JP2022505173A - 導入遺伝子を送達するための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本明細書で提供されるのは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸の標的細胞への標的化送達のための組成物、方法、およびシステムである。ゲノム編集によって細胞において導入遺伝子を発現させるための組成物、方法、およびシステムも提供される。さらに、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）を、ゲノム内の標的ゲノム遺伝子座、特にアルブミン遺伝子の遺伝子座にノックインするための組成物、方法、およびシステムが提供される。エクスビボおよび／またはインビボゲノム編集を使用して、障害もしくは健康状態を有するか、または有することが疑われる対象を治療するための組成物、方法、およびシステムも提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／７４７，１２８号の優先権の利益を主張し、図面を含め、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
配列表の組み込み
添付の配列表の内容は、参照により本出願に組み込まれる。０５２９８４－５３５００１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の添付の配列表テキストファイルは、２０１９年１０月８日に作成され、１２５ＫＢである。
本開示は、例えば、ヒト細胞などの標的細胞への核酸の標的化送達のための組成物、方法、およびシステムを提供する。本発明のいくつかの実施形態は、ゲノム編集によって細胞内で導入遺伝子を発現させるための組成物、方法、およびシステムに関する。
ゲノム配列決定技術および分析方法における最近の進歩により、多様な範囲の生物学的機能および疾患と関連付けられた遺伝的要因をカタログ化およびマッピングする能力が著しく加速されている。正確なゲノム標的化技術は、個々の遺伝的要素の選択的摂動を可能にすることによって、原因となる遺伝的変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）の系統的リバースエンジニアリングを可能にするために、ならびに合成生物学、生物工学的、および医学的応用を進歩させるために必要とされている。
最近、設計された部位特異的ヌクレアーゼを使用した遺伝子編集が、基本的な生物医学研究および治療法開発の両方のための技術として出現した。近年、４つの主要なタイプのエンドヌクレアーゼ、すなわち、メガヌクレアーゼおよびその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびにクラスター化された規則的配置の回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ９（ｃａｓ９）に基づく様々なプラットフォームが遺伝子編集のために開発されている。各ヌクレアーゼタイプは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を特定のＤＮＡ遺伝子座で誘発することができ、そのため、２つのＤＮＡ修復経路を引き起こす。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路は、ＤＳＢでランダムな挿入／欠失（インデル）変異を生成するが、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路は、ドナーテンプレート上に担持される遺伝情報でＤＳＢを修復する。したがって、これらの遺伝子編集プラットフォームは、遺伝子機能を破壊すること、変異遺伝子を正常に修復すること、およびＤＮＡ材料を挿入することなど、複数の方法において、特定のゲノム遺伝子座で遺伝子を操作することができる。
しかしながら、現在利用可能なゲノム編集技術は、例えば、精度、許容不能なレベルの標的外編集などの多くの不利点に悩まされ得る。したがって、遺伝子機能を破壊すること、変異遺伝子を正常に修復すること、および／または標的細胞のゲノム内のセーフハーバー遺伝子座などの特定の遺伝子座で異種ＤＮＡ材料を挿入することなど、複数の方法において、特定のゲノム遺伝子座で遺伝子を操作することができる新しいゲノム遺伝子編集プラットフォームに対する必要性が依然として存在する。
本明細書で提供されるのは、とりわけ、標的細胞、例えば、ヒト細胞への、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸の標的化送達のための組成物、方法、およびシステムである。ゲノム編集による標的化方式における導入遺伝子の細胞ゲノムへの組み込みによって、細胞で導入遺伝子を発現させるための組成物、方法、およびシステムも提供される。本開示の特定の態様および実施形態は、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）をゲノム内の特定のセーフハーバー位置、特に内因性アルブミン遺伝子座内またはその近くのゲノム位置にノックインするための組成物、方法、およびシステムに関する。さらに、エクスビボおよび／またはインビボゲノム編集を使用して、障害もしくは健康状態を有するか、または有することが疑われる対象を治療するための組成物、方法、およびシステムが提供される。
一態様において、本明細書で提供されるのは、内因性アルブミン遺伝子座内またはその近くのゲノム配列に相補的な配列を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列である。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、表３に列挙されるものから選択される配列、および表３に列挙されるもののいずれかに対して少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを有する。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、上記のｇＲＮＡのいずれかを有する組成物である。
一態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはｇＲＮＡをコードする核酸を含むシステムである。いくつかの実施形態において、システムのｇＲＮＡは、表３に列挙されるものから選択される配列、および表３に列挙されるもののいずれかに対して少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを有する。
いくつかの実施形態において、システムはさらに、以下：デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、および関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）またはその機能的誘導体をコードする核酸配列を有するドナーテンプレート、のうちの１つ以上を有する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチド、またはその機能的誘導体、またはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅに由来する（ｓｐＣａｓ９）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓに由来する（ＳｌｕＣａｓ９）。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。
いくつかの実施形態において、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、治療用ポリペプチドおよび予防用ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質、第ＩＸ因子タンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）タンパク質、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）タンパク質、第Ｘ因子（ＦＸ）タンパク質、プロテインＣ、セリンプロテアーゼ阻害剤Ｇ１（セルピンＧ１）、またはそれらのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質またはその機能的誘導体をコードする。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、ＦＩＸタンパク質またはその機能的誘導体をコードする。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、セルピンＧ１タンパク質またはその機能的誘導体をコードする。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ配列は、共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている。
いくつかの実施形態において、組成物はさらに、リポソームまたは脂質ナノ粒子を有する。
いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされている。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される。
いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡも有する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡと事前に複合体化されて、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、上記の組成物のいずれかを有し、さらに使用説明書を有するキットである。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、細胞においてゲノムを編集する方法である。本方法は、細胞に、以下：（ａ）本明細書に記載のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸のいずれか、（ｂ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｃ）関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）または機能的誘導体をコードする核酸配列を有するドナーテンプレート、を提供することを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、表３に列挙されるものから選択される配列、および表３に列挙されるもののいずれかに対して少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを有する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは任意のヌクレオチド、またはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅに由来する（ｓｐＣａｓ９）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓに由来する（ＳｌｕＣａｓ９）。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、コドン最適化されている。
いくつかの実施形態において、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸配列は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、治療用ポリペプチドおよび予防用ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＩＸタンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、ＦＸＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩタンパク質、ＦＸタンパク質、プロテインＣ、セルピンＧ１、またはそれらのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ配列は、共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている。
いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている。
いくつかの実施形態において、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの１つ以上は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される。
いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡも有する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、細胞への供給の前に、ｇＲＮＡと事前に複合体化され、ＲＮＰ複合体を形成する。
いくつかの実施形態において、（ａ）および（ｂ）は、（ｃ）が細胞に提供された後に細胞に提供される。
いくつかの実施形態において、（ａ）および（ｂ）は、（ｃ）が細胞に提供されてから約１日～１４日後に、細胞に提供される。
いくつかの実施形態において、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸配列は、細胞のゲノム配列に挿入される。
いくつかの実施形態において、挿入は、細胞のゲノムにおけるアルブミン遺伝子またはアルブミン遺伝子調節要素で、その中で、またはその近くである。
いくつかの実施形態において、挿入は、アルブミン遺伝子の第１のイントロン内である。
いくつかの実施形態において、挿入は、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第１のエクソンの末端の少なくとも３７ｂｐ下流であり、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第２のエクソンの開始の少なくとも３３０ｂｐ上流である。
いくつかの実施形態において、関心対象の遺伝子をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される。
いくつかの実施形態において、細胞は、肝細胞である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、細胞のゲノムが上記の方法のいずれかによって編集される遺伝子改変細胞である。
いくつかの実施形態において、関心対象の遺伝子をコードする核酸配列は、細胞のゲノム配列に挿入される。
いくつかの実施形態において、挿入は、細胞のゲノムにおけるアルブミン遺伝子またはアルブミン遺伝子調節要素で、その中で、またはその近くである。
いくつかの実施形態において、挿入は、アルブミン遺伝子の第１のイントロン内である。
いくつかの実施形態において、挿入は、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第１のエクソンの末端の少なくとも３７ｂｐ下流であり、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第２のエクソンの開始の少なくとも３３０ｂｐ上流である。
いくつかの実施形態において、関心対象の遺伝子をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される。
いくつかの実施形態において、関心対象の遺伝子をコードする核酸配列は、コドン最適化されている。
いくつかの実施形態において、細胞は、肝細胞である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、対象における障害または健康状態を治療する方法である。本方法は、上記の遺伝子改変細胞のいずれかを対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、またはＨＡＥを有するか、または有することが疑われる患者である。
いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、またはＨＡＥのリスクを有すると診断されている。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、自家である。
いくつかの実施形態において、細胞は、肝細胞である。
いくつかの実施形態において、関心対象の遺伝子をコードする核酸配列は、細胞のゲノム配列に挿入される。
いくつかの実施形態において、挿入は、細胞のゲノムにおけるアルブミン遺伝子またはアルブミン遺伝子調節要素で、その中で、またはその近くである。
いくつかの実施形態において、挿入は、アルブミン遺伝子の第１のイントロン内である。
いくつかの実施形態において、挿入は、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第１のエクソンの末端の少なくとも３７ｂｐ下流であり、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第２のエクソンの開始の少なくとも３３０ｂｐ上流である。
いくつかの実施形態において、関心対象の遺伝子をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される。
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、生物学的試料を対象から得て、生物学的試料が肝細胞の細胞を有することと、その関心対象の遺伝子をコードする核酸配列を細胞のゲノム配列に挿入することによって肝細胞の細胞のゲノムを編集することと、を有し、それによって遺伝子改変細胞を生成する（ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、対象における障害または健康状態を治療する方法である。本方法は、生物学的試料を対象から得て、生物学的試料が肝細胞の細胞を有することと、肝細胞の細胞に、以下：（ａ）上記のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸のいずれか、（ｂ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｃ）関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）または機能的誘導体をコードする核酸配列を有するドナーテンプレートを提供することと、それによって遺伝子改変細胞を生成することと、遺伝子改変細胞を対象に投与することと、を有する。
いくつかの実施形態において、対象は、ＦＶＩＩＩ欠乏症（血友病Ａ）、ＦＩＸ欠乏症（血友病Ｂ）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）、ハーラー症候群（ＭＰＳ１Ｈ）、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、および遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）からなる群から選択される障害もしくは健康状態を有するか、または有することが疑われる患者である。いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ａを有するか、または有することが疑われる患者である。いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ｂを有するか、または有することが疑われる患者である。いくつかの実施形態において、対象は、ＨＡＥを有するか、または有することが疑われる患者である。
いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害または健康状態のリスクを有すると診断されている。いくつかの実施形態において、対象は血友病Ａのリスクを有すると診断されている。いくつかの実施形態において、対象は血友病Ｂのリスクを有すると診断されている。いくつかの実施形態において、対象は、ＨＡＥのリスクを有すると診断されている。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、自家である。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、表３に列挙されるものから選択される配列、および表３に列挙されるもののいずれかに対して少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを有する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは任意のヌクレオチド、またはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅに由来する（ｓｐＣａｓ９）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓに由来する（ＳｌｕＣａｓ９）。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、コドン最適化されている。
いくつかの実施形態において、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）またはその機能的誘導体をコードする核酸配列は、コドン最適化されている。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ配列は、共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている。
いくつかの実施形態において、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの１つ以上は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される。
いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される。
いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡも有する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、細胞への供給の前に、ｇＲＮＡと事前に複合体化され、ＲＮＰ複合体を形成する。
いくつかの実施形態において、（ａ）および（ｂ）は、（ｃ）が細胞に提供された後に細胞に提供される。
いくつかの実施形態において、（ａ）および（ｂ）は、（ｃ）が細胞に提供されてから約１日～１４日後に、細胞に提供される。
いくつかの実施形態において、（ＧＯＩ）または機能的誘導体をコードする核酸配列は、細胞のゲノム配列に挿入される。
いくつかの実施形態において、挿入は、細胞のゲノムにおけるアルブミン遺伝子またはアルブミン遺伝子調節要素で、その中で、またはその近くである。
いくつかの実施形態において、挿入は、アルブミン遺伝子の第１のイントロン内である。
いくつかの実施形態において、挿入は、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第１のエクソンの末端の少なくとも３７ｂｐ下流であり、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第２のエクソンの開始の少なくとも３３０ｂｐ上流である。
いくつかの実施形態において、（ＧＯＩ）または機能的誘導体をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される。
いくつかの実施形態において、細胞は、肝細胞である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、対象における血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害または健康状態を治療する方法である。本方法は、対象における細胞に、以下：（ａ）上記のｇＲＮＡのいずれか、（ｂ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｃ）関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）または機能的誘導体をコードする核酸配列を有するドナーテンプレート、を提供することを有する。
いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害もしくは健康状態を有するか、または有することが疑われる患者である。
いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害または健康状態のリスクを有すると診断されている。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、表３に列挙されるものから選択される配列、および表３に列挙されるもののいずれかに対して少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを有する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは任意のヌクレオチド、またはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅに由来する（ｓｐＣａｓ９）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓに由来する（ＳｌｕＣａｓ９）。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、コドン最適化されている。
いくつかの実施形態において、ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする核酸配列は、コドン最適化されている。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ配列は、共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている。
いくつかの実施形態において、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの１つ以上は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される。
いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される。
いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡも有する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、細胞への供給の前に、ｇＲＮＡと事前に複合体化され、ＲＮＰ複合体を形成する。
いくつかの実施形態において、（ａ）および（ｂ）は、（ｃ）が細胞に提供された後に細胞に提供される。
いくつかの実施形態において、（ａ）および（ｂ）は、（ｃ）が細胞に提供されてから約１日～１４日後に、細胞に提供される。
いくつかの実施形態において、ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする核酸配列は、細胞のゲノム配列に挿入される。
いくつかの実施形態において、挿入は、細胞のゲノムにおけるアルブミン遺伝子またはアルブミン遺伝子調節要素で、その中で、またはその近くである。
いくつかの実施形態において、挿入は、細胞のゲノムにおけるアルブミン遺伝子の第１のイントロン内である。
いくつかの実施形態において、挿入は、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第１のエクソンの末端の少なくとも３７ｂｐ下流であり、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第２のエクソンの開始の少なくとも３３０ｂｐ上流である。
いくつかの実施形態において、ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される。
いくつかの実施形態において、細胞は、肝細胞である。
いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質または機能的誘導体をコードする核酸配列などの、ＧＯＩをコードする核酸配列は、対象の肝臓において発現される。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、対象における血友病Ａ、血友病Ｂ、またはＨＡＥを治療する方法である。本方法は、本明細書に開示される遺伝子改変細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、対象に対して自家である。いくつかの実施形態において、本方法は、（ｉ）対象から生物学的試料を得て、生物学的試料が肝細胞の細胞を含み、遺伝子改変細胞が肝細胞から調製されることを含む。
本明細書に記載の態様および実施形態の各々は、実施形態または態様の文脈から明示的または明確に除外されない限り、一緒に使用することができる。
前述の要約は単なる例示であり、決して限定することを意図されるものではない。本明細書に記載の例示的な実施形態および特徴に加えて、本開示のさらなる態様、実施形態、目的、および特徴は、図面および詳細な説明ならびに特許請求の範囲から完全に明らかになるであろう。
本開示の特定の特徴および利点の理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、およびその添付の図面を参照することによって得られるであろう。
異なるコドン最適化ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤコード配列のマルチプルアラインメントを示す。成熟コード配列のみが示されている（シグナルペプチド領域は削除されている）。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用した。 ＤＮＡドナーテンプレートの非限定的な例示的設計を示す。 Ｈｅｐａ１－６細胞におけるｍＡｌｂ ｇＲＮＡ－Ｔ１の切断効率のＴＩＤＥ解析結果を示す。 異なる用量のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂ ｇＲＮＡ＿Ｔ１、またはＰＢＳコントロールをカプセル化した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を投与した３日後における、マウスの肝臓および脾臓におけるＩＮＤＥＬ頻度の結果を示す。群あたりＮ＝５マウス、平均値がプロットされている。 実施例４で使用したアルブミンイントロン１への標的化された組み込みのためのＤＮＡドナーテンプレートの設計を示す。ＳＡ：スプライスアクセプター配列、ＬＨＡ：左相同性アーム、ＲＨＡ：右相同性アーム、ｐＡ：ポリアデニル化シグナル、ｇＲＮＡ部位：ｇＲＮＡ標的化Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる切断を媒介するｇＲＮＡの標的部位、Δフーリン：ＦＶＩＩＩにおけるフーリン部位の欠失、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ：ＢドメインがＳＱリンクペプチドで置き換えられているＢドメイン欠失（ＢＤＤ）を伴うヒトＦＶＩＩＩのコード配列。 ４名のドナーからの初代ヒト肝細胞におけるヒトアルブミンイントロン１を標的化する７つの候補ｇＲＮＡのＩＮＤＥＬ頻度を示す。 異なるアルブミンガイドＲＮＡおよびｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡでトランスフェクトした非ヒト霊長類（サル）初代肝細胞におけるＩＮＤＥＬ頻度を示す。 例示的なＡＡＶ－ｍＳＥＡＰドナーカセットの概略図を示す。 ＡＡＶへのパッケージングに使用される例示的なＦＶＩＩＩドナーカセットの概略図を示す。 血友病Ａマウスの血中ＦＶＩＩＩレベルを、ＡＡＶ８－ｐＣＢ０５６の注射、それに続くｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂＴ１ガイドＲＮＡをカプセル化したＬＮＰの注射後の時間経過で示す。 ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡをカプセル化したＬＮＰを注射した後１０日目および１７日目の血友病ＡマウスのＦＶＩＩＩレベルを示す。ＬＮＰは、ＡＡＶ８－ｐＣＢ００５６の１７日後または４日後に投与した。 ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子および異なるポリアデニル化シグナル配列を含む例示的なプラスミドドナーの概略図を示す。 ３つの異なるポリＡシグナル、それに続くＬＮＰカプセル化Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡによるプラスミドドナーの流体力学的注射後の、マウスにおけるＦＶＩＩＩ活性およびＦＶＩＩＩ活性／標的化された組み込み比を示す。群２、３、および４には、それぞれｐＣＢ０６５、ｐＣＢ０７６、およびｐＣＢ０７７が投与された。表は、個々のマウスについて、１０日目のＦＶＩＩＩ活性の値、標的化された組み込み頻度、およびＦＶＩＩＩ活性／ＴＩ比（比）が含まれる。 初代ヒト肝細胞における標的化された組み込みを評価するために使用される例示的なＡＡＶドナーカセットの概略図を示す。 ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｈＡＬｂ４ ｇＲＮＡのリポフェクションを伴うか、または伴わずに、ＡＡＶ－ＤＪ－ＳＥＡＰウイルスで形質導入された初代ヒト肝細胞の培地におけるＳＥＡＰ活性を示す。２つの細胞ドナー（ＨＪＫ、ＯＮＲ）を試験し、黒および白のバーで示される。左側の３対のバーは、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡのみ（最初のバーの対）、１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１０７（ＳＥＡＰウイルス）単独（２番目のバーの対）、または１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１５６（ＦＶＩＩＩウイルス）単独（３番目のバーの対）でトランスフェクトした細胞のコントロール条件でのＳＥＡＰ活性を表す。右側の４対のバーは、様々なＭＩＯのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１０７（ＳＥＡＰウイルス）で形質導入され、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｈＡｌｂＴ４ ｇＲＮＡでトランスフェクトした細胞のウェルにおけるＳＥＡＰ活性を表す。 ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｈＡＬｂ４ ｇＲＮＡのリポフェクションを伴うか、または伴わずに、ＡＡＶ－ＤＪ－ＦＶＩＩＩウイルスで形質導入された初代ヒト肝細胞の培地におけるＦＶＩＩＩ活性を示す。２つの細胞ドナー（ＨＪＫ、ＯＮＲ）を試験し、黒および白のバーで示される。左側の２対のバーは、１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１０７（ＳＥＡＰウイルス）単独（１番目のバーの対）、または１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１５６（ＦＶＩＩＩウイルス）単独（２番目のバーの対）で形質導入した細胞のコントロール条件でのＦＶＩＩＩ活性を表す。右側の４対のバーは、様々なＭＩＯのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１５６（ＦＶＩＩＩウイルス）で形質導入され、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｈＡｌｂＴ４ ｇＲＮＡでトランスフェクトした細胞のウェルからの培地におけるＦＶＩＩＩ活性を表す。 血液凝固第ＩＸ因子（Ｆ９、ＦＩＸ）のためのコドン最適化配列を含むＤＮＡテンプレートの非限定的な例示的設計を示す。ｈＦＩＸ ＳＡ：ｈＦＩＸスプライスアクセプター、ｓｐＡ＋：シグナルペプチド、スタッファー：ヒトマイクロサテライト配列に由来するスタッファーフラグメント、１８：１８ｂｐのランダム配列。 アルブミン遺伝子座の第１のイントロンにおける、図１７Ａに記載されたドナーＤＮＡテンプレートの標的化された組み込み効率を図にまとめて示す。 ヒトセルピンＧ１／Ｃ１阻害剤遺伝子（ＳＥＲＰＩＮＧ１）のコード配列を含むＤＮＡテンプレートの非限定的な例示的設計を示す。 アルブミン遺伝子座の第１のイントロンへの挿入後、１１日目に図１８Ａに記載されたドナーＤＮＡテンプレートから発現されたＳＥＲＰＩＮＧ１活性を図にまとめて示す。
本開示は、とりわけ、特定の位置、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞などの標的細胞のゲノムにおけるセーフハーバー遺伝子座などへの、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸の標的化送達のための組成物、方法、およびシステムを提供する。導入遺伝子の部位特異的送達は、それが挿入変異誘発のリスクを軽減できるため、ランダム組み込みに代わる有利な選択肢である。本開示のいくつかの態様および実施形態は、ゲノム編集による標的化方式で、細胞のゲノムに組み込まれた導入遺伝子を発現させるための組成物、方法、およびシステムに関する。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ゲノム内の特定のセーフハーバー位置に挿入され得、そのセーフハーバー遺伝子座に認められるプロモーターを利用し得るか、または挿入前に導入遺伝子に融合される外因性プロモーターによって導入遺伝子の発現調節を可能にし得る。いくつかの実施形態において、関心対象の導入遺伝子は、標的化された方式で、アルブミン遺伝子の第１のイントロンの近くまたはその中に組み込まれる。原則として、セーフハーバー遺伝子座に送達される導入遺伝子に特定の制限はない。いくつかの特定の態様および実施形態は、標的細胞のゲノムにおける特定のセーフハーバー遺伝子座として使用される、内因性アルブミン遺伝子座の中またはその近くのゲノム位置に組み込まれる、血液凝固タンパク質ＦＩＸおよびＣ１阻害剤（Ｃ１ＩＮＨ）などの関心対象の治療用タンパク質を発現するゲノム編集のための、システム、組成物、および方法に関する。本開示はまた、とりわけ、疾患または健康状態、例えば、血友病Ｂもしくは遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を有するか、または有することが疑われる対象を、エクスビボおよびインビボの両方で治療するためのシステム、組成物、および方法を提供し、障害または健康状態の治療における使用のためのシステム、および障害または健康状態の治療のための医薬品の製造における使用のためのシステムを含む。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、請求される主題が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。詳細な説明は例示的かつ説明的なものにすぎず、請求されるいかなる主題も制限するものではないことを理解されたい。本出願では、特に明記されていない限り、単数形の使用は複数形を含む。本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本出願において、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形式の使用は、限定的ではない。
本開示の様々な特徴は、単一の実施形態の文脈で説明され得るが、特徴はまた、別個に、または任意の適切な組み合わせで提供され得る。逆に、本開示は、明確にするために別個の実施形態の文脈で本明細書に記載され得るが、本開示はまた、単一の実施形態で実施され得る。本明細書で引用される公開された特許出願および他の公開された参考文献、文書、原稿、および科学文献は、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含め、本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表すことができる。約は、正確な量も含む。したがって、「約５μＬ」は、「約５μＬ」および「５μＬ」も意味する。一般に、「約」という用語には、±１０％などの実験誤差の範囲内であると予測される量が含まれる。
数値の範囲が本明細書で提示される場合、範囲の下限と上限の間の各介入値、範囲の上限と下限である値、およびその範囲とともに記載されたすべての値は、本開示に包含される。範囲の下限および上限内のすべての可能な下位範囲も、本開示により企図されている。
「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド」、「ペプチド配列」、「タンパク質」、「タンパク質配列」、および「アミノ酸配列」という用語は、アミノ酸残基の直線的な連続がペプチド結合によって互いに結合されていることを示し、連続には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、およびそれらのフラグメントが含まれ得る。タンパク質は、天然に発生するアミノ酸および／または合成（例えば、修飾されたまたは非天然起源）のアミノ酸から構成され得る。したがって、本明細書で使用される「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然に発生するアミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、融合タンパク質を含み、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有するか、または有さない異種および相同リーダー配列との融合、免疫学的にタグ化されたタンパク質、検出可能な融合パートナーを有する融合タンパク質、例えば、融合パートナーとして蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸配列の最初または最後のダッシュは、１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列とのペプチド結合、またはカルボキシルもしくはヒドロキシル末端基への共有結合のいずれかを示すことに留意されたい。しかしながら、ダッシュの欠如は、そのようなペプチド結合またはカルボキシルもしくはヒドロキシル末端基への共有結合が存在しないことを意味すると解釈されるべきではなく、そのような省略はアミノ酸配列の表示における慣例的なものである。
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド配列」、「オリゴマー」、「オリゴ」、「核酸配列」、または「ヌクレオチド配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの重合体型であり、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、または多本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を有する重合体を含むが、これらに限定されない。
「誘導体」および「バリアント」という用語は、本明細書に開示される化合物に由来する構造または配列を有し、その構造または配列が本明細書に開示されるものと十分に類似しており、そのため、それは同一もしくは類似の活性および効用、またはそのような類似性に基づいて、当業者によって、参照される化合物と同一もしくは類似の活性および効用を示すことが期待される、核酸またはタンパク質などの任意の化合物を指すが、これらに限定されず、したがってまた、「機能的に同等な」または「機能的同等物」と交換可能で言及される。「誘導体」または「バリアント」を得るための変更には、例えば、核酸またはアミノ酸残基のうちの１つ以上の付加、欠失、および／または置換が含まれ得る。
タンパク質の文脈において、機能的同等物または機能的同等物のフラグメントは、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有し得る。「保存的アミノ酸置換」という用語は、元のアミノ酸と同様の特性を有する別のアミノ酸へのアミノ酸の置換を指す。保存的アミノ酸の群は以下のとおりである。
Figure 2022505173000001
保存的置換は、好ましい所定のペプチドまたはそのフラグメントの任意の位置に導入され得る。しかしながらまた、非保存的置換、特に、任意の１つ以上の位置に非保存的置換を導入することが、これに限定されないが、望ましいものであり得る。ペプチドの機能的に同等のフラグメントの形成をもたらす非保存的置換は、例えば、誘導体またはバリアントフラグメントの機能性を維持しながら、極性、電荷、および／または立体的容積において、実質的に異なるであろう。
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントについて参照配列（付加または欠失を有さない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を有し得る。いくつかの例において、パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で発生して一致した位置の数を生じる位置の数を決定することと、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除することと、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることと、によって計算することができる。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一な」または「同一性」パーセントという用語は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、またはマニュアルのアラインメントおよび目視検査によって測定された、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大の対応について比較および整列させると、同一であるか、または同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（例えば、特定の領域、例えば、ポリペプチドの全ポリペプチド配列または個々のドメインにわたって、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性）を有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。そして、そのような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義は、試験配列の相補体も指す。
本明細書で互換的に使用される「相補的」または「実質的に相補的」という用語は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、別の核酸と、配列特異的な逆平行の方法で、非共有結合する、すなわち、ワトソン－クリック塩基対および／またはＧ／Ｕ塩基対を形成することを可能にする、ヌクレオチドの配列を有することを意味する（すなわち、核酸は相補的な核酸に特異的に結合する）。当技術分野で知られているように、標準的なワトソン－クリック塩基対形成には、チミジン（Ｔ）と対形成するアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）と対形成するアデニン（Ａ）、およびシトシン（Ｃ）と対形成するグアニン（Ｇ）が含まれる。
特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列は、適切な調節配列の制御下に配置されると、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードし得るか、またはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはガイドＲＮＡ、「非コード化」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードし得る。タンパク質コード配列または特定のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする配列は、ｍＲＮＡに転写され（ＤＮＡの場合）、適切な調節配列の制御下に配置されると、インビトロまたはインビボでポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）。
本明細書で使用される場合、「コドン」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子において遺伝暗号のユニットを一緒に形成する３つのヌクレオチドの配列を指す。本明細書で使用される場合、「コドン縮重」という用語は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列の変異を可能にする遺伝暗号における性質を指す。
「コドン最適化された」または「コドン最適化」という用語は、様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコード領域を指し、宿主生物の典型的なコドン使用を、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更することなく反映する、遺伝子または核酸分子のコード領域のコドンの変更を指す。そのような最適化は、少なくとも１つ、もしくは２つ以上、またはかなりの数のコドンを、その生物の遺伝子でより頻繁に使用される１つ以上のコドンで置き換えることを含む。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００８年３月２０日閲覧）の「コドン使用頻度データベース（Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）」から容易に入手可能である。各生物におけるコドン使用頻度またはコドン選択に関する知識を利用することによって、当業者は、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用し、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸フラグメントを生成することができるが、所与の種に最適なコドンを使用する。コドン最適化コード領域は、当業者に知られている様々な方法によって設計することができる。
例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合の「組換え」または「操作された」という用語は、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、実験方法によって修飾されているか、または実験室的方法の結果である。したがって、例えば、組換えタンパク質または操作されたタンパク質には、実験室の方法によって生成されたタンパク質が含まれる。組換えタンパク質または操作されたタンパク質は、タンパク質の天然（非組換えまたは野生型）形態内に認められないアミノ酸残基を含むことができるか、または修飾されている、例えば標識されている、アミノ酸残基を含むことができる。本用語は、ペプチド、タンパク質、または核酸配列への任意の修飾を含むことができる。そのような修飾には、１つ以上のアミノ酸、デオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドを含む、ペプチド、タンパク質、または核酸配列の任意の化学修飾、ペプチドまたはタンパク質における１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換、ならびに核酸配列における１つ以上の核酸の付加、欠失、および／または置換が含まれる。
「ゲノムＤＮＡ」または「ゲノム配列」という用語は、細菌、真菌、古細菌、植物、または動物のゲノムのＤＮＡを含むが、これらに限定されない、生物のゲノムのＤＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、核酸の文脈における「導入遺伝子」、「外因性遺伝子」、または「外因性配列」は、細胞のゲノムには存在しなかったが、ゲノムに人工的に、例えば、ゲノム編集を介して、導入された核酸配列または遺伝子を指す。
本明細書で使用される場合、核酸の文脈における「内因性遺伝子」または「内因性配列」は、人工的手段を介して導入されることなく、細胞のゲノムに天然に存在する核酸配列または遺伝子を指す。
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、別のＤＮＡセグメント、すなわち「挿入物」が、細胞において結合したセグメントの複製をもたらすように結合され得る、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンを意味する。
「発現カセット」という用語は、プロモーターに操作可能に連結されたＤＮＡコード配列を有するベクターを指す。「操作可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素が、それらが意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に操作可能に連結されている。「組換え発現ベクター」または「ＤＮＡ構築物」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ベクターおよび少なくとも１つの挿入物を有するＤＮＡ分子を指す。組換え発現ベクターは通常、挿入物（複数可）を発現および／もしくは増幅させる（ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ）目的のために、または他の組換えヌクレオチド配列の構築のために、生成される。核酸（複数可）は、プロモーター配列に操作可能に連結され得るか、または連結され得ず、ＤＮＡ調節配列に操作可能に連結され得るか、または連結され得ない。
「操作可能に連結された」という用語は、関心対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で調節配列（複数可）に連結されていることを意味する。「調節配列」という用語は、例えば、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、およびある特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。当業者は、発現ベクターの設計が、標的細胞の選択、所望の発現レベルなどのような要因に依存し得ることを理解するであろう。
細胞は、外因性ＤＮＡ、例えば組換え発現ベクターによって、そのようなＤＮＡが細胞内に導入されているときに、「遺伝子改変」または「形質転換」または「トランスフェクト」されている。外因性ＤＮＡの存在は、恒久的または一時的遺伝子変化をもたらす。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれ得る（共有結合される）か、または組み込まれ得ない。例えば、血友病Ａを治療するなど、治療活性を有する遺伝子改変された（または形質転換もしくはトランスフェクトされた）細胞を使用することができ、治療用細胞と呼ばれる。
ペプチドフラグメントなどの分子の文脈で使用される「濃度」という用語は、所与の体積の溶液中に存在する分子の量、例えば、分子のモル数を指す。
「個体」、「対象」、および「宿主」という用語は、本明細書で互換的に使用され、診断、治療、または療法が望まれる任意の対象を指す。いくつかの態様において、対象は哺乳動物である。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は患者である。いくつかの態様において、対象はヒト患者である。いくつかの態様において、対象は、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）に関連する障害もしくは健康状態を有する可能性があるか、または有することが疑われる。いくつかの態様において、対象は、血友病Ａを有する可能性があるか、もしくは血友病Ａを有することが疑われ、かつ／または血友病Ａの１つ以上の症状を有する。いくつかの態様において、対象は、診断時またはそれ以降に、ＧＯＩに関連する障害もしくは健康状態のリスクを有すると診断されるヒトである。いくつかの態様において、対象は、診断時またはそれ以降に、血友病Ａのリスクを有すると診断されるヒトである。いくつかの例において、ＧＯＩに関連する障害もしくは健康状態のリスクを有する診断は、ＧＯＩの発現に影響を与え得るゲノム内の内因性ＧＯＩまたはＧＯＩ付近のゲノム配列における１つ以上の変異の存在に基づいて決定することができる。
疾患または状態を指すために使用される「治療」という用語は、個体を苦しめる状態に関連する症状の少なくとも改善が達成されることを意味し、改善は、広い意味で、治療されている状態（例えば、血友病Ａ）に関連するパラメーター、例えば、症状の大きさの少なくとも低減を指す。したがって、治療はまた、病的状態、もしくは少なくともそれに関連する症状が、完全に抑制されるか、例えば、発生が防止されるか、または宿主がその状態、もしくは少なくとも状態に特徴的な症状にもはや苦しまないように、完全に排除される状況を含む。したがって、治療は、（ｉ）予防、すなわち、臨床症状を発症しないようにすること、例えば、疾患の進行を防止することを含む、臨床症状の発症のリスクを低減させることと、（ｉｉ）阻害、すなわち、臨床症状の発症またはさらなる発症を阻止する、例えば、活動性疾患を軽減または完全に阻害することと、を含む。
本明細書で使用される「有効量」、「薬学的有効量」、または「治療有効量」という用語は、特定の状態を有する対象に投与されると、所望の有用性を提供するのに十分な量の組成物を意味する。血友病Ａのエクスビボ治療の文脈において、「有効量」という用語は、血友病Ａの少なくとも１つ以上の兆候または症状を予防または緩和するために必要な治療用細胞集団またはそれらの子孫の量を指し、所望の効果を提供する、例えば、対象の血友病Ａの症状を治療する治療用細胞またはそれらの子孫を有する十分な量の組成物に関する。したがって、「治療有効量」という用語は、血友病Ａを有するか、またはそのリスクがある対象など、治療を必要とする対象に投与されると、特定の効果を促進するのに十分な治療用細胞または治療用細胞を有する組成物の量を指す。有効量はまた、疾患の症状の発症を予防もしくは遅延させるか、疾患の症状の経過を変える（例えば、疾患の症状の進行を遅延させるが、これに限定されない）か、または病気の症状を逆転させるのに十分な量を含む。対象（例えば、患者）における血友病Ａのインビボ治療またはインビトロで培養された細胞で行われるゲノム編集の文脈において、有効量は、対象における細胞またはインビトロで培養された細胞のゲノムを編集するために必要とされる、ｇＲＮＡ、ドナーテンプレート、および／または部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）などのゲノム編集のために使用される構成要素の量を指す。任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、定型的な実験を使用して当業者によって決定され得ることが理解される。
本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、対象に関心対象の化合物（複数可）を投与するための薬学的に許容される担体、添加剤、または希釈剤を提供する任意の適切な物質を指す。「薬学的に許容される賦形剤」は、薬学的に許容される希釈剤、薬学的に許容される添加剤、および薬学的に許容される担体と呼ばれる物質を包含することができる。
ゲノム編集のためのシステム
一態様において、本明細書で提供されるのは、ゲノム編集によって細胞内で関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）を発現させるための組成物、方法、およびシステムである。いくつかの実施形態において、提供される組成物、方法、およびシステムは、ＧＯＩをゲノム内の特定のセーフハーバー位置、特に内因性アルブミン遺伝子座内またはその近くのゲノム位置にノックインするためのものである。一般に、当業者は、セーフハーバー遺伝子座が、外因性の核酸を組み込むために使用することができるゲノム内の位置であることを理解し、セーフハーバー遺伝子座への外因性核酸の付加は、核酸単独の付加によって宿主細胞の増殖に有意な影響を生じない。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、ゲノム内の特定のセーフハーバー位置に挿入され得、そのセーフハーバー遺伝子座に見出されるプロモーターを利用し得るか、または挿入前にＧＯＩコード配列と融合される外因性プロモーターによってＧＯＩの発現調節を可能にし得る。いくつかの実施形態において、関心対象のＧＯＩは、標的化された方式で、アルブミン遺伝子の第１のイントロンの近くまたはその内部に組み込まれる。
原則として、セーフハーバー遺伝子座に送達される導入遺伝子に特定の制限はない。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、治療用ポリペプチドおよび予防用ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質、第ＩＸ因子タンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、ＦＸＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩタンパク質、ＦＸタンパク質、プロテインＣ、またはそれらのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの特定の実施形態は、ゲノム編集によって細胞においてＦＶＩＩＩなどの血液凝固タンパク質の発現、機能、または活性を調節する編集のための組成物および方法に関する。本開示はまた、とりわけ、エクスビボおよびインビボの両方で、上記のタンパク質のうちの１つ以上に関連する障害もしくは健康状態を有するか、または有することが疑われる患者を治療するための組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、患者は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害もしくは健康状態を有するか、または有することが疑われる患者である。いくつかの実施形態において、患者は、血友病Ａを有する患者である。いくつかの実施形態において、患者は、血友病Ｂを有する患者である。いくつかの実施形態において、患者は、ＨＡＥを有する患者である。
血友病Ａ（ＨｅｍＡ）および第ＶＩＩＩ因子
血友病Ａ（ＨｅｍＡ）は、血中に、低いか、または検出不能なレベルのＦＶＩＩＩタンパク質をもたらす、ＦＶＩＩＩ遺伝子の遺伝子欠損によって引き起こされる。これは、組織傷害部位で効果のない血餅形成を生じさせ、治療されないと致死的であり得る制御されない出血につながる。欠如しているＦＶＩＩＩタンパク質の補充は、ＨｅｍＡ患者にとって効果的な治療であり、現在の治療標準である。しかしながら、タンパク質補充療法は、ＦＶＩＩＩタンパク質の頻繁な静脈内注射を必要とし、成人には不都合であり、小児には問題があり、法外な費用がかかり（＞２００，０００ドル／年）、治療計画に厳密に従わないと破綻出血事象を引き起こす可能性がある。
ＦＶＩＩＩ遺伝子は、肝臓ならびに体内の他の部位に存在する類洞内皮細胞で主に発現される。外因性ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩを生成する肝臓の肝細胞で発現されて、循環系に分泌され得、そのため疾患の治癒に影響を及ぼし得る。肝臓の肝細胞を標的化する遺伝子送達法が開発されており、したがってこれらは、動物モデルおよび臨床試験中の患者の両方において、ＨｅｍＡの治療としてＦＶＩＩＩ遺伝子を送達するために使用されてきている。
血友病Ａの恒久的な治療法が非常に望ましい。ＡＡＶを使用する従来のウイルスベースの遺伝子治療は、前臨床動物モデルおよび患者において有望性を示し得るが、それは多くの欠点を有する。ＡＡＶベースの遺伝子治療は、ＡＡＶウイルスキャプシド（なかでも、一般に、血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、もしくはＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ１０を使用する）内にカプセル化された肝臓特異的プロモーターによって駆動されるＦＶＩＩＩ遺伝子を使用する。遺伝子治療に使用されるすべてのＡＡＶウイルスは、パッケージ化された遺伝子カセットを、形質導入細胞の核に送達し、そこで遺伝子カセットはほぼ排他的にエピソームのままであり、それは治療用タンパク質を生じさせる治療用遺伝子のエピソームコピーである。ＡＡＶは、カプセル化されたそのＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組み込むメカニズムは有さないが、代わりに、エピソームとして維持され、したがって宿主細胞が分裂するときに複製されない。エピソームＤＮＡは、時間の経過とともに分解に供され得る。ＡＡＶエピソームを含む肝細胞が分裂するように誘導されると、ＡＡＶゲノムは複製されず、代わりに希釈されることが実証されている。結果として、ＡＡＶベースの遺伝子治療は、肝臓がまだ成人サイズに達していない小児に与えられた場合、効果的であることは期待されない。さらに、ＡＡＶベースの遺伝子治療が成人に与えられたときにどれくらい持続するかは現在不明であるが、動物のデータは１０年もの長い期間にわたって治療効果のわずかな損失のみが示されている。したがって、ＨｅｍＡの新しい効果的で浸透性のある治療を開発することが決定的に必要とされている。
血友病Ｂ（ＨｅｍＢ）および第ＩＸ因子
血友病Ｂは、血液凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の欠乏または機能不全によって引き起こされる遺伝性出血障害である。十分な第ＩＸ因子がないと、血液は出血を制御するように適切に凝固することができない。それは元来、本障害を有すると診断された最初の人物名から「クリスマス病」と名付けられた。すべての人種および経済群が、この障害の影響を受けている。血友病Ｂは、Ｘ連鎖劣性疾患として遺伝し、通常は男性に現れ、Ｘ染色体に原因となる変異を有する女性によって遺伝される。血友病Ｂは、ＦＩＸ遺伝子の様々な欠陥から生じる。血友病Ｂは、第２の最も一般的なタイプの血友病であり、ＦＩＸ欠乏症の広がりは、ＦＶＩＩＩ欠乏症（血友病Ａ）よりも４～６倍少ない。
血友病Ｂは一般に、罹患した個人における第ＩＸ因子の血漿レベルに基づいて、重度、中度、または軽度として分類される（それぞれ、＜１％、２～５％、６～３０％）。複数の根底にある変異が特定されており、異なるレベルの臨床的重症度と関連付けられている。第ＩＸ因子欠乏は、出血の増加傾向につながり、自然発症的か、または軽度の外傷に反応したものであり得る。第ＩＸ因子欠乏は、凝固カスケードの干渉を引き起こし得、それによって、外傷があると自然出血を生じる。第ＩＸ因子は活性化されると、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を促進する第Ｘ因子を活性化する。現在、血友病Ｂの診断は、多くの既知の技術および方法によって実施することができ、凝固スクリーニング検査、出血スコア、凝固因子アッセイが含まれる。
遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）およびＳＥＲＰＩＮＧ１
遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）は、主にＣ１阻害剤（Ｃ１ＩＮＨ）をコードするＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子における変異によって引き起こされる遺伝性障害であり、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）が血漿欠乏を引き起こし、重度の腫脹の再発性発作をもたらす。３つの主なタイプのＨＡＥがある。タイプＩおよびＩＩは、Ｃ１阻害剤タンパク質を作製するＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子の変異によって引き起こされ、一方、タイプＩＩＩは、しばしば第ＸＩＩ因子遺伝子の変異に起因する。これは、腫脹を促進するブラジキニンの量の増加を生じる。この状態は、常染色体優性の形式で個人の両親から遺伝され得るか、または新たな変異として発生し得る。発作の誘因には、軽度の外傷またはストレスが含まれ得るが、しばしばいかなる明らかな先行事象も伴わずに発生する。
遺伝性血管浮腫は、およそ５万人に１人が罹患している。障害は一般的に小児期に最初に気づかれる。タイプＩおよびタイプＩＩは、女性と男性で同様に発症する。タイプＩＩＩは、男性よりも女性にしばしば多く発症する。気道が含まれ、治療されないと、死亡が約２５％で発生する。現在、タイプＩおよびタイプＩＩの診断は、多くの既知の技術および方法によって実施することができ、血清補体因子４（Ｃ４）およびＣ１阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）レベルを測定することに基づくものが含まれる。例えば、血液検査を使用して、血清補体因子２および４（Ｃ２およびＣ４）、Ｃ１阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）抗原タンパク質、Ｃ１阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）機能レベルの測定のうちの１つ以上によって障害を診断することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、ゲノム編集のためのシステム、特に、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする核酸配列を細胞のゲノムに挿入するためのシステムである。これらのシステムは、細胞のゲノムを編集するため、および対象、例えば、ＧＯＩに関連する健康状態または障害に苦しむ患者を治療するためなど、本明細書に記載の方法で使用することができる。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードすることができる。一般に、コードされたポリペプチドのサイズまたは生物学的活性もしくは機能性に関して特定の制限はない。したがって、コードされたポリペプチドは、任意のポリペプチドであることができ、例えば、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、および栄養補助用ポリペプチドであることができる。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質、第ＩＸ因子タンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、ＦＸＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩタンパク質、ＦＸタンパク質、プロテインＣ、またはそれらのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるシステムは、細胞のゲノムを編集するため、および上記タンパク質のうちの１つ以上に関連する障害もしくは健康状態を有するか、または有することが疑われる患者を、エクスビボおよびインビボの両方で治療するためなど、本明細書に記載の方法で使用することができる。いくつかの実施形態において、患者は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害もしくは健康状態を有するか、または有することが疑われる患者である。いくつかの実施形態において、患者は、血友病Ａを有する患者である。いくつかの実施形態において、患者は、血友病Ｂを有する患者である。いくつかの実施形態において、患者は、ＨＡＥを有する患者である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｂ）配列番号１８～４４および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｃ）関心対象の遺伝子（例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、またはＳＥＲＰＩＮＧ１）をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を含むシステムである。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｂ）配列番号１８～４４および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｃ）ＦＶＩＩＩ遺伝子をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を含むシステムである。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｂ）配列番号１８～４４および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｃ）ＦＩＸ遺伝子をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を含むシステムである。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｂ）配列番号１８～４４および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｃ）ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を含むシステムである。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む本明細書に記載のシステムのいずれかにより、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する（ＳｐｙＣａｓ９）。例えば、いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、配列番号１１０のアミノ酸配列または配列番号１１０のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓに由来する（ＳｌｕＣａｓ９）。例えば、いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、配列番号１１１のアミノ酸配列または配列番号１１１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む本明細書に記載のシステムのいずれかにより、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、異なるＣａｓエンドヌクレアーゼに由来する２つ以上の部分を含む操作されたエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、異なるＣａｓエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、異なるＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）に由来するＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩＤ）を含む。いくつかの実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ Ｃａｓ９（ＳｌｕＣａｓ９）に由来するＰＩＤを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかにより、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅに由来する（ｓｐＣａｓ９）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓに由来する（ＳｌｕＣａｓ９）。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかにより、関心対象の遺伝子をコードする核酸配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、関心対象の遺伝子をコードする核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかにより、システムは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかにより、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＧＯＩをコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、ドナーカセットは、片側または両側で、ｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている。いくつかの実施形態において、ドナーカセットは、両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ標的部位は、システムにおけるｇＲＮＡのための標的部位である。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートのｇＲＮＡ標的部位は、システム内のｇＲＮＡのための細胞ゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかにより、ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡも含む。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、システムは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸およびｇＲＮＡを含む、脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムのいずれかにより、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡと複合体化され、ＲＮＰ複合体を形成する。
核酸
ゲノム標的化核酸またはガイドＲＮＡ
本開示は、関連ポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）の活性を、標的核酸内の特定の標的配列に向けることができるゲノム標的化核酸を提供する。いくつかの実施形態において、ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡである。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、少なくとも関心対象の標的核酸配列にハイブリダイズするスペーサ配列、およびＣＲＩＳＰＲ反復配列を有する。タイプＩＩシステムでは、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡを含む。タイプＩＩガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。タイプＶガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ｃｒＲＮＡは、二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合し、それによりガイドＲＮＡおよび部位特異的ポリペプチドが複合体を形成する。ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドとのその会合によって、複合体に標的特異性を提供する。したがって、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を方向付ける。
いくつかの実施形態において、ゲノム標的化核酸は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ゲノム標的化核酸は、単一分子ガイドＲＮＡである。二重分子ガイドＲＮＡは、２本のＲＮＡ鎖を有する。第１の鎖は、５′から３′方向に、任意のスペーサ伸長配列、スペーサ配列、および最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を有する。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小のＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有する。タイプＩＩシステムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５′から３′方向に、任意のスペーサ伸長配列、スペーサ配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有する。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡに追加機能（例えば、安定性）を付与する要素を有し得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を結合させて、ヘアピン構造を形成する。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１つ以上のヘアピンを有する。タイプＶシステムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５′から３′方向に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列およびスペーサ配列を有する。
実例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１システムで使用されるガイドＲＮＡ、または他のより小さなＲＮＡは、以下に示され、当該技術分野で説明されるように、化学的手段により容易に合成することができる。化学合成手順は、継続的に拡大しているが、ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの手順によるそのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチドの長さが１００ヌクレオチド程度を超えて大幅に増加するため、より困難になる傾向がある。より長いＲＮＡを生成するために使用される１つのアプローチは、一緒に連結される（ｌｉｇａｔｅｄ）２つ以上の分子を生成することである。Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするものなど、はるかに長いＲＮＡは、より容易に酵素的に生成される。種々のタイプのＲＮＡ修飾は、化学合成および／またはＲＮＡの酵素的生成中または後に導入することができ、例えば、安定性を高める修飾は、当該技術分野で説明されるように、先天性免疫応答の可能性もしくは程度を低減し、かつ／または他の属性を強化する。
スペーサ伸長配列
ゲノム標的化核酸のいくつかの実施形態において、スペーサ伸長配列は、活性を修飾し、安定性を提供し、かつ／またはゲノム標的化核酸の修飾のための位置を提供することができる。スペーサ伸長配列は、標的内または標的外活性または特異性を修飾することができる。いくつかの実施形態において、スペーサ伸長配列が提供され得る。スペーサ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、または７０００以上のヌクレオチド以上の長さを有し得る。スペーサ伸長配列は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、または７０００以上のヌクレオチドの長さを有し得る。スペーサ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００以上のヌクレオチド未満の長さを有し得る。いくつかの実施形態において、スペーサ伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さである。いくつかの実施形態において、スペーサ伸長配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、スペーサ伸長配列は、３０～７０ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態において、スペーサ伸長配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を有する。いくつかの実施形態において、この部分は、核酸を標的化する核酸の安定性を減少または増加させる。いくつかの実施形態において、この部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）である。いくつかの実施形態において、この部分は、真核細胞で機能する。いくつかの実施形態において、この部分は、原核細胞で機能する。いくつかの実施形態において、部分は、真核細胞および原核細胞の両方において機能する。適切な部分の非限定的な例には、５′キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７ Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節されたアクセシビリティを可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン）、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列、追跡を提供する修飾または配列（例えば、蛍光分子への直接接合、蛍光検出を促進する部分への接合、蛍光検出を可能にする配列など）、および／またはタンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾もしくは配列が含まれる。
スペーサ配列
スペーサ配列は、関心対象の標的核酸の配列にハイブリダイズする。ゲノム標的化核酸のスペーサは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して、配列特異的な方法で標的核酸と相互作用する。そのため、スペーサのヌクレオチド配列は、関心対象の標的核酸の配列に応じて変化する。
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサ配列は、システムで使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５′に位置する標的核酸にハイブリダイズするように設計される。スペーサは、標的配列と完全に一致することができるか、またはミスマッチを有することができる。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡで認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、標的核酸において、配列５′－ＮＲＧ－３′を有するＰＡＭを認識し、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかを有し、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサ配列によって標的化された標的核酸配列の３′のすぐ近くである。
いくつかの実施形態において、標的核酸配列は、２０ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、２０ヌクレオチド未満を有する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、２０を超えるヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５′のすぐ近くに２０塩基を有する。例えば、
Figure 2022505173000002
 を有する配列において、標的核酸は、Ｎに対応する配列を有することができ、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、下線が引かれたＮＲＧ配列（ＲはＧまたはＡである）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ ＰＡＭである。いくつかの実施形態において、Ｓ．ｐ．Ｃａｓ９によって認識される配列として、本開示の組成物および方法において使用されるＰＡＭ配列は、ＮＧＧである。
いくつかの実施形態において、標的核酸にハイブリダイズするスペーサ配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有する。スペーサ配列は、少なくとも約６ｎｔ、約１０ｎｔ、約１５ｎｔ、約１８ｎｔ、約１９ｎｔ、約２０ｎｔ、約２５ｎｔ、約３０ｎｔ、約３５ｎｔ、または約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約８０ｎｔ、約６ｎｔ～約５０ｎｔ、約６ｎｔ～約４５ｎｔ、約６ｎｔ～約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約３５ｎｔ、約６ｎｔ～約３０ｎｔ、約６ｎｔ～約２５ｎｔ、約６ｎｔ～約２０ｎｔ、約６ｎｔ～約１９ｎｔ、約１０ｎｔ～約５０ｎｔ、約１０ｎｔ～約４５ｎｔ、約１０ｎｔ～約４０ｎｔ、約１０ｎｔ～約３５ｎｔ、約１０ｎｔ～約３０ｎｔ、約１０ｎｔ～約２５ｎｔ、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１９ｎｔ、約１９ｎｔ～約２５ｎｔ、約１９ｎｔ～約３０ｎｔ、約１９ｎｔ～約３５ｎｔ、約１９ｎｔ～約４０ｎｔ、約１９ｎｔ～約４５ｎｔ、約１９ｎｔ～約５０ｎｔ、約１９ｎｔ～約６０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３５ｎｔ、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約４５ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ～約６０ｎｔであり得る。いくつかの実施形態において、スペーサ配列は、２０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、スペーサは、１９ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、スペーサは、１８ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、スペーサは、１７ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、スペーサは、１６ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、スペーサは、１５ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、スペーサ配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。いくつかの実施形態において、スペーサ配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、最大約３０％、最大約４０％、最大約５０％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８０％、最大約８５％、最大約９０％、最大約９５％、最大約９７％、最大約９８％、最大約９９％、または１００％である。いくつかの実施形態において、スペーサ配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列の６つの連続する５′末端ヌクレオチドにわたって１００％である。いくつかの実施形態において、スペーサ配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、約２０の連続したヌクレオチドにわたって少なくとも６０％である。いくつかの実施形態において、スペーサ配列および標的核酸の長さは、１～６ヌクレオチド異なることができ、これは１つまたは複数のバルジと考えられ得る。
いくつかの実施形態において、スペーサ配列は、コンピュータプログラムを使用して、設計または選択される。コンピュータプログラムは、予測融解温度、二次構造形成、予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％ＧＣ、ゲノム発生頻度（例えば、同一または類似しているが、ミスマッチ、挿入、または欠失の結果として１つ以上のスポットで異なる配列の）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用し得る。
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列
いくつかの実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、参照ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列である。
いくつかの実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、細胞内の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズできるヌクレオチドを有する。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、二重鎖、すなわち、塩基対の二本鎖構造を形成する。一緒に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、部位特異的ポリペプチドに結合する。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を有する。いくつかの実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を有する。
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約７ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約７ｎｔ～約４０ｎｔ、約７ｎｔ～約３０ｎｔ、約７ｎｔ～約２５ｎｔ、約７ｎｔ～約２０ｎｔ、約７ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔである。いくつかの実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、およそ９ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、およそ１２ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの区間にわたって参照最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｃｒＲＮＡ）と少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの区間にわたって参照最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列と、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一である。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
いくつかの実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列である。
いくつかの実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞内の最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズするヌクレオチドを有する。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、二重鎖、すなわち、塩基対の二本鎖構造を形成する。一緒に、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および最小ＣＲＩＳＰＲ反復は、部位特異的ポリペプチドに結合する。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補性である。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約７ｎｔ～約４０ｎｔ、約７ｎｔ～約３０ｎｔ、約７ｎｔ～約２５ｎｔ、約７ｎｔ～約２０ｎｔ、約７ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔの長さであり得る。いくつかの実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ９ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１２ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）に記載されているｔｒａｃｒＲＮＡ ｎｔ２３～４８からなる。
いくつかの実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの区間にわたって、参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、野生型、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）と少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの区間にわたって、参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と、少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一である。
いくつかの実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、二重らせんを有する。いくつかの実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、二重鎖は、ミスマッチを有する（すなわち、二重鎖の２つの鎖は、１００％相補的ではない）。いくつかの実施形態において、二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、または５つのミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、二重鎖は、最大で約１、２、３、４、または５つのミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、二重鎖は２つ以下のミスマッチを有する。
バルジ
いくつかの実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖に「バルジ」が存在する。バルジは、二重鎖内のヌクレオチドの不対領域である。いくつかの実施形態において、バルジは、部位特異的ポリペプチドへの二重鎖の結合に寄与する。バルジは、二重鎖の片側に、不対５′－ＸＸＸＹ－３’（Ｘは、任意のプリンであり、Ｙは、反対の鎖上のヌクレオチドとウォブル対を形成することができるヌクレオチドを有する）、および二重鎖の反対側に不対ヌクレオチド領域を有する。二本鎖の両側の不対ヌクレオチドの数は、異なり得る。
一例において、バルジは、バルジの最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上に不対プリン（例えば、アデニン）を有する。いくつかの実施形態において、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の不対５′－ＡＡＧＹ－３′を有し、Ｙは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上のヌクレオチドとウォブル対を形成することができるヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、または５以上の不対ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側のバルジは、最大で１、２、３、４、または５以上の不対ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側のバルジは、１つの不対ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の不対ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の不対ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、二重鎖の第２の側のバルジ（例えば、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）は、４つの不対ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、バルジは、少なくとも１つのウォブル対を有する。いくつかの実施形態において、バルジは、最大で１つのウォブル対を有する。いくつかの実施形態において、バルジは、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、バルジは、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを有する。
ヘアピン
様々な実施形態において、１つ以上のヘアピンは、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列における最小ｔｒａｃｒＲＮＡの３′に配置される。
いくつかの実施形態において、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列二重鎖における最後のヌクレオチド対から少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以上のヌクレオチドの３′から開始する。いくつかの実施形態において、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列二重鎖における最後のヌクレオチド対の最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のヌクレオチドの３′から開始し得る。
いくつかの実施形態において、ヘアピンは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以上の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、ヘアピンは、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５以上の連続したヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、ヘアピンは、ＣＣジヌクレオチド（すなわち、２つの連続するシトシンヌクレオチド）を有する。
いくつかの実施形態において、ヘアピンは、二重鎖ヌクレオチド（例えば、一緒にハイブリダイズされたヘアピン内のヌクレオチド）を有する。例えば、ヘアピンは、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピン二重鎖中におけるＧＧジヌクレオチドにハイブリダイズするＣＣジヌクレオチドを有する。
ヘアピンのうちの１つ以上は、部位特異的ポリペプチドのガイドＲＮＡ相互作用領域と相互作用することができる。
いくつかの実施形態において、２つ以上のヘアピンがあり、他の実施形態において、３つ以上のヘアピンがある。
３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
いくつかの実施形態において、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列を有する。
いくつかの実施形態において、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有する。例えば、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約６ｎｔ～約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約３０ｎｔ、約６ｎｔ～約２５ｎｔ、約６ｎｔ～約２０ｎｔ、約６ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１４ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態において、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの区間にわたって、参照３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と少なくとも約６０％同一である。例えば、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの区間にわたって、参照３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一であり得る。
いくつかの実施形態において、３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つ以上の二重鎖領域（例えば、ヘアピン、ハイブリッド化領域）を有する。いくつかの実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つの二重鎖領域を有する。
いくつかの実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ステムループ構造を有する。いくつかの実施形態において、３′ｔｒａｃｒＲＮＡにおけるステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、３′ｔｒａｃｒＲＮＡにおけるステムループ構造は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、ステムループ構造は、機能的部分を有する。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを有する。いくつかの実施形態において、ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、または５以上の機能的部分を有する。いくつかの実施形態において、ステムループ構造は、最大で約１、２、３、４、または５以上の機能的部分を有する。
いくつかの実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列におけるヘアピンは、Ｐドメインを有する。いくつかの実施形態において、Ｐドメインは、ヘアピンに二本鎖領域を有する。
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列
いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、単一分子ガイドまたは二重分子ガイドの文脈にあるかどうかに関係なく提供され得る。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約１ヌクレオチド～約４００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００ヌクレオチドを超える長さを有する。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約２０～約５０００以上のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチドを超える長さを有する。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００以上のヌクレオチド未満の長さを有し得る。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有し得る。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さを有する。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、３０～７０ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、機能的部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を有する。いくつかの実施形態において、機能的部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）を有する。いくつかの実施形態において、機能的部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）～約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、もしくは約１５ｎｔ～約２５ｎｔの全長を有する。いくつかの実施形態において、機能的部分は、真核細胞において機能する。いくつかの実施形態において、機能的部分は、原核細胞において機能する。いくつかの実施形態において、機能的部分は、真核細胞および原核細胞の両方において機能する。
適切なｔｒａｃｒＲＮＡ伸長機能的部分の非限定的な例には、３′ポリ－アデニル化テール、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節されたアクセシビリティを可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン）、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列、追跡を提供する修飾または配列（例えば、蛍光分子への直接接合、蛍光検出を促進する部分への接合、蛍光検出を可能にする配列など）、および／またはタンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾もしくは配列が含まれる。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、プライマー結合部位または分子インデックス（例えば、バーコード配列）を有する。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１つ以上の親和性タグを有する。
単一分子ガイドリンカー配列
いくつかの実施形態において、単一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有する。上記のＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）では、例えば、単純な４ヌクレオチド「テトラループ」（－ＧＡＡＡ－）が使用された。例示的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約９０ｎｔ、約３ｎｔ～約８０ｎｔ、約３ｎｔ～約７０ｎｔ、約３ｎｔ～約６０ｎｔ、約３ｎｔ～約５０ｎｔ、約３ｎｔ～約４０ｎｔ、約３ｎｔ～約３０ｎｔ、約３ｎｔ～約２０ｎｔ、約３ｎｔ～約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ～約５ｎｔ、約５ｎｔ～約１０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２５ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約３５ｎｔ、約３５ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ～約１００ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態において、単一分子ガイド核酸のリンカーは、４～４０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、リンカーは、最大で約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００以上のヌクレオチドである。
リンカーは、様々な配列のいずれかを有することができるが、いくつかの実施形態において、リンカーは、ガイドＲＮＡの他の部分と広範な相同領域を有する配列を有さないため、ガイドの他の機能領域を干渉し得る分子内結合を引き起こし得る。上記のＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）では、単純な４ヌクレオチド配列－ＧＡＡＡ－が使用されたが、より長い配列を含む多数の他の配列も同様に使用することができる。
いくつかの実施形態において、リンカー配列は、機能的部分を有する。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、タンパク質結合部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含む１つ以上の特徴を有することができる。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、または５以上の機能的部分を有する。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、最大で約１、２、３、４、または５以上の機能的部分を有する。
いくつかの実施形態において、所定の開示に従ってｇＲＮＡによって標的化されるゲノム位置は、ゲノム、例えばヒトゲノムにおける内因性アルブミン遺伝子座で、その内部で、またはその近くであることができる。そのような位置を標的化する例示的なガイドＲＮＡには、表３または４に列挙されるスペーサ配列および関連するＣａｓ９またはＣｐｆ１切断部位が含まれる。当業者によって理解されるように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサ配列を含むように設計される。例えば、表３または４に列挙されるスペーサ配列の各々は、単一のＲＮＡキメラまたはｃｒＲＮＡ（対応するｔｒａｃｒＲＮＡとともに）に入れることができる。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６－８２１（２０１２）およびＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２－６０７（２０１１）を参照されたい。
ドナーＤＮＡまたはドナーテンプレート
ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどの部位特異的ポリペプチドは、核酸、例えばゲノムＤＮＡに二本鎖切断または一本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合もしくは代替の非相同末端結合（Ａ－ＮＨＥＪ）あるいはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同テンプレートを必要とせずに、切断された標的核酸を修復することができる。これにより、切断部位の標的核酸に小さな欠失または挿入（インデル）が生じることがあり、遺伝子発現の破壊または変化をもたらし得る。相同的組換え（ＨＲ）としても知られるＨＤＲは、相同修復テンプレートまたはドナーが利用可能である場合、発生することができる。
相同ドナーテンプレートは、標的核酸切断部位に隣接する配列と相同である配列を有する。姉妹染色分体は、一般に、細胞によって修復テンプレートとして使用される。しかしながら、ゲノム編集の目的のために、修復テンプレートは、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸などの外因性核酸としてしばしば供給される。外因性ドナーテンプレートを用いて、追加の核酸配列（導入遺伝子など）または改変（単一もしくは複数の塩基変化もしくは欠失など）を隣接する相同領域の間に導入して、追加または変更された核酸配列も標的遺伝子座に組み込まれるようにすることは、一般的である。ＭＭＥＪは、小さな欠失および挿入が切断部位で発生し得るという点で、ＮＨＥＪと同様の遺伝的結果をもたらす。ＭＭＥＪは、切断部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を使用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復結果を促進する。場合によっては、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づいて、可能性のある修復結果を予測することができる。
したがって、いくつかの例において、相同組換えを使用して、外因性ポリヌクレオチド配列を標的核酸切断部位に挿入する。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書においてドナーポリヌクレオチド（あるいはドナーもしくはドナー配列またはポリヌクレオチドドナーテンプレート）と呼ばれる。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的核酸切断部位に挿入される。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位で天然に発生しない配列である。
外因性ＤＮＡ分子が、二本鎖切断が起こる細胞の核内に十分な濃度で供給されると、外因性ＤＮＡは、ＮＨＥＪ修復プロセス中に二本鎖切断に挿入され、そのためゲノムへの恒久的な付加になり得る。これらの外因性ＤＮＡ分子は、いくつかの実施形態においてドナーテンプレートと呼ばれる。ドナーテンプレートが、ＦＶＩＩＩ遺伝子などの関心対象の遺伝子のコード配列を、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ配列、および／またはスプライスアクセプター配列（本明細書では「ドナーカセット」とも呼ばれる）などの関連する調節配列とともに、任意に一緒に含むと、関心対象の遺伝子は、ゲノムに組み込まれたコピーから発現させることができ、細胞の寿命の間、恒久的な発現をもたらす。さらに、ドナーＤＮＡテンプレートの組み込まれたコピーは、細胞が分裂するときに娘細胞に伝達され得る。
二本鎖切断のいずれかの側のＤＮＡ配列と相同性を有する隣接ＤＮＡ配列を含む十分な濃度のドナーＤＮＡテンプレート（相同性アームと呼ばれる）の存在下で、ドナーＤＮＡテンプレートはＨＤＲ経路を介して組み込まれ得る。相同性アームは、ドナーテンプレートと、二本鎖切断のいずれかの側の配列との間の相同組換えの基質として機能する。これにより、二本鎖切断のいずれかの側の配列が未改変ゲノムの配列から変更されていないドナーテンプレートのエラーのない挿入をもたらすことができる。
ＨＤＲによる編集のために供給されるドナーは著しく異なるが、一般に、ゲノムＤＮＡへのアニーリングを可能にするために、小さなまたは大きな隣接している相同性アームを有する、意図した配列を含む。導入された遺伝子変化に隣接する相同領域は、３０ｂｐ以下、またはプロモーター、ｃＤＮＡなどを含むことができるマルチキロベースカセットと同じ大きさであり得る。一本鎖および二本鎖の両方のオリゴヌクレオチドドナーを使用することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、サイズが１００ｎｔ未満から数ｋｂを超えるが、より長いｓｓＤＮＡを生成して使用することもできる。ＰＣＲアンプリコン、プラスミド、およびミニサークルなどの二本鎖ドナーがしばしば使用される。一般に、個々のドナーのパッケージングの制限は５ｋｂ未満であるが、ＡＡＶベクターは、ドナーテンプレートの送達の非常に効果的な手段であることがわかっている。ドナーの活発な転写によりＨＤＲが３倍増加し、プロモーターを含めると変換が増加し得ることを示す。逆に、ドナーのＣｐＧメチル化は、遺伝子発現およびＨＤＲを減少させることができる。
いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼとともに、または様々な異なる方法によって、例えば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、もしくはウイルス形質導入によって独立して供給され得る。いくつかの実施形態においてＨＤＲに対するドナーの利用性を高めるために、様々な繋ぐ選択肢が使用され得る。例には、ドナーをヌクレアーゼに結合する、近くに結合するＤＮＡ結合タンパク質に結合する、またはＤＮＡ末端の結合もしくは修復に関与するタンパク質に結合することが含まれる。
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路およびＨＲの両方を使用する部位特異的遺伝子挿入が実施され得る。組み合わせアプローチは、恐らくはイントロン／エクソン境界を含む、特定の設定で適用され得る。ＮＨＥＪは、イントロンでの連結に効果的であることを証明することができるが、エラーのないＨＤＲは、コード領域においてより適している可能性がある。
いくつかの実施形態において、ゲノムに挿入されることが意図される外因性配列は、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）またはその機能的誘導体である。外因性遺伝子は、ＧＯＩ生成物、例えばＧＯＩタンパク質、またはその機能的誘導体をコードするヌクレオチド配列を含み得る。ＧＯＩの機能的誘導体は、野生型ヒトＧＯＩタンパク質などの野生型ＧＯＩタンパク質の実質的な活性、例えば、野生型ＧＯＩが示す活性の少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％を有するＧＯＩタンパク質の機能的誘導体をコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＧＯＩタンパク質の機能的誘導体は、ＧＯＩタンパク質、例えば野生型ＧＯＩタンパク質と、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％のアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態において、当業者は、化合物、例えばペプチドもしくはタンパク質の機能性または活性を試験する分野で知られている多くの方法を使用することができる。ＧＯＩタンパク質の機能的誘導体はまた、野生型ＧＯＩタンパク質の任意のフラグメント、または全長の野生型ＧＯＩタンパク質の１つ以上のアミノ酸残基に保存的改変を有する改変ＧＯＩタンパク質のフラグメントを含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、ＧＯＩの核酸配列の機能的誘導体は、ＧＯＩ、例えば野生型ＧＯＩに対して、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約ＧＯＩに対する９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の核酸配列同一性を有し得る。
ＧＯＩまたはその機能的誘導体の挿入が関係するいくつかの実施形態において、ＧＯＩまたはその機能的誘導体のｃＤＮＡは、欠陥のあるＧＯＩまたはその調節配列を有する患者のゲノムに挿入され得る。そのような場合、ドナーＤＮＡまたはドナーテンプレートは、ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする配列、例えばｃＤＮＡ配列を有する発現カセットまたはベクター構築物であり得る。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、本開示の他の場所に記載されている、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤなどの改変ＧＯＩタンパク質をコードする配列を含み、使用することができる。
いくつかの実施形態において、ドナーカセットを含む本明細書に記載のドナーテンプレートのいずれかによれば、ドナーカセットは、片側または両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている。例えば、そのようなドナーテンプレートは、ドナーカセットの５’のｇＲＮＡ標的部位および／またはドナーカセットの３’のｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含み得る。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ドナーカセットの５’にｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含む。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ドナーカセットの３’にｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含む。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ドナーカセットの５’のｇＲＮＡ標的部位およびドナーカセットの３’のｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含む。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ドナーカセットの５’のｇＲＮＡ標的部位およびドナーカセットの３’のｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含み、２つのｇＲＮＡ標的部位は、同じ配列を含む。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナーテンプレート中の少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナーテンプレートのドナーカセットが組み込まれる標的遺伝子座におけるｇＲＮＡ標的部位と同じ配列を含む。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナーテンプレート中の少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナーテンプレートのドナーカセットが組み込まれる標的遺伝子座におけるｇＲＮＡ標的部位の逆相補体を含む。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ドナーカセットの５’のｇＲＮＡ標的部位およびドナーカセットの３’のｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含み、ドナーテンプレート中の２つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナーテンプレートのドナーカセットが組み込まれる標的遺伝子座におけるｇＲＮＡ標的部位と同じ配列を含む。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ドナーカセットの５’のｇＲＮＡ標的部位およびドナーカセットの３’のｇＲＮＡ標的部位を有するドナーカセットを含み、ドナーテンプレート中の２つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナーテンプレートのドナーカセットが組み込まれる標的遺伝子座におけるｇＲＮＡ標的部位の逆相補体を含む。
部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸
いくつかの実施形態において、ゲノム編集および組成物の方法は、したがって、部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列（またはオリゴヌクレオチド）を使用することができる。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列がＲＮＡである場合、それはｇＲＮＡ配列に共有結合するか、または別個の配列として存在することができる。いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼのペプチド配列は、その核酸配列の代わりに使用され得る。
ベクター
別の態様において、本開示は、本開示のゲノム標的化核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の実施形態を実施するのに必要な任意の核酸もしくはタンパク質分子をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。いくつかの実施形態において、そのような核酸は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）である。
企図される発現ベクターには、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、ネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにＲｏｕｓ肉腫ウイルス、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）、ならびに他の組換えベクターが含まれるが、これらに限定されない。真核生物の標的細胞について企図される他のベクターには、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるが、これらに限定されない。真核生物の標的細胞について企図される追加のベクターには、ベクターｐＣＴｘ－１、ｐＣＴｘ－２、およびｐＣＴｘ－３が含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞と適合する限り、他のベクターを使用することができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、１つ以上の転写および／または翻訳制御要素を含むことができる。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的かつ誘導性のプロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む、多数の適切な転写および翻訳制御要素のいずれかを発現ベクターで使用することができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ機構の構成要素または他の要素のいずれかを不活性化する自己不活性化ベクターである。
適切な真核生物プロモーター（すなわち、真核生物細胞で機能するプロモーター）の非限定的な例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長末端反復（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子－１プロモーター（ＥＦ１）、ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを有するハイブリッド構築物、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）、およびマウスメタロチオネイン－Ｉに由来するものが含まれる。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して使用されるガイドＲＮＡを含む、低分子ＲＮＡの発現には、例えばＵ６およびＨ１を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの様々なプロモーターが有利であり得る。そのようなプロモーターの使用を強化するための説明およびパラメーターは、当該技術分野で知られており、追加の情報およびアプローチが定期的に説明されている。例えば、Ｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３，ｅ１６１（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照されたい。
発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含むこともできる。発現ベクターはまた、発現を増幅させるための適切な配列も含むことができる。発現ベクターはまた、部位特異的ポリペプチドに融合され、したがって融合タンパク質をもたらす非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、血球凝集素タグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなど）である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、空間的に制限され、かつ／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）である。いくつかの実施形態において、ベクターは、それがゲノムに挿入された後に、ゲノムに存在する内因性プロモーターの下で発現される場合、宿主細胞において発現される少なくとも１つの遺伝子のためのプロモーターを有さない。
部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修飾は、例えば、変異、欠失、改変、組み込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座、および／または遺伝子変異につながり得る。非天然核酸をゲノムＤＮＡに組み込むプロセスは、ゲノム編集の例である。
部位特異的ポリペプチドは、ゲノム編集でＤＮＡを切断するために使用されるヌクレアーゼである。部位特異的は、１つ以上のポリペプチド、またはポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡのいずれかとして、細胞または患者に投与することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの文脈において、部位特異的ポリペプチドは、今度はガイドＲＮＡに結合することができ、ポリペプチドが向けられる標的ＤＮＡにおける部位を特定する。本明細書におけるＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムのいくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、複数の核酸切断（すなわち、ヌクレアーゼ）ドメインを有する。２つ以上の核酸切断ドメインは、リンカーを介して一緒に結合することができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、フレキシブルリンカーを有する。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０以上のアミノ酸の長さを有することができる。
天然に発生する野生型Ｃａｓ９酵素は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣドメインの２つのヌクレアーゼドメインを有する。本明細書において、「Ｃａｓ９」は、天然に発生するＣａｓ９および組換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で企図されるＣａｓ９酵素は、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、および／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを有する。
ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様折り畳みを有する。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つの逆平行β鎖およびαらせんを有する。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価カチオン結合部位）を有する。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸の一方の鎖（例えば、ｃｒＲＮＡ標的鎖の相補鎖）を切断することができる。
ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、ＲＮａｓｅＨまたはＲＮａｓｅＨ様折り畳みを有する。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に作用することを含む、様々な核酸ベースの機能に関与する。ＲＮａｓｅＨドメインは、複数のαらせんに囲まれた５つのβ鎖を有する。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価カチオン結合部位）を有する。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、二本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖）を切断することができる。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド［例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、ＵＳ２０１４／００６８７９７、配列番号８またはＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３９（２１）：９２７５－９２８２（２０１１）］および様々な他の部位特異的ポリペプチドに対して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）のヌクレアーゼドメインに対して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、１０個の連続したアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、１０個の連続したアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）に対して最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）に対して最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）に対して最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を有する。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの修飾形態を有する。野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低減する変異を有する。いくつかの実施形態において、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）の核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有する。部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、実質的な核酸切断活性を有さない可能性がある。部位特異的ポリペプチドが実質的な核酸切断活性を有さない修飾形態である場合、本明細書では「酵素的に不活性」と呼ばれる。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、標的核酸上で一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導できるような変異を有する（例えば、二本鎖標的核酸の糖リン酸骨格のうちの１つのみを切断することにより）。いくつかの実施形態において、変異は、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）の複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上における核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満をもたらす。いくつかの実施形態において、変異は、標的核酸の相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の非相補鎖を切断するその能力を低減する複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上をもたらす。いくつかの実施形態において、変異は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の相補鎖を切断する能力を低減する複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上をもたらす。例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６などの野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドの残基は、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）のうちの１つ以上を不活性化するように変異する。いくつかの実施形態において、変異される残基は、野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドの残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６に対応する（例えば、配列および／または構造的アラインメントにより決定される）。変異の非限定的な例には、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａが含まれる。当業者は、アラニン置換以外の変異が適切であり得ることを認識するであろう。
いくつかの実施形態において、Ｄ１０Ａ変異は、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態において、Ｈ８４０Ａ変異は、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態において、Ｎ８５４Ａ変異は、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態において、Ｎ８５６Ａ変異は、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生成する。１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを有する部位特異的ポリペプチドは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのバリアント、例えばＣａｓ９を使用して、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集の特異性を高めることができる。野生型Ｃａｓ９は、一般に、標的配列（内因性ゲノム遺伝子座など）の特定の約２０ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計された単一ガイドＲＮＡによって誘導される。しかしながら、ガイドＲＮＡと標的遺伝子座との間でいくつかのミスマッチが許容され、標的部位での必要な相同の長さを、例えばわずか１３ｎｔの相同性に効果的に低減することができ、それにより標的外切断としても知られる、標的ゲノムの他の場所におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による結合および二本鎖核酸切断の可能性の上昇をもたらす。Ｃａｓ９のニッカーゼバリアントは、それぞれ１本の鎖のみを切断するため、二本鎖切断を作成するために、一対のニッカーゼが標的核酸に近接して反対側の鎖に結合し、それにより一対のニックを作成する必要があり、これは二本鎖切断と同等である。これには、２つの別個のガイドＲＮＡ（各ニッカーゼに１つずつ）が、標的核酸に近接して反対側の鎖に結合する必要がある。この要件により、二本鎖切断に必要な相同の最小長が本質的に２倍になり、それにより二本鎖切断事象がゲノムの他の場所で起こる可能性を低減し、２つのガイドＲＮＡ部位は（存在する場合）、二本鎖切断の形成を可能にするために、互いに十分に接近する可能性は低い。当該技術分野で説明されているように、ニッカーゼを使用して、ＨＤＲ対ＮＨＥＪを促進することもできる。ＨＤＲを使用して、所望の変化を効果的に媒介する特定のドナー配列の使用によって、選択した変化をゲノムの標的部位に導入することができる。遺伝子編集で使用するための様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの説明は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号、およびＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２、３４７－３５５（２０１４）、ならびにそれらに引用されている参考文献に認めることができる。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアント、変異した、酵素的に不活性および／または条件付きで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は、核酸を標的化する。いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアント、変異した、酵素的に不活性および／または条件付きで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は、ＤＮＡを標的化する。いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアント、変異した、酵素的に不活性および／または条件付きで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は、ＲＮＡを標的化する。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上の非天然配列を有する（例えば、部位特異的ポリペプチドは融合タンパク質である）。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、核酸結合ドメイン、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を有する。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を有する。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメインを有し、核酸切断ドメインの一方または両方は、細菌由来のＣａｓ９由来のヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有する。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）、および非天然配列（例えば、核局在化シグナル）または部位特異的ポリペプチドを非天然配列に結合するリンカーを有する。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を有し、部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減する核酸切断ドメインの一方または両方に変異を有する。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を有し、ヌクレアーゼドメインのうちの１つが、１０位アスパラギン酸の変異を含み、かつ／またはヌクレアーゼドメインのうちの１つが、８４０位ヒスチジンの変異を有し、その変異は、ヌクレアーゼドメイン（複数可）の切断活性を少なくとも５０％低減する。
いくつかの実施形態において、１つ以上の部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノムの特定の遺伝子座で一緒に１つの二本鎖切断をもたらす２つのニッカーゼ、またはゲノム内の特定の遺伝子座で２つの二本鎖切断をもたらす４つのニッカーゼを含む。あるいは、１つの部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の遺伝子座で１つの二本鎖切断をもたらす。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド使用して、ゲノムを編集することができる。いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、関心対象の標的ＤＮＡを含む細胞での発現について、当該技術分野で標準的な方法に従ってコドン最適化される。例えば、意図された標的核酸がヒト細胞にある場合、Ｃａｓ９をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドを生成するための使用が企図される。
以下は、本開示の様々な実施形態で使用することができる部位特異的ポリペプチドのいくつかの例を提供する。
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼシステム
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な配置の短い回文配列反復）ゲノム遺伝子座は、多くの原核生物（例えば、細菌および古細菌）のゲノムに見ることができる。原核生物では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ウイルスおよびファージなどの外来侵入物から原核生物を守るのに役立つ免疫系の一種として機能する生成物をコードする。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座機能には３つの段階、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への新しい配列の組み込み、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、および外来侵入核酸のサイレンシングがある。５つのタイプのＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＵ、タイプＶ）が特定された。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座には、「反復」と呼ばれる短い反復配列が多数含まれている。発現されると、反復は、二次ヘアピン構造（例えば、ヘアピン）を形成し、かつ／または非構造化一本鎖配列を有する。繰り返しは、通常クラスターで発生し、種間で頻繁に分岐する。反復は、「スペーサ」と呼ばれる固有の介在配列で規則的に配置され、反復－スペーサ－反復遺伝子座アーキテクチャをもたらす。スペーサは、既知の外来侵入物配列と同一であるか、または高い相同性を有する。スペーサ－反復ユニットは、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）コードし、これはスペーサ－反復ユニットの成熟形態に処理される。ｃｒＲＮＡは、標的核酸の標的化に関与する「種」またはスペーサ配列を有する（原核生物の天然に発生する形態では、スペーサ配列は、外来侵入物核酸を標的化する）。スペーサ配列は、ｃｒＲＮＡの５′または３′末端に位置する。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を有する。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物のｃｒＲＮＡ機能の生合成および干渉段階に関与するエンドヌクレアーゼをコードする。いくつかのＣａｓ遺伝子は、相同の二次および／または三次構造を有する。
タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステム
自然界におけるタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムでのｃｒＲＮＡの生合成は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性ＲＮａｓｅＩＩＩによって修飾され、次いでｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイのｃｒＲＮＡ反復にハイブリダイズする。内因性ＲＮａｓｅＩＩＩを動員して、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡを切断する。切断されたｃｒＲＮＡをエキソリボヌクレアーゼトリミングに供して、成熟ｃｒＲＮＡ形態（例えば、５′トリミング）を生成する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとハイブリダイズしたままであり、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡがハイブリダイズできる標的核酸に複合体を誘導する。ｃｒＲＮＡの標的核酸とのハイブリダイゼーションは、標的化核酸切断のためにＣａｓ９を活性化する。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの標的核酸は、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる。自然界では、ＰＡＭは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）の標的核酸への結合を促進するために不可欠である。タイプＩＩシステム（ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４とも呼ばれる）は、タイプＩＩ－Ａ（ＣＡＳＳ４）およびＩＩ－Ｂ（ＣＡＳＳ４ａ）にさらに細分される。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、ＲＮＡでプログラム可能なゲノム編集に有用であることを示し、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号は、部位特異的遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの多くの例および適用を提供する。
タイプＶ ＣＲＩＳＰＲシステム
タイプＶ ＣＲＩＳＰＲシステムには、タイプＩＩシステムといくつかの重要な違いがある。例えば、Ｃｐｆ１は、タイプＩＩシステムとは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。実際、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、追加のトランス活性化ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせずに、成熟ｃｒＲＮＡに処理される。タイプＶ ＣＲＩＳＰＲアレイは、長さ４２～４４ヌクレオチドの短い成熟ｃｒＲＮＡに処理され、各成熟ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの直接反復で始まり、２３～２５ヌクレオチドのスペーサ配列が続く。対照的に、タイプＩＩシステムの成熟ｃｒＲＮＡは、２０～２４ヌクレオチドのスペーサ配列で始まり、約２２ヌクレオチドの直接反復が続く。また、Ｃｐｆ１は、Ｔリッチプロトスペーサ隣接モチーフを利用し、それによりＣｐｆ１－ｃｒＲＮＡ複合体は、タイプＩＩシステムの標的ＤＮＡに続くＧリッチＰＡＭとは対照的である、短いＴリッチＰＡＭが先行する標的ＤＮＡを効率的に切断する。したがって、タイプＶシステムは、ＰＡＭから離れたポイントで切断するが、タイプＩＩシステムは、ＰＡＭに隣接するポイントで切断する。さらに、タイプＩＩシステムとは対照的に、Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチドの５′オーバーハングで互い違いのＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。タイプＩＩシステムは、鈍い二本鎖切断によって切断する。タイプＩＩシステムと同様に、Ｃｐｆ１は、予測されるＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含むが、タイプＩＩシステムとは対照的に、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠いている。
Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチドおよびプロトスペーサ隣接モチーフ
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドには、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２：２５７７－２５９０（２０１４）の図１におけるＣａｓ９ポリペプチドが含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子命名システムは、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、大幅に書き換えられている。Ｆｏｎｆａｒａ、上記、の図５は、様々な種に由来するＣａｓ９ポリペプチドのためのＰＡＭ配列を提供する。
ゲノム標的化核酸と部位特異的ポリペプチドとの複合体
ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９などの核酸誘導ヌクレアーゼ）と相互作用し、それにより複合体を形成する。ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、部位特異的ポリペプチドを標的核酸に誘導する。
前述のように、いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドおよびゲノム標的化核酸は、各々、細胞または患者に別々に投与することができる。他方で、いくつかの他の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つ以上のｃｒＲＮＡと事前に複合体化することができる。次いで、事前に複合体化された材料を、細胞または患者に投与することができる。このような事前に複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られている。
ゲノム編集の方法
一態様において、本明細書で提供されるのは、ゲノム編集の方法、特に、関心対象の遺伝子を細胞のゲノムに挿入する方法である。いくつかの実施形態は、ゲノム編集によって細胞内のタンパク質の発現、機能、または活性を調節するために編集するための方法に関するものであり、タンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＩＸタンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、ＦＸＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩタンパク質、ＦＸタンパク質、プロテインＣ、およびセルピンＧ１からなる群から選択される。いくつかの特定の実施形態は、ゲノム編集によって細胞内のＦＶＩＩＩなどの血液凝固タンパク質の発現、機能、または活性を調節するために編集するための方法に関する。この方法は、対象、例えば血友病Ａの患者を治療するために使用することができ、そのような場合では、細胞が患者または別のドナーから単離され得る。次いで、細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料および方法を使用して編集される。いくつかの他の特定の実施形態は、ゲノム編集によって細胞内の血液凝固タンパク質ＦＩＸの発現、機能、または活性を調節するために編集するための方法に関する。この方法は、対象、例えば血友病Ｂの患者を治療するために使用することができ、そのような場合、細胞は患者または別のドナーから単離され得る。さらにいくつかの他の特定の実施形態は、ゲノム編集によって細胞内のセリンプロテアーゼ阻害剤Ｇ１の発現、機能、または活性を調節するために編集するための方法に関する。この方法は、対象、例えば遺伝性血管浮腫の患者を治療するために使用することができ、そのような場合、細胞は患者または別のドナーから単離され得る。
いくつかの実施形態において、ノックイン戦略は、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）をノックインすることを含む。コードされたポリペプチドのサイズまたは生物学的活性もしくは機能に関して特定の制限はない。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＩＸタンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、ＦＸＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩタンパク質、ＦＸタンパク質、プロテインＣ、およびセルピンＧ１、またはそれらのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ＧＯＩが挿入されるゲノム配列は、アルブミン遺伝子座に、その内部に、またはその近くにある。いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩなどの血液凝固タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ノックイン戦略は、ＦＶＩＩＩコード配列、例えば、野生型ＦＶＩＩＩ遺伝子（例えば、野生型ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子）、ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡ、ミニ遺伝子（天然または合成のエンハンサーおよびプロモーター、１つ以上のエクソン、および天然または合成イントロン、および天然または合成３’ＵＴＲ、およびポリアデニル化シグナルを有する）、または改変ＦＶＩＩＩ遺伝子を、ゲノム配列にノックインすることを含む。いくつかの実施形態において、ノックイン戦略は、ＦＩＸコード配列、例えば、野生型ＦＩＸ遺伝子（例えば、野生型ヒトＦＩＸ遺伝子）、ＦＩＸ ｃＤＮＡ、ミニ遺伝子（天然または合成のエンハンサーおよびプロモーター、１つ以上のエクソン、および天然または合成イントロン、および天然または合成３’ＵＴＲ、およびポリアデニル化シグナルを有する）、または改変ＦＩＸ遺伝子を、ゲノム配列にノックインすることを含む。いくつかの実施形態において、ノックイン戦略は、ＳＥＲＰＩＮＧ１をコードする配列、例えば、野生型ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子（例えば、野生型ヒトＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子）、ＳＥＲＰＩＮＧ１ ｃＤＮＡ、ミニ遺伝子（天然または合成のエンハンサーおよびプロモーター、１つまたは複数のエクソン、および天然または合成のイントロン、および天然または合成の３’ＵＴＲおよびポリアデニル化シグナルを有する）または改変されたＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子を、ゲノム配列にノックインすることを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）、例えば、ＦＶＩＩＩ遺伝子またはその機能的誘導体をコードする遺伝子を、ゲノムにノックインする方法である。一態様において、本開示は、ＧＯＩの核酸配列、例えば、ＦＶＩＩＩ遺伝子、例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質またはその機能的誘導体をコードする核酸配列の、細胞のゲノムへの挿入を提供する。ＧＯＩの核酸配列は、ＧＯＩの野生型タンパク質またはその誘導体をコードすることができる。したがって、いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、野生型タンパク質をコードすることができる。野生型タンパク質の機能的誘導体は、野生型タンパク質の実質的な活性、例えば、野生型タンパク質が示す活性の、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％を有するペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、当業者は、当分野で知られている多くの方法を使用して、化合物、例えば、ペプチドまたはタンパク質の機能性または活性を試験することができる。いくつかの実施形態において、コードされた野生型タンパク質の機能的誘導体はまた、野生型タンパク質の任意のフラグメント、または対応する全長野生型タンパク質におけるアミノ酸残基のうちの１つ以上に保存的改変を有する改変タンパク質のフラグメントを含むことができる。いくつかの実施形態において、コードされた野生型タンパク質の機能的誘導体はまた、野生型タンパク質の機能性に実質的に負の影響を及ぼさない任意の改変（複数可）、例えば、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、および／または変異を含むことができる。したがって、いくつかの実施形態において、野生型ＧＯＩの核酸配列の機能的誘導体は、野生型ＧＯＩに対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の核酸配列同一性を有することができる。
いくつかの実施形態において、ＧＯＩまたはその機能的誘導体は、細胞内のゲノム配列に挿入される。いくつかの実施形態において、挿入部位は、細胞のゲノム中のアルブミン遺伝子座に、またはその中にある。挿入方法は、アルブミン遺伝子の第１のイントロン（またはイントロン１）を標的化する１つ以上のｇＲＮＡを使用する。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、ＧＯＩまたはその機能的誘導体のコード配列を含む一本鎖または二本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＩＸタンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、ＦＸＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩタンパク質、ＦＸタンパク質、プロテインＣ、セルピンＧ１、またはその機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質のコード配列を含む一本鎖または二本鎖ＤＮＡである。
いくつかの実施形態において、ゲノム編集方法は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼを利用して、関心対象の遺伝子またはその機能的誘導体を遺伝子操作的に導入（ノックイン）する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチド、その相同体、天然に発生する分子の組換え、そのコドン最適化または改変型、および上記のいずれかの組み合わせである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅに由来する（ｓｐＣａｓ９）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓに由来する（ＳｌｕＣａｓ９）。
いくつかの実施形態において、ゲノム編集に供される細胞は、ゲノムに１つ以上の変異を有し、これは、そのような変異（複数可）を有さない正常における発現と比較して、内因性の関心対象の遺伝子の発現の減少をもたらす。正常細胞は、ＧＯＩにおける欠損を有さない別の対象に由来する（またはそこから単離された）健康な細胞またはコントロール細胞であることができる。いくつかの実施形態において、ゲノム編集が供される細胞は、ＧＯＩ関連の状態または障害の治療を必要としている対象に由来（またはそこから単離）し得る。いくつかの特定の実施形態において、ゲノム編集に供される細胞は、ＧＯＩに関連する健康状態または障害の治療を必要としている患者に由来（またはそこから単離）し得る。いくつかの実施形態において、患者は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害もしくは健康状態を有するか、または有することが疑われる患者である。いくつかの実施形態において、患者は、血友病Ａを有する患者である。いくつかの実施形態において、患者は、血友病Ｂを有する患者である。いくつかの実施形態において、患者は、ＨＡＥを有する患者である。したがって、いくつかの実施形態において、そのような細胞における内因性ＧＯＩ遺伝子の発現は、正常細胞における内因性の関心対象の遺伝子発現の発現と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％低減される。
いくつかの実施形態において、ゲノム編集方法は、例えば、ＦＶＩＩＩ遺伝子、例えば、インビボでＦＶＩＩＩタンパク質を安定して生成するように、供給されたプロモーターに操作可能に連結されるＦＶＩＩＩコード配列などの機能的ＧＯＩのゲノムの非コード領域で、標的化された組み込みを行う。いくつかの実施形態において、ＧＯＩコード配列の標的化された組み込みは、関心対象の細胞型、例えば肝細胞または類洞内皮細胞において高度に発現されるアルブミン遺伝子のイントロンにおいて発生する。いくつかの実施形態において、挿入されるＧＯＩコード配列は、野生型ＧＯＩコード配列、例えば、野生型ヒトＧＯＩコード配列であることができる。いくつかの実施形態において、ＧＯＩコード配列は、野生型ヒトＧＯＩコード配列などの野生型ＧＯＩコード配列の機能的誘導体であることができる。
一態様において、本開示は、細胞のゲノムへの、例えば、ＦＶＩＩＩ遺伝子またはその機能的誘導体などの関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）の核酸配列の挿入を提供する。いくつかの実施形態において、挿入されるＧＯＩコード配列は、改変されたＧＯＩコード配列である。いくつかの実施形態において、改変されたＧＯＩコード配列は、標的細胞内のアルブミン遺伝子のイントロン１に特異的に組み込まれる。いくつかの実施形態において、改変されたＧＯＩコード配列は、ヒトを含む哺乳動物の肝細胞におけるアルブミン遺伝子のイントロン１に特異的に組み込まれる。いくつかの実施形態において、挿入されるＧＯＩコード配列は、改変されたＦＶＩＩＩコード配列である。いくつかの実施形態において、改変ＦＶＩＩＩコード配列において、野生型ＦＶＩＩＩコード配列のＢドメインが欠失され、「ＳＱリンク」と呼ばれるリンカーペプチド（アミノ酸配列ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ－配列番号１）で置き換えられる。このＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）は、当技術分野でよく知られており、全長ＦＶＩＩＩと同等の生物学的活性を有する。例えば、いくつかの実施形態において、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、その小さいそのサイズによって（４３７１ｂｐ対７０５３ｂｐ）全長ＦＶＩＩＩを越えている。したがって、いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩＩシグナルペプチドを欠き、その５’末端にスプライスアクセプター配列（ＦＶＩＩＩコード配列のＮ末端）を含むＦＶＩＩＩ－ＢＤＤコード配列は、ヒトを含む哺乳動物の肝細胞におけるアルブミン遺伝子のイントロン１に特異的に組み込まれる。いくつかの実施形態において、アルブミンプロモーターからのこの改変されたＧＯＩコード配列の転写は、アルブミンのエクソン１、イントロン１の一部、および組み込まれたＧＯＩ配列を含むプレｍＲＮＡをもたらすことができる。例えば、アルブミンプロモーターからの上記の改変ＦＶＩＩＩコード配列の転写は、アルブミンのエクソン１、イントロン１の一部、および組み込まれたＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ遺伝子配列を含むプレｍＲＮＡをもたらすことができる。このプレｍＲＮＡが自然なスプライシングプロセスを経てイントロンを除去すると、スプライシング機構は、アルブミンエクソン１の３’側でスプライスドナーを、挿入されたＤＮＡドナーのＦＶＩＩＩ－ＢＤＤコード配列の５’端でのスプライスアクセプターである、次に利用なスプライスアクセプターに結合することができる。これにより、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの成熟コード配列に融合したアルブミンエクソン１を含む成熟ｍＲＮＡをもたらすことができる。アルブミンのエクソン１は、シグナルペプチドに加えて２つの追加アミノ酸と、ヒトでは通常アルブミンのＮ末端にあるタンパク質配列ＤＡＨをコードするコドンの１／３をコードする。したがって、いくつかの実施形態において、細胞からの分泌の際に予測されるアルブミンシグナルペプチドの切断後、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質が生成され得、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質のＮ末端にアミノ酸配列－
Figure 2022505173000003
 －をもたらすＮ末端に加えられる、３つの追加のアミノ酸残基を有する。これら３個のアミノ酸（下線）の３番目は、部分的にエクソン１の末端によって、部分的にＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ＤＮＡドナーテンプレートによってコードされているため、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、またはＡｒｇのいずれかであるように３番目の追加のアミノ酸残基の固有性を選択することが可能である。これらの選択肢の中で、いくつかの実施形態においてＬｅｕが選択されるが、それは、Ｌｅｕが分子的に最も複雑でなく、したがって新しいＴ細胞エピトープを形成する可能性が最も低く、アミノ酸配列－
Figure 2022505173000004
 －をＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質のＮ末端でもたらすためである。あるいは、ＤＮＡドナーテンプレートは、３番目の残基を欠失するように設計することができ、アミノ酸配列
Figure 2022505173000005
 をＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質のＮ末端にもたらす。いくつかの例において、天然のタンパク質の配列に追加のアミノ酸を加えることは、免疫原性リスクを増加させ得る。したがって、いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤのＮ末端に対する２つの潜在的な選択肢の免疫原性の可能性を予測するコンピュータによる分析は、１つの残基の欠失（
Figure 2022505173000006
 ）は、より低い免疫原性スコアを有することを示し、これは、少なくともいくつかの実施形態において、選択される設計であることができる。
いくつかの実施形態において、コドン使用頻度が最適化されている、例えばＦＶＩＩＩ－ＢＤＤなどの改変ＧＯＩをコードするＤＮＡ配列を使用して、哺乳動物細胞における発現を改善することができる（いわゆるコドン最適化）。異なるコンピュータアルゴリズムも、コドン最適化を実施するための分野で利用可能であり、これらは別個のＤＮＡ配列を生成する。市販のコドン最適化アルゴリズムの例は、ＡＴＵＭおよびＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部）の企業で採用されているものである。コドン最適化ＦＶＩＩＩコード配列は、マウスへの遺伝子ベースの送達後に、ＦＶＩＩＩの発現を有意に改善することが実証された（Ｎａｔｈｗａｎｉ ＡＣ，Ｇｒａｙ ＪＴ，Ｎｇ ＣＹ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７（７）：２６５３－２６６１、Ｗａｒｄ ＮＪ，Ｂｕｃｋｌｅｙ ＳＭ，Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎ ＳＮ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１７（３）：７９８－８０７、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ ＰＡ，Ｓｉｏｎ ＣＪ，Ｗｉｌｋｅｓ ＦＪ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８；１５（４）：２８９－２９７）。
いくつかの実施形態において、異なるアルゴリズムによってコドン最適化された改変ＧＯＩコード配列と天然のＧＯＩ配列（ヒトゲノムに存在する）との間の配列相同性または同一性は、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、改変ＧＯＩのコドン最適化コード配列は、天然のＧＯＩ配列に対して約７５％～約７９％の配列相同性または同一性を有する。いくつかの実施形態において、改変ＧＯＩのコドン最適化コード配列は、天然のＧＯＩ配列に対して、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、または約８０％の配列相同性または同一性を有する。
いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートまたはドナー構築物は、改変ＧＯＩをコードするＤＮＡ配列を含むように調製される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡドナーテンプレートは、改変ＧＯＩのコドン最適化されたヒトコード配列を含むように設計される。いくつかの実施形態において、コドン最適化は、ＧＯＩ、例えば、ＦＶＩＩＩのシグナルペプチドをコードする５’末端で配列が欠失され、スプライスアクセプター配列で置き換えられており、さらにポリアデニル化シグナルがＦＶＩＩＩ終止コドン（ＭＡＢ８Ａ－配列番号８７）の後の３’末端に付加されるような方法で行われる。スプライスアクセプター配列は、既知の遺伝子からの既知のスプライスアクセプター配列の中から選択することができるか、または本分野で知られている多くのスプライスアクセプター配列のアラインメントから派生されるコンセンサススプライスアクセプター配列を使用することができる。いくつかの実施形態において、高度に発現された遺伝子からのスプライスアクセプター配列が使用されるが、そのような配列は、最適なスプライシング効率を提供すると考えられているためである。いくつかの実施形態において、コンセンサススプライシングアクセプター配列は、コンセンサス配列Ｔ／ＣＮＣ／ＴＴ／ＣＡ／ＧＡＣ／Ｔ（配列番号９９）を有する分岐部位、およびその後に、２０ｂｐ以内で、ＡＧ＞Ｇ／Ａ（＞はイントロン／エクソン境界の位置である）が続く１０～１２塩基のポリピリミジントラクト（ＣまたはＴ）から構成される。いくつかの実施形態において、合成スプライスアクセプター配列
Figure 2022505173000007
 が使用される。別の実施形態において、ヒトのアルブミン遺伝子イントロン１／エクソン２境界からの天然のスプライスアクセプター配列
Figure 2022505173000008
 またはマウス
Figure 2022505173000009
 が使用される。
ポリアデニル化配列は、細胞内のｍＲＮＡの安定性に不可欠なポリＡテールを追加するシグナルを細胞のために提供する。ＤＮＡドナーテンプレートがＡＡＶ粒子にパッケージ化されるいくつかの実施形態において、パッケージ化されたＤＮＡのサイズは、一般に、例えば約５Ｋｂ未満、例えば約４．７Ｋｂ以下であるＡＡＶのパッケージング限度内に維持される。したがって、いくつかの実施形態において、可能な限り短いポリＡ配列、例えば、約１０－ｍｅｒ、約２０－ｍｅｒ、約３０－ｍｅｒ、約４０－ｍｅｒ、約５０－ｍｅｒ、もしくは約６０－ｍｅｒ、または前述の任意の間の数のヌクレオチドとして使用することが望ましい。コンセンサス合成ポリＡシグナル配列は、文献で報告されており（Ｌｅｖｉｔｔ Ｎ，Ｂｒｉｇｇｓ Ｄ，Ｇｉｌ Ａ，Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ ＮＪ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９８９；３（７）：１０１９－１０２５）、配列ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ（配列番号５）を有し、多くの発現ベクターで一般的に使用される。
いくつかの実施形態において、追加の配列要素をＤＮＡドナーテンプレートに追加して、組み込み頻度を改善することができる。そのような一要素は、ＨＤＲによる組み込みを可能にするために組み込みが標的化されるゲノムにおける二本鎖切断のどちらかの側のＤＮＡ配列と同一の配列である相同性アームである。二本鎖切断の左側からの配列（ＬＨＡ）は、ＤＮＡドナーテンプレートの５’（ＦＶＩＩＩコード配列のＮ末端）末端に付加され、二本鎖切断の右側からの配列（ＲＨＡ）は、ＤＮＡドナーテンプレート、例えばＭＡＢ８Ｂ（配列番号８８）の３’（ＦＶＩＩＩコード配列のＣ末端）末端に付加される。
いくつかの実施形態で提供される代替のＤＮＡドナーテンプレート設計は、ゲノム部位を切断するために使用されるｓｇＲＮＡの認識配列に相補的な配列を有する。ＭＡＢ８Ｃ（配列番号８９）は、このタイプのＤＮＡドナーテンプレートの例を表す。ｓｇＲＮＡ認識部位を含めることによって、ＤＮＡドナーテンプレートは、ＤＮＡドナーテンプレートおよびｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９が送達されている細胞の核内で、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体によって切断される。ドナーＤＮＡテンプレートの線形フラグメントへの切断は、非相同末端結合メカニズムまたはＨＤＲメカニズムによる二本鎖切断での組み込みの頻度を増加させることができる。これは、核への送達後に、ＡＡＶゲノムがコンカテマー化してより大きな環状二本鎖ＤＮＡ分子を形成することが知られているため、ＡＡＶにパッケージ化されたドナーＤＮＡテンプレートの送達の場合に特に有益であり得る（Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｏｌｏｇｙ ２００１，ｖｏｌ ７５ ｐ．６９６９－６９７６）。したがって、いくつかの例において、環状コンカテマーは、特にＮＨＥＪメカニズムによって、二本鎖切断での組み込みにとって効率の低いドナーになり得る。環状プラスミドＤＮＡドナーテンプレートを使用した標的化された組み込みの効率は、プラスミドにジンクフィンガーヌクレアーゼ切断部位を含めることによって増加できることが以前に報告された（Ｃｒｉｓｔｅａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１３；１１０：８７１－８８０）。最近では、このアプローチは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用して適用された（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｔｕｒｅ ５４０，１４４－１４９）。ｓｇＲＮＡ認識配列は、二本鎖ＤＮＡドナーテンプレートのどちらかの鎖に存在すると活性であるが、ゲノムに存在するｓｇＲＮＡ認識配列の逆相補体の使用は、逆方向での組み込みが、再切断され得るｓｇＲＮＡ認識配列を再生成して挿入されたドナーＤＮＡテンプレートを解放するため、安定した組み込みに好都合であることが予測される。ＮＨＥＪによる順方向のゲノムにおけるそのようなドナーＤＮＡテンプレートの組み込みは、組み込まれたドナーＤＮＡテンプレートがゲノムから切り出されないように、ｓｇＲＮＡ認識配列を再生成しないことが予測される。ＧＯＩドナーＤＮＡテンプレートの組み込み効率において、相同性アームの有無にかかわらずドナーにｓｇＲＮＡ認識配列を含めることの利点は、例えば、ドナーの送達にＡＡＶを使用し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９構成要素の送達にＬＮＰを使用するマウスで試験して決定することができる。
いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡテンプレートは、ＧＯＩまたはその機能的誘導体を、ｇＲＮＡ標的部位が片側または両側に隣接する、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるドナーカセット内に含む。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ドナーカセットの５’のｇＲＮＡ標的部位および／またはドナーカセットの３’のｇＲＮＡ標的部位を含む。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、２つの隣接するｇＲＮＡ標的部位を含み、２つのｇＲＮＡ標的部位は、同じ配列を含む。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナーテンプレートにおける少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子の第１のイントロンを標的化する１つ以上のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つの標的部位である。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナーテンプレートにおける少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子の第１のイントロンにおける１つ以上のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つの標的部位の逆相補体である。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ドナーカセットの５’のｇＲＮＡ標的部位およびドナーカセットの３’のｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナーテンプレートにおける２つのｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子の第１のイントロンを標的化する１つ以上のｇＲＮＡによって標的化される。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ドナーカセットの５’のｇＲＮＡ標的部位およびドナーカセットの３’のｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナーテンプレート中の２つのｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子の第１のイントロンにおける１つ以上のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つの標的部位の逆相補体である。
標的部位、すなわち、ＧＯＩをコードする遺伝子が挿入されるゲノム位置へのＧＯＩをコードする遺伝子の挿入は、内因性のアルブミン遺伝子座またはその隣接配列にあり得る。いくつかの実施形態において、ＧＯＩコード遺伝子は、挿入される遺伝子の発現が、アルブミン遺伝子の内因性プロモーターによって制御される方法で挿入される。いくつかの実施形態において、ＧＯＩをコードする遺伝子は、アルブミン遺伝子のイントロンのうちの１つに挿入される。いくつかの実施形態において、ＧＯＩをコードする遺伝子は、アルブミン遺伝子のエクソンのうちの１つに挿入される。いくつかの実施形態において、ＧＯＩをコードする遺伝子は、イントロン：エクソン（またはその逆）の接合部で挿入される。いくつかの実施形態において、ＧＯＩをコードする遺伝子の挿入は、アルブミン遺伝子座の第１のイントロン（またはイントロン１）にある。いくつかの実施形態において、ＧＯＩをコードする遺伝子の挿入は、アルブミン遺伝子の発現に有意に影響を及ぼす、例えば、上方調節または下方調節することがない。
いくつかの実施形態において、ＧＯＩをコードする遺伝子の挿入のための標的部位は、内因性アルブミン遺伝子に、その内部に、またはその近くにある。いくつかの実施形態において、標的部位は、ゲノム中のアルブミン遺伝子座のプロモーターの上流である遺伝子間領域にある。いくつかの実施形態において、標的部位は、アルブミン遺伝子座内にある。いくつかの実施形態において、標的部位は、アルブミン遺伝子座のイントロンのうちの１つにある。いくつかの実施形態において、標的部位は、アルブミン遺伝子座のエクソンのうちの１つにある。いくつかの実施形態において、標的部位は、アルブミン遺伝子座のイントロンとエクソン（またはその逆）の間の接合部のうちの１つにある。いくつかの実施形態において、標的部位は、アルブミン遺伝子座の第１のイントロン（またはイントロン１）にある。特定の実施形態において、標的部位は、アルブミン遺伝子の第１のエクソンの、少なくとも、約、もしくはほとんど０、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００、または５５０、または６００、または６５０ｂｐ下流（すなわち、第１のエクソンの最後の核酸から）である。いくつかの実施形態において、標的部位は、アルブミン遺伝子の第１のイントロンの、少なくとも、約、もしくはほとんど０．１ｋｂ、約０．２ｋｂ、約０．３ｋｂ、約０．４ｋｂ、約０．５ｋｂ、約１ｋｂ、約１．５ｋｂ、約２ｋｂ、約２．５ｋｂ、約３ｋｂ、約３．５ｋｂ、約４ｋｂ、約４．５ｋｂ、または約５ｋｂ上流である。いくつかの実施形態において、標的部位は、アルブミン遺伝子の第２のエクソンの、約０ｂｐ～約１００ｂｐ上流、約１０１ｂｐ～約２００ｂｐ上流、約２０１ｂｐ～約３００ｂｐ上流、約３０１ｂｐ～約４００ｂｐ上流、約４０１ｂｐ～約５００ｂｐ上流、約５０１ｂｐ～約６００ｂｐ上流、約６０１ｂｐ～約７００ｂｐ上流、約７０１ｂｐ～約８００ｂｐ上流、約８０１ｂｐ～約９００ｂｐ上流、約９０１ｂｐ～約１０００ｂｐ上流、約１００１ｂｐ～約１５００ｂｐ上流、約１５０１ｂｐ～約２０００ｂｐ上流、約２００１ｂｐ～約２５００ｂｐ上流、約２５０１ｂｐ～約３０００ｂｐ上流、約３００１ｂｐ～約３５００ｂｐ上流、約３５０１ｂｐ～約４０００ｂｐ上流、約４００１ｂｐ～約４５００ｂｐ上流、または約４５０１ｂｐ～約５０００ｂｐ上流の内のいずれかの位置である。いくつかの実施形態において、標的部位は、ゲノムにおけるヒトアルブミン遺伝子の第１のエクソンの末端（すなわち、３’末端）の少なくとも３７ｂｐ下流である。いくつかの実施形態において、標的部位は、ゲノムにおけるヒトアルブミン遺伝子の第２のエクソンの開始（すなわち、５’開始）の少なくとも３３０ｂｐ上流である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、細胞においてゲノムを編集する方法であり、本方法は、細胞に以下：（ａ）配列番号１８～４４および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列を含むｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸と、（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｃ）ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を提供することを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝細胞の細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞においてゲノムを編集する方法のいずれかにより、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅに由来する（ｓｐＣａｓ９）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓに由来する（ＳｌｕＣａｓ９）。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞においてゲノムを編集する方法のいずれかにより、ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする核酸配列は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞においてゲノムを編集する方法のいずれかにより、本方法は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を使用する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝細胞の細胞である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞においてゲノムを編集する方法のいずれかにより、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）または機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、ドナーカセットは、片側または両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている。いくつかの実施形態において、ドナーカセットは、両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）のｇＲＮＡのための標的部位である。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートのｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）のｇＲＮＡのための細胞ゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞においてゲノムを編集する方法のいずれかにより、ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡも含む。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードする核酸を含む脂質ナノ粒子を使用する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞においてゲノムを編集する方法のいずれかにより、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡと事前に複合体化され、ＲＮＰ複合体を形成する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞においてゲノムを編集する方法のいずれかにより、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナーテンプレートが細胞に提供された後に細胞に提供される。いくつかの実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナーテンプレートが細胞に提供されてから４日を超えた後に、細胞に提供される。いくつかの実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナーテンプレートが細胞に提供されてから少なくとも１４日後に、細胞に提供される。いくつかの実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナーテンプレートが細胞に提供されてから少なくとも１７日後に、細胞に提供される。いくつかの実施形態において、（ａ）および（ｂ）は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸およびｇＲＮＡを含む脂質ナノ粒子として細胞に提供される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、（ｃ）は、ドナーテンプレートをコードするＡＡＶベクターとして細胞に提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞においてゲノムを編集する方法のいずれかにより、１つ以上の追加用量の、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、第１の用量の、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて細胞に提供される。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加用量の、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）もしくは機能的誘導体をコードする核酸配列の標的化された組み込みの標的レベル、および／またはＧＯＩもしくは機能的誘導体をコードする核酸配列の発現の標的レベルが達成されるまで、第１の用量の、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、細胞に提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞においてゲノムを編集する方法のいずれかにより、ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、ＧＯＩまたはその機能的誘導体を、細胞ゲノムのアルブミン遺伝子座に挿入する方法であり、この方法は、細胞に（ａ）Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）またはＣａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｂ）Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼを誘導して、アルブミン遺伝子座における標的ポリヌクレオチド配列を切断することができる、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸と、（ｃ）ＧＯＩまたはその機能的誘導体を含む、本明細書に記載される実施形態のいずれかによるドナーテンプレートと、を導入することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ｉ）Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびｉｉ）ｇＲＮＡを含む、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＬＮＰを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＡＡＶドナーテンプレートである。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＧＯＩまたはその機能的誘導体を含むドナーカセットを含み、ドナーカセットは、片側または両側で、ｇＲＮＡの標的部位によって隣接されている。いくつかの実施形態において、ドナーカセットに隣接するｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子座におけるｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＣａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、およびｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸は、ドナーテンプレートの細胞への導入に続いて、細胞に導入される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＣａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、およびｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸は、ドナーテンプレートが細胞核に入るのを可能にする細胞へのドナーテンプレートの導入に続いて、細胞に十分な時間導入される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＣａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、およびｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸は、細胞核においてドナーテンプレートが一本鎖ＡＡＶゲノムから二本鎖ＤＮＡ分子に変換されることを可能にする細胞へのドナーテンプレートの導入に続いて、細胞に十分な時間導入される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
いくつかの実施形態において、ＧＯＩまたはその機能的誘導体を本明細書に記載の細胞ゲノムのアルブミン遺伝子座に挿入する方法のいずれかにより、標的ポリヌクレオチド配列は、アルブミン遺伝子のイントロン１にある。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、表３または４に列挙されるスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１８～４４および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、ＧＯＩまたはその機能的誘導体を細胞ゲノムのアルブミン遺伝子座に挿入する方法であり、この方法は、細胞に、（ａ）ｉ）Ｃａｓ９ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびｉｉ）ｇＲＮＡであって、Ｃａｓ９ ＤＮＡエンドヌクレアーゼを誘導してアルブミン遺伝子座の標的ポリヌクレオチド配列を切断することができるｇＲＮＡを含む本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＬＮＰと、（ｂ）ＧＯＩまたはその機能的誘導体を含む本明細書に記載の実施形態のいずれかによるＡＡＶドナーテンプレートと、を導入することを含む。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＧＯＩまたはその機能的誘導体を含むドナーカセットを含み、ドナーカセットは、片側または両側で、ｇＲＮＡの標的部位によって隣接されている。いくつかの実施形態において、ドナーカセットに隣接するｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子座におけるｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、ＡＡＶドナーテンプレートの細胞への導入に続いて細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、ドナーテンプレートが細胞核に入ることを可能にするために、細胞へのＡＡＶドナーテンプレートの導入に続いて、細胞に十分な時間導入される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、ドナーテンプレートが細胞核において一本鎖ＡＡＶゲノムから二本鎖ＤＮＡ分子に変換されることを可能にするために、細胞へのＡＡＶドナーテンプレートの導入に続いて、細胞に十分な時間導入される。いくつかの実施形態において、細胞へのＬＮＰの１つ以上（２、３、４、５、またはそれ以上など）の追加の導入は、細胞へのＬＮＰの第１の導入に続いて実施される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１８～４４および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む。
標的配列の選択
いくつかの実施形態において、本明細書でさらに説明および例示されるように、編集のために選択されたエンドヌクレアーゼシステムに部分的に依存する、特定の参照遺伝子座に対する５′境界および／または３′境界の位置のシフトを使用して、遺伝子編集の特定の適用を促進または強化する。
そのような標的配列の選択の最初の非限定的な態様において、多くのエンドヌクレアーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩまたはタイプＶエンドヌクレアーゼの場合に、ＤＮＡ切断部位に隣接した特定の位置でのＰＡＭ配列モチーフの要件など、切断のための潜在的な標的部位の初期選択を導く規則または基準を有する。
標的配列の選択または最適化の別の非限定的な態様において、標的配列および遺伝子編集エンドヌクレアーゼの特定の組み合わせの「標的外（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）」活性の頻度（すなわち、選択された標的配列以外の部位で生じるＤＳＢの頻度）を、標的内（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ）活性の頻度に対して評価する。いくつかの例において、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞は、他の細胞と比較して選択的な利点を有し得る。選択的利点の例示的であるが非限定的な例には、複製率の向上、持続性、ある特定の条件に対する耐性、生着の成功率の向上または患者への導入後のインビボでの持続性などの属性の獲得、およびそのような細胞の数または生存率の維持または増加に関連する他の属性が含まれる。他の例において、正しく編集された細胞を特定、分類、または他の方法で選択するために使用される１つ以上のスクリーニング方法により、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞を適切に選択することができる。選択的利点および有向選択方法の両方が、修正に関連する表現型を利用することができる。いくつかの実施形態において、意図した細胞集団を選択または精製するために使用される新しい表現型を作成する第２の修飾を作成するために、細胞を２回以上編集することができる。そのような第２の修飾は、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーに第２のｇＲＮＡを付加することで作成され得る。いくつかの例において、ｃＤＮＡおよび選択可能なマーカーを含むＤＮＡフラグメントを使用して、所望される遺伝子座で細胞を正しく編集することができる。
いくつかの実施形態において、任意の選択的利点が適用可能であるか、またはいずれの有向選択が特定の場合に適用されるかに関係なく、標的配列の選択はまた、適用の有効性を高め、かつ／または所望の標的以外の部位での望ましくない変化の可能性を低減するために、標的外頻度の考慮によって導かれる。本明細書および当該技術分野でさらに説明および例示されるように、標的外活性の発生は、標的部位と様々な標的外部位との間の類似性および非類似性、ならびに使用される特定のエンドヌクレアーゼを含む多くの要因によって影響を受ける。標的外活性の予測を支援する生物情報学的ツールを利用することができ、また頻繁に、そのようなツールを使用して、標的外活性の最も可能性の高い部位を特定することもでき、次いで、実験設定で評価して（ａｓｓｅｓｓｅｄ）、標的内活性に対する標的外の相対頻度を評価する（ｅｖａｌｕａｔｅ）ことができ、それにより高い相対標的内活性を有する配列の選択を可能にする。そのような技術の例示的な例が本明細書で提供され、他のものは当該技術分野で知られている。
標的配列の選択の別の態様は、相同的組換え事象に関する。相同領域を共有する配列は、介在配列の欠失をもたらす相同的組換え事象の焦点として機能し得る。そのような組換え事象は、染色体および他のＤＮＡ配列の通常の複製過程で、またＤＮＡ配列が合成されている他の時点で、例えば、通常の細胞複製サイクル中に規則的に起こるが、様々な事象の発生（ＵＶ光および他のＤＮＡ切断の誘導物質など）またはある特定の薬剤の存在（様々な化学的誘導物質など）によって強化され得る、二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合に発生する。そのような誘導物質の多くは、ＤＳＢをゲノム内で無差別に発生させ、ＤＳＢは、正常細胞で規則的に誘導および修復される。修復中、元の配列は、完全に忠実に再構築され得るが、いくつかの例において、小さな挿入または欠失（「インデル」と呼ばれる）が、ＤＳＢ部位で導入される。
本明細書に記載のエンドヌクレアーゼ系の場合のように、特定の位置でＤＳＢを特異的に誘導することもでき、これを使用して選択された染色体位置で有向または選好的遺伝子改変事象を引き起こすことができる。相同配列がＤＮＡ修復（および複製）の文脈で組換えの対象となる傾向は、多くの状況で有利であり得、ＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集システムの１つの適用の基礎となっており、相同性指向修復を使用して、「ドナー」ポリヌクレオチドの使用によって提供される関心対象の配列を所望の染色体位置に挿入する。
わずか１０以下の塩基対を有することができる「マイクロホモロジー」の小さな領域であり得る、特定の配列間の相同領域を使用して、所望の欠失をもたらすこともできる。例えば、単一のＤＳＢは、近くの配列でマイクロホモロジーを示す部位に導入される。そのようなＤＳＢの通常の修復過程において、高頻度で生じる結果は、ＤＳＢおよび付随する細胞修復プロセスによって促進される組換えの結果としての介在配列の欠失である。
しかしながら、状況によっては、相同領域内で標的配列を選択すると、遺伝子融合（欠失がコード領域にある場合）を含む、はるかに大きな欠失が生じる可能性もあり、特定の状況ではそれは望ましいことであり得るか、またはあり得ない。
本明細書で提供される例は、ＧＯＩ、例えばＦＶＩＩＩコード遺伝子を挿入するように設計されたＤＳＢの作成のための様々な標的領域の選択、ならびに標的内事象に対して標的外事象を最小化するように設計されているような領域内の特定の標的配列の選択をさらに説明する。
標的化された組み込み
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、「標的化された組み込み」と呼ばれる、肝細胞のゲノムにおける特定の位置に関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）または機能的ＧＯＩを組み込むことである。いくつかの実施形態において、標的化された組み込みは、配列特異的ヌクレアーゼを使用して、ゲノムＤＮＡに二本鎖切断を生成することが可能である。
いくつかの実施形態で使用されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、大多数のゲノム標的を迅速にスクリーニングして、最適なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ設計を特定することができるという利点を有する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、関連するＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）をＤＮＡにおける特定の配列に標的化させる単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれるＲＮＡ分子を使用する。この標的化は、ｓｇＲＮＡと、ｓｇＲＮＡのおよそ２０ｂｐ標的化配列内のゲノム配列との間のワトソン－クリック塩基対によって生じる。標的部位に結合すると、ＣａｓヌクレアーゼはゲノムＤＮＡの両方の鎖を切断し、二本鎖切断を生じる。特定のＤＮＡ配列を標的化するｓｇＲＮＡを設計するための唯一の要件は、標的配列が、ゲノム配列に相補的なｓｇＲＮＡ配列の３’末端にプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含まなければならないことである。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの場合、ＰＡＭ配列はＮＲＧ（ＲはＡまたはＧであり、Ｎは任意の塩基である）、またはより制限されたＰＡＭ配列ＮＧＧである。したがって、ゲノムの任意の領域を標的化するｓｇＲＮＡ分子は、２０ｂｐの配列をすべてのＰＡＭモチーフに隣接して配置することによってコンピュータで設計することができる。ＰＡＭモチーフは、真核生物のゲノムで平均してまさに１５ｂｐで生じる。しかしながら、コンピュータで設計されたｓｇＲＮＡは、細胞における二重鎖切断を異なる効率で生成し、コンピュータ法を使用して一連のｓｇＲＮＡ分子の切断効率を予測することはできない。ｓｇＲＮＡはインビトロで迅速に合成できるため、これは、所定のゲノム領域内のすべての潜在的なｓｇＲＮＡ配列を迅速にスクリーニングして、最も効率的な切断をもたらすｓｇＲＮＡを特定することを可能にする。一般に、所定のゲノム領域内の一連のｓｇＲＮＡを細胞で試験すると、０～９０％の範囲の切断効率が認められる。コンピュータアルゴリズムならびに検査室試験を使用して、任意の所与のｓｇＲＮＡの標的外の可能性を決定することもできる。ｓｇＲＮＡの２０ｂｐ認識配列との完全な一致は、ほとんどの真核生物ゲノムで主に１回だけ発生するが、ｓｇＲＮＡと１つ以上の塩基対のミスマッチを有する多数の追加部位がゲノム内にある。これらの部位は、ミスマッチの数または位置に基づいてしばしば予測することができない可変頻度で切断され得る。コンピュータ分析によって特定されなかった追加の標的外部位での切断も、発生し得る。したがって、関連する細胞型で多数のｓｇＲＮＡをスクリーニングして、最も有利な標的外プロファイルを有するｓｇＲＮＡを特定することは、治療使用に最適なｓｇＲＮＡを選択する重要な要素である。有利な標的外プロファイルでは、実際の標的外部位の数およびこれらの部位での切断の頻度だけでなく、これらの部位のゲノム内の位置も考慮される。例えば、機能的に重要な遺伝子、特に癌遺伝子または抗癌遺伝子に近い、またはその内部の標的外部位は、既知の機能を有さない遺伝子間領域の部位よりも好都合ではないとみなされる。したがって、最適なｓｇＲＮＡの特定は、生物のゲノム配列のコンピュータ分析だけでは予測することができず、実験的試験を必要とする。コンピュータ分析は、試験するガイドの数を絞り込むのに役立つが、標的内切断が多いガイドを予測するか、または望ましい標的外切断が少ないガイドを予測することはできない。実験データは、各々が関心対象の領域（アルブミンイントロン１など）のゲノムとの完全な一致を有するｓｇＲＮＡの切断効率は、切断なしから＞９０％切断まで変化し、既知のいかなるアルゴリズムによっても予測可能ではないことを示す。所与のｓｇＲＮＡがＣａｓ酵素による切断を促進する能力は、その領域のクロマチン構造によって決定され得るゲノムＤＮＡ内のその特定部位のアクセシビリティに関連し得る。肝細胞などの静止分化細胞のゲノムＤＮＡの大部分は、高度に凝縮されたヘテロクロマチンに存在するが、活発に転写される領域は、Ｃａｓタンパク質のようなタンパク質などの大きい分子に、よりアクセス可能であることが知られている、より開いたクロマチン状態で存在する。活発に転写された遺伝子内でさえ、結合した転写因子または他の調節タンパク質の有無により、ＤＮＡのいくつかの特定の領域は、他の領域よりもアクセス可能である。ゲノム内もしくは特定のゲノム遺伝子座における部位、またはアルブミンイントロン１などのイントロンなどのゲノム遺伝子座の領域を予測することは、不可能であり、したがって、関連する細胞型で実験的に決定する必要がある。いくつかの部位が挿入の可能性のある部位として選択されると、例えば、実験的試験の有無にかかわらず、選択された部位から上流または下流に数ヌクレオチドを移動することによって、そのような部位にいくつかの変異を追加することが可能であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法で使用することができるｇＲＮＡは、表３に列挙された１つ以上、または表３からのものに対して少なくとも約８５％のヌクレオチド配列同一性を有するその任意の誘導体である。
核酸修飾
いくつかの実施形態において、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、本明細書でさらに説明され、当該技術分野で知られているように、例えば、活性、安定性、または特異性を高めるか、送達を変える、宿主細胞における先天性免疫応答を低減するか、または他の増強のために、個々にまたは組み合わせて使用することができる１つ以上の修飾を有することができる。
特定の実施形態において、修飾ポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで使用され、この場合、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイドまたは二重分子ガイドのいずれか）および／または細胞に導入されるＣａｓもしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、以下で説明および図示されるように修飾され得る。そのような修飾ポリヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで使用して、任意の１つ以上のゲノム遺伝子座を編集することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムをそのような用途の非限定的な例の目的のために使用すると、ガイドＲＮＡの修飾を使用して、単一分子ガイドまたは二重分子であり得るガイドＲＮＡおよびＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成または安定性を強化することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替として、ゲノム編集複合体とゲノム内の標的配列との相互作用の開始、安定性、または動力学を強化するために使用することができ、これは、例えば、標的内活性を強化するために使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替として、他の（標的外）部位での効果と比較して、特異性、例えば、標的内部位でのゲノム編集の相対速度を高めるために使用することもできる。
修飾はまた、または代替として、例えば、細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）による分解に対する抵抗性を高めることによって、ガイドＲＮＡの安定性を高め、それにより細胞内での半減期を増加させるために使用することができる。エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入されたガイドＲＮＡの半減期を増加させることが、ガイドＲＮＡおよびコードされたＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが細胞内に共存する時間を増加させるために使用することができるため、ガイドＲＮＡの半減期を増加させる修飾は、ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼを生成するために翻訳される必要があるＲＮＡを介して編集される細胞に導入される実施形態において特に有用であり得る。
修飾はまた、または代替として、細胞に導入されたＲＮＡが先天性免疫応答を誘発する可能性または程度を減少させるために使用することができる。下記および当該技術分野で説明するように、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の文脈で十分に特徴付けられているそのような応答は、ＲＮＡの半減期の低減および／またはサイトカインまたは免疫応答に関連する他の因子の誘発に関連する傾向がある。
１種以上の修飾はまた、細胞に導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに対して行うことができ、ＲＮＡの安定性を高める修飾（例えば、細胞内に存在するＲＮａｓｅによる分解を増加させることによって、など）、得られる生成物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を強化する修飾、および／または細胞に導入されるＲＮＡが先天性免疫応答を誘発する可能性もしくは程度を減少させる修飾が含まれるが、これらに限定されない。
前述のものおよび他のものなどの修飾の組み合わせも同様に使用することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の場合、１種以上の修飾をガイドＲＮＡ（上記に例示したものを含む）に対して行うことができ、かつ／または１種以上の修飾を、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ（上記に例示したものを含む）に対して行うことができる。
実例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで使用されるガイドＲＮＡ、または他のより小さなＲＮＡは、以下に示され、当該技術分野で説明されるように、化学的手段によって容易に合成することができ、多くの修飾が容易に組み込まれるようにする。化学的合成手順は、継続的に拡大しているが、高性能液体クロマトグラフィー（ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避するＨＰＬＣ）などの手順によるそのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチドの長さが１００ヌクレオチド程度を超えて大幅に増加するため、より困難になる傾向がある。より長い化学的に修飾されたＲＮＡを生成するために使用される１つのアプローチは、一緒に連結される２つ以上の分子を生成することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするものなど、はるかに長いＲＮＡは、より容易に酵素的に生成される。酵素的に生成されたＲＮＡで使用するために一般的に利用可能な修飾の種類は少ないが、例えば、安定性を高め、先天性免疫応答の可能性もしくは程度を低減し、かつ／または下記および当該技術分野でさらに説明されるように、他の属性を強化するために使用され得る修飾がさらに存在し、新たな種類の修飾が定期的に開発されている。
様々な種類の修飾、特により小さな化学的に合成されたＲＮＡで頻繁に使用される修飾の例として、修飾は、糖の２′位で修飾された１つ以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態において、２′－Ｏ－アルキル、２′－Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、または２′－フルオロ修飾ヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ修飾には、ピリミジン、脱塩基残基、またはＲＮＡの３′末端の逆塩基のリボースに対する２′－フルオロ、２′－アミノ、または２′－Ｏ－メチル修飾が含まれる。そのような修飾は、オリゴヌクレオチドに日常的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する２′－デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。
多くのヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾は、それらが組み込まれているオリゴヌクレオチドを、天然のオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化に対してより耐性にすることが示されている。これらの修飾オリゴは、未修飾オリゴヌクレオチドよりも長い時間無傷で生存する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例には、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間結合を有するものが含まれる。いくつかのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格およびヘテロ原子骨格、特に、ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２、ＣＨ、～Ｎ（ＣＨ３）～Ｏ～ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られている）、ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２、ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２、およびＯ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２骨格であり、天然のホスホジエステル骨格は、Ｏ－Ｐ－－Ｏ－ＣＨで表される骨格、アミド骨格［Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２８：３６６－３７４（１９９５）］、モルホリノ骨格構造（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号を参照）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格に置き換えられ、ヌクレオチドがポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５４，１４９７を参照）を有するオリゴヌクレオチドである。リン含有結合には、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、および３′アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを有する他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３′－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを有するホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３′－５′結合を有するボラノホスフェート、これらの２′－５′結合した類似体、ならびに反転極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接対が結合されている、３′－５′と５′－３′または２′－５′と５′－２′）が含まれるが、これらに限定されず、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、および同第５，６２５，０５０号を参照されたい。
モルホリノベースのオリゴマー化合物は、Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４）：４５０３－４５１０（２００２）、Ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３０，Ｉｓｓｕｅ ３，（２００１）、Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３：２０９－２１４（２００２）、Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２６：２１６－２２０（２０００）、Ｌａｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：９５９１－９５９６（２０００）、および１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８５９５－８６０２（２０００）に記載されている。
リン原子を内部に含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）を有するもの、シロキサン骨格；硫化物、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２成分が混合しているものを有する。米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、および同第５，６７７，４３９号を参照し、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。
１つ以上の置換糖部分、例えば、以下のうちの１つもまた、２′位に含まれ得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中、ｎは、１～約１０である）；Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；挿入剤；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドおよび同様の特性を有する他の置換基の薬力学的特性を改善するための基。いくつかの実施形態において、修飾は、２′－Ｏ－（２－メトキシエチル）としても知られる、２′－メトキシエトキシ（２′－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３を含む（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）。他の修飾は、２′－メトキシ（２′－Ｏ－ＣＨ３）、２′－プロポキシ（２′－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、および２′－フルオロ（２′－Ｆ）を含む。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に３′末端ヌクレオチド上の糖の３′位および５′末端ヌクレオチドの５′位で行うこともできる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣物を有することもできる。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格は、新規の基で置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、例えば、アミノエチルグリシン骨格などの骨格を含むアミドで置き換えられる。核酸塩基は保持され、直接または間接的に骨格のアミド部分のアザ窒素原子に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２号を有するが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７－１５００（１９９１）に見ることができる。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、追加としてまたは代替として、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）修飾または置換を含むこともできる。本明細書で使用される場合、「未修飾」または「天然」核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、天然核酸に稀にまたは一時的にしか見られない核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジン、特に５－メチルシトシン（５－メチル－２′デオキシシトシンとも呼ばれ、当該技術分野ではしばしば５－Ｍｅ－Ｃと呼ばれる）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲントビオシルＨＭＣ、ならびに合成核酸塩基、例えば、２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾリルアルキル）アデニン、２－（アミノアルキルアミノ）アデニン、または他のヘテロ置換アルキルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン、および２，６－ジアミノプリンが含まれる。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ７５－７７（１９８０）、Ｇｅｂｅｙｅｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５１３（１９９７）。当該技術分野で知られている「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンもまた含まれ得る。５－Ｍｅ－Ｃ置換は、核酸二重鎖の安定性が０．６～１．２℃向上することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、塩基置換の実施形態である。
いくつかの実施形態において、修飾された核酸塩基は、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（疑似－ウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルクアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンを含む。
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、′Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ′，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ′，１９９１，３０，ｐａｇｅ ６１３により開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ′，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅａ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３により開示されているものを含む。これらのある特定の核酸塩基は、本開示のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６、および０－６置換プリンが含まれ、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンを有する。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃向上させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ，′Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ′，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、さらにより具体的には２′－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合の塩基置換の実施形態である。修飾された核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、および同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６８１，９４１号、同第５，７５０，６９２号、同第５，７６３，５８８号、同第５，８３０，６５３号、同第６，００５，０９６号、ならびに米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号に記載されている。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼをコードするガイドＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ（またはＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを強化する１つ以上の部分または共役体に化学結合する。そのような部分には、コレステロール部分などの脂質部分［Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３－６５５６（１９８９）］、コール酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３－１０６０（１９９４）］、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６－３０９（１９９２）およびＭａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５－２７７０（１９９３）］、チオコレステロール［Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：５３３－５３８（１９９２）］、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基［Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７－３３０（１９９０）およびＳｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９－５４（１９９３）］、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４（１９９５）およびＳｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３７７７－３７８３（１９９０）］、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖［Ｍａｎｃｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９－９７３（１９９５）］、アダマンタン酢酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４（１９９５）］、パルミチル部分［（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９－２３７（１９９５）］、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－ｔオキシコレステロール部分［Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３－９３７（１９９６）］が含まれるが、これらに限定されない米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７、５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３、５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９、９２８号、および同第５，６８８，９４１号も参照されたい。
いくつかの実施形態において、糖および他の部分を使用して、カチオン性ポリソームおよびリポソームなどのヌクレオチドを有するタンパク質および複合体を特定の部位に標的化することができる。例えば、肝細胞向けの伝達は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を介して媒介され得る。例えば、Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．２１（１０）：１０２５－３０（２０１４）を参照されたい。当該技術分野で既知であり、定期的に開発されている他のシステムを使用して、本事例で使用する生体分子および／またはその複合体を関心対象の特定の標的細胞に標的化することができる。
いくつかの実施形態において、これらの標的化部分または共役体は、一級または二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した共役基を含み得る。本開示の共役基には、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、およびオリゴマーの薬物動態特性を高める基が含まれる。典型的な共役基には、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。本開示の文脈において、薬力学的特性を強化する基には、取り込みを改善し、分解に対する耐性を強化し、かつ／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本開示の文脈において、薬物動態特性を強化する基には、本開示の化合物の取り込み、分布、代謝、または排泄を改善する基が含まれる。代表的な共役基は、参照により本明細書に組み込まれる、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号、および米国特許第６，２８７，８６０号に開示されている。共役部分には、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル－５－トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム、１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート、ポリアミン、もしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７、５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３、５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号、および同第５，６８８，９４１号を参照されたい。
化学合成の影響を受けにくく、酵素的合成によって一般的に生成されるより長いポリヌクレオチドもまた、様々な手段によって修飾され得る。そのような修飾には、例えば、ある特定のヌクレオチド類似体の導入、分子の５′または３′末端での特定の配列または他の部分の組み込み、および他の修飾が含まれ得る。例として、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは、長さがおよそ４ｋｂであり、インビトロ転写により合成することができる。ｍＲＮＡの修飾は、例えば、その翻訳または安定性を高めるために（例えば、細胞での分解に対する耐性を高めることによって）適用するか、またはＲＮＡが細胞でしばしば観察される先天性免疫応答を誘発する傾向を低減した後、外因性ＲＮＡ、特にＣａｓ９をコードするようなより長いＲＮＡを導入するために適用され得る。
多くのそのような修飾、例えば、ポリＡテール、５′キャップ類似体（例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）もしくはｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇ（ｍＣＡＰ））、修飾された５′もしくは３′非翻訳領域（ＵＴＲ）、修飾された塩基の使用（例えば、疑似－ＵＴＰ、２－チオ－ＵＴＰ、５－メチルシチジン－５′－トリホスフェート（５－メチル－ＣＴＰ）もしくはＮ６－メチル－ＡＴＰなど）の使用、または５′末端リン酸を除去するためのホスファターゼによる処置は、当該技術分野において説明されている。これらおよび他の修飾は、当該技術分野で知られており、ＲＮＡの新しい修飾が定期的に開発されている。
例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＡｘｏＬａｂｓ，Ｂｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、およびその他多くを含む、修飾ＲＮＡの多数の商業的サプライヤーが存在する。ＴｒｉＬｉｎｋに記載されているように、例えば、５－メチル－ＣＴＰを使用して、ヌクレアーゼ安定性の増加、翻訳の増加、または先天性免疫受容体とインビトロ転写ＲＮＡとの相互作用の低減などの望ましい特性を付与することができる。５－メチルシチジン－５′－トリホスフェート（５－メチル－ＣＴＰ）、Ｎ６－メチル－ＡＴＰ、疑似－ＵＴＰおよび２－チオ－ＵＴＰはまた、下記で参照されるＫｏｒｍａｎｎらおよびＷａｒｒｅｎらによる刊行物において説明されるように、培養物中およびインビボで先天性免疫刺激を低減する一方で、翻訳を強化することが示されている。
インビボで送達される化学的に修飾されたｍＲＮＡを使用して、改善された治療効果を達成できることが示されている。例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９，１５４－１５７（２０１１）を参照されたい。そのような修飾を使用して、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を高め、かつ／またはその免疫原性を低減することができる。疑似－Ｕ、Ｎ６－メチル－Ａ、２－チオ－Ｕ、および５－メチル－Ｃなどの化学修飾を使用して、ウリジンおよびシチジン残基の４分の１のみをそれぞれ２－チオ－Ｕおよび５－メチル－Ｃで置換することが、マウスのｍＲＮＡのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）媒介認識の有意な減少をもたらしたことがわかった。先天性免疫系の活性化を低減させることにより、これらの修飾を使用して、インビボでのｍＲＮＡの安定性および寿命を効果的に高めることができる。例えば、上記のＫｏｒｍａｎｎらを参照されたい。
また、先天性抗ウイルス応答をバイパスするように設計された修飾を組み込んだ合成メッセンジャーＲＮＡを繰り返し投与すると、分化したヒト細胞を多能性に再プログラムできることが示されている。例えば、Ｗａｒｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８－３０（２０１０）を参照されたい。一次再プログラミングタンパク質として作用するこのような修飾ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞型を再プログラミングする効率的な手段であり得る。このような細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれ、５－メチル－ＣＴＰ、疑似－ＵＴＰ、およびアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を組み込んだ酵素的に合成されたＲＮＡを使用して、細胞の抗ウイルスを効果的に回避できることがわかった。例えば、上記のＷａｒｒｅｎらを参照されたい。
当該技術分野に記載されたポリヌクレオチドの他の修飾には、例えば、ポリＡテールの使用、５′キャップ類似体の付加（ｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇ（ｍＣＡＰ）など）、５′または３′非翻訳領域（ＵＴＲ）の修飾、または５′末端リン酸を除去するためのホスファターゼによる処置が含まれ、新しいアプローチが定期的に開発されている。
本明細書で使用するための修飾ＲＮＡの生成に適用可能な多くの組成物および技術が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の修飾に関連して開発されてきた。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ干渉を介した遺伝子サイレンシングへの影響が一般に一過性であり、反復投与を必要とし得るため、インビボで特定の課題を提示する。さらに、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳動物細胞は、多くの場合、ウイルス感染の副産物であるｄｓＲＮＡを検出し、中和するために進化した免疫応答を有する。したがって、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ応答性キナーゼ）などの哺乳動物酵素、およびｄｓＲＮＡに対する細胞応答を媒介することができる潜在的にレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、ならびにそのような分子に応答してサイトカインの誘導を引き起こすことができるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８など）が存在する。例えば、Ａｎｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）６（４）：４４０－４６８（２０１３）、Ｋａｎａｓｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０（３）：５１３－５２４（２０１２）、Ｂｕｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．６（９）：１１３０－４６（２０１１）、Ｊｕｄｇｅ ａｎｄ ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９（２）：１１１－２４（２００８）によるレビュー、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。
本明細書に記載されるように、ＲＮＡの安定性を高め、先天性免疫応答を低減し、かつ／またはヒト細胞へのポリヌクレオチドの導入に関連して有用であり得る他の利点を達成するために、多種多様な修飾が開発および適用されている。例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ＫＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２：７７－９６（２０１１）、Ｇａｇｌｉｏｎｅ ａｎｄ Ｍｅｓｓｅｒｅ，Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１０（７）：５７８－９５（２０１０）、Ｃｈｅｒｎｏｌｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１２（２）：１５８－６７（２０１０）、Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ Ｃｈａｐｔｅｒ １６：Ｕｎｉｔ １６．３（２００９）、Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８（４）：３０５－１９（２００８）、Ｆｕｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ ２２（３）：２０５－２１０（２０１２）、Ｂｒｅｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ ３：１５４（２０１２）によるレビューを参照されたい。
上記のように、修飾ＲＮＡの多くの商業的サプライヤーがあり、その多くは、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計された修飾に特化している。文献で報告されている様々な発見に基づいて、様々なアプローチが提供されている。例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎは、Ｋｏｌｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １１：１２５－１４０（２０１２）によって報告されているように、非架橋酸素の硫黄（ホスホロチオエート、ＰＳ）への置換が、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するために広く使用されていることに注目している。リボースの２′位の修飾は、ヌクレオチド間リン酸結合のヌクレアーゼ耐性を向上させる一方で、二重鎖の安定性（Ｔｍ）を高めることが報告されており、これはまた、免疫活性からの保護を提供することも示されている。中程度のＰＳ骨格修飾と小さな良好な耐容性の２′置換（２′－Ｏ－メチル、２′－フルオロ、２′－ハイドロ）の組み合わせは、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８（２００４）によって報告されたインビボでの適用のための安定性の高いｓｉＲＮＡと関連付けられており、２′－Ｏ－メチル修飾は、Ｖｏｌｋｏｖ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９：１９１－２０２（２００９）によって報告された安定性の改善に効果的であると報告されている。先天性免疫応答の誘導の低下に関して、特定の配列を２′－Ｏ－メチル、２′－フルオロ、２′－ハイドロで修飾すると、一般にサイレンシング活性を維持しながら、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８相互作用を低減することが報告されている。例えば、Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：４９４－５０５（２００６）、およびＣｅｋａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６５：９０－１０８（２００７）を参照されたい。２－チオウラシル、疑似ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、およびＮ６－メチルアデノシンなどの追加の修飾もまた、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８によって媒介される免疫効果を最小限に抑えることが示されている。例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：１６５－１７５（２００５）を参照されたい。
当該技術分野において知られ、市販されているように、本明細書で使用するために、例えば、コレステロール、トコフェロールおよび葉酸、脂質、ペプチド、重合体、リンカー、およびアプタマーを含む細胞による送達および／または取り込みを増強することができるＲＮＡなどのポリヌクレオチドに多くの共役体を適用することができる。例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４：７９１－８０９（２０１３）によるレビューおよびそこに引用されている参考文献を参照されたい。
送達
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法で使用される任意の核酸分子、例えば、本開示のゲノム標的化核酸および／または部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達のために送達ビヒクルの表面または表面上にパッケージ化され得る。企図される送達ビヒクルには、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、およびミセルが含まれるが、これらに限定されない。当該技術分野で説明されているように、様々な標的化部分を使用して、そのようなビヒクルと所望の細胞型または位置との優先的相互作用を強化することができる。
本開示の複合体、ポリペプチド、および核酸の細胞への導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達、および同様な技術によって起こり得る。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）および／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（複数可）（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、当該技術分野で既知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクルによって送達され得る。あるいは、エンドヌクレアーゼポリペプチド（複数可）は、電気穿孔または脂質ナノ粒子など、当該技術分野で知られているウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクルによって送達することができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のポリペプチドとして、単独で、または１つ以上のガイドＲＮＡと、または１つ以上のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを事前に複合体化してのいずれかで送達され得る。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正荷電ペプチド、低分子ＲＮＡ共役体、アプタマーＲＮＡキメラ、ＲＮＡ融合タンパク質複合体を含むが、これらに限定されない非ウイルス送達ビヒクルによって送達され得る。いくつかの例示的な非ウイルス性送達ビヒクルは、Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８：１１２７－１１３３（２０１１）（他のポリヌクレオチドの送達にも有用なｓｉＲＮＡの非ウイルス性送達ビヒクルに焦点を当てている）に記載されている。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、およびエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって細胞または患者に送達することができる。
核酸のいくつかの非ウイルス送達法が動物モデルおよびヒトの両方で試験されているが、最も十分に開発されたシステムは、脂質ナノ粒子である。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、一般に、イオン化可能なカチオン性脂質および３つ以上の追加成分、通常はコレステロール、ＤＯＰＥ、および脂質を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなり、例えば、例２を参照されたい。カチオン性脂質は、正電荷に帯電した核酸に結合して、核酸を分解から保護する高密度の複合体を形成することができる。マイクロ流体システムを通過する間に、成分は自己集合して５０～１５０ｎＭのサイズ範囲で粒子を形成し、そこに核酸はカチオン性脂質と複合体を形成したコアにカプセル化され、脂質二重層様構造によって囲まれる。対象の循環への注射後、これらの粒子はアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）に結合することができる。ＡｐｏＥはＬＤＬ受容体のリガンドであり、受容体媒介性エンドサイトーシスを介して肝臓の肝細胞への取り込みを仲介する。このタイプのＬＮＰは、げっ歯類、霊長類、およびヒトの肝臓の肝細胞に、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを効率的に送達することが示されている。エンドサイトーシス後、ＬＮＰはエンドソームに存在する。カプセル化された核酸は、カチオン性脂質のイオン化可能な性質によって媒介されるエンドソーム脱出のプロセスを経る。これにより、核酸が細胞質に送達され、そこでｍＲＮＡがコードされたタンパク質に翻訳され得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡのＬＮＰへのカプセル化を使用して、ＩＶ注射後に両方の構成要素を肝細胞に効率的に送達させる。エンドソーム脱出後、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質に翻訳され、ｇＲＮＡと複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質配列への核局在化シグナルの包含は、Ｃａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡ複合体の核への移行を促進する。あるいは、小さなｇＲＮＡは核膜孔複合体を通過し、核でＣａｓ９タンパク質と複合体を形成する。核に入ると、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ゲノムを相同的な標的部位について探査し、ゲノムにおける所望の標的部位で優先的に二本鎖切断を生じる。インビボでのＲＮＡ分子の半減期は、数時間から数日のオーダーで、短期である。同様に、タンパク質の半減期は、数時間から数日のオーダーで、短い傾向がある。したがって、いくつかの実施形態において、ＬＮＰを使用するｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡの送達は、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の一過性の発現および活性のみをもたらすことができる。これは、標的外切断の頻度を低減するという利点を提供し、したがって、いくつかの実施形態において遺伝子毒性のリスクを最小限に抑えることができる。ＬＮＰは、一般的にウイルス粒子よりも低い免疫原性である。多くのヒトは、ＡＡＶに対する既存の免疫を有するが、ＬＮＰに対する既存の免疫はない。さらに、ＬＮＰに対する追加および適応免疫応答が発生する可能性は低く、ＬＮＰの反復投与を可能にする。
いくつかの異なるイオン化可能なカチオン性脂質が、ＬＮＰにおける使用のために開発されている。これらには、とりわけ、Ｃ１２－２００（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ（２０１０），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ｖｏｌ．１０７，１８６４－１８６９）、ＭＣ３、ＬＮ１６、ＭＤ１が含まれる。ＬＮＰの一タイプでは、ＧａｌＮａｃ部分がＬＮＰの外側に付着し、アシアリロ糖タンパク質受容体を介して肝臓に取り込まれるためのリガンドとして作用する。これらのカチオン性脂質のいずれかを使用して、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡの肝臓への送達のためのＬＮＰを製剤化する。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、または２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。あるいは、ナノ粒子は、サイズが１～１０００ｎｍ、１～５００ｎｍ、１～２５０ｎｍ、２５～２００ｎｍ、２５～１００ｎｍ、３５～７５ｎｍ、または２５～６０ｎｍの範囲であることができる。
ＬＮＰは、カチオン性、アニオン性、または中性脂質から作製することができる。融合性リン脂質ＤＯＰＥまたは膜成分コレステロールなどの中性脂質は、トランスフェクション活性およびナノ粒子の安定性を高めるための「ヘルパー脂質」としてＬＮＰに含まれ得る。カチオン性脂質の限界には、安定性が低く、クリアランスが速いことによる有効性の低下、ならびに炎症反応または抗炎症反応の生成が含まれる。ＬＮＰはまた、疎水性脂質、親水性脂質、または疎水性脂質および親水性脂質の両方を有することができる。
当該技術分野で知られている任意の脂質または脂質の組み合わせを使用して、ＬＮＰを生成することができる。ＬＮＰを生成するために使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ－ＤＰｙＰＥ、およびＧＬ６７Ａ－ＤＯＰＥ－ＤＭＰＥ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。カチオン性脂質の例は、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、および７Ｃ１である。中性脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭである。ＰＥＧ修飾脂質の例は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、およびＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０である。
いくつかの実施形態において、脂質を任意のモル比で組み合わせて、ＬＮＰを生成することができる。さらに、ポリヌクレオチド（複数可）を脂質（複数可）と広範囲のモル比で組み合わせてＬＮＰを生成することができる。
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドおよびゲノム標的化核酸はそれぞれ、細胞または患者に別々に投与することができる。一方で、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つ以上のｃｒＲＮＡと事前に複合体化することができる。次いで、事前に複合体化された材料を、細胞または患者に投与することができる。このような事前に複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られている。
ＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡと特定の相互作用を形成することができる。この特性は、多くの生物学的プロセスで活用されているが、核酸が豊富な細胞環境での無差別な相互作用のリスクも伴う。この問題に対する１つの解決策は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成であり、この場合、ＲＮＡは、エンドヌクレアーゼと事前に複合体化される。ＲＮＰの別の利点は、ＲＮＡの分解からの保護である。
いくつかの実施形態において、ＲＮＰのエンドヌクレアーゼは、修飾または未修飾であり得る。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは、修飾または未修飾であり得る。当該技術分野では、多くの修飾が知られており、使用することができる。
エンドヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡは、一般に１：１のモル比で組み合わせることができる。あるいは、エンドヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、一般に１：１：１のモル比で組み合わせることができる。しかしながら、広範囲のモル比を使用して、ＲＮＰを生成することができる。
いくつかの実施形態において、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを送達に使用することができる。送達されるポリヌクレオチドを含む、パッケージ化されるＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を生成する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの生成は、以下の成分であるｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、ｒＡＡＶゲノム中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得、またｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来し得、ＡＡＶ血清型であるＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、およびＡＡＶｒｈ．７４を含むが、それらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ０１／８３６９２号に開示されている。表１を参照されたい。
Figure 2022505173000010
いくつかの実施形態において、パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子生成に必要なすべての成分を安定して発現する細胞株を作成することを含む。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別のＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを有するプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されている。次に、パッケージング細胞株は、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスで感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模生成に好適であることである。好適な方法の他の例は、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用して、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入する。
ｒＡＡＶ生産の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９；およびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。
ＡＡＶベクターの血清型は、標的細胞型に一致させることができる。例えば、以下の例示的な細胞型は、中でも示されたＡＡＶ血清型によって形質導入され得る。例えば、肝臓組織／細胞型に好適なＡＡＶベクターの血清型には、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれるが、これらに限定されない。
アデノ随伴ウイルスベクターに加えて、他のウイルスベクターを使用することができる。そのようなウイルスベクターには、レンチウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、ペスチウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、アルブミン遺伝子の１つまたは２つの遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡ、およびドナーＤＮＡは、各々が別々に脂質ナノ粒子に製剤化されるか、またはすべて１つの脂質ナノ粒子に共製剤化されるか、もしくは２つ以上の脂質ナノ粒子に共製剤化される。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に製剤化され、一方、ｓｇＲＮＡおよびドナーＤＮＡは、ＡＡＶベクターで送達される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡは、脂質ナノ粒子に共製剤化され、ドナーＤＮＡは、ＡＡＶベクターで送達される。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＤＮＡプラスミドとして、ｍＲＮＡとして、またはタンパク質として送達するオプションが利用可能である。ガイドＲＮＡは、同じＤＮＡから発現され得るか、またはＲＮＡとして送達することもできる。ＲＮＡを化学的に修飾して、その半減期を変更もしくは改善し得るか、または免疫応答の可能性もしくは程度を低下させることができる。エンドヌクレアーゼタンパク質は、送達前にｇＲＮＡと複合体化することができる。ウイルスベクターは、効率的な送達を可能にし、Ｃａｓ９の分割バージョンおよびＣａｓ９の小さなオルソログは、ＨＤＲのドナーと同様にＡＡＶにパッケージ化され得る。これらの各成分を送達できる一連の非ウイルス性送達方法も存在するか、または非ウイルス性およびウイルス性の方法を組み合わせて使用することもできる。例えば、ナノ粒子を使用してタンパク質およびガイドＲＮＡを送達することができる一方で、ＡＡＶを使用してドナーＤＮＡを送達することができる。
治療的処置のためにゲノム編集成分を送達することに関連するいくつかの実施形態において、少なくとも２つの成分である配列特異的ヌクレアーゼおよびＤＮＡドナーテンプレートが、形質転換される細胞、例えば肝細胞の核に送達される。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡテンプレートは、肝臓に対して向性を有するＡＡＶにパッケージ化される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ－ＤＪから選択される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶパッケージ化ＤＮＡドナーテンプレートが、対象、例えば、患者に、最初に末梢ＩＶ注射によって、続いて配列特異的ヌクレアーゼが投与される。ＡＡＶパッケージ化ドナーＤＮＡテンプレートを最初に送達することの利点は、送達されたドナーＤＮＡテンプレートが形質導入された肝細胞の核内で安定して維持され、ゲノムに二本鎖切断を作成する配列特異的ヌクレアーゼのそれに続く投与を可能にし、ＨＤＲまたはＮＨＥＪによるＤＮＡドナーのその後の組み込みを伴うことである。いくつかの実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、所望の治療効果のために十分なレベルで導入遺伝子の標的化された組み込みを促進するのに必要な時間だけ、標的細胞において活性を維持することが望ましい。配列特異的ヌクレアーゼが細胞内で長期間活性を維持する場合、これは、標的外部位での二本鎖切断の頻度の増加をもたらす。具体的には、標的外切断の頻度は、ヌクレアーゼが活性である時間が乗じられる標的外切断効率の関数である。配列特異的ヌクレアーゼをｍＲＮＡの形態で送達すると、ｍＲＮＡおよび翻訳されたタンパク質は細胞内で短命であるため、数時間から数日の範囲の短い持続期間でヌクレアーゼ活性をもたらす。したがって、ドナーテンプレートをすでに含む細胞への配列特異的ヌクレアーゼの送達は、標的外組み込みと比較して、標的化された組み込みの可能な限り高い比率をもたらすと予想される。さらに、末梢ＩＶ注射後の肝細胞の核へのドナーＤＮＡテンプレートのＡＡＶ媒介送達は、ウイルスが細胞に感染し、エンドソームを脱出し、そして核を通過する必要性、および宿主成分による一本鎖ＡＡＶゲノムの二本鎖ＤＮＡ分子への変換のため、一般に１～１４日のオーダーで時間がかかる。したがって、いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡテンプレートの核への送達のプロセスは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９構成要素を供給する前に完了することができるが、それはこれらのヌクレアーゼ成分が約１～３日間のみ活性であるためである。
いくつかの実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９であり、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとともに、アルブミン遺伝子のイントロン１内のＤＮＡ配列に向けられるｓｇＲＮＡから構成される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に操作可能に融合されたＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡとして送達される。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子にパッケージ化することによって肝細胞に送達される。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、脂質Ｃ１２－２００を含む（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ ２０１０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ｖｏｌ １０７ １８６４－１８６９）。いくつかの実施形態において、ＬＮＰにパッケージ化されるＣａｓ９ ｍＲＮＡに対するｓｇＲＮＡの比は、１：１（質量比）であり、マウスにおいてインビボで最大のＤＮＡ切断をもたらす。代替の実施形態において、ＬＮＰにパッケージ化されるＣａｓ９ ｍＲＮＡに対するｓｇＲＮＡの異なる質量比は、例えば、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、もしくは２：１、または逆の比率を使用することができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡは、別個のＬＮＰ製剤にパッケージ化され、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ含有ＬＮＰは、ｓｇＲＮＡの送達前に翻訳されるＣａｓ９ ｍＲＮＡの最適時間を可能にするように、ｓｇＲＮＡ含有ＬＮＰの約１～約８時間前に患者に送達される。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡをカプセル化するＬＮＰ製剤（「ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤」）は、ＡＡＶにパッケージ化されたＤＮＡドナーテンプレートが既に投与された対象、例えば患者に投与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤は、ＡＡＶ－ドナーＤＮＡテンプレートの投与後、１日～２８日以内、または７日～２８日以内、または７日～１４日以内に対象に投与される。ＡＡＶ－ドナーＤＮＡテンプレートと比較したＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の送達の最適なタイミングは、当技術分野で知られている技術、例えば、マウスおよびサルを含む動物モデルで行われる試験を使用して、決定することができる。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡドナーテンプレートは、非ウイルス送達法を使用して、対象、例えば患者の肝細胞に送達される。一部の患者（一般に３０％）は、最も一般的に使用されるＡＡＶ血清型に向けられた既存の中和抗体を有しており、該ＡＡＶによる効果的な遺伝子送達を妨げるが、すべての患者は、非ウイルス送達法で治療可能である。いくつかの非ウイルス送達方法論が、本分野で知られている。特に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、動物およびヒトにおける静脈内注射後に、それらのカプセル化されたカーゴを肝細胞の細胞質に効率的に送達することが知られている。これらのＬＮＰは、受容体媒介性エンドサイトーシスのプロセスを通じて肝臓によって活発に取り込まれ、肝臓への優先的な取り込みをもたらす。
いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートの核局在化を促進するために、プラスミドの核局在化を促進することができるＤＮＡ配列、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）複製起点の３６６ｂｐ領域および初期プロモーターを、ドナーテンプレートに加えることができる。細胞タンパク質に結合する他のＤＮＡ配列も、ＤＮＡの核内侵入を改善するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、導入されたＧＯＩの発現または活性のレベルは、ＡＡＶ－ドナーＤＮＡテンプレート後に、例えば、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の第１の投与に続いて、対象、例えば患者の血液において測定される。ＧＯＩレベルが、例えば、少なくとも５～５０％、特に正常レベルの５～２０％のＧＯＩレベルとして定義されるように、疾患を治癒するのに十分でない場合、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の第２または第３の投与が、アルブミンイントロン１部位への追加の標的化された組み込みを促進するために与えられる。ＧＯＩの所望の治療レベルを得るためにＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の複数回投与を使用することの実現可能性は、例えば、マウスおよびサルを含む動物モデルを使用して試験する、本分野で知られている技術を使用して試験および最適化することができる。
いくつかの実施形態において、ｉ）ドナーカセットを含むＡＡＶ－ドナーＤＮＡテンプレート、およびｉｉ）ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の、対象への投与を含む本明細書に記載の方法のいずれかに従って、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の初回用量は、対象へのＡＡＶドナーＤＮＡテンプレートの投与後、１日～２８日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の初回用量は、標的細胞の核へのドナーＤＮＡテンプレートの送達を可能にするのに十分な時間の後に、対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の初回用量は、標的細胞の核において一本鎖ＡＡＶゲノムの二本鎖ＤＮＡ分子への変換を可能にするのに十分な時間の後に、対象に投与される。いくつかの実施形態において、１つ以上（２、３、４、５、またはそれ以上など）の追加用量のＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤が、初期用量の投与に続いて対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の１つ以上の用量は、ドナーカセットの標的化された組み込みの標的レベルおよび／またはドナーカセットの発現の標的レベルが達成されるまで、対象に投与される。いくつかの実施形態において、本方法は、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の各投与後のドナーカセットの標的化された組み込みのレベルおよび／またはドナーカセットの発現のレベルを測定することと、ドナーカセットの標的化された組み込みの標的レベルおよび／またはドナーカセットの発現の標的レベルが達成されない場合にＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の追加用量を投与することと、をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の１つ以上の追加用量のうちの少なくとも１つの量は、初回用量と同じである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の１つ以上の追加用量のうちの少なくとも１つの量は、初回用量よりも少ない。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ－ヌクレアーゼ製剤の１つ以上の追加用量のうちの少なくとも１つの量は、初回用量よりも多い。
遺伝子組み換え細胞および細胞集団
一態様において、本開示は、細胞においてゲノムを編集する方法を提供し、それによって、遺伝子改変細胞を作成する。いくつかの態様において、遺伝子改変細胞の集団が提供される。したがって、遺伝子改変細胞は、ゲノム編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムを使用）によって導入された少なくとも１つの遺伝子改変を有する細胞を指す。いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変された肝細胞の細胞である。外因性ゲノム標的化核酸および／またはゲノム標的化核酸をコードする外因性核酸を有する遺伝子改変細胞が、本明細書で企図される。「遺伝子改変細胞」という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指す。変異または環境の影響のいずれかにより、特定の改変が次の世代で発生し得るため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書で使用される本用語の範囲内に含まれる。
いくつかの実施形態において、細胞のゲノムは、関心対象の遺伝子またはその機能的誘導体の核酸配列を細胞のゲノム配列に挿入することによって編集することができる。いくつかの実施形態において、ゲノム編集に供される細胞は、ゲノムに１つ以上の変異を有し、その結果、そのような変異（複数可）を有さない正常の発現と比較して、内因性ＧＯＩの発現の低減をもたらす。正常細胞は、ＧＯＩに関連する欠陥を有さない別の対象に由来する（または単離された）健康な細胞またはコントロール細胞であることができる。いくつかの実施形態において、ゲノム編集に供される細胞は、ＧＯＩ関連の状態または障害の治療を必要としている対象に由来（またはそこから単離）し得る。したがって、いくつかの実施形態において、そのような細胞における内因性ＧＯＩの発現は、正常細胞における内因性ＧＯＩ発現の発現と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％低減される。
導入遺伝子、例えばＧＯＩまたはその機能的フラグメントをコードする核酸の挿入が成功すると、細胞における導入されたＧＯＩまたはその機能的誘導体の発現は、細胞における内因性ＧＯＩの発現と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１，０００％、約２，０００％、約３，０００％、約５，０００％、約１０，０００％、またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態において、ゲノム編集された細胞におけるＧＯＩの機能的フラグメントを含む導入されたＧＯＩ生成物の活性は、細胞の内因性ＧＯＩの発現と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１，０００％、約２，０００％、約３，０００％、約５，０００％、約１０，０００％。またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態において、細胞における導入されたＧＯＩまたはその機能的誘導体の発現は、細胞の内因性ＧＯＩの発現の、少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約５０倍、約１００倍、約１０００倍以上、またはそれ以上である。また、いくつかの実施形態において、ゲノム編集された細胞におけるＧＯＩの機能的フラグメントを含む導入されたＧＯＩ生成物の活性は、正常で健康な細胞におけるＧＯＩ生成物の活性に匹敵するか、またはそれ以上であり得る。
例えば血友病Ａなどの障害もしくは健康状態を治療または改善することが関係するいくつかの実施形態において、遺伝子編集の主な標的は、ヒト細胞である。例えば、エクスビボ法およびインビボ法では、ヒト細胞は肝細胞である。いくつかの実施形態において、必要とする患者に由来する、したがって既に完全に一致している自家細胞で遺伝子編集を実施することにより、患者に安全に再導入され得る細胞を生成し、患者の疾患に関連する１つ以上の臨床状態の改善に効果的となる、細胞集団を効果的に生じさせることが可能である。そのような治療のためのいくつかの実施形態において、肝細胞の細胞を、当技術分野で知られている任意の方法に従って単離することができ、遺伝子改変された、治療上有効な細胞を作製するために使用することができる。いくつかの実施形態において、肝臓幹細胞は、エクスビボで遺伝子改変され、次いで患者に再導入され、それらが、挿入されたＧＯＩ（例えば、挿入されたＦＶＩＩＩ遺伝子）を発現する遺伝子改変肝細胞または類洞内皮細胞を生じさせる。
本開示はさらに、遺伝子改変細胞の子孫を提供し、子孫は、それが由来する遺伝子改変細胞と同じ外因性核酸またはポリペプチドを含むことができる。
治療的アプローチ
一態様において、本明細書で提供されるのは、患者のゲノムを編集することによって、患者における障害または健康状態を治療するための遺伝子治療アプローチである。いくつかの実施形態において、遺伝子治療アプローチは、機能的ＧＯＩ、例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、およびＳＥＲＰＩＮＧ１を、患者における関連する細胞型のゲノムに組み込み、これは、ＧＯＩ関連障害または健康状態、例えば血友病Ａ、の恒久的な治癒を提供することができる。血友病Ａの治療のためのＦＶＩＩＩ遺伝子の使用が関係する実施形態において、ＦＶＩＩＩ遺伝子を組み込む遺伝子治療アプローチが供される細胞タイプは、肝細胞であり、それは、これらの細胞が多くのタンパク質を血中に効率的に発現および分泌するためである。さらに、肝細胞を使用するこの組み込みアプローチは、肝細胞が分裂するときに組み込まれた遺伝子が娘細胞に伝達されるため、肝臓が完全に成長していない小児患者について考慮することができる。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、ＧＯＩまたはその機能的誘導体をゲノム内の遺伝子座にノックインし、ＧＯＩ生成物の活性を回復することによって、ゲノムに恒久的な変化を生じさせるゲノム工学ツールを使用するための、細胞のエクスビボおよびインビボの方法である。そのような方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、および類似のエンドヌクレアーゼ）ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを使用して、ゲノムから任意の配列を恒久的に欠失、挿入、編集、修正、もしくは置換させるか、またはゲノム遺伝子座に外因性配列、例えばＧＯＩを挿入する。このようにして、本開示に記載される例は、（患者の生涯にわたって潜在的な療法を送達するのではなく）単回治療でＧＯＩの活性を復元させる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、障害または健康状態の治療のための医薬品の製造における使用のためなど、標的タンパク質に関連する障害または健康状態の治療で使用するための、本明細書に記載される実施形態のいずれかによるゲノム編集のためのシステムの１つ以上の構成要素である。
いくつかの実施形態において、エクスビボ細胞ベースの療法は、患者から単離される肝細胞を使用して行われる。次いで、これらの細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料および方法を使用して編集される。最後に、編集した細胞を、患者に移植する。
エクスビボ細胞療法アプローチの１つの利点は、投与前に治療薬の包括的な分析を実施することができることである。ヌクレアーゼベースの治療薬はすべて、ある程度のレベルの標的外効果を有する。エクスビボで遺伝子修正を実施すると、移植前に修正された細胞集団を完全に特徴付けることができる。本開示の態様は、修正された細胞の全ゲノムを配列決定して、標的外切断がもしあれば、患者への最小リスクに関連するゲノム位置にあることを確実にすることを含む。さらに、移植前に、クローン集団を含む特定の細胞集団を単離することができる。
そのような方法の別の実施形態は、インビボベースの療法である。この方法において、患者における細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料および方法を使用して修正される。いくつかの実施形態において、細胞は、肝細胞である。
インビボ遺伝子治療の利点は、治療用生成および投与の容易さである。同じ治療アプローチおよび療法は、２名以上の患者、例えば同じまたは類似の遺伝子型または対立遺伝子を共有する多くの患者、を治療するために使用することができる。対照的に、エクスビボ細胞療法では、一般的に、患者自身の細胞を使用し、それらの細胞は単離され、操作され、同じ患者に戻される。
いくつかの実施形態において、本開示による治療方法を必要とする対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害または健康状態の症状を有する患者である。いくつかの実施形態において、対象は、障害または健康状態を有することが疑われるヒトであることができる。いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ａを有することが疑われるヒトであることができる。あるいは、対象は、障害または健康状態、例えば、血友病Ａのリスクを有すると診断されたヒトであることができる。いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ｂを有することが疑われるヒトであることができる。あるいは、対象は血友病Ｂのリスクを有すると診断されたヒトであることができる。いくつかの実施形態において、対象は、ＨＡＥを有することが疑われるヒトであることができる。あるいは、対象は、ＨＡＥのリスクを有すると診断されたヒトであることができる。いくつかの実施形態において、治療を必要とする対象は、内因性ＧＯＩまたはその調節配列に１つ以上の遺伝的欠陥（例えば、欠失、挿入、および／または変異）を有し得、その結果、ＧＯＩ生成物の発現レベルまたは機能性を含む活性が、正常で健康な対象と比較して大幅に低減している。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、対象における血友病Ａを治療する方法であり、本方法は、対象における細胞に以下：（ａ）配列番号１８～４４および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列を含むｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸と、（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｃ）ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を提供することを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝細胞の細胞である。いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥを有するか、または有することが疑われる患者である。いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ａのリスクを有すると診断されている。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、対象における血友病Ｂを治療する方法であり、本方法は、対象における細胞に以下：（ａ）配列番号１８～４４および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列を含むｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸と、（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｃ）ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を提供することを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝細胞の細胞である。いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ｂを有するか、または血友病Ｂを有することが疑われる患者である。いくつかの実施形態において、対象は、血友病Ｂのリスクを有すると診断される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、対象におけるＨＡＥを治療する方法であり、本方法は、対象における細胞に以下：（ａ）配列番号１８～４４および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列を含むｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸と、（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｃ）ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を提供することを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝細胞の細胞である。いくつかの実施形態において、対象は、遺伝性血管浮腫を有するか、または有することが疑われる患者である。いくつかの実施形態において、対象は、遺伝性血管浮腫のリスクを有すると診断されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の障害または健康状態を治療する方法のいずれかにより、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅに由来する（ｓｐＣａｓ９）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓに由来する（ＳｌｕＣａｓ９）。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の障害または健康状態を治療する方法のいずれかにより、ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする核酸配列は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の障害または健康状態を治療する方法のいずれかにより、本方法は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を使用する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝細胞の細胞である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の障害または健康状態を治療する方法のいずれかにより、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、ドナーカセットは、片側または両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている。いくつかの実施形態において、ドナーカセットは、両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）のｇＲＮＡのための標的部位である。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートのｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）のｇＲＮＡのための細胞ゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートを細胞に提供することは、ドナーテンプレートを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、投与は静脈内経路を介する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の障害または健康状態を治療する方法のいずれかにより、ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡも含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に提供することは、リポソームまたは脂質ナノ粒子を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、投与は静脈内経路を介する。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードする核酸を含む脂質ナノ粒子を使用する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の障害または健康状態を治療する方法のいずれかにより、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡと事前に複合体化され、ＲＮＰ複合体を形成する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の障害または健康状態を治療する方法のいずれかにより、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナーテンプレートが細胞に提供された後に細胞に提供される。いくつかの実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナーテンプレートが細胞に提供されてから４日を超えた後に、細胞に提供される。いくつかの実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナーテンプレートが細胞に提供されてから少なくとも１４日後に、細胞に提供される。いくつかの実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナーテンプレートが細胞に提供されてから少なくとも１７日後に、細胞に提供される。いくつかの実施形態において、（ａ）および（ｂ）を細胞に提供することは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードする核酸を含む脂質ナノ粒子を対象に（静脈内経路などによって）投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、（ｃ）を細胞に提供することは、ＡＡＶベクターにコードされたドナーテンプレートを対象に（静脈内経路などによって）投与することを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の障害または健康状態を治療する方法のいずれかにより、１つ以上の追加用量の、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、第１の用量の、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて細胞に提供される。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加用量の、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＧＯＩもしくは機能的誘導体をコードする核酸配列の標的化された組み込みの標的レベル、および／またはＧＯＩもしくは機能的誘導体をコードする核酸配列の発現の標的レベルが達成されるまで、第１の用量の、（ａ）のｇＲＮＡおよび（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、細胞に提供される。いくつかの実施形態において、（ａ）および（ｂ）を細胞に提供することは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードする核酸を含む脂質ナノ粒子を対象に（静脈内経路などによって）投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の障害または健康状態を治療する方法のいずれかにより、ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の障害または健康状態を治療する方法のいずれかにより、ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする核酸配列は、対象の肝臓で発現される。
細胞を対象に移植する
いくつかの実施形態において、本開示のエクスビボ方法は、そのような方法を必要とする対象にゲノム編集された細胞を移植することを含む。この移植ステップは、当該技術分野で知られている任意の移植方法を使用して達成することができる。例えば、遺伝子組換え細胞は、対象の血液に直接注射することができるか、または他の方法で対象に投与することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、所望の効果（複数可）を生じるような所望の部位に、導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、遺伝子改変された治療用細胞を対象に投与することを含み、これは「導入すること」および「移植すること」と互換的に使用することができる。治療用細胞、またはそれらの分化した子孫は、移植された細胞または細胞の成分の少なくとも一部が生存し続ける、対象の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間の短期間、例えば、２４時間、数日、数年もの長期間、またはさらには患者の寿命、すなわち長期の生着であり得る。
予防的に提供される場合、本明細書に記載の治療用細胞は、ＧＯＩ関連障害または健康状態、例えば、血友病Ａの任意の症状に先立って対象に投与することができる。したがって、血友病Ａの治療のためにＦＶＩＩＩ遺伝子を使用するいくつかの実施形態において、遺伝子改変された肝細胞の細胞集団の予防的投与は、血友病Ａの症状の発生を防ぐのに役立つ。
いくつかの実施形態において治療的に提供される場合、遺伝子改変肝細胞の細胞は、例えば、疾患の発症時に、ＧＯＩ関連障害または健康状態の症状または徴候の発症時（またはその後）に提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って投与される治療用肝細胞の細胞集団は、１人以上のドナーから得られた同種異系肝細胞の細胞を有する。「同種異系」とは、同じ種の１つ以上の異なるドナーから得られた肝細胞の細胞または肝細胞の細胞を有する生物学的試料を指し、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一ではない。例えば、対象に投与される肝細胞の細胞集団は、１人以上の無関係のドナー対象、または１人以上の同一でない兄弟姉妹に由来し得る。いくつかの実施形態において、遺伝的に同一の動物または一卵性双生児から得られたものなど、同系肝細胞の細胞集団を使用することができる。他の実施形態において、肝細胞の細胞は、自家細胞であり、すなわち、肝細胞の細胞は、対象から取得または単離され、同じ対象に投与され、すなわち、ドナーとレシピエントは同じである。
いくつかの実施形態において、有効量は、ＧＯＩ関連障害または健康状態の少なくとも１つ以上の兆候または症状を予防または緩和するために必要な治療用細胞の集団の量を指し、所望の効果を提供する、例えば、ＧＯＩ関連障害または健康状態を有する対象を治療する、組成物の十分な量に関する。いくつかの実施形態において、治療有効量は、したがって、ＧＯＩ関連障害または健康状態を有するか、またはそのリスクがあるなどの典型的な対象に投与したときに、特定の効果を促進するのに十分な治療用細胞または治療用細胞を有する組成物の量を指す。有効量には、疾患の症状の発症を予防または遅延させ、疾患の症状の経過を変更する（例えば、限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせる）のに十分な量も含まれるか、または疾患の症状を反転させる。任意の所与の場合について、適切な有効量は、通常の実験を使用して当業者によって決定され得ることが理解される。
本明細書に記載の様々な実施形態で使用するために、有効量の治療用細胞、例えば、ゲノム編集された肝細胞の細胞は、少なくとも１０２細胞、少なくとも５×１０２細胞、少なくとも１０３細胞、少なくとも５×１０３細胞、少なくとも１０４細胞、少なくとも５×１０４細胞、少なくとも１０５細胞、少なくとも２×１０５細胞、少なくとも３×１０５細胞、少なくとも４×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも６×１０５細胞、少なくとも７×１０５細胞、少なくとも８×１０５細胞、少なくとも９×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも２×１０６細胞、少なくとも３×１０６細胞、少なくとも４×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも６×１０６細胞、少なくとも７×１０６細胞、少なくとも８×１０６細胞、少なくとも９×１０６細胞、またはその倍数であることができる。治療用細胞は、１人以上のドナーに由来し得るか、または自家供給源から得られる。本明細書に記載のいくつかの実施形態において、治療用細胞は、それを必要とする対象への投与の前に培養で増殖させる。
いくつかの実施形態において、ＧＯＩ関連障害または健康状態を有する患者の細胞で発現される機能的ＧＯＩ生成物のレベルのわずかで漸進的な増加は、疾患の１つ以上の症状の改善、長期生存の増加、および／または他の治療に関連する副作用の軽減に有益であり得る。そのような細胞をヒト患者に投与すると、機能的ＧＯＩ生成物のレベルを増加させる治療用細胞の存在は有益である。いくつかの実施形態において、対象の効果的な治療は、治療される対象における全ＧＯＩ生成物と比較して、機能的ＧＯＩ生成物を、少なくとも約１％、３％、５％、または７％増加させる。いくつかの実施形態において、機能的ＧＯＩ生成物は、全ＧＯＩ生成物の少なくとも約１０％である。いくつかの実施形態において、機能的ＧＯＩ生成物は、全ＧＯＩ生成物の少なくとも、約、または最大で２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である。同様に、機能的ＧＯＩ生成物の大幅に増加したレベルを有する細胞の比較的限られた亜集団の導入さえ、状況によっては正常化された細胞が罹患細胞と比較して選択的な利点を有するため、様々な患者にとって有益であり得る。しかしながら、機能的なＧＯＩ生成物の上昇したレベルを有する治療用細胞の中程度のレベルさえ、患者におけるＧＯＩ関連障害または健康状態の１つ以上の状況を改善するのに有益であり得る。いくつかの実施形態において、そのような細胞が投与される患者における治療の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上は、機能的ＧＯＩ生成物の増加したレベルを生じている。
いくつかの実施形態において、方法または経路による対象への治療用細胞組成物の送達は、所望の部位での細胞組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす。細胞組成物は、対象における効果的な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与することができ、すなわち、投与は、対象の所望の位置への送達をもたらし、送達される組成物の少なくとも一部、すなわち少なくとも１×１０４細胞が、一定期間にわたって所望の位置に送達される。投与方法には、注射、注入、点滴、または摂取が含まれる。「注射」には、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、胸骨内注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、経路は静脈内である。細胞の送達のために、注射または注入による投与を行うことができる。
いくつかの実施形態において、細胞は全身投与される、言い換えれば、治療用細胞の集団は、標的部位、組織、または器官に直接的にではなく投与され、その代わりに、対象の循環系に入り、したがって代謝や他の同様のプロセスに供される。
ＧＯＩ障害または健康状態の治療のための組成物を有する治療の有効性は、熟練した臨床医によって決定され得る。しかしながら、機能的ＧＯＩ生成物のレベルのうちの１つまたはすべての兆候または症状が有益な方法で変更された（例えば、少なくとも１０％増加した）場合、または他の臨床的に認められた症状または疾患のマーカーが改善または改良される場合、治療は「効果的な治療」とみなされる。有効性はまた、入院または医学的介入の必要性（例えば、疾患の進行が停止するか、少なくとも遅くなる）によって評価されるように、個人が悪化しないことによって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、かつ／または本明細書に記載されている。治療には、個体または動物の疾患の任意の治療（いくつかの非限定的な例にはヒトまたは哺乳動物が含まれる）が含まれ、（１）疾患を抑制すること、例えば、症状の進行を停止もしくは遅延させること、または（２）疾患を緩和すること、例えば、症状の退行を引き起こすこと、および（３）症状の発生の可能性を防止または低減することを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、障害または健康状態の治療のための医薬品の製造における使用のためなど、機能的標的タンパク質欠損に関連する障害または健康状態の治療で使用するための、本明細書に記載される実施形態のいずれかによる遺伝子改変細胞である。
組成物
一態様において、本開示は、本明細書で開示される方法を実行するための組成物を提供する。組成物は、以下：ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）または部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、本明細書に開示される方法の所望の遺伝子改変をもたらすために挿入されるポリヌクレオチド（例えば、ドナーテンプレート）と、のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、組成物は、部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）を有する。いくつかの実施形態において、組成物は、部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、組成物は、ゲノムに挿入されるポリヌクレオチド（例えば、ドナーテンプレート）を有する。
いくつかの実施形態において、組成物は、（ｉ）ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）または部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、組成物は、（ｉ）ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）ゲノムに挿入されるポリヌクレオチド（例えば、ドナーテンプレート）を有する。
いくつかの実施形態において、組成物は、（ｉ）部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）または部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）ゲノムに挿入されるポリヌクレオチド（例えば、ドナーテンプレート）を有する。
いくつかの実施形態において、組成物は、（ｉ）ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）または部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）ゲノムに挿入されるポリヌクレオチド（例えば、ドナーテンプレート）を有する。
上記組成物のいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、単一分子ガイドのゲノム標的化核酸を有する。上記組成物のいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、二重分子ゲノム標的化核酸を有する。上記組成物のいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、２つ以上の二重分子ガイドまたは単一分子ガイドを有する。いくつかの実施形態において、組成物は、核酸標的化核酸をコードするベクターを有する。いくつかの実施形態において、ゲノム標的化核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、特に、Ｃａｓ９である。
いくつかの実施形態において、組成物は、ゲノム編集、特に、細胞のゲノムへのＧＯＩまたはその誘導体の挿入に使用することができる、１つ以上のｇＲＮＡを含む組成物を含むことができる。組成物のためのｇＲＮＡは、内因性アルブミン遺伝子で、その中で、またはその近くでゲノム部位を標的にすることができる。したがって、いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、アルブミン遺伝子で、その中で、またはその近くでゲノム配列に相補的なスペーサ配列を有することができる。
いくつかの実施形態において、組成物のためのｇＲＮＡは、表３に列挙されるもの、および表３に列挙されるもののいずれかと、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の同一性または相同性を有するそれらのバリアントから選択される配列である。いくつかの実施形態において、キットのためのｇＲＮＡのバリアントは、表３に列挙されるもののいずれかに対して少なくとも約８５％の相同性を有する。
いくつかの実施形態において、組成物のためのｇＲＮＡは、ゲノムにおける標的部位に相補的であるスペーサ配列を有する。いくつかの実施形態において、スペーサ配列は、１５塩基～２０塩基の長さである。いくつかの実施形態において、スペーサ配列とゲノム配列との間の相補性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％である。
いくつかの実施形態において、組成物は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼもしくはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸および／またはＧＯＩもしくはその機能的誘導体の核酸配列を有するドナーテンプレートを有し得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、キットのための任意のオリゴヌクレオチドまたは核酸配列のうちの１つ以上は、ＡＡＶベクターにコードされ得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＡＡＶベクターにコードされ得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＡＡＶベクターにコードされ得る。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされ得る。いくつかの実施形態において、２つ以上のオリゴヌクレオチドまたは核酸配列は、単一のＡＡＶベクターにコードされ得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ配列およびＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、単一のＡＡＶベクターにコードされ得る。
いくつかの実施形態において、組成物は、リポソームまたは脂質ナノ粒子を有することができる。したがって、いくつかの実施形態において、組成物の任意の化合物（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸、ｇＲＮＡ、およびドナーテンプレート）を、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上のそのような化合物は、共有結合または非共有結合を介してリポソームまたは脂質ナノ粒子と会合される。いくつかの実施形態において、化合物のいずれかは、リポソームまたは脂質ナノ粒子に別々にまたは一緒に含まれ得る。したがって、いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸、ｇＲＮＡ、およびドナーテンプレートの各々は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に別々に製剤化される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡと一緒にリポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸と、ｇＲＮＡと、ドナーテンプレートとは、リポソームまたは脂質ナノ粒子中に一緒に製剤化される。
いくつかの実施形態において、上記の組成物は１つ以上の追加の試薬をさらに有し、そのような追加の試薬は、緩衝液、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞に導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、コントロール試薬、コントロールベクター、コントロールＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからのポリペプチドのインビトロ生成のための試薬、配列決定のためのアダプターなどから選択される。緩衝液は、安定化緩衝液、再構成緩衝液、希釈緩衝液などであり得る。いくつかの実施形態において、組成物はまた、エンドヌクレアーゼによる標的内結合もしくはＤＮＡの切断を促進もしくは増強するため、または標的化の特異性を改善するために使用することができる１つ以上の成分を含むこともできる。
いくつかの実施形態において、組成物の任意の成分は、特定の投与様式および剤形に応じて、担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化することができる。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ組成物は、一般的に製剤および投与経路に応じて、生理学的に適合するｐＨを達成するように製剤化され、約ｐＨ３～約ｐＨ１１、約ｐＨ３～約ｐＨ７の範囲である。いくつかの実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ５．０～約ｐＨ８の範囲に調整される。いくつかの実施形態において、組成物は、治療有効量の本明細書に記載の少なくとも１つの化合物を、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに有する。任意に、組成物は、本明細書に記載の化合物の組み合わせを有することができるか、または細菌増殖の治療または予防に有用な第２の活性成分をことができるか（例えば、限定されないが、抗細菌剤または抗菌剤）、または本開示の試薬の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、他の１つ以上のオリゴヌクレオチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸および／またはドナーテンプレートとともに製剤化される。あるいは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸およびドナーテンプレートは、別々に、または他のオリゴヌクレオチドと組み合わせて、ｇＲＮＡ製剤のために上記の方法を用いて製剤化される。
適切な賦形剤には、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活性ウイルス粒子などの、大きくゆっくりと代謝される高分子を含む担体分子が含まれ得る。他の例示的な賦形剤には、抗酸化剤（例えば、限定されないが、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば、限定されないが、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、限定されないが、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、およびヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、限定されないが、油、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノール）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが含まれる。
いくつかの実施形態において、組成物の任意の化合物（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸、ｇＲＮＡ、およびドナーテンプレート）は、電気穿孔などのトランスフェクションを介して送達することができる。いくつかの例示的な実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、細胞への供給の前に、ｇＲＮＡと事前に複合体形成して、ＲＮＰ複合体を形成することができ、ＲＮＰ複合体を電気穿孔することができる。そのような実施形態において、ドナーテンプレートは、電気穿孔を介して送達することができる。
いくつかの実施形態において、組成物は、エクスビボ治療法で使用される治療用細胞を有する治療用組成物を指す。
いくつかの実施形態において、治療用組成物は、細胞組成物とともに生理学的に許容される担体、および任意に活性成分として内部に溶解または分散した本明細書に記載の少なくとも１つの追加の生物活性剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、治療用組成物は、望まない限り、治療目的で哺乳動物またはヒトの患者に投与される場合、実質的に免疫原性ではない。
一般に、本明細書に記載の遺伝子改変された治療用細胞は、薬学的に許容される担体によるエマルジョンとして投与される。当業者は、細胞組成物に使用される薬学的に許容される担体は、対象に送達される細胞の生存率を実質的に干渉する量の緩衝液、化合物、凍結保存剤、防腐剤、または他の薬剤を含まないことを認識するであろう。細胞を有する製剤は、例えば、細胞膜の完全性を維持することを可能にする浸透圧緩衝液、および任意に、投与時に細胞生存率を維持するか、または生着を増強する栄養素を含むことができる。そのような製剤および懸濁液は、当業者に既知であり、かつ／または日常的な実験を使用して、本明細書に記載されるように前駆細胞との使用に適合させることができる。
いくつかの実施形態において、乳化手順が細胞の生存率に悪影響を与えない限り、細胞組成物を乳化させるか、またはリポソーム組成物として提供することもできる。細胞および任意の他の活性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合する賦形剤と、本明細書に記載の治療方法での使用に適した量で混合することができる。
細胞組成物に含まれる追加の薬剤は、その中に成分の薬学的に許容される塩を含むことができる。薬学的に許容される塩には、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。
生理学的に許容される担体は、当該技術分野で周知である。例示的な液体担体は、活性成分および水に加えて材料を含まないか、または生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理食塩水、もしくはリン酸緩衝食塩水などの両方を含む滅菌水溶液である。なおさらに、水性担体は、２つ以上の緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、デキストロース、ポリエチレングリコール、ならびに他の溶質などの塩を含むことができる。液体組成物はまた、水に加えて、および水の排除に加えて、液相を含むことができる。そのような追加の液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水油エマルジョンである。特定の障害または状態の治療に有効な細胞組成物で使用される活性化合物の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定され得る。
キット
いくつかの実施形態は、上記の組成物のいずれか、例えば、ゲノム編集のための組成物または治療用細胞組成物、および１つ以上の追加の構成要素を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態において、キットは、所望の目的、例えばゲノム編集または細胞療法のために、組成物と同時に、または連続して投与することができる１つ以上の追加の治療薬を有することができる。
いくつかの実施形態において、キットは、キットの構成要素を使用して方法を実施するための指示書をさらに含むことができる。この方法を実施するための指示書は、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示書は、紙またはプラスチック等の基材に印刷することができる。指示書は、添付文書として、キットの容器またはその構成要素のラベル等（すなわち、包装または分包装に関連する）に存在し得る。指示書は、適切なコンピュータ読み取り可能な記憶媒体、例えばＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブ等に存在する電子記憶データファイルとして存在し得る。場合によって、実際の指示書はキットに存在しないが、リモートソースから（例えば、インターネット経由で）指示書を取得するための手段を提供することができる。この実施形態の例は、指示書を見ることができる、および／または指示書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示書と同様に、指示書を入手するためのこの手段は、適切な基材に記録することができる。
他の可能な治療アプローチ
遺伝子編集は、特定の配列を標的化するように操作されたヌクレアーゼを使用して実施することができる。これまでに、４つの主要なタイプのヌクレアーゼがある：メガヌクレアーゼとその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、エフェクターヌクレアーゼのような転写活性化因子（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステム。特にＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの特異性は、タンパク質とＤＮＡの相互作用によるものであり、ＲＮＡとＤＮＡの相互作用は主にＣａｓ９を導くため、ヌクレアーゼプラットフォームは、設計の難易度、標的密度、および作用モードが異なる。Ｃａｓ９切断はまた、隣接するモチーフであるＰＡＭを必要とし、異なるＣＲＩＳＰＲシステム間で異なる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９は、ＮＲＧ ＰＡＭを使用して切断し、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣＲＩＳＰＲは、ＮＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号１０１）、ＮＮＮＮＮＧＴＴＴ（配列番号１０２）、およびＮＮＮＮＧＣＴＴ（配列番号１０３）を含むＰＡＭを有する部位で切断することができる。他の多くのＣａｓ９オルソログは、代替ＰＡＭに隣接するプロトスペーサを標的にする。
Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、本開示の方法の様々な実施形態で使用することができる。しかしながら、治療標的部位などの本明細書に記載の教示は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、またはＭｅｇａＴＡＬなどの他の形態のエンドヌクレアーゼに適用することができるか、またはヌクレアーゼの組み合わせを使用することができる。しかしながら、本開示の教示をそのようなエンドヌクレアーゼに適用するために、とりわけ、特定の標的部位に向けられたタンパク質を操作する必要があるだろう。
追加の結合ドメインをＣａｓ９タンパク質に融合して、特異性を高めることができる。これらの構築物の標的部位は、特定されたｇＲＮＡ指定部位にマッピングされるが、ジンクフィンガードメインなどの追加の結合モチーフを必要とする。Ｍｅｇａ－ＴＡＬの場合、メガヌクレアーゼをＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに融合することができる。メガヌクレアーゼドメインは、特異性を高め、切断を提供する。同様に、不活化または死んだＣａｓ９（ｄＣａｓ９）は切断ドメインに融合でき、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位および融合ＤＮＡ結合ドメインの隣接結合部位を必要とする。これには、追加の結合部位なしで結合を減少させるために、触媒の不活性化に加えて、ｄＣａｓ９のタンパク質工学がいくらか必要になるであろう。
いくつかの実施形態において、本開示に従ってゲノムを編集する組成物および方法（例えば、アルブミン遺伝子座へのＧＯＩコード化配列の挿入）は、以下のアプローチのいずれかを利用するか、または使用して行うことができる。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、タイプＩＩエンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインに結合するように操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを有するモジュール式タンパク質である。ＦｏｋＩは、二量体としてのみ機能するため、ＺＦＮの一対は、触媒活性ＦｏｋＩ二量体の形成を可能にするために、対向するＤＮＡ鎖上の同種の標的「ハーフサイト」配列に、正確な間隔で結合するように操作する必要がある。それ自体は配列特異性を持たないＦｏｋＩドメインの二量体化により、ゲノム編集の開始ステップとして、ＺＦＮハーフサイト間にＤＮＡ二本鎖切断が生成される。
各ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、一般的に、豊富なＣｙｓ２－Ｈｉｓ２アーキテクチャの３～６個のジンクフィンガーを有し、各フィンガーは主に標的ＤＮＡ配列の１本の鎖のヌクレオチドのトリプレットを認識するが、第４のヌクレオチドとの鎖間相互作用もまた重要である。ＤＮＡとの重要な接触を行う位置でのフィンガーのアミノ酸の変更は、特定のフィンガーの配列特異性を変更する。したがって、４本指のジンクフィンガータンパク質は、１２ｂｐ標的配列を選択的に認識し、標的配列は、各フィンガーが寄与するトリプレット選好の複合体であるが、トリプレット選好は、隣接するフィンガーによって異なる程度で影響され得る。ＺＦＮの重要な側面は、単に個々のフィンガーを修正することによって、それらをほぼすべてのゲノムアドレスに容易に再標的化することができるが、これを良好に行うにはかなりの専門知識が必要である。ＺＦＮのほとんどの適用では、４～６フィンガーのタンパク質が使用され、それぞれ１２～１８ｂｐを認識する。したがって、ＺＦＮの一対は、ハーフサイト間の５～７ｂｐスペーサを含まない、２４～３６ｂｐの結合標的配列を一般的に認識するであろう。結合部位は、１５～１７ｂｐを含むより大きなスペーサでさらに分離され得る。この長さの標的配列は、設計プロセス中に反復配列または遺伝子ホモログが除外されると想定すると、ヒトゲノムにおいて固有である可能性がある。それにもかかわらず、ＺＦＮタンパク質－ＤＮＡ相互作用は、特異性が絶対的ではないため、２つのＺＦＮ間のヘテロ二量体として、またはＺＦＮの一方または他方のホモ二量体としてのいずれかで、標的外結合および切断事象が発生する。後者の可能性は、ＦｏｋＩドメインの二量体化接触面を操作して、それら自体ではなく、互いにのみ二量体化し得る、絶対ヘテロ二量体バリアントとも呼ばれる「プラス」および「マイナス」バリアントを作成することにより効果的に排除された。絶対ヘテロ二量体を強制すると、ホモ二量体の形成が防止される。これにより、ＺＦＮ、ならびにこれらのＦｏｋＩバリアントを採用する任意の他のヌクレアーゼの特異性が大幅に向上した。
様々なＺＦＮベースのシステムが、当該技術分野で説明されており、その修正が定期的に報告されており、多くの参考文献がＺＦＮの設計を導くために使用される規則およびパラメータを説明している。例えば、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６（６）：２７５８－６３（１９９９）、Ｄｒｅｉｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３０３（４）：４８９－５０２（２０００）、Ｌｉｕ Ｑ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７（６）：３８５０－６（２００２）、Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（４２）：３５５８８－９７（２００５）、およびＤｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（３１）：２９４６６－７８（２００１）を参照されたい。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインがＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに結合されているモジュラーヌクレアーゼの別の形式を表し、一対のＴＡＬＥＮが連携して、標的ＤＮＡ切断を実現する。ＺＦＮとの主な違いは、ＤＮＡ結合ドメインの性質と、関連する標的ＤＮＡ配列認識特性である。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインは、植物細菌病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種に本来記載されているＴＡＬＥタンパク質に由来する。ＴＡＬＥは、３３～３５アミノ酸反復のタンデムアレイを有し、各反復は、一般的に最大２０ｂｐ長であり、標的配列全長が最大４０ｂｐである、標的ＤＮＡ配列中の単一の塩基対を認識する。各反復のヌクレオチド特異性は、反復変数二残基（ＲＶＤ）によって決定され、これは、位置１２および１３に２つのアミノ酸のみを含む。塩基のグアニン、アデニン、シトシン、およびチミンは、主に４つのＲＶＤ、Ａｓｎ－Ａｓｎ、Ａｓｎ－Ｉｌｅ、Ｈｉｓ－Ａｓｐ、およびＡｓｎ－Ｇｌｙによってそれぞれ認識される。これは、ジンクフィンガーよりもはるかに簡単な認識コードを構成し、したがって、ヌクレアーゼ設計に関して後者を超える利点を表す。それにもかかわらず、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質－ＤＮＡ相互作用は、それらの特異性において絶対的ではなく、ＴＡＬＥＮは、標的外活性を低減するためにＦｏｋＩドメインの絶対ヘテロ二量体バリアントの使用からも恩恵を受けている。
触媒機能が無効になっている、ＦｏｋＩドメインの追加のバリアントが作成されている。ＴＡＬＥＮ一対またはＺＦＮ一対のいずれかの半分に不活性なＦｏｋＩドメインが含まれている場合、ＤＳＢではなく、標的部位で一本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）のみが発生する。結果は、Ｃａｓ９切断ドメインのうちの１つが不活性化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１「ニッカーゼ」変異体の使用に匹敵する。ＤＮＡニックを使用して、ＨＤＲによるゲノム編集を駆動することができるが、ＤＳＢよりも効率が低くなる。主な利点は、ＮＨＥＪを介した誤修復の傾向があるＤＳＢとは異なり、標的外ニックが迅速かつ正確に修復されることである。
様々なＴＡＬＥＮベースのシステムが当該技術分野で説明されており、その修正が定期的に報告されている。例えば、Ｂｏｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０９－１２（２００９）、Ｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３５（６０６９）：７１６－９（２０１２）、およびＭｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０１（２００９）を参照されたい。「ゴールデンゲート」プラットフォームまたはクローニングスキームに基づくＴＡＬＥＮの使用は、複数のグループによって説明されている。例えば、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（１２）：ｅ８２（２０１１）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（１４）：６３１５－２５（２０１１）、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．６（２）：ｅ１６７６５（２０１１）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４１（６）：３３９－４７，Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｃａｎ １７（２０１４）、およびＣｅｒｍａｋ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１２３９：１３３－５９（２０１５）を参照されたい。
ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、長い認識配列（１４～４４塩基対）を有し、多くの場合、ゲノムで固有の部位において、高い特異性でＤＮＡを切断する配列特異的エンドヌクレアーゼである。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号６）、ＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈｉｓ－Ｃｉｓボックス、Ｈ－Ｎ－Ｈ、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、および広範囲の宿主（真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア、およびファージを含む）に由来するＶｓｒ様を含む構造によって分類される、少なくとも６つの既知のＨＥファミリーがある。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥを使用して、ゲノム編集の最初のステップとして標的遺伝子座にＤＳＢを作成することができる。さらに、一部の天然および操作されたＨＥは、ＤＮＡの一本鎖のみを切断し、それにより部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大きな標的配列とそれらが提供する特異性により、ＨＥは部位特異的ＤＳＢを作成する魅力的な候補になった。
様々なＨＥベースのシステムが当該技術分野で説明されており、その修正が定期的に報告されている。例えば、Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２４（８）：６６３－８０（２０１４），Ｂｅｌｆｏｒｔ ａｎｄ Ｂｏｎｏｃｏｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１１２３：１－２６（２０１４）、Ｈａｆｅｚ ａｎｄ Ｈａｕｓｎｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ ５５（８）：５５３－６９（２０１２）によるレビュー、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。
ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ－ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッドヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォームおよびＴｅｖ－ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥの調整可能なＤＮＡ結合および特異性の両方、ならびにＨＥの切断配列特異性を利用して、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび触媒活性ＨＥの融合を使用する。例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ４２：２５９１－２６０１（２０１４）、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇ３ ４：１１５５－６５（２０１４）、およびＢｏｉｓｓｅｌ ａｎｄ Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２３９：１７１－９６（２０１５）を参照されたい。
さらなる変異において、ＭｅｇａＴｅｖアーキテクチャは、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）とＧＩＹ－ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼＩ－ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）に由来するヌクレアーゼドメインとの融合である。２つの活性部位は、ＤＮＡ基板上で約３０ｂｐ離れて位置付けられ、互換性のない粘着末端を有する２つのＤＳＢを生成する。例えば、Ｗｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ４２，８８１６－２９（２０１４）を参照されたい。既存のヌクレアーゼベースのアプローチの他の組み合わせが進化し、本明細書に記載の標的ゲノム修飾を達成するのに役立つと予想される。
ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩまたはｄＣｐｆ１－Ｆｏｋ１および他のヌクレアーゼ
上記のヌクレアーゼプラットフォームの構造的かつ機能的な特性を組み合わせることにより、固有の欠陥のいくつかを潜在的に克服することができるゲノム編集へのさらなるアプローチが提供される。例として、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集システムは、一般的に、単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用してＤＳＢを作成する。標的化の特異性は、標的ＤＮＡとワトソン－クリック塩基対合を行うガイドＲＮＡの２０または２２ヌクレオチド配列（さらに、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合、隣接したＮＡＧまたはＮＧＧ ＰＡＭ配列における追加の２塩基）によって駆動される。そのような配列は、ヒトゲノムにおいて固有であるのに十分な長さであるが、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性は絶対的ではなく、特に標的配列の５′半分でかなりの混乱が許容されることがあり、特異性を促進する塩基の数を効果的に低減する。これに対する解決策の１つは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合機能のみを保持するＣａｓ９またはＣｐｆ１触媒機能を完全に不活性化し、代わりにＦｏｋＩドメインを不活性化したＣａｓ９に融合することである。例えば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２：５６９－７６（２０１４）、およびＧｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：５７７－８２（２０１４）を参照されたい。ＦｏｋＩは、触媒的に活性化するために二量体化しなければならないため、２つのＦｏｋＩ融合体を近接させて二量体を形成し、ＤＮＡを切断するには２つのガイドＲＮＡが必要である。これにより、複合された標的部位の塩基数が本質的に２倍になり、それによりＣＲＩＳＰＲベースのシステムによる標的化の厳密性が高まる。
さらなる例として、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＩ－ＴｅｖＩなどの触媒活性ＨＥへの融合は、ＴＡＬＥの調整可能なＤＮＡ結合および特異性、ならびにＩ－ＴｅｖＩの切断配列特異性の両方を利用し、標的外切断がさらに低減され得ると期待される。
本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、下記の付随する説明に記載されている。本開示の実施または試験において、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の材料および方法を使用することができるが、いくつかの例示的な材料および方法をここで説明する。本開示の他の特徴、目的、および利点は、説明から明らかとなるであろう。説明において、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、単数形は複数形も含む。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本説明が優先する。
本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が、当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の請求項の範囲に含まれることが理解される。本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供される開示のいくつかの実施形態は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
実施例１：インビトロでＨｅｐａ１－６細胞においてマウスアルブミン遺伝子のイントロン１におけるＣａｓ９ヌクレアーゼによる切断を指示するｇＲＮＡの特定
関連する前臨床動物モデルでの評価の目的のため、関連する前臨床動物種からのアルブミンのイントロン１におけるＣａｓ９ヌクレアーゼによる効率的な切断を指示するｇＲＮＡ分子を試験した。血友病Ａのマウスモデルは十分に確立されており（Ｂｉ Ｌ，Ｌａｗｌｅｒ ＡＭ，Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ ＳＥ，Ｈｉｇｈ ＫＡ，Ｇｅａｒｈａｒｔ ＪＤ，Ｋａｚａｚｉａｎ ＨＨ．，Ｊｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ．（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９５；１０：１１９－２１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ０５９５－１１９）、この疾患の新しい治療アプローチを試験するための価値あるモデルシステムを代表する。マウスアルブミンのイントロン１を切断する可能性のあるｇＲＮＡを特定するために、イントロンの配列を、関心対象の配列およびマウスゲノムにおけるすべての関連する配列において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）による切断の潜在的な標的となるＮＧＧ ＰＡＭ配列を利用して、すべての可能性のあるｇＲＮＡ標的配列を特定するアルゴリズム（例えば、ＣＣＴＯＰ；ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｃｏｓ．ｕｎｉ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）を使用して分析した。次に、各ｇＲＮＡを、マウスゲノム内の正確な配列または関連する配列の頻度に基づいてランク付けし、標的外切断の理論的リスクが最も少ないｇＲＮＡを特定した。このタイプの分析に基づいて、ｍＡＬｂｇＲＮＡ＿Ｔ１と呼ばれるｇＲＮＡが、試験のために選択された。
ｍＡｌｂｇＲＮＡ＿Ｔ１は、マウスゲノム内の他の４つの部位のみと相同性を示し、各々が以下の表２に示すように４つのヌクレオチドのミスマッチを示す。
Figure 2022505173000011
マウス細胞におけるＣａｓ９による切断を促進するｍＡＬｂｇＲＮＡ＿Ｔ１の効率を評価するために、マウス肝細胞由来細胞株Ｈｅｐａ１－６を使用した。Ｈｅｐａ１－６細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内でＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養した。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）タンパク質に結合したｇＲＮＡからなるＲＮＰを、２．４μｌのｓｐＣａｓ９（０．８μｇ／μｌ）および３μｌの合成ｇＲＮＡ（２０μＭ）を、７μｌのＰＢＳで混合する（１：５のｓｐＣａｓ９：ｇＲＮＡ比）ことによって前形成させ、室温で１０分間インキュベートした。ヌクレオフェクションでは、ＳＦサプリメント試薬（Ｌｏｎｚａ）のバイアル全体をＳＦ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ試薬（Ｌｏｎｚａ）に添加して、完全なヌクレオフェクション試薬を調製した。各ヌクレオフェクションについて、１×１０５Ｈｅｐａ１－６細胞を２０μｌの完全なヌクレオフェクション試薬に再懸濁し、ＲＮＰに添加してから、４Ｄヌクレオフェクションデバイス（Ｌｏｎｚａ）に配置したヌクレオフェクションキュベット（１６ウェルストリップ）に移し、プログラムＥＨ－１００を使用してヌクレオフェクトした。細胞を１０分間静置した後、新鮮な完全培地を入れた適切なサイズのプレートに移した。ヌクレオフェクションの４８時間後に細胞を回収し、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙキット（ｃａｔ６９５０６）を使用してゲノムＤＮＡを抽出および精製した。
アルブミンイントロン１の標的部位でのＣａｓ９／ｇＲＮＡを介した切断の頻度を評価するために、標的部位に隣接するプライマー対（ＭＡＬＢＦ３：５’ＴＴＡＴＴＡＣＧＧＴＣＴＣＡＴＡＧＧＧＣ３’（配列番号１１）およびＭＡＬＢＲ５：ＡＧＴＣＴＴＴＣＴＧＴＣＡＡＴＧＣＡＣＡＣ３’（配列番号１２））を、５２℃のアニーリング温度を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用して、ゲノムＤＮＡから６０９ｂｐ領域を増幅させた。ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ ｎｏ．２８１０６）を使用して精製し、ＰＣＲ反応に使用した同じプライマーを用いてサンガー配列決定を使用して直接的に配列決定した。配列データは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の予測切断部位に存在する挿入および欠失（ＩＮＤＥＬ）の頻度を決定する分解によるインデルの追跡（Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）（ＴＩＤＥ）と呼ばれるアルゴリズムによって分析した（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ（２１０４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，１）。ｍＡｌｂｇＲＮＡ＿Ｔ１のＩＮＤＥＬ生成の全体的な頻度は、３つの独立した実験で試験した場合、８５～９５％であり、これらの細胞のゲノムにおけるｇＲＮＡ／Ｃａｓ９による効率的な切断を示す。ｍＡｌｂｇ ＲＮＡ－Ｔ１でヌクレオフェクトしたＨｅｐａ１－６細胞におけるＴＩＤＥ分析の例を、図３に示す。ほとんどの挿入および欠失は、１ｂｐの挿入および１ｂｐの欠失からなり、欠失の数は６ｂｐまでの小さい数である。
実施例２：マウスにおけるインビボでのｍＡｌｂｇＲＮＡ＿Ｔ１の切断効率の評価
Ｃａｓ９およびｍＡｌｂｇＲＮＡ－Ｔ１をマウスの肝細胞に送達するために、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達ビヒクルを使用した。ｓｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する耐性を向上させるために化学的に修飾されたヌクレオチドを組み込んで化学的に合成した。一例のｇＲＮＡは、以下：
Figure 2022505173000012
 の構造からなり、「Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ」は天然ＲＮＡヌクレオチドであり、「ａ、ｇ、ｕ、ｃ」は２’－Ｏ－メチルヌクレオチドであり、「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。ｇＲＮＡのマウスアルブミン標的化配列には下線が引かれ、ｇＲＮＡ配列の残りは、一般的なスキャホルド配列である。ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡは、ゲノムＤＮＡの切断を生じることができる核コンパートメントに、ｓｐＣａｓ９タンパク質を輸送するために必要な核局在化ドメイン（ＮＬＳ）に融合したｓｐＣａｓ９タンパク質をコードするように設計した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの追加の構成要素は、リボソーム結合を促進する第１のコドンの前の５’末端のＫＯＺＡＫ配列、および連続したＡ残基で構成される３’末端のポリＡテールである。ＮＬＳ配列を有するｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡの配列の例は、配列番号８１に示される。ｍＲＮＡは、当技術分野で周知の様々な方法によって生成することができる。本明細書で使用されるそのような方法の１つは、ｍＲＮＡの配列がＴ７ポリメラーゼプロモーターを含むプラスミドにコードされている、Ｔ７ポリメラーゼを使用するインビトロ転写である。簡単に説明すると、Ｔ７ポリメラーゼおよびリボヌクレオチドを含む適切な緩衝液におけるプラスミドのインキュベーションで、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＲＮＡ分子を生成した。反応混合物中の天然リボヌクレオチドまたは化学修飾リボヌクレオチドのいずれかを使用して、天然化学構造を有するか、または発現、安定性、もしくは免疫原性の点で利点を有し得る修飾化学構造を有する、ｍＲＮＡ分子を生成した。さらに、ｓｐＣａｓ９コード配列の配列は、各アミノ酸で最も頻繁に使用されるコドンを利用することによって、コドン使用頻度について最適化した。さらに、コード配列は、ｍＲＮＡのｓｐＣａｓ９タンパク質への最も効率的な翻訳を促進するために、隠れたリボソーム結合部位および上流のオープンリーディングフレームを除去するように最適化した。
これらの試験で使用されたＬＮＰの主成分は、脂質Ｃ１２－２００である（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ（２０１０），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ｖｏｌ．１０７，１８６４－１８６９）。Ｃ１２－２００脂質は、高電荷のＲＮＡ分子と複合体を形成する。Ｃ１２－２００は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ＤＭＰＥ－ｍＰＥＧ２０００、およびコレステロールと組み合わせた。ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡなどの核酸と、例えばＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒデバイス（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における制御された条件下で混合すると、核酸がＬＮＰ内にカプセル化されるＬＮＰの自己集合を生じた。ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡをＬＮＰに集合させるため、エタノールおよび脂質のストックを、適切にガラスバイアルにピペッティングした。ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥ－ｍＰＥＧ２０００、およびコレステロールに対するＣ１２－２００の比を、製剤を最適化するために調整した。典型的な比は、Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびｍＰＥＧ２０００－ＤＭＧが５０：１０：３８．５：１．５のモル比で構成された。ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーチューブ内で、１００ｍＭのクエン酸Ｎａ、ｐＨ３．０および３００ｍＭのＮａＣｌで希釈した。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒカートリッジ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）は、脂質側をエタノールで、ＲＮＡ側を水で洗浄した。脂質の作業ストックをシリンジに引き込み、シリンジから空気を取り除き、カートリッジに挿入した。同じ手順を使用して、ｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡの混合物をシリンジに加えた。次に、Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒの実行を、標準条件下で実施した。次に、ＬＮＰ懸濁液を、４リットルのＰＢＳ中で２０Ｋｄカットオフ透析カートリッジを使用して４時間透析し、次いで、２０Ｋｄカットオフスピンカートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ）による遠心分離を使用して濃縮し、遠心分離中にＰＢＳで３回洗浄することを含んだ。最後に、ＬＮＰ懸濁液を、０．２μＭシリンジフィルターで滅菌ろ過した。エンドトキシンレベルは、市販のエンドトキシンキット（ＬＡＬアッセイ）を使用してチェックし、粒子サイズ分布は動的光散乱によって決定した。カプセル化されたＲＮＡの濃度は、リボグリーンアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して決定した。あるいは、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡは、別々にＬＮＰに製剤化し、培養中の細胞の処理または動物への注射の前に一緒に混合した。別々に製剤化されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡを使用することは、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡの特定の比率を試験することを可能にした。
代替カチオン性脂質分子を利用した代替ＬＮＰ製剤も、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡのインビボ送達に使用した。ｍＡＬＢ ｇＲＮＡ Ｔ１およびＣａｓ９ ｍＲＮＡをカプセル化した新たに調製したＬＮＰを、ＲＮＡの質量比１：１で混合し、血友病Ａマウスの尾静脈に注射（ＴＶ注射）した。あるいは、ＬＮＰは、後眼窩（ＲＯ）注射によって投与した。マウスに与えられたＬＮＰの用量は、体重１ｋｇあたり０．５～２ｍｇのＲＮＡの範囲だった。ＬＮＰの注射の３日後、マウスを犠牲にし、肝臓の左右の葉の一片および脾臓の一片を収集し、各々からゲノムＤＮＡを精製した。次に、ゲノムＤＮＡをＴＩＤＥ分析に供し、アルブミンイントロン１の標的部位での切断頻度および切断プロファイルを測定した。結果の例を図４に示し、平均して対立遺伝子の２５％が、２ｍｇ／ｋｇの用量で切断された。用量反応は、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で約５％の切断をもたらし、１ｍｇ／ｋｇで約１０％の切断をもたらした。ＰＢＳ緩衝液のみを注射したマウスは、ＴＩＤＥアッセイで約１～２％の低いシグナルを示し、ＴＩＤＥアッセイ自体のバックグラウンドの測定である。
実施例３：ヒトアルブミンのイントロン１に標的化されるｓｇＲＮＡのインデル頻度を評価する
ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１内のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）による切断の標的であるＮＧＧ ＰＡＭ配列を利用するすべての潜在的なｇＲＮＡ配列は、「ＣＣＴｏｐ」と呼ばれる公開されたアルゴリズムに基づく「Ｇｕｉｄｏ」と呼ばれる独自のアルゴリズムを使用して特定された。（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｃｏｓ．ｕｎｉ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／を参照）。このアルゴリズムは、ヒトゲノム内の潜在的な標的外部位を特定し、予測される標的外切断の可能性に基づいて各ｇＲＮＡをランク付けする。特定されたｇＲＮＡ配列を以下の表に提供する。
Figure 2022505173000013
５μｇ／μｌのＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質（Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標））は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号Ａ２７８６５、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入し、０．８３μｇ／μｌまたは５．２μＭの作業濃度に１：６希釈した。化学修飾された合成単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）を、ストック溶液としてＴＥ緩衝液で１００μＭに再懸濁した。あるいは、使用されるｇＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって生成することができる。この溶液をヌクレアーゼフリー水で２０μＭの作業濃度に希釈した。
リボ核タンパク質複合体を作製するために、Ｃａｓ９タンパク質（１２．５ｐｍｏｌ）およびｓｇＲＮＡ（６０ｐｍｏｌ）を室温で１０～２０分間インキュベートした。このインキュベーション中に、ＨｅｐＧ２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）またはＨｕＨ７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を、０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して３７℃で５分間解離させた。各トランスフェクション反応には１×１０５細胞が含まれ、実験ごとに適切な数の細胞を３５０×Ｇで３分間遠心分離し、次いでトランスフェクション反応ごとに２０μｌのＬｏｎｚａ ＳＦヌクレオフェクション＋サプリメント溶液（カタログ番号Ｖ４ＸＣ－２０３２、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に再懸濁した。２０μｌのヌクレオフェクション溶液に再懸濁した細胞を、ＲＮＰの各チューブに加え、全量を１６ウェルヌクレオフェクションストリップの１つのウェルに移した。ＨｅｐＧ２またはＨｕＨ７細胞は、Ａｍａｘａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ）でＥＨ－１００プログラムを使用してトランスフェクトした。ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ７は、ヒト肝細胞の細胞株であり、したがって肝臓で遺伝子を切断するために使用されるｇＲＮＡを評価するのに適している。トランスフェクション後、細胞をヌクレオフェクションストリップ中で１０分間インキュベートし、１０％ウシ胎児血清（カタログ番号１０４３８０２６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したイーグル最小必須培地（カタログ番号１０－００９－ＣＶ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）からなる温かい培地を含む４８ウェルプレートに移した。細胞は、新鮮な培地が翌日に再供給された。
トランスフェクションの４８時間後、ＨｅｐＧ２またはＨｕＨ７細胞を分離し、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙキット（カタログ番号６９５０６、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。ＰＣＲを、抽出したゲノムＤＮＡをＰｌａｔｉｎｕｍ ＳｕｐｅｒＦｉ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および０．２μＭの以下のプライマー：アルブミンフォワード：５’－ＣＣＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＴ－３’（配列番号１４）、アルブミンリバース：５’－ＴＣＴＡＣＧＡＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＴＴ－３’（配列番号１５）、ＡＡＶＳ１フォワード：５’－ＡＡＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＧＴ－３’（配列番号１６）、ＡＡＶＳ１リバース：５’－ＣＣＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧ－３’（配列番号１７）、を使用して実施した。ＰＣＲ条件は、９８℃（１×）で２分、続いて９８℃で３０秒、６２．５℃で３０秒、および７２℃（３５×）で１分だった。正しいＰＣＲ産物は、１．２％Ｅ－Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して確認し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０６）を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物は、対応するＰＣＲ産物のフォワードまたはリバースプライマーのいずれかを使用してサンガー配列決定に供した。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９の予測される切断部位での挿入または欠失の頻度は、Ｂｒｉｎｋｍａｎら（Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｅ．Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｔ．，Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｍ，ａｎｄ ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｓｅｌ，Ｂ．Ｅａｓｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｒａｃｅ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．２２ ｅ１６８）によって記載されているＴＩＤＥ分析アルゴリズムを使用して決定した。簡単に説明すると、クロマトグラム配列決定ファイルを、未処理の細胞に由来するコントロールクロマトグラムと比較して、異常なヌクレオチドの相対的な量を決定した。結果を表４にまとめる。非ヒト霊長類などの関連する前臨床種において相同であるヒトにおけるｇＲＮＡ配列を特定することも興味深い。表４に示すように、ヒトアルブミンイントロン１で特定された潜在的なｇＲＮＡ配列と、霊長類Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓおよびＭａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａのアルブミンイントロン１配列とのアラインメントにより、完全一致または１～２ヌクレオチドのミスマッチを有するいくつかのｇＲＮＡ分子が特定された。ＩＶＴガイドを使用して生成されたＩＮＤＥＬ頻度は、ＨｕＨ７細胞で測定され、合成ガイドを用いて生成されたＩＮＤＥＬ頻度は、ＨｅｐＧ２細胞で測定された。ＨｕＨ７細胞における様々なガイドによって生成されたＩＮＤＥＬ頻度は、０．３％～６４％の範囲であり、アルブミンのイントロン１で効率的に切断するｇＲＮＡを、コンピュータアルゴリズムに基づいた配列を開くことに純粋に基づいて選択することができなかったことを示す。ＨｕＨ７におけるＩＶＴ ｇＲＮＡおよびＨｅｐＧ２細胞における合成ｇＲＮＡのＩＮＤＥＬ頻度に基づいて、切断頻度が４０％を超えるいくつかのｇＲＮＡが特定された。特に興味深いのは、合成ガイドとして４６％および４３％の切断を示し、ヒトおよび霊長類で１００％同一であるｇＲＮＡ Ｔ５およびＴ１２である。
Figure 2022505173000014
Figure 2022505173000015
Figure 2022505173000016
実施例４：マウスアルブミンイントロン１の関心対象の治療用遺伝子の標的化された組み込み
疾患を治療するために必要とされる治療用タンパク質を発現するためのアプローチは、インビボで肝臓におけるアルブミン遺伝子座への、そのタンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡまたはコード配列の標的化された組み込みである。標的化された組み込みは、ドナーＤＮＡテンプレートが二本鎖切断の部位で生物のゲノムに組み込まれるプロセスであり、そのような組み込みは、ＨＤＲまたはＮＨＥＪのいずれかによって発生する。このアプローチは、生物の細胞への配列特異的ＤＮＡヌクレアーゼおよび治療用遺伝子をコードするドナーＤＮＡテンプレートの導入を使用する。アルブミンイントロン１に標的化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ドナーＤＮＡテンプレートの標的化された組み込みを促進することができるかどうかを評価した。ドナーＤＮＡテンプレートは、ＡＡＶウイルス、例えば、マウスの場合はＡＡＶ８ウイルスで送達され、静脈内注射後に肝臓の肝細胞を優先的に形質導入する。配列特異的なｇＲＮＡ ｍＡｌｂ＿Ｔ１およびＣａｓ９ ｍＲＮＡは、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡをカプセル化しているＬＮＰ製剤の静脈内またはＲＯ注射によって、同じマウスの肝臓の肝細胞に送達される。一例では、ＡＡＶ８ドナーテンプレートは、ＬＮＰの前にマウスに注射され、それはＡＡＶによる肝細胞の形質導入は、数時間から数日かかり、送達されたドナーＤＮＡは肝細胞の核内で数週間から数ヶ月安定して維持されることが知られているためである。対照的に、ＬＮＰによって送達されるｇＲＮＡおよびｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子の固有な不安定性のために、肝細胞に１～４日間しか存続しない。別の例では、ＬＮＰは、ＡＡＶドナーテンプレートの１日～７日後にマウスに注射される。ドナーＤＮＡテンプレートは、（ｉ）組み込みを最大化し、（ｉｉ）コードされた治療用タンパク質の発現を最大化する目的で、いくつかの設計特性を取り入れる。
ＨＤＲを介して組み込みを生じるため、相同性アームが治療用遺伝子カセットのいずれかの側に含まれる必要がある。これらの相同性アームは、マウスアルブミンイントロン１のｇＲＮＡ切断部位のいずれかの側の配列で構成される。より長い相同性アームは、一般により効率的なＨＤＲを促進するが、相同性アームの長さは、約４．７～５．０ＫｂのＡＡＶウイルスのパッケージング限度によって制限され得る。したがって、相同性アームの最適な長さを特定するには、試験が必要である。組み込みはまた、二本鎖ＤＮＡドナーの自由端が二本鎖切断の端に結合するＮＨＥＪメカニズムを介して発生することができる。この場合、相同性アームは必要とされない。しかしながら、遺伝子カセットのいずれかの側にｇＲＮＡ切断部位を組み込む（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ）と、線形二本鎖フラグメントを生成することによって、組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）の効率を向上させることができる。逆方向のｇＲＮＡ切断部位を使用することによって、所望の順方向の組み込みを促進することができる。ＦＶＩＩＩのフーリン切断部位での変異の導入は、タンパク質の発現中にフーリンによって切断できないＦＶＩＩＩタンパク質を生成することができ、完全な機能性を維持しながら血漿中の安定性を向上させることが示されている一本鎖ＦＶＩＩＩポリペプチドをもたらす。
アルブミンイントロン１にＦＶＩＩＩ遺伝子を組み込むように設計された例示的なＤＮＡドナーが、図５に示される。特定のドナー設計の配列は、配列番号８７～９２からの配列にある。
ＦＶＩＩＩドナーＤＮＡをパッケージ化したＡＡＶ８または他のＡＡＶ血清型ウイルスの作成は、十分に確立されたウイルスパッケージング方法を使用して達成される。そのような方法の１つでは、ＨＥＫ２９３細胞は、３つのプラスミドでトランスフェクトされ、第１のプラスミドはＡＡＶパッケージングタンパク質をコードし、第２のプラスミドはアデノウイルスヘルパータンパク質をコードし、第３のプラスミドはＡＡＶ ＩＴＲ配列によって隣接されるＦＶＩＩＩドナーＤＮＡ配列を含む。トランスフェクトされた細胞は、第１のプラスミドにコードされたＡＡＶキャプシドタンパク質の組成によって特定される血清型のＡＡＶ粒子を生じさせる。これらのＡＡＶ粒子は、細胞上清もしくは上清および溶解した細胞から収集され、ＣｓＣｌ勾配またはイオジキサノール勾配で、または必要に応じて他の方法で精製される。精製されたウイルス粒子は、定量ＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によってドナーＤＮＡのゲノムコピー数を測定することによって定量化される。
ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡのインビボ送達は、様々な方法で行われる。第１の場合では、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質は、ＡＡＶウイルスベクターから発現される。この場合、ｇＲＮＡの転写は、Ｕ６プロモーターから駆動され、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの転写は、ＥＦ１－アルファのような遍在するプロモーター、またはトランスチレチンプロモーター／エンハンサーなどの肝臓特異的プロモーターおよびエンハンサーのいずれかから駆動される。ｓｐＣａｓ９遺伝子のサイズ（４．４Ｋｂ）が、ｓｐＣａｓ９およびｇＲＮＡカセットの単一ＡＡＶにおける包含を妨げ、それによって、ｇＲＮＡおよびｓｐＣａｓ９を送達するために別々のＡＡＶが必要になる。第２の場合では、ウイルスゲノムの自己不活化を促進する配列要素を有するＡＡＶベクターが使用される。この場合、ベクターＤＮＡにｇＲＮＡのための切断部位を含めると、インビボでベクターＤＮＡの切断を生じる。Ｃａｓ９の発現を切断時にブロックする位置に切断部位を含めることによって、Ｃａｓ９の発現はより短い期間に制限される。第３では、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９をインビボで細胞に送達するための代替アプローチである非ウイルス送達法が使用される。一例では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が、非ウイルス送達法として使用される。いくつかのイオン化可能なカチオン性脂質が、ＬＮＰで使用可能である。これらには、とりわけ、Ｃ１２－２００（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ（２０１０），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ｖｏｌ．１０７，１８６４－１８６９）、ＭＣ３、ＬＮ１６、ＭＤ１が含まれる。ＬＮＰの一タイプでは、ＧａｌＮａｃ部分がＬＮＰの外側に付着され、アシアリロ糖タンパク質受容体を介して肝臓に取り込まれるためのリガンドとして作用する。これらのカチオン性脂質のいずれかを使用して、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡを肝臓に送達するためのＬＮＰを製剤化する。
ＦＶＩＩＩの標的化された組み込みおよび発現を評価するために、血友病Ａマウスに最初に、ＦＶＩＩＩドナーＤＮＡテンプレートをカプセル化するＡＡＶウイルス、例えば、ＡＡＶ８ウイルスを静脈内注射する。ＡＡＶの投与量は、４×１０１１～４×１０１３ＶＧ／ｋｇに相当する１０１０～１０１２ベクターゲノム（ＶＧ）／マウスの範囲である。ＡＡＶドナーの注射後１時間から７日の間に、同じマウスに、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡをカプセル化したＬＮＰのｉｖ注射を投与する。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは、別々のＬＮＰにカプセル化し、１：１のＲＮＡ質量比で注射前に混合する。与えられるＬＮＰの用量は、体重１ｋｇあたり０．２５～２ｍｇのＲＮＡの範囲である。ＬＮＰは、尾静脈注射または眼窩後注射によって投与される。標的化された組み込みおよびＦＶＩＩＩタンパク質発現の効率について、ＡＡＶ注射と比較したＬＮＰ注射の時間の影響を、ＡＡＶ投与後、１時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、および１６８時間の試験時間によって評価する。
別の例では、ドナーＤＮＡテンプレートは、ＬＮＰである非ウイルス送達システムを使用して、インビボで送達される。ＤＮＡ分子は、上記と同様のＬＮＰ粒子にカプセル化され、ｉｖ注射後に肝臓中の肝細胞に送達される。エンドソームから細胞質へのＤＮＡの脱出は比較的効率的に起こるが、大荷電ＤＮＡ分子の核への移行は、効率的ではない。一例では、核へのＤＮＡの送達を改善する方法は、ドナーＤＮＡテンプレートへのＡＡＶ ＩＴＲの組み込みによって、ＡＡＶゲノムを模倣することである。この場合、ＩＴＲ配列は、ＤＮＡを安定化するか、または核転座を改善する。ドナーＤＮＡテンプレート配列を形成するＣＧジヌクレオチド（ＣｐＧ配列）の除去も、核送達を改善する。ＣＧジヌクレオチドを含むＤＮＡは、自然免疫系によって認識され、排除される。人工ＤＮＡ配列に存在するＣｐＧ配列の除去は、非ウイルスベクターおよびウイルスベクターによって送達されるＤＮＡの持続性を向上する。コドン最適化のプロセスは、一般にＣＧジヌクレオチドの含有量を増加させ、それは多くの場合、最も頻度の高いコドンは、次のコドンがＧで始まるときにＣＧを作成する機会を増加させる第３の位置にＣ残基を有するためである。ドナーＤＮＡテンプレートの１時間から５日後に続くｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡを含むＬＮＰによるＬＮＰ送達の組み合わせを、血友病Ａマウスで評価する。
ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９およびドナーＤＮＡテンプレートのインビボ送達の有効性を評価するために、注射された血友病Ａマウスは、第２の成分の投与後約７日から開始する異なる時点で、血中のＦＶＩＩＩレベルについて評価する。血液試料は、ＲＯ採血によって収集し、血漿を分離し、発色アッセイ（Ｄｉａｐｈａｒｍａ）を使用してＦＶＩＩＩ活性をアッセイする。ＦＶＩＩＩタンパク質標準を使用して、アッセイを校正し、血中のＦＶＩＩＩ活性１ｍｌあたりの単位を計算する。
ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡの発現は、試験終了時にマウスの肝臓でも測定する。マウスの肝臓から抽出された全ＲＮＡは、Ｑ－ＰＣＲを使用してアルブミンｍＲＮＡおよびＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡのレベルについてアッセイする。未処理のマウスと比較した場合のアルブミンｍＲＮＡに対するＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡの比率は、ハイブリッドアルブミン－ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡを生成するために利用されているアルブミン転写物の％を示す。
処理されたマウスの肝臓からのゲノムＤＮＡは、ｇＲＮＡの標的部位、特にアルブミンイントロン１における標的化された組み込み事象について評価される。ＰＣＲプライマー対は、予測される標的化された組み込みのいずれかの末端で、接合フラグメントを増幅するように設計される。これらのプライマーは、順方向および逆方向の両方での組み込みを検出するように設計される。ＰＣＲ産物の配列決定によって、予想される組み込み事象が発生しているかどうかを確認する。標的化された組み込みを受けているアルブミン対立遺伝子の割合を定量化するために、予想される接合部フラグメントに対応する標準を合成する。未処理のマウスからのゲノムＤＮＡに異なる濃度でスパイクし、次に同じＰＣＲ反応を供するときに、標準曲線を作成し、処理されたマウスからの試料で組み込み事象を有する対立遺伝子のコピー数を計算する。
実施例５：霊長類のアルブミンイントロン１への標的化された組み込み
マウスについて実施例４に記載の同じ方法論を、霊長類のアルブミンイントロン１を標的化するｇＲＮＡを使用して霊長類種に適用する。ＡＡＶ８またはＬＮＰのいずれかを使用して、ドナーＤＮＡテンプレートをｉｖ注射によって最初に送達する。使用される用量は、マウスで成功することが認められている用量に基づいている。続いて、同じ霊長類に、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡをカプセル化したＬＮＰをｉｖ注射する。マウスで有効であることを認められた同じＬＮＰ製剤および用量を使用する。霊長類の血友病Ａモデルは存在しないため、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒトＦＶＩＩＩ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定する必要がある。実施例４に記載されている標的化された組み込みおよびＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡレベルについて同じ分子分析が霊長類で実施される。霊長類は、臨床評価への橋渡しを可能にする優れた前臨床モデルである。
実施例６：ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９による標的内および標的外切断、ならびにヒト初代肝細胞における標的化された組み込みの評価
初代ヒト肝細胞は、患者の肝臓に送達されるｇＲＮＡ／Ｃａｓ９の効力および標的外切断の評価において、最も関連する細胞型である。これらの細胞は、付着性単層として限られた期間、培養で増殖させる。ｍＲＮＡによる付着細胞のトランスフェクションのための方法、例えば、Ｍｅｓｓａｇｅ Ｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が確立されている。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの混合物によるトランスフェクション後、ＴＩＤＥ分析を使用して標的内切断効率を測定する。ゲノムＤＮＡの同じ試料を標的外分析に供し、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体によって切断されたゲノム内の追加の部位を特定する。そのような１つの方法は、「ＧｕｉｄｅＳｅｑ」（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｆｅｂ；３３（２）：１８７－１９７）である。その他の方法には、ディープ配列決定、全ゲノム配列決定、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，６７７－６８３ ２０１４）、ＢＬＥＳＳ（２０１３ Ｃｒｏｓｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２４０８）、２０１５ Ｆｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３１０１に記載されているハイスループット、ゲノムワイド、トランスロケーション配列決定（ＨＴＧＴＳ）、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑ（２０１５ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３２８４）、およびＩＤＬＶ（２０１４ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３１２７）が含まれる。
初代ヒト肝細胞はまた、ドナーＤＮＡテンプレートを含むＡＡＶウイルスによっても形質導入される。特に、ＡＡＶ６またはＡＡＶＤＪ血清型は、培養中の細胞の形質導入で特に効果的である。ＡＡＶ－ＤＮＡドナーによる形質導入の１～４８時間後に、細胞はｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡでトランスフェクトして、標的化された組み込みを誘導する。標的化された組み込み事象は、実施例４に記載の同じＰＣＲベースのアプローチを使用して測定される。
実施例７：培養中の初代ヒト肝細胞においてヒトアルブミンイントロン１で効率的に切断するガイドＲＮＡの特定および選択
初代ヒト肝細胞における切断効率の評価のために、非ヒト霊長類との完全な相同性を有すること、ならびにＨｕＨ７およびＨｅｐＧ２細胞の切断効率のスクリーニング（表４）に基づいて、４つのｇＲＮＡ（Ｔ４、Ｔ５、Ｔ１１、Ｔ１３）を選択した。初代ヒト肝細胞（ＢｉｏＩＶＴから入手）を解凍し、凍結保存肝細胞回収培地（ＣＨＲＭ）（Ｇｉｂｃｏ）に移し、低速でペレット化し、次いでＩｎＶｉｔｒｏ ＧＲＯ（商標）ＣＰ培地（ＢｉｏＩＶＴ）＋Ｔｏｒｐｅｄｏ（商標）抗生物質ミックス（ＢｉｏＩＶＴ）中で、コラーゲンＩＶ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で予めコーティングした２４ウェルプレートに、０．７×１０６細胞／ｍＬの密度で播種した。プレートを、５％ＣＯ２中で、３７℃でインキュベートした。細胞が付着した後（播種後３～４時間）、プレートに付着していない死んだ細胞を新鮮な温かい完全培地で洗い流し、次に細胞を５％ＣＯ２中で、３７℃でインキュベートした。細胞をトランスフェクトするために、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）およびガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）を氷上で解凍し、ウェルあたり０．６ｕｇのｍＲＮＡおよび０．２ｕｇのガイドで、３０μｌのＯｐｔｉＭｅｍ培地（Ｇｉｂｃｏ）に添加した。ＯｐｔｉＭｅｍで３０μｌに希釈したＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、核酸の総重量に対して２：１の容量で、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ ＯｐｔｉＭｅｍ溶液と室温で２０分間インキュベートした。この混合物を、２４ウェルプレート内の培養肝細胞のウェルあたり５００μｌの肝細胞播種培地（ｐｌａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）に滴下して加え、細胞を５％ＣＯ２中で３７℃でインキュベートした。細胞を洗浄し、翌朝再供給し、トランスフェクションの４８時間後に、細胞は、ゲノムＤＮＡ抽出のために、２００μｌの温かい０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を各ウェルに添加し、３７℃で５～１０分間インキュベートすることによって収集した。細胞を移動して、２００μｌのＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を添加してトリプシンを不活性化した。１ｍｌのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）に加えた後、細胞を１２００ｒｐｍで３分間ペレット化し、５０μｌのＰＢＳに再懸濁した。ゲノムＤＮＡは、ＭａｇＭＡＸ ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉ－Ｓａｍｐｌｅ Ｕｌｔｒａ ２．０ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）をキットの説明書に従って使用して、抽出した。ゲノムＤＮＡの品質および濃度は、分光光度計を使用して分析した。ＴＩＤＥ分析では、ゲノムＤＮＡを、予測される標的内切断部位に隣接するプライマー（ＡｌｂＦ：ＣＣＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＴＴＴＣおよびＡｌｂＲ：ＣＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡ）およびＰｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、３５サイクルのＰＣＲおよび５５℃のアニーリング温度を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、最初にアガロースゲル電気泳動で分析し、適切なサイズの産物（１０５３ｂｐ）が生成されていることを確認し、次いで精製してプライマー（ｆｏｒ：ＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧ、ｒｅｖ：ＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧ）を使用して配列決定した。次に、配列データは、Ｔｓｕｎａｍｉと呼ばれるＴＩＤＥアルゴリズムの修正バージョン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ（２１０４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，１）を使用して分析した。これによって、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の予測される切断部位に存在する挿入および欠失（ＩＮＤＥＬ）の頻度が決定される。
Ｔ４、Ｔ５、Ｔ１１、およびＴ１３ガイド（ＡｘｏＬａｂｓ、Ｋｕｌｍｂａｃｈ Ｇｅｒｍａｎｙ、またはＳｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡで化学的に合成された）の標準的な２０ヌクレオチド標的配列または１９ヌクレオチド標的配列（５’末端で１ｂｐ短い）のいずれかを含むガイドＲＮＡを試験した。１９ヌクレオチドのｇＲＮＡは、より配列特異的であり得るが、短いガイドは効力が低くなり得る。ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座およびヒト補体因子を標的化するコントロールガイドを、ドナー間の比較のために含めた。アルブミンイントロン１の標的部位でのＩＮＤＥＬ頻度は、トランスフェクションの４８時間後にＴＩＤＥ法を使用して測定した。図６は、４名の異なるヒトドナーからの初代肝細胞のトランスフェクションからの結果を要約する。結果は、異なるガイドで２０％～８０％の範囲の切断効率を示す。各アルブミンｇＲＮＡの２０ヌクレオチド型は、１９ヌクレオチドバリアントよりも一貫して強力だった。２０ヌクレオチドｇＲＮＡの優れた効力は、１９ヌクレオチドｇＲＮＡが標的外切断に関して有し得る潜在的な有益性を相殺し得る。ガイドＲＮＡ Ｔ４は、約６０％のＩＮＤＥＬ頻度を有し、４つの細胞ドナー間で最も一貫した切断を示した。ｇＲＮＡ Ｔ４、Ｔ５、Ｔ１１、およびＴ１３が、標的外分析のために選択された。
実施例８：ヒトアルブミンガイドＲＮＡの標的外部位の特定
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９での標的外部位の特定における２つのアプローチは、最初からの予測および経験的検出である。ガイドＲＮＡによるＣａｓ９切断部位の特定は、Ｃａｓ９切断がガイドＲＮＡ配列とゲノム間のミスマッチを許容するため、不完全なプロセスである。Ｃａｓ９切断部位のスペクトルを知ることは、異なるガイドの安全性リスクを理解し、最も好ましい標的外プロファイルを有するガイドを選択するために重要である。予測方法は、標的外予測のためのＣＣＴｏｐアルゴリズムを採用したソフトウェアツールであるＧｕｉｄｏ（Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）に基づいている。Ｇｕｉｄｏは、Ｂｏｗｔｉｅ １アルゴリズムを使用して、ガイドＲＮＡとヒトゲノムを構成する全ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８との間の相同性を検索することによって、潜在的な標的外切断部位を特定する（Ｌａｎｇｍｅａｄ ｅｔ ａｌ．，２００９）。Ｇｕｉｄｏは、ガイドＲＮＡに対して最大５つのミスマッチがある配列を検出し、ＰＡＭ近位相同性および正しく配置されたＮＧＧ ＰＡＭを優先させる。部位は、それらのミスマッチの数および位置によってランク付した。各実行で、ガイド配列ならびにゲノムＰＡＭを結びつけ、デフォルトのパラメーターで実行する。ミスマッチが３つ以下のトップヒットは、アルブミンガイドＴ４、Ｔ５、Ｔ１１、およびＴ１３について以下の表５～８示される。各表の最初の行はヒトゲノムにおける標的内部位を示し、下の行は予測される標的外部位を示す。
Figure 2022505173000017
Figure 2022505173000018
Figure 2022505173000019
Figure 2022505173000020
Figure 2022505173000021
Figure 2022505173000022
さらに、ヒト肝細胞におけるヒトアルブミンｇＲＮＡ Ｔ４、Ｔ５、Ｔ１１、Ｔ１３の標的外部位を、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑと呼ばれる方法を使用して特定した。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）は、標的外切断部位を見つけるための経験的方法である。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑは、染色体ＤＮＡにおける二本鎖切断部位でのオリゴヌクレオチドの自発的捕捉に依存している。簡単に説明すると、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体による関連細胞のトランスフェクションに続いて、二本鎖オリゴヌクレオチドゲノムＤＮＡを細胞から精製し、超音波処理し、一連のアダプター連結を実施してライブラリーを作成する。オリゴヌクレオチドを含むライブラリーは、ハイスループットＤＮＡ配列決定に供され、出力はデフォルトのＧＵＩＤＥ－ｓｅｑソフトウェアで処理されて、オリゴヌクレオチドの捕捉部位が特定される。
詳細には、二本鎖ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑオリゴを、８９℃に加熱してからゆっくりと室温に冷却することによって、２つの相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングすることで生成した。ＲＮＰ複合体は、２４０ｐｍｏｌのガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）および４８ｐｍｏｌの２０μＭ Ｃａｓ９ ＴｒｕＣｕｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を最終容量４．８ｕＬで混合することによって調製した。別のチューブで、４μｌの１０μＭ ＧＵＩＤｅｓｅｑ二本鎖オリゴヌクレオチドを、１．２μｌのＲＮＰミックスと混合してから、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎカセット（Ｌｏｎｚａ）に加えた。これに、１６．４μｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＳＦ溶液（Ｌｏｎｚａ）および３．６μｌのＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｏｎｚａ）を加えた。付着培養として増殖したＨｅｐＧ２細胞をトリプシンで処理してプレートからそれらを放出させ、トリプシンの不活性化後、ペレット化し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に１２．５ｅ６細胞／ｍｌで再懸濁し、２０μｌ（２．５ｅ５細胞）を各ヌクレオフェクションキュベットに加えた。ヌクレオフェクションは、４－Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｕｎｉｔ（Ｌｏｎｚａ）でＥＨ－１００細胞プログラムを用いて実施した。室温で１０分間インキュベーション後に８０μＬの完全ＨｅｐＧ２培地を添加し、細胞懸濁液を２４ウェルプレートのウェルに加えて、５％ＣＯ２中で、３７℃で４８時間インキュベートした。細胞をトリプシンで放出させ、遠心分離（３００ｇで１０分）によってペレット化し、次にＤＮＡｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。ヒトアルブミンイントロン１領域は、プライマーＡｌｂＦ（ＣＣＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＴＴＴＣ）およびＡｌｂＲ（ＣＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡ）、ならびにＰｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３５サイクルのＰＣおよび５５℃のアニーリング温度を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、最初にアガロースゲル電気泳動で分析し、適切なサイズの産物（１０５３ｂｐ）が生成されていることを確認し、次いでプライマー（ｆｏｒ：ＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧ、ｒｅｖ：ＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧ）を使用して直接的に配列決定した。次に、配列データは、Ｔｓｕｎａｍｉと呼ばれるＴＩＤＥアルゴリズムの修正バージョン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ（２１０４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，１）を使用して分析した。これによって、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の予測される切断部位に存在する挿入および欠失（ＩＮＤＥＬ）の頻度が決定される。Ｔｓａｉらによって記載されたプロトコルと比較して、４０ｐｍｏｌ（約１．６７μＭ）のキャプチャーオリゴヌクレオチドを用いてＧＵＩＤＥ－ｓｅｑを実施し、標的外切断部位特定の感度を高めた。およそ０．０１％の感度を達成するために、トランスフェクションごとに最低５０％の標的内切断を有する最低１０，０００の独自な標的内配列リードを定めた。ＲＮＰのトランスフェクションを加えない試料を、並行して処理した。ＲＮＰを含む試料およびＲＮＰを含まない試料の両方で認められた部位（＋／－１ｋｂ）は、さらなる分析から除外する。
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑは、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２で実施した。ＨｅｐＧ２では、標的内部位でのＧＵＩＤＥ－ｓｅｑオリゴヌクレオチドの捕捉は、ＮＨＥＪ頻度の７０％～２００％の範囲であり、効率的なオリゴ捕捉を示した。
Ｙアダプターは、８－ｍｅｒの分子インデックスを含む試料バーコードアダプター（Ａ０１～Ａ１６）の各々にＣｏｍｍｏｎ Ａｄａｐｔｅｒをアニーリングすることによって調製した。ＲＮＰおよびＧＵＩＤＥＤｓｅｑオリゴでヌクレオフェクトされたＨｅｐＧ２細胞から抽出されたゲノムＤＮＡは、Ｑｕｂｉｔを使用して定量し、試料はすべて、１２０ｕＬ容量のＴＥ緩衝液で４００ｎｇに規準化した。ゲノムＤＮＡは、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０ソニケーターの標準的な操作手順に従って、平均２００ｂｐの長さに剪断した。平均フラグメント長を確認するために、１ｕＬの試料をＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで、製造業者のプロトコルに従って分析した。剪断されたＤＮＡの試料は、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩビーズを製造業者のプロトコルに従って使用してクリーンアップし、１７ｕＬのＴＥ緩衝液で溶出した。末端修復反応は、１．２μｌのｄＮＴＰミックス（５ｍＭの各ｄＮＴＰ）、３μｌの１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液、２．４μｌのＥｎｄ－Ｒｅｐａｉｒ Ｍｉｘ、２．４μｌの１０×Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ緩衝液（Ｍｇ２＋フリー）、および０．６μｌのＴａｑポリメラーゼ（非ホットスタート）、ならびに１４ｕＬの剪断したＤＮＡ試料（前のステップから）をチューブあたり２２．５ｕＬの全量で混合することによってゲノムＤＮＡにおいて実施し、サーモサイクラーでインキュベートした（１２℃で１５分、３７℃で１５分、７２℃で１５分、４℃に維持）。これに、１μｌのアニーリングしたＹアダプター（１０μＭ）、２μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、混合物をサーモサイクラーでインキュベートした（１６℃で３０分、２２℃で３０分、４℃に維持）。試料は、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩビーズを製造業者のプロトコルに従って使用してクリーンアップし、２３ｕＬのＴＥ緩衝液で溶出した。１ｕＬの試料について、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを製造業者のプロトコルに従って実行し、アダプターのフラグメントへの連結を確認した。ＧＵＩＤＥｓｅｑライブラリーを調製するために、反応物は、１４μｌのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ、３．６μｌの１０×Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ緩衝液、０．７μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ（各々１０ｍＭ）、１．４μｌの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３６μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、１．２μｌのセンスまたはアンチセンス遺伝子特異的プライマー（１０μＭ）、１．８μｌのＴＭＡＣ（０．５Ｍ）、０．６μｌのＰ５＿１（１０μＭ）、および前のステップからの１０μｌの試料を含めて調製した。この混合物をサーモサイクラーでインキュベートした（９５℃で５分、次に９５℃で３０秒、７０℃（サイクルあたりマイナス１℃）で２分、７２℃で３０秒の１５サイクル、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で３０秒の１０サイクル、続いて７２℃で５分）。ＰＣＲ反応は、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩビーズを製造業者のプロトコルに従って使用してクリーンアップし、１５ｕＬのＴＥ緩衝液で溶出した。１ｕＬの試料を、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで製造業者のプロトコルに従ってチェックし、試料の進行を追跡した。第２のＰＣＲは、６．５μｌのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ、３．６μｌの１０×Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ緩衝液（Ｍｇ２＋フリー）、０．７μｌのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、１．４μｌのＭｇＣｌ２（５０ｍＭ）、０．４μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、１．２μｌの遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）２（センス：＋またはアンチセンス：－）、１．８μｌのＴＭＡＣ（０．５Ｍ）、０．６μｌのＰ５＿２（１０μＭ）、および前のステップからの１５μｌのＰＣＲ産物を混合することによって実施した。ＧＳＰ１＋を第１のＰＣＲで使用した場合、ＧＳＰ２＋をＰＣＲ２で使用した。ＧＳＰ１－プライマーを第１のＰＣＲ反応で使用した場合、ＧＳＰ２－プライマーをこの第２のＰＣＲ反応で使用した。１．５μｌのＰ７（１０μＭ）を加えた後、反応物をサーモサイクラーで以下のプログラム：９５℃で５分、次に９５℃で３０秒、７０℃（サイクルあたりマイナス１℃）で２分、７２℃で３０秒の１５サイクル、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で３０秒の１０サイクル、続いて７２℃で５分を用いてインキュベートした。ＰＣＲ反応は、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩビーズを製造業者のプロトコルに従って使用してクリーンアップし、３０ｕＬのＴＥ緩衝液で溶出し、１ｕＬを、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで製造業者のプロトコルに従って分析して増幅を確認した。ＰＣＲ産物のライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ用のＫａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓキットを製造業者のプロトコルに従って定量化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムで次世代配列決定に供して、オリゴヌクレオチドが組み込まれた部位を決定した。
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑの結果を表９～１２に示す。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによって特定された予測される標的配列を考慮することが重要である。予測される標的配列がＰＡＭを欠いているか、またはｇＲＮＡとの有意な相同性を欠いている場合、例えば５つ以上のミスマッチ（ｍｍ）の場合、これらのゲノム部位は、真の標的外部位ではなく、アッセイからのバックグラウンドシグナルとみなされる。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑアプローチは、ＨｅｐＧ２細胞で高頻度のオリゴ捕捉をもたらし、この方法がこの細胞型に適切であることを示している。標的内リード数は、４つのガイドのうち３つについて、標的リードで最低１０，０００の所定基準を満たした。４つの主なｇＲＮＡ候補の数少ない標的外部位が、特定された。真の標的外部位（ＰＡＭを含み、ｇＲＮＡと有意な相同性を有することを意味する）の数は、４つのｇＲＮＡについて０～６の範囲だった。Ｔ４ガイドは、真のように見える２つの標的外部位を示した。配列決定リード数によって判断されたＧＵＩＤＥ－ｓｅｑでのこれらの事象の頻度は、標的内切断頻度の２％および０．６％だった。Ｔ１３ガイドおよびＴ５ガイドはともに、ｇＲＮＡと相同性を有し、ＰＡＭを含むＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによる標的外部位を示さず、そのため試験した４つのガイドの中で最も望ましい標的外プロファイルを有すると考えられる。ｇＲＮＡ Ｔ１１は、標的内リード数の２３％である比較的高いリードカウントを有する１つの標的外部位を示し、このガイドが治療用使用にはあまり魅力的でないことを示唆する。
Figure 2022505173000023
Figure 2022505173000024
Figure 2022505173000025
Figure 2022505173000026
治療薬候補は、非ヒト霊長類でしばしば評価され、ヒト使用におけるそれらの効力および安全性を予測する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用した遺伝子編集の場合、ガイドＲＮＡの配列特異性は、ヒトで使用される可能性のあるガイドを試験するために、ヒトおよび非ヒト霊長類の両方に同じ標的配列が存在することを必要とする。ヒトアルブミンイントロン１を標的化するガイドをコンピュータでスクリーニングして、Ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓにおける対応するゲノム配列に一致するガイドを特定した（表４を参照）。しかしながら、これらのガイドが非ヒト霊長類のゲノムを切断する能力、およびそれらが予測される標的内部位で切断する相対的な効率は、関連する細胞系で決定することが必要である。Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓサルからの初代肝細胞（ＢｉｏＩＶＴ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹから入手）に、初代ヒト肝細胞について前述された同じ実験プロトコルを使用して、アルブミンガイドＲＮＡ Ｔ４、Ｔ５、Ｔ１１、またはＴ１３、およびｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。次に、ＩＮＤＥＬの頻度を、上記と同じＴＩＤＥプロトコルを使用して決定したが、ただし、Ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓアルブミンイントロン１に特異的なＰＣＲプライマーを使用した。結果を、図７に要約する。ヒト初代肝細胞におけるガイドＲＮＡ Ｔ４の対応するデータを、比較のために同じ図に示す。４つのガイドすべてが、２つの異なる動物ドナーからのＣｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ肝細胞のアルブミンイントロン１における予想される部位で、１０％～２５％の範囲の頻度で切断を促進した。切断効率の順位は、Ｔ５＞Ｔ４＞Ｔ１１＝Ｔ１３だった。Ｔ５ガイドＲＮＡは、４つのガイドの中で最も強力であり、２つのドナーにおける標的対立遺伝子の２０％および２５％を切断した。切断効率は、トランスフェクション効率の違いに起因し得、ヒト細胞の対応するガイドよりも低かった。あるいは、これらのガイドおよび／またはｓｐＣａｓ９酵素は、霊長類細胞では本質的に効力が低い可能性がある。それにもかかわらず、Ｔ５は、ＧＵＩＤＥｓｅｑによるその好ましい標的外プロファイルとともに４つのガイドの中で最も強力だったという結果は、Ｔ５を、ＮＨＰ（非ヒト霊長類）およびヒトにおける試験にとって魅力的なものにする。
実施例９：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介されるマウスアルブミンイントロン１へのＳＥＡＰレポーター遺伝子ドナーの標的化された組み込みは、ＳＥＡＰの発現および血中への分泌をもたらす。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による配列特異的切断を使用することが、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体によって作成された二本鎖切断に関心対象の遺伝子をコードするドナーテンプレート配列の組み込みを仲介する可能性について評価するために、ネズミ分泌型アルカリホスファターゼ（ｍＳＥＡＰ）であるレポーター遺伝子をコードするドナーテンプレートを設計および構築した。ｍＳＥＡＰ遺伝子はマウスでは非免疫原性であり、コード化されたｍＳＥＡＰタンパク質の発現を、タンパク質に対する免疫応答の干渉なしにモニタリングすることができる。さらに、適切なシグナルペプチドがコード配列の５’末端に含まれていると、ｍＳＥＡＰは血液中に容易に分泌され、タンパク質の活性を測定するアッセイを使用してタンパク質を容易に検出することができる。ＡＡＶにパッケージングするためのｍＳＥＡＰ構築物は、ｓｐＣａｓ９およびガイドＲＮＡ ｍＡＬｂＴ１（ｔｇｃｃａｇｔｔｃｃｃｇａｔｃｇｔｔａｃａｇｇ、配列番号８０）による切断を介したマウスアルブミンのイントロン１への標的化された組み込みのために、図８に示すように設計された。シグナルペプチドが除去されたｍＳＥＡＰコード配列は、マウスのためにコドン最適化され、内因性マウスアルブミンエクソン１にスプライシングした後、正しいリーディングフレームを維持するために必要とされる２塩基対（ＴＧ）を先行させた。コンセンサススプライスアクセプター配列およびポリピリミジントラクト（ＣＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧ、配列番号２）からなるスプライスアクセプターを、コード配列の５’末端に付加し、ポリアデニル化シグナル（ｓＰＡ）を、コード配列（ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ、配列番号５）の３’末端に付加した。ゲノムに存在するｍＡｌｂＴ１ガイドＲＮＡの標的部位の逆相補体（ＴＧＣＣＡＧＴＴＣＣＣＧＡＴＣＧＴＴＡＣＡＧＧ、配列番号８０）が、このカセットのいずれかの側に含まれた。ガイドＲＮＡの切断部位を追加することによって、ＡＡＶゲノムは、それが送達された細胞の核内でインビボで切断され、それによって、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路による二本鎖切断での組み込みに最適なテンプレートである線形ＤＮＡフラグメントを生成すると仮定した。ＡＡＶキャプシドへの効率的なパッケージ化を可能にするために、ヒトマイクロサテライト配列に由来するスタッファーフラグメントを追加して、４５９６ｂｐのＩＴＲを含む全体のサイズを達成した。このドナーカセットが、Ｃａｓ９／ｍＡＬｂＴ１ガイドＲＮＡ複合体によって作成されたアルブミンイントロン１の二本鎖切断に順方向で組み込まれる場合、アルブミンプロモーターからの転写は、アルブミンエクソン１のスプライスドナーからコンセンサススプライスアクセプターまでのスプライシングを受けることができる一次転写産物を生成し、アルブミンエクソン１がフレーム内でｍＳＥＡＰコード配列に融合される成熟したｍＲＮＡを生じることが予測される。このｍＲＮＡの翻訳は、マウスアルブミンのシグナルペプチド（アルブミンエクソン１にコードされている）が先行するｍＳＥＡＰタンパク質を生成する。シグナルペプチドは、ｍＳＥＡＰの循環系への分泌を指示し、分泌の過程で切断されて、成熟ｍＳＥＡＰタンパク質を離す。マウスアルブミンエクソン１は、シグナルペプチドおよびプロペプチドをコードし、成熟アルブミンタンパク質のＮ末端をコードする７ｂｐ（Ｇｌｕ－Ａｌａ＋１ｂｐ（Ｃ）をコードする）が続くため、プロペプチドの切断後、ＳＥＡＰタンパク質は、Ｎ末端に３つの追加アミノ酸、すなわちＧｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕを含むと予測される（Ｌｅｕは、組み込まれたＳＥＡＰ遺伝子カセットからＴＧにスプライシングされるアルブミンエクソン１の最後のＣ塩基によって生成される）。Ｎ末端に追加された３つの追加アミノ酸の第３として、ロイシン（Ｌｅｕ）をコードすることを選択するが、それは、ロイシンが非荷電および非極性であり、ＳＥＡＰタンパク質の機能に干渉する可能性が低いためである。ｐＣＢ００４７と呼ばれるこのＳＥＡＰドナーカセットは、ＨＥＫ２９３ベースのトランスフェクションシステムおよびウイルス精製の標準的な方法（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ）を使用して、ＡＡＶ８血清型キャプシドにパッケージ化された。ウイルスは、ｍＳＥＡＰコード配列内に配置されるプライマーおよびプローブを用いた定量的ＰＣＲを使用して力価測定した。
ｐＣＢ００４７ウイルスを０日目に２ｅ１２ｖｇ／ｋｇの用量でマウスの尾静脈に注射し、４日後にｍＡＬｂＴ１ガイドＲＮＡ
Figure 2022505173000027
 およびｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡをカプセル化した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を注射した。単一ガイドＲＮＡは、化学的に合成され、基本的に報告されている（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ ３３（９）：９８５－９８９）ように化学的に修飾された塩基が組み込まれ、標準のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を使用した。ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡは、標準的な技術を使用して合成され、タンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方に核局在化シグナルを追加するヌクレオチド配列を含んだ。核局在化シグナルは、ｍＲＮＡがＬＮＰによって関心対象の細胞の細胞質に送達され、次にｓｐＣａｓ９タンパク質に翻訳された後、ｓｐＣａｓ９タンパク質を核に向けるために必要とされる。Ｃａｓ９タンパク質を核に向けるためのＮＬＳ配列の使用は、当技術分野でよく知られており、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ（ｅＬｉｆｅ ２０１３；２：ｅ００４７１．ＤＯＩ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．００４７１）を参照する。ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡはまた、ポリＡテールも含み、５’末端がキャップされて安定性および翻訳効率を向上させた。ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡをＬＮＰにパッケージ化するために、基本的にＫａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．１５（１１）：７３００－６）によって報告されているプロトコルを使用して、イオン化可能な脂質Ｃ１２－２００（ＡｘｏＬａｂｓから購入）に基づいてＬＮＰを組み立てた。ＬＮＰの他の成分は、ｃｉｓ－４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｓｉｇｍａから購入）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ、Ａｖａｎｔｉから購入）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＭＰＥ－ｍＰＥＧ２００、Ａｖａｎｔｉから購入）およびコレステロール（Ａｖａｎｔｉから購入）である。ＬＮＰは、Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して作成し、脂質および核酸成分をマイクロ流体チャンバー内で制御された条件下で混合すると、ＬＮＰが自己集団化する。ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡは、別々のＬＮＰにカプセル化した。ＬＮＰは、リン酸緩衝生理食塩水への透析によって濃縮され、使用前に４℃で最大１週間保存した。ＬＮＰは、動的光散乱を使用して特徴付けられ、一般に、５０～６０ｎＭの範囲のサイズを有した。ＬＮＰ中のＲＮＡ濃度は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定し、マウスに投与する用量を決定するために使用した。マウスに投与するため、ｓｐＣａｓ９およびガイドＲＮＡ ＬＮＰは、注射の直前にＲＮＡの質量比１：１で混合した。これらのＬＮＰがｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをマウスの肝臓に送達する能力は、マウスをＬＮＰ用量の範囲でＩＶ注射して、肝臓におけるアルブミンイントロン１の標的部位でのマウスゲノムの切断を、ＴＩＤＥ手順（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｄｅｃ １６；４２（２２）：ｅ１６８）を使用して測定することによって実証された。対立遺伝子の最大２５％が標的部位で切断された典型的な結果について、実施例２（図４）を参照する。
５匹のマウスの２つのコホートについて、２ｅ１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８－ＣＢ００４７ウイルスを尾静脈に注射した。３日後、コホートの１つに、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂＴ１ガイドＲＮＡをカプセル化したＬＮＰを、２ｍｇ／ｋｇの全ＲＮＡ用量（ｓｐＣａｓ９とｇＲＮＡの比が１：１）で注射した。血液試料を毎週収集し、血漿をＳＥＡＰ活性について市販のキット（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用してアッセイした。結果（表１３を参照）は、ＳＥＡＰ活性が、ＡＡＶ８－ｐＣＢ００４７ウイルスのみを受けたマウスでは検出可能ではなかったことを示す。ＡＡＶ８－ｐＣＢ００４７ウイルスに続いてＬＮＰを受けたマウスは、投与後４週間の最後の時点まで継続して安定した血漿中のＳＥＡＰ活性を有した。マウスがＡＡＶ８ドナーＳＥＡＰ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集構成要素の両方を受けたときにのみ、ＳＥＡＰが発現されたという結果は、ＳＥＡＰタンパク質がアルブミンイントロン１の標的部位に組み込まれたＳＥＡＰ遺伝子のコピーから発現されていたことを示唆する。ｐＣＢ０４７におけるＳＥＡＰ遺伝子はシグナルペプチドまたはプロモーターを欠いているため、それはフレーム内にあるプロモーターおよびシグナルペプチドにＳＥＡＰコード配列と操作可能に連結されていない限り、発現および分泌することはできない。ｐＣＢ０４７遺伝子カセットがゲノムにおけるランダムな部位に組み込まれている場合、これが起こる可能性は低い。
ｐＣＢ００４７からのＳＥＡＰ遺伝子カセットが、アルブミンのイントロン１に組み込まれていることを確認するために、Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（ＤＤ－ＰＣＲ）を使用して、試験の最後にマウスの肝臓から抽出されたゲノムＤＮＡにおける組み込み頻度を測定した。ＤＤ－ＰＣＲは、複雑な混合物中の核酸配列のコピー数を正確に定量化する方法である。ＰＣＲプライマー対は、ｍＡｌｂＴ１ガイドの標的部位（標的化された組み込みのために予測された部位）の５’側にあるマウスアルブミンゲノム配列に配置されるもの、およびｐＣＢ００４７におけるＳＥＡＰ遺伝子の５’末端に配置される他のプライマーを用いて設計した。この「ｉｎ－ｏｕｔ」ＰＣＲは、ＳＥＡＰカセットが所望の順方向に組み込まれている場合、マウスアルブミンゲノム配列と組み込まれたＳＥＡＰカセットとの間の接合部を増幅する。これらの２つのプライマーによって増幅されたＤＮＡ配列にハイブリダイズする蛍光プローブを設計した。ＤＤ－ＰＣＲアッセイの内部コントロールとして、マウスアルブミン遺伝子を検出するプライマープローブセットを使用した。このＤＤ－ＰＣＲアッセイを使用して、０．２４＋／－０．０７％（アルブミン遺伝子の１００コピーあたり０．２４コピー）の標的化された組み込みが測定され、これによってＳＥＡＰカセットがアルブミンイントロン１に組み込まれたことを確証した。
Figure 2022505173000028
実施例１０：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介されるマウスアルブミンイントロン１へのヒトＦＶＩＩＩ遺伝子ドナーの標的化された組み込みは、血液におけるＦＶＩＩＩの発現をもたらす
アルブミンのイントロン１への遺伝子の標的化された組み込みのための本明細書に記載の遺伝子編集戦略は、治療上の利益を提供する目的で、肝臓において任意の関心対象の遺伝子を発現するために使用され得る。タンパク質の欠如またはレベルの低下をもたらし、そのタンパク質を肝臓で発現させることによって置き換えることができる遺伝性疾患を有する患者は、このアプローチによって治療され得る。特に、血液中に通常存在するタンパク質の欠乏によって引き起こされる疾患は、たとえタンパク質の正常な発現部位が肝臓ではなく、または肝臓内の肝細胞ではない場合でも、肝細胞のアルブミンイントロン１に組み込まれた治療用遺伝子の発現は、コードされたタンパク質の血中への分泌を生じるため、この標的化遺伝子編集アプローチによって治療され得る。
この遺伝子編集戦略によって治療され得る疾患の例には、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥが含まれる。
本明細書に記載の遺伝子編集アプローチを使用して治療上の利益を提供できるかどうかを決定する疾患の例として、血友病Ａが選択された。血友病Ａは、広く研究されている疾患であり（Ｃｏｐｐｏｌａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｌｏｏｄ Ｍｅｄ．２０１０；１：１８３－１９５）、患者はＦＶＩＩＩ遺伝子に変異を有しており、それらの血液中の機能的なＦＶＩＩＩタンパク質の低いレベルをもたらす。第ＶＩＩＩ因子は、凝固カスケードの重要な構成要素であり、十分な量のＦＶＩＩＩがないと、血液は損傷部位で安定した血餅を形成できず、過度の出血を引き起こす。効果的に治療されていない血友病Ａ患者は、関節への出血を経て、関節破壊を生じる。頭蓋内出血も発生する可能性があり、時には致命的となり得る。
この遺伝子編集戦略を血友病Ａの治療に使用することができるかどうかを評価するために、マウスＦＶＩＩＩ遺伝子が不活化されたマウスモデルを使用した。これらの血友病Ａマウスは、それらの血液中に検出可能なＦＶＩＩＩを有さないため、ＦＶＩＩＩ活性アッセイ（Ｄｉａｐｈａｒｍａ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ ＳＰ第ＦＶＩＩＩ因子、カタログ番号Ｋ８２４０８６ｋｉｔ）を使用して外因的に供給されたＦＶＩＩＩを測定することが可能である。このアッセイの標準として、血友病患者の治療に使用される組換えヒトＦＶＩＩＩであるＫｏｇｅｎａｔｅ（Ｂａｙｅｒ）を使用した。アッセイの結果は、１ＩＵ／ｍｌとして定義される正常なヒトＦＶＩＩＩ活性のパーセンテージとして報告される。ヒトＦＶＩＩＩドナーテンプレートは、強力な肝臓特異的プロモーターの制御下でＡＡＶベクターを用いてマウスに送達された場合に機能することが示されたＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩコード配列に基づいて構築した（ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ｂｌｏｏｄ；１２１（１７）：３３３５－３３４４）。天然のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、このＦＶＩＩＩコード配列から除去され、マウスアルブミンエクソン１にスプライシングした後、正しいリーディングフレームを維持するために必要な２つの塩基対（ＴＧ）に置き換えた。マウスアルブミンイントロン１に由来するスプライスアクセプター配列は、このＦＶＩＩＩコード配列の５’のすぐ隣に挿入した。ヒトグロビン遺伝子からの３’非翻訳配列とそれに続く合成ポリアデニル化シグナル配列を、ＦＶＩＩＩコード配列の３’側に挿入した。合成ポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル化を効果的に指示することが示されている短い４９ｂｐ配列である（Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ，１９８９；ＧＥＮＥＳ ＆ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ３：１０１９－１０２５）。３’ＵＴＲ配列は、Ｂ－グロビン遺伝子から得られ、ポリアデニル化効率をさらに改善するように機能し得る。ｍＡｌｂＴ１ガイドＲＮＡの標的部位の逆相補体をこのＦＶＩＩＩ遺伝子カセットのいずれかの部位に配置して、図９に示すようにＡＡＶ２のＩＴＲ配列を含むｐＣＢ０５６と呼ばれるベクターを作成した。このプラスミドをＡＡＶ８キャプシドにパッケージ化して、ＡＡＶ８－ｐＣＢ０５６ウイルスを得た。
５匹の血友病Ａマウスのコホート（群２、Ｇ２）に、ＡＡＶ８－ｐＣＢ０５６ウイルスを１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で尾静脈に注射し、１９日後に同じマウスに、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂＴ１ガイドＲＮＡをカプセル化する２つのＣ１２－２００ベースのＬＮＰの混合物を、各々１ｍｇ ＲＮＡ／ｋｇの用量で尾静脈に注射した。ＬＮＰは、上記の実施例２に記載されているように製剤化した。５匹の血友病Ａマウスの別のコホート（群６、Ｇ６）に１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量でＡＡＶ８－ｐＣＢ０５６ウイルスを尾静脈に注射し、ＦＶＩＩＩ活性を次の４週間にわたってモニタリングした。ＡＡＶのみを注射した場合、マウスの血液中に測定可能なＦＶＩＩＩ活性はなかった（図９のＧ６）。ＡＡＶ８－ｐＣＢ０５６ウイルスに続いてＬＮＰでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集構成要素を投与されたマウスは、それらの血液中に、正常なヒトレベルのＦＶＩＩＩ活性の２５％から６０％の範囲であるＦＶＩＩＩ活性を有した。重度の血友病患者は、正常の１％未満のＦＶＩＩＩ活性レベルを有し、中度の血友病Ａ患者は、正常の１～５％のＦＶＩＩＩレベルを有し、軽度の患者は、正常の６％～３０％のＦＶＩＩＩレベルを有する。ＦＶＩＩＩ補充タンパク質療法を受けている血友病Ａ患者の分析では、予測されるＦＶＩＩＩトラフレベルが３％、５％、１０％、１５％、および２０％の場合、出血が発生しなかった頻度はそれぞれ７１％、７９％、９１％、９７％、および１００％（Ｓｐｏｔｔｓ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ ２０１４ １２４：６８９）であり、ＦＶＩＩＩレベルが１５～２０％の最小レベルを超えて維持されると、出血事象の発生率がゼロ近くまで低減されたことを示唆する。血友病Ａを治癒させるのに必要な正確なＦＶＩＩＩレベルは定義されておらず、患者によって異なる可能性があるが、５％から３０％のレベルは、出血事象の有意な減少を提供する可能性がある。したがって、上記の血友病Ａマウスでは、達成されたＦＶＩＩＩレベル（２５～６０％）は、治癒的であると期待される治療上適切な範囲にある。
図１０の５匹のマウスのうちの４匹は、３６日目の試験の終わりまで、安定したＦＶＩＩＩレベル（アッセイの通常の変動性およびマウス生理学の変動の範囲内）を示した。マウスのうちの１匹（２－３）のＦＶＩＩＩ活性は、３６日目に検出できないレベルに低下し、これは、マウスで外来タンパク質として認識され得るヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫応答に起因する可能性があった（Ｍｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ，２０１２ Ｂｌｏｏｄ １２０（１２）：２５１２－２５２０）。ＡＡＶ－ＦＶＩＩＩドナーテンプレートのみを注射した場合にマウスでＦＶＩＩＩタンパク質が発現しなかったという観察結果は、ＦＶＩＩＩの発現にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集構成要素の提供が必要であることを示している。ＦＶＩＩＩドナーカセットはプロモーターまたはシグナルペプチドを有さないため、ゲノム内のランダムな部位へのカセットの組み込みによって、または他の未定義のメカニズムによって、ＦＶＩＩＩが作成される可能性は低い。ＦＶＩＩＩドナーカセットがアルブミンのイントロン１に組み込まれたことを確認するために、ＤＤ－ＰＣＲ形式でｉｎ－ｏｕｔ ＰＣＲを使用した。群２のマウスの肝臓全体をホモジナイズし、ゲノムＤＮＡを抽出し、標的内組み込みが生じていると予測されるｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡの切断部位の５’位置でマウスアルブミン遺伝子に配置される１つのプライマーを使用して、ＤＤ－ＰＣＲによってアッセイした。第２のＰＣＲプライマーは、ｐＣＢ０５６カセット内のＦＶＩＩＩコード配列の５’末端に配置させた。検出に使用される蛍光プローブは、２つのＰＣＲプライマー間の配列にハイブリダイズするように設計した。これらの２つのプライマーを使用したＰＣＲは、ＦＶＩＩＩカセットがｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡ切断部位に、ＦＶＩＩＩタンパク質を発現できる順方向で組み込まれた組み込み事象の５’接合部を増幅させる。マウスアルブミン遺伝子内の領域に対するＤＤ－ＰＣＲアッセイを、アッセイにおけるマウスゲノムのコピー数を測定するためのコントロールとして使用した。このアッセイによって、１００個の半数体マウスゲノムあたり０．４６～１．２８の標的化された組み込み事象が検出された（平均１．０）。標的化された組み込みの頻度と、組み込まれたＦＶＩＩＩ遺伝子カセットから生成されるＦＶＩＩＩと一致するピークＦＶＩＩＩレベルとの間に相関関係があった。マウス肝臓における細胞の約７０％が肝細胞であり、ＡＡＶ８およびＬＮＰの両方が主に肝細胞に取り込まれると仮定すると、肝細胞アルブミン対立遺伝子の１．４％（１．０×（１／０．７））が順方向で組み込まれたＦＶＩＩＩカセットを含むと想定される。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、適切に設計されたＦＶＩＩＩ遺伝子カセットをマウスのアルブミンイントロン１に組み込み、治療レベルの機能的ＦＶＩＩＩタンパク質の発現および血液への分泌をもたらすことができることを示す。この試験で採用された送達様式、すなわち、ＦＶＩＩＩドナーテンプレートを送達するＡＡＶウイルスおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を送達するＬＮＰは、患者へのインビボ送達に潜在的に適している。Ｃａｓ９はインビボでの寿命が短い（１～３日の範囲）ｍＲＮＡとして提供されたため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集複合体は、短時間しか活性にならず、標的外切断事象が発生する時間が制限され、したがって予測される安全上の利点を提供する。これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が短時間のみ活性であったにもかかわらず、これはマウスにおいて治療上適切なレベルのＦＶＩＩＩ活性を生成するのに十分な頻度で、標的化された組み込みを誘導するのに適していたことを示す。
Figure 2022505173000029
実施例１１：ＡＡＶドナーに対するＬＮＰにおけるガイドＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡの投与のタイミングは、遺伝子発現のレベルに影響を及ぼす
ＡＡＶドナーテンプレートの注射と、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをカプセル化したＬＮＰの投与との間の時間が、ドナーテンプレートにコードされた遺伝子発現のレベルに影響を与えるかどうかを評価するために、５匹のマウスからなる２つのコホートの各々に、ｍＳＥＡＰをコードするＡＡＶ８－ｐＣＢ００４７を注射した。ＡＡＶを注射した４日後、１つのコホートのマウス（群３）に、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡ（各１ｍｇ／ｋｇ）をカプセル化したＣ１２－２００ベースのＬＮＰを注射し、血漿中のＳＥＡＰ活性を次の４週間、毎週測定した。ＳＥＡＰ活性は、マウスの第２のコホートで４週間モニタリングし、その間にＳＥＡＰは検出されなかった。ＡＡＶを注射してから２８日後、群４のマウスにｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡ（各１ｍｇ／ｋｇ）をカプセル化したＣ１２－２００ベースのＬＮＰを投与し、血漿中のＳＥＡＰ活性を次の３週間、毎週測定した。ＳＥＡＰデータを、表１５に要約する。ＡＡＶの４日後にＬＮＰカプセル化ｓｐＣａｓ９／ｇＲＮＡを投与された群３では、ＳＥＡＰ活性は平均３３０６マイクロＵ／ｍｌだった。ＡＡＶの２８日後にＬＮＰカプセル化ｓｐＣａｓ９／ｇＲＮＡを投与された群４では、ＳＥＡＰ活性は平均１３３８９マイクロＵ／ｍｌであり、群３より４倍高い。これらのデータは、ＬＮＰカプセル化ｓｐＣａｓ９／ｇＲＮＡをＬＮＰの２８日後に投与すると、ＡＡＶドナーテンプレートのわずか４日後にＬＮＰカプセル化ｓｐＣａｓ９／ｇＲＮＡを投与した場合よりも、ゲノムに組み込まれた遺伝子から４倍高い発現をもたらすことを示した。この改善された発現は、全長ドナーをコードする遺伝子カセットのアルブミンイントロン１へのより高い頻度の組み込みに起因する可能性が高い。
Figure 2022505173000030
ＡＡＶドナーおよびＬＮＰカプセル化Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ投与のタイミングの影響をまた、治療に関連する遺伝子の例としてＦＶＩＩＩ遺伝子も使用してさらに評価した。血友病Ａマウスの２つのコホートに、ヒトＦＶＩＩＩドナーカセットをコードするＡＡＶ８－ｐＣＢ０５６を、０日目に２ｅ１２ｖｇ／ｋｇの用量で注射した。コホートの１つには４日後にｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡ（各１ｍｇ／ｋｇ）をカプセル化したＣ１２－２００ベースのＬＮＰを注射し、第２のコホートには１７日後にｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡ（各１ｍｇ／ｋｇ）をカプセル化したＣ１２－２００ベースのＬＮＰを注射した。ＡＡＶ８－ｐＣＢ０５６の投与をずらし、それによってｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをカプセル化したＬＮＰの同じバッチを、両方の群で同一日に使用した。マウスの血中ＦＶＩＩＩ活性を、ＬＮＰを投与した後の１０日目および１７日目に測定し、その結果を図１１に示す。ＡＡＶの４日後にＬＮＰを投与されたマウスは、血中に検出可能なＦＶＩＩＩを有さなかったが、ＡＡＶの１７日後にＬＮＰを注射された群の４匹のマウスはすべて、１７日目に正常の２％～３０％の範囲の検出可能なＦＶＩＩＩ活性を有した。これらの結果は、ＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶドナーにおいて、ＡＡＶドナーの少なくとも１７日後にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を投与すると、治療上適切なレベルのＦＶＩＩＩを生じ、一方、ＡＡＶの４日後に投与してもＦＶＩＩＩの発現をもたらさなかったことを示す。
ＡＡＶが肝臓の細胞を含む細胞に感染するプロセスには、エンドソームからの脱出、ウイルス脱殻、およびＡＡＶゲノムの核への輸送が含まれる。一本鎖ゲノムがウイルスにパッケージ化されているこれらの試験で使用されたＡＡＶの場合、一本鎖ゲノムは二本鎖ＤＮＡ合成のプロセスを経て二本鎖ＤＮＡゲノムを形成する。一本鎖ゲノムから二本鎖ゲノムへの完全な変換に必要な時間は十分に確立されていないが、それは律速段階であると考えられている（Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ １９９６；Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７０：３２２７－３２３４）。次に、二本鎖線形ゲノムは、頭から尾および尾から頭に結合された単量体から構成される多量体の環状形態にコンカタマー化される（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ ２０１０；Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１：７５０－７６２）。試験で使用されたＡＡＶドナーテンプレートには相同性アームが含まれていないため、それらはＨＤＲのテンプレートにはならず、したがってＮＥＨＪ経路を介してのみ組み込むことができる。二本鎖の線状ＤＮＡフラグメントのみが、二本鎖切断でのＮＨＥＪ媒介性組み込みのためのテンプレートである。したがって、ＡＡＶドナーの直後にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９構成要素を肝細胞に送達すると、ＡＡＶゲノムの大部分が一本鎖形態であり、これらの状況下ではゲノムにおけるほとんどの二本鎖切断は、ドナーテンプレートの組み込みを伴わず、小さい挿入および欠失によって修復されるため、組み込みの頻度が低くなり得ると仮定される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集構成要素をＡＡＶドナーテンプレート後の遅れた時期で送達することは、ＮＨＥＪ媒介性の標的化された組み込みのためのテンプレートである二本鎖ＡＡＶゲノムの形成のための時間を与える。しかしながら、ＡＡＶドナーが送達されてから時間がかかりすぎると、二本鎖線形形態の、ＮＨＥＪを介した標的化された組み込みのテンプレートとならない環状（コンカタマー）形態への変換を生じ得る。ドナーテンプレートにガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９のための切断部位を含めると、環状型の切断をもたらして線形型を生じる。残りの線形型も切断されて、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む短いフラグメントが放出される。ＡＡＶドナーテンプレートにおける１つまたは２つのガイドＲＮＡ切断部位を含めると、ＡＡＶゲノムのコンカタマー型から様々な線形フラグメントが生成される。線形フラグメントのタイプは、ＡＡＶゲノムにおける切断部位の数、および各コンカテマーにおける多量体の数、ならびにそれらの相対的な向きによって異なるため、予測は困難である。ＡＡＶにおけるカセットの５’末端に配置された単一ｇＲＮＡ部位は、単量体の環および頭から尾のコンカテマー（頭から尾は、１つのＡＡＶゲノムの５’末端が次のＡＡＶゲノムの３’末端に結合していることを意味する）の両方から単量体二本鎖テンプレートを放出する。しかしながら、５’末端の単一ｇＲＮＡ部位は、単量体の二本鎖線形テンプレートを頭から頭へのコンカテマーから放出しない（頭から頭へのコンカテマーは、次のＡＡＶゲノムの５’末端に結合した１つのＡＡＶゲノムの５’末端で構成される）。５’末端に単一ｇＲＮＡ部位を使用することで考えられる利点は、それが頭から頭のコンカテマーであるが、頭から尾のコンカテマーではない、二本鎖フラグメントを含む短いＩＴＲのみを放出することである。ＡＡＶゲノムの５’末端での単一ｇＲＮＡ切断部位によって、ＩＴＲは線形単量体遺伝子カセットの３’末端に留まり、したがってゲノムに組み込まれる。ＡＡＶにおけるドナーカセットに２つのｇＲＮＡ部位（カセットに隣接）が含まれている場合、これにより、すべての形態の二本鎖ＤＮＡから単量体の二本鎖テンプレートが放出されるため、特に頭から尾および尾から頭のコンカテマーの混合が存在する場合、標的化された組み込みのために多くにテンプレートを開放し得る。カセットに隣接する２つのｇＲＮＡ標的部位を含めることの潜在的な欠点は、これがＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む小さな（約１５０塩基対）二本鎖線形フラグメントを放出することである。これらの小さな（約１５０塩基対）フラグメントのうちの２つは、関心対象の治療用遺伝子を含む遺伝子カセットの各コピーに対して生成される。フラグメントを含む短いＩＴＲは、ゲノムにおける二本鎖切断でのＮＨＥＪを介した標的化された組み込みのテンプレートでもあると予想され、したがって、ゲノムにおける二本鎖切断での組み込みのために遺伝子カセットを含むフラグメントと競合し、それによって治療用遺伝子カセットの宿主細胞のゲノムへの組み込みの所望の事象が発生する頻度を低下させる。コンカテマー形成の動態およびコンカテマーの分子組成（頭から尾および尾から頭へのコンカテマーの含有量およびコンカテマー中の単量体単位数）などの多くのパラメーターが知られていないこの生物学的システムの複雑さを考えると、ドナーカセットにおける０、１、または２つのガイド切断部位が、治療用遺伝子を含む所望のドナーカセットの最高の標的化された組み込みを達成するかどうか、またはこれがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集構成要素の送達のタイミングによってどのように影響されるかを確実に予測することは可能ではない。データは、２つのガイドＲＮＡ切断部位を含めることで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集構成要素が、ＡＡＶドナーカセットが投与された少なくとも１７日後に、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをカプセル化するＬＮＰによって送達される設定では、測定可能な標的化された組み込みをもたらすが、ＬＮＰがＡＡＶドナーカセットの４日後に投与されたときはそうではないことを裏付ける。
実施例１２：ＦＶＩＩＩ発現における異なるポリアデニル化シグナルの影響
マウスアルブミンイントロン１への標的化された組み込み後のＦＶＩＩＩ遺伝子の発現における異なるポリアデニル化シグナル配列の影響を評価するために、図１２に示される一連のプラスミドを構築した。これらのプラスミドは、５’末端にｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡのための単一の標的部位を備えて設計されており、流体力学的注射（ＨＤＩ）を使用してマウスに送達した後、インビボで環状プラスミドＤＮＡの線形化をもたらす。ＨＤＩは、プラスミドＤＮＡのマウスの肝臓への送達のための確立された技術であり（Ｂｕｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３，５９３－５９８）、生理食塩水中のネイキッドプラスミドＤＮＡがマウスの尾静脈に急速に注射される（５～７秒で２～３ｍｌの容量）。
６匹の血友病Ａマウスのコホートに、マウスあたり２５μｇのｐＣＢ０６５、ｐＣＢ０７６、またはｐＣＢ０７７を流体力学的に注射した。２４時間後、マウスに、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡを各ＲＮＡの１ｍｇ／ｋｇの用量でカプセル化するＣ１２－２００ＬＮＰを、眼窩後方注射によって投与した。マウスの血中におけるＦＶＩＩＩ活性は、ＬＮＰ投与後１０日目に測定した。１０日目にマウスを犠牲にし、肝臓全体をホモジナイズし、ホモジネートからゲノムＤＮＡを抽出した。アルブミンイントロン１への順方向におけるＦＶＩＩＩドナーカセットの標的化された組み込みの頻度を、定量的リアルタイムＰＣＲを使用して定量化した。このリアルタイムＰＣＲアッセイでは、１つのプライマーは、予想される組み込み部位（ｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡのための切断部位）の５’側のマウスアルブミン遺伝子のゲノム配列に位置し、第２のＰＣＲプライマーは、ドナープラスミドにおけるＦＶＩＩＩコード配列の５’末端に配置された。蛍光プローブは、２つのプライマーの間に配置された。このアッセイは、組み込みが順方向（ＦＶＩＩＩ遺伝子がゲノムマウスアルブミン遺伝子と同じ方向にある）で生じた場合に、マウスゲノムとドナーカセットの間の接合部を特異的に検出する。ナイーブマウス肝臓ゲノムＤＮＡにスパイクされた接合フラグメントの予測配列で構成される合成ＤＮＡフラグメントをコピー数標準として使用して、肝臓ゲノムＤＮＡにおける組み込み事象の絶対コピーを計算した。群２（ｐＣＢ０６５を注射）、群３（ｐＣＢ０７６を注射）、および群４（ｐＣＢ０７７を注射）のマウスのＦＶＩＩＩ活性は、それぞれ５．５％、４．２％、および１１．４％だった。ｐＣＢ０７７が注射された群４は、最も高いＦＶＩＩＩ活性を示した。流体力学的注射による肝臓へのＤＮＡの送達は、マウス間で大きく変動するため、各個別マウスについて図１３に示すように、ＦＶＩＩＩ活性を標的化された組み込み頻度で除して計算した。この比率は、ＦＶＩＩＩ遺伝子の組み込まれたコピーあたりのＦＶＩＩＩ発現を表し、ｐＣＢ０６５およびｐＣＢ０７６と比較してｐＣＢ０７７（群４）からの優れた発現を示した。ＦＶＩＩＩを発現しなかったマウスを除外した場合、平均ＦＶＩＩＩ／ＴＩ比は、ｐＣＢ０６５、ｐＣＢ０７６、およびｐＣＢ０７７でそれぞれ４２、８、および５７だった。これらのデータは、ｐＣＢ０７７におけるａＰＡ＋ポリアデニル化シグナルが、ｐＣＢ０７６のｓＰＡポリアデニル化シグナルと比較して、ＦＶＩＩＩの優れた発現を可能にすることを示す。ｓＰＡ＋ポリアデニル化シグナルを使用したＦＶＩＩＩの発現は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルを使用したものと同様だった。ＡＡＶウイルスを使用してドナーを送達する場合、特に、４．３Ｋｂのサイズで、ＡＡＶのパッケージ制限（ＩＴＲを除いて４．４Ｋｂ）に近いＦＶＩＩＩ遺伝子の場合、ｂＧＨポリＡ（２２５ｂｐ）と比較して、ｓＰＡ（４９ｂｐ）またはｓＰＡ＋（５４ｂｐ）などの短いポリアデニル化シグナル配列を使用することは有効である。ｓＰＡ＋ポリアデニル化シグナルは、ＦＶＩＩＩ遺伝子の停止コドンと合成ポリアデニル化シグナル配列（ａａｔａａａａｇａｔｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｔａｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇ）との間の５ｂｐスペーサ（ｔｃｇｃｇ）の存在によってのみ、ｓＰＡポリアデニル化シグナルと異なる。この合成ポリアデニル化シグナル配列は、既に報告されおり（Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ，１９８９；Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（７）：１０１９－２５）、ＡＡＶベースの遺伝子治療ベクターにおいて他で使用されているが（ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５－３３４４）、スペーサ配列を含めることの利点は明確には実証されていない。本発明者らのデータは、５ｂｐの短いスペーサを含めると、転写がゲノム内の強力なアルブミンプロモーターから追い出されるアルブミンイントロン１に組み込まれたＦＶＩＩＩ遺伝子の発現が改善されたことを示す。スペーサの利点は、ゲノム内の高度に発現された遺伝子座への標的化された組み込みの設定に特有である可能性がある。
実施例１３：ＬＮＰを使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素の反復投与は、マウスアルブミンイントロン１に標的化されたＡＡＶ送達ドナーカセットの発現の漸進的増加をもたらす
治療遺伝子がアルブミンのイントロン１に組み込まれる遺伝子編集ベースの遺伝子治療を患者に投与する設定では、患者に最適な治療的利益を提供するレベルの遺伝子発現を達成することが有利であろう。例えば、血友病Ａでは、血中のＦＶＩＩＩタンパク質の最も望ましいレベルは、２０％～１００％、または３０％～１００％、または４０％～１００％、または５０％～１００％の範囲であろう。１００％を超えるＦＶＩＩＩレベルは、血栓性事象のリスクを高め（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，２０１２；Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１５７：６５３－６３）、したがって望ましくない。強力なプロモーターを使用してＡＡＶゲノムのエピソームコピーから治療用遺伝子の発現を促進する標準的なＡＡＶベースの遺伝子治療は、ＡＡＶウイルスを一度しか投与することができず、達成される発現レベルは患者間で大幅に異なるため、達成される発現レベルのいかなる制御も可能ではない（Ｒａｎｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ，２０１７；Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７：２５１９－２５３０）。患者がＡＡＶウイルスを投与された後、前臨床モデルに基づき、ウイルスの効果的な再投与を妨げると予想される、ウイルスキャプシドタンパク質に対する高力価抗体をそれらは発達させる（Ｐｅｔｒｙ ｅｔ ａｌ，２００８；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：５４－６０）。ＡＡＶウイルスによって送達された治療用遺伝子がアルブミンイントロン１などのセーフハーバー遺伝子座でゲノムに組み込まれ、この標的化された組み込みがゲノムの二本鎖切断の作成を介して生じるアプローチは、標的化された組み込みのレベル、したがって治療用遺伝子産物のレベルを制御する機会を提供する。関心対象の治療用遺伝子をコードするドナーＤＮＡカセットを含むＡＡＶゲノムをカプセル化するＡＡＶによって肝臓が形質導入された後、ＡＡＶゲノムは形質導入された細胞の核内にエピソームによって維持される。これらのエピソームＡＡＶゲノムは、時間経過で比較的安定しており、したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって作成された二本鎖切断での標的化された組み込みのためのドナーテンプレートのプールを提供する。非免疫原性ＬＮＰで送達されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素の反復投与を使用して、ＡＡＶ送達されたドナーテンプレートにコードされたタンパク質の発現の段階的増加を誘導する可能性を、ＡＡＶ８－ｐＣＢ００４７、ならびにＣ１２－２００ＬＮＰにカプセル化されたｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡを使用して評価した。５匹のマウスのコホートに、２ｅ１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８－ｐＣＢ００４７を尾静脈に注射し、４日後に１ｍｇ／ｋｇのｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび１ｍｇ／ｋｇのｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡをカプセル化したＣ１２－２００ベースのＬＮＰを静脈内注射した。血中のＳＥＡＰレベルは、次の４週間、毎週測定し、平均３３０６マイクロＵ／ｍｌだった（表１６）。４週目の最後のＳＥＡＰ測定に続いて、同じマウスにｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡを各々１ｍｇ／ｋｇでカプセル化したＣ１２－２００ＬＮＰで再投与した。血中のＳＥＡＰレベルは、次の３週間、毎週測定し、平均６９００マイクロＵ／ｍｌであり、最初のＬＮＰ投与後の平均週レベルより２倍高かった。次に、同じ５匹のマウスに、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡを各々１ｍｇ／ｋｇでカプセル化したＣ１２－２００ＬＮＰで３回注射した。血中のＳＥＡＰレベルは、次の４週間、毎週測定し、平均１３１１７マイクロＵ／ｍｌであり、第２のＬＮＰ投与後の平均週レベルより２倍高かった。これらのデータは、ＬＮＰにカプセル化されたｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集構成要素の反復投与が、ＡＡＶ送達ドナーテンプレートからの遺伝子発現の段階的な増加をもたらすことができることを示す。ドナーテンプレートにコードされているＳＥＡＰ遺伝子が、プロモーターとの共有結合および発現のためのシグナルペプチド配列に依存しているという事実は、発現の増加が、アルブミンイントロン１への標的化された組み込みの増加によるものであることを強く示唆する。１２週目にマウスを犠牲にして、肝臓全体をホモジナイズし、ゲノムＤＮＡを抽出し、アルブミンイントロン１での標的化された組み込みについて、プライマーを前方方向（機能的なＳＥＡＰタンパク質を生成するのに必要な方向）で予測される５’接合部に隣接するプライマーを用いたＤＤ－ＰＣＲを使用してアッセイした。組み込み頻度は、平均０．３％だった（１００アルブミン対立遺伝子あたり０．３コピー）。
Figure 2022505173000031
実施例１４：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介される初代ヒト肝細胞におけるアルブミンイントロン１へのＳＥＡＰドナーの標的化された組み込みは、ＳＥＡＰの発現をもたらす
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断によって媒介されるアルブミンイントロン１への遺伝子カセットの標的化された組み込みが、ヒトゲノムに特異的なガイドＲＮＡを使用してヒト細胞でも機能することを実証するために、初代ヒト肝細胞で実験を実施した。初代ヒト肝細胞は、ヒトドナーの肝臓から収集され、それらの正常な表現型を維持するために最小限のインビトロ操作を受けている。２つのドナーテンプレートを図１４に示すように構築し、インビトロで肝細胞を形質導入するのに特に効果的であるＡＡＶ－ＤＪ血清型（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ，２００８；Ｊ Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１）にパッケージ化した。ＡＡＶ－ＤＪウイルスは、関連遺伝子（ＦＶＩＩＩまたはｍＳＥＡＰ）のコード配列内に配置されるプライマーおよびプローブを使用した定量ＰＣＲによって力価が測定され、１ｍｌあたりのゲノムコピー（ＧＣ）として表される力価を得た。
初代ヒト肝細胞（ＢｉｏＩＶＴ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹから入手）を解凍し、肝細胞回収培地（ＣＨＲＭ）（Ｇｉｂｃｏ）に移し、低速でペレット化し、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ（商標）ＣＰ培地（ＢｉｏＩＶＴ）＋Ｔｏｒｐｅｄｏ（商標）抗生物質ミックス（ＢｉｏＩＶＴ）中で、コラーゲンＩＶ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で予めコーティングした２４ウェルプレートに、０．７×１０６細胞／ｍＬ一定の密度で播種した。プレートを、５％ＣＯ２中で、３７℃でインキュベートした。細胞が付着した後（播種後３～４時間）、プレートに付着していない死んだ細胞を洗い流し、新鮮な温かい完全培地を細胞に加えた。ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ製）およびｈＡｌｂ Ｔ４ガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ製）の脂質ベースのトランスフェクション混合物は、ＲＮＡをＯｐｔｉＭｅｍ培地（Ｇｉｂｃｏ）に最終濃度０．０２μｇ／μｌのｍＲＮＡおよび０．２μＭガイドで添加することによって調製した。これに、Ｏｐｔｉｍｅｍで３０倍に希釈した等容量のリポフェクタミンを加え、室温で２０分間インキュベートした。ＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１０７またはＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１５６のいずれかを、細胞あたり１，０００ＧＣ～細胞あたり１００，０００ＧＣまでの様々な感染多重度で関連するウェルに添加し、直ちに（５分以内）ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ脂質切断混合物を添加した。次にプレートを、５％ＣＯ２中で、３７℃で７２時間インキュベートした後、培地を収集し、発色アッセイ（Ｄｉａｐｈａｒｍａ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＦＶＩＩＩ、カタログ番号Ｋ８２４０８６ｋｉｔ）を使用してＦＶＩＩＩ活性、または市販のキット（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用してＳＥＡＰ活性のいずれかをアッセイした。結果を図１５および１６に要約する。細胞をｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのみ、またはＳＥＡＰウイルスのみ、またはＦＶＩＩＩウイルスのみでトランスフェクトしたコントロールは、細胞内のバックグラウンド活性を表す低レベルのＳＥＡＰ活性を有した。ＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１０７ウイルスおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｈＡｌｂＴ４ ｇＲＮＡの両方でトランスフェクトすると、ＳＥＡＰ活性は、５０，０００および１００，０００のより高いＭＯＩで、バックグラウンドレベルを有意に超えた。これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集構成要素と、同じｇＲＮＡのための切断部位を含むＡＡＶ送達ドナーと、の組み合わせが、ドナーにコードされた導入遺伝子の発現を生じることができることを示す。ＡＡＶドナーにコードされているＳＥＡＰ遺伝子はプロモーターまたはシグナルペプチドを欠いており、ＳＥＡＰ発現には遺伝子編集構成要素を必要とするため、ＳＥＡＰはヒトアルブミンイントロン１に組み込まれたドナーのコピーから発現された可能性がある。ｉｎ－ｏｕｔＰＣＲは、ＳＥＡＰドナーのヒトアルブミンのイントロン１への組み込みを確認するために使用することができる方法である。
細胞を１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１０７またはＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１５６ウイルスのいずれかのみ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはｇＲＮＡは伴わない）でトランスフェクトしたコントロールは、７２時間で培地中に低レベルまたは検出不可能なレベルのＦＶＩＩＩ活性を示した（図１６）。ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｈＡｌｂＴ４ ｇＲＮＡとともに様々なＭＯＩのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１５６ウイルスでトランスフェクトした細胞は、７２時間で培地中に０．２～０．６ｍＩＵ／ｍｌの範囲の測定可能なレベルのＦＶＩＩＩ活性を有した。これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集構成要素と、同じｇＲＮＡのための切断部位を含むＡＡＶ送達されたドナーと、の組み合わせが、ドナーにコードされたＦＶＩＩＩ導入遺伝子の発現を生じることができることを示す。ＡＡＶドナーにコードされているＦＶＩＩＩ遺伝子はプロモーターまたはシグナルペプチドを欠いており、ＦＶＩＩＩ発現には遺伝子編集構成要素を必要とするため、ＦＶＩＩＩはヒトアルブミンイントロン１に組み込まれたドナーのコピーから発現された可能性がある。ｉｎ－ｏｕｔＰＣＲは、ＦＶＩＩＩドナーがヒトアルブミンのイントロン１に組み込まれていることを確認するために使用することができる方法である。
実施例１５：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介されたＮＳＧマウスモデルにおける第ＩＸ因子ドナーのアルブミンイントロン１への標的化された組み込みは第ＩＸ因子の発現をもたらす
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断によって媒介されるアルブミンイントロン１への遺伝子カセットの標的化された組み込みが、他の関心対象の遺伝子のために使用することができることを実証するために、追加の実験を設計して、ＦＩＸドナー配列を含むＡＡＶベースのベクターと、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびアルブミンイントロン１（配列番号８０）を標的化するｇＲＮＡを含むＬＮＰと、の投与で、ＮＳＧマウスにおける血液凝固第ＩＸ因子（Ｆ９、ＦＩＸ）の発現を評価した。ＦＩＸの生物学的重要性は、ＦＩＸ機能の量的（低活性および低抗原）および／または質的（低活性および正常抗原）な欠陥に起因するＸ連鎖先天性出血性疾患である血友病Ｂ（クリスマス病）で示される。
これらの実験で使用されたＡＡＶ８ベクター（ＣＢ１０２２）の概略図を図１７Ａに示す。ヒトマイクロサテライトに由来するスタッファーフラグメントをＡＡＶベクターに組み込んで、上記の実施例１４に記載のＦＶＩＩＩをコードするベクターと同様のサイズを維持して、より直接的な比較を可能にした。ＦＩＸをコードするコドン最適化配列は、配列リストにおいて配列番号１０５として提供される。これらの実験では、ＦＩＸ発現を、Ｓｈａｒｍａら（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｂｕｍｉｎ ｌｏｃｕｓ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ，１２６（１５）：１７７７－１７８４，２０１５）で報告されているＡｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓのＶｉｓｕＬｉｚｅ ｈＦａｃｔｏｒ ＩＸ抗原ＥＬＩＳＡキットを使用して評価した。ＦＩＸはＦＶＩＩＩに比べて小さいタンパク質であるため、ＦＩＸはＦＶＩＩＩに比べて高レベルで発現されると予測され、小さいＡＡＶドナーの優れた組み込み効率に起因する可能性が高い。３つの異なる用量のＡＶＶベクターを、以下のように、１５匹のマウス（５匹の３群）で尾静脈注射によって、ＦＩＸの発現レベルを調査した。
Figure 2022505173000032
４週間後、凍結したＬＮＰを２ｍｇ／ｋｇの全ＲＮＡで投与した。これらの実験で使用されたＬＮＰは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはｍＡＬｂ ｇＲＮＡ＿Ｔ１（配列番号８０）のいずれかをカプセル化した凍結ＬＮＰ製剤であり、ｇＲＮＡ ＬＮＰおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＬＮＰは、注射前にＲＮＡ質量で計算して１：１の比率で混合した。同じ凍結ＬＮＰ製剤は、別々の試験において、２ｍｇ／ｋｇで３３％のＩＮＤＥＬを生成することが示された。ＦＩＸ発現レベルは、ＬＮＰ投与後１０日目および２４日目に眼窩後方（ＲＯ）採血を介して、３つの異なる抗原希釈である１：５０、１：２００、および１：４００を用いて、Ｓｈａｒｍａら（２０１５、上記）で報告されているように、Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓのＶｉｓｕＬｉｚｅ ｈＦａｃｔｏｒ ＩＸ ａｎｔｉｇｅｎ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。以下の表１８に要約されているように、１×１０１３（およそ４％）および２×１０１２（およそ１．５％）ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８－ＣＢ１０２２ベクターを投与したＮＳＧマウスにおいて、１０日目に低レベルのｈＦＩＸ活性が検出された。２４日目に、低いレベルのＦＩＸは、１×１０１３を投与されたＮＳＧマウスで維持された。標的化された組み込み（ＴＩ）効率は２４日目に評価し、結果を以下の表１８および図１７Ｂに要約する。
Figure 2022505173000033
この実施例に記載された結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断によって媒介されるアルブミンイントロン１への遺伝子カセットの標的化された組み込みを、他の関心対象の遺伝子に使用することができることを示す。
実施例１６：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介されるＮＳＧマウスモデルにおけるアルブミンイントロン１へのセルピンＧ１ドナーの標的化された組み込みは、セルピンＧ１の発現をもたらす。
この実施例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性切断を使用して、マウスセルピンＧ１／Ｃ１阻害剤遺伝子のための遺伝子カセットのアルブミンイントロン１への組み込みを、標的化することができることを実証するために実施された、実験の結果を説明する。これらの実験で使用されたＡＶＶベクター（ＣＢ１０４５）の概略図が図１８Ａに示され、ヒトマイクロサテライト配列に由来するスタッファーフラグメントをＡＡＶベクターに組み込み、より直接的な比較を可能にするために、上記の実施例１４～１５に記載のＦＶＩＩＩおよびＦＩＸをコードするベクターと同様のサイズを維持した。ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子は、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）であるＣ１阻害剤をコードしている。Ｃ１阻害剤は、炎症を含む血管の維持に含まれる範囲のプロセスを制御するために重要である。炎症は、感染、刺激、またはその他の傷害に対する正常な身体反応である。特に、Ｃ１阻害剤は、血漿カリクレインおよび第ＸＩＩ因子の活性化型など、血中のいくつかのタンパク質の活性を遮断する。ＳＥＲＰＩＮＧ１における変異は、約１０，０００人に１人～５０，０００人に１人に発生する非常にまれで、生命を脅かす可能性のある遺伝的状態である遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を引き起こす。
実験は、成熟ＳＥＲＰＩＮＧ１ ＣＤＳをＮＳＧマウスのアルブミン遺伝子座にＡＡＶ８を介して送達し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介して組み込むように設計した。図１８Ａに示されるように、ＳＥＲＰＩＮＧ１はまた、ＦＶＩＩＩと比較してより短いドナー配列であり、したがって、ＡＡＶベクターは各々、パッキング能力を維持するためのスタッファーフラグメントを含んだ。これらの実験では、アルブミンからのＣ１阻害剤の発現は、ＡｂｃａｍのＨｕｍａｎ Ｃ１阻害剤ＥＬＩＳＡキット（ａｂ２２４８８３）によって測定した。これらの実験で使用された成熟ＳＥＲＰＩＮＧ１コード配列（ＣＤＳ）は、配列リストに配列番号１０６として提供される。２つの異なる用量のＡＶＶベクターＣＢ１０４５を、１５匹のマウス（５匹の３つの群）で、以下のように尾静脈注射によって試験し、ＳＥＲＰＩＮＧ１の発現レベルを調査した。
Figure 2022505173000034
４週後、凍結ＬＮＰを群１および２の動物に、１ｍｇ／ｋｇの全ＲＮＡで投与した。これらの実験で使用されたＬＮＰは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはｍＡＬＢ ｇＲＮＡ（配列番号８０）のいずれかをカプセル化したＣ１２－２００凍結ＬＮＰ製剤であり、ｇＲＮＡ ＬＮＰおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＬＮＰは、注射前にＲＮＡ質量で計算して１：１の比率で混合した。ＳＥＲＰＩＮＧ１発現レベルは、ＬＮＰ投与後１１日目と１７日目に眼窩後方（ＲＯ）採血を介して、ＡｂｃａｍのＨｕｍａｎ Ｃ１阻害剤ＥＬＩＳＡキット（ａｂ２２４８８３）を使用することによって測定した。図１８Ｂに要約されるように、マウスｍＡＬＢ遺伝子座から発現されたＳＥＲＰＩＮＧ１活性は、群１および２のＮＳＧマウスにおいて１１日目に観察された。
この実施例で説明される結果によって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性切断を使用して、マウスＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子によって例示されるような他の関心対象の遺伝子のための遺伝子カセットのアルブミンイントロン１への組み込みを、標的化することができることがさらに確証される。
本開示は、いくつかの説明された実施形態に関してある程度詳細に説明されたが、そのような詳細または実施形態または任意の特定の実施形態に限定されるべきではないが、先行技術を考慮して、そのような特許請求の範囲の可能な限り広い解釈を提供し、したがって、本開示の意図された範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲に対する参照と解釈されるべきである。

Claims (114)

  1. システムであって、
    デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、
    配列番号２２、２１、２８、３０、１８～２０、２３～２７、２９、３１～４４、および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸と、
    関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）またはその機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を含む、システム。
  2. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む、請求項２に記載のシステム。
  4. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む、請求項２に記載のシステム。
  5. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む、請求項２に記載のシステム。
  6. 前記ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む、請求項２に記載のシステム。
  7. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはその機能的誘導体である、請求項１～６のいずれか一項に記載のシステム。
  8. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である、請求項１～７のいずれか一項に記載のシステム。
  9. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、請求項１～８のいずれか一項に記載のシステム。
  10. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１～９のいずれか一項に記載のシステム。
  11. 前記ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載のシステム。
  12. 前記ＧＯＩは、治療用ポリペプチドおよび予防用ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１～１１のいずれか一項に記載のシステム。
  13. 前記ＧＯＩは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）タンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）タンパク質、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）タンパク質、第Ｘ因子（ＦＸ）タンパク質、プロテインＣ、セリンプロテアーゼ阻害剤Ｇ１（セルピンＧ１）、またはそれらのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１～１１のいずれか一項に記載のシステム。
  14. 前記ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、請求項１３に記載のシステム。
  15. 前記ＧＯＩは、ＦＩＸタンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、請求項１３に記載のシステム。
  16. 前記ＧＯＩは、セルピンＧ１タンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、請求項１３に記載のシステム。
  17. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。
  18. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。
  19. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡである、請求項１８に記載のシステム。
  20. 前記ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている、請求項１～１９のいずれか一項に記載のシステム。
  21. 前記ドナーテンプレートは、前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットは、片側または両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、請求項２０に記載のシステム。
  22. 前記ドナーカセットは、両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、請求項２１に記載のシステム。
  23. 前記ｇＲＮＡ標的部位は、前記システムにおけるｇＲＮＡのための標的部位である、請求項２１または２２に記載のシステム。
  24. 前記ドナーテンプレートの前記ｇＲＮＡ標的部位は、前記システムにおけるｇＲＮＡのためのゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、請求項２３に記載のシステム。
  25. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項１～２４のいずれか一項に記載のシステム。
  26. 前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、前記ｇＲＮＡも含む、請求項２５に記載のシステム。
  27. 前記ｇＲＮＡと予め複合体化されて、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のシステム。
  28. 細胞においてゲノムを編集する方法であって、
    前記細胞に、以下：
    （ａ）配列番号２２、２１、２８、３０、１８～２０、２３～２７、２９、３１～４４、および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列を含むｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸と、
    （ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、
    （ｃ）関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）または機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を提供することを含む、方法。
  29. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む、請求項２９に記載の方法。
  33. 前記ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む、請求項２９に記載の方法。
  34. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはその機能的誘導体である、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２８～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ＧＯＩは、治療用ポリペプチドおよび予防用ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＩＸタンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、ＦＸＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩタンパク質、ＦＸタンパク質、プロテインＣ、セルピンＧ１、またはそれらのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項２８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項２８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡである、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている、請求項２８～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記ドナーテンプレートは、前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットは、片側または両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、請求項２８～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ドナーカセットは、両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）の前記ｇＲＮＡのための標的部位である、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 前記ドナーテンプレートの前記ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）の前記ｇＲＮＡのための前記細胞ゲノムにおけるｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項２８～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、前記ｇＲＮＡも含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記細胞に、前記ｇＲＮＡと予め複合体化された前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを提供し、ＲＮＰ複合体を形成することを含む、請求項２８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. （ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）の前記ドナーテンプレートが前記細胞に提供されてから４日を超えた後に、前記細胞に提供される、請求項２８～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. （ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）が前記細胞に提供されてから少なくとも１４日後に、前記細胞に提供される、請求項２８～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. １つ以上の追加用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、第１の用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、前記細胞に提供される、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. １つ以上の追加用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、前記ＧＯＩもしくは機能的誘導体をコードする前記核酸配列の標的化された組み込みの標的レベル、および／または前記ＧＯＩもしくは機能的誘導体をコードする前記核酸配列の発現の標的レベルが達成されるまで、前記第１の用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、前記細胞に提供される、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、請求項２８～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記細胞は、肝細胞である、請求項２８～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 遺伝子改変細胞であって、前記細胞のゲノムは、請求項２８～５７のいずれか一項に記載の方法によって編集されている、遺伝子改変細胞。
  59. 前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記内因性アルブミンプロモーターの前記制御下で発現される、請求項５８に記載の遺伝子改変細胞。
  60. 前記ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項５８または５９に記載の遺伝子改変細胞。
  61. 前記細胞は、肝細胞である、請求項５８～６０のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  62. 対象における障害または健康状態を治療する方法であって、
    前記対象における細胞に、以下：
    （ａ）配列番号２２、２１、２８、３０、１８～２０、２３～２７、２９、３１～４４、および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列を含むｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸と、
    （ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、
    （ｃ）関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）または機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を提供することを含む、方法。
  63. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む、請求項６３に記載の方法。
  67. 前記ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む、請求項６３に記載の方法。
  68. 前記ＧＯＩは、治療用ポリペプチドおよび予防用ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項６２～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＩＸタンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、ＦＸＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩタンパク質、ＦＸタンパク質、プロテインＣ、セルピンＧ１、またはそれらのそのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項６２～６７のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記ＧＯＩは、ＦＩＸタンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、請求項６９に記載の方法。
  72. 前記ＧＯＩは、セルピンＧ１またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、請求項６９に記載の方法。
  73. 前記対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害もしくは健康状態を有するか、または有することが疑われる患者である、請求項６２～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記対象は、血友病Ａを有するか、または有することが疑われる患者である、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記対象は、血友病Ｂを有するか、または有することが疑われる患者である、請求項７３に記載の方法。
  76. 前記対象は、ＨＡＥを有するか、または有することが疑われる患者である、請求項７３に記載の方法。
  77. 前記対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害または健康状態のリスクを有すると診断されている、請求項６２～７２のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記対象は、血友病Ａのリスクを有すると診断されている患者である、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記対象は、血友病Ｂのリスクを有すると診断されている患者である、請求項７７に記載の方法。
  80. 前記対象は、ＨＡＥのリスクを有すると診断されている患者である、請求項７７に記載の方法。
  81. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはその機能的誘導体である、請求項６２～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である、請求項６２～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、請求項６２～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項６２～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項６２～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項６２～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項６２～８５のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡである、請求項８７に記載の方法。
  89. （ａ）の前記ｇＲＮＡ、（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｃ）の前記ドナーテンプレート、のうちの１つ以上は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項６２～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている、請求項６２～８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記ドナーテンプレートは、前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットは、片側または両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、請求項６２～９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記ドナーカセットは、両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）の前記ｇＲＮＡのための標的部位である、請求項９１または９２に記載の方法。
  94. 前記ドナーテンプレートの前記ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）の前記ｇＲＮＡのための前記細胞ゲノムにおける前記ｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記ドナーテンプレートを前記細胞に提供することは、前記ドナーテンプレートを前記対象に投与することを含む、請求項６２～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記投与は、静脈内経路を介する、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項６２～９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、前記ｇＲＮＡも含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記ｇＲＮＡおよび前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記細胞に提供することは、前記リポソームまたは脂質ナノ粒子を前記対象に投与することを含む、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記投与は、静脈内経路を介する、請求項９９に記載の方法。
  101. 前記細胞に、前記ｇＲＮＡと予め複合体化された前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを提供し、ＲＮＰ複合体を形成することを含む、請求項６２～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. （ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）の前記ドナーテンプレートが前記細胞に提供されてから４日を超えた後に、前記細胞に提供される、請求項６２～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. （ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）の前記ドナーテンプレートが前記細胞に提供されてから少なくとも１４日後に、前記細胞に提供される、請求項６２～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. １つ以上の追加用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、前記第１の用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、前記細胞に提供される、請求項１０２または１０３に記載の方法。
  105. １つ以上の追加用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列の標的化された組み込みの標的レベルおよび／または前記ＧＯＩタンパク質または機能的誘導体をコードする前記核酸配列の発現の標的レベルが達成されるまで、前記第１の用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、前記細胞に提供される、請求項１０４に記載の方法。
  106. （ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記細胞に提供することは、前記対象に前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸および前記ｇＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を投与することを含む、請求項１０２～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. （ｃ）の前記ドナーテンプレートを前記細胞に提供することは、前記対象に、ＡＡＶベクターにコードされた前記ドナーテンプレートを投与することを含む、請求項１０２～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、請求項６２～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記細胞は、肝細胞である、請求項６２～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記対象の前記肝臓において発現される、請求項６２～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 対象における血友病Ａ、血友病Ｂ、または遺伝性血管浮腫を治療する方法であって、
    請求項５８～６１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
  112. 前記遺伝子改変細胞は、前記対象に対して自家である、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記対象からの生物学的試料を得ることをさらに含み、前記生物学的試料は、肝細胞の細胞を含み、前記遺伝子改変細胞は、前記肝細胞から調製される、請求項１１１または１１２に記載の方法。
  114. 請求項１～２７のいずれか一項に記載のシステムの１つ以上の要素を含み、かつ使用のための説明書をさらに含む、キット。
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