾ
イル化され（糖水酸基およびアミノ基ならびにアシル基
は水酸化ナトリウム溶液により選択的に除去される。択
一的に、ヌクレオシドをクロロトリメチルシランで第一
に処理するin situ工程および引き続きアシレーション
から糖水酸基を保護するための塩基を採用できる。もう
ひとつの転換法はピリミジン型４−塩素基を1,2,4−ト
リアゾロ基（DNA合成機上にオリゴヌクレオチド合成を
通じて完全に維持され、オリゴヌクレオチドをCPG支持
体から除去し複数環の脱保護をおこなう水酸化アンモニ
ウム工程中のアンモニウムにより置き換えられる）で置
換する。さらに多くの場合、ピリジン型４−塩素基は単
に記載され、オリゴヌクレオチド合成の最後に置換され
るものとして利用され得る。５−アザ−シチジンおよび
５−ニトロ−シチジンはそのウリジン類似体に従って得
ることができる。同様に、４−クロロ−５−メチルメル
カプトシチジンは記載のごとく合成される。 実施例８ ６−アザ−５−ブロモ−５′−０−（ジメトキシトリ
フェニルメチル）−３′−０−（β−シアノエチルジイ
ソプロピルホスホアミジチル）−２′−デオキシシチジ
ンの合成、即ち５−アミノ−６−ブロモ−２−（５′−
０−ジメトキシトリフェニルメチル−３′−０−β−シ
アノエチルジイソプロピルホスホアミジチル−２′−デ
オキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフルオロシル）−1,
2,4−トリアジン−３（2H）−オン この単量体はデオキシリホシル化６−ブロモ−1,2,3
−トリアジン−3,5（2H、4H）−ジオン（実施例７に従
う）を実施例５による２′−デオキシシチジン類似体へ
の転換により調製される。 実施例９ 1.5−トリフルオロ−５′−０−（ジメトキシトリフェ
ニルメチル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプ
ロピルホスホアミジチル）−２′−デオキシウリジンの
合成、即ち１−（５′−［４、４′−ジメトキシトリチ
ル］−２′−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラ
ノシル）5,5,5−トリフルオロチミン トリフロオロチミジン（1,2.0g），（PCR社、グラン
スビル、FLから購入）を２度ピリジンと共蒸発させ、つ
いで無水ピリジン（100ml）中にアルゴン雰囲気下で溶
解した。4,4′−ジメチルアミノピリジン（50mg）およ
び4,4′−ジメトキシトリチルクロライド（2.74g）を連
続的に溶液に加えて、次に室温で６時間攪拌した。反応
混合物を100mlの水で処理しジエチルエーテル（４×100
ml）で繰り返し抽出した。エーテル抽出物をプールし、
硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し次に蒸発させオレ
ンジガムを得た。このガムはトルエンと共蒸発させ（３
×25ml）次に酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン
（49/49/2,V/V）を溶出液として使用する120mgのシリカ
ゲルカラム上でクロマトグラフィーを行った。適当な画
分をプールし、蒸発させて0.77gの（19％）の固形泡を
得た。1H−NMR（DMSO−d6）δ8.05（s,1H,H−６）;7.4
−6.7（2m,13H,芳香族）;6.05（t,1H,H−１′）。 2.1−（５′−［4,4′−ジメトキシトリチル］−２′−
デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−5,
5,5−トリフルオロチミン−３′−０−N,N−ジイソプル
ピル−β−シアノエチルホスホアノダイト（３）の合成 無水THF中の５−トリフルオロ−５′−０−（ジメト
キシトリフェニルメチル）−３′−０−（β−シアノエ
チルジイソプロピルホスホアミジチル）−２′−デオキ
シウリジン、即ち１−（５′−［4,4′−ジメトキシト
リチル］−２′−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペント
フラノシル）−5,5,5−トリフルオロチミン（２）（0.7
0g,1.2mMol）攪拌溶液中に、ジイソプロピルエチルアミ
ン（1.0ml）をアルゴン雰囲気下で加えた。この溶液
に、塩化N,N−ジイソプロピルシアノエチルホスホアミ
ダイ（0.33ml,1.44mMol）を５分間にわたって滴下し
た。この混合物を室温で３時間攪拌した。この終わりの
時に、反応混合物を乾燥するまで真空で蒸発させ、生成
した粘性残渣をCH2Cl2（75ml）に溶解した。溶液を飽和
NaHC03（２×35ml）および塩水（35ml）で洗浄した。有
機相を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過およ
び真空で蒸発させ無色のガムを得た。この物質をCHCl3/
トリエチルアミン（99/1,V/V）を溶出液として使用する
60gのシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行っ
た。適当な画分をプールし、蒸発させて無色泡を得た
（0.6g,67％）。1H−NMR（DMSO−d6）δ8.15（s,1H,H−
６）;7.4−6.8（1m,13H,芳香族）;6.05（t,1H,H−
１′）。このホスホアミダイトは引き続き実施例２に説
明したオリゴヌクレオチド中に包含された。幾つかの例
は次のとおりである。 実施例10 ５−フルオロ−５′−０−（ジメトキシトリフェニル
メチル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプルピ
ルホスホアミジチル）−２′−デオキシウリジンをグレ
ンリサーチ社（Glenresearch Corporation）から購入し
た。これは以前オリゴヌクレオチドに挿入された。ハー
ベナー（J.F.Harbener）Proceedings of National Acad
emy of Science of the U.S.A.,85:1735−1739（198
8）。幾つかの例を以下に掲げる。 実施例11 ５−ブロモ−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメ
チル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプロピル
ホスホアミジチル）−２′−デオキシウリジン（これは
グレンリサーチ社から購入）を実施例２に説明した手順
にしたがって合成する間に、オリゴヌクレオチド中に挿
入した。 実施例12 ５−ブロモ−２′−デオキシシチジン−修飾オリゴヌ
クレオチド（以下に掲げる）の合成は実施例２に説明し
た方法で達成した。 実施例13 ５−メチル−２′−デオキシシチジン−修飾オリゴヌ
クレオチド（以下に掲げる）の合成は実施例２に説明し
た方法で、野生型シチジン塩基を５−メチル−２′デオ
キシシチジン（これはグレンリサーチ社から購入した）
に置換して達成した。 実施例14 ５−イオド−２′−デオキシウリジン−修飾オリゴヌ
クレオチド（以下に掲げる）の合成は実施例２に説明し
た方法で、野生型ウリジン塩基を５−イオド−２′デオ
キシウリジン（これはグレンリサーチ社から購入した）
に置換して達成した。 実施例15 ５−イオド−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメ
チル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプロピル
ホスホアミジチル）−２′−デオキシシチジンの合成は
実施例２および７に説明された方法を利用して達成され
た。 実施例16 ５−クロロ−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメチ
ル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプロピルホ
スホアミジチル）−２′−デオキシウリジンの合成 ５−クロロウラシルはアルドリッチ化学社から入手で
きる。この物質は実施例1,2および５に説明された方法
をに従って表題のホスホアミダイトに転換される。 実施例17 ５−クロロ−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメ
チル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプロピル
ホスホアミジチル）−２′−デオキシシチジンの合成は
実施例２および７に説明された方法に従って達成され
た。 実施例18 ５−ニトロ−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメチ
ル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソプロピルホ
スホアミジチル）−２′−デオキシウリジンの合成 ５−ニトロウラシルはアルドリッチ化学社から入手で
きる。この物質は実施例1,2および５に説明された方法
に従って表題のホスホアミダイトに転換される。 実施例19 ５−（2,4−ジニトロフェニルメルカプト−５′−０−
（ジメトキシトリフェニルメチル）−３′−０（β−シ
アノエチルジイソプロピルアミノホスフィニル）−２′
−デオキシウリジンの合成 ５−メルカプト−２′−デオキシウリジン（Foxらの
方法、Journal of the American Chemical Society81:1
78（1959）によって得た）を等量の水素化ナトリウムお
よび2,4−ジニトロフェニルフルオライドで処理するこ
とにより2,4−ジニトロフェニルスルフィニル誘導体に
転換する。この物を質実施例１に説明されたように５′
−DMT3′−ホスホアミダイトに転換する。 実施例20 ４−クロロ−５−（2,4−ジニトロフェニルメルカプト
−５′−０−（ジメトキシトリフェニルメチル）−３′
−０−（ｂ−シアノエチルジイソプロピルアミノホスフ
ィニル）−２′−デオキシシチジンの合成 ５−メルカプト−２′−デオキシウリジン（Foxらの
方法、Journal of the American Chemical Society81:1
78（1959）によって得た）を等量の水素化ナトリウムお
よび2,4−ジニトロフェニルフルオライドで処理して2,4
−ジニトロフェニルスルフィニル誘導体に転換する。こ
の物質をアセチル化、塩素化および実施例１および５に
説明されたように５′−DMT−３′−ホスホアミダイト
に転換する。 実施例21 ５−メチルメルカプト−５′−０−（ジメトキシトリフ
ェニルメチル）−３′−０−（β−シアノエチルジイソ
プロピルアミノホスフィル）−２′−デオキシウリジン
の合成 ５−メルカプト−２′−デオキシウリジン（Foxらの
方法、Journal of the American Chemical Society81:1
78（1959）によって得た）を等量の水素化ナトリウムお
よびヨウ化メチルで処理してメチル誘導体に転換する。
この物質を実施例１に説明された方法に記載されたよう
に５′−DMT−３′−ホスホアミダイトに転換する。 実施例22 ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドがそれらの相補的
RNAまたはDNA配列にハイブリダイズする能力を熱溶解分
析で決定した。RNA相補体はT7RNAポリメラーゼで合成
し、DNAの鋳型−プロモーター（tmplate−promoter）は
アプライドバイオシステム社の380Bで合成した。RNA種
はFPLC（LKB−ファルマシア社）を使用してイオン交換
により精製した。天然アンチオリゴヌクレオチドまたは
ピリミジン修飾を特異的位置に含有するアンチセンスオ
リゴヌクレオチドのいずれもRNAまたはDNA相補体のいず
れかを化学量論的濃度で添加され、二重鎖がランダムコ
イルに転移する時の濃色効果（260nm）をギルホードレ
スポンス分光光度計で監視された。これらの測定は10mM
Naリン酸、pH7.4,0,1mM EDTA、およびNaClで0.1Mから
1.0Mの10のイオン強度を作成した緩衝液中で行われた。
データは1/Tm対1n［Ct］のグラフ表示され、ここで［C
t］は全オリゴヌクレオチド濃度であった。この分析か
ら熱力学的パラメーターが決定された。特定のこれらの
結果を表IIに表す。 表II 修飾に関する融解温度（Tm）データ ５′から３′への修飾部を読むオリゴヌクレオチド
５′TCC AGG TGT CGG CAT C3′の１から16位のピリミジ
ン修飾のTm（℃） ６−Aza T162.81562.07,958.21,7,9,1554.56−Aza dC
263.02,359.810,1151.06−Me dU163.21562.57,955.71,
7,9,1552.35,6−DiMe dU1560.37,954.71,7,9,1552.55−
Iodo dU163.51563.37,7,9,1561.55−Bromo dU163.5156
3.37,963.31,7,9,1561.55−Fluoro dU163.21563.27,96
5.01,7,9,1563.75−Bromo dC10,1165.82,3,10,11,1368.
05−Me dC10,1165.32,3,10,11,1367.0 形成されたヘテロ二重鎖の二重安定性に関して得られ
た情報に基づいて修飾ピリミジンのオリゴヌクレオチド
中への配置は、そのヘリックス安定性効果に関して評価
された。ハイブリッドの安定性を劇的に変える修飾は、
自由エネルギー（デルタＧ）の減少を表し、そしてアン
チセンスオリゴヌクレオチドとしてのそれらの有用性に
関して決定された。このような安定性関するレトロスペ
クティブな研究を表IIIに示す。 表III 二重鎖安定性および特異性に関するピリミジン修飾の効
果 化合物安定性 対特異性 対DNA 標的DNA 標的天然
DNA0＋4.26−Aza T＋0.6＋3.76−Aza dC＋1.9＋6.06
−Me dU＋1.3＋3.05,6−DiMe dU＋1.1＋1.55−Iodo dU
＋0.3−５−Bromo dU−0.3＋4.95−Fluoro dU−0.2＋4.
45−Bromo dC−0.1＋6.55−Methyl dC−0.2＋6.3 ピリミジン修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが特
異的に標的mRNAにハイブリダイズする能力は、全細胞性
RNAの存在下で精製標的mRNAのノーザンブロット分析に
より示された。標的mRNAは、T7RNAポリメラーゼプロモ
ーターから下流に位置する標的mRNAに関するcDNAを含有
するベクターから合成された。合成されたmRNAはアガロ
ースゲル電気泳動ならびに適当な支持体膜（すなわちニ
トロセルロース）に転写された。支持体膜はブロックさ
れ．、［32P］−標識アンチセンスオリゴヌクレオチド
を使用してプローブとされた。 ストリンジェンシー（stringency）はブロットを複製
し、上昇温度または減少イオン強度の洗浄バッファーの
いずれかで洗浄して測定された。オートラジオグラフィ
ーはヘテロ二重鎖形成の存在を評価するために行い、な
らびにオートラジオグラムはレーザーテンシトメーター
（LKB−Pharmacia社）により定量した。 ハイブリッド形成の特異性は、標準法にて全細胞性RNA
の単離およびそのアガロース電気泳動による分析によ
り、膜転写および標識ピリミジン修飾オリゴヌクレオチ
ドによるプロービングにより決定した。非修飾アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドに関するストリンジェンシーは
予め決定され、ならびに使用された条件は標識mRNAのみ
がピリミジン修飾オリゴヌクレオチドとヘテロ二重鎖を
形成できものであった。 実施例23 天然、ホスホロチオエートおよびピリミジン修飾オリ
ゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを種々の濃度の
胎児ウシ血清（FSC）または成人ヒト血清を含有する培
地中でそれらの血清ヌクレアーゼ耐性に関して評価され
た。標識したオリゴヌクレオチドは種々の時間インキュ
ベーションされ、プロテアーゼＫで処理されて次に20％
ポリアクリルアミド−尿素変性ゲル電気泳動、引き続き
オートラジオグラフィーで分析された。オートラジオグ
ラムは、レーザーデンシトメトリーで定量した。修飾の
位置およびオリゴヌクレオチドの既知の長さに基づき、
特定のピリミジン修飾によりヌクレアーゼ分解に関する
効果を決定することが可能である。細胞質ヌクレアーゼ
についてはHL60細胞系を使用した。ミトコンドリア上澄
後を分画遠心分離によって調製し、標識オリゴヌクレオ
チドをこの上澄中で種々の時間インキュベーションし
た。インキュベーションの後、オリゴヌクレオチドは、
血清核酸溶解分解に関して上記に概述されたように評価
された。オートラジオイグラフィーの結果は、非修飾、
ホスホロチオエートおよびピリミジン修飾オリゴヌクレ
オチドの比較用に定量された。 特別なヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアー
ゼ、３′,5′−エキソ−および５′,3′−エキソヌクレ
アーゼ）に対する天然、ピリミジン修飾オリゴヌクレオ
チドの耐性の評価がなされ、分解に対する修飾の正確な
効果が決定された。修飾されたオリゴヌクレオチドを種
々の選択されたヌクレアーゼに特異的で明確な反応緩衝
液中でインキュベーションした。プロテアーゼＫで生成
物を処理した後に尿素が添加され、尿素含有20％ポリア
クリルアミドゲルの分析がなされた。ゲル生成物はステ
インズオール（Steins All:シグマ化学社）を使用して
染色することにより視覚化された。レーザーデンシトメ
トリーは、分解の程度を定量するために使用された。ピ
リミジン修飾の効果は特別なヌクレアーゼに関して行な
われ、血清および細胞質系から得た結果と比較された。 そのような試験のひとつにおいて、約1mg/mlの修飾ピ
リミジン関連オリゴヌクレオチドを37℃で、熱活性化10
％FSCを補給したDMED中でインキュベーションした。種
々の時間点において、アリコートが分取され、等量の9M
尿素/1xTBE緩衝中で混合され、−20℃で凍結された。試
料をポリアクリルアミド電気泳動（20％PA/7M尿素）で
分析しステインズオール試薬にて視覚化し、LKBレーザ
ーデンシトメーターを使用する定量に供した。ピークの
積算は完全長のオリゴヌクレオチドを表し、およびｎ−
１オリゴヌクレオチドを作成した。％分解を、試料の時
間０と比較することにより各時間に関して計算した。デ
ータをグラフ化し、修飾オリゴヌクレオチドのＴ1/2に
関するグラフでの推定を天然非修飾オリゴヌクレオチド
との比較により行った。６−aza T含有オリゴヌクレオ
チドを利用して、そのような６−aza T修飾オリゴヌク
レオチドが核酸溶解分解に対するより大きな耐性を示す
ことが分かった。６−アザＴ化合物に関して、修飾の数
を増加させるとFCS中での分解に対する安定性が増大し
た。さらに、最良の結果は、６−aza Tを３′−末端キ
ャップとして使用した時に得られた。そのような３′−
末端キャップを含有するオリゴヌクレオチドは、天然オ
リゴヌクレオチドを比較して３′−５′エキソ核酸溶解
分解からの保護を与えた。Ｔ1/2は天然オリゴヌクレオ
チドの20分から修飾オリゴヌクレオチドに関する４時間
のＴ1/2に増加した。これはFCS存在下におけるオリゴヌ
クレオチドの分解の感受性を12倍減少させたことを表し
た。この試験結果はFSC、これは天然非修飾オリゴヌク
レオチドを３′末端から分解すると知られているが、３
つの６−aza Tブロックを適当な基質として認識しない
ことを示唆する。このような認識の欠如は修飾オリゴヌ
クレオチドの加水分解をおおいに減少させる。 実施例24 リボリクレアーゼＨ活性 標的mRNAのRNaseによる開裂は、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの阻害効果をおおいに増大させる。現在で
は大腸菌RNaseHは、DNA−RNAヘテロ二重鎖のDNA部分上
のたった３から４個の非修飾残基結合部位がRNAの開裂
を引き出すために必要であると思われている。この試験
に関し、各Ｔヌクレオチドを置換した６−aza Tを有す
る5LO mRNA（５′−AAA TAG TGT TGC TGA TCT TGA C−
３′）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドかRNas
eH試験に関して利用された。試験オリゴヌクレオチドの
中で、６−aza Tを含むように修飾された後は、２天然
塩基より離れないようにし−即ち、オリゴヌクレオチド
は大腸菌RNaseHによる認識を実証すべきである。天然相
補的DNA（５′AAA TAG TGT TGC TGA TCT TGA C−３′）
を比較の目的で合成した。５−LO mRNA（2.5kb）をin v
itro合成した。天然DNA（AAA TAG TGT TGC TGA TCT TGA
C）および６−aza T含有修飾オリゴヌクレオチド（AAA
TAG TGT TGC TGA TCT TGA C）、（双方とも５−LO mRN
Aに対するアンチセンスDNAである）を自動DNA合成で合
成した。各々の天然および修飾オリオヌクレオチドが３
倍モル過剰量の存在下でmRNAを30分間、60℃で加熱し、
天然オリゴヌクレオチドを対照に使用した。インキュベ
ーション後、溶液を37℃にゆっくりと冷却し、RNase H
（大腸菌）を添加した。RNase H処理溶液を37℃で30分
間静置した。分解生成物は1.2％アガロース／ホルムア
ルデヒド電気泳動で分析し、および定量のためにエチジ
ウムブロマイドで視覚化した。この結果は、RNase H
（大腸菌）が，天然のまたは６−aza Tを含有する修飾D
NAのいずれかに結合したmRNAを同等の効力で認識かつ開
裂できることを示している。
Claims (17)
- 【請求項１】リボースまたはデオキスリボースおよび塩
基部分を独立して含む複数の共有結合ヌクレオキシド単
位から成る、ヌクレアーゼ耐性を有する化合物であっ
て、ここで 複数の塩基部分はピリミジン塩基であり；そして 少なくともひとつのピリミジン塩基が構造： を有する修飾されたピリミジン塩基であり、ここで： ＸはOHまたはNH2であり； ＢはＣ−低級アルキル、N,C−CF3,C−F,C−Cl,C−Br,C
−I,C−ハロカルボン、Ｃ−NO2,C−OCF3,C−SH,C−SC
H3,C−OH,C−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−CH2OH,C−CH2SH,C
−CH2SCH3,C−CH2OCH3,C−NH2,C−CH2NH2,アルキル−NH
2,C−ベンジル、Ｃ−アリール、Ｃ−置換アリールまた
はベンジルから成る群から選択され、 ＡはＣ−H,N,C−CF3,C−F,C−Cl,C−Br,C−I,C−ハロカ
ルボン、Ｃ−NO2,C−OCF3,C−SH,C−SCH3,C−OH,C−Ｏ
−低級アルキル、Ｃ−CH2OH,C−CH2SH,C−CH2SCH3,C−C
H2OCH3,C−NH2,C−CH2NH2,C−ベンジル、Ｃ−アリー
ル、Ｃ−置換アリールまたはベンジルから成る群から選
択され；または ＡおよびＢは一緒にＡおよびＢを通じてピリミジン環に
融合された炭素または複素環の部分である、化合物。 - 【請求項２】上記修飾されたピリミジンが上記化合物の
３′または５′末端にある請求項１に記載の化合物。 - 【請求項３】約３個以下の修飾されたピリミジンが上記
化合物の３′末端に包含される請求項１に記載の化合
物。 - 【請求項４】少なくとも約１％の上記ピリミジン塩基が
修飾されている請求項１に記載の化合物。 - 【請求項５】ピリミジンの糖部分がリボースまたはデオ
キシリボースである請求項１に記載の化合物。 - 【請求項６】上記ヌクレオシド単位がホスホロチオエー
ト、メチルホスホネートまたはリン酸アルキレート基に
結合している請求項１に記載の化合物。 - 【請求項７】上記ヌクレオシド単位が炭素またはエーテ
ル結合基に連結している請求項１に記載の化合物。 - 【請求項８】薬学的に受容できるキャリアー中の請求項
１に記載の化合物。 - 【請求項９】対応する野生型化合物と比較して改良され
たヌクレアーゼ耐性を示す請求項１に記載の化合物。 - 【請求項１０】生物によるタンパク質の生産を変調させ
る方法であって、生物を該タンパク質をコードする選択
された核酸配列と特異的にハイブリダイズし、かつヌク
レアーゼ耐性を有する化合物と接触させ、ここで該化合
物はリボースまたはデオキシリボース糖部分および塩基
部分を独立して含む複数の共有結合ヌクレオシド単位か
ら成り、ここで 複数の塩基部分はピリミジン塩基であり；そして 少なくともひとつの該ピリミジン塩基が構造： を有する修飾されたピリミジン塩基であり、ここで： ＸはOHまたはNH2であり； ＢはＣ−低級アルキル、N,C−CF3,C−F,C−Cl,C−Br,C
−I,C−ハロカルボン、Ｃ−NO2,C−OCF3,C−SH,C−SC
H3,C−OH,C−Ｏ−低級アルキル、Ｃ−CH2OH,C−CH2SH,C
−CH2SCH3,C−CH2OCH3,C−NH2,C−CH2NH2,アルキル−NH
2,C−ベンジル、Ｃ−アリール、Ｃ−置換アリールまた
はベンジルから成る群から選択され、 ＡはＣ−H,N,C−CF3,C−F,C−Cl,C−Br,C−I,C−ハロカ
ルボン、Ｃ−NO2,C−OCF3,C−SH,C−SCH3,C−OH,C−Ｏ
−低級アルキル、Ｃ−CH2OH,C−CH2SH,C−CH2SCH3,C−C
H2OCH3,C−NH2,C−CH2NH2,C−ベンジル、Ｃ−アリー
ル、Ｃ−置換アリールまたはベンジルから成る群から選
択され；または ＡおよびＢは一緒にＡおよびＢを通じてピリミジン環に
融合された炭素または複素環の部分である方法。 - 【請求項１１】上記修飾されたピリミジンが上記化合物
の３′または５′末端にある請求項10に記載の方法。 - 【請求項１２】約３個以下の修飾されたピリミジンが上
記化合物の３′末端に包含される請求項10に記載の方
法。 - 【請求項１３】少なくとも約１％の上記ピリミジンが装
飾されている請求項10に記載の方法。 - 【請求項１４】ピリミジンの糖部分がリボースまたはデ
オキシリボースである請求項10に記載の方法。 - 【請求項１５】上記ヌクレオシド単位がホスホロチオエ
ート、メチルホスホネートまたはリン酸アルキレート基
に結合している請求項10に記載の方法。 - 【請求項１６】上記ヌクレオシド単位が炭素またはエー
テル結合基に連結している請求項10に記載の方法。 - 【請求項１７】上記化合物が対応する野生型化合物と比
較して改良されたヌクレアーゼ耐性を示す請求項10に記
載の方法。
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