CN113366106A - 用于递送转基因的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供用于将核酸(包括DNA和RNA)靶向递送到靶细胞的组合物、方法和系统。还提供用于通过基因组编辑在细胞中表达转基因的组合物、方法和系统。还提供用于将目的基因(GOI)敲入基因组中的目标基因组位点中，确切地说敲入白蛋白基因的位点中的组合物、方法和系统。还提供用于采用离体和/或体内基因组编辑治疗患有或疑似患有病症或健康状况的受试者的组合物、方法和系统。

Description

用于递送转基因的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请案要求于2018年10月17日提交的美国临时专利申请序列第62/747,128号的优先权，其(包括任何附图)通过全文引用的方式明确地并入本文中。
合并序列表
随附序列表中的材料特此通过引用的方式并入本申请。在2019年10月8日创建命名为052984-535001WO_Sequence Listing.txt的随附序列表文本文件，并且是125KB。
技术领域
本公开提供用于将核酸靶向递送到靶细胞(例如人类细胞)的组合物、方法和系统。本发明的一些实施例涉及用于通过基因组编辑在细胞中表达转基因的组合物、方法和系统。
背景技术
基因组测序技术和分析方法中的最近进展已显著加快了对与不同范围的生物功能和疾病相关的遗传因素进行分类和映射的能力。需要精确基因组靶向技术以通过允许对个别遗传元件进行选择性干扰来实现因果性遗传变异的系统性逆向工程改造，以及推动合成生物学、生物技术和医疗应用。
近来，使用设计的位点特异性核酸酶进行基因编辑已作为基础生物医学研究和治疗开发的技术出现。近年来，已经开发了基于四种主要类型的核酸内切酶的各种平台来进行基因编辑，即兆核酸酶及其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和簇状有规律地间隔的短回文重复(CRISPR)相关的核酸内切酶9(cas9)。每一核酸酶类型能够在特定DNA位点处诱导DNA双链断裂(DSB)，因此触发两个DNA修复路径。非同源末端连接(NHEJ)路径在DSB处产生随机插入/缺失(插入缺失(indel))突变，而同源定向修复(HDR)路径利用供体模板上携带的遗传信息修复DSB。因此，这些基因编辑平台能够以多种方式操控特定基因组位点处的基因，如破坏基因功能、将突变型基因修复正常和插入DNA物质。
然而，当前可用的基因组编辑技术可能具有许多缺点，例如准确性，不可接受的脱靶编辑水平等。因此，仍然需要新的基因组基因编辑平台，其能够以多种方式操控特定基因组位点处的基因，如破坏基因功能、将突变型基因修复正常，和/或将异源DNA物质插入特定位点(如靶细胞基因组内的安全港位点)。
发明内容
本文尤其提供用于将核酸(包括DNA和RNA)靶向递送到靶细胞(例如人类细胞)的组合物、方法和系统。还提供用于通过基因组编辑通过以靶向方式将转基因整合到细胞的基因组中来表达细胞中的转基因的组合物、方法和系统。本公开的某些方面和实施例涉及用于将目的基因(GOI)敲入基因组中的特定安全港位置中，确切地说，敲入内源性白蛋白位点内或附近的基因组位置中的组合物、方法和系统。还提供用于采用离体和/或体内基因组编辑治疗患有或疑似患有病症或健康状况的受试者的组合物、方法和系统。
一方面，本文提供具有与内源性白蛋白位点内或附近的基因组序列互补的序列的向导RNA(gRNA)序列。
在一些实施例中，gRNA具有选自表3中所列出的那些和其与表3中所列出的那些中的任一者具有至少85％同源性的变异体的序列。
另一方面，本文提供具有上文所提及的gRNA中的任一者的组合物。
一方面，本文提供一种系统，其包括如本文所公开的向导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核酸。在一些实施例中，系统的gRNA具有选自表3中所列出的那些和其与表3中所列出的那些中的任一者具有至少85％同源性的变异体的序列。
在一些实施例中，系统还具有以下各者中的一者或多者：脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸；和供体模板，其具有编码目的基因(GOI)或其功能衍生物的核酸序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:22、21、28和30中的任一者的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:22的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:28的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:30的间隔序列。
在一些实施例中，DNA核酸内切酶识别具有序列NGG或NNGG的原间隔区相邻基序(PAM)，其中N是任何核苷酸或其功能衍生物，或其功能衍生物。在一些实施例中，DNA核酸内切酶是II型Cas核酸内切酶或其功能衍生物。
在一些实施例中，DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，Cas9来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(spCas9)。在一些实施例中，Cas9来自路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)(SluCas9)。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸经密码子优化以用于在宿主细胞中表达。
在一些实施例中，编码目的基因(GOI)的核酸序列经密码子优化以用于在宿主细胞中表达。在一些实施例中，GOI编码选自由以下组成的组的多肽：治疗性多肽和预防性多肽。在一些实施例中，GOI编码选自由以下组成的组的蛋白质：因子VIII(FVIII)蛋白质、因子IX蛋白质、α-1-抗胰蛋白酶、因子XIII(FXIII)蛋白质、因子VII(FVII)蛋白质、因子X(FX)蛋白质、蛋白质C、丝氨酸蛋白酶抑制剂G1(Serpin G1)其任一者的功能衍生物。在一些实施例中，GOI编码FVIII蛋白质或其功能衍生物。在一些实施例中，GOI编码FIX蛋白质或其功能衍生物。在一些实施例中，GOI编码丝氨酸蛋白酶抑制剂G1蛋白质或其功能衍生物。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)序列。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是核糖核酸(RNA)序列。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的RNA序列经由共价键连接到gRNA。
在一些实施例中，组合物还具有脂质体或脂质纳米颗粒。
在一些实施例中，供体模板编码于腺相关病毒(AAV)载体中。
在一些实施例中，将DNA核酸内切酶调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。
在一些实施例中，脂质体或脂质纳米颗粒还具有gRNA。
在一些实施例中，DNA核酸内切酶与gRNA预复合，形成核糖核蛋白(RNP)复合物。
另一方面，本文提供具有上文所描述的组合物中的任一者且还具有使用说明书的试剂盒。
另一方面，，本文提供一种编辑细胞中的基因组的方法。所述方法包括向细胞提供以下各者：(a)本文所描述的gRNA或编码gRNA的核酸中的任一者；(b)脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸；以及(c)供体模板，其具有编码目的基因(GOI)或功能衍生物的核酸序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:22、21、28和30中的任一者的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:22的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:28的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:30的间隔序列。
在一些实施例中，gRNA具有选自表3中所列出的那些和其与表3中所列出的那些中的任一者具有至少85％同源性的变异体的序列。
在一些实施例中，DNA核酸内切酶识别具有序列NGG或NNGG的原间隔区相邻基序(PAM)，其中N是任何核苷酸；或其功能衍生物。在一些实施例中，DNA核酸内切酶是II型Cas核酸内切酶或其功能衍生物。
在一些实施例中，DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，Cas9来自酿脓链球菌(spCas9)。在一些实施例中，Cas9来自路邓葡萄球菌(SluCas9)。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸经密码子优化。
在一些实施例中，编码目的基因(GOI)的核酸序列经密码子优化。在一些实施例中，GOI编码选自由以下组成的组的多肽：治疗性多肽和预防性多肽。在一些实施例中，GOI编码选自由以下组成的组的蛋白质：FVIII蛋白质、FIX蛋白质、α-1-抗胰蛋白酶、FXIII蛋白质、FVII蛋白质、FX蛋白质、蛋白质C、丝氨酸蛋白酶抑制剂G1其任一者的功能衍生物。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)序列。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是核糖核酸(RNA)序列。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的RNA序列经由共价键连接到gRNA。
在一些实施例中，供体模板在AAV载体中编码。
在一些实施例中，将(a)、(b)和(c)中的一者或多者调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。
在一些实施例中，将DNA核酸内切酶调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。
在一些实施例中，脂质体或脂质纳米颗粒还具有gRNA。
在一些实施例中，在提供到细胞之前，DNA核酸内切酶与gRNA预复合，形成RNP复合物。
在一些实施例中，在将(c)提供到细胞之后，将(a)和(b)提供到细胞。
在一些实施例中，在将(c)提供到细胞之后约1到14天将(a)和(b)提供到细胞。
在一些实施例中，将编码目的基因(GOI)的核酸序列插入到细胞的基因组序列中。
在一些实施例中，插入在细胞基因组中的白蛋白基因或白蛋白基因调节元件处、在其内或其附近。
在一些实施例中，插入在白蛋白基因的第一内含子中。
在一些实施例中，插入在基因组中的人类白蛋白基因的第一外显子的末端下游至少37bp，并且在基因组中的人类白蛋白基因的第二外显子的开始上游至少330bp。
在一些实施例中，编码目的基因的核酸序列在内源性白蛋白启动子的控制下表达。
在一些实施例中，细胞是肝细胞。
另一方面，本文提供一种遗传修饰的细胞，其中通过上文所描述的方法中的任一者编辑细胞的基因组。
在一些实施例中，将编码目的基因的核酸序列插入到细胞的基因组序列中。
在一些实施例中，插入在细胞基因组中的白蛋白基因或白蛋白基因调节元件处、在其内或其附近。
在一些实施例中，插入在白蛋白基因的第一内含子中。
在一些实施例中，插入在基因组中的人类白蛋白基因的第一外显子的末端下游至少37bp，并且在基因组中的人类白蛋白基因的第二外显子的开始上游至少330bp。
在一些实施例中，编码目的基因的核酸序列在内源性白蛋白启动子的控制下表达。
在一些实施例中，编码目的基因的核酸序列经密码子优化。
在一些实施例中，细胞是肝细胞。
另一方面，本文提供治疗受试者的病症或健康状况的方法。所述方法包括向受试者投予上文所提及的遗传修饰的细胞中的任一者。
在一些实施例中，受试者是患有或疑似患有血友病A、血友病B或HAE的患者。
在一些实施例中，受试者诊断为具有血友病A、血友病B或HAE的风险。
在一些实施例中，遗传修饰的细胞是自体的。
在一些实施例中，细胞是肝细胞。
在一些实施例中，将编码目的基因的核酸序列插入到细胞的基因组序列中。
在一些实施例中，插入在细胞基因组中的白蛋白基因或白蛋白基因调节元件处、在其内或其附近。
在一些实施例中，插入在白蛋白基因的第一内含子中。
在一些实施例中，插入在基因组中的人类白蛋白基因的第一外显子的末端下游至少37bp，并且在基因组中的人类白蛋白基因的第二外显子的开始上游至少330bp。
在一些实施例中，编码目的基因的核酸序列在内源性白蛋白启动子的控制下表达。
在一些实施例中，所述方法还具有从受试者获得生物样本，其中所述生物样本具有肝细胞细胞并且通过将编码其目的基因的核酸序列插入到细胞的基因组序列中来编辑肝细胞的基因组，从而产生遗传修饰的细胞。
另一方面，本文提供治疗受试者的病症或健康状况的方法。所述方法已从受试者获得生物样本，其中所述生物样本具有肝细胞，向肝细胞提供以下各者：(a)上文所描述的gRNA中的任一者或编码gRNA的核酸；(b)脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸；以及(c)供体模板，其具有编码目的基因(GOI)或功能衍生物的核酸序列，从而产生遗传修饰的细胞，并且向受试者投予遗传修饰的细胞。
在一些实施例中，受试者是患有或疑似患有选自由以下组成的组的病症或健康状况的患者：FVIII缺乏(血友病A)、FIX缺乏(血友病B)、亨特氏综合症(MPS II)、赫勒氏综合症(MPS1H)、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、FXIII缺乏、FVII缺乏、FX缺乏、蛋白质C缺乏和遗传性血管性水肿(HAE)。在一些实施例中，受试者是患有或疑似患有血友病A的患者。在一些实施例中，受试者是患有或疑似患有血友病B的患者。在一些实施例中，受试者是患有或疑似患有HAE的患者。
在一些实施例中，受试者诊断为具有选自由以下组成的组的病症或健康状况的风险：血友病A、血友病B、MPS II、MPS1H、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、FXIII缺乏、FVII缺乏、FX缺乏、蛋白质C缺乏和HAE。在一些实施例中，受试者诊断为具有血友病A的风险。在一些实施例中，受试者诊断为具有血友病B的风险。在一些实施例中，受试者诊断为具有HAE的风险。
在一些实施例中，遗传修饰的细胞是自体的。
在一些实施例中，gRNA具有选自表3中所列出的那些和其与表3中所列出的那些中的任一者具有至少85％同源性的变异体的序列。
在一些实施例中，DNA核酸内切酶识别具有序列NGG或NNGG的原间隔区相邻基序(PAM)，其中N是任何核苷酸；或其功能衍生物。在一些实施例中，DNA核酸内切酶是II型Cas核酸内切酶或其功能衍生物。
在一些实施例中，DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，Cas9来自酿脓链球菌(spCas9)。在一些实施例中，Cas9来自路邓葡萄球菌(SluCas9)。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸经密码子优化。
在一些实施例中，编码目的基因(GOI)或其功能衍生物的核酸序列经密码子优化。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)序列。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是核糖核酸(RNA)序列。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的RNA序列经由共价键连接到gRNA。
在一些实施例中，将(a)、(b)和(c)中的一者或多者调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。
在一些实施例中，供体模板在AAV载体中编码。
在一些实施例中，将DNA核酸内切酶调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。
在一些实施例中，脂质体或脂质纳米颗粒还具有gRNA。
在一些实施例中，在提供到细胞之前，DNA核酸内切酶与gRNA预复合，形成RNP复合物。
在一些实施例中，在将(c)提供到细胞之后，将(a)和(b)提供到细胞。
在一些实施例中，在将(c)提供到细胞之后约1到14天将(a)和(b)提供到细胞。
在一些实施例中，将编码(GOI)或功能衍生物的核酸序列插入到细胞的基因组序列中。
在一些实施例中，插入在细胞基因组中的白蛋白基因或白蛋白基因调节元件处、在其内或其附近。
在一些实施例中，插入在白蛋白基因的第一内含子中。
在一些实施例中，插入在基因组中的人类白蛋白基因的第一外显子的末端下游至少37bp，并且在基因组中的人类白蛋白基因的第二外显子的开始上游至少330bp。
在一些实施例中，编码(GOI)或功能衍生物的核酸序列在内源性白蛋白启动子的控制下表达。
在一些实施例中，细胞是肝细胞。
另一方面，本文提供一种治疗受试者的选自由以下组成的组的病症或健康状况的方法：血友病A、血友病B、MPS II、MPS1H、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、FXIII缺乏、FVII缺乏、FX缺乏、蛋白质C缺乏和HAE。所述方法已向受试者中的细胞提供以下各者：(a)上文所描述的gRNA中的任一者；(b)脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸；以及(c)供体模板，其具有编码目的基因(GOI)或功能衍生物的核酸序列。
在一些实施例中，受试者是患有或疑似患有选自由以下组成的组的病症或健康状况的患者：血友病A、血友病B、MPS II、MPS1H、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、FXIII缺乏、FVII缺乏、FX缺乏、蛋白质C缺乏和HAE。
在一些实施例中，受试者诊断为具有选自由以下组成的组的病症或健康状况的风险：血友病A、血友病B、MPS II、MPS1H、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、FXIII缺乏、FVII缺乏、FX缺乏、蛋白质C缺乏和HAE。
在一些实施例中，gRNA具有选自表3中所列出的那些和其与表3中所列出的那些中的任一者具有至少85％同源性的变异体的序列。
在一些实施例中，DNA核酸内切酶识别具有序列NGG或NNGG的原间隔区相邻基序(PAM)，其中N是任何核苷酸；或其功能衍生物。在一些实施例中，DNA核酸内切酶是II型Cas核酸内切酶或其功能衍生物。
在一些实施例中，DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，Cas9来自酿脓链球菌(spCas9)。在一些实施例中，Cas9来自路邓葡萄球菌(SluCas9)。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸经密码子优化。
在一些实施例中，编码GOI或其功能衍生物的核酸序列经密码子优化。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)序列。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是核糖核酸(RNA)序列。
在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的RNA序列经由共价键连接到gRNA。
在一些实施例中，将(a)、(b)和(c)中的一者或多者调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。
在一些实施例中，供体模板在AAV载体中编码。
在一些实施例中，将DNA核酸内切酶调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。
在一些实施例中，脂质体或脂质纳米颗粒还具有gRNA。
在一些实施例中，在提供到细胞之前，DNA核酸内切酶与gRNA预复合，形成RNP复合物。
在一些实施例中，在将(c)提供到细胞之后，将(a)和(b)提供到细胞。
在一些实施例中，在将(c)提供到细胞之后约1到14天将(a)和(b)提供到细胞。
在一些实施例中，将编码GOI或功能衍生物的核酸序列插入到细胞的基因组序列中。
在一些实施例中，插入在细胞基因组中的白蛋白基因或白蛋白基因调节元件处、在其内或其附近。
在一些实施例中，插入在细胞基因组中的白蛋白基因的第一内含子中。
在一些实施例中，插入在基因组中的人类白蛋白基因的第一外显子的末端下游至少37bp，并且在基因组中的人类白蛋白基因的第二外显子的开始上游至少330bp。
在一些实施例中，编码GOI或功能衍生物的核酸序列在内源性白蛋白启动子的控制下表达。
在一些实施例中，细胞是肝细胞。
在一些实施例中，编码GOI的核酸序列(如编码FVIII蛋白质或功能衍生物的核酸序列)在受试者的肝脏中表达。
另一方面，本文提供一种治疗受试者的血友病A、血友病B或HAE的方法。所述方法包括给予如本文所公开的遗传修饰的细胞。在一些实施例中，遗传修饰的细胞对受试者是自体的。在一些实施例中，所述方法包括(i)从受试者获得生物样本，其中所述生物样本包括肝细胞，其中遗传修饰的细胞由肝细胞制备。
除非从实施例或方面的上下文中明确或清楚地排除，否则本文所描述的方面和实施例中的每一者均能够一起使用。
前述概述仅仅是说明性的，并且并不旨在以任何方式作为限制。除本文中所描述的说明性实施例和特征之外，本公开的其它方面、实施例、对象和特征将从图式和实施方式以及权利要求书变得完全显而易见。
附图说明
将通过参考以下详细描述(其阐述其中利用本公开的原理的说明性实施例)和附图获得对本公开的某些特征和优点的理解，其中：
图1显示不同密码子优化的FVIII-BDD编码序列的多重比对。仅显示成熟编码序列(缺失信号肽区)。使用ClustalW算法。
图2显示DNA供体模板的非限制性示例性设计。
图3显示Hepa1-6细胞中mAlb gRNA-T1的切割效率的TIDE分析的结果。
图4显示在以不同剂量或PBS对照下使用包封Cas9 mRNA和mAlb gRNA_T1的脂质纳米颗粒(LNP)给药之后3天，小鼠的肝脏和脾脏中的插入缺失频率的结果。每组N＝5只小鼠，绘制平均值。
图5显示用于靶向整合到实例4中所使用的白蛋白内含子1中的DNA供体模板的设计。SA；剪接受体序列，LHA；左同源臂；RHA；右同源臂，pA；聚腺苷酸化信号，gRNA位点；通过gRNA靶向的Cas9核酸酶介导切割的gRNA的靶位点，δ弗林蛋白酶；FVIII、FVIII-BDD中弗林蛋白酶位点的缺失；具有B结构域缺失(BDD)的人类FVIII的编码序列，其中所述B结构域被SQ连接肽替代。
图6显示靶向来自四个供体的原代人类肝细胞中的人类白蛋白内含子1的七个候选gRNA的插入缺失频率。
图7显示用不同白蛋白向导RNA和spCas9 mRNA转染的非人类灵长类(猴)原代肝细胞中的插入缺失频率。
图8显示示例性AAV-mSEAP供体盒的示意图。
图9显示用于包装到AAV中的示例性FVIII供体盒的示意图。
图10显示在注射AAV8-pCB056，接着注射包封spCas9 mRNA和mAlbT1向导RNA的LNP之后，血友病A小鼠血液中的FVIII水平随时间的变化。
图11显示注射包封spCas9 mRNA和gRNA的LNP之后第10天和第17天的血友病A小鼠中的FVIII水平。在AAV8-pCB0056之后17天或4天给药LNP。
图12显示含有人类FVIII基因和不同聚腺苷酸化信号序列的示例性质粒供体的示意图。
图13显示在流体动力学注射具有3种不同聚A信号的质粒供体，接着注射LNP包封的Cas9mRNA和mAlbT1 gRNA之后，小鼠中FVIII活性和FVIII活性/靶向整合比率。第2、3和4组分别用pCB065、pCB076和pCB077给药。表含有第10天FVIII活性值、每一个别小鼠的靶向整合频率和FVIII活性/TI比率(比率)。
图14显示用于评估原代人类肝细胞中的靶向整合的示例性AAV供体盒的示意图。
图15显示在具有或不具有spCas9 mRNA和hALb4 gRNA的脂质体转染的情况下用AAV-DJ-SEAP病毒转导的原代人类肝细胞的培养基中的SEAP活性。测试由黑白条指示的两个细胞供体(HJK，ONR)。左侧的3对柱表示在仅用Cas9和gRNA(第一对柱)，单独以100,000MOI的AAV-DJ-pCB0107(SEAP病毒)(第二对柱)或单独以100,000MOI的AAV-DJ-pCB0156(FVIII病毒)(第三对柱)转染的细胞的对照条件下的SEAP活性。右侧的4对柱表示在各种MOI下用AAV-DJ-pCB0107(SEAP病毒)转导且用Cas9 mRNA和hAlb T4 gRNA转染的细胞的孔中的SEAP活性。
图16显示在具有或不具有spCas9 mRNA和hALb4 gRNA的脂质体转染的情况下用AAV-DJ-FVIII病毒转导的原代人类肝细胞的培养基中的FVIII活性。测试由黑白条指示的两个细胞供体(HJK，ONR)。左侧的2对柱表示在单独以100,000MOI的AAV-DJ-pCB0107(SEAP病毒)(第一对柱)或单独以100,000MOI的AAV-DJ-pCB0156(FVIII病毒)(第二对柱)转导的细胞的对照条件下的FVIII活性。右侧的4对柱表示来自在各种MOI下用AAV-DJ-pCB0156(FVIII病毒)转导且用Cas9 mRNA和hAlb T4 gRNA转染的细胞的孔的培养基中的FVIII活性。
图17A描绘含有血液凝血因子IX(F9，FIX)的密码子优化的序列的DNA模板的非限制性示例性设计。hFIX SA：hFIX剪接受体。spA+：信号肽。填充物：衍生自人类微小外围组织序列的填充片段。18：18-bp随机序列。
图17B示意性地概括图17A中所描述的供体DNA模板在白蛋白位点的第一内含子中的靶向整合效率。
图18A描绘含有人类丝氨酸蛋白酶抑制剂G1/C1抑制剂基因(SERPING1)的编码序列的DNA模板的非限制性示例性设计。图18B示意性地概括在插入到白蛋白位点的第一内含子中之后的第11天，图18A中所描述的供体DNA模板表示的SERPING1活性。
具体实施方式
本公开尤其提供用于将核酸(包括DNA和RNA)靶向递送到靶细胞(例如哺乳动物细胞(例如人类细胞))的基因组中的特定位置(例如安全港位点)的组合物、方法和系统。转基因的位点特异性递送是随机整合的有利替代方案，因为其允许减轻插入型诱变的风险。本公开的一些方面和实施例涉及通过基因组编辑用于以靶向方式表达整合到细胞的基因组中的转基因的组合物、方法和系统。在一些实施例中，转基因可插入到基因组中的特定安全港位置中，所述基因组可以利用在所述安全港位点处发现的启动子，或允许转基因通过在插入之前融合到转基因的外源性启动子的表达调节。在一些实施例中，目的转基因以靶向方式在白蛋白基因的第一内含子附近或内整合。原则上，不存在待递送到安全港位点的转基因的特定限制。一些特定方面和实施例涉及基因组编辑以表达目的治疗性蛋白质的系统、组合物和方法，所述治疗性蛋白质如凝血蛋白质FIX和C1抑制剂(C1INH)，其被整合到用作靶细胞的基因组中的特定安全港位点的内源性白蛋白位点内或附近的基因组位置。本公开还尤其提供用于治疗患有或疑似患有病症或健康状况(例如血友病B或遗传性血管性水肿(HAE))的受试者的系统、组合物和方法，其包括用于治疗病症或健康状况的系统，以及用于制造用于治疗病症或健康状况的药剂的系统。
定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语皆具有与所要求的主题所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。应理解，详细描述仅是示例性和解释性的，并且不限制所要求的任何主题。在本申请中，除非另外具体陈述，否则单数的使用包括复数。必须指出，除非上下文另外明确规定，否则如说明书中所使用，单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”等其它形式的使用不具限制性。
尽管可在单一实施例的上下文中描述本公开的各种特征，但所述特征还可单独地或以任何合适的组合提供。相反地，尽管为了清楚起见，可在独立实施例的上下文中描述本公开，但本公开还可在单一实施例中实施。本文所引用的任何公布的专利申请和任何其它公布的参考文献、文档、手册和科学文献出于任何目的通过引用的方式并入本文中。在冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的并且并不意欲是限制性的。
如本文中所使用，范围和量可以表达为“约”某个特定的值或范围。约也包括准确的量。因此，“约5μL”意指“约5μL”，并且还指“5μL”。通常，术语“约”包括预期在实验误差之内的量，如±10％。
当本文中呈现数值范围时，经考虑，在所述范围的下限与上限之间的每个中间值、作为所述范围的上限和下限的值，以及在所述范围内的所有所陈述值都涵盖于本公开内。本公开还设想了所述范围的下限和上限内的所有可能的子范围。
术语“多肽”、“多肽序列”、“肽”、“肽序列”、“蛋白质”、“蛋白质序列”和“氨基酸序列”在本文中可互换使用，以表示通过肽键彼此连接的线性氨基酸残基系列，所述系列可包括蛋白质、多肽、寡肽、肽和其片段。蛋白质可由天然存在的氨基酸和/或合成(例如经修饰或非天然存在的)氨基酸组成。因此，如本文所使用，“氨基酸”或“肽残基”意指天然存在和合成氨基酸两者。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括融合蛋白，包括(但不限于)具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合体，具有或不具有N末端甲硫氨酸残基；免疫标记的蛋白质；具有可检测的融合伴侣的融合蛋白，例如包括荧光蛋白，β-半乳糖苷酶，荧光素酶等作为融合伴侣的融合蛋白。此外，应注意，在氨基酸序列的开始或结束时的破折号指示到一个或多个氨基酸残基的另一序列的肽键或到羧基或羟基端基的共价键。然而，不存在破折号不应被认为是指不存在与羧基或羟基端基的此类肽键或共价键，因为在氨基酸序列的表示中省略此类肽键或共价键是常规的。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“寡核苷酸”、“寡核苷酸序列”、“寡聚物”、“寡核苷酸”、“核酸序列”或“核苷酸序列”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，此术语包括(但不限于)：单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体，或具有嘌呤碱基和嘧啶碱基或其它天然、经化学方式或生物化学方式修饰的、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
术语“衍生物”和“变异体”是指(不限于)如核酸或蛋白质的任何化合物，其具有衍生自本文所公开的化合物的结构或序列并且其结构或序列与本文所公开的那些足够相似以使其具有相同或相似的活性和效用，或基于此类相似性，所属领域的技术人员将期望展现出与所引用的化合物相同或相似的活性和效用，从而也可互换地称为“功能上等效”或“功能等效物”。获得“衍生物”或“异体”的修饰可包括，例如，一个或多个核酸或氨基酸残基的添加、缺失和/或取代。
在蛋白质的背景下，功能等效物或功能等效物的片段可具有一个或多个保守氨基酸取代。术语“保守氨基酸取代”是指将一个氨基酸取代为具有与原始氨基酸相似特性的另一氨基酸。保守氨基酸的基团如下：
基团 氨基酸名称
脂肪族 Gly、Ala、Val、Leu、Ile
羟基或巯基/含硒 Ser、Cys、Thr、Met
环状 Pro
芳香族 Phe、Tyr、Trp
碱性 His、Lys、Arg
酸和其酰胺 Asp、Glu、Asn、Gln
可在优选的预定肽或其片段的任何位置中引入保守取代。然而，可能需要引入非保守取代，确切地说，但不限于，在任何一个或多个位置中的非保守取代。产生肽的功能等效片段的形成的非保守取代将例如在极性、电荷和/或空间容积方面基本上不同，同时维持衍生物或变异体片段的功能性。
通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定“序列一致性百分比”，其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列部分与参考序列(不具有添加或缺失)相比可具有添加或缺失(即空位)以使两个序列达到最佳比对。在一些情况下，百分比可以通过以下计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口中的总位置数并且将结果乘以100以得到序列一致性百分比。
在两种或更多种核酸或多肽序列的背景中，术语“一致”或“一致性”百分比是指在比较窗口或使用以下序列比较算法之一或通过人工比对和目视检查测量的指定区域上根据最大一致性进行比较和比对时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，例如多肽的完整多肽序列或个别域在指定区域上的60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性)。此类序列然后被称为“基本上一致”。此定义也指测试序列的补体。
本文可互换使用的术语“互补的”或“基本上互补的”意指核酸(例如DNA或RNA)具有使其能够非共价结合的核苷酸序列，即以序列特异性、反平行方式(即，核酸与互补核酸特异性结合)形成与另一个核酸的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对和/或G/U碱基对。如所属领域已知的，标准的沃森-克里克碱基对包括：腺嘌呤(A)与胸苷(T)配对，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对，以及鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。
“编码”特定RNA的DNA序列是DNA核酸序列，当置于适当的调节序列的控制之下时，其转录成RNA。DNA多核苷酸可编码被翻译成蛋白质的RNA(mRNA)，或DNA多核苷酸可编码未被翻译成蛋白质的RNA(例如tRNA、rRNA或向导RNA；也称为“非编码”RNA或“ncRNA”)。蛋白质编码序列或编码特定蛋白质或多肽的序列是核酸序列，其转录成mRNA(在DNA的情况下)且当置于适当的调节序列的控制下时体外或体内翻译(在mRNA的情况下)到多肽中。
如本文所使用，“密码子”是指一起形成DNA或RNA分子中的遗传密码的单元的三个核苷酸的序列。如本文所使用，术语“密码子简并”是指遗传密码中的性质，其允许核苷酸序列的变化而不影响经编码的多肽的氨基酸序列。
术语“密码子优化的”或“密码子优化”是指用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区，是指核酸分子的基因或编码区中的密码子改变以反映宿主生物的典型密码子使用而不改变DNA编码的多肽。此类优化包括用在所述生物的基因中更频繁使用的一个或多个密码子替代至少一个，或多于一个或相当大数目的密码子。密码子使用表可轻易地(例如)在www.kazusa.or.jp/codon/(2008年3月20日访问)在“密码子使用数据库”中获得。通过利用对每个生物体中的密码子使用或密码子偏好的了解，所属领域的普通技术人员可以将频率应用到任何给定多肽序列，并且产生编码多肽的密码子优化的编码区的核酸片段，但其使用对于给定物种最佳的密码子。经密码子优化的编码区可以通过所属领域的技术人员已知的各种方法来设计。
当涉及例如细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”或“被工程改造的”表明所述细胞、核酸、蛋白质或载体已被修饰或为实验室方法的结果。因此，例如，重组或被工程改造的蛋白质包括通过实验室方法产生的蛋白质。重组或被工程改造的蛋白质可以包括天然(非重组或野生型)形式的蛋白质内未发现的氨基酸残基，或可以包括已被修饰(例如标记)的氨基酸残基。术语可以包括对肽、蛋白质或核酸序列的任何修饰。此类修饰可包括以下：肽、蛋白质或核酸序列的任何化学修饰，包括一个或多个氨基酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的化学修饰；肽或蛋白质中一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代；以及核酸序列中一个或多个核酸的添加，缺失和/或取代。
术语“基因组DNA”或“基因组序列”是指生物的基因组的DNA，包括(但不限于)细菌、真菌、古细菌、植物或动物的基因组的DNA。
如本文所使用，在核酸的背景下，“转基因”、“外源性基因”或“外源性序列”是指不存在于细胞基因组中但被人工引入基因组中的核酸序列或基因，例如通过基因组编辑。
如本文所使用，在核酸的背景下，“内源性基因”或“内源性序列”是指天然存在于细胞基因组中而没有通过任何人工手段引入的核酸序列或基因。
术语“载体”或“表达载体”意指另一个DNA区段(即“插入”)可附接的复制子，如质粒、噬菌体、病毒或粘质体，以便使所附接的区段在细胞中复制。
术语“表达盒”是指具有与启动子可操作地连接的DNA编码序列的载体。“可操作地连接”是指其中所描述的组分处于允许其以其预期方式起作用的关系的并置。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子可操作地连接到编码序列。术语“重组表达载体”或“DNA构建体”在本文中可互换使用，是指具有载体和至少一个插入物的DNA分子。重组表达载体通常出于表达和/或扩增插入物的目的或用于构建其它重组核苷酸序列而产生。核酸可或可不可操作地连接到启动子序列，并且可或可不可操作地连接到DNA调节序列。
术语“可操作地连接”意指目的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式连接到调节序列。术语“调节序列”意欲包括例如启动子、增强子以及其它表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调节序列是所属领域所熟知的并且描述于例如以下中：Goeddel；《基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)》185,学术出版社(Academic Press),圣地亚哥,加利福尼亚州(1990)。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中直接组成型表达核苷酸序列的调节序列和仅在某些宿主细胞中直接表达核苷酸序列的调节序列(例如，组织特异性调节序列)。所属领域的技术人员应了解，表达载体的设计可以取决于如靶细胞的选择、期望的表达水平等因素。
当此类DNA已经引入到细胞内部时，细胞已经由外源性DNA(例如重组表达载体)“遗传修饰”或“转化”或“转染”。外源性DNA的存在导致永久或瞬时的遗传变化。转化DNA可或可以不整合(共价连接)到细胞的基因组中。可以使用具有治疗活性的遗传修饰(或经转化或经转染)细胞，例如治疗血友病A，并且被称为治疗性细胞。
在分子(例如肽片段)的背景下使用的术语“浓度”是指在给定体积的溶液中存在的分子量，例如分子的摩尔数。
术语“个体”、“受试者”和“宿主”在本文中可互换使用，并且是指期望进行诊断、治疗或疗法的任何受试者。在一些方面，受试者是哺乳动物。在一些方面，受试者是人类。在一些方面，受试者是患者。在一些方面，受试者是人类患者。在一些方面，受试者可能患有或怀疑患有与目的基因(GOI)相关的病症或健康状况。在一些方面，受试者可能患有或怀疑患有血友病A和/或患有血友病A的一种或多种症状。在一些方面，受试者是在诊断时或稍后诊断为具有与GOI相关的病症或健康状况的风险的人类。在一些方面，受试者是在诊断时或稍后诊断为具有血友病A的风险的人类。在一些情况下，可以基于基因组中内源性GOI或接近可能影响GOI表达的GOI的基因组序列中的一个或多个突变的存在来确定具有与GOI相关的病症或健康状况的风险的诊断。
用于指代疾病或病况的术语“治疗”意指至少实现与困扰个体的病况相关的症状的改善，其中改善以广泛意义使用以指至少与所治疗的病况(例如血友病A)相关的参数(例如症状)的量值的减少。如此，治疗还包括其中病理病况或至少与其相关的症状被完全抑制，例如，预防发生，或完全消除，使得宿主不再患有病况，或至少表征病况的症状。因此，治疗包括：(i)预防，也就是说，降低临床症状发展的风险，包括使临床症状不发展，例如预防疾病进展；(ii)抑制，也就是说，遏制临床症状发展或进一步发展，例如减轻或完全抑制活性疾病。
如本文所使用的术语“有效量”、“药学上有效量”，或“治疗有效量”意指当向患有特定病况的受试者给予时足以提供所需效用的组合物的量。在离体治疗血友病A的背景下，术语“有效量”是指预防或减轻血友病A的至少一种或多种病征或症状所需的治疗性细胞群体或其后代的量，并且涉及具有治疗性细胞或其后代的足够量的组合物以提供所需效果，例如以治疗受试者的血友病A的症状。因此，术语“治疗有效量”是指当向需要治疗的受试者(例如患有血友病A或处于血友病A风险中的受试者)给予时，足以促进特定效果的治疗性细胞或具有治疗性细胞的组合物的量。有效量还包括足以预防或延迟疾病症状发展，改变疾病症状进程的量(例如但不限于，减慢疾病症状的进展))，或逆转疾病症状。在受试者(例如患者)中体内治疗血友病A的或体外培养的细胞中进行的基因组编辑的背景下，有效量是指用于编辑受试者中细胞基因组或体外培养的细胞所需的基因组编辑，如gRNA、供体模板和/或定点多肽(例如DNA核酸内切酶)的组分的量。应理解，对于任何给定情况，可以使用常规实验由所属领域的技术人员确定适当的“有效量”。
如本文所使用的术语“药学上可接受的赋形剂”是指提供药学上可接受的载剂、添加剂或稀释剂以向受试者给予目的化合物的任何合适的物质。“药学上可接受的赋形剂”可以涵盖被称作药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的添加剂和药学上可接受的载剂的物质。
基因组编辑系统
在一个方面，本文提供用于通过基因组编辑在细胞中表达目的基因(GOI)的组合物、方法和系统。在一些实施例中，所提供的组合物、方法和系统用于将GOI敲入基因组中的特定安全港位置中，确切地说，敲入内源性白蛋白位点内或附近的基因组位置中。一般来说，所属领域的技术人员将理解，安全港位点是可以用于整合外源性核酸的基因组内的位置，其中将外源性核酸添加到安全港位点中不会通过单独添加核酸对宿主细胞的生长造成显著影响。在一些实施例中，转基因可插入到基因组中的特定安全港位置中，所述基因组可以利用在所述安全港位点处发现的启动子，或允许转基因通过在插入之前融合到GOI编码序列的外源性启动子的表达调节。在一些实施例中，目的GOI以靶向方式在白蛋白基因的第一内含子附近或内整合。
原则上，不存在待递送到安全港位点的转基因的特定限制。在一些实施例中，GOI编码选自由以下组成的组的多肽：治疗性多肽和预防性多肽。在一些实施例中，GOI编码选自由以下组成的组的蛋白质：FVIII蛋白质、因子IX蛋白质、α-1-抗胰蛋白酶、FXIII蛋白质、FVII蛋白质、FX蛋白质、蛋白质C其任一者的功能衍生物。一些特定实施例涉及通过基因组编辑来编辑以调节细胞中的凝血蛋白质(如FVIII)的表达、功能或活性的组合物和方法。本公开还尤其提供用于离体和体内治疗患有或疑似患有与前述蛋白质中的一种或多种相关的病症或健康状况的患者的组合物和方法。在一些实施例中，患者是患有或疑似患有选自由以下组成的组的病症或健康状况的患者：血友病A、血友病B、MPS II、MPS1H、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、FXIII缺乏、FVII缺乏、FX缺乏、蛋白质C缺乏和HAE。在一些实施例中，患者是患有血友病A的患者。在一些实施例中，患者是患有血友病B的患者。在一些实施例中，患者是患有HAE的患者。
血友病A(Hem A)和因子VIII
血友病A(HemA)是由FVIII基因中导致血液中FVIII蛋白质水平低或不可检测的遗传缺陷引起的。此导致组织损伤部位处的低效凝块形成，造成不受控的出血，如果未处理，那么其可能是致命的。缺失FVIII蛋白质的替代是对HemA患者的有效治疗并且是目前的护理标准。然而，蛋白质替代疗法需要频繁静脉内注射FVIII蛋白质，这在成人中是不方便的，在儿童中是成问题的，成本过高(>$200,000/年)，并且如果没有密切地遵循治疗方案，那么可能导致突破性出血事件。
FVIII基因主要在存在于肝脏中的窦内皮细胞以及身体中的其它部位中表达。外源性FVIII可以在循环中从产生FVIII的肝脏的肝细胞中表达并且分泌，并且因此影响疾病的治愈。已开发靶向肝脏的肝细胞的基因递送方法，并且这些基因递送方法因此已用于递送FVIII基因作为动物模型中和临床试验患者中的HemA的治疗。
对于血友病A的永久性固化是非常合乎需要的。虽然使用AAV的传统的基于病毒的基因疗法可能在临床前动物模型和患者中显示前景，但其具有许多劣势。基于AAV的基因疗法使用由包封于AAV病毒衣壳内部的肝脏特异性启动子驱动的FVIII基因(尤其通常使用血清型AAV5、AAV8或AAV9或AAVrh10)。用于基因疗法的所有AAV病毒将包装的基因盒递送到转导细胞的细胞核中，其中基因盒几乎完全地保持游离型，并且其是产生治疗性蛋白质的治疗性基因的游离型复本。AAV不具有将其包封的DNA整合到宿主细胞的基因组中的机构，而是维持为附加体，因此当宿主细胞分裂时不被复制。游离型DNA还可以随时间的流逝而降解。已证实，当诱导含有AAV附加体的肝细胞分裂时，AAV基因组不会被复制而是被稀释。结果，当给予其肝脏尚未达到成年大小的儿童时，基于AAV的基因疗法预期是无效的。此外，目前尚不知道当给成人使用基于AAV的基因疗法会持续多长时间，尽管动物数据已表明长达10年的周期内治疗效果仅有很小的损失。因此，迫切需要开发针对HemA的新的有效和渗透性治疗。
血友病B(Hem B)和因子IX
血友病B是由凝血因子IX(FIX)缺乏或功能异常引起的遗传性出血病症。在没有足够因子IX的情况下，血液无法恰当地堵塞以控制出血。在被诊断患有病症的第一人之后，其最初命名为“圣诞病(Christmas disease)”。所有种族和经济群体都受此病症的影响。血友病B是一种X连锁隐性病症，通常在男性中表现出来，并且由在X染色体上携带致病突变的女性传播。血友病B由FIX基因中的多种缺陷引起。血友病B是第二最常见类型的血友病，其中FVIII缺乏(血友病A)比FIX缺乏低4到6倍。
基于受影响的个体中的因子IX的血浆水平，通常将血友病B分为重度、中度或轻度(分别<1％、2-5％、6-30％)。已鉴别出多个潜在突变并且与不同水平的临床严重程度相关。因子IX缺乏引起出血的可能性增加，其可以自发地或响应于轻度创伤。因子IX缺乏可以引起凝结级联的干扰，从而在发生创伤时引起自发性出血。因子IX活化后会活化因子X，后者有助于纤维蛋白原向纤维蛋白的转化。目前，可以通过多种已知技术和方法，包括凝结筛选测试、出血评分和凝血因子分析来进行针对血友病B的诊断。
遗传性血管性水肿(HAE)和SERPING1
遗传血管性水肿(HAE)是一种遗传病症，主要由编码C1抑制剂(C1INH)的SERPING1基因中的突变引起，所述C1抑制剂是导致血浆缺乏的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)，导致反复发作的严重肿胀。存在三种主要类型的HAE。I型和II型是由SERPING1基因中的突变引起的，所述突变使得C1抑制剂蛋白质产生，而III型通常归因于因子XII基因的突变。此导致缓激肽的量增加，从而促进肿胀。所述病况可以常染色体显性方式从一个人的父母那里继承，或以新的突变形式出现。发作的诱因可包括一般创伤或应力，但通常在无任何明显的前述事件的情况下发生。
遗传血管性水肿影响大约50,000人中的一人。这种病症通常在儿童时期首先被发现。I型和II型对女性和男性的影响均相同。III型对女性的影响大于男性。当涉及气道时，在不进行治疗的情况下，则约有25％会发生死亡。目前，可以通过多种已知技术和方法，包括基于测量血清补体因子4(C4)和C1抑制剂(C1-INH)水平的那些技术和方法来进行I型和II型诊断。举例来说，可以使用血液测试通过以下测量中的一种或多种来诊断病症：血清补体因子2和4(C2和C4)、C1抑制剂(C1-INH)抗原蛋白质、C1抑制剂(C1-INH)功能水平。
在一些实施例中，本文提供用于基因组编辑，确切地说，用于将编码目的基因(GOI)的核酸序列插入到细胞的基因组中的系统。这些系统可以用于本文所描述的方法中，例如用于编辑细胞的基因组并且用于治疗受试者，例如患有与GOI相关的健康状况或病症的患者。在一些实施例中，GOI可以编码多肽的氨基酸序列。一般来说，关于经编码的多肽的大小或生物活性或功能性不存在特定限制。因此，经编码的多肽可以是任何多肽，并且可以是例如治疗性多肽、预防性多肽、诊断性多肽和保健品多肽。在一些实施例中，GOI编码选自由以下组成的组的蛋白质：FVIII蛋白质、因子IX蛋白质、α-1-抗胰蛋白酶、FXIII蛋白质、FVII蛋白质、FX蛋白质、蛋白质C其任一者的功能衍生物。在一些实施例中，本文所公开的系统可以用于本文所描述的方法中，如用于编辑细胞的基因组并且用于离体和体内治疗患有或疑似患有与前述蛋白质中的一种或多种相关的病症或健康状况的患者。在一些实施例中，患者是患有或疑似患有选自由以下组成的组的病症或健康状况的患者：血友病A、血友病B、MPS II、MPS1H、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、FXIII缺乏、FVII缺乏、FX缺乏、蛋白质C缺乏和HAE。在一些实施例中，患者是患有血友病A的患者。在一些实施例中，患者是患有血友病B的患者。在一些实施例中，患者是患有HAE的患者。
在一些实施例中，本文提供一种系统，其包含(a)脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸；(b)向导RNA(gRNA)，其包含来自SEQ ID NO:18-44和104中的任一者的间隔序列，或编码gRNA的核酸；和(c)供体模板，其包含编码目的基因(例如FVIII、FIX或SERPING1)的核酸序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21、22、28和30中的任一者的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:22的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ IDNO:28的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:30的间隔序列。
在一些实施例中，本文提供一种系统，其包含(a)脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸；(b)包含来自SEQ ID NO:18-44和104中的任一者的间隔序列的向导RNA(gRNA)，或编码gRNA的核酸；和(c)供体模板，其包含编码FVIII基因的核酸序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21、22、28和30中的任一者的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ IDNO:22的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:28的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:30的间隔序列。
在一些实施例中，本文提供一种系统，其包含(a)脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸；(b)包含来自SEQ ID NO:18-44和104中的任一者的间隔序列的向导RNA(gRNA)，或编码gRNA的核酸；和(c)供体模板，其包含编码FIX基因的核酸序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21、22、28和30中的任一者的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ IDNO:22的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:28的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:30的间隔序列。
在一些实施例中，本文提供一种系统，其包含(a)脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸；(b)包含来自SEQ ID NO:18-44和104中的任一者的间隔序列的向导RNA(gRNA)，或编码gRNA的核酸；和(c)供体模板，其包含编码SERPING1基因的核酸序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21、22、28和30中的任一者的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQID NO:22的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:28的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:30的间隔序列。
在一些实施例中，根据本文所描述的系统中的任一个，其包含DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸，DNA核酸内切酶是Cas核酸内切酶。在一些实施例中，Cas核酸内切酶识别具有序列NGG或NNGG的原间隔区相邻基序(PAM)，其中N是任何核苷酸。在一些实施例中，Cas核酸内切酶是II型Cas核酸内切酶。在一些实施例中，Cas核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。在一些实施例中，Cas9核酸内切酶来自酿脓链球菌(SpyCas9)。例如，在一些实施例中，Cas9包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少75％序列一致性的变异体。在一些实施例中，Cas9核酸内切酶来自路邓葡萄球菌(SluCas9)。例如，在一些实施例中，Cas9包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列或其与SEQ IDNO:111的氨基酸序列具有至少75％序列一致性的变异体。
在一些实施例中，根据本文所描述的系统中的任一个，其包含DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸，DNA核酸内切酶是包含衍生自不同Cas核酸内切酶的两个或更多个部分的被工程改造的核酸内切酶。在一些实施例中，被工程改造的核酸内切酶识别具有序列NGG或NNGG的原间隔区相邻基序(PAM)，其中N是任何核苷酸。在一些实施例中，不同Cas核酸内切酶是II型Cas核酸内切酶。在一些实施例中，不同Cas核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。在一些实施例中，被工程改造的核酸内切酶包含来自酿脓链球菌Cas9(SpyCas9)的PAM相互作用域(PID)。在一些实施例中，被工程改造的核酸内切酶包含来自路邓葡萄球菌Cas9(SluCas9)的PID。
在一些实施例中，根据本文所描述的系统中的任一个，DNA核酸内切酶识别具有序列NGG或NNGG的原间隔区相邻基序(PAM)，其中N是任何核苷酸或其功能衍生物。在一些实施例中，DNA核酸内切酶是II型Cas核酸内切酶或其功能衍生物。在一些实施例中，DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，Cas9来自酿脓链球菌(spCas9)。在一些实施例中，Cas9来自路邓葡萄球菌(SluCas9)。
在一些实施例中，根据本文所描述的系统中的任一个，编码其目的基因的核酸序列经密码子优化以用于在宿主细胞中表达。在一些实施例中，编码目的基因的核酸序列经密码子优化以用于在人类细胞中表达。
在一些实施例中，根据本文所描述的系统中的任一个，所述系统包含编码DNA核酸内切酶的核酸。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸经密码子优化以用于在宿主细胞中表达。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸经密码子优化以用于在人类细胞中表达。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是DNA，如DNA质粒。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是RNA，如mRNA。
在一些实施例中，根据本文所描述的系统中的任一个，供体模板在AAV载体中编码。在一些实施例中，供体模板包含供体盒，所述供体盒包含编码GOI的核酸序列，并且供体盒的一侧或两侧上侧接gRNA靶位点。在一些实施例中，供体盒的两侧上侧接gRNA靶位点。在一些实施例中，gRNA靶位点是系统中的gRNA的靶位点。在一些实施例中，供体模板的gRNA靶位点是系统中的gRNA的细胞基因组gRNA靶位点的反向补体。
在一些实施例中，根据本文所描述的系统中的任一个，将DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施例中，脂质体或脂质纳米颗粒还包含gRNA。在一些实施例中，脂质体或脂质纳米颗粒是脂质纳米颗粒。在一些实施例中，所述系统包含脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含编码DNA核酸内切酶的核酸和gRNA。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是编码DNA核酸内切酶的mRNA。
在一些实施例中，根据本文所描述的系统中的任一个，DNA核酸内切酶与gRNA复合，形成RNP复合物。
核酸
基因组靶向核酸或向导RNA
本公开提供一种基因组靶向核酸，其可以将相关多肽(例如，定点多肽或DNA核酸内切酶)的活性引导到靶核酸内的特异性靶序列。在一些实施例中，基因组靶向核酸是RNA。基因组靶向RNA在本文中被称作“向导RNA”或“gRNA”。向导RNA具有至少与目的靶核酸序列杂交的间隔序列和CRISPR重复序列。在II型系统中，gRNA还具有被称作tracrRNA序列的第二RNA。在II型向导RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交以形成双链体。在V型向导RNA(gRNA)中，crRNA形成双链体。在这两种系统中，双链体结合定点多肽，使得向导RNA和定点多肽形成复合物。基因组靶向核酸借助于其与定点多肽的缔合而对复合物提供目标特异性。基因组靶向核酸因此引导定点多肽的活性。
在一些实施例中，基因组靶向核酸是双分子向导RNA。在一些实施例中，基因组靶向核酸是单分子向导RNA。双分子向导RNA具有两股RNA。所述第一股在5'到3'方向上具有任选的间隔区扩展序列、间隔序列和最小CRISPR重复序列。第二股具有最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3'tracrRNA序列和任选的tracrRNA扩展序列。II型系统中的单分子向导RNA(sgRNA)在5'到3'方向上具有任选的间隔区扩展序列、间隔序列、最小CRISPR重复序列、单分子向导连接子、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列和任选的tracrRNA扩展序列。任选的tracrRNA扩展可具有对向导RNA的额外功能性(例如稳定性)有帮助的元件。单分子向导连接子连接最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列以形成发夹结构。任选的tracrRNA扩展具有一个或多个发夹。V型系统中的单分子向导RNA(sgRNA)在5'到3'方向上具有最小CRISPR重复序列和间隔序列。
通过说明的方式，用于CRISPR/Cas/Cpf1系统中的向导RNA或其它较小RNA可以通过如下文所说明且在所属领域中描述的化学方式轻易地合成。虽然化学合成程序不断扩展，但是在多核苷酸长度显著增加超过一百个核苷酸左右时，通过如高效液相色谱法(HPLC，其避免了使用如PAGE等凝胶)等程序来纯化此类RNA往往变得更具挑战性。用于生成更大长度的RNA的一种方式是产生连接在一起的两个或更多个分子。如编码Cas9或Cpf1核酸内切酶的那些长得多的RNA更容易通过酶生成。可以在化学合成和/或酶生成RNA期间或之后引入各种类型的RNA修饰，例如增强稳定性、降低先天性免疫反应的可能性或程度和/或增强其它属性的修饰，如所属领域中所描述。
间隔区扩展序列
在基因组靶向核酸的一些实施例中，间隔区扩展序列可以修饰活性、提供稳定性和/或提供修饰基因组靶向核酸的位置。间隔区扩展序列可以修饰中靶或脱靶活性或特异性。在一些实施例中，提供间隔区扩展序列。间隔区扩展序列的长度可以大于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000或7000个或更多个核苷酸。间隔区扩展序列的长度可以为约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000或7000个或更多个核苷酸。间隔区扩展序列的长度可以小于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000或7000个或更多个核苷酸。在一些实施例中，间隔区扩展序列的长度小于10个核苷酸。在一些实施例中，间隔区扩展序列的长度在10-30个核苷酸之间。在一些实施例中，间隔区扩展序列的长度在30-70个核苷酸之间。
在一些实施例中，间隔区扩展序列具有另一部分(例如稳定性控制序列、核糖核酸内切酶结合序列、核酶)。在一些实施例中，所述部分降低或增加核酸靶向核酸的稳定性。在一些实施例中，所述部分是转录终止子片段(即转录终止序列)。在一些实施例中，所述部分在真核细胞中起作用。在一些实施例中，所述部分在原核细胞中起作用。在一些实施例中，所述部分在真核细胞和原核细胞两者中均起作用。合适的部分的非限制性实例包括：5'帽(例如，7-甲基鸟苷酸帽(m7 G))、核糖开关序列(例如，用于允许通过蛋白质和蛋白复合物来调节稳定性和/或调节可达性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、使RNA靶向亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的序列、提供跟踪的修饰或序列(例如，到与荧光分子的直接缀合、与促进荧光检测的部分的缀合、允许荧光检测的序列等)，和/或为蛋白质(例如，作用于DNA上的蛋白质，包括转录激活子、转录抑制子、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰基转移酶、组蛋白脱乙酰基酶等)提供结合位点的修饰或序列。
间隔序列
间隔序列与目的靶核酸中的序列杂交。基因组靶向核酸的间隔区经由杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。间隔区的核苷酸序列因此取决于目的靶核酸的序列而变化。
在本文的CRISPR/Cas系统中，间隔序列被设计成与位于系统中所使用的Cas9酶的PAM的5'处的靶核酸杂交。间隔区可以与靶序列完全匹配或不匹配。每一Cas9酶具有其在目标DNA中识别的特定PAM序列。例如，酿脓链球菌在靶核酸中识别具有序列5'-NRG-3'的PAM，其中R具有A或G，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由间隔序列靶向的靶核酸序列的3'。
在一些实施例中，靶核酸序列具有20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸具有小于20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸具有超过20个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸具有至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸具有至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。在一些实施例中，靶核酸序列具有紧邻PAM的第一核苷酸的5'的20个碱基。例如，在具有5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3'的序列(SEQ ID NO：100)中，靶核酸具有与Ns相对应的序列，其中N是任何核苷酸，并且带下划线的NRG序列(R是G或A)是酿脓链球菌Cas9 PAM。在一些实施例中，本公开的组合物和方法中所使用的PAM序列是由S.p.识别的序列。Cas9是NGG。
在一些实施例中，与靶核酸杂交的间隔序列具有至少约6个核苷酸(nt)的长度。间隔序列可以是至少约6nt、约10nt、约15nt、约18nt、约19nt、约20nt、约25nt、约30nt、约35nt或约40nt、约6nt到约80nt、约6nt到约50nt、约6nt到约45nt、约6nt到约40nt、约6nt到约35nt、约6nt到约30nt、约6nt到约25nt、约6nt到约20nt、约6nt到约19nt、约10nt到约50nt、约10nt到约45nt、约10nt到约40nt、约10nt到约35nt、约10nt到约30nt、约10nt到约25nt、约10nt到约20nt、约10nt到约19nt、约19nt到约25nt、约19nt到约30nt、约19nt到约35nt、约19nt到约40nt、约19nt到约45nt、约19nt到约50nt、约19nt到约60nt、约20nt到约25nt、约20nt到约30nt、约20nt到约35nt、约20nt到约40nt、约20nt到约45nt、约20nt到约50nt、或约20nt到约60nt。在一些实施例中，间隔序列具有20个核苷酸。在一些实施例中，间隔区具有19个核苷酸。在一些实施例中，间隔区具有18个核苷酸。在一些实施例中，间隔区具有17个核苷酸。在一些实施例中，间隔区具有16个核苷酸。在一些实施例中，间隔区具有15个核苷酸。
在一些实施例中，间隔序列与靶核酸之间的互补性百分比是至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。在一些实施例中，间隔序列与靶核酸之间的互补性百分比是至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约97％、至多约98％、至多约99％或100％.在一些实施例中，在靶核酸的互补链的靶序列的六个连续的最靠近5'的核苷酸内，间隔序列与靶核酸之间的互补性百分比是100％。在一些实施例中，在约20个连续核苷酸内，间隔序列与靶核酸之间的互补性百分比是至少60％。在一些实施例中，间隔序列和靶核酸的长度可以相差1到6个核苷酸，这可以被认为是一个或多个凸起。
在一些实施例中，间隔序列使用计算机程序设计或选择。计算机程序可以使用如以下等变量：预测的熔融温度、二级结构形成、预测的退火温度、序列一致性、基因组背景、染色质可达性、GC％、基因组出现频率(例如，完全相同或类似但由于错配、插入或缺失而在一个或多个斑点上有所不同的序列的基因组出现频率)、甲基化状态、SNP的存在等。
最小CRISPR重复序列
在一些实施例中，最小CRISPR重复序列是与参考CRISPR重复序列(例如，来自酿脓链球菌的crRNA)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％序列一致性的序列。
在一些实施例中，最小CRISPR重复序列具有可以与细胞中的最小tracrRNA序列杂交的核苷酸。最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列形成双链体，即，碱基对双链结构。最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列可以一起与定点多肽结合。最小CRISPR重复序列的至少一部分与最小tracrRNA序列杂交。在一些实施例中，最小CRISPR重复序列的至少一部分与最小tracrRNA序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％互补。在一些实施例中，最小CRISPR重复序列的至少一部分与最小tracrRNA序列至多约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％互补。
最小CRISPR重复序列可以具有约7个核苷酸到约100个核苷酸的长度。例如，最小CRISPR重复序列的长度是约7个核苷酸(nt)到约50nt、约7nt到约40nt、约7nt到约30nt、约7nt到约25nt、约7nt到约20nt、约7nt到约15nt、约8nt到约40nt、约8nt到约30nt、约8nt到约25nt、约8nt到约20nt、约8nt到约15nt、约15nt到约100nt、约15nt到约80nt、约15nt到约50nt、约15nt到约40nt、约15nt到约30nt或约15nt到约25nt。在一些实施例中，最小CRISPR重复序列的长度是大约9个核苷酸。在一些实施例中，最小CRISPR重复序列的长度是大约12个核苷酸。
在一些实施例中，在一段至少6、7或8个连续核苷酸内，最小CRISPR重复序列与参考最小CRISPR重复序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型crRNA)至少约60％一致。例如，在一段至少6个、7个或8个连续核苷酸内，最小CRISPR重复序列与参考最小CRISPR重复序列至少约65％一致、至少约70％一致、至少约75％一致、至少约80％一致、至少约85％一致、至少约90％一致、至少约95％一致、至少约98％一致、至少约99％一致或100％一致。
最小tracrRNA序列
在一些实施例中，最小tracrRNA序列是与参考tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型tracrRNA)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％序列一致性的序列。
在一些实施例中，最小tracrRNA序列具有与细胞中的最小CRISPR重复序列杂交的核苷酸。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复序列形成双链体，即，碱基配对双链结构。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复可以一起与定点多肽结合。最小tracrRNA序列的至少一部分可以与最小CRISPR重复序列杂交。在一些实施例中，最小tracrRNA序列与最小CRISPR重复序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％互补。
最小tracrRNA序列的长度可以为约7个核苷酸到约100个核苷酸。例如，最小tracrRNA序列的长度可以为约7个核苷酸(nt)到约50nt、约7nt到约40nt、约7nt到约30nt、约7nt到约25nt、约7nt到约20nt、约7nt到约15nt、约8nt到约40nt、约8nt到约30nt、约8nt到约25nt、约8nt到约20nt、约8nt到约15nt、约15nt到约100nt、约15nt到约80nt、约15nt到约50nt、约15nt到约40nt、约15nt到约30nt或约15nt到约25nt。在一些实施例中，最小tracrRNA序列的长度是大约9个核苷酸。在一些实施例中，最小tracrRNA序列是大约12个核苷酸。在一些实施例中，最小tracrRNA由Jinek等人,《科学(Science)》,337(6096)：816-821(2012)中所描述的tracrRNA nt 23-48组成。
在一些实施例中，在一段至少6、7或8个连续核苷酸内，最小tracrRNA序列与参考最小tracrRNA(例如，来自酿脓链球菌的野生型tracrRNA)序列至少约60％一致。例如，在一段至少6、7或8个连续核苷酸内，最小tracrRNA序列与参考最小tracrRNA序列至少约65％一致、约70％一致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约95％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。
在一些实施例中，最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体具有双螺旋。在一些实施例中，最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体具有至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。在一些实施例中，最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体具有至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。
在一些实施例中，双链体具有错配(即，双链体的两个链并非100％互补)。在一些实施例中，双链体具有至少约1个、2个、3个、4个或5个或错配。在一些实施例中，双链体具有至多约1个、2个、3个、4个或5个或错配。在一些实施例中，双链体具有不超过2个错配。
凸起
在一些实施例中，在最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体中存在“凸起”。凸起是双链体内的核苷酸的未配对区。在一些实施例中，凸起有助于将双链体与定点多肽结合。凸起在双链体的一侧具有未配对的5'-XXXY-3'，其中X是任何嘌呤，并且Y具有可以与相对链上的核苷酸形成摆对的核苷酸，以及双链体的另一侧上的未配对核苷酸区。双链体的两侧上的未配对核苷酸的数量可以不同。
在一个实例中，凸起在凸起的最小CRISPR重复链上具有未配对嘌呤(例如，腺嘌呤)。在一些实施例中，凸起具有凸起的最小tracrRNA序列链的未配对的5'-AAGY-3'，其中Y具有可以与最小CRISPR重复序列链上的核苷酸形成摆动配对的核苷酸。
在一些实施例中，双链体的最小CRISPR重复侧上的凸起具有至少1、2、3、4或5个或更多个未配对核苷酸。在一些实施例中，双链体的最小CRISPR重复侧上的凸起具有至多1、2、3、4或5个或更多个未配对核苷酸。在一些实施例中，双链体的最小CRISPR重复侧上的凸起具有1个未配对核苷酸。
在一些实施例中，双链体的最小tracrRNA序列侧上的凸起具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对核苷酸。在一些实施例中，双链体的最小tracrRNA序列侧上的凸起具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对核苷酸。在一些实施例中，双链体的第二侧(例如，双链体的最小tracrRNA序列侧)上的凸起具有4个未配对核苷酸。
在一些实施例中，凸起具有至少一个摆动配对。在一些实施例中，凸起具有至多一个摆动配对。在一些实施例中，凸起具有至少一个嘌呤核苷酸。在一些实施例中，凸起具有至少3个嘌呤核苷酸。在一些实施例中，凸起序列具有至少5个嘌呤核苷酸。在一些实施例中，凸起序列具有至少一个鸟嘌呤核苷酸。在一些实施例中，凸起序列具有至少一个腺嘌呤核苷酸。
发夹
在各种实施例中，一个或多个发夹位于3'tracrRNA序列中的最小tracrRNA的3'处。
在一些实施例中，发夹从最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列双链体中的最后一个配对核苷酸的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个核苷酸3'处开始。在一些实施例中，发夹可以在最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列双链体中的最后一个配对核苷酸的至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸3'处开始。
在一些实施例中，发夹具有至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个连续核苷酸。在一些实施例中，发夹具有至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15个或更多个连续核苷酸。
在一些实施例中，发夹具有CC二核苷酸(即，两个连续胞嘧啶核苷酸)。
在一些实施例中，发夹具有双链核苷酸(例如发夹中的核苷酸杂交在一起)。例如，发夹具有与3'tracrRNA序列的发夹双链体中的GG二核苷酸杂交的CC二核苷酸。
发夹中的一个或多个可以与定点多肽的向导RNA相互作用区域相互作用。
在一些实施例中，存在两个或更多个发夹，并且在一些实施例中，存在三个或更多个发夹。
3'tracrRNA序列
在一些实施例中，3'tracrRNA序列具有与参考tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的tracrRNA)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％序列一致性的序列。
在一些实施例中，3'tracrRNA序列具有约6个核苷酸到约100个核苷酸的长度。例如，3'tracrRNA序列的长度可以为约6个核苷酸(nt)到约50nt、约6nt到约40nt、约6nt到约30nt、约6nt到约25nt、约6nt到约20nt、约6nt到约15nt、约8nt到约40nt、约8nt到约30nt、约8nt到约25nt、约8nt到约20nt、约8nt到约15nt、约15nt到约100nt、约15nt到约80nt、约15nt到约50nt、约15nt到约40nt、约15nt到约30nt或约15nt到约25nt。在一些实施例中，3'tracrRNA序列具有大约14个核苷酸的长度。
在一些实施例中，在一段至少6、7或8个连续核苷酸内，3'tracrRNA序列与参考3'tracrRNA(例如，来自酿脓链球菌的野生型3'tracrRNA)序列至少约60％一致。例如，在一段至少6、7或8个连续核苷酸内，3'tracrRNA序列与参考3'tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型3'tracrRNA序列)至少约60％一致、约65％一致、约70％一致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约95％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。
在一些实施例中，3'tracrRNA序列具有多于一个双链区(例如发夹、杂交区)。在一些实施例中，3'tracrRNA序列具有两个双链区。
在一些实施例中，3'tracrRNA序列具有茎环结构。在一些实施例中，3'tracrRNA中的茎环结构具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个核苷酸。在一些实施例中，3'tracrRNA中的茎环结构具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。在一些实施例中，茎环结构具有功能部分。例如，茎环结构可以具有适体、核酶、蛋白质相互作用发夹、CRISPR阵列、内含子或外显子。在一些实施例中，茎环结构具有至少约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。在一些实施例中，茎环结构具有至多约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。
在一些实施例中，3'tracrRNA序列中的发夹具有P结构域。在一些实施例中，P结构域在发夹中具有双链区。
tracrRNA扩展序列
在一些实施例中，无论tracrRNA是处于单分子向导还是双分子向导的背景下，都可以提供tracrRNA扩展序列。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有约1个核苷酸到约400个核苷酸的长度。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有大于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380或400个核苷酸的长度。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有约20到约5000个或更多个核苷酸的长度。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有超过1000个核苷酸的长度。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有小于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400个或更多个核苷酸的长度。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列可以具有小于1000个核苷酸的长度。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有小于10个核苷酸的长度。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列的长度为10-30个核苷酸。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列的长度为30-70个核苷酸。
在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有功能部分(例如稳定性控制序列、核酶、核糖核酸内切酶结合序列)。在一些实施例中，功能部分是转录终止子片段(即转录终止序列)。
在一些实施例中，功能部分的总长度为约10个核苷酸(nt)到约100个核苷酸、约10nt到约20nt、约20nt到约30nt、约30nt到约40nt、约40nt到约50nt、约50nt到约60nt、约60nt到约70nt、约70nt到约80nt、约80nt到约90nt、或约90nt到约100nt、约15nt到约80nt、约15nt到约50nt、约15nt到约40nt、约15nt到约30nt、或约15nt到约25nt。在一些实施例中，功能部分在真核细胞中起作用。在一些实施例中，功能部分在原核细胞中起作用。在一些实施例中，功能部分在真核细胞和原核细胞两者中均起作用。
合适的tracrRNA扩展功能部分的非限制性实例包括：3'多腺苷酸化尾、核糖开关序列(例如，用于允许通过蛋白质和蛋白复合物来调节稳定性和/或调节可达性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、使RNA靶向亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的序列、提供跟踪的修饰或序列(例如，到与荧光分子的直接缀合、与促进荧光检测的部分的缀合、允许荧光检测的序列等)，和/或为蛋白质(例如，作用于DNA上的蛋白质，包括转录激活子、转录抑制子、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰基转移酶、组蛋白脱乙酰基酶等)提供结合位点的修饰或序列。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有引物结合位点或分子指数(例如，条形码序列)。在一些实施例中，tracrRNA扩展序列具有一个或多个亲和力标签。
单分子引导接头序列
在一些实施例中，单分子引导核酸的接头序列具有约3个核苷酸到约100个核苷酸的长度。例如，在上文中的Jinek等人,《科学》,337(6096)：816-821(2012)中，使用了简单的4个核苷酸“四环”(-GAAA-)。说明性连接子的长度为约3个核苷酸(nt)到约90nt、约3nt到约80nt、约3nt到约70nt、约3nt到约60nt、约3nt到约50nt、约3nt到约40nt、约3nt到约30nt、约3nt到约20nt、约3nt到约10nt。例如，连接子的长度可以为约3nt到约5nt、约5nt到约10nt、约10nt到约15nt、约15nt到约20nt、约20nt到约25nt、约25nt到约30nt、约30nt到约35nt、约35nt到约40nt、约40nt到约50nt、约50nt到约60nt、约60nt到约70nt、约70nt到约80nt、约80nt到约90nt、或约90nt到约100nt。在一些实施例中，单分子向导核酸的连接子在4与40个核苷酸之间。在一些实施例中，连接子为至少约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多个核苷酸。在一些实施例中，连接子为至多约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多个核苷酸。
连接子可以具有多种序列中的任一种，但在一些实施例中，连接子将不具有与向导RNA的其它部分具有广泛同源性区域的序列，这可能引起可能干扰向导的其它功能区域的分子内结合。在上文中的Jinek等人,《科学》,337(6096)：816-821(2012)中，使用了简单的4个核苷酸序列-GAAA-，但是同样可以使用包括较长序列在内的许多其它序列。
在一些实施例中，接头序列具有功能部分。例如，接头序列可以具有一个或多个特征，包括适体、核酶、蛋白质相互作用发夹、蛋白质结合位点、CRISPR阵列、内含子或外显子。在一些实施例中，接头序列具有至少约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。在一些实施例中，接头序列具有至多约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。
在一些实施例中，根据本公开的通过gRNA靶向的基因组位置可以在基因组(例如人类基因组)中的内源性白蛋白位点处、内或附近。靶向此类位置的示例性向导RNA包括表3或4中所列出的间隔序列和相关Cas9或Cpf1切割位点。如所属领域的普通技术人员所理解，每一向导RNA被设计成包括与其基因组靶序列互补的间隔序列。例如，表3或4中所列出的间隔序列中的每一者可以置于单一RNA嵌合体或crRNA(连同对应的tracrRNA)中。参见Jinek等人,《科学》,337,816-821(2012)和Deltcheva等人,《自然(nature)》,471,602-607(2011)。
供体DNA或供体模板
定点多肽(如DNA核酸内切酶)可以在核酸(例如基因组DNA)中引入双链断裂或单链断裂。双链断裂可以刺激细胞的内源性DNA修复路径(例如，同源依赖修复(HDR)或非同源末端连接或替代性非同源末端连接(A-NHEJ)或微同源性介导的末端连接(MMEJ))。NHEJ可以在不需要同源模板的情况下修复裂解靶核酸。这有时可能导致在裂解位点处的靶核酸中的小缺失或插入(插入缺失)，并且可能导致基因表达的破坏或更改。当可获得同源修复模板或供体时，可能发生HDR，也称为同源重组(HR)。
同源供体模板具有与侧接靶核酸裂解位点的序列同源的序列。姐妹染色单体通常被细胞用作修复模板。然而，出于基因组编辑的目的，修复模板通常作为外源性核酸供应，例如质粒、双链体寡核苷酸、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或病毒核酸。对于外源性供体模板，常见的是在侧接同源区之间引入额外核酸序列(如转基因)或修饰(如单个或多个碱基变化或缺失)，使得额外或更改的核酸序列也并入到目标位点中。MMEJ产生类似于NHEJ的遗传结果，因为可能在裂解位点发生小缺失和插入。MMEJ利用侧接裂解位点的几个碱基对的同源序列来驱动有利的端连接DNA修复结果。在一些情况下，有可能基于对核酸酶目标区中潜在的微同源性的分析来预测可能的修复结果。
因此，在一些情况下，同源重组用于将外源性多核苷酸序列插入到靶核酸裂解位点中。外源性多核苷酸序列在本文中称为供体多核苷酸(或供体或供体序列或多核苷酸供体模板)。在一些实施例中，供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的拷贝或供体多核苷酸的拷贝的一部分被插入到靶核酸裂解位点中。在一些实施例中，供体多核苷酸是外源性多核苷酸序列，即，并非天然存在于靶核酸裂解位点处的序列。
当在其中发生双链断裂的细胞的细胞核内以足够浓度供应外源性DNA分子时，可以在NHEJ修复过程期间将外源性DNA插入双链断裂处并且因此变成基因组的永久性添加。在一些实施例中，这些外源性DNA分子被称为供体模板。如果供体模板含有目的基因(如FVIII基因)的编码序列，以及相关的调节序列(如启动子、增强子、聚A序列和/或剪接受体序列)(在本文中也称为“供体盒”)，可以从基因组中的整合拷贝中表达目的基因，从而在细胞的生命期内永久表达。此外，当细胞分裂时，供体DNA模板的整合拷贝可以被传输到子细胞。
在足够浓度的供体DNA模板存在下，所述供体DNA模板含有与双链断裂的任一侧的DNA序列具有同源性的侧接DNA序列(称为同源臂)，供体DNA模板可以经由HDR路径整合。同源臂充当供体模板与双链断裂的任一侧的序列之间的同源重组的底物。这可能引起供体模板的无误差插入，其中双链断裂的任一侧的序列未从未经修饰的基因组中的序列改变。
用于通过HDR编辑的供应供体显著变化，但通常含有具有小或大侧接同源臂的既定序列以允许退火到基因组DNA。侧接所引入的遗传变化的同源区可以是30bp或更小，或与可以含有启动子、cDNA等的多千碱基盒一样大。可以使用单链和双链寡核苷酸供体。这些寡核苷酸的大小范围为小于100nt到超过许多kb，但是还可以生成并使用较长的ssDNA。通常使用双链供体，包括PCR扩增子、质粒和迷你环。一般来说，已发现AAV载体是递送供体模板的极有效方式，但个别供体的包装限制<5kb。供体的活性转录使HDR增大三倍，表明包括启动子可以增加转化。相反地，供体的CpG甲基化可以降低基因表达和HDR。
在一些实施例中，供体DNA可以通过核酸酶或通过多种不同方法独立地供应，例如通过转染、纳米颗粒、微注射或病毒转导。在一些实施例中，一系列系栓选项可以用于增加供体对于HDR的可用性。实例包括将供体附接到核酸酶，与在附近结合的DNA结合蛋白附接，或与参与DNA末端结合或修复的蛋白质附接。
除通过NHEJ或HDR进行基因组编辑之外，还可以进行使用NHEJ路径和HR两者的位点特异性基因插入。组合方法可以适用于某些设置，可能包括内含子/外显子边界。可以证明NHEJ对于内含子中的连接是有效的，而在编码区中，无错HDR可能更适合。
在一些实施例中，打算插入到基因组中的外源性序列是目的基因(GOI)或其功能衍生物。外源性基因可以包括编码GOI产物(例如，GOI蛋白质)或其功能衍生物的核苷酸序列。GOI的功能衍生物可以包括编码具有野生型GOI蛋白质(如野生型人类GOI蛋白质)的相当大活性的GOI蛋白质的功能衍生物的核酸序列，例如野生型GOI蛋白质所展现的活性的至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％。在一些实施例中，GOI蛋白质的功能衍生物可以与GOI蛋白质(例如野生型GOI蛋白质)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％氨基酸序列一致性。在一些实施例中，所属领域的普通技术人员可以使用所属领域中已知的多种方法来测试化合物(例如肽或蛋白质)的功能性或活性。GOI蛋白质的功能衍生物还可以包括野生型GOI蛋白质的任何片段或经修饰的GOI蛋白质的片段，所述经修饰的GOI蛋白质的片段对全长野生型GOI蛋白质中的氨基酸残基中的一种或多种具有保守修饰。因此，在一些实施例中，GOI的核酸序列的功能衍生物可以与GOI(例如野生型GOI)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％核酸序列一致性。
在涉及GOI或其功能衍生物的插入的一些实施例中，可以将GOI或其功能衍生物的cDNA插入到具有缺陷GOI或其调节序列的患者的基因组中。在此情况下，供体DNA或供体模板可以是具有编码GOI或其功能衍生物(例如cDNA序列)的序列的表达盒或载体构建体。在一些实施例中，表达载体含有编码修饰的GOI蛋白质的序列，如可以使用本公开中其它地方所描述的FVIII-BDD。
在一些实施例中，根据本文所描述的包含供体盒的供体模板中的任一个，供体盒在一侧或两侧上侧接gRNA靶位点。例如，此类供体模板可包含供体盒，其具有供体盒的gRNA靶位点5'和/或供体盒的gRNA靶位点3'。在一些实施例中，供体模板包含具有供体盒的gRNA靶位点5'的供体盒。在一些实施例中，供体模板包含具有供体盒的gRNA靶位点3'的供体盒。在一些实施例中，供体模板包含具有供体盒的gRNA靶位点5'和供体盒的gRNA靶位点3'的供体盒。在一些实施例中，供体模板包含具有供体盒的gRNA靶位点5'和供体盒的gRNA靶位点3'的供体盒，并且两个gRNA靶位点包含相同序列。在一些实施例中，供体模板包含至少一个gRNA靶位点，并且供体模板中的至少一个gRNA靶位点包含与供体模板的供体盒整合到其中的目标位点中的gRNA靶位点相同的序列。在一些实施例中，供体模板包含至少一个gRNA靶位点，并且供体模板中的至少一个gRNA靶位点包含供体模板的供体盒整合到其中的目标位点中的gRNA靶位点的反向补体。在一些实施例中，供体模板包含具有供体盒的gRNA靶位点5'和供体盒的gRNA靶位点3'的供体盒，并且供体模板中的两个gRNA靶位点包含与供体模板的供体盒整合到其中的目标位点中的gRNA靶位点相同的序列。在一些实施例中，供体模板包含具有供体盒的gRNA靶位点5'和供体盒的gRNA靶位点3'的供体盒，并且供体模板中的两个gRNA靶位点包含供体模板的供体盒整合到其中的目标位点中的gRNA靶位点的反向补体。
编码定点多肽或DNA核酸内切酶的核酸
在一些实施例中，基因组编辑和组合物的方法因此可以使用编码定点多肽或DNA核酸内切酶的核酸序列(或寡核苷酸)。编码定点多肽的核酸序列可以是DNA或RNA。如果编码定点多肽的核酸序列是RNA，那么它可以与gRNA序列共价连接或以单独的序列存在。在一些实施例中，可以使用定点多肽或DNA核酸内切酶的肽序列代替其核酸序列。
载体
在另一方面，本公开提供一种核酸，其具有编码本公开的基因组靶向核酸的核苷酸序列、本公开的定点多肽和/或进行本公开的方法的实施例所需的任何核酸或蛋白质分子。在一些实施例中，此类核酸是载体(例如重组表达载体)。
所考虑的表达载体包括(但不限于)基于牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯性疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、逆转录病毒(例如，鼠类白血病病毒、脾坏死病毒，以及衍生自(如劳氏肉瘤病毒、哈威肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒的转录病毒)的载体)的病毒载体以及其它重组载体。考虑用于真核靶细胞的其它载体包括(但不限于)载体pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(法玛西亚公司(Pharmacia))。考虑用于真核靶细胞的额外载体包括(但不限于)载体pCTx-1、pCTx-2和pCTx-3。可使用其它载体，只要其与宿主细胞相容即可。
在一些实施例中，载体具有一个或多个转录和/或翻译控制元件。根据所利用的宿主/载体系统，表达载体中可以使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任何元件，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等。在一些实施例中，载体是使病毒序列或者CRISPR机构或其它元件的组分失活的自我失活型载体。
合适的真核启动子(即，在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性实例包括来自以下的那些启动子：立早巨细胞病毒(CMV)、单纯性疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复(LTR)、人类延伸因子-1启动子(EF1)、包括与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的混合构建体、鼠类干细胞病毒启动子(MSCV)、磷酸甘油酸激酶-1位点启动子(PGK)，以及小鼠金属硫蛋白-I。
为了表达小型RNA(包括结合Cas核酸内切酶使用的向导RNA)，如RNA聚合酶III启动子等各种启动子(包括例如U6和H1)可以是有利的。对此类启动子的描述和用于增强此类启动子的使用的参数在所属领域中是已知的，并且额外的信息和方法正在进行定期描述；参见例如，Ma,H.等人,《分子疗法-核酸(Molecular Therapy-Nucleic Acids)》,3,e161(2014)doi:10.1038/mtna.2014.12。
表达载体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可以包括用于扩增表达的适当序列。表达载体还可以包括对与定点多肽融合由此产生融合蛋白非天然标签(例如，组氨酸标签、血球凝聚素标签、绿色荧光蛋白等)进行编码的核苷酸序列。
在一些实施例中，启动子是诱导型启动子(例如，热休克启动子、四环素调节的启动子、类固醇调节的启动子、金属调节的启动子、雌激素受体调节的启动子等)。在一些实施例中，启动子是组成型启动子(例如CMV启动子、UBC启动子)。在一些实施例中，启动子是空间受限和/或时间受限启动子(例如，组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)。在一些实施例中，如果待表达的基因在其插入到基因组中之后在存在于基因组中的内源性启动子下表达，那么载体不具有在宿主细胞中表达的至少一个基因的启动子。
定点多肽或DNA核酸内切酶
由于NHEJ和/或HDR而产生的对靶DNA的修饰可能导致例如突变、缺失、改变、整合、基因校正、基因替代、基因标签、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏、易位和/或基因突变。将非天然核酸整合到基因组DNA中的过程是基因组编辑的一个实例。
定点多肽是在基因组编辑中用于对DNA进行裂解的核酸酶。定点多肽可以作为以下中的任一项给予细胞或患者：一个或多个多肽，或编码多肽的一个或多个mRNA。
在CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统的背景下，定点多肽可以与向导RNA结合，所述向导RNA进而指定目标DNA中多肽所针对的位点。在本文的CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统的一些实施例中，定点多肽是核酸内切酶，如DNA核酸内切酶。
在一些实施例中，定点多肽具有多个核酸裂解(即，核酸酶)机构域。两个或更多个核酸裂解结构域可以经由连接子连接在一起。在一些实施例中，连接子具有柔性连接子。连接子的长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40个或更多个氨基酸。
天然存在的野生型Cas9酶包括两个核酸酶结构域：HNH核酸酶结构域和RuvC结构域。在本文中，“Cas9”是指天然存在的和重组Cas9。本文中考虑的Cas9酶具有HNH或HNH样核酸酶结构域和/或RuvC或RuvC样核酸酶结构域。
HNH或HNH样结构域具有McrA样折叠。HNH或HNH样结构域具有两个反平行β链和α螺旋。HNH或HNH样结构域具有金属结合位点(例如，二价阳离子结合位点)。HNH或HNH样结构域可以裂解靶核酸的一个链(例如，crRNA靶向链的互补链)。
RuvC或RuvC样结构域具有RNaseH或RNaseH样折叠。多样的一系列基于核酸的功能中涉及RuvC/RNaseH结构域，所述基于核酸的功能包括作用于RNA和DNA两者上。RNaseH结构域具有由多个α螺旋包围的5个β链。RuvC/RNaseH或RuvC/RNaseH样结构域具有金属结合位点(例如，二价阳离子结合位点)。RuvC/RNaseH或RuvC/RNaseH样结构域可以裂解靶核酸的一个链(例如，双链目标DNA的非互补链)。
在一些实施例中，定点多肽具有与野生型示例性定点多肽[例如，来自酿脓链球菌的Cas9，US2014/0068797序列ID号8或Sapranauskas等人,《核酸研究(Nucleic AcidsRes)》,39(21)：9275-9282(2011)]和各种其它定点多肽具有至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施例中，定点多肽具有与野生型示例性定点多肽(例如，来自上述酿脓链球菌的Cas9，同上)的核酸酶结构域具有至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施例中，在10个连续氨基酸内，定点多肽具有与野生型定点多肽(例如，来自上述酿脓链球菌的Cas9)至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的一致性。在一些实施例中，在10个连续氨基酸内，定点多肽具有与野生型定点多肽(例如，来自上述酿脓链球菌的Cas9)至多70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的一致性。在一些实施例中，在定点多肽的HNH核酸酶结构域中的10个连续氨基酸内，定点多肽具有与野生型定点多肽(例如，来自上述酿脓链球菌的Cas9)至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的一致性。在一些实施例中，在定点多肽的HNH核酸酶结构域中的10个连续氨基酸内，定点多肽具有与野生型定点多肽(例如，来自上述酿脓链球菌的Cas9)至多70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的一致性。在一些实施例中，在定点多肽的RuvC核酸酶结构域中的10个连续氨基酸内，定点多肽具有与野生型定点多肽(例如，来自上述酿脓链球菌的Cas9)至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的一致性。在一些实施例中，在定点多肽的RuvC核酸酶结构域中的10个连续氨基酸内，定点多肽具有与野生型定点多肽(例如，来自上述酿脓链球菌的Cas9)至多70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的一致性。
在一些实施例中，定点多肽具有野生型示例性定点多肽的修饰形式。野生型示例性定点多肽的修饰形式具有降低定点多肽的核酸裂解活性的突变。在一些实施例中，野生型示例性定点多肽的修饰形式可以具有野生型示例性定点多肽(例如，来自上述酿脓链球菌的Cas9)的核酸裂解活性的小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％。定点多肽的修饰形式可以不具有实质的核酸裂解活性。当定点多肽是不具有实质的核酸裂解活性的修饰形式时，其在本文中被称为“酶失活”。
在一些实施例中，定点多肽的修饰形式具有突变，使得突变可以在靶核酸上诱导单链断裂(SSB)(例如，通过对双链靶核酸的糖-磷酸主链中的仅一个进行裂解)。在一些实施例中，突变导致野生型定点多肽(例如，来自上述酿脓链球菌的Cas9)的多个核酸裂解结构域中的一个或多个的核酸裂解活性小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％。在一些实施例中，突变导致多个核酸裂解结构域中的一个或多个保留裂解靶核酸的非互补链的能力，但是降低其裂解靶核酸的非互补链的能力。在一些实施例中，突变导致多个核酸裂解结构域中的一个或多个保留裂解靶核酸的非互补链的能力，但是降低其裂解靶核酸的互补链的能力。例如，使野生型示例性酿脓链球菌Cas9多肽中的残基，如Asp10、His840、Asn854和Asn856发生突变以使多个核酸裂解结构域(例如，核酸酶结构域)中的一个或多个失活。在一些实施例中，待突变的残基对应于野生型示例性酿脓链球菌Cas9多肽中的残基Asp10、His840、Asn854和Asn856(例如，如通过序列和/或结构比对确定的)。突变的非限制性实例包括D10A、H840A、N854A或N856A。所属领域的技术人员将认识到，除了丙氨酸取代之外的突变可以是合适的。
在一些实施例中，D10A突变与H840A、N854A或N856A突变中的一个或多个组合以产生实质上缺少DNA裂解活性的定点多肽。在一些实施例中，H840A突变与D10A、N854A或N856A突变中的一个或多个组合以产生实质上缺少DNA裂解活性的定点多肽。在一些实施例中，N854A突变与H840A、D10A或N856A突变中的一个或多个组合以产生实质上缺少DNA裂解活性的定点多肽。在一些实施例中，N856A突变与H840A、N854A或D10A突变中的一个或多个组合以产生实质上缺少DNA裂解活性的定点多肽。包括一个基本上失活的核酸酶结构域的定点多肽被称为“切口酶”。
在一些实施例中，可以使用RNA向导的核酸内切酶(例如Cas9)的变异体来增加CRISPR介导的基因组编辑的特异性。野生型Cas9通常由被设计成与靶序列中的指定的～20个核苷酸序列(如内源性基因组位点)杂交的单个向导RNA来引导。然而，向导RNA与目标位点之间可以容许有若干个错配，从而有效地将靶位点中的所需同源性的长度减小为例如小到13nt的同源性，并且由此使CRISPR/Cas9复合物在目标基因组中其它地方的结合和双链核酸裂解-也被称为脱靶裂解-的潜能提高。因为Cas9的切口酶变异体各自仅对一个链进行切割，所以为了产生双链断裂，有必要使一对切口酶在靶核酸的相反链上紧密结合，由此产生相当于双链断裂的一对切口。这要求两个单独的向导RNA-每个切口酶一个向导RNA-必须在靶核酸的相反链上紧密结合。此要求基本上使发生双链断裂所需的同源性的最小长度加倍，由此降低了将在基因组中的其它地方发生双链链接的可能性，其中这两个向导RNA位点-如果存在的话-不可能足够靠近彼此以使双链断裂能够形成。如所属领域中所描述，切口酶还可以用于促进HDR与NHEJ。HDR可以用于通过使用有效地介导所需变化的特定供体序列将所选择变化引入到基因组中的靶位点中。用于基因编辑的各种CRISPR/Cas系统的描述可以在例如国际专利申请公开号WO2013/176772和《自然生物技术(NatureBiotechnology)》32,347-355(2014)，以及其中所引用的参考文献中找到。
在一些实施例中，定点多肽(例如，变异体、突变的、酶失活和/或有条件的酶失活的定点多肽)靶向核酸。在一些实施例中，定点多肽(例如，变异体、突变的、酶失活和/或有条件的酶失活的内切核糖核酸酶)靶向DNA。在一些实施例中，定点多肽(例如，变异体、突变的、酶失活和/或有条件的酶失活的内切核糖核酸酶)靶向RNA。
在一些实施例中，定点多肽具有一个或多个非天然序列(例如，定点多肽是融合蛋白)。
在一些实施例中，定点多肽具有与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9具有至少15％氨基酸一致性的氨基酸序列、核酸结合结构域，以及两个核酸裂解结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)。
在一些实施例中，定点多肽具有与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9具有至少15％氨基酸一致性的氨基酸序列和两个核酸裂解结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)。
在一些实施例中，定点多肽具有与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9具有至少15％氨基酸一致性的氨基酸序列和两个核酸裂解结构域，其中核酸裂解结构域中的一个或两个与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9的核酸酶结构域具有至少50％氨基酸一致性。
在一些实施例中，定点多肽具有与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9具有至少15％氨基酸一致性的氨基酸序列、两个核酸裂解结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)，以及非天然序列(例如，核定位信号)或将定点多肽与非天然序列连接的连接子。
在一些实施例中，定点多肽具有与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9具有至少15％氨基酸一致性的氨基酸序列、两个核酸裂解结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)，其中定点多肽具有核酸裂解结构域中的一个或两个的突变，所述突变使核酸酶结构域的裂解活性降低至少50％。
在一些实施例中，定点多肽具有与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的Cas9具有至少15％氨基酸一致性的氨基酸序列和两个核酸裂解结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)，其中核酸酶结构域中的一个具有天冬氨酸10的突变，和/或其中核酸酶结构域中的一个具有组氨酸840的突变，并且其中突变使一个或多个核酸酶结构域的裂解活性降低至少50％。
在一些实施例中，一个或多个定点多肽(例如，DNA核酸内切酶)包括一起在基因组中的特异性位点处实现一个双链断裂的两个切口酶或者一起在基因组中的特异性位点处实现两个双链断裂的四个切口酶。或者，一个定点多肽(例如DNA核酸内切酶)在基因组中的特异性位点处实现一个双链断裂。
在一些实施例中，编码定点多肽的多核苷酸可以用于编辑基因组。在此类实施例中的一些中，根据所属领域中用于在含有目的目标DNA的细胞中进行表达的标准方法，可以对编码定点多肽的多核苷酸进行密码子优化。例如，如果预期靶核酸在人类细胞中，那么设想编码Cas9的经人类密码子优化的多核苷酸用于产生Cas9多肽。
以下提供了可用于本公开的各种实施例中的定点多肽的一些实例。
CRISPR核酸内切酶系统
CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeat))基因组位点可以在许多原核生物(例如，细菌和古菌)的基因组中找到。在原核生物中，CRISPR位点对充当用于帮助保卫原核生物抵御如病毒和噬菌体等外来侵入物的类型的免疫系统的产物进行编码。CRISPR位点功能有三个阶段：将新序列整合到CRISPR位点中、表达CRISPR RNA(crRNA)和使外来侵入物核酸沉默。已经识别五种类型的CRISPR系统(例如I型、II型、III型、U型和V型)。
CRISPR位点包括被称为“重复”的多个短重复序列。重复在被表达时可以形成二级发夹结构(例如，发夹)和/或具有未结构化的单链序列。重复通常成簇地发生并且频繁地在物种之间发散。重复规律地间隔有被称为“间隔区”的独特插入序列，从而产生重复-间隔区-重复位点架构。间隔区与已知的外来侵入物序列完全相同或与其具有高同源性。间隔区-重复单元编码crisprRNA(crRNA)，所述crRNA被加工成间隔区-重复单元的成熟形式。crRNA具有参与靶向靶核酸的“种子”或间隔序列(在原核生物的天然存在形式中，间隔序列靶向外来侵入物核酸)。间隔序列位于crRNA的5'端或3'端。
CRISPR位点还具有编码CRISPR相关(Cas)基因的多核苷酸序列。Cas基因对参与生物发生和原核生物中的crRNA功能的干扰阶段的核酸内切酶进行编码。一些Cas基因具有同源二级和/或三级结构。
II型CRISPR系统
II型CRISPR系统中的crRNA生物发生本质上需要反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。tracrRNA由内源性RNaseIII修饰，并且接着与前crRNA阵列中的crRNA重复杂交。募集内源性RNaseIII以裂解前crRNA。裂解的crRNA经受核糖核酸外切酶修剪以产生成熟的crRNA形式(例如，5'修剪)。tracrRNA保持与crRNA杂交，并且tracrRNA和crRNA与定点多肽(例如，Cas9)缔合。crRNA-tracrRNA-Cas9复合物中的crRNA将复合物引导到crRNA可以与其杂交的靶核酸。crRNA与靶核酸的杂交激活Cas9以进行靶核酸裂解。II型CRISPR系统中的靶核酸被称为原间隔区相邻基序(PAM)。本质上，PAM对于促进定点多肽(例如，Cas9)与靶核酸的结合而言是必不可少的。II型系统(也被称为Nmeni或CASS4)进一步细分为II-A型(CASS4)和II-B型(CASS4a)。Jinek等人,《科学》,337(6096)：816-821(2012)显示，CRISPR/Cas9系统可用于RNA可编程基因组编辑，并且国际专利申请公开第WO2013/176772号提供了CRISPR/Cas核酸内切酶系统用于位点特异性基因编辑的许多实例和应用。
V型CRISPR系统
V型CRISPR系统与II型系统具有若干个重要差异。例如，Cpf1是与II型系统相比缺少tracrRNA的单个RNA引导的核酸内切酶。实际上，Cpf1相关CRISPR阵列在不需要额外的反式激活tracrRNA的情况下被加工成成熟crRNA。V型CRISPR阵列被加工成长度为42-44个核苷酸的短成熟crRNA，每一成熟crRNA以同向重复的19个核苷酸开始，随后是间隔序列的23-25个核苷酸。相比而言，II型系统中的成熟crRNA以间隔序列的20-24个核苷酸开始，随后是同向重复的约22个核苷酸。而且，Cpf1利用富含T的原间隔区相邻基序，使得Cpf1-crRNA复合物高效地裂解短的富含T的PAM之后的目标DNA，所述短的富含T的PAM与II型系统的目标DNA之后的富含G的PAM形成对比。因此，V型系统在远离PAM的点处裂解，而II型系统在相邻PAM的点处裂解。此外，相比于II型系统，Cpf1经由具有4或5个核苷酸5'突出的交错DNA双链断裂来裂解DNA。II型系统经由平端双链断裂来裂解。类似于II型系统，Cpf1含有预测的RuvC样核酸内切酶结构域，但是缺少第二HNH核酸内切酶结构域，这与II型系统形成对比。
Cas基因/多肽和原间隔区相邻基序
示例性CRISPR/Cas多肽包括如在图1中在Fonfara等人,《核酸研究》,42：2577-2590(2014)中的Cas9多肽。自Cas基因被发现以来，CRISPR/Cas基因命名系统已经经历了大量重写。上述图5中Fonfara提供了来自各种物种的Cas9多肽的PAM序列。
基因组靶向核酸和定点多肽的复合物
基因组靶向核酸与定点多肽(例如，如Cas9等核酸引导的核酸酶)相互作用，由此形成复合物。基因组靶向核酸(例如gRNA)将定点多肽引导到靶核酸。
如先前所陈述，在一些实施例中，定点多肽和基因组靶向核酸各自可以单独地给予细胞或患者。另一方面，在一些其它实施例中，可以将定点多肽与一个或多个向导RNA或者一个或多个crRNA连同tracrRNA预复合。然后可以将预复合的材料给予细胞或患者。此类预复合的材料被称为核糖核蛋白颗粒(RNP)。
基因组编辑的方法
一方面，本文提供一种基因组编辑的方法，确切地说，将目的基因入到细胞的基因组中。一些实施例涉及通过基因组编辑来编辑以调节细胞中蛋白质的表达、功能或活性的方法，所述蛋白质选自由以下组成的组：FVIII蛋白质、FIX蛋白质、α-1-抗胰蛋白酶、FXIII蛋白质、FVII蛋白质、FX蛋白质、蛋白质C和丝氨酸蛋白酶抑制剂G1。一些特定实施例涉及用于通过基因组编辑来编辑以调节细胞中的凝血蛋白质(如FVIII)的表达、功能或活性的方法。此方法可以用于治疗受试者，例如血友病A患者，并且在此情况下，可以从患者或单独的供体中分离细胞。然后，使用本文所描述的材料和方法编辑细胞的染色体DNA。一些其它特定实施例涉及用于通过基因组编辑来编辑以调节细胞中的凝血蛋白质FIX的表达、功能或活性的方法。此方法可以用于治疗受试者，例如血友病B患者，并且在此情况下，可以从患者或单独的供体中分离细胞。在又一些其它特定实施例中，涉及用于通过基因组编辑来编辑以调节细胞中的丝氨酸蛋白酶抑制剂G1的表达、功能或活性的方法。此方法可以用于治疗受试者，例如遗传血管性水肿患者，并且在此情况下，可以从患者或单独的供体中分离细胞。
在一些实施例中，敲入策略涉及敲入目的基因(GOI)。关于经编码的多肽的大小或生物活性或功能不存在特定限制。在一些实施例中，GOI编码选自由以下组成的组的蛋白质：FVIII蛋白质、FIX蛋白质、α-1-抗胰蛋白酶、FXIII蛋白质、FVII蛋白质、FX蛋白质、蛋白质C和丝氨酸蛋白酶抑制剂G1，其任一者的功能衍生物。在一些实施例中，其中所插入的GOI的基因组序列在白蛋白位点处、内或其附近。在一些实施例中，GOI编码凝血蛋白质(如FVIII)。在一些实施例中，敲入策略涉及将FVIII编码序列，例如野生型FVIII基因(例如野生型人类FVIII基因)、FVIII cDNA、小基因(具有天然或合成增强子和启动子、一个或多个外显子，和天然或合成内含子，和天然或合成3'UTR和聚腺苷酸化信号)或修饰的FVIII基因敲入到基因组序列中。在一些实施例中，敲入策略涉及将FIX编码序列，例如野生型FIX基因(例如野生型人类FIX基因)、FIX cDNA、小基因(具有天然或合成增强子和启动子、一个或多个外显子，和天然或合成内含子，和天然或合成3'UTR和聚腺苷酸化信号)或修饰的FIX基因敲入到基因组序列中。在一些实施例中，敲入策略涉及将SERPING1编码序列，例如野生型SERPING1基因(例如野生型人类SERPING1基因)、SERPING1 cDNA、小基因(具有天然或合成增强子和启动子、一个或多个外显子，和天然或合成内含子，和天然或合成3'UTR和聚腺苷酸化信号)或修饰的SERPING1基因敲入到基因组序列中。
在一些实施例中，本文提供了将目的基因(GOI)，例如编码FVIII基因或其功能衍生物的基因敲入到基因组中的方法。一方面，本公开提供将GOI(例如FVIII基因)的核酸序列(例如编码FVIII蛋白质或其功能衍生物的核酸序列)插入到细胞的基因组中。GOI的核酸序列可以编码GOI的野生型蛋白质或其衍生物。因此，在一些实施例中，GOI可以编码野生型蛋白质。野生型蛋白质的功能衍生物可以包括具有野生型蛋白质的实质活性的肽，例如至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的野生型蛋白质表现出的活性。在一些实施例中，所属领域的普通技术人员可以使用所属领域中已知的多种方法来测试化合物(例如肽或蛋白质)的功能性或活性。在一些实施例中，经编码的野生型蛋白质的功能衍生物还可以包括野生型蛋白质的任何片段或经修饰的蛋白质的片段，所述经修饰的蛋白质的片段对相对应的全长野生型蛋白质中的氨基酸残基中的一种或多种具有保守修饰。在一些实施例中，经编码的野生型蛋白质的功能衍生物还可以包括任何修饰，例如并非实质上不利地影响野生型蛋白质的功能的一个或多个氨基酸的缺失、插入和/或突变。因此，在一些实施例中，野生型GOI的核酸序列的功能衍生物可以与野生型GOI具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％核酸序列一致性。
在一些实施例中，将GOI或其功能衍生物插入到细胞中的基因组序列中。在一些实施例中，插入位点在细胞基因组中的白蛋白位点处或内。插入方法使用靶向白蛋白基因的第一内含子(或内含子1)的一种或多种gRNA。在一些实施例中，供体DNA是单链或双链DNA，包括用于GOI的编码序列或其功能衍生物。在一些实施例中，供体DNA是单链或双链DNA，其包括选自由以下组成的组的蛋白质的编码序列：FVIII蛋白质、FIX蛋白质、α-1-抗胰蛋白酶、FXIII蛋白质、FVII蛋白质、FX蛋白质、蛋白质C、丝氨酸蛋白酶抑制剂G1或其功能衍生物。
在一些实施例中，基因组编辑方法利用DNA核酸内切酶，如CRISPR/Cas系统，以遗传引入(敲入)目的基因或其功能衍生物。在一些实施例中，DNA核酸内切酶识别具有序列NGG或NNGG的原间隔区相邻基序(PAM)，其中N是任何核苷酸、其同源物、天然存在的分子的重组、其经密码子优化或修饰的形式，以及前述中的任一种的组合。在一些实施例中，DNA核酸内切酶是II型Cas核酸内切酶或其功能衍生物。在一些实施例中，DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，Cas9来自酿脓链球菌(spCas9)。在一些实施例中，Cas9来自路邓葡萄球菌(SluCas9)。
在一些实施例中，经历基因组编辑的细胞在基因组中具有一个或多个突变，与不具有此类突变的正常中的表达相比，所述突变引起内源性目的基因的表达的减少。正常细胞可以是来源于(或分离自)不具有GOI中的缺陷的不同受试者的健康或对照细胞。在一些实施例中，经历基因组编辑的细胞可以来源于(或分离自)需要治疗GOI相关病况或病症的受试者。在一些特定实施例中，经历基因组编辑的细胞可以来源于(或分离自)需要治疗与GOI相关的健康状况或病症的患者。在一些实施例中，患者是患有或疑似患有选自由以下组成的组的病症或健康状况的患者：血友病A、血友病B、MPS II、MPS1H、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、FXIII缺乏、FVII缺乏、FX缺乏、蛋白质C缺乏和HAE。在一些实施例中，患者是患有血友病A的患者。在一些实施例中，患者是患有血友病B的患者。在一些实施例中，患者是患有HAE的患者。因此，在一些实施例中，相比于正常细胞中内源性目的基因表达的表达，此类细胞中内源性GOI基因的表达减少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
在一些实施例中，基因组编辑方法在功能GOI(例如FVIII基因，例如可操作地连接到所供应的启动子以便在体内稳定地产生FVIII蛋白质的FVIII编码序列)的基因组的非编码区处进行靶向整合。在一些实施例中，GOI编码序列的靶向整合发生在目的细胞类型(例如肝细胞或窦内皮细胞)中高度表达的白蛋白基因的内含子中。在一些实施例中，待插入的GOI编码序列可以是野生型GOI编码序列，例如野生型人类GOI编码序列。在一些实施例中，GOI编码序列可以是野生型GOI编码序列(如野生型人类GOI编码序列)的功能衍生物。
一方面，本公开提出将目的基因(GOI)(例如FVIII基因或其功能衍生物)的核酸序列插入到细胞的基因组中。在一些实施例中，待插入的GOI编码序列是经修饰的GOI编码序列。在一些实施例中，将经修饰的GOI编码序列特异性地整合到靶细胞中白蛋白基因的内含子1中。在一些实施例中，将经修饰的GOI编码序列特异性地整合到哺乳动物(包括人类)的肝细胞中白蛋白基因的内含子1中。在一些实施例中，待插入的GOI编码序列是经修饰的FVIII编码序列。在一些实施例中，在经修饰的FVIII编码序列中，野生型FVIII编码序列的B结构域被缺失并且被称为“SQ连接”(氨基酸序列SFSQNPPVLKRHQR-SEQ ID NO:1)的连接肽替代。此缺失B结构域的FVIII(FVIII-BDD)在所属领域中是众所周知的，并且具有与全长FVIII等效的生物活性。例如，在一些实施例中，由于其大小较小(4371bp对7053bp)，缺失B结构域的FVIII在全长FVIII上。因此，在一些实施例中，将缺乏FVIII信号肽并且在其5'末端含有剪接受体序列的FVIII-BDD编码序列(FVIII编码序列的N端)特异性地整合到哺乳动物(包括人类)的肝细胞中白蛋白基因的内含子1中。在一些实施例中，来自白蛋白启动子的此经修饰的GOI编码序列的转录可能产生含有白蛋白的外显子1、内含子1的部分和整合的GOI序列的预mRNA。举例来说，来自白蛋白启动子的以上经修饰的FVIII编码序列的转录可能产生含有白蛋白的外显子1、内含子1的部分和整合的FVIII-BDD基因序列的预mRNA。当此预mRNA经历天然剪接过程以去除内含子时，剪接机构可以在白蛋白外显子1的3'侧将剪接供体连接到下一个可用的剪接受体，所述剪接受体将是插入的DNA供体的FVIII-BDD编码序列的5'端处的剪接受体。这可能产生含有融合到FVIII-BDD的成熟编码序列的白蛋白外显子1的成熟mRNA。白蛋白的外显子1编码信号肽加2个额外的氨基酸和在人类中通常在白蛋白的N端处编码蛋白质序列DAH的密码子的1/3。因此，在一些实施例中，在预测白蛋白信号肽在从细胞分泌期间裂解之后，可以产生FVIII-BDD蛋白质，其具有添加到N端的3个额外氨基酸残基，产生在FVIII-BDD蛋白质的N端处的氨基酸序列-DAHATRRYY(SEQ ID NO:98)-。因为这些3种氨基酸中的第3种(带下划线的)部分由外显子1的末端并且部分由FVIII-BDDDNA供体模板编码，所以有可能选择第3种额外氨基酸残基的标识为Leu、Pro、His、Gln或Arg。在这些选择方案中，在一些实施例中选择Leu，因为Leu的分子复杂性最低，并且因此至少有可能形成新的T细胞表位，在FVIII-BDD蛋白质的N端处产生氨基酸序列DALATRRYY-。或者，DNA供体模板可以被设计成缺失第3个残基，在FVIII-BDD蛋白质的N端处产生氨基酸序列DALTRRYY。在一些情况下，将额外氨基酸添加到天然蛋白质的序列可以增加免疫原性风险。因此，在其中计算机分析预测FVIII-BDD的N端的2个潜在选项的潜在免疫原性的一些实施例中，表明1种残基(DALTRRYY)的缺失具有较低免疫原性分数，这可能是至少在一些实施例中选择的设计。
在一些实施例中，可以使用编码经修饰的GOI(例如FVIII-BDD)的DNA序列，其中密码子使用已经优化，以便改进哺乳动物细胞中的表达(所谓的密码子优化)。不同计算机算法在用于进行密码子优化的领域中也是可用的，并且这些算法产生不同DNA序列。市售密码子优化算法的实例是由ATUM和GeneArt(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)的部分)公司采用的那些算法。密码子优化表明，FVIII编码序列在基于基因的递送到小鼠之后显著改善FVIII的表达(Nathwani AC,Gray JT,Ng CY,等人,《血液(Blood.)》2006：107(7)：2653-2661.：Ward NJ,Buckley SM,Waddington SN,等人,《血液》2011；117(3)：798-807；Radcliffe PA,Sion CJ,Wilkes FJ,等人,《基因疗法(Gene Ther.)》2008；15(4)：289-297)。
在一些实施例中，通过不同算法经密码子优化的修饰的GOI编码序列与原生GOI序列(如存在于人类基因组中)之间的序列同源性或一致性可以在约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％范围内。在一些实施例中，经修饰的GOI的密码子优化的编码序列与原生GOI序列具有约75％到约79％之间的序列同源性或一致性。在一些实施例中，经修饰的GOI的密码子优化编码序列与天然GOI序列具有约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％或约80％的序列同源性或一致性。
在一些实施例中，制备供体模板或供体构建体以含有编码经修饰的GOI的DNA序列。在一些实施例中，DNA供体模板被设计成含有经修饰的GOI的密码子优化的人类编码序列。在一些实施例中，密码子优化以此类方式进行，使得编码GOI的信号肽(例如FVIII)的5'末端处的序列已被缺失并且由剪接受体序列替代，并且此外将聚腺苷酸化信号在FVIII终止密码子(MAB8A-SEQ ID NO:87)之后添加到3'末端。剪接受体序列可以选自已知基因的已知剪接受体序列之中，或可以使用衍生自所属领域中已知的许多剪接受体序列的比对的共同剪接受体序列。在一些实施例中，使用来自高度表达基因的剪接受体序列，因为认为此类序列提供最佳剪接效率。在一些实施例中，共同剪接受体序列由具有共有序列T/CNC/TT/CA/GAC/T(SEQ ID NO:99)的分支位点构成，接着在20bp内，其中多嘧啶通道(C或T)为10到12个碱基，接着AG>G/A，其中>为内含子/外显子边界的位置。在一些实施例中，使用合成剪接受体序列(ctgacctcttctcttcctcccacag-SEQ ID NO:2)。在另一个实施例中，使用来自人类白蛋白基因内含子1/外显子2边界
Figure BDA0003117691830000461
或小鼠(ttaaatatgttgtgtggtttttctctccctgtttccacag-SEQ ID NO:4)的天然剪接受体序列。
聚腺苷酸化序列为细胞提供信号以添加聚A尾，这对于mRNA在细胞内的稳定性至关重要。在DNA供体模板待包装到AAV颗粒中的一些实施例中，包装的DNA的大小一般保持在AAV的包装限制内，所述包装限制例如小于约5Kb，例如不超过约4.7Kb。因此，在一些实施例中，需要使用尽可能短的聚A序列，例如约10-mer、约20-mer、约30-mer、约40-mer、约50-mer或约60-mer或前述核苷酸的任何中间数目。共有合成聚A信号序列已经描述于文献(LevittN,Briggs D,Gil A,Proudfoot NJ《基因开发(Genes Dev.)》1989；3(7)：1019-1025)，其序列为AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG(SEQ ID NO:5)，并且通常用于众多表达载体中。
在一些实施例中，可以将额外序列元件添加到DNA供体模板以改进整合频率。一个此类元件是同源臂，其为与基因组中双链断裂的两侧的DNA序列相同的序列，在所述基因组处，靶向整合以使得能够通过HDR整合。将来自双链断裂(LHA)的左侧的序列附加到DNA供体模板的5'(N端到FVIII编码序列)末端，并且将来自双链断裂(RHA)的右侧的序列附加到DNA供体模板的3'(FVIII编码序列的C端)末端，例如MAB8B(SEQ ID NO:88)。
在一些实施例中提供的替代性DNA供体模板设计具有与将用于裂解基因组位点的sgRNA的识别序列互补的序列。MAB8C(SEQ ID NO:89)表示这种类型的DNA供体模板的一个实例。通过包括sgRNA识别位点，DNA供体模板将在DNA供体模板和sgRNA/Cas9已递送至的细胞核内的sgRNA/Cas9复合物侧裂解。供体DNA模板裂解成线性片段可以增加通过非同源末端结合机构或通过HDR机构在双链断裂下整合的频率。这在递送包装在AAV中的供体DNA模板的情况下可能尤其有益，因为在递送到细胞核之后，已知AAV基因组会聚结形成更大的环状双链DNA分子(Nakai等人,《病毒学杂志(J.Viology)》2001,第75卷，第6969-6976页)。因此，在一些情况下，尤其是通过NHEJ机构，环状多联体可能是双链断裂处整合效率较低的供体。据先前报告，可以通过在质粒中包括锌指核酸酶裂解位点来提高使用环状质粒DNA供体模板的靶向整合的效率(Cristea等人,《生物技术与生物工程学(Biotechnol.Bioeng.)》2013：110：871-880)。最近，还使用CRISPR/Cas9核酸酶(Suzuki等人,2017,《自然》,540,144-149)来应用此方法。虽然sgRNA识别序列当存在于双链DNA供体模板的任一条链上时具有活性，但预计存在于基因组中的sgRNA识别序列的反向补体的使用有利于稳定整合，因为反向定向的整合重新产生可以被重新裂解的sgRNA识别序列，由此释放插入的供体DNA模板。预测此类供体DNA模板在前向定向中通过NHEJ的基因组中的整合不会重新产生sgRNA识别序列，使得整合的供体DNA模板不能无法从基因组中切除。可以测试和确定在具有或不具有同源臂的供体中包括sgRNA识别序列对GOI供体DNA模板整合效率的益处，例如在使用AAV递送供体的小鼠中，并且在使用AAV递送供体和LNP递送CRISPR-Cas9组件的小鼠中。
在一些实施例中，供体DNA模板包含根据本文所描述的任何实施例在供体盒中的GOI或其功能衍生物，所述供体盒在一侧或两侧上侧接gRNA靶位点。在一些实施例中，供体模板包含供体盒的gRNA靶位点5'和/或供体盒的gRNA靶位点3'。在一些实施例中，供体模板包含两个侧接gRNA靶位点，并且两个gRNA靶位点包含相同序列。在一些实施例中，供体模板包含至少一个gRNA靶位点，并且供体模板中的至少一个gRNA靶位点是靶向白蛋白基因的第一内含子的一个或多个gRNA中的至少一个的靶位点。在一些实施例中，供体模板包含至少一个gRNA靶位点，并且供体模板中的至少一个gRNA靶位点是白蛋白基因的第一内含子中的一个或多个gRNA中的至少一个的靶位点的反向补体。在一些实施例中，供体模板包含供体盒的gRNA靶位点5'供体盒和供体盒的gRNA靶位点3'，并且供体模板中的两个gRNA靶位点通过靶向白蛋白基因的第一内含子的一个或多个gRNA靶向。在一些实施例中，供体模板包含供体盒的gRNA靶位点5'供体盒和供体盒的gRNA靶位点3'，并且供体模板中的两个gRNA靶位点是白蛋白基因的第一内含子中的一个或多个gRNA中的至少一个的靶位点的反向补体。
将GOI编码基因插入到靶位点中，即插入GOI编码基因的基因组位置，可以在内源性白蛋白基因位点或其相邻序列中。在一些实施例中，以这样的方式插入GOI编码基因：插入的基因的表达受白蛋白基因的内源性启动子控制。在一些实施例中，将GOI编码基因插入白蛋白基因的内含子中的一者中。在一些实施例中，将GOI编码基因插入白蛋白基因的外显子中的一者中。在一些实施例中，将GOI编码基因插入内含子:外显子的接合点处(或反之亦然)。在一些实施例中，GOI编码基因的插入在白蛋白位点的第一内含子(或内含子1)中。在一些实施例中，GOI编码基因的插入并不显著影响，例如上调或下调白蛋白基因的表达。
在一些实施例中，用于插入GOI编码基因的靶位点处于内源性白蛋白基因处、内或其附近。在一些实施例中，靶位点处于基因组中白蛋白基因位点的启动子上游的基因间区中。在一些实施例中，靶位点在白蛋白基因位点内。在一些实施例中，白蛋白基因位点的内含子中的一者中的靶位点。在一些实施例中，白蛋白基因位点的外显子中的一者中的靶位点。在一些实施例中，靶位点处于白蛋白基因位点的内含子与外显子(或反之亦然)之间的接合点中的一者中。在一些实施例中，靶位点处于白蛋白基因位点的第一内含子(或内含子1)中。在某些实施例中，靶位点在白蛋白基因的第一外显子下游(即来自第一外显子的最后一个核酸)至少约或至多0、1、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500或550或600或650bp。在一些实施例中，靶位点在白蛋白基因的第一内含子上游至少约或至多0.1kb、约0.2kb、约0.3kb、约0.4kb、约0.5kb、约1kb、约1.5kb、约2kb、约2.5kb、约3kb、约3.5kb、约4kb、约4.5kb或约5kb。在一些实施例中，靶位点在白蛋白基因的第二外显子上游约0bp到约100bp、上游约101bp到约200bp、上游约201bp到约300bp、上游约301bp到约400bp、约401bp到约500bp、上游约501bp到约600bp、上游约601bp到约700bp、上游约701bp到约800bp、上游约801bp到约900bp、上游约901bp到约1000bp、上游约1001bp到约1500bp、上游约1501bp到约2000bp、上游约2001bp到约2500bp、上游约2501bp到约3000bp、上游约3001bp到约3500bp、约3501bp到约4000bp、上游约4001bp到约4500bp，或上游约4501bp到约5000bp内的任何位置。在一些实施例中，靶位点在基因组中的人类白蛋白基因的第一外显子的末端(即3'末端)下游至少37bp。在一些实施例中，靶位点在基因组中的人类白蛋白基因的第二外显子的开始(即5'开始)上游至少330bp。
在一些实施例中，本文提供一种在细胞中编辑基因组的方法，所述方法包含向所述细胞提供以下各者：(a)gRNA，其包含来自SEQ ID NO:18-44和104中的任一个的间隔序列，或编码gRNA的核酸；(b)DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸；以及(c)供体模板，其包含编码GOI或功能衍生物的核酸序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21、22、28和30中的任一者的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：21的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：22的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：28的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：30的间隔序列。在一些实施例中，细胞是人类细胞，例如人类肝细胞。
在一些实施例中，根据本文所描述的在细胞中编辑基因组的方法中的任一种，DNA核酸内切酶识别具有序列NGG或NNGG的原间隔区相邻基序(PAM)，其中N是任何核苷酸或其功能衍生物。在一些实施例中，DNA核酸内切酶是II型Cas核酸内切酶或其功能衍生物。在一些实施例中，DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，Cas9来自酿脓链球菌(spCas9)。在一些实施例中，Cas9来自路邓葡萄球菌(SluCas9)。
在一些实施例中，根据本文所描述的在细胞中编辑基因组的方法中的任一种，编码GOI或其功能衍生物的核酸序列经密码子优化以用于在细胞中表达。在一些实施例中，细胞是人类细胞。
在一些实施例中，根据本文所描述的在细胞中编辑基因组的方法中的任一种，所述方法采用编码DNA核酸内切酶的核酸。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸经密码子优化以用于在细胞中表达。在一些实施例中，细胞是人类细胞，例如人类肝细胞。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是DNA，如DNA质粒。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是RNA，如mRNA。
在一些实施例中，根据本文所描述的在细胞中编辑基因组的方法中的任一种，供体模板在AAV载体中编码。在一些实施例中，供体模板包含供体盒，其包含编码目的基因(GOI)或功能衍生物的核酸序列，并且供体盒在一侧或两侧上侧接gRNA靶位点。在一些实施例中，供体盒的两侧上侧接gRNA靶位点。在一些实施例中，gRNA靶位点是(a)的gRNA的靶位点。在一些实施例中，供体模板的gRNA靶位点是(a)的gRNA的细胞基因组gRNA靶位点的反向补体。
在一些实施例中，根据本文所描述的在细胞中编辑基因组的方法中的任一种，将DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施例中，脂质体或脂质纳米颗粒还包含gRNA。在一些实施例中，脂质体或脂质纳米颗粒是脂质纳米颗粒。在一些实施例中，所述方法采用脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含编码DNA核酸内切酶的核酸和gRNA。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是编码DNA核酸内切酶的mRNA。
在一些实施例中，根据本文所描述的在细胞中编辑基因组的方法中的任一种，DNA核酸内切酶与gRNA预复合，形成RNP复合物。
在一些实施例中，根据本文所描述的在细胞中编辑基因组的方法中的任一种，在将(c)的供体模板提供到细胞之后，将(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸提供到细胞。在一些实施例中，在将(c)的供体模板提供到细胞之后超过4天，将(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸提供到细胞。在一些实施例中，在将(c)的供体模板提供到细胞之后至少14天，将(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸提供到细胞。在一些实施例中，在将(c)的供体模板提供到细胞之后至少17天，将(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸提供到细胞。在一些实施例中，将(a)和(b)作为脂质纳米颗粒提供到细胞，所述脂质纳米颗粒包含编码DNA核酸内切酶的核酸和gRNA。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是编码DNA核酸内切酶的mRNA。在一些实施例中，将(c)作为编码供体模板的AAV载体提供到细胞。
在一些实施例中，根据本文所描述的在细胞中编辑基因组的方法中的任一种，在第一剂量的(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸之后，向细胞提供一个或多个额外剂量的(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸。在一些实施例中，在第一剂量的(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸之后，向细胞提供一个或多个额外剂量的(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸，直到达到编码目的基因(GOI)或功能衍生物的核酸序列的靶向整合的目标水平和/或编码GOI或功能衍生物的核酸序列的表达的目标水平。
在一些实施例中，根据本文所描述的在细胞中编辑基因组的方法中的任一种，在内源性白蛋白启动子的控制下表达编码GOI或功能衍生物的核酸序列。
在一些实施例中，本文提供一种将GOI或其功能衍生物插入到细胞基因组的白蛋白位点中的方法，其包含将(a)Cas DNA核酸内切酶(例如，Cas9)或编码Cas DNA核酸内切酶的核酸，(b)gRNA或编码gRNA的核酸，以及(c)根据本文所描述的实施例中的任一个的供体模板引入到细胞中，其中gRNA能够引导Cas DNA核酸内切酶裂解白蛋白位点中的目标多核苷酸序列，所述供体模板包含GOI或其功能衍生物。在一些实施例中，所述方法包含将编码Cas DNA核酸内切酶的mRNA引入到细胞中。在一些实施例中，所述方法包含将根据本文所描述的实施例中的任一个的LNP引入到细胞中，所述LNP包含i)编码Cas DNA核酸内切酶的mRNA和ii)gRNA。在一些实施例中，供体模板是AAV供体模板。在一些实施例中，供体模板包含供体盒，所述供体盒包含GOI或其功能衍生物，其中供体盒在一侧或两侧上侧接gRNA的靶位点。在一些实施例中，侧接供体盒的gRNA靶位点是白蛋白位点中的gRNA靶位点的反向补体。在一些实施例中，在将供体模板引入到细胞中之后，将Cas DNA核酸内切酶和编码CasDNA核酸内切酶和gRNA或编码gRNA的核酸引入到细胞中。在一些实施例中，在将供体模板引入到细胞中之后，将Cas DNA核酸内切酶或编码Cas DNA核酸内切酶的核酸，和gRNA或编码gRNA的核酸引入到细胞中足够的时间，以允许供体模板进入细胞核。在一些实施例中，在将供体模板引入到细胞中之后，将Cas DNA核酸内切酶或编码Cas DNA核酸内切酶的核酸，和gRNA或编码gRNA的核酸引入到细胞中足够的时间，以允许供体模板从单链AAV基因组转换成细胞核中的双链DNA分子。在一些实施例中，Cas DNA核酸内切酶是Cas9。
在一些实施例中，根据将GOI或其功能衍生物插入到本文所描述的细胞基因组的白蛋白位点中的方法中的任一种，目标多核苷酸序列处于白蛋白基因的内含子1中。在一些实施例中，gRNA包含表3或4中所列出的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ IDNO:18-44和104中的任一者的间隔序列，或编码gRNA的核酸。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21、22、28和30中的任一者的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQID NO：21的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：22的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：28的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ IDNO：30的间隔序列。
在一些实施例中，本文提供一种将GOI或其功能衍生物插入到细胞基因组的白蛋白位点中的方法，其包含将(a)根据本文所描述的实施例中的任一个的LNP，和(b)根据本文所描述的实施例中的任一个的AAV供体模板引入到细胞中，所述LNP包含i)编码Cas9 DNA核酸内切酶的mRNA和ii)gRNA，其中gRNA能够引导Cas9 DNA核酸内切酶裂解白蛋白位点中的目标多核苷酸序列，所述AAV供体模板包含GOI或其功能衍生物。在一些实施例中，供体模板包含供体盒，所述供体盒包含GOI或其功能衍生物，其中供体盒在一侧或两侧上侧接gRNA的靶位点。在一些实施例中，侧接供体盒的gRNA靶位点是白蛋白位点中的gRNA靶位点的反向补体。在一些实施例中，在将AAV供体模板引入到细胞中之后将LNP引入到细胞中。在一些实施例中，在将AAV供体模板引入到细胞中之后，将LNP引入到细胞中足够的时间以允许供体模板进入细胞核。在一些实施例中，在将AAV供体模板引入到细胞中之后，将LNP引入到细胞中足够的时间以允许供体模板从单链AAV基因组转换成细胞核中的双链DNA分子。在一些实施例中，在将LNP首先引入到细胞中之后，进行LNP到细胞中的一次或多次(如2、3、4、5或更多次)额外引入。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:18-44和104中的任一者的间隔序列，或编码gRNA的核酸。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21、22、28和30中的任一者的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：21的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：22的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：28的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：30的间隔序列。
靶序列选择
在一些实施例中，可以使用5'边界和/或3'边界相对于特定参考位点的移位来促进或增强基因编辑的特定应用，这部分取决于选择用于编辑的核酸内切酶系统，如本文中进一步描述和说明。
在此类靶序列选择的第一非限制性方面中，许多核酸内切酶系统具有引导潜在靶位点的初始选择以供裂解的规则或标准，如在CRISPR II型或V型核酸内切酶的情况下，邻近DNA裂解位点的特定位置中的PAM序列基序的要求。
在靶序列选择或优化的另一个非限制性方面中，可以相对于中靶活性频率来评估靶序列和基因编辑核酸内切酶的特定组合的“脱靶”活性频率(即，在除了所选靶序列之外的位点处发生DSB的频率)。在一些情况下，已在期望位点正确编辑的细胞可以具有相对于其它细胞的选择性优点。选择性优点的说明性但非限制性实例包括获取如以下等属性：增强的复制率、持久性、对某些条件的抗性、增强的成功移植率或者在引入到患者体内之后的体内持久性、以及与维持此类细胞或增加此类细胞的数量或活力相关的其它属性。在其它情况下，可以通过用于识别、分类或以其它方式选择已经被正确编辑的细胞的一种或多种筛选方法来积极地选择已经在期望位点处被正确编辑的细胞。选择性优点和定向选择方法两者都可以利用与校正相关的表现型。在一些实施例中，可以编辑细胞两次或更多次，以便创建产生用于选择或纯化预期细胞群体的新表现型的第二修饰。可以通过为可选择或可筛选标记添加第二gRNA来产生此类第二修饰。在一些情况下，可以使用含有cDNA的DNA片段和可选标记来正确地编辑期望位点处的细胞。
在一些实施例中，无论任何选择性优点适用还是要在特定情况下应用任何定向选择，还可以通过考虑脱靶频率来引导靶序列选择，以便增强应用的效率和/或减小在除了期望目标之外的位点处发生不期望的改变的可能性。如本文中和所属领域中进一步描述和说明的，脱靶活性的发生受许多因素以及所使用的特定核酸内切酶的影响，所述因素包括靶位点与各种脱靶位点之间的类似点和不同点。可获得辅助预测脱靶活性的生物信息学工具，并且这种工具也可以频繁用于识别最可能的脱靶活性位点，然后可以在实验环境中对所述位点进行评估以评价脱靶活性相对于中靶活性的频率，由此允许选择具有较高相对中靶活性的序列。本文提供了此类技术的说明性实例，并且其它技术在所属领域中是已知的。
靶序列选择的另一方面涉及同源重组事件。共享同源区的序列可以充当导致插入序列缺失的同源重组事件的焦点。这种重组事件发生在染色体和其它DNA序列的正常复制过程期间，并且还在合成DNA序列的其它时间发生，如在双链断裂(DSB)修复的情况下，所述双链断裂在正常细胞复制周期期间有规律地发生，但还可以通过各种事件(如UV光以及DNA断裂的其它诱导物)的发生或某些药剂(如各种化学诱导物)的存在得到增强。许多此类诱导物使DSB在基因组中任意地发生，并且DSB可以在正常细胞中有规律地诱导和修复。在修复期间，可以完全保真地重构原始序列，然而，在一些情况下，在DSB位点处引入小型插入或缺失(被称为“插入缺失”)。
如在本文所描述的核酸内切酶系统的情况下，还可以在特定位置特异性地诱导DSB，其可以用于引起所选择的染色体位置处的定向或优先基因修饰事件。可以在多种情形下利用同原序列在DNA修复(以及复制)的背景下经受重组的趋势，并且所述趋势是如CRISPR等基因编辑系统的一个应用的基础，在所述应用中，使用同源定向修复将通过使用“供体”多核苷酸提供的目的序列插入到期望染色体位置中。
还可以使用特定序列之间的同源区来产生所需缺失，所述同源区可以是可以具有少到十个碱基对或更少的“微同源性”小区域。例如，可以在表现出与附近序列具有微同源性的位点处引入单个DSB。在修复此类DSB的正常过程期间，高频率发生的结果是，由于DSB和伴随的细胞修复过程所促进的重组导致插入序列缺失。
然而，在一些情形下，选择同源区内的靶序列还可以产生大得多的缺失，包括基因融合体(当缺失在编码区中时)，考虑到特定情形，所述缺失可以是期望的或者可以是不期望的。
本文所提供的实例进一步说明了为产生设计用于插入GOI(例如FVIII-编码基因)的DSB而选择的各种目标区域，以及在此类区域内选择特异性靶序列，所述区域被设计成使相对于中靶事件的脱靶事件最小化。
靶向整合
在一些实施例中，本文所提供的方法是将目的基因(GOI)或功能GOI整合在被称为“靶向整合”的肝细胞的基因组中的特定位置处。在一些实施例中，通过使用序列特异性核酸酶以在基因组DNA中产生双链断裂来实现靶向整合。
在一些实施例中使用的CRISPR-Cas系统具有以下优点：可以快速筛选大量基因组目标以识别最优CRISPR-Cas设计。CRISPR-Cas系统使用称为单一向导RNA(sgRNA)的RNA分子，其将相关Cas核酸酶(例如，Cas9核酸酶)靶向到DNA中的特定序列。此靶向通过sgRNA与sgRNA的大约20bp靶向序列内的基因组序列之间的基于沃森-克里克的配对进行。一旦在靶位点处结合，Cas核酸酶使基因组DNA的两个链裂解，产生双链断裂。设计sgRNA以靶向特定DNA序列的唯一要求是靶序列必须在sgRNA序列的3'末端含有与基因组序列互补的原间隔区相邻基序(PAM)序列。在Cas9核酸酶的情况下，PAM序列是NRG(其中R是A或G且N是任何碱基)，或更受限制的PAM序列NGG。因此，可以通过邻近于所有PAM基序定位20bp序列来通过计算机设计的方式靶向基因组的任何区域的sgRNA分子。PAM基序在真核生物的基因组中平均出现15bp。然而，通过计算机方法设计的sgRNA将在具有不同效率的细胞中产生双链断裂，并且不可能使用计算机方法预测一系列sgRNA分子的切割效率。因为sgRNA可以在体外快速合成，所以这使得能够快速筛选给定基因组区域中的所有潜在sgRNA序列以识别产生最有效切割的sgRNA。一般来说，当在细胞中测试给定基因组区域内的sgRNA系列时，观察到的裂解效率范围在0与90％之间。计算机算法以及实验室实验还可以用于确定任何给定sgRNA的脱靶潜能。尽管与sgRNA的20bp识别序列的完美匹配主要在大多数真核基因组中仅出现一次，但在基因组中还会有许多其他位点与sgRNA错配1个或多个碱基。这些位点可以以可变频率裂解，所述频率通常无法根据错配的数量或位置预测。还可以发生在未通过计算机分析识别的额外脱靶位点处的裂解。因此，筛选相关细胞类型中的sgRNA的数目以识别具有最有利的脱靶特征的sgRNA是选择用于治疗用途的最优sgRNA的重要组分。有利的脱靶特征不仅要考虑实际脱靶位点的数量和在这些位点的切割频率，还要考虑这些位点在基因组中的位置。例如，与功能上重要的基因(尤其是致癌基因或抗癌基因)接近或相距较远的脱靶位点，将被视为不如基因功能区中功能未知的位点更不有利。因此，无法简单地通过对生物的基因组序列进行计算机分析来预测最优sgRNA的识别，但需要实验测试。虽然计算机分析可能有助于缩小测试引导的数量，但它无法预测中靶切割较高的引导或预测期望脱靶切割较低的引导。实验数据表明，sgRNA的切割效率各自与目的区域(如白蛋白内含子1)中的基因组完全匹配，在未切割到>90％的切割范围内变化，并且无法由任何已知算法预测。给定sgRNA促进Cas酶的裂解的能力可能涉及基因组DNA中的所述特定位点的可接入性，其可以由所述区域中的染色质结构确定。虽然静态分化细胞(如肝细胞)中的大部分基因组DNA存在于高度缩合的异染色质中，而主动转录的区域则以更开放的染色质状态存在，已知该状态更容易接近大分子(如像Cas蛋白质的蛋白质)。甚至在主动转录的基因内，由于存在或不存在结合的转录因子或其它调节蛋白，DNA的一些特定区域比其它区域更可接近。无法预测基因组中或特定基因组位点内或基因组位点(例如内含子)和如白蛋白内含子1的区域内的位点，因此需要在相关细胞类型中通过实验确定。一旦选择了一些位点作为潜在的插入位点，就有可能向此类位点添加一些变化，例如，在有或没有实验测试的情况下，通过在选定位点的上游或下游移动几个核苷酸来实现。
在一些实施例中，可以用于本文所公开的方法中的gRNA是表3中所列出的一个或多个或其与表3中的那些具有至少约85％核苷酸序列一致性的任何衍生物。
核酸修饰
在一些实施例中，引入到细胞中的多核苷酸具有可以单独地或组合地用于例如提高活性、稳定性或特异性、改变递送、降低宿主细胞中的先天性免疫反应，或用于其它增强的一种或多种修饰，如本文中进一步描述并且所属领域中已知的。
在某些实施例中，在CRISPR/Cas9/Cpf1系统中使用修饰的多核苷酸，在这种情况下，向导RNA(单分子向导或双分子向导)和/或对引入到细胞中的Cas或Cpf1核酸内切酶进行编码的DNA或RNA可以被修饰，如下文所描述和说明的。可以在CRISPR/Cas9/Cpf1系统中使用此类修饰的多核苷酸来编辑任何一个或多个基因组位点。
出于非限制性说明此类用途的目的使用CRISPR/Cas9/Cpf1系统，可以使用对向导RNA的修饰来增强具有向导RNA和Cas或Cpf1核酸内切酶的CRISPR/Cas9/Cpf1基因组编辑复合物的形成和稳定性，所述向导RNA可以是单分子向导或双分子。对向导RNA的修饰还可以或可替代地用于增强基因组编辑复合物与基因组中的靶序列之间的相互作用的初始化、稳定性或动力学，这可以例如用于提高中靶活性。对向导RNA的修饰还可以或可替代地用于增强特异性，例如，中靶位点处的基因组编辑相比于其它(脱靶)位点处的效应的相对速率。
修饰还可以或可替代地用于例如通过增加向导RNA被细胞中存在的核糖核酸酶(RNA酶)降解的抗性来提高向导RNA的稳定性，由此使向导RNA在细胞中的半衰期增加。在经由需要翻译生成核酸内切酶的RNA将Cas或Cpf1核酸内切酶引入到待编辑的细胞中的实施例中，增加向导RNA半衰期的修饰可能是特别有用的，这是因为增加在RNA对核酸内切酶进行编码的同时引入的向导RNA的半衰期可以用于增加向导RNA和经编码的Cas或Cpf1核酸内切酶共存于细胞中的时间。
修饰还可以或可替代地用于降低引入到细胞中的RNA引起先天性免疫反应的可能性或程度。如下文和所属领域中描述的已经在包括小干扰RNA(siRNA)的RNA干扰(RNAi)的背景下得到充分表征的此类反应往往与RNA的半衰期的降低相关和/或与细胞因子或与免疫反应相关的其它因子的引出相关。
还可以对引入到细胞中的编码核酸内切酶的RNA进行一种或多种类型的修饰，包括(但不限于)增强RNA的稳定性的修饰(如通过提高细胞中存在的RNA酶对其进行的降解)、增强对所得产物(即，核酸内切酶)的翻译的修饰，和/或降低引入到细胞中的RNA引起先天性免疫反应的可能性或程度的修饰。
同样可以使用如前述和其它修饰等修饰的组合。例如，在CRISPR/Cas9/Cpf1的情况下，可以对向导RNA进行一种或多种类型的修饰(包括上文中所例示的那些修饰)和/或可以对编码Cas核酸内切酶的RNA进行一种或多种类型的修饰(包括上文中所例示的那些修饰)。
通过说明的方式，CRISPR/Cas9/Cpf1系统中使用的向导RNA或其它更小的RNA可以通过化学手段轻易地合成，从而使许多修饰能够轻易地并入，如在下文中说明并且在所属领域中描述的。虽然化学合成程序不断扩展，但是在多核苷酸长度显著增大超过一百个核苷酸左右时，通过如高效液相色谱法(HPLC，其避免了使用如PAGE等凝胶)等程序来纯化此类RNA往往变得更具挑战性。用于生成更大长度的化学修饰的RNA的一种方式是产生连接在一起的两个或更多个分子。如编码Cas9核酸内切酶的那些长得多的RNA更容易通过酶生成。虽然较少类型的修饰通常可用于酶产生的RNA中，但是仍然存在可以用于例如增强稳定性、降低先天性免疫反应的可能性或程度和/或增强其它属性的修饰，如下文和所属领域中进一步描述的；并且正在定期开发新类型的修饰。
通过说明各种类型的修饰的方式，特别是频繁地与较小化学合成RNA一起使用的那些修饰，修饰可以包括在糖的2'位置处修饰的一个或多个核苷酸，在一些实施例中，所述一个或多个核苷酸为2'-O-烷基、2'-O-烷基-O-烷基，或2'-氟修饰的核苷酸。在一些实施例中，RNA修饰包括在RNA的3'末端的嘧啶、无碱基残基或反向碱基的核糖上的2'-氟、2'-氨基或2'O-甲基修饰。此类修饰通常并入寡核苷酸中，并且这些寡核苷酸已经显示具有比针对给定目标2'-脱氧寡核苷酸更高的Tm(即，更高的目标结合亲和力)。
许多核苷酸和核苷修饰已经显示为使其所并入的寡核苷酸相比于天然寡核苷酸对核酸酶分解更具抗性；相比于未修饰的寡核苷酸，这些修饰的寡核苷酸在更长的时间内保持完整。修饰的寡核苷酸的具体实例包括具有修饰的主链的那些，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。一些寡核苷酸是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的那些寡核苷酸，特别是CH2-NH-O-CH2、CH、～N(CH3)～O～CH2(被称为亚甲基(甲亚氨基)或MMI主链)、CH2--O--N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2主链，其中天然磷酸二酯主链表示为O-P--O-CH；酰胺主链[参见De Mesmaeker等人,《化学研究述评(Ace.Chem.Res.)》,28：366-374(1995)]；吗啉基主链结构(参见Summerton和Weller，美国专利第5,034,506号)；肽核酸(PNA)主链(其中寡核苷酸的磷酸二酯主链被替代为聚酰胺主链，核苷酸与聚酰胺主链的氮杂氮原子直接或间接结合，参见Nielsen等人,《科学》1991,254,1497)。含磷键包括(但不限于)：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3'亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(具有3'-氨基磷酰胺酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代磷酰胺酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯，和具有正常3'-5'键的硼磷酸酯、这些酯的2'-5'连接类似物以及具有反向极性的那些酯，其中相邻对的核苷单位以3'-5'到5'-3'或2'-5'到5'-2'来连接；参见美国专利第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,196号；第5,188,897号；第5,264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,306号；第5,550,111号；第5,563,253号、第5,571,799号；第5,587,361号和第5,625,050号。
基于吗啉基的低聚化合物描述于以下中：Braasch和David Corey,《生物化学(Biochemistry)》,41(14)：4503-4510(2002)；《遗传学(Genesis)》,第30卷,第3期(2001)；Heasman,《发育生物学(Dev.Biol.)》,243：209-214(2002)；Nasevicius等人,《自然遗传学(Nat.Genet.)》,26：216-220(2000)；Lacerra等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,97：9591-9596(2000)；以及1991年7月23日发布的美国专利第5,034,506号。
在Wang等人,《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》,122：8595-8602(2000)中描述了环己烯基核酸寡核苷酸模拟物。
其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸主链具有由以下形成的主链：短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。这些主链具有那些具有吗啉基键(部分由核苷的糖部分形成)的主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；含烯烃主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其它主链；参见美国专利第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,264,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,610,289号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号和第5,677,439号，其中每一者通过引用的方式并入本文。
还可以包括一个或多个取代的糖部分，例如，在2'位置处的以下中的一个：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3、OCH3 O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2或O(CH2)n CH3，其中n是1到约10；C1到C10低级烷基、烷氧基烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2 CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨烷基氨基；聚烷氨基；取代的甲硅烷基；RNA裂解基团；报告基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或者用于改善寡核苷酸的药效性质的基团、以及具有类似性质的其它取代基。在一些实施例中，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧乙基))(Martin等人,《HeIv化学学报(HeIv.Chim.Acta)》,1995,78,486)。其它修饰包括2'-甲氧基(2'-O-CH3)、2'-丙氧基(2'-OCH2CH2CH3)和2'-氟(2'-F)。还可以在寡核苷酸上的其它位置处进行类似修饰，特别是3'末端核苷酸上的糖的3'位置处以及5'末端核苷酸的5'位置处。寡核苷酸还可以具有糖模拟物，如替代戊呋喃糖基的环丁基。
在一些实施例中，核苷酸单元的糖和核苷间键(即，主链)都被新颖基团替代。保持碱基单元与适当的核酸目标化合物杂交。一种此类低聚化合物，即已经显示具有优异杂交性质的寡核苷酸模拟物，被称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，将寡核苷酸的糖主链替代为含酰胺主链，例如氨基乙基甘氨酸主链。核碱基经保留且直接或间接结合到主链的酰胺部分的氮杂氮原子。教导制备PNA化合物的代表性美国专利具有但不限于美国专利第5,539,082号、第5,714,331号和第5,719,262号。可以在Nielsen等人,《科学》,254：1497-1500(1991)中找到PNA化合物的其它教导。
在一些实施例中，另外或可替代地，向导RNA还可以包括核碱基(在所属领域中常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所使用，“未经修饰的”或“天然”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括仅很少或瞬时发现于天然核酸中的核碱基，例如，次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶(特别是5-甲基胞嘧啶(也被称为5-甲基-2'脱氧胞嘧啶并且在所属领域中常被称为5-Me-C))、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基HMC、以及合成的核碱基，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(吲唑基甲基)腺嘌呤、2-(氨甲基氨基)腺嘌呤或其它杂取代的甲基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基脲嘧啶、8-氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。Kornberg,A.,《DNA复制(DNA Replication)》,W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.),旧金山,第75-77页(1980)；Gebeyehu等人,《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》15：4513(1997)。还可以包括所属领域中已知的“通用”碱基，例如，肌苷。已显示5-Me-C取代将核酸双链体稳定性增加0.6到1.2℃。(Sanghvi,Y.S.、Crooke,S.T.和Lebleu,B.编,《反义研究和应用(Antisense Research and Applications)》,CRC出版社,波卡拉顿(Boca Raton),1993,第276-278页)，并且是碱基取代的实施例。
在一些实施例中，修饰的核碱基包括其它合成的和天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-卤尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代尤其是5-溴代、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤；以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
进一步地，核碱基可以包括以下中公开的那些核碱基：美国专利第3,687,808号；《聚合物科学与工程简明百科全书(The Concise Encyclopedia of Polymer Science AndEngineering)》,第858到859页,Kroschwitz,J.I.编,约翰威利父子公司(John Wiley&Sons),1990；Englisch等人《应用化学(Angewandle Chemie)国际版》,1991,30,第613页；和Sanghvi,Y.S.,第15章,《反义研究与应用》,第289到302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编,CRC出版社,1993。这些核碱基中的某些核碱基对提高本公开的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，具有2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经显示，5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性提高了0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.、Crooke,S.T.和Lebleu,B.编,《反义研究与应用》,CRC出版社,波卡拉顿,1993,第276-278页)，并且是碱基取代的实施例，甚至更尤其是与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。修饰的核碱基描述于美国专利第3,687,808号以及第4,845,205号、第5,130,302号、第5,134,066号、第5,175,273号、第5,367,066号、第5,432,272号、第5,457,187号、第5,459,255号、第5,484,908号、第5,502,177号、第5,525,711号、第5,552,540号、第5,587,469号、第5,596,091号、第5,614,617号、第5,681,941号、第5,750,692号、第5,763,588号、第5,830,653号、第6,005,096号；和美国专利申请公开2003/0158403。
在一些实施例中，编码核酸内切酶的向导RNA和/或mRNA(或DNA)以化学方式连接到一个或多个部分或缀合物，所述部分或缀合物增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。一些部分包括(但不限于)：脂质部分，如胆固醇部分[Letsinger等人,《美国国家科学院院刊》,86：6553-6556(1989)]；胆酸[Manoharan等人,《生物有机化学与医药化学快报(Bioorg.Med.Chem.Let.)》,4：1053-1060(1994)]；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇[Manoharan等人,《纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》,660：306-309(1992)和Manoharan等人,《生物有机化学与医药化学快报》,3：2765-2770(1993)]；巯基胆固醇[Oberhauser等人,《核酸研究》,20：533-538(1992)]；脂肪链，例如十二烷基二醇或十一烷基残基[Kabanov等人,《FEBS快报(FEBS Lett.)》,259：327-330(1990)和Svinarchuk等人,《生物化学(Biochimie)》,75：49-54(1993)]；磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-丙三基-3-H-磷酸酯[Manoharan等人,《四面体快报(Tetrahedron Lett.)》,36：3651-3654(1995)以及Shea等人,《核酸研究》,18：3777-3783(1990)]；聚氨或聚乙二醇链[Mancharan等人,《核苷与核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)》,14:969-973(1995)]；金刚烷乙酸[Manoharan等人,《四面体快报》,36：3651-3654(1995)]；棕榈基部分[Mishra等人,《生物化学与生物物理学学报Biochim.Biophys.Acta)》,1264：229-237(1995)]；或者十八胺或己胺-羰基-叔羟胆固醇部分[Crooke等人,《药理学与实验治疗学期刊(J.Pharmacol.Exp.Ther.)》277：923-937(1996)]。还参见美国专利第4,828,979号、第4,948,882号、第5,218,105号、第5,525,465号、第5,541,313号、第5,545,730号、第5,552,538号、第5,578,717号、第5,580,731号、第5,580,731号、第5,591,584号、第5,109,124号、第5,118,802号、第5,138,045号、第5,414,077号、第5,486,603号、第5,512,439号、第5,578,718号、第5,608,046号、第4,587,044号、第4,605,735号、第4,667,025号、第4,762,779号、第4,789,737号、第4,824,941号、第4,835,263号、第4,876,335号、第4,904,582号、第4,958,013号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,245,022号、第5,254,469号、第5,258,506号、第5,262,536号、第5,272,250号、第5,292,873号、第5,317,098号、第5,371,241号、第5,391,723号、第5,416,203号、第5,451,463号、第5,510,475号、第5,512,667号、第5,514,785号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,595,726号、第5,597,696号、第5,599,923号、第5,599、928号和第5,688,941号。
在一些实施例中，可以使用糖或其它部分来将具有核苷酸(如阳离子多核糖体和脂质体)的蛋白质和复合物靶向到特定位点。例如，可以经由脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)介导肝细胞定向转移；参见例如Hu等人,《蛋白质和肽快报(Protein Pept Lett.)》21(10)：1025-30(2014)。可以使用所属领域中已知的和定期开发的其它系统来将本案例中使用的生物分子和/或其复合物特定目的靶向细胞。
在一些实施例中，这些靶向分子或缀合物可以包括与功能基团(如伯羟基或仲羟基)共价结合的缀合物基团。本公开的缀合物基团包括嵌入剂、报告分子、聚氨、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物的药效动力学性质的基团，和增强寡聚物的药代动力学性质的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、啡啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本公开的背景下，增强药效动力学性质的基团包括改善摄取、增强对降解的抗性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本公开的背景下，增强药代动力学性质的基团包括改进对本公开的化合物的摄取、分布、代谢或排泄的基团。1992年10月23日提交的国际专利申请第PCT/US92/09196号以及美国专利第6,287,860号中公开了代表性缀合物基团，其通过引用的方式并入本文中。缀合物部分包括(但不限于)脂质部分(如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如，己基-5-三苯甲基硫醇)、巯基胆固醇、脂肪链(例如，十二烷基二醇或十一基残基)、磷脂(例如，二-十六基-外消旋-甘油或1,2-二-O-十六基-外消旋-三丙基-3-H-膦酸三乙基铵)、聚氨或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸、棕榈基部分，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。参见例如美国专利第4,828,979号；第4,948,882号；第5,218,105号；第5,525,465号；第5,541,313号；第5,545,730号；第5,552,538号；第5,578,717号；第5,580,731号；第5,580,731号；第5,591,584号；第5,109,124号；第5,118,802号；第5,138,045号；第5,414,077号；第5,486,603号；第5,512,439号；第5,578,718号；第5,608,046号；第4,587,044号；第4,605,735号；第4,667,025号；第4,762,779号；第4,789,737号；第4,824,941号；第4,835,263号；第4,876,335号；第4,904,582号；第4,958,013号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,245,022号；第5,254,469号；第5,258,506号；第5,262,536号；第5,272,250号；第5,292,873号；第5,317,098号；第5,371,241号；第5,391,723号；第5,416,203号；第5,451,463号；第5,510,475号；第5,512,667号；第5,514,785号；第5,565,552号；第5,567,810号；第5,574,142号；第5,585,481号；第5,587,371号；第5,595,726号；第5,597,696号；第5,599,923号；第5,599,928号和第5,688,941号。
还可以通过各种手段对较不易于化学合成并且通常通过酶合成产生的较长多核苷酸进行修饰。此类修饰可以包括例如引入某些核苷酸类似物、在分子的5'或3'端处并入特定序列或其它部分，以及其它修饰。通过说明的方式，编码Cas9的mRNA的长度为约4kb并且可以通过体外转录来合成。可以应用对mRNA的修饰，以便例如提高其翻译或稳定性(如通过提高其对被细胞降解的抗性)或降低RNA引起通常在引入外源RNA特别是如对Cas9进行编码的RNA等较长RNA之后在细胞中观察到的先天性免疫反应的趋势。
所属领域中已经描述了许多此类修饰，如聚A尾、5'帽类似物(例如，抗反向帽类似物(ARCA)或m7G(5')ppp(5')G(mCAP))、修饰的5'或3'非翻译区(UTR)、使用修饰的碱基(如假UTP、2-硫代-UTP、5-甲基胞苷-5'-三磷酸脂(5-甲基-CTP)或N6-甲基-ATP)，或用磷酸酶进行治疗以移除5'末端磷酸酯。这些和其它修饰在所属领域中是已知的，并且正在定期开发对RNA的新修饰。
修饰的RNA有许多商业供应商，包括例如TriLink Biotech、AxoLabs、Bio-Synthesis Inc.、Dharmacon等。例如，如TriLink所描述的，可以使用5-甲基-CTP来赋予期望特征，如核酸酶稳定性提高、翻译提高、或先天性免疫受体与经过体外转录的RNA的相互作用减少。已经显示，5-甲基胞苷-5'-三磷酸酯(5-甲基-CTP)、N6-甲基-ATP和假UTP和2-硫代-UTP在培养时并且在体内也减少了先天性免疫刺激，同时增强了翻译，如下文中参考的Kormann等人和Warren等人的出版物中说明的。
已经显示，可以使用体内递送的化学修饰的mRNA来实现改善的治疗效果；参见例如，Kormann等人,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》29,154-157(2011)。此类修饰可以例如用于提高RNA分子的稳定性和/或降低其免疫原性。通过使用如假U、N6-甲基-A、2-硫代-U和5-甲基-C等化学修饰，发现分别使用2-硫代-U和5-甲基-C来取代尿苷残基和胞苷残基的仅四分之一导致在小鼠中对mRNA进行的toll样受体(TLR)介导识别显著减少。通过减少激活先天性免疫系统，这些修饰可以用于有效地提高mRNA的体内稳定性和寿命；参见例如Kormann等人，同上。
还已展示，重复给予并入经设计以绕过先天性抗病毒反应的修饰的合成信使RNA可以将分化的人类细胞重新编程为具有多能性。参见例如Warren等人,《细胞干细胞(CellStem Cell)》,7(5)：618-30(2010)。充当原代重新编程蛋白质的此类修饰的mRNA可能是对多种人类细胞类型进行重新编程的高效手段。此类细胞被称为诱导的多能干细胞(iPSC)，并且已经发现，可以使用并入了5-甲基-CTP、假UTP和抗反向帽类似物(ARCA)的酶合成RNA来有效地规避细胞的抗病毒反应；参见例如Warren等人，同上。
所属领域中描述的其它多核苷酸修饰包括例如使用聚A尾、添加5'端帽类似物(如m7G(5')ppp(5')G(mCAP))、修饰5'或3'非翻译区(UTR)或用磷酸酶进行治疗以移除5'末端磷酸酯-并且正在定期开发新的方法。
已经结合对RNA干扰(RNAi)的修饰开发了适用于生成本文所使用的修饰的RNA的许多组合物和技术，包括小干扰RNA(siRNA)。siRNA在体内呈现出特定挑战，因为siRNA经由mRNA干扰对基因沉默的影响通常是短暂的，这会需要重复给予。此外，siRNA是双链RNA(dsRNA)，并且哺乳动物细胞具有已经演化成检测并且中和dsRNA的免疫反应，这常常是病毒感染的副产物。因此，存在如PKR(dsRNA反应性激酶)等哺乳动物酶和可以介导对dsRNA的细胞反应的可能的视黄酸诱导型基因I(RIG-I)以及可以响应于这种分子而触发诱导细胞因子的Toll样受体(如TLR3、TLR7和TLR8)；参见例如，Angart等人的评述,《药物(Pharmaceuticals)》,(巴塞尔)6(4)：440-468(2013)；Kanasty等人,《分子疗法(MolecularTherapy)》20(3)：513-524(2012)；Burnett等人,《生物技术杂志(Biotechnol J.)》6(9)：1130-46(2011)；Judge和MacLachlan,《人类基因疗法(Hum Gene Ther)》19(2)：111-24(2008)；以及其中引用的参考文献。
大量修饰已经被开发并且应用于增强RNA稳定性、减少先天性免疫反应和/或结合将多核苷酸引入到人类细胞中实现会有用的其它益处，如本文所描述的；参见例如，Whitehead KA等人的评述,《化学与生物分子工程年评(Annual Review of Chemical andBiomolecular Engineering)》2：77-96(2011)；Gaglione和Messere,《药物化学短评(MiniRev Med Chem)》,10(7)：578-95(2010)；Chernolovskaya等人,《分子疗法时论(Curr OpinMol Ther.)》,12(2)：158-67(2010)；Deleavey等人,《核酸化学实验手册(Curr ProtocNucleic Acid Chem)》,第16章：第16.3单元(2009)；Behlke,《寡核苷酸(Oligonucleotides)》18(4)：305-19(2008)；Fucini等人,《核酸疗法(Nucleic AcidTher)》,22(3)：205-210(2012)；Bremsen等人,《遗传学前沿(Front Genet)》3：154(2012)。
如上所述，修饰的RNA有许多商业供应商，其中的许多供应商专门研究被设计成改善siRNA的有效性的修饰。基于文献中报告的各种发现提供了各种方法。例如，Dharmacon指出，用硫(硫代磷酸酯，PS)来替代非桥氧已经被广泛用于改进siRNA的核酸酶抗性，如Kole,《自然评论药物发现(Nature Reviews Drug Discovery)》11：125-140(2012)所报告的。据报告，对核糖的2'位置的修饰改进了核苷酸间磷酸键的核酸酶抗性，同时提高了双链体稳定性(Tm)，这还已经显示提供了针对免疫激活的保护。中度PS主链修饰与小型耐受性良好的2'-取代(2'-O-甲基、2'-氟、2'-氢)的组合与供体内应用的高度稳定siRNA相关，如Soutschek等人,《自然》432：173-178(2004)所报告的；并且据报告，2'-O-甲基修饰有效地改进了稳定性，如Volkov,《寡核苷酸(Oligonucleotides)》19：191-202(2009)所报告的。关于降低对先天性免疫反应的诱导，据报告，用2'-O-甲基、2'-氟、2'-氢来修饰特异性序列减少了TLR7/TLR8相互作用，同时总体上保存了沉默活性；参见例如，Judge等人,《分子疗法(Mol.Ther.)》13：494-505(2006)；以及Cekaite等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》365：90-108(2007)。还已经显示，如2-硫尿嘧啶、假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和N6-甲基腺苷等另外的修饰使通过TLR3、TLR7和TLR8介导的免疫效果最小化；参见例如，Kariko,K.等人,《免疫(Immunity)》23：165-175(2005)。
还如所属领域中已知的并且可商够获得的，许多缀合物可以应用于如RNA等可以增强由细胞对其进行的递送和/或摄取的供本文中使用的多核苷酸，包括例如胆固醇、生育酚和叶酸、脂质、肽、聚合物、连接子以及适配子；参见例如，Winkler的评述,《治疗递送(Ther.Deliv.)》4：791-809(2013)以及其中引用的参考文献。
递送
在一些实施例中，将本文所提供的方法中所使用的任何核酸分子(例如编码本公开的基因组靶向核酸的核酸和/或定点多肽)包装到递送媒剂中或所述递送媒剂表面上以递送到细胞。所考虑的递送媒剂包括(但不限于)纳米球、脂质体、量子点、纳米颗粒、聚乙二醇颗粒、水凝胶和胶束。如所属领域中所描述，多种靶向部分可以用于增强此类媒剂与期望细胞类型或位置的优先相互作用。
将本公开的复合物、多肽和核酸引入到细胞中可以通过以下方式发生：病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE右旋糖酐介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射、纳米颗粒介导的核酸递送和类似技术。
在一些实施例中，可以通过所属领域中已知的病毒递送媒剂或非病毒递送媒剂来递送向导RNA多核苷酸(RNA或DNA)和/或一个或多个核酸内切酶多核苷酸(RNA或DNA)。可替代地，可以通过所属领域中已知的如电穿孔或脂质纳米颗粒等病毒递送媒剂或非病毒递送媒剂来递送一个或多个核酸内切酶多肽。在一些实施例中，DNA核酸内切酶可以以作为一个或多个多肽单独地或以与一个或多个向导RNA或者一个或多个crRNA连同tracrRNA预复合的方式递送。
在一些实施例中，多核苷酸可以通过非病毒递送媒剂递送，包括(但不限于)纳米颗粒、脂质体、核糖核蛋白、带正电的肽、小分子RNA缀合物、适配子RNA嵌合体和RNA融合蛋白质复合物。一些示例性非病毒递送媒剂描述于Peer和Lieberman,《基因疗法(GeneTherapy)》,18：1127-1133(2011)(其集中于对递送其它多核苷酸有用的用于siRNA的非病毒递送媒剂)中。
在一些实施例中，可以通过脂质纳米颗粒(LNP)将编码核酸内切酶的多核苷酸(如向导RNA、sgRNA和mRNA)递送到细胞或患者。
尽管已经在动物模型中和在人类中测试了用于核酸的数种非病毒递送方法，但最充分开发的系统是脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒(LNP)通常由可电离阳离子脂质和3种或更多种额外组分(通常为胆固醇、DOPE和含有脂质的聚乙二醇(PEG))组成，参见例如实例2。阳离子脂质可以结合到带正电的核酸，形成保护核酸免于降解的致密复合物。在通过微流体系统期间，各组分自组装形成大小范围为50到150nM的颗粒，其中核酸被包封在与阳离子脂质复合的核中并且被脂质双层样结构包围。在注射到受试者的循环之后，这些颗粒可以结合到载脂蛋白E(apoE)。ApoE是LDL受体的配位体，并且经由受体介导的内吞作用介导肝细胞摄取。已经显示，此类型的LNP有效地将mRNA和siRNA递送到啮齿动物，灵长类动物和人类肝脏的肝细胞中。内吞之后，LNP存在于内体中。包封的核酸经历了阳离子脂质的可电离性质介导的内体逃逸过程。此将核酸递送到细胞质中，其中mRNA可以翻译成编码的蛋白质。因此，在一些实施例中，将编码Cas9的gRNA和mRNA包封到LNP中用于在IV注射之后将两种组分有效地递送至肝细胞。内体逸出之后，Cas9 mRNA被翻译成Cas9蛋白，并且可以与gRNA形成复合物。在一些实施例中，在Cas9蛋白质序列中包括核定位信号促进了Cas9蛋白质/gRNA复合物向核的移位。或者，小gRNA穿过核孔复合物并且与核中的Cas9蛋白质形成复合物。一旦进入细胞核，gRNA/Cas9复合物就会在基因组中扫描同源靶位点，并且优先在基因组中的期望靶位点产生双链断裂。体内RNA分子的半衰期短至数小时至数天。同样，蛋白质的半衰期往往很短，大约数小时至数天。因此，在一些实施例中，使用LNP递送gRNA和Cas9 mRNA可以仅导致gRNA/Cas9复合物的瞬时表达和活性。这可以提供减少脱靶裂解的频率的优点，并且因此使一些实施例中的遗传毒性的风险最小化。LNP通常不如病毒颗粒具有更高的免疫原性。尽管许多人对AAV具有预先存在的免疫力，但对LNP却没有预先存在的免疫力。此外，不太可能发生针对LNP的适应性免疫反应，从而能够重复给药LNP。
已经开发出几种不同的可电离的阳离子脂质用于LNP。这些包括C12-200(Love等人(2010),《美国国家科学院学报》,第107卷,1864-1869)、MC3、LN16、MD1等。在一种类型的LNP中，GalNac部分附接到LNP的外部，并且作为经由脱唾液酸糖蛋白受体被肝脏吸收的配位体。这些阳离子脂质中的任何一种均用于调配LNP，以将gRNA和Cas9 mRNA递送至肝脏。
在一些实施例中，LNP是指直径小于1000nm、500nm、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm或25nm的任何颗粒。或者，纳米颗粒的大小范围可以为1-1000nm、1-500nm、1-250nm、25-200nm、25-100nm、35-75nm或25-60nm。
LNP可以由阳离子脂质、阴离子脂质或中性脂质制成。如融合性磷脂DOPE或膜组分胆固醇等中性脂质可以包括在LNP中作为“辅助脂质”以增强转染活性和纳米颗粒稳定性。阳离子脂质的限制包括由于稳定性差和快速清除以及炎症反应或抗炎反应的生成而产生的低功效。LNP还可以具有疏水性脂质、亲水性脂质，或具有疏水性和亲水性脂质。
可以使用所属领域中已知的任何脂质或脂质组合来产生LNP。用于产生LNP的脂质的实例为：DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE和GL67A-DOPE-DMPE-聚乙二醇(PEG)。阳离子脂质的实例为：98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1和7C1。中性脂质的实例为：DPSC、DPPC、POPC、DOPE和SM。PEG修饰的脂质的实例为：PEG-DMG、PEG-CerC14和PEG-CerC20。
在一些实施例中，脂质可以以任何数量的摩尔比组合以产生LNP。此外，可以以广泛范围的摩尔比将一个或多个多核苷酸与一个或多个脂质组合以产生LNP。
在一些实施例中，定点多肽和基因组靶向核酸各自可以单独地给予细胞或患者。另一方面，可以将定点多肽与一个或多个向导RNA或者一个或多个crRNA连同tracrRNA预复合。然后可以将预复合的材料给予细胞或患者。此类预复合的材料被称为核糖核蛋白颗粒(RNP)。
RNA能够与RNA或DNA形成特异性相互作用。虽然在许多生物过程中利用了此性质，但是这在核酸富集的细胞环境中还伴随有混杂相互作用的风险。此问题的一种解决方案是形成核糖核蛋白颗粒(RNP)，在所述RNP中，RNA与核酸内切酶预复合。RNP的另一益处是保护RNA免于降解。
在一些实施例中，RNP中的核酸内切酶可以是修饰的或未修饰的。同样地，gRNA、crRNA、tracrRNA或sgRNA可以是修饰的或未修饰的。所属领域中已知许多修饰，并且可以使用所述修饰。
通常可以以1:1的摩尔比将核酸内切酶与sgRNA组合。或者，通常可以以1:1:1的摩尔比将核酸内切酶、crRNA与tracrRNA组合。然而，可以使用广泛范围的摩尔比来产生RNP。
在一些实施例中，可以使用重组的腺相关病毒(AAV)载体进行递送。用于产生rAAV颗粒的技术在所属领域中是标准的，在所述技术中，向细胞提供包括待递送多核苷酸的待包装AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能。rAAV的产生需要以下组分存在于单个细胞内(在本文中表示为包装细胞)：rAAV基因组、与rAAV基因组分开(即不在其中)的AAV rep和cap基因，以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自可产生重组病毒的任何AAV血清型，并且可来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型，包括(但不限于)AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13以及AAVrh.74。假型rAAV的产生公开于例如国际专利申请公开第WO 01/83692号中。参见表1。
表1.一些选定AAV的AAV血清型和基因库(Genbank)寄存号。
AAV血清型 基因库寄存编号
AAV-1 NC_002077.1
AAV-2 NC_001401.2
AAV-3 NC_001729.1
AAV-3B AF028705.1
AAV-4 NC_001829.1
AAV-5 NC_006152.1
AAV-6 AF028704.1
AAV-7 NC_006260.1
AAV-8 NC_006261.1
AAV-9 AX753250.1
AAV-10 AY631965.1
AAV-11 AY631966.1
AAV-12 DQ813647.1
AAV-13 EU285562.1
在一些实施例中，产生包装细胞的方法是创建稳定表达AAV颗粒产生的所有必需组分的细胞系。例如，具有缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组、与rAAV基因组分开的AAVrep和cap基因、以及可选标记(例如新霉素抗性基因)的质粒(或多个质粒)被整合到细胞的基因组中。已经通过如GC拖尾等程序将AAV基因组引入细菌质粒中(Samulski等人,1982,《美国国家科学院院刊S6》,79：2077-2081)，添加含有限制性核酸内切酶切割位点的合成连接子(Laughlin等人,1983,《基因(Gene)》,23：65-73)或通过直接平末端连接(Senapathy和Carter,1984,《生物化学期刊(J.Biol.Chem.)》,259：4661-4666)。然后用辅助病毒(如腺病毒)感染包装细胞系。此方法的优点是细胞是可选择的并且适合于大规模生产rAAV。合适的方法的其它实例采用腺病毒或杆状病毒而不是质粒将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。
rAAV产生的一般原理综述于例如Carter,1992,《生物技术最新观点(CurrentOpinions in Biotechnology)》,1533-539；和Muzyczka《当今微生物学和免疫学(Curr.Topics in Microbial.and Immunol.)》,158：97-129)中评论。各种方法描述于Ratschin等人,《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》4：2072(1984)；Hermonat等人,《美国国家科学院院刊》,81：6466(1984)；Tratschin等人,《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》5：3251(1985)；McLaughlin等人,《病毒学期刊(J.Virol.)》,62：1963(1988)；以及Lebkowski等人,1988《分子与细胞生物学》,7：349(1988)。Samulski等人,(1989,《病毒学期刊》,63：3822-3828)；美国专利第5,173,414号；WO 95/13365和对应美国专利第5,658.776号；WO 95/13392；WO96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人(1995)《疫苗(Vaccine)》13：1244-1250；Paul等人(1993)《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》4：609-615；Clark等人(1996)《基因疗法(Gene Therapy)》3：1124-1132；美国专利第5,786,211号；美国专利第5,871,982号；以及美国专利第6,258,595号。
AAV载体血清型可以与靶细胞类型匹配。例如，以下示例性细胞类型可以通过所指示AAV血清型等进行转导。例如，适合于肝组织/细胞类型的AAV载体的血清型包括(但不限于)AAV3、AAV5、AAV8和AAV9。
除腺相关病毒载体以外，还可以使用其它病毒载体。此类病毒载体包括(但不限于)慢病毒、甲病毒、肠道病毒、瘟疫病毒、杆状病毒、疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus)、乳多空病毒、痘病毒、牛痘病毒和单纯性疱疹病毒。
在一些实施例中，Cas9 mRNA，靶向白蛋白基因中一个或两个位点的sgRNA和供体DNA各自分别调配为脂质纳米颗粒，或全部共同调配为一个脂质纳米颗粒，或共同调配为两个或更多个脂质纳米颗粒。
在一些实施例中，Cas9 mRNA调配于脂质纳米颗粒中，而sgRNA和供体DNA在AAV载体中递送。在一些实施例中，Cas9 mRNA和sgRNA共同调配于脂质纳米颗粒中，而供体DNA在AAV载体中递送。
可获得用于将Cas9核酸酶作为DNA质粒、作为mRNA或作为蛋白质进行递送的选项。向导RNA可以由相同DNA表达，或也可以以RNA形式递送。可以对RNA进行化学修饰以改变或改进其半衰期或降低免疫反应的可能性或程度。核酸内切酶蛋白质可以在递送之前与gRNA复合。病毒载体允许高效递送；可以将Cas9的分裂版本和Cas9的较小直系同源物包装在AAV中，如供体可以的那样以进行HDR。还存在可以递送这些组分中的每个组分的一系列非病毒递送方法，或者可以前后采用非病毒方法和病毒方法。例如，可以使用纳米颗粒来递送蛋白质和向导RNA，同时可以使用AAV来递送供体DNA。
在与递送用于治疗的基因组编辑组分有关的一些实施例中，至少两种组分被递送到待转化细胞(例如肝细胞)的细胞核中；序列特异性核酸酶和DNA供体模板。在一些实施例中，将供体DNA模板包装到对肝脏具有嗜性的AAV中。在一些实施例中，AAV选自血清型AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV5、AAV6或AAV-DJ。在一些实施例中，首先通过外周IV注射，然后通过序列特异性核酸酶，将AAV包装的DNA供体模板给予受试者，例如患者。首先递送AAV包装的供体DNA模板的优点在于，所递送的供体DNA模板将被稳定地保持在转导的肝细胞的核中，这允许随后给予序列特异性核酸酶，这将在基因组中产生双链断裂。随后通过HDR或NHEJ整合DNA供体。在一些实施例中，期望序列特异性核酸酶仅在以足够的水平促进转基因的靶向整合以达到所需治疗效果所需的时间内在靶细胞中保持活性。如果序列特异性核酸酶在细胞中保持活性较长时间，这将导致脱靶位点处双链断裂的频率增加。具体来说，脱靶裂解的频率是脱靶切割效率乘以核酸酶激活时间的函数。由于mRNA和翻译的蛋白质在细胞中的寿命很短，因此以mRNA形式递送序列特异性核酸酶会导致数小时至几天内的核酸酶活性持续时间很短。因此，预期将序列特异性核酸酶递送至已经含有供体模板的细胞中导致相对于脱靶整合的靶向整合的最高可能比率。此外，外周静脉注射之后，AAV介导的供体DNA模板向肝细胞核的递送需要时间，通常为1到14天左右，因为需要病毒感染细胞，逃逸内体然后转运通过宿主成分将AAV基因组转移到细胞核，并将单链AAV基因组转化成双链DNA分子。因此，在一些实施例中，在提供CRISPR-Cas9组分之前，允许完成将供体DNA模板向细胞核的递送过程，因为这些核酸酶组分将仅活性约1到3天。
在一些实施例中，序列特异性核酸酶是CRISPR-Cas9，其由指向白蛋白基因的内含子1内的DNA序列的sgRNA和Cas9核酸酶构成。在一些实施例中，Cas9核酸酶作为编码可操作地融合到一个或多个核定位信号(NLS)的Cas9蛋白质的mRNA而递送。在一些实施例中，通过包装到脂质纳米颗粒中，sgRNA和Cas9mRNA被递送到肝细胞。在一些实施例中，脂质纳米颗粒含有脂质C12-200(Love等人2010,《美国国家科学院院刊》第107卷1864-1869)。在一些实施例中，包装在LNP中的sgRNA与Cas9 mRNA的比例为1:1(质量比)，以导致小鼠体内的最大DNA裂解。在替代实施例中，可以使用sgRNA与包装于LNP中的Cas9 mRNA的不同质量比，例如10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1或2:1或反向比。在一些实施例中，将Cas9 mRNA和sgRNA包装到单独的LNP调配物中，并且在含有sgRNA的LNP之前约1到约8小时将含有LNP的Cas9 mRNA递送至患者，以允许在递送sgRNA之前翻译Cas9 mRNA的最佳时间。
在一些实施例中，将包封gRNA和Cas9 mRNA的LNP调配物(“LNP核酸酶调配物”)给予受试者，例如患者，所属受试者先前被给予包装在AAV中的DNA供体模板。在一些实施例中，在给予AAV供体DNA模板之后的1天到28天或7天到28天或7天到14天之内将LNP核酸酶调配物给予受试者。可以使用所属领域已知的技术(例如在包括小鼠和猴子的动物模型中进行的研究)来确定相对于AAV供体DNA模板的LNP核酸酶调配物的最佳递送时机。
在一些实施例中，使用非病毒递送方法将DNA供体模板递送到受试者(例如患者)的肝细胞。尽管一些患者(通常为30％)已经存在针对最常用的AAV血清型的中和抗体，从而阻止所述AAV的有效基因递送，但所有患者均可采用非病毒递送方法治疗。在所属领域中已知几种非病毒递送方法。确切地说，已知在动物和人类中静脉内注射之后，脂质纳米颗粒(LNP)有效地将其包封的货物递送到肝细胞的细胞质。这些LNP由肝脏经由受体介导的内吞作用的过程有效地吸收，导致肝脏中的优先吸收。
在一些实施例中，为了促进供体模板的核定位，可以促进质粒的核定位的DNA序列，例如可以将猿猴病毒40(SV40)复制起点和早期启动子的366bp区域添加到供体模板中。与细胞蛋白质结合的其它DNA序列也可以用于改善DNA的核进入。
在一些实施例中，在AAV供体DNA模板之后，在第一次给予例如含有gRNA和Cas9核酸酶或编码Cas9核酸酶的mRNA的LNP核酸酶调配物之后，在受试者(例如患者)的血液中测量引入的GOI的表达或活性水平。如果GOI水平不足以治愈疾病，例如定义为正常水平的至少5％至50％，特别是5％至20％的GOI水平，那么可以第二次或第三次给予LNP核酸酶调配物以促进与白蛋白内含子1位点的其它靶向整合。可以使用领域中已知的技术，例如使用包括小鼠和猴的动物模型测试来测试和优化使用多个剂量的LNP-核酸酶调配物获得期望治疗水平的GOI的可行性。
在一些实施例中，根据本文所描述的任何方法，包含向受试者给予i)包含供体盒的AAV供体DNA模板和ii)LNP核酸酶调配物，在向受试者给予AAV供体DNA模板之后的1天到28天内，向受试者给予所述LNP核酸酶调配物的初始剂量。在一些实施例中，在足够的时间后将LNP核酸酶调配物的初始剂量给予受试者，以允许将供体DNA模板递送到靶细胞的核。在一些实施例中，在足够的时间后将LNP核酸酶调配物的初始剂量给予受试者，以允许单链AAV基因组转化成靶细胞核中的双链DNA分子。在一些实施例中，在给予初始剂量之后，向受试者给予一种或多种(如2、3、4、5，或更多种)LNP核酸酶调配物的额外剂量。在一些实施例中，向受试者给予一剂或多剂LNP核酸酶调配物，直到达到供体盒的靶向整合的目标水平和/或供体盒的表达的目标水平。在一些实施例中，如果未达到供体盒的靶向整合的目标水平和/或供体盒的表达的目标水平，所述方法还包含在每次给予LNP核酸酶调配物之后测量供体盒的靶向整合水平和/或供体盒的表达水平，并且给予额外剂量的LNP核酸酶调配物。在一些实施例中，LNP核酸酶调配物的一个或多个额外剂量中的至少一个的量与初始剂量相同。在一些实施例中，LNP核酸酶调配物的一个或多个额外剂量中的至少一个的量小于初始剂量。在一些实施例中，LNP核酸酶调配物的一个或多个额外剂量中的至少一个的量大于初始剂量。
遗传修饰的细胞和细胞群
一方面，本公开提供了一种编辑细胞中的基因组，从而产生遗传修饰的细胞的方法。在一些方面，提供了遗传修饰的细胞群。因此，遗传修饰的细胞是指具有通过基因组编辑(例如使用CRISPR/Cas9/Cpf1系统)引入的至少一种遗传修饰的细胞。在一些实施例中，遗传修饰的细胞是遗传修饰的肝细胞。本文中考虑了具有外源性基因组靶向核酸和/或编码基因组靶向核酸的外源性核酸的遗传修饰的细胞。术语“遗传修饰的细胞”不仅是指特定的受试者细胞，而且还指此类细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而出现在随后几代中，所以所述后代可能实际上与母体细胞不一致，但是仍然包括在如本文中所使用的术语的范围内。
在一些实施例中，可以通过将目的基因或其功能衍生物的核酸序列插入细胞的基因组序列中来编辑细胞的基因组。在一些实施例中，经历基因组编辑的细胞在基因组中具有一个或多个突变，与不具有此类突变的正常中的表达相比，所述突变引起内源性GOI的表达的减少。正常细胞可以是来源于(或分离自)不具有与GOI相关的缺陷的不同受试者的健康或对照细胞。在一些实施例中，经历基因组编辑的细胞可以来源于(或分离自)需要治疗GOI相关病况或病症的受试者。因此，在一些实施例中，相比于正常细胞中内源性GOI表达的表达，此类细胞中内源性GOI基因的表达减少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
一旦成功插入转基因，例如编码GOI或其功能片段的核酸，所引入的GOI或其功能衍生物在细胞中的表达与细胞的内源性GOI的表达相比，可以为至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％、约1,000％、约2,000％、约3,000％、约5,000％、约10,000％或更多。在一些实施例中，所引入的包括基因组编辑的细胞中的GOI的功能片段的GOI产物的活性与细胞的内源性GOI的表达相比，可以是至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％、约1,000％、约2,000％、约3,000％、约5,000％、约10,000％或更多。在一些实施例中，所引入的GOI或其功能衍生物在细胞中的表达是细胞的内源性GOI的表达的至少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约30倍、约50倍、约100倍、约1000倍或更多。并且，在一些实施例中，在基因组编辑的细胞中引入的包括GOI的功能片段的GOI产物的活性可以与正常健康细胞中GOI产物的活性相当或大于正常健康细胞中GOI产物的活性。
在治疗或改善的病症或健康状况(如就血友病A而言)的一些实施例中，用于基因编辑的主要目标是人类细胞。例如，在离体方法和体内方法中，人类细胞是肝细胞。在一些实施例中，通过在衍生自并且因此已经与有需要的患者完全匹配的自体细胞中进行基因编辑，有可能生成可以被安全地重新引入到患者体内的细胞并且有效地产生将有效地减轻与患者的疾病相关的一个或多个临床病况的细胞群。在用于此类治疗的一些实施例中，可以根据所属领域已知的任何方法分离肝细胞，并且用于产生遗传修饰的、治疗有效的细胞。在一些实施例中，肝脏干细胞离体遗传修饰，并且然后再引入到患者，其中其将产生表达所插入的GOI(例如，所插入的FVIII基因)的遗传修饰的肝细胞或窦内皮细胞。
本公开还提供了遗传修饰的细胞的后代，其中所述后代可以包括与衍生自其的遗传修饰的细胞相同的外源性核酸或多肽。
治疗方法
一方面，本文提供了一种基因治疗方法，用于通过编辑患者的基因组来治疗患者的病症或健康状况。在一些实施例中，基因治疗方法将功能GOI(例如FVIII、FIX和SERPING1)整合到患者的相关细胞类型的基因组中，并且可以为GOI相关病症或健康状况(例如血友病A)提供永久性治愈。在关于FVIII基因用于治疗血友病A的使用的实施例中，经历整合FVIII基因的基因治疗方法的细胞类型是肝细胞，因为这些细胞在血液中有效表达并分泌许多蛋白质。此外，对于肝脏未完全生长的小儿患者，可以考虑使用这种使用肝细胞的整合方法，因为随着肝细胞分裂，整合的基因将被传送到子细胞。
另一方面，本文提供了细胞、离体和体内方法，其用于使用基因组工程改造工具通过将GOI或其功能衍生物敲入位点进入基因组并恢复GOI产物的活性来产生基因组的永久性变化。此类方法使用核酸内切酶(如CRISPR相关的(CRISPR/Cas9、Cpf1和类似核酸内切酶)核酸酶)来永久删除、插入、编辑、校正或替代基因组中的任何序列，或在基因组位点中插入外源性序列(例如GOI)。以此方式，本公开中阐述的实例通过单一治疗恢复GOI的活性(而非在患者的寿命内递送潜在疗法)。
在一些实施例中，本文提供了根据本文所描述的任何实施例的用于基因组编辑的系统的一个或多个组件，其用于治疗与目标蛋白相关的病症或健康状况，如用于制造用于治疗病症或健康状况的药物。
在一些实施例中，使用从患者分离的肝细胞完成基于离体细胞的治疗。接着，使用本文所描述的材料和方法编辑这些细胞的染色体DNA。最后，将编辑的细胞植入到患者中。
离体细胞疗法的一个优点在于能够在给予之前对治疗进行综合分析。所有基于核酸酶的疗法都具有一些水平的脱靶效应。离体进行基因校正使人们能够在植入前充分表征校正后的细胞群。本公开的方面包括对校正的细胞的整个基因组进行测序以确保脱靶切割(如果存在的话)处于与患者的最小风险相关的基因组位置。此外，可以在植入之前分离特定细胞群，包括克隆群。
此类方法的另一个实施例是基于体内的疗法。在此方法中，使用本文所描述的材料和方法来校正患者的细胞的染色体DNA。在一些实施例中，细胞是肝细胞。
体内基因疗法的优点是易于治疗性生产和给予。相同的治疗方法和疗法可以用于治疗多于一位患者，例如，共享相同或类似基因型或等位基因的多位患者。相比之下，离体细胞疗法通常使用患者自身的细胞，所述细胞被分离、操控并且返回到同一患者。
在一些实施例中，需要根据本公开的治疗方法的受试者是患有选自由以下组成的组的病症或健康状况的症状的患者：血友病A、血友病B、MPS II、MPS1H、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、FXIII缺乏、FVII缺乏、FX缺乏、蛋白质C缺乏和HAE。在一些实施例中，受试者可以是疑似患有病症或健康状况的人类。在一些实施例中，受试者可以是疑似患有血友病A的人类。或者，受试者可以是被诊断为具有病症或健康状况的风险的人类，例如血友病A。在一些实施例中，受试者可以是疑似患有血友病B的人类。或者，受试者可以是被诊断为具有血友病B的风险的人类。在一些实施例中，受试者可以是疑似患有HAE的人类。或者，受试者可以是被诊断为具有HAE的风险的人类。在一些实施例中，需要治疗的受试者可以在内源性GOI或其调节序列中具有一个或多个遗传缺陷(例如缺失、插入和/或突变)，使得包括GOI产物的表达水平或功能性的活性与正常健康的受试者相比明显降低。
在一些实施例中，本文提供一种治疗受试者的血友病A的方法，所述方法包含向受试者的细胞提供以下各者：(a)gRNA，其包含来自SEQ ID NO:18-44和104中的任一个的间隔序列，或编码gRNA的核酸；(b)DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸；以及(c)供体模板，其包含编码GOI或功能衍生物的核酸序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21、22、28和30中的任一者的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：21的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：22的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：28的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：30的间隔序列。在一些实施例中，细胞是人类细胞，例如人类肝细胞。在一些实施例中，受试者是患有或疑似患有血友病A、血友病B、MPS II、MPS1H、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、FXIII缺乏、FVII缺乏、FX缺乏、蛋白质C缺乏和HAE的患者。在一些实施例中，受试者被诊断为具有血友病A的风险。
在一些实施例中，本文提供一种治疗受试者的血友病B的方法，所述方法包含向受试者的细胞提供以下各者：(a)gRNA，其包含来自SEQ ID NO:18-44和104中的任一个的间隔序列，或编码gRNA的核酸；(b)DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸；以及(c)供体模板，其包含编码GOI或功能衍生物的核酸序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21、22、28和30中的任一者的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：21的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：22的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：28的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：30的间隔序列。在一些实施例中，细胞是人类细胞，例如人类肝细胞。在一些实施例中，受试者是患有或疑似患有血友病B的患者。在一些实施例中，受试者被诊断为具有血友病B的风险。
在一些实施例中，本文提供一种治疗受试者的HAE的方法，所述方法包含向受试者的细胞提供以下各者：(a)gRNA，其包含来自SEQ ID NO:18-44和104中的任一个的间隔序列，或编码gRNA的核酸；(b)DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸；以及(c)供体模板，其包含编码GOI或功能衍生物的核酸序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO:21、22、28和30中的任一者的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：21的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：22的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：28的间隔序列。在一些实施例中，gRNA包含来自SEQ ID NO：30的间隔序列。在一些实施例中，细胞是人类细胞，例如人类肝细胞。在一些实施例中，受试者是患有或疑似患有遗传血管性水肿的患者。在一些实施例中，受试者诊断为具有遗传血管性水肿的风险。
在一些实施例中，根据本文所描述的治疗病症或健康状况的方法中的任一种，DNA核酸内切酶识别具有序列NGG或NNGG的原间隔区相邻基序(PAM)，其中N是任何核苷酸或其功能衍生物。在一些实施例中，DNA核酸内切酶是II型Cas核酸内切酶或其功能衍生物。在一些实施例中，DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，Cas9来自酿脓链球菌(spCas9)。在一些实施例中，Cas9来自路邓葡萄球菌(SluCas9)。
在一些实施例中，根据本文所描述的治疗病症或健康状况的方法中的任一种，编码GOI或其功能衍生物的核酸序列经密码子优化以用于在细胞中表达。在一些实施例中，细胞是人类细胞。
在一些实施例中，根据本文所描述的治疗病症或健康状况的方法中的任一种，所述方法采用编码DNA核酸内切酶的核酸。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸经密码子优化以用于在细胞中表达。在一些实施例中，细胞是人类细胞，例如人类肝细胞。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是DNA，如DNA质粒。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是RNA，如mRNA。
在一些实施例中，根据本文所描述的治疗病症或健康状况的方法中的任一种，供体模板在AAV载体中编码。在一些实施例中，供体模板包含供体盒，其包含编码GOI或功能衍生物的核酸序列，并且供体盒在一侧或两侧上侧接gRNA靶位点。在一些实施例中，供体盒的两侧上侧接gRNA靶位点。在一些实施例中，gRNA靶位点是(a)的gRNA的靶位点。在一些实施例中，供体模板的gRNA靶位点是(a)的gRNA的细胞基因组gRNA靶位点的反向补体。在一些实施例中，向细胞提供供体模板包含向受试者给予供体模板。在一些实施例中，经由静脉内途径给予。
在一些实施例中，根据本文所描述的治疗病症或健康状况的方法中的任一种，将DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施例中，脂质体或脂质纳米颗粒还包含gRNA。在一些实施例中，向细胞提供gRNA和DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸包含向受试者给予脂质体或脂质纳米颗粒。在一些实施例中，经由静脉内途径给予。在一些实施例中，脂质体或脂质纳米颗粒是脂质纳米颗粒。在一些实施例中，所述方法采用脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含编码DNA核酸内切酶的核酸和gRNA。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是编码DNA核酸内切酶的mRNA。
在一些实施例中，根据本文所描述的治疗病症或健康状况的方法中的任一种，DNA核酸内切酶与gRNA预复合，形成RNP复合物。
在一些实施例中，根据本文所描述的治疗病症或健康状况的方法中的任一种，在将(c)的供体模板提供到细胞之后，将(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸提供到细胞。在一些实施例中，在将(c)的供体模板提供到细胞之后超过4天，将(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸提供到细胞。在一些实施例中，在将(c)的供体模板提供到细胞之后至少14天，将(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸提供到细胞。在一些实施例中，在将(c)的供体模板提供到细胞之后至少17天，将(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸提供到细胞。在一些实施例中，向细胞提供(a)和(b)包含向受试者给予(如通过静脉内途径)包含编码DNA核酸内切酶的核酸和gRNA的脂质纳米颗粒。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是编码DNA核酸内切酶的mRNA。在一些实施例中，向细胞提供(c)包含向受试者给予(如通过静脉内途径)在AAV载体中编码的供体模板。
在一些实施例中，根据本文所描述的治疗病症或健康状况的方法中的任一种，在第一剂量的(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸之后，向细胞提供一个或多个额外剂量的(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸。在一些实施例中，在第一剂量的(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸之后，向细胞提供一个或多个额外剂量的(a)的gRNA和(b)的DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸，直到达到编码GOI或功能衍生物的核酸序列的靶向整合的目标水平和/或编码GOI或功能衍生物的核酸序列的表达的目标水平。在一些实施例中，向细胞提供(a)和(b)包含向受试者给予(如通过静脉内途径)包含编码DNA核酸内切酶的核酸和gRNA的脂质纳米颗粒。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是编码DNA核酸内切酶的mRNA。
在一些实施例中，根据本文所描述的治疗病症或健康状况的方法中的任一种，编码GOI或功能衍生物的核酸序列在内源性白蛋白启动子的控制下表达。
在一些实施例中，根据本文所描述的治疗病症或健康状况的方法中的任一者，编码GOI或功能衍生物的核酸序列在受试者的肝脏中表达。
将细胞植入到受试者
在一些实施例中，本公开的离体方法涉及将基因组编辑的细胞植入到需要此类方法的受试者中。此植入步骤可以使用所属领域中已知的任何植入方法来实现。例如，可以在受试者的血液中直接注射遗传修饰的细胞或以其它方式向受试者给予。
在一些实施例中，本文所公开的方法包括通过产生所引入的细胞在所需部位处的至少部分定位的方法或途径，向受试者给予可以与“引入”和“移植”、遗传修饰互换使用的治疗性细胞，从而产生期望效果。治疗性细胞或其分化的后代可以通过任何适当的途径给予，所述途径导致递送到受试者的期望位置，在所述期望位置，植入的细胞或细胞组分的至少一部分保持存活。向受试者给予之后细胞的存活期可以短到几小时，例如二十四小时到几天，到长达若干年，或甚至患者的寿命，即长期植入。
当提供预防性时，本文所描述的治疗性细胞可以在GOI相关病症或健康状况(例如血友病A)的任何症状之前向受试者给予。因此，在涉及FVIII基因用于治疗血友病A的一些实施例中，遗传修饰的肝细胞细胞群的预防性给予用于预防血友病A症状的发生。
在一些实施例中，当提供治疗性时，在GOI相关病症或健康状况的症状或适应症发作时(或之后)(例如在疾病发作时)提供遗传修饰的肝细胞。
在一些实施例中，根据本文所描述的方法给予的治疗性肝细胞细胞群具有获自一个或多个供体的同种异体肝细胞。“同种异体”是指肝细胞或具有从同一物种的一个或多个不同供体获得的肝细胞的生物样本，其中一个或多个位点处的基因不相同。例如，向受试者给予的肝细胞细胞群可以衍生自一个或多个不相关的供体受试者，或衍生自一个或多个不相同的同胞。在一些实施例中，可以使用同基因肝细胞细胞群，例如获自遗传上相同的动物或获自同一物种的那些同基因肝细胞细胞群。在其它实施例中，肝细胞是自体细胞；也就是说，肝细胞获自受试者或从受试者分离并且向相同受试者给予，即，供体和接受者相同。
在一些实施例中，有效量是指预防或减轻GOI相关病症或健康状况的至少一个或多个体征或症状所需的治疗性细胞群的量，并且涉及足够量的组合物以提供期望的效果，例如治疗患有GOI相关病症或健康状况的受试者。在一些实施例中，治疗有效量因此是指治疗性细胞或具有治疗性细胞的组合物的量，所述治疗性细胞或组合物具有足以在向典型受试者给予时促进特定作用，如具有或处于GOI相关病症或健康状况的风险的治疗性细胞或组合物。有效量还将包括足以预防或延迟疾病的症状的发展、改变疾病的症状的过程(例如(但不限于)减缓疾病的症状的进展)或逆转疾病的症状的量。应理解，对于任何给定情况，可以使用常规实验由所属领域的技术人员确定适当的有效量。
为了在本文中所描述的各个实施例中使用，治疗性细胞(例如基因组编辑的肝细胞)的有效量可以为至少102个细胞、至少5×102个细胞、至少103个细胞、至少5×103个细胞、至少104个细胞、至少5×104个细胞、至少105个细胞、至少2×105个细胞、至少3×105个细胞、至少4×105个细胞、至少5×105个细胞、至少6×105个细胞、至少7×105个细胞、至少8×105个细胞、至少9×105个细胞、至少1×106个细胞、至少2×106个细胞、至少3×106个细胞、至少4×106个细胞、至少5×106个细胞、至少6×106个细胞、至少7×106个细胞、至少8×106个细胞、至少9×106个细胞或其倍数。治疗性细胞可以来源于一个或多个供体，或获自自体来源。在本文所描述的一些实施例中，治疗性细胞在向有需要的受试者给予之前在培养物中扩增。
在一些实施例中，功能GOI产物在患有GOI相关病症或健康状况的患者的细胞中表达的水平的适度和递增增加可能有益于改善疾病的一种或多种症状，用于增加长期存活，和/或用于减少与其它治疗相关的副作用。在向人类患者给予此类细胞后，产生增加水平的功能GOI产物的治疗性细胞的存在是有益的。在一些实施例中，受试者的有效处理产生至少约1％、3％、5％或7％的功能GOI产物，相对于所治疗受试者中的总GOI产物。在一些实施例中，功能GOI产物是总GOI产物的至少约10％。在一些实施例中，功能GOI产物是总GOI产物的至少约或至多20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。类似地，引入甚至相对有限的具有显著升高水平的功能GOI的细胞亚群可能有益于各个患者，因为在一些情形下，归一化细胞将具有相对于患病细胞的选择性优点。然而，即使适度水平的具有升高水平的功能GOI产物的治疗性细胞对于改善患者中的GOI相关病症或健康状况的一个或多个方面可能是有益的。在一些实施例中，给予此类细胞的患者中的治疗量的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多产生增加水平的功能GOI产物。
在一些实施例中，通过方法或途径将治疗性细胞组合物递送到受试者中引起所需部位处的细胞组合物至少部分定位。可以通过导致对受试者进行有效治疗的任何适当的途径给予细胞组合物，即导致递送到受试者的期望位置的给予，在所述期望位置，递送的组合物的至少一部分即至少1×104个细胞被递送到期望部位一段时间。给予模式包括注射、输注、滴注或摄入。“注射”包括(但不限于)静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎管内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施例中，所述途径是静脉内的。为了递送细胞，给予可以通过注射或输注来进行。
在一些实施例中，系统地给予细胞，换句话说，将治疗性细胞群以不同于直接给予到目标部位、组织或器官的方式给予，从而使其进入受试者的循环系统，并且因此经历新陈代谢和其它类似过程。
熟练的临床医师可以确定具有用于治疗GOI相关病症或健康状况的组合物的治疗功效。然而，如果仅作为一个实例，功能GOI产物水平的任何一种或所有征兆或症状以有益的方式改变(例如，增加至少10％)，或疾病的其它临床上可接受的症状或标记得到改善或减轻，那么治疗被认为是有效治疗。疗效还可以通过个体并未如通过住院治疗评估的那样恶化或需要医疗干预(例如，疾病的进展停止或至少减慢)来测量。测量这些指标的方法是所属领域技术人员已知的和/或描述于本文中。治疗包括对个体或动物(一些非限制性实例包括人类或哺乳动物)的疾病的任何治疗并且包括：(1)抑制疾病，例如阻止或减慢症状的进展；或(2)缓解疾病，例如使症状消退；以及(3)预防或减小症状发展的可能性。
在一些实施例中，本文提供了根据本文所描述的实施例中任一项的遗传修饰的细胞，其用于治疗与功能目标蛋白缺陷相关的病症或健康状况，如用于制造用于治疗疾病或健康状况的药物。
组合物
一方面，本公开提供用于进行本文所公开的方法的组合物。组合物可以包括以下各者中的一者或多者：基因组靶向核酸(例如gRNA)；定点多肽(例如DNA核酸内切酶)或编码定点多肽的核苷酸序列；以及待插入的多核苷酸(例如供体模板)以实现本文所公开的方法的期望遗传修饰。
在一些实施例中，组合物具有编码基因组靶向核酸(例如gRNA)的核苷酸序列。
在一些实施例中，组合物具有定点多肽(例如DNA核酸内切酶)。在一些实施例中，组合物具有编码定点多肽的核苷酸序列。
在一些实施例中，组合物具有待插入到基因组中的多核苷酸(例如供体模板)。
在一些实施例中，组合物具有(i)编码基因组靶向核酸(例如gRNA)的核苷酸序列和(ii)定点多肽(例如DNA核酸内切酶)或编码定点多肽的核苷酸序列。
在一些实施例中，组合物具有(i)编码基因组靶向核酸(例如gRNA)的核苷酸序列和(ii)待插入到基因组中的多核苷酸(例如供体模板)。
在一些实施例中，组合物具有(i)定点多肽(例如DNA核酸内切酶)或编码定点多肽的核苷酸序列，和(ii)待插入到基因组中的多核苷酸(例如供体模板)。
在一些实施例中，组合物具有(i)编码基因组靶向核酸(例如gRNA)的核苷酸序列，(ii)定点多肽(例如DNA核酸内切酶)或编码定点多肽的核苷酸序列，和(iii)待插入到基因组中的多核苷酸(例如供体模板)。
在以上组合物中的任一种的一些实施例中，组合物具有单分子向导基因组靶向核酸。在以上组合物中的任一种的一些实施例中，组合物具有双分子基因组靶向核酸。在以上组合物中的任一种的一些实施例中，组合物具有两个或更多个双分子向导或单分子向导。在一些实施例中，组合物具有编码靶向核酸的核酸的载体。在一些实施例中，基因组靶向核酸是DNA核酸内切酶，确切地说，是Cas9。
在一些实施例中，组合物可以含有组合物，其包括可以用于基因组编辑，确切地说，将GOI或其衍生物插入到细胞的基因组中的一个或多个gRNA。组合物的gRNA可以靶向内源性白蛋白基因处、内或其附近的基因组位点。因此，在一些实施例中，gRNA可以具有与白蛋白基因处、内或其附近的基因组序列互补的间隔序列。
在一些实施例中，组合物的gRNA是选自表3中所列出的那些和其与表3中所列出的那些中的任一者具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％一致性或同源性的变异体的序列。在一些实施例中，试剂盒的gRNA的变异体与表3中所列出的那些中的任一者具有至少约85％同源性。
在一些实施例中，组合物的gRNA具有与基因组中的靶位点互补的间隔序列。在一些实施例中，间隔序列的长度是15个碱基到20个碱基。在一些实施例中，间隔序列与基因组序列之间的互补性是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％。
在一些实施例中，组合物可以具有DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸和/或具有GOI或其功能衍生物的核酸序列的供体模板。在一些实施例中，DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸是DNA或RNA。
在一些实施例中，试剂盒的任何寡核苷酸或核酸序列中的一个或多个可以在AAV载体中编码。因此，在一些实施例中，gRNA可以在AAV载体中编码。在一些实施例中，编码DNA核酸内切酶的核酸可以在AAV载体中编码。在一些实施例中，供体模板可以在AAV载体中编码。在一些实施例中，两个或更多个寡核苷酸或核酸序列可以在单个AAV载体中编码。因此，在一些实施例中，gRNA序列和编码DNA核酸内切酶的核酸可以在单个AAV载体中编码。
在一些实施例中，组合物可以具有脂质体或脂质纳米颗粒。因此，在一些实施例中，组合物的任何化合物(例如DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸、gRNA和供体模板)可以调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施例中，一种或多种此类化合物经由共价键或非共价键与脂质体或脂质纳米颗粒缔合。在一些实施例中，化合物中的任一种可以单独地或一起含于脂质体或脂质纳米颗粒中。因此，在一些实施例中，将DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸、gRNA和供体模板中的每一者分别调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施例中，将DNA核酸内切酶与gRNA一起调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施例中，将DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸、gRNA和供体模板一起调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。
在一些实施例中，上文所描述的组合物还具有一种或多种额外试剂，其中此类额外试剂选自缓冲液、用于将多肽或多核苷酸引入到细胞中的缓冲液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照载体、对照RNA多核苷酸、用于从DNA体外生产多肽的试剂、用于测序的衔接子等。缓冲液可以是稳定缓冲液、重构缓冲液、稀释缓冲液等。在一些实施例中，组合物还可以包括可以用于促进或增强中靶结合或通过核酸内切酶来裂解DNA或改进靶向特异性的一种或多种组分。
在一些实施例中，根据特定给予模式和剂型，组合物的任何组分用药学上可接受的赋形剂，如载剂、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等来调配。在一些实施例中，根据调配物和给予途径，通常将向导RNA组合物调配成实现生理上相容的pH值，并且在约3的pH值到约11的pH值、约pH 3到约pH 7的范围内。在一些实施例中，将pH调节到约pH 5.0到约pH 8的范围。在一些实施例中，组合物具有治疗有效量的至少一种如本文所描述的化合物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。任选地，组合物可以具有本文所描述的化合物的组合，或可以包括适用于治疗或预防细菌生长的第二活性成分(例如(但不限于)抗菌剂或抗微生物剂)，或可以包括本公开的试剂的组合。在一些实施例中，RNA与其它一种或多种寡核苷酸，例如编码DNA核酸内切酶的核酸和/或供体模板一起调配。或者，单独地或与其它寡核苷酸组合的编码DNA核酸内切酶的核酸和供体模板用上文所描述的用于gRNA调配物的方法调配。
合适的赋形剂可以包括(例如)载剂分子，所述载剂分子包括大、代谢缓慢的大分子如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和惰性病毒颗粒。其它示例性赋形剂包括抗氧化剂(例如但不限于抗坏血酸)、螯合剂(例如但不限于EDTA)、碳水化合物(例如但不限于糊精、羟烷基纤维素和羟烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如但不限于油、水、生理盐水、甘油和乙醇)、湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
在一些实施例中，组合物的任何化合物(例如DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸、gRNA和供体模板)可以经由转染(例如电穿孔)递送。在一些示例性实施例中，DNA核酸内切酶可以与gRNA预复合，在提供到细胞之前形成RNP复合物，并且RNP复合物可以电穿孔。在此类实施例中，供体模板可以经由电穿孔递送。
在一些实施例中，组合物是指具有在离体治疗方法中使用的治疗性细胞的治疗性组合物。
在一些实施例中，治疗性组合物含有生理上可耐受的载剂以及细胞组合物，和任选地至少一种如本文所描述的额外生物活性剂，其呈活性成分形式溶解或分散于其中。在一些实施例中，当出于治疗目的给予哺乳动物或人类患者时，治疗性组合物基本上无免疫原性，除非这样期望。
一般来说，本文所描述的遗传修饰的治疗性细胞以与药学上可接受的载剂的悬浮液形式给予。所属领域的技术人员将认识到，待用于细胞组合物的药学上可接受的载剂将不包括实质上干扰待递送到受试者的细胞的活力的量的缓冲液、化合物、低温保存剂、防腐剂或其它药剂。包括细胞的调配物可以包括例如允许维持细胞膜完整性的渗透缓冲液以及任选的用于在给予时维持细胞活力或增强移入的营养素。此类调配物和悬浮液是所属领域的技术人员已知和/或可以适于如本文所描述使用常规实验与祖细胞一起使用。
在一些实施例中，细胞组合物还可以乳化或呈现为脂质体组合物，其限制条件为乳化程序不对细胞活力产生不利影响。细胞和任何其它活性成分可以与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的并且与活性成分相容，并且采用适于在本文所描述的治疗方法中使用的量。
包括于细胞组合物中的额外药剂可以包括其中组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由多肽的游离氨基形成)，所述酸加成盐由无机酸如例如盐酸或磷酸或有机酸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等形成。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁、以及出来有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙胺乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等。
生理学上可耐受的载剂是所属领域中熟知的。示例性液体载剂是无菌水溶液，所述无菌水溶液除了活性成分和水之外不含任何物质或者含有处于生理pH值的磷酸钠等缓冲液、生理盐水或两者，如磷酸盐缓冲盐水。仍进一步地，水性载剂可以含有超过一种缓冲盐以及盐，如氯化钠和氯化钾、右旋糖、聚乙二醇和其它溶质。液体组合物还可以含有除了水之外并且排除水之外的液相。此类额外液相的实例是甘油、如棉花籽油等植物油以及水油乳剂。在治疗特定病症或病况中有效的细胞组合物中使用的活性化合物的量将取决于病症或病况的性质，并且可以通过标准临床技术确定。
试剂盒
一些实施例提供一种试剂盒，其含有上文所描述的组合物中的任一者，例如用于基因组编辑的组合物或治疗性细胞组合物和一种或多种额外组分。
在一些实施例中，试剂盒可以具有一种或多种额外治疗剂，其可以与组合物同时或依序给予以实现期望目的，例如基因组编辑或细胞疗法。
在一些实施例中，试剂盒还可以包括用于使用试剂盒的组分来实践所述方法的说明书。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在基底(如纸或塑料等)上。说明书可以作为包装插页、试剂盒的容器的标签或其组件(即与包装或分包装相关)等存在于试剂盒中。说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质上的电子存储数据文件而存在，所述合适的计算机可读存储介质例如CD-ROM、磁盘、闪存驱动器等。在一些情况下，实际说明书不存在于试剂盒中，但是可以提供用于从远程来源(例如经由互联网)获得说明书的手段。此实施例的一个实例是包括网址的试剂盒，在所述网址上可以查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。与说明书一样，这种用于获得说明书的手段记录在合适的基底上。
其它可能的治疗方法
可以使用被工程改造到目标特定序列的核酸酶进行基因编辑。迄今为止，存在四种主要类型的核酸酶：兆核酸酶及其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9核酸酶系统。核酸酶平台在设计难度、靶向密度和作用模式方面不同，特别是在ZFN和TALEN的特异性贯穿整个蛋白质-DNA相互作用，而RNA-DNA相互作用主要引导Cas9时。Cas9裂解还需要一个相邻的基序-PAM，在不同的CRISPR系统之间它有所不同。来自酿脓链球菌的Cas9使用NRG PAM裂解，来自脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)的CRISPR可以在具有PAM的位点裂解，所述PAM包括NNNNGATT(SEQ ID NO:101)、NNNNNGTTT(SEQ ID NO:102)和NNNNGCTT(SEQ ID NO:103)。许多其它Cas9直系同源物靶向邻近替代PAM的原间隔区。
CRISPR核酸内切酶(例如Cas9)可以用于本公开的方法的各种实施例中。然而，本文所描述的教导(如治疗性靶位点)可以应用于其它形式的核酸内切酶，如ZFN、TALEN、HE或MegaTAL，或使用核酸酶的组合。然而，为了将本公开的教导应用于此类核酸内切酶，除了其它方面之外，人们需要将针对特异性靶位点的蛋白质工程改造。
额外结合结构域可以与Cas9蛋白质融合以增加特异性。这些构建体的靶位点将会映射到识别出的gRNA指定位点，但是将会需要额外结合基序，如用于锌指结构域。在Mega-TAL的情况下，兆核酸酶可以与TALE DNA结合结构域融合。兆核酸酶结构域可以增加特异性并且提供裂解。类似地，灭活的或死亡Cas9(dCas9)可以与裂解结构域融合并且需要sgRNA/Cas9靶位点和融合的DNA结合结构域的相邻结合位点。这可能需要dCas9的一些蛋白质工程改造，除催化失活以外，以减少不具有额外结合位点的结合。
在一些实施例中，根据本公开的编辑基因组的组合物和方法(例如，将GOI编码序列插入到白蛋白位点中)可以利用或使用以下方法中的任一者进行。
锌指核酸酶
锌指核酸酶(ZFN)是具有与II型核酸内切酶FokI的催化结构域连接的被工程改造的锌指DNA结合结构域的模块化蛋白质。因为FokI仅起到二聚体的作用，所以一对ZFN必须被工程改造以与相反DNA链上的同源目标“半位点”序列结合并且在其之间具有精确间隔以使得能够形成催化活性FokI二聚体。在本身不具有序列特异性的FokI结构域的二聚后，作为基因组编辑的初始步骤，在ZFN半位点之间产生DNA双链断裂。
每个ZFN的DNA结合结构域通常具有丰富的Cys2-His2架构的3-6个锌指，其中每个锌指主要识别目标DNA序列的一条链上的核苷酸三联体，但是与第四个核苷酸的跨链相互作用可能也很重要。锌指的氨基酸在与DNA进行关键接触的位置上的改变使给定锌指的序列特异性发生改变。因此，四指锌指蛋白质将选择性地识别12bp靶序列，其中靶序列是由每个锌指贡献的三联体偏好的复合物，但是三联体偏好可以在不同程度上受相邻锌指的影响。ZFN的重要方面是，ZFN可以仅通过修饰单独的锌指轻易地重新靶向几乎任何基因组地址，但是做好这一点需要相当多的专业知识。在ZFN的大多数应用中，使用了具有4-6个锌指的蛋白质，从而分别识别出12-18bp。因此，一对ZFN将通常识别24-36bp的组合靶序列，不包括半位点之间的5-7bp间隔区。结合位点还可以与较大间隔区分离，包括15-17bp。假设在设计过程期间不包括重复序列或基因同源物，这种长度的靶序列可能在人类基因组中是唯一的。然而，ZFN蛋白质-DNA相互作用在其特异性上并非是绝对的，因此脱靶结合和裂解事件作为这两个ZFN之间的异质二聚体或者作为ZFN中的一个或另一个的同源二聚体而发生。已经通过工程改造FokI结构域的二聚界面以创建“加”和“减”变异体(也被称为专性异二聚体变异体)有效地消除了后一种可能性，所述专性异二聚体变异体仅可以彼此二聚化，而不与自身二聚化。强加专性异二聚体防止形成同二聚体。这大大增强了ZFN以及采用这些FokI变异体的任何其它核酸酶的特异性。
所属领域中已经描述了各种基于ZFN的系统，定期报告其修改，并且许多参考文献描述了用于引导ZFN设计的规则和参数；参见例如，Segal等人,《美国国家科学院院刊》96(6)：2758-63(1999)；Dreier B等人,《分子生物学杂志》303(4)：489-502(2000)；Liu Q等人,《生物化学杂志(J Biol Chem.)》277(6)：3850-6(2002)；Dreier等人,《生物化学杂志》280(42)：35588-97(2005)；以及Dreier等人,《生物化学杂志》276(31)：29466-78(2001)。
转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)
TALEN表示模块化核酸酶的另一种格式，由此与ZFN一样，工程改造的DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域连接，并且一对TALEN前后操作以实现靶向DNA裂解。与ZFN的主要区别是DNA结合结构域的性质和关联的目标DNA序列识别特性。TALEN DNA结合结构域来源于起初在植物细菌性病原体黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)中所描述的TALE蛋白质。TALE具有含33-35个氨基酸重复的串联阵列，其中每个重复识别通常长达20bp的目标DNA序列中的单个碱基对，从而给出了长达40bp的总靶序列长度。每个重复的核苷酸特异性由重复可变双残基(RVD)确定，所述RVD仅包括位置12和13处的两个氨基酸。碱基鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶主要分别由四种RVD识别：Asn-Asn、Asn-Ile、His-Asp和Asn-Gly。这构成了比针对锌指更简单的识别代码，并且因此表示在核酸酶设计方面优于后者。然而，与ZFN一样，TALEN的蛋白质-DNA相互作用在其特异性上并非是绝对的，并且TALEN还得益于使用FokI结构域的专性异二聚体变异体来减小脱靶活性。
已经产生了在其催化功能中灭活的FokI结构域的额外变异体。如果TALEN或ZFN对的一半含有失活FokI结构域，那么仅单链DNA裂解(切口)而非DSB将在靶位点处发生。结果与其中Cas9裂解结构域之一已经被灭活的CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1“切口酶”突变体的使用相当。DNA切口可以用于由HDR驱动基因组编辑，但是比使用DSB效率更低。主要益处是脱靶切口被快速且准确地修复，不像DSB，其容易发生NHEJ介导的错误修复。
所属领域中已经描述了各种基于TALEN的系统，并且定期报告其修改；参见例如，Boch,《科学》326(5959)：1509-12(2009)；Mak等人,《科学》335(6069)：716-9(2012)；以及Moscou等人,《科学》326(5959)：1501(2009)。已经通过多个组描述了基于“Golden Gate”平台或克隆方案对TALEN的使用；参见例如，Cermak等人,《核酸研究》39(12)：e82(2011)；Li等人,《核酸研究》39(14)：6315-25(2011)；Weber等人,《公共科学图书馆综合(PLoS One.)》6(2)：e16765(2011)；Wang等人,《遗传学与基因组学杂志(J Genet Genomics)》41(6)：339-47,电子出版2014Can 17(2014)；以及Cermak T等人,《分子生物学方法(Methods MolBiol.)》1239：133-59(2015)。
归巢核酸内切酶
归巢核酸内切酶(HE)是序列特异性核酸内切酶，所述序列特异性核酸内切酶具有长识别序列(14-44个碱基对)并且经常在基因组中独特的位点处以高特异性裂解DNA。存在至少六个如由其结构分类的已知HE家族，包括LAGLIDADG(SEQ ID NO:6)、GIY-YIG、His-Cis盒、H-N-H、PD-(D/E)xK以及衍生自广泛范围的宿主的Vsr类，包括真核生物、原生生物、细菌、古细菌、蓝藻细菌和噬菌体。与ZFN和TALEN一样，HE可以用于作为基因组编辑中的初始步骤在目标位点处产生DSB。此外，一些天然和工程改造的HE仅切割DNA的单链，由此充当位点特异性切口酶。HE的大靶序列和其提供的特异性使其成为用于产生位点特异性DSB的有吸引力的候选物。
所属领域中已经描述了各种基于HE的系统，并且定期报告其修改；参见例如，Steentoft等人的评述,《糖生物学(Glycobiology)》24(8)：663-80(2014)；Belfort和Bonocora,《分子生物学方法》1123：1-26(2014)；Hafez和Hausner,《基因组(Genome)》55(8)：553-69(2012)；以及其中引用的参考文献。
MegaTAL/Tev-mTALEN/MegaTev
如杂合核酸酶的其它实例，MegaTAL平台和Tev-mTALEN平台使用了TALE DNA结合结构域与催化活性HE的融合物，从而利用了TALE的可调DNA结合和的特异性两者，连同HE的裂解序列特异性；参见例如，Boissel等人,《NAR》42：2591-2601(2014)；Kleinstiver等人,《G3》4：1155-65(2014)；以及Boissel和Scharenberg,《分子生物学方法》1239：171-96(2015)。
在其它变型中，MegaTev架构是兆核酸酶(Mega)与衍生自GIY-YIG归巢核酸内切酶I-TevI(Tev)的核酸酶结构域的融合物。这两个活性位点被定位在DNA底物上相隔～30bp并且产生具有不相容的粘合末端的两个DSB；参见例如,Wolfs等人,《NAR》42,8816-29(2014)。预期现有的基于核酸酶的方法的其它组合将进化并且在实现本文所描述的靶向基因组修饰时有用。
dCas9-FokI或dCpf1-Fok1和其它核酸酶
结合上述核酸酶平台的结构和功能性质提供了用于基因组编辑的其它方法，所述方法可以潜在地克服固有缺陷中的一些缺陷。作为实例，CRISPR基因组编辑系统通常使用单个Cas9核酸内切酶来产生DSB。靶向的特异性由经历与目标DNA的Watson-Crick碱基配对的向导RNA中的20或22个核苷酸序列驱动(加上在来自酿脓链球菌的Cas9的情况下相邻NAG或NGG PAM序列中的另外2个碱基)。此类序列足够长以在人类基因组中是唯一的，然而，RNA/DNA相互作用的特异性并非是绝对的，极大的混杂有时是可耐受的，特别是在靶序列的一半处的5'端中，从而有效地减少了驱动特异性的碱基数量。对此的一种解决方案是将Cas9或Cpf1催化功能完全灭活-仅保留RNA导向的DNA结合功能-并且实际上将FokI结构域与灭活的Cas9融合；参见例如,Tsai等人,《自然生物技术》32：569-76(2014)；以及Guilinger等人,《自然生物技术》32：577-82(2014)。因为FokI必须二聚化以变得具有催化活性，所以需要两个向导RNA来很靠近地拴系两个FokI融合物以形成二聚体并裂解DNA。这本质上使组合的靶位点中的碱基数量加倍，由此增加了由基于CRISPR的系统进行的靶向的严格度。
作为另一实例，TALE DNA结合结构域与催化活性HE的融合物(如I-TevI)利用了TALE的可调DNA结合和特异性两者以及I-TevI的裂解序列特异性，期望可以进一步减少脱靶裂解。
以下所附描述中阐述了本公开的一个或多个实施例的细节。尽管与本文描述的材料和方法类似或等效的任何材料和方法可以用于实践或测试本公开，但是现在描述了示例性材料和方法。根据描述，本公开的其它特征、目的和优点将变得显而易见。在描述中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式还包括复数形式。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。在冲突的情况下，以本说明书为准。
应理解，本文所描述的实例和实施例仅是出于说明性目的，且根据其的各种修改或变化将由所属领域的技术人员想到且包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请案都出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
本文中所提供的本公开的一些实施例通过以下非限制性实例进一步说明。
实例
范例1：识别直接在体内Hepa1-6细胞中小鼠白蛋白基因的内含子1中被Cas9核酸酶裂解的gRNA
为了在相关的临床前动物模型中进行评估，对指导在相关临床前动物物种的白蛋白内含子1中通过Cas9核酸酶有效裂解的gRNA分子进行了测试。血友病A的小鼠模型已经很好地建立了(Bi L,Lawler AM,Antonarakis SE,High KA,Gearhart JD,Kazazian HH.,Jr靶向破坏小鼠因子VIII基因产生血友病A的模型。(Nat Genet.1995；10：119-21。doi:10.1038/ng0595-119)，并且代表了一种有价值的模型系统，用于测试此疾病的新治疗方法。为了识别具有切割小鼠白蛋白内含子1的潜力的gRNA，使用算法(例如CCTOP；https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/)分析了内含子的序列，所述算法识别所有可能的gRNA靶序列，利用NGG PAM序列作为潜在目标来裂解目的序列中的Cas9(spCas9)的酿脓链球菌，以及小鼠基因组中的所有相关序列。然后，根据小鼠基因组中确切或相关序列的频率对每个gRNA进行排名，以识别出脱靶切割的理论风险最小的gRNA。基于对此类型的分析，选择了一种称为mALbgRNA_T1的gRNA进行测试。
mAlbgRNA_T1仅与小鼠基因组中的其它4个位点表现出同源性，每个位点均表现出4个核苷酸错配，如下表2所示。
表2.小鼠基因组中gRNA mAlb_T1的潜在脱靶位点(MM＝错配数)
Figure BDA0003117691830000891
为了评估mALbgRNA_T1促进Cas9裂解小鼠细胞的效率，使用了小鼠肝细胞衍生的细胞系Hepa1-6。将Hepa1-6细胞在5％CO2培育箱中在DMEM 10％FBS中培养。由结合到酿脓链球菌Cas9(spCas9)蛋白质的gRNA构成的RNP通过混合2.4μl spCas9(0.8μg/μl)和3μl合成gRNA(20μ摩尔)和7μl PBS(1:5spCas9:gRNA比例)来预制备，并且在室温下培育持续10分钟。为了进行核转染，将整个小瓶的SF补充试剂(龙沙(Lonza))添加到SF核转染试剂(龙沙)中，以制备完整的核转染试剂。对于每一次核转染，将1x105 Hepa1-6细胞再悬浮于20μl完整的核转染试剂中，添加到RNP中，然后转移到放置在4D核转染设备(龙沙)中的核转染比色皿(16孔条)中并使用程序EH-100进行核转染。在使细胞静置10分钟之后，将其转移到具有新制完整培养基的适当大小的板。核转染后48小时，收集了细胞，并且使用Qiagen DNeasy试剂盒(cat 69506)提取并纯化基因组DNA。
为了评估在白蛋白内含子1中的靶位点处Cas9/gRNA介导的切割的频率，侧接靶位点的一对引物(MALBF3；5'TTATTACGGTCTCATAGGGC 3'(SEQ ID NO：11)和MALBR5：AGTCTTTCTGTCAATGCACAC 3'(SEQ ID NO：12))用于聚合酶链反应(PCR)中，使用52℃的退火温度从基因组DNA扩增609bp区域。使用Qiagen PCR纯化试剂盒(目录号28106)纯化PCR产物并且使用桑格测序(Sanger sequencing)用用于PCR反应的相同引物直接测序。序列数据通过称为分解跟踪插入缺失的算法(TIDES)进行了分析，所述算法确定了存在于预测的gRNA/Cas9复合物切割位点处的插入和缺失(INDELS)的频率(Brinkman等人(2104)；《核酸研究》,2014,1)。在3个独立的实验中进行测试时，mAlbgRNA_T1产生插入缺失的总频率介于85％和95％之间，表明被这些细胞的基因组中的gRNA/Cas9有效切割。图3中显示了在用mAb gRNA-T1核转的Hepa1-6细胞中TIDES分析的实例。大多数插入和缺失由1bp插入和1bp缺失组成，其中较小数目的缺失高达6bp。
实例2：评估小鼠体内mAlbgRNA_T1的裂解效率
为了将Cas9和mAlbgRNA-T1递送到小鼠的肝细胞，使用了脂质纳米颗粒(LNP)递送媒剂。将sgRNA以化学方式合成，并有化学修饰的核苷酸以改进对核酸酶的抗性。一个实例中的gRNA由以下结构组成：5'
usgscsCAGUUCCCGAUCGUUACGUUUUAGAgcuaGAAAuagcAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCaacuuGAAAaaguggcaccgagucggugcusususU-3'(SEQ ID NO：13)，其中“A、G、U、C”是天然RNA核苷酸，“a、g、u、c”是2'-O-甲基核苷酸，并且“s”表示硫代磷酸酯主链。带下划线的是gRNA的小鼠白蛋白靶向序列，其余的gRNA序列是常见的架构序列。spCas9 mRNA被设计成用于编码融合到核定位结构域(NLS)的spCas9蛋白质，这是将spCas9蛋白质转运到可能发生基因组DNA裂解的核区室中所必需的。Cas9 mRNA的其它组分是在第一个密码子之前的5'端的KOZAK序列，以促进核糖体结合，在3'端的聚A尾部由一系列A残基构成。具有NLS序列的spCas9 mRNA的序列的实例展示于SEQ ID NO:81中。可以通过所属领域众所周知的不同方法产生mRNA。本文使用的此类方法之一是使用T7聚合酶进行体外转录，其中mRNA的序列编码于含有T7聚合酶启动子的质粒中。简单来说，将质粒在含有T7聚合酶和核糖核苷酸的适当缓冲液中培育后，产生了编码所需蛋白质的氨基酸序列的RNA分子。反应混合物中的天然核糖核苷酸或化学修饰的核糖核苷酸用于产生具有天然化学结构或具有修饰的化学结构的mRNA分子，所述mRNA分子在表达、稳定性或免疫原性方面可能具有优势。此外，通过利用每个氨基酸最常用的密码子，针对密码子使用对spCas9编码序列的序列进行了优化。此外，优化编码序列以去除加密核糖体结合位点和上游开放阅读框架，以促进mRNA最有效地翻译成spCas9蛋白质。
这些研究中使用的LNP的主要组分是脂质C12-200(Love等人(2010),《美国国家科学院院刊》,第107卷,1864-1869)。C12-200脂质与带高电荷的RNA分子形成复合物。C12-200与1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，DMPE-mPEG2000和胆固醇。当在受控条件下(例如，在纳米组装装置(NanoAssemblr device)(精密纳米系统(PrecisionNanoSystems))中)与核酸(如gRNA和mRNA)混合时，会发生LNP的自组装，其中核酸被包封在LNP内部。为了在LNP中组装gRNA和Cas9 mRNA，按需要将乙醇和脂质储备液吸移到玻璃小瓶中。调节C12-200与DOPE、DMPE-mPEG2000和胆固醇的比例以优化调配物。典型比例由C12-200、DOPE、胆固醇和mPEG2000-DMG构成，摩尔比为50:10:38.5:1.5。在无RNase的试管中，将gRNA和mRNA在100mM柠檬酸钠pH 3.0和300mM NaCl中稀释。在脂质侧用乙醇洗涤纳米组装筒(精密纳米系统)，在RNA侧用水洗涤。将脂质的工作储备液抽吸到注射器中，从注射器中去除空气，然后将其插入筒中。使用相同的程序将gRNA和Cas9mRNA的混合物装入注射器。然后在标准条件下进行纳米组装操作。然后，使用20Kd截止透析筒在4升PBS中透析LNP悬浮液4h，并且然后利用离心通过20Kd截止纺柱(艾米康(Amicon))进行浓缩，包括在离心过程中用PBS洗涤三次。最后，将LNP悬浮液通过0.2μM注射器过滤器进行无菌过滤。使用市售内毒素试剂盒(LAL分析)检查内毒素水平，并通过动态光散射测定粒度分布。使用ribogreen测定法(赛默飞世尔)来测定包封的RNA的浓度。或者，将gRNA和Cas9 mRNA分别调配成LNP，并且然后混合在一起，接着处理培养物中的细胞或注射到动物中。使用单独调配的gRNA和Cas9 mRNA，允许测试gRNA和Cas9mRNA的特定比例。
利用替代性阳离子脂质分子的替代性LNP调配物还用于体内递送gRNA和Cas9mRNA。将新鲜制备的包封mALB gRNA T1和Cas9 mRNA的LNP以1:1的RNA质量比混合，并注入血友病A小鼠的尾静脉(TV注射)。或者，LNP通过眶后(RO)注射给药。给予小鼠的LNP剂量为每公斤体重0.5到2mg RNA。注射LNP后三天，处死小鼠，并且收集一块肝脏的左、右叶和一块脾脏，并分别从中纯化基因组DNA。然后使基因组DNA经历TIDES分析以测量白蛋白内含子1中的靶位点处的切割频率和裂解特征。结果的一个实例展示在图4中，其中平均25％的等位基因以2mg/kg的剂量裂解。看到剂量反应，其中0.5mg/kg的剂量导致约5％的切割，而1mg/kg的剂量导致约10％的切割。在TIDES分析中，仅注射PBS缓冲液的小鼠表现出大约1至2％的低信号，这是TIDES分析本身背景的一种度量。
实例3：评估靶向人类白蛋白的内含子1的sgRNA的插入缺失频率
使用称为“Guido”的专有算法(基于已发布的称为“CCTop”的算法)来识别利用NGGPAM序列的所有潜在的gRNA序列，这些序列将被人类白蛋白基因的内含子1内的酿脓链球菌Cas9(spCas9)裂解(参见例如https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/)。此算法识别人类基因组中的潜在脱靶位点，并且根据预测的脱靶切割潜力对每个gRNA进行分级。所识别的gRNA序列提供于下表中。
表3.人类白蛋白内含子1gRNA序列
gRNA名称 gRNA序列(具有PAM)
人类白蛋白内含子-1_T1 TAATTTTCTTTTGCGCACTAAGG(SEQ ID NO:18)
人类白蛋白内含子-1_T2 TAGTGCAATGGATAGGTCTTTGG(SEQ ID NO:19)
人类白蛋白内含子-1_T3 AGTGCAATGGATAGGTCTTTGGG(SEQ ID NO:20)
人类白蛋白内含子-1_T4 TAAAGCATAGTGCAATGGATAGG(SEQ DI NO：21)
人类白蛋白内含子-1_T5 ATTTATGAGATCAACAGCACAGG(SEQ ID NO:22)
人类白蛋白内含子-1_T6 TGATTCCTACAGAAAAACTCAGG(SEQ ID NO:23)
人类白蛋白内含子-1_T7 TGTATTTGTGAAGTCTTACAAGG(SEQ ID NO:24)
人类白蛋白内含子-1_T8 GACTGAAACTTCACAGAATAGGG(SEQ ID NO:25)
人类白蛋白内含子-1_T9 AATGCATAATCTAAGTCAAATGG(SEQ ID NO:26)
人类白蛋白内含子-1_T10 TGACTGAAACTTCACAGAATAGG(SEQ ID NO:27)
人类白蛋白内含子-1_T11 TTAAATAAAGCATAGTGCAATGG(SEQ ID NO:28)
人类白蛋白内含子-1_T12 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG(SEQ ID NO:29)
人类白蛋白内含子-1_T13 TAATAAAATTCAAACATCCTAGG(SEQ ID NO:30)
人类白蛋白内含子-1_T14 TTCATTTTAGTCTGTCTTCTTGG(SEQ ID NO:31)
人类白蛋白内含子-1_T15 ATTATCTAAGTTTGAATATAAGG(SEQ ID NO:32)
人类白蛋白内含子-1_T16 ATCATCCTGAGTTTTTCTGTAGG(SEQ ID NO:33)
人类白蛋白内含子-1_T17 GCATCTTTAAAGAATTATTTTGG(SEQ ID NO:34)
人类白蛋白内含子-1_T18 TACTAAAACTTTATTTTACTGGG(SEQ ID NO:35)
人类白蛋白内含子-1_T19 TGAATTATTCTTCTGTTTAAAGG(SEQ ID NO:36)
人类白蛋白内含子-1_T20 AATTTTTAAAATAGTATTCTTGG(SEQ ID NO:37)
人类白蛋白内含子-1_T21 ATGCATTTGTTTCAAAATATTGG(SEQ ID NO:38)
人类白蛋白内含子-1_T22 TTTGGCATTTATTTCTAAAATGG(SEQ ID NO:39)
人类白蛋白内含子-1_T23 AAAGTTGAACAATAGAAAAATGG(SEQ ID NO:40)
人类白蛋白内含子-1_T24 TTACTAAAACTTTATTTTACTGG(SEQ ID NO:41)
人类白蛋白内含子-1_T25 ACCTTTTTTTTTTTTTACCTAGG(SEQ ID NO:104)
人类白蛋白内含子-1_T26 TGCATTTGTTTCAAAATATTGGG(SEQ ID NO:42)
人类白蛋白内含子-1_T27 TGGGCAAGGGAAGAAAAAAAAGG(SEQ ID NO:43)
人类白蛋白内含子-1_T28 TCCTAGGTAAAAAAAAAAAAAGG(SEQ ID NO:44)
从赛默飞世尔科技(目录号A27865,卡尔斯巴德,加利福尼亚)购买5μg/μl的Cas9核酸酶蛋白质(PlatinumTM,GeneArtTM)，然后以1:6的比例稀释到0.83μg/μl或5.2μM的工作浓度。化学修饰的合成单一向导RNA(sgRNA)(加利福尼亚州门洛帕克的Synthego公司(Synthego Corp,Menlo Park,CA))在100μM下与TE缓冲液作为储备溶液再悬浮。或者，可以通过体外转录(IVT)产生所使用的gRNA。用不含核酸酶的水将此溶液稀释到20μM的工作浓度。
为了制备核糖核蛋白复合物，将Cas9蛋白质(12.5pmol)和sgRNA(60pmol)在室温下培育10-20分钟。在此培育期间，HepG2细胞(美国典型培养物收集、马萨诸塞州弗吉尼亚)或HuH7细胞(马萨诸塞州弗吉尼亚的美国典型培养物保藏中心(American Type TissueCulture Collection,Manassas,Virginia))在0.25％(赛默飞世尔科技)下在37℃下使用胰蛋白酶-EDTA解离5分钟。每个转染反应均含有1×105个细胞，并且每个实验中适当数量的细胞在350xG下离心3分钟，然后每个转染反应中再悬浮于20μl龙沙SF核转染加补充溶液(目录号V4XC-2032，瑞士巴塞尔)。将20μl核转染溶液中的再悬浮细胞添加到RNG的每个试管中，并且将整个体积转移到16孔核转染条带的一个孔中。使用EH-100程序在Amaxa 4D-核转染系统(龙沙)上转染HepG2或HuH7细胞。HepG2和HuH7是人类肝细胞细胞系，其因此与评估用于在肝脏中裂解基因的gRNA有关。转染之后，将细胞在核转染条带中培育10分钟，然后转移到含有温暖培养基的48孔板中，所述培养基由补充10％胎牛血清(目录号10438026，赛默飞世尔科技)的伊格尔氏最低必需培养基(Eagle's Minimum Essential Medium)(目录号10-009-CV，纽约州康宁(Corning,NY))组成。第二天，用新鲜培养基重新喂养细胞。
转染之后48小时，解离HepG2或HuH7细胞，并且使用Qiagen DNeasy试剂盒(目录号69506，德国希尔登(Hilden,Germany))提取基因组DNA。使用提取的基因组DNA，用PlatinumSuperFi Green PCR预混液(赛默飞世尔科技)和以下处于0.2μM的引物进行PCR：正向白蛋白：5’-CCCTCCGTTTGTCCTAGCTT-3'(SEQ ID NO:14)；反向白蛋白：5'-TCTACGAGGCAGCACTGTT-3'(SEQ ID NO:15)；正向AAVS1：5'-AACTGCTTCTCCTCTTGGGAAGT-3'(SEQ ID NO:16)；反向AAVS1：5'-CCTCTCCATCCTCTTGCTTTCTTTG-3'(SEQ ID NO:17)。PCR条件是在98℃(1X)下2分钟，然后在98℃下30秒，在62.5℃下30秒和72℃(35x)下1分钟。使用1.2％E-Gel(赛默飞世尔科技)确认正确的PCR产物，并且使用Qiagen PCR纯化试剂盒(目录号28106)纯化。使用对应PCR产物的正向或反向引物对纯化的PCR产物进行桑格测序。使用如Brinkman等人所描述的TIDE分析算法确定在gRNA/Cas9的预期裂解位点处插入或缺失的频率。(Brinkman,E.K.,Chen,T.,Amendola,M,和van Steensel,B.《通过序列痕量分解可轻松进行基因组编辑的定量评估(Easy quantitative assessment of genome editing bysequence trace decomposition)》。《核酸研究》,2014,第42卷,第22e168号)。简单来说，将色谱图测序文件与衍生自未处理细胞的对照色谱图进行比较，以确定异常核苷酸的相对丰度。结果概括于表4中。识别与相关临床前物种(如非人类灵长类动物)同源的人类中的gRNA序列也是令人关注的。人类白蛋白内含子1中识别的潜在gRNA序列与灵长类动物食蟹猴(Macaca fascicularis)和猕猴(Macaca mulatta)白蛋白内含子1序列的比对识别了几个具有完美匹配或1到2个核苷酸错配的gRNA分子，如表4所示。在HuH7细胞中测量了使用IVT向导产生的插入缺失频率，在HepG2细胞中测量了使用合成向导产生的插入缺失频率。HuH7细胞中不同向导产生的插入缺失频率范围为0.3％到64％，这表明不能完全基于开放的基于序列的计算机模拟算法来选择有效裂解白蛋白内含子1的gRNA。根据HuH7中IVT gRNA的插入缺失频率和HepG2细胞中的合成gRNA，识别了几种裂解频率大于40％的gRNA。备受关注的是gRNA T5和T12，它们表现出46％和43％的切割作为合成向导，并且在人类和灵长类动物中100％相同。
表4.sgRNA候选物在人类白蛋白内含子1中的裂解效率和其与灵长类动物的同源性。sgRNA＝合成gRNA，IVT gRNA＝通过体外转录制得的gRNA。*与食蟹猴和猕猴的序列比对，在粗体和带下划线的情况下最多有2个错配。IVT gRNA的插入缺失数据N＝1-2；合成sgRNA，N＝2-3
Figure BDA0003117691830000941
Figure BDA0003117691830000951
实例4：在小鼠白蛋白内含子1处治疗性目的基因的靶向整合
表达一种治疗疾病所需的治疗性蛋白质的方法是在体内将cDNA或编码所述蛋白质的基因的编码序列靶向整合到肝脏中的白蛋白位点。靶向整合是供体DNA模板在双链断裂部位处整合到生物的基因组中的方法，此类整合通过HDR或NHEJ发生。此方法使用将序列特异性DNA核酸酶和编码治疗性基因的供体DNA模板引入到生物细胞中。我们评估靶向白蛋白内含子1的CRISPR-Cas9核酸酶是否能够促进供体DNA模板的靶向整合。供体DNA模板以AAV病毒(例如，对于小鼠而言是AAV8病毒)递送，其在静脉内注射之后优先转导肝脏的肝细胞。通过静脉内或RO注射包封gRNA和Cas9 mRNA的LNP调配物，将序列特异性gRNA mAlb_T1和Cas9 mRNA递送到相同小鼠的肝脏的肝细胞。在一种情况下，AAV8-供体模板在LNP之前注射到小鼠中，因为已知通过AAV转导肝细胞需要几个小时到数天并且所递送的供体DNA稳定地维持在肝细胞的细胞核中数周到数月。相反，由于RNA分子固有的不稳定性，由LNP递送的gRNA和mRNA将仅在肝细胞中保留1-4天。在另一情况下，在AAV供体模板之后1天至7天之间将LNP注射到小鼠中。供体DNA模板结合了几种设计特征，其目的是(i)最大化整合和(ii)最大化编码的治疗性蛋白质的表达。
为了通过HDR同源性发生整合，需要在治疗性基因盒的任一侧包括臂。这些同源臂由小鼠白蛋白内含子1中gRNA切割位点两侧的序列构成。尽管较长的同源臂通常促进更有效的HDR，但同源臂的长度可能受限于约4.7到5.0Kb的AAV病毒包装限制。因此，识别同源臂的最佳长度需要测试。还可以经由NHEJ机制发生整合，其中双链DNA供体的自由末端连接到双链断裂的末端。在这种情况下，不需要同源臂。然而，在基因盒的任一侧并入gRNA切割位点可以通过产生线性双链片段来提高整合效率。通过在反向定向中使用gRNA裂解位点，可以有利于以期望的正向定向整合。在FVIII的弗林蛋白酶裂解位点中引入突变可以产生FVIII蛋白质，所述FVIII蛋白质在蛋白质表达期间不能被弗林蛋白酶裂解，产生一个单链FVIII多肽，所述多肽已显示出在血浆中具有改善的稳定性同时保持完整功能性。
设计成在白蛋白内含子1上整合FVIII基因的示例性DNA供体展示在图5中。特定供体设计的序列是来自SEQ ID NO：87-92的序列。
使用公认的病毒包装方法实现用FVIII供体DNA包装的AAV8或其它AAV血清型病毒。在一种此类方法中，用3个质粒转染HEK293细胞，一个编码AAV包装蛋白质，第二个编码腺病毒辅助蛋白质，并且第3个含有侧接AVIII ITR序列的FVIII供体DNA序列。转染的细胞产生血清型的AAV颗粒，其由在第一质粒上编码的AAV衣壳蛋白质的组成指定。从细胞上清液或上清液和裂解的细胞中收集这些AAV颗粒，并通过CsCl梯度或碘克沙醇梯度或按需要通过其它方法纯化。通过定量PCR(Q-PCR)测量供体DNA的基因组拷贝数来定量纯化的病毒颗粒。
gRNA和Cas9mRNA的体内递送通过多种方法完成。在第一种情况下，gRNA和Cas9蛋白质从AAV病毒载体表达。在这种情况下，gRNA的转录由U6启动子驱动，而Cas9 mRNA的转录则由无处不在的启动子(如EF1-α)或肝脏特异性启动子和增强子(如运甲状腺素蛋白启动子/增强子)驱动。spCas9基因的大小(4.4Kb)阻止了在单个AAV中包括spCas9和gRNA盒，因此需要单独的AAV来递送gRNA和spCas9。在第二种情况下，使用具有促进病毒基因组自我灭活的序列元件的AAV载体。在这种情况下，在载体DNA中包括gRNA的裂解位点导致体内载体DNA的裂解。通过将裂解位点包括在当裂解时阻断Cas9的表达的位置中，Cas9表达限于较短时间段内。在第三种情况下，使用将gRNA和Cas9递送到细胞体内的替代性方法-非病毒递送方法。在一个实例中，脂质纳米颗粒(LNP)用作非病毒递送方法。几种不同的可电离的阳离子脂质可用于LNP。这些包括C12-200(Love等人(2010),《美国国家科学院学报》,第107卷,1864-1869)、MC3、LN16、MD1等。在一种类型的LNP中，GalNac部分附接到LNP的外部，并且作为经由脱唾液酸糖蛋白受体被肝脏吸收的配位体。这些阳离子脂质中的任何一种均用于调配LNP，以将gRNA和Cas9 mRNA递送至肝脏。
为了评估FVIII的靶向整合和表达，首先向血友病A小鼠静脉内注射AAV病毒，例如包封FVIII供体DNA模板的AAV8病毒。每只小鼠的AAV剂量范围为1010到1012个载体基因组(VG)，相当于4x1011到4x1013 VG/kg。在注射AAV供体后1h与7天之间，对相同的小鼠进行静脉内注射包封gRNA和Cas9 mRNA的LNP。在注射之前以1:1的RNA质量比将Cas9 mRNA和gRNA包封在独立的LNP中并且然后混合。给定的LNP剂量为每公斤体重0.25到2mg RNA。LNP通过尾静脉注射或通过逆转录注射给药。通过给药AAV之后测试1小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时和168小时的时间来评估LNP注射时间相对于AAV注射时间对靶向整合和FVIII蛋白质表达效率的影响。
在另一个实例中，供体DNA模板使用为LNP的非病毒递送系统在体内递送。DNA分子被包封到与上述类似的LNP颗粒中，并在静脉内注射之后递送到肝脏中的肝细胞。尽管DNA从核内体逃逸到细胞质的过程相对有效，但大电荷的DNA分子向核内的易位却没有效率。在一种情况下，改进DNA到细胞核的递送的方式通过将AAV ITR并入到供体DNA模板中来模拟AAV基因组。在这种情况下，ITR序列稳定DNA或以其它方式改进核易位。去除CG二核苷酸(CpG序列)形成供体DNA模板序列还改进了核递送。含有CG二核苷酸的DNA被先天免疫系统识别并消除。去除存在于人工DNA序列中的CpG序列改进非病毒和病毒载体递送的DNA的持久性。密码子优化的过程通常增加CG二核苷酸的含量，因为在许多情况下，最常见的密码子在第3位置中具有C残基，这增加了在下一个密码子以G开始时产生CG的机会。在血友病A小鼠中评价在1h到5天之后供体DNA模板的LNP递送与含有gRNA和Cas9 mRNA的LNP的组合。
为了评估体内递送gRNA/Cas9和供体DNA模板的有效性，在注射第二种成分后约7天开始的不同时间，对已注射的血友病A小鼠的血液中FVIII水平进行了评估。通过RO出血收集血液样本，并且分离血浆并使用生色分析(Diapharma)测定FVIII活性。FVIII蛋白质标准品用于校准测定并计算血液中每毫升FVIII活性的单位。
在研究结束时，还在小鼠的肝脏中测量了FVIII mRNA的表达。使用Q-PCR测定从小鼠肝脏提取的总RNA的白蛋白mRNA和FVIII mRNA的水平。与未处理的小鼠相比，FVIII mRNA与白蛋白mRNA的比率表明已被选择产生杂合白蛋白-FVIII mRNA的白蛋白转录本的％。
在gRNA的靶位点(特别是在白蛋白内含子1中)评估了来自治疗的小鼠肝脏的基因组DNA的靶向整合事件。PCR引物对设计用于在预测的靶向整合的任一末端扩增连接片段。这些引物被设计成检测正向定位和反向定位的整合。PCR产物的测序证实了是否发生了预期的整合事件。为了量化已经进行靶向整合的白蛋白等位基因的百分比，合成了与预期的连接片段相对应的标准物。当在不同浓度下外加来自未处理小鼠的基因组DNA且接着进行相同PCR反应时，产生标准曲线并且用于计算具有来自经处理小鼠的样本中的整合事件的等位基因的拷贝数。
实例5：在灵长类白蛋白内含子1中的靶向整合
使用靶向灵长类动物白蛋白内含子1的gRNA，将实例4中所描述的与小鼠相同的方法应用于灵长类动物。使用AAV8或LNP首先通过静脉内注射递送供体DNA模板。所使用的剂量基于在小鼠中发现成功的剂量。随后，通过静脉内注射包封gRNA和Cas9 mRNA的LNP给予相同的灵长类动物。使用在小鼠中发现有效的相同LNP调配物和剂量。由于不存在灵长类动物的血友病A模型，因此需要使用人类FVIII特异性ELISA分析来测量FVIII蛋白质。在灵长类动物中进行与实例4中所描述的靶向整合和FVIII mRNA水平相同的分子分析。灵长类动物是良好的临床前模型，能够转化成临床评估。
实例6：评估通过gRNA/Cas9进行的中靶裂解和脱靶裂解以及在人类原代肝细胞中 的靶向整合
人类原代肝细胞是最相关的细胞类型，用于评估将递送至患者肝脏的gRNA/Cas9的效能和脱靶裂解。这些细胞在培养物中以粘附单层的形式生长有限的时间。已经建立了用mRNA转染粘附细胞的方法，例如Message Max(赛默飞世尔)。用Cas9 mRNA和gRNA的混合物转染之后，使用TIDES分析来测量中靶裂解效率。对基因组DNA的相同样本进行脱靶分析，以识别基因组中被gRNA/Cas9复合物裂解的其它位点。一种此类方法是“GuideSeq”(Tsai等人《自然生物技术(Nat Biotechnol.)》2015年2月；33(2)：187-197)。其它方法包括深度测序、全基因组测序、ChIP-seq(《自然生物技术》32,677-683 2014),BLESS(2013Crosetto等人,doi:10.1038/nmeth.2408)、高通量、全基因组、易位测序((HTGTS)如2015Frock等人所描述,doi:10.1038/nbt.3101)、Digenome-seq(2015Kim等人,doi:10.1038/nmeth.3284)和IDLV(2014Wang等人,doi:10.1038/nbt.3127)。
含有供体DNA模板的AAV病毒也可以转导原代人类肝细胞。确切地说，AAV6或AAVDJ血清型在转导培养物的细胞方面特别有效。在由AAV-DNA供体转导后的1至48h之间，然后用gRNA和Cas9 mRNA转染细胞以诱导靶向整合。使用实例4中所描述的基于PCR的方法来测量靶向整合事件。
实例7：识别和选择在培养物的原代人类肝细胞中有效裂解人类白蛋白内含子1的 向导RNA
基于与非人类灵长类动物的完美同源性以及筛选HuH7和HepG2细胞的切割效率(表4)，选择了四个gRNA(T4、T5、T11、T13)，以评估原代人类肝细胞的切割效率。将原代人类肝细胞(从BioIVT获得)解冻，转移到冷冻保存的肝细胞恢复培养基(CHRM)(Gibco)，低速沉淀，然后在预先用胶原蛋白IV(康宁)包被的24孔板中以0.7x106个细胞/ml的密度接种于InVitro GROTMCP培养基(BioIVT)加TorpedoTM抗生素混合物(BioIVT)中。将板在5％CO2中在37℃下培育。在细胞粘附(铺板之后3-4小时)之后，用新鲜温热的完全培养基洗去未粘附在板上的死细胞，然后将细胞在5％CO2中在37℃下培育。为了转染细胞，将Cas9 mRNA(Trilink)和向导RNA(Synthego公司，加利福尼亚州门洛帕克)在冰上解冻，然后以每孔0.6ug mRNA和0.2ug向导的量添加到30μl OptiMem培养基(Gibco)中。在OptiMem中以2:1的体积在30μl下稀释到总核酸重量的MessengerMax(赛默飞世尔)与Cas9mRNA/gRNA OptiMem溶液在室温下培育20分钟。将此混合物逐滴添加到在24孔板中每孔培养的肝细胞的500μl肝细胞铺板培养基中，并将细胞在5％CO2中在37℃下培育。洗涤细胞并在第二天早晨再喂养，并在转染后48h收集细胞用于基因组DNA提取，方法是将200μl温热的0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)添加到每个孔中，并在37℃下培育5-10分钟。细胞移出后，添加200μl FBS(Gibco)以使胰蛋白酶失活。添加1ml PBS(Gibco)之后，将细胞以1200rpm沉淀3分钟，然后再悬浮于50μl PBS中。按照试剂盒中的说明，使用MagMAX DNA Multi-Sample Ultra 2.0试剂盒(应用生物系统(Applied Biosytems))提取基因组DNA。使用分光光度计分析基因组DNA质量和浓度。对于TIDE分析，使用侧接预测的中标裂解位点(AlbF:CCCTCCGTTTGTCCTAGCTTTTC和AlbR:CCAGATACAGAATATCTTCCTCAACGCAGA)和铂PCR超混合液高保真度(Platinum PCR SuperMix High Fidelity)(英杰(Invitrogen))的引物，使用35个PCR循环和55℃的退火温度进行PCR扩增基因组DNA。首先通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，以确认已生成合适大小的产物(1053bp)，然后使用引物(For：CCTTTGGCACAATGAAGTGG，rev：GAATCTGAACCCTGATGACAAG)纯化和测序。然后使用被称作Tsunami的改良版本的TIDES算法(Brinkman等人(2104)；《核酸研究》,2014,1)分析序列数据。这确定了在gRNA/Cas9复合物的预测切割位点处出现的插入和缺失(INDELS)的频率。
测试含有T4、T5、T11和T13向导()的标准20个核苷酸靶序列或19个核苷酸靶序列(在5'末端短1bp)的向导RNA(在加利福尼亚州门洛帕克的AxoLabs、德国库尔姆巴赫或Synthego公司处化学合成)。19个核苷酸的gRNA可能具有更高的序列特异性，但较短的向导可能具有较低的效力。包括靶向人类AAVS1位点和人类补体因子的对照向导，用于在供体之间进行比较。使用TIDES方法转染之后48h，测量白蛋白内含子1中的靶位点处的插入缺失频率。图6概括来自4种不同人类供体的原代肝细胞的转染结果。结果表明，不同向导的切割效率在20％到80％范围内。每个白蛋白gRNA的20个核苷酸版本始终比19个核苷酸变异体更有效。20个核苷酸gRNA的优良效力可能会抵消19个核苷酸gRNA在脱靶切割方面可能具有的任何潜在益处。向导RNA T4在4个细胞供体上表现出最一致的切割，其中插入缺失频率约为60％。选择gRNA T4、T5、T11和T13进行脱靶分析。
实例8：识别人类白蛋白向导RNA的脱靶位点
识别CRISPR/Cas9的脱靶位点的两种方法是从头算预测和经验检测。向导RNA对Cas9裂解位点的规范是不完善的过程，因为Cas9裂解耐受向导RNA序列和基因组之间的错配。重要的是要了解Cas9裂解位点的频谱，以了解不同向导的安全风险，并选择具有最有利脱靶特征的向导。预测方法基于Guido，一种根据用于脱靶预测的CCTop算法调适的软件工具(Stemmer等人,2015)。Guido使用Bowtie 1算法，通过搜索向导RNA与人类基因组的整个GRCh38/hg38构建体之间的同源性来识别潜在的脱靶裂解位点(Langmead等人,2009)。Guido检测到与向导RNA最多有5个错配的序列，优先考虑PAM近端同源性和正确定位的NGGPAM。位点按其错配的数量和位置分级。对于每次运行，将向导序列和基因组PAM连接起来，并使用默认参数运行。下表5-8中显示了白蛋白向导T4、T5、T11和T13的三个或更少的错配的顶部命中。每个表中的第一行显示了人类基因组中的中靶位点，下面的线显示了预测的脱靶位点。
表5
Figure BDA0003117691830001011
表6
Figure BDA0003117691830001012
表7
Figure BDA0003117691830001021
表8
Figure BDA0003117691830001031
此外，使用称为GUIDE-seq的方法识别了人类肝细胞中人类白蛋白gRNA T4、T5、T11、T13的脱靶位点。GUIDE-seq(Tsai等人,2015)是一种发现脱靶裂解位点的经验方法。GUIDE-seq依赖于寡核苷酸在染色体DNA双链断裂位点的自发捕获。简单来说，在用gRNA/Cas9复合物转染相关细胞后，从细胞中纯化双链寡核苷酸基因组DNA，超声处理并进行一系列衔接子连接以产生库。对含有寡核苷酸的库进行高通量DNA测序，并且使用默认的GUIDE-seq软件处理输出，以识别寡核苷酸捕获的位点。
详细地说，通过使两个互补单链寡核苷酸通过加热到89℃然后缓慢冷却到室温来退火，产生双链GUIDE-seq寡核苷酸。通过将240pmol的向导RNA(Synthego公司，加利福尼亚州门洛帕克)和48pmol的20μ摩尔Cas9 TruCut(赛默飞世尔)混合成最终体积为4.8uL来制备RNP复合物。在单独的管中，将4μl的10μ摩尔GUIDeseq双链寡核苷酸与1.2μl的RNP混合物混合，然后添加到核转染盒(龙沙)中。向其中添加16.4μl的核转染SF溶液(龙沙)和3.6μl补充剂(龙沙)。用胰蛋白酶处理生长为粘附培养物的HepG2细胞以使其从板上释放，然后将胰蛋白酶灭活后沉淀并以12.5e6细胞/ml再悬浮于核转染溶液中，并将20μl(2.5e5细胞)添加到每个核转染比色皿中。用4-D核转染单位(龙沙)中的EH-100细胞程序进行核转染。在室温下培育10分钟后，添加80-μl完整的HepG2培养基，并将细胞悬浮液置于24孔板的孔中，并在37℃下在5％CO2下培育48小时。用胰蛋白酶释放细胞，离心(300g，10分钟)沉淀，然后使用DNAeasy血液和组织试剂盒(DNAeasy Blood and Tissue Kit)(Qiagen)提取基因组DNA。使用引物AlbF(CCCTCCGTTTGTCCTAGCTTTTC)和AlbR(CCAGATACAGAATATCTTCCTCAACGCAGA)和铂PCR超混合液高保真度(英杰)，使用35个PC循环和55℃的退火温度对人类白蛋白内含子1区进行PCR扩增。首先通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，以确认已生成合适大小的产物(1053bp)，然后使用引物(For：CCTTTGGCACAATGAAGTGG，rev：GAATCTGAACCCTGATGACAAG)直接测序。然后使用被称作Tsunami的改良版本的TIDES算法(Brinkman等人(2104)；《核酸研究》,2014,1)分析序列数据。这确定了在gRNA/Cas9复合物的预测切割位点处出现的插入和缺失(INDELS)的频率。与Tsai等人所描述的协议相比，我们使用40pmol
Figure BDA0003117691830001041
捕获寡核苷酸进行了GUIDE-seq，以提高脱靶裂解位点识别的敏感性。为了获得大约0.01％的灵敏度，我们定义了每个转染最少10,000个唯一的中靶序列读数，其中最小的中靶切割率为50％。未转染的RNP的样本被平行处理。在含有RNP的样本和不含RNP的样本中发现的位点(+/-1kb)均无法进行进一步分析。
在人类肝瘤细胞系HepG2中进行GUIDE-seq。在HepG2中，GUIDE-seq寡核苷酸在中靶位点处的捕获在表明为有效的寡核苷酸捕获的NHEJ频率的70％-200％范围内。
通过将通用衔接子退火到每个含有8-mer分子指数的样本条形码衔接子(A01-A16)，来制备Y衔接子。使用Qubit对从已经用RNP和GUIDEDseq oligo进行核转染的HepG2细胞中提取的基因组DNA进行定量，并在120uL体积的TE缓冲液中将所有样本归一化到400ng。根据Covaris S220超声仪的标准操作程序，将基因组DNA剪切到200bp的平均长度。为了确认平均片段长度，根据制造商协议在TapeStation上分析1uL样本。根据制造商的协议使用AMPure XP SPRI珠子清洁剪切的DNA样本，并在17uL的TE缓冲液中洗脱。通过混合1.2μl的dNTP混合液(每个dNTP 5mM)、3μl的10×T4 DNA连接酶缓冲液、2.4μl末端修复混合液、2.4μl 10×铂Taq缓冲液(不含Mg2+)和0.6μl的Taq聚合酶(非热启动)和14uL剪切的DNA样本(来自上一步)，每管总体积为22.5uL，并在热循环仪中培育(12℃15分钟；37℃15分钟；72℃15分钟；保持4℃)在基因组DNA上进行末端修复反应。向其中添加1μl退火的Y衔接子(10μM)、2μl T4 DNA连接酶和在热循环仪中培育的混合物(16℃，30分钟；22℃，30分钟；保持4℃)。根据制造商协议，使用AMPure XP SPRI珠粒清洁样本，并在23uL TE缓冲液中洗脱。根据制造商协议，在TapeStation上运行1uL样本，以确认衔接子与片段的连接。为了制备GUIDEseq库，制备含有14μl不含核酸酶的H2O、3.6μl 10×铂Taq缓冲液、0.7μl dNTP混合液(各10mM)、1.4μl MgCl2、50mM、0.36μl铂Taq聚合酶、1.2μl有义或反义基因特异性引物(10μM)、1.8μl TMAC(0.5M)、0.6μl P5_1(10μM)和10μl来自前述步骤的样本的反应。将此混合液在热循环仪中培育(95℃5分钟，然后95℃30sec、70℃(每个循环减1℃)持续2分钟、72℃30sec循环15次，接着95℃30sec、55℃1min、72℃30sec，接着72℃5分钟循环10次)。根据制造商协议，使用AMPure XP SPRI珠粒净化PCR反应，并在15uL TE缓冲液中洗脱。根据制造商协议，在TapeStation上检查了1uL样本，以跟踪样本进度。通过混合6.5μl无核酸酶H2O、3.6μl 10×铂Taq缓冲液(不含Mg2+)、0.7μl dNTP混合液(各10mM)、1.4μl MgCl2(50mM)、0.4μl铂Taq聚合酶、1.2μl基因特异性引物(GSP)2(有义；+或反义；-)、1.8μl TMAC(0.5M)、0.6μl P5_2(10μM)和15μl来自上一步骤的PCR产物来进行第二次PCR。如果在第一次PCR中使用GSP1+，那么在PCR2中使用GSP2+。如果在第一次PCR反应中使用GSP1引物，那么在第二次PCR反应中使用GSP2引物。添加1.5μl P7(10μM)之后，将反应物在热循环仪中按照以下程序进行培育：95℃5分钟，然后95℃30sec、70℃(每个循环减1℃)持续2分钟、72℃30sec循环15次，接着95℃30sec、55℃1min、72℃30sec，接着72℃5分钟循环10次。根据制造商协议，使用AMPure XPSPRI珠粒净化PCR反应，并根据制造商协议在30uL TE缓冲液中洗脱并在TapeStation上分析1uL以确认扩增。根据制造商提供的协议，使用用于因美纳库定量(Illumina LibraryQuantification)的Kapa生物系统试剂盒试对PCR产物的库进行定量，并且对因美纳系统进行下一代测序以确定寡核苷酸已整合到的位点。
表9到表12列出了GUIDE-seq的结果。重要的是要考虑到GUIDE-seq识别的预测靶序列。如果预测的靶序列缺乏PAM或缺乏与gRNA的显著同源性，例如超过5个的错配(mm)，那么这些基因组位点不是真正的脱靶位点，而是测定的背景信号。GUIDE-seq方法导致HepG2细胞中寡核苷酸的捕获频率很高，表明此方法适用于此细胞类型。中靶读数计数符合预设标准，即4份向导中的3份中靶读数的最低标准为10,000。识别出了4个先导gRNA候选物的少量脱靶位点。对于4个gRNA，真正的脱靶位点的数目(意味着含有PAM并且与gRNA具有显著同源性)在0到6的范围内。T4向导展示了2个看上去真实的脱靶位点。通过测序读数计数判断，这些事件在GUIDE-seq中的发生频率分别是中靶裂解频率的2％和0.6％。T13和T5向导均未通过GUIDE-seq展示出与gRNA具有同源性并且含有PAM的脱靶位点，并且因此似乎具有所测试的4种向导中最理想的脱靶特征。gRNA T11展示了一个脱靶位点，其具有相对较高的读数计数，所述读数计数是中靶读数计数的23％，这表明此读数对治疗用途的吸引力较小。
表9
Figure BDA0003117691830001061
表10
Figure BDA0003117691830001071
没有列出染色体的两个条目映射到GL000220.1(未放置的161kb重叠群)。
表11
Figure BDA0003117691830001081
没有列出染色体的两个条目映射到GL000220.1(未放置的161kb重叠群)。
表12
Figure BDA0003117691830001091
没有列出染色体的条目映射到GL000220.1(未放置的161kb重叠群)。
通常在非人类灵长类动物中评估治疗性药物候选物，以预测其对人类使用的效力和安全性。在使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑的情况下，向导RNA的序列特异性要求在人类和非人类灵长类动物中都应存在相同的靶序列，以测试可能在人类中使用的向导。在计算机上筛选了靶向人类白蛋白内含子1的向导，以识别与食蟹猴猕猴中对应的基因组序列相匹配的那些(参见表4)。然而，需要在相关的细胞系统中确定这些向导切割非人类灵长类动物基因组的能力以及它们在预测的中靶位点上切割的相对效率。使用与上述原代人类肝细胞相同的实验方案，用白蛋白向导RNA T4、T5、T11或T13和spCas9 mRNA转染食蟹猴的原代肝细胞(从纽约州韦斯特伯里的BioIVT(BioIVT,Westbury,NY)获得)。然后使用上述相同的TIDES方案，但使用对食蟹猴白蛋白内含子1具有特异性的PCR引物，确定INDELS的频率。结果概括在图7中。在同一图中显示了人类原代肝细胞中向导RNA T4的对应数据以用于比较。所有4个向导均以10％到25％的频率促进了来自两个不同动物供体的食蟹猴肝细胞中白蛋白内含子1中的预期位点处的裂解。切割效率的等级顺序为T5>T4>T11＝T13。T5向导RNA是4个向导中最有效的，并且在2个供体中切割了20％和25％的目标等位基因。切割效率低于人类细胞中对应的向导，这可能是由于转染效率的差异。或者，这些向导和/或spCas9酶可能在灵长类细胞中本身效力较低。尽管如此，通过GUIDEseq发现T5是4个向导中最有效的，连同其有利的脱靶特征，使T5在NHP以及人类测试中都具有吸引力。
实例9：将SEAP报告基因供体靶向整合到CRISPR/Cas9介导的小鼠白蛋白内含子1 中导致将SEAP表达并分泌到血液中。
为了评估使用CRISPR/Cas9的序列特异性裂解来介导编码目的基因的供体模板序列在由Cas9/gRNA复合物产生的双链断裂处的整合的潜力，我们设计并构建了编码报告基因鼠分泌型碱性磷酸酶(mSEAP)的供体模板。mSEAP基因在小鼠中是非免疫原性的，能够监测编码的mSEAP蛋白质的表达，而不会受到对所述蛋白质免疫反应的干扰。此外，当在编码序列的5'末端包括适当的信号肽时，mSEAP轻易地分泌到血液中，并且可以使用测量蛋白质活性的测定轻易地检测蛋白质。如图8所示，设计了用于包装到AAV的mSEAP构建体，用于经由用spCas9和向导RNA mALbT1(tgccagttcccgatcgttacagg，SEQ ID NO:80)的裂解靶向整合到小鼠白蛋白内含子1中。对去除了信号肽的mSEAP编码序列进行密码子优化以用于小鼠，并且在剪接到内源性小鼠白蛋白外显子1之前需要两个碱基对(TG)来维持正确的阅读框架。由共有剪接受体序列和聚嘧啶通道(CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG，SEQ ID NO:2)组成的剪接受体被添加到编码序列的5'末端，并且聚腺苷酸化信号(sPA)被添加到编码序列的3'末端(AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG，SEQ ID NO:5)。存在于基因组中的mAlbT1向导RNA的靶位点的反向补体(TGCCAGTTCCCGATCGTTACAGG，SEQ IDNO:80)被包括在此盒的任一侧。我们假设，通过为向导RNA添加切割位点，应该将AAV基因组在体内递送给其的细胞核内裂解，从而产生线性DNA片段，所述线性DNA片段是通过非同源末端连接(NHEJ)途径在双链断裂处整合的最佳模板。为了能够有效地包装到AAV衣壳中，添加了来源于人类微小外围组织序列的填充片段，以实现包括4596bp ITR在内的整体大小。如果此供体盒以正向方向整合到由Cas9/mALbT1向导RNA复合物产生的白蛋白内含子1的双链断裂中，那么预测白蛋白启动子的转录会产生初级转录本，所述转录本可以经历从白蛋白外显子1的剪接供体至共有剪接受体的剪接，并且产生成熟的mRNA，其中白蛋白外显子1与mSEAP编码序列同框融合。此mRNA的翻译将在小鼠白蛋白(其编码于白蛋白外显子1中)的信号肽之前产生一个mSEAP蛋白质。信号肽将引导mSEAP的分泌进入循环系统，并且在分泌过程中被裂解，留下成熟的mSEAP蛋白质。因为小鼠白蛋白外显子1编码信号肽和前肽，接着是编码的成熟白蛋白蛋白质的N端的7bp(编码Glu-Ala加1bp(C))，在前肽裂解之后，预测SEAP蛋白质在N端含有3个额外的氨基酸，即Glu-Ala-Leu(Leu是由白蛋白外显子1的最后一个C碱基产生的，它与来自整合的SEAP基因盒的TG剪接)。由于亮氨酸是不带电荷的且是非极性的，因此不太可能干扰SEAP蛋白质的功能，我们选择编码亮氨酸(Leu)作为在N端添加的3个额外氨基酸的第3位。使用基于HEK 293的转染系统和用于病毒纯化的标准方法将此SEAP供体盒(称为pCB0047)包装到AAV8血清型衣壳中(载体生物实验室公司(VectorBiolabs Inc))。使用位于mSEAP编码序列内的引物和探针，使用定量PCR对病毒进行滴定。
将pCB0047病毒在第0天以2e12 vg/kg的剂量注射到小鼠的尾静脉中，接着在4天后是包封mALbT1向导RNA(向导RNA序列5'TGCCAGTTCCCGATCGTTACAGG 3'，加划线的PAM，SEQID NO:80)和spCas9 mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)。基本上如(Hendel等人,《自然·生物技术》2015 33(9)：985-989)所描述，单个向导RNA是化学合成的并且掺入化学修饰的碱基，并且使用了标准tracr RNA序列。spCas9 mRNA是使用标准技术合成的，并且包括在蛋白质的N端和C端均添加核定位信号的核苷酸序列。在mRNA被LNP递送到目的细胞的细胞质之后，接着翻译成spCas9蛋白质之后，核定位信号需要将spCas9蛋白质引导到细胞核。使用NLS序列将Cas9蛋白质引导到细胞核是所属领域众所周知的，例如参见Jinek等人(eLife 2013；2：e00471。DOI:10.7554/eLife.00471)。spCas9 mRNA也含有聚A尾部，并且在5'末端加帽以提高稳定性和翻译效率。为了将gRNA和Cas9 mRNA包装在LNP中，我们使用了如Kaufmann等人(《纳米快报(Nano Lett.)》15(11)：7300-6)所描述的方案以基于可电离脂质C12-200(购自AxoLabs)组装LNP。LNP的其它组分是顺式4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA，购自西格玛(Sigma))、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC，购自Avanti))、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DMPE-mPEG200，购自Avanti)和胆固醇(购自Avanti)。使用纳米组装台式仪器(精密纳米系统)生产LNP，其中当脂质和核酸组分在对照条件下在微流室内混合时，LNP会自组装。将spCas9 mRNA和向导RNA包封到单独LNP中。通过透析将LNP浓缩到磷酸盐缓冲盐水中，并且在使用前在4℃下储存长达1周。LNP使用动态光散射进行表征，并且大小通常在50到60nM之间。使用Ribogreen分析试剂盒(赛默飞世尔科学)测量LNP中RNA的浓度，并且用于确定给予小鼠的剂量。对于给药小鼠，在注射前立即将spCas9和向导RNA LNP以1:1的RNA质量比混合。这些LNP将spCas9 mRNA和指导RNA递送至小鼠肝脏的能力通过用一系列LNP剂量注射小鼠IV并且使用TIDES程序测量小鼠基因组在肝脏中的白蛋白内含子1中的脱靶位点处的裂解来证明(Brinkman等人,《核酸研究》2014年12月16日；42(22)：e168)。参见实例2(图4)对于其中至多25％的等位基因在中靶位点处裂解的典型结果。
用2e12 vg/kg的AAV8-CB0047病毒在尾静脉中注射两组，每组5只小鼠。三天后，以2mg/kg的总RNA剂量(spCas9和gRNA的1:1比例)向其中一组注射了包封有spCas9 mRNA和mAlbT1向导RNA的LNP。每周收集血液样本，并且使用市售试剂盒(英杰)测定血浆的SEAP活性。结果(参见表13)表明在只接受AAV8-pCB0047病毒的小鼠中无SEAP活性是可检测的。接收AAV8-pCB0047病毒接着是LNP的小鼠在血浆中具有SEAP活性，其在给药后4周时保持稳定直至最后一个时间点。仅当小鼠同时接受AAV8供体SEAP基因和CRISPR-Cas9基因编辑成分时才表达SEAP的发现表明，SEAP蛋白质是从整合到白蛋白内含子1中的靶位点中的SEAP基因的拷贝表达出来的。由于pCB047中的SEAP基因缺少信号肽或启动子，除非将其与SEAP编码序列同框的启动子和信号肽可操作地连接，否则无法表达和分泌。如果将pCB047基因盒整合到基因组中的随机位点，那么不太可能发生这种情况。
为了确认来自pCB0047的SEAP基因盒整合到白蛋白的内含子1中，我们使用小液滴数字PCR(DD-PCR)来测量在研究结束时从小鼠的肝提取的基因组DNA中的整合频率。DD-PCR是一种精确定量复杂混合物中核酸序列拷贝数的方法。设计了一对PCR引物，其中一个位于mAlbT1向导的靶位点的5'侧上的小鼠白蛋白基因组序列中(靶向整合的预测位点)，并且另一个引物位于pCB0047中SEAP基因的5'末端处。当SEAP盒以所需的正向方向整合时，这种“进-退”PCR将扩增小鼠白蛋白基因组序列与整合的SEAP盒之间的连接。设计了一种荧光探针，所述探针与通过这两种引物扩增的DNA序列杂交。作为DD-PCR分析的内部对照，使用了检测小鼠白蛋白基因的引物探针组。使用这种DD-PCR分析，我们测得靶向整合频率为0.24+/-0.07％(每100份白蛋白基因0.24份)，从而确认SEAP盒在白蛋白内含子1处整合。
表13：单独注射pCB0047 AAV8病毒或3天后用LNP包封spCas9 mRNA和mAlbT1向导RNA注射的小鼠血浆中的SEAP活性
Figure BDA0003117691830001131
实例10：将人类FVIII基因供体靶向整合到由CRISPR/Cas9介导的小鼠白蛋白内含 子1中导致FVIII在血液中的表达
本文描述的用于将基因靶向整合到白蛋白内含子1中的基因编辑策略可以用于在肝脏中表达任何目的基因，以提供治疗益处。可以用此方法治疗患有遗传性疾病的患者，所述遗传性疾病导致蛋白质缺失或蛋白质水平降低，所述蛋白质通过在肝脏中表达某种蛋白质而被替代。确切地说，即使所述蛋白质的正常表达位点不是肝脏或肝脏内的肝细胞，也可以通过这种靶向基因编辑方法来治疗由血液中正常存在的蛋白质不足引起的疾病，因为整合到白蛋白内含子1的治疗性基因在肝细胞中的表达将导致编码的蛋白质分泌到血液中。
可使用此基因编辑策略治疗的疾病的实例包括血友病A、血友病B、MPS II、MPS1H、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、FXIII缺乏、FVII缺乏、FX缺乏、蛋白质C缺乏和HAE。
选择血友病A作为疾病的实例，以确定本文所描述的基因编辑方法是否可以用于提供治疗益处。血友病A是一项经过广泛研究的疾病(Coppola等人,《血液医学杂志(JBlood Med.)》2010；1：183-195)，其中患者的FVIII基因突变导致其血液中功能FVIII蛋白质水平降低。因子VIII是凝血级联反应的关键组分，并且在缺乏足够量的FVIII的情况下，血液无法在受伤部位形成稳定的血凝块，从而导致大量出血。未经有效治疗的血友病A患者会经历关节出血，导致关节损坏。颅内出血也可能发生且有时可能致命。
为了评估此基因编辑策略是否可以用于治疗血友病A，我们使用了小鼠FVIII基因失活的小鼠模型。这些血友病A小鼠的血液中没有可检测到的FVIII，这使得有可能使用FVIII活性分析(Diapharma，Chromogenix Coatest SP因子FVIII，目录号#K824086试剂盒)测量外源供应的FVIII。作为此分析的标准，我们使用了Kogenate(拜耳(Bayer))，一种用于治疗血友病患者的重组人类FVIII。分析结果报告为正常人类FVIII活性的百分比，其定义为1IU/ml。基于B结构域缺失的FVIII编码序列构建了人类FVIII供体模板，所述序列已显示当在强肝特异性启动子的控制下用AAV载体递送到小鼠时发挥功能(McIntosh等人,2013；《血液》；121(17)：3335-3344)。从此FVIII编码序列中去除了编码天然信号肽的DNA序列，并且在剪接到小鼠白蛋白外显子1之后被维持正确阅读框所需的两个碱基对(TG)替代。将衍生自小鼠白蛋白内含子1的剪接受体序列立即插入此FVIII编码序列的5'。将来自人类珠蛋白基因的3'非翻译序列，接着是合成的聚腺苷酸化信号序列插入到FVIII编码序列的3'侧。合成的聚腺苷酸化信号是一个49bp的短序列，其显示有效地引导聚腺苷酸化(Levitt等人,1989；GENES&DEVELOPMENT 3：1019-1025)。3'UTR序列获自B珠蛋白基因并且可用于进一步改进聚腺苷酸化效率。将mAlbT1向导RNA的靶位点的反向补体置于此FVIII基因盒的任一位点上，以产生称为pCB056的载体，所述载体含有如图9所示的AAV2的ITR序列。将此质粒包装于AAV8衣壳中以产生AAV8-pCB056病毒。
向一组5只血友病A小鼠(第2组；G2)以1e13 vg/kg的剂量在尾静脉中注射AAV8-pCB056病毒，并且在19天后，向同一小鼠的尾静脉中注射两个基于C12-200的LNP的混合物，所述LNP包封spCas9 mRNA和mAlbT1向导RNA，剂量分别为1mg RNA/kg。如以上实例2中所描述调配LNP。将5只血友病A小鼠的独立组(第6组；G6)以1e13 vg/kg的剂量在尾静脉中注射AAV8-pCB056病毒，并且在接下来的4周中监测FVIII活性。当仅注射AAV时，在小鼠的血液中没有可测量的FVIII活性(图9中的G6)。接受AAV8-pCB056病毒，接着是LNP中的CRISPR/Cas9基因编辑组分的小鼠,其血液中的FVIII活性是正常人FVIII活性水平的25％到60％。严重血友病患者的FVIII活性水平低于正常水平的1％，中度血友病A患者的FVIII水平是正常水平的1到5％，并且轻度患者的FVIII水平是正常水平的6％到30％。对接受FVIII替代蛋白质治疗的血友病A患者的分析报告说，在预测的FVIII低谷水平为3％、5％、10％、15％和20％时，无出血发生的频率分别是71％、79％、91％、97％和100％(Spotts等人《血液》2014 124:689)，这表明当FVIII水平维持在最低水平15到20％以上时，出血事件的发生率降低到接近零。虽然尚未定义治愈血友病A所需的精确FVIII水平，并且可能因患者而异，但5％至30％的水平可能会显著减少出血事件。因此，在上述血友病A小鼠模型中，达到的FVIII水平(25到60％)在预期可治愈的治疗相关范围内。
图10中的五只小鼠中的四只展现稳定的FVIII水平(在测定的正常可变性和小鼠生理学的变化内)直到第36天研究结束。在第36天，其中一只小鼠(2-3)中的FVIII活性降到无法检测的水平，并且这很可能是由于针对人类FVIII蛋白质的免疫反应，所述人类FVIII蛋白质可能被识别为小鼠中的外来蛋白质(Meeks等人,2012《血液》120(12)：2512-2520)。当仅注射AAV-FVIII供体模板时，小鼠中未表达FVIII蛋白质的观察结果表明，FVIII的表达需要提供CRISPR/Cas9基因编辑组分。由于FVIII供体盒没有启动子或信号肽，因此不太可能通过将盒整合到基因组中的随机位点或通过其它一些不确定的机制来制备FVIII。为了确认FVIII供体盒已整合到白蛋白内含子1中，我们以DD-PCR格式使用进-退PCR。将第2组小鼠的全肝匀浆并提取基因组DNA，并且使用位于预测中靶整合已发生的mAlbT1 gRNA切割位点的位置5'处的小鼠白蛋白基因中的一个引物，通过DD-PCR进行分析。第二个PCR引物位于pCB056盒内FVIII编码序列的5'末端。设计用于检测的荧光探针以与两个PCR引物之间的序列杂交。使用这两个引物的PCR将扩增整合事件的5'连接点，其中FVIII盒以能够表达FVIII蛋白质的正向定向整合在mAlbT1 gRNA切割位点处。针对小鼠白蛋白基因内区域的DD-PCR分析用作对照，以测定分析中小鼠基因组的拷贝数。此分析每100个单倍体小鼠基因组检测到0.46到1.28个靶向整合事件(平均值为1.0)。在靶向整合频率和峰值FVIII水平之间存在相关性，与从整合的FVIII基因盒中产生的FVIII一致。假设小鼠肝脏中的约70％细胞是肝细胞并且AAV8和LNP两者主要由肝细胞吸收，可以估计的是，1.4％(1.0*(1/0.7))的肝细胞白蛋白等位基因在正向定向中含有整合的FVIII盒。这些结果表明，CRISPR/Cas9可以用于将经过适当设计的FVIII基因盒整合到小鼠的白蛋白内含子1中，并且从而将治疗水平的功能FVIII蛋白质表达和分泌到血液中。在这项研究中采用的递送方式，即递送FVIII供体模板的AAV病毒和递送CRISPR/Cas9组分的LNP可能适合体内递送给患者。因为Cas9是作为一种在体内具有较短寿命(在1-3天范围内)的mRNA递送的，所以CRISPR/Cas9基因编辑复合物将只能在很短的时间内起作用，从而限制了脱靶裂解的时间事件的发生，从而提供了预测的安全益处。这些数据表明，尽管CRISPR/Cas9仅在很短的时间内有活性，但这足以诱导靶向整合，其频率足以在小鼠中产生治疗相关水平的FVIII活性。
表14：注射AAV8-pCB056和LNP的第2组HemA小鼠的靶向整合频率和FVIII水平
Figure BDA0003117691830001151
实例11：相对于AAV供体在LNP中给药向导RNA和Cas9 mRNA的定时影响基因表达的 水平
为了评估在注射AAV供体模板与给药包封Cas9 mRNA和向导RNA的LNP之间是否对编码于供体模板上的基因的表达水平产生影响，我们注射了两组，每组5只小鼠，每只小鼠均接种编码mSEAP的AAV8-pCB0047。注射AAV之后四天，向一组小鼠(第3组)注射基于C12-200的LNP，所述LNP包封spCas9 mRNA和mAlbT1 gRNA(各1mg/kg)，并且在接下来的4周每周测量血浆中SEAP的活性。在第二组小鼠中监测SEAP活性4周，在此期间未检测到SEAP。注射AAV之后28天，对第4组的小鼠给药基于C12-200的LNP，所述LNP包封spCas9 mRNA和mAlbT1gRNA(各1mg/kg)，并且在接下来的3周内每周测量血浆中SEAP的活性。SEAP数据概括在表15中。在AAV之后4天接受LNP包封的spCas9/gRNA的第3组中，SEAP活性平均为3306微单位/毫升。在AAV之后28天接受LNP包封的spCas9/gRNA的第4组中，SEAP活性平均为13389微单位/毫升，这比第3组高4倍。这些数据表明，与仅在AAV供体模板之后4天给药LNP包封的spCas9/gRNA相比，在LNP之后28天给药LNP包封的spCas9/gRNA导致基因组中整合的基因的表达高4倍。此改进的表达可能是由于全长供体编码的基因盒整合到白蛋白内含子1中的频率更高。
表15：4天或28天后注射AAV8-pCB0047和LNP的小鼠血浆中的SEAP活性
Figure BDA0003117691830001161
还使用FVIII基因作为治疗相关基因的一个实例，评估了AAV供体和LNP包封的Cas9/gRNA给药定时的影响。在第0天，向两组血友病A组小鼠注射AAV8-pCB056，其编码人类FVIII供体盒，剂量为2e12 vg/kg。其中一组在4天后注射了包封spCas9 mRNA和mAlbT1gRNA的基于C12-200的LNP(各1mg/kg)，而第二组在17天后给药包封spCas9mRNA和mAlbT1gRNA的基于C12-200的LNP(各1mg/kg)。错开AAV8-pCB056的剂量，以便在同一天将同一批包封spCas9 mRNA和向导RNA的LNP用于两组。在给予LNP后的第10天和第17天测量小鼠血液中的FVIII活性，并且结果示于图11中。AAV之后4天接受LNP的小鼠血液中没有可检测到的FVIII，而AAV之后17天注射LNP的组中的所有4只小鼠具有在第17天正常的2％到30％范围内的可检测的FVIII活性。这些结果表明，对于编码FVIII的AAV供体，在AAV供体之后至少17天给药CRISPR/Cas9组分导致治疗相关的FVIII水平，而在AAV之后4天给药未导致FVIII表达。
AAV感染细胞(包括肝脏细胞)的过程涉及从内体逃逸、病毒脱壳以及AAV基因组向核的转运。在这些研究中使用的AAV中，单链基因组包装在病毒中，单链基因组经过第二链DNA合成过程形成双链DNA基因组。将单链基因组完全转化成双链基因组所需的时间尚未确定，但其被视为限速步骤(Ferrari等人,1996；《病毒学杂志(J Virol.)》70：3227-3234)。然后，双链线性基因组连成由头对尾和尾对头连接的单体构成的多聚体环形式(Sun等人,2010；《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》21：750-762)。由于我们研究中使用的AAV供体模板不含有同源臂，因此它们将不是HDR模板，并且因此只能经由NEHJ途径整合。只有双链线性DNA片段是在双链断裂处NHEJ介导的整合的模板。因此，我们假设在AAV供体之后不久将CRISPR-Cas9组分递送到肝细胞可能导致整合频率较低，因为大多数AAV基因组是单链形式，并且在这些情况下大多数是基因组的双链断裂将以小的插入和缺失进行修复，而无需整合供体模板。在AAV供体模板之后的较晚时间递送CRISPR/Cas9基因编辑组分，可以留出时间形成双链AAV基因组，而AAV基因组是NHEJ介导的靶向整合的模板。然而，在递送AAV供体之后等待太长时间可能会导致将双链线性形式转化成环状(多联体)形式，而这将不是NHEJ介导的靶向整合的模板。供体模板中包括向导RNA/Cas9的切割位点将导致环状形式的裂解以生成线性形式。任何其余的线性形式也将被切割以释放含有AAV ITR序列的短片段。在AAV供体模板中包括1或2个向导RNA切割位点将从AAV基因组的多联体形式产生多种线性片段。线性片段的类型将取决于AAV基因组中的切割位点的数目和各多联体中的多聚体数目以及其相对定向而变化，并且因此难以预测。放置在AAV盒的5'末端的单个gRNA位点将从单体环和头尾多联体释放单体双链模板(头尾意味着连接到下一个AAV基因组的3'末端的一个AAV基因组的5'末端)。然而，5'末端处的单个gRNA位点将不会从头部释放单体双链线性模板到头部多联体(头对头多联体由连接到下一个AAV基因组的5'末端的一个AAV基因组的5'末端组成)。使用5'末端处的单个gRNA位点的可能优势是，它只会从头对头多联体而不是从头对尾多联体来释放含有双链片段的短ITR。在AAV基因组5'末端处的单个gRNA切割位点的情况下，ITR将保留在线性单体基因盒的3'末端处，并且因此将整合到基因组中。当AAV中的供体盒含有两个gRNA位点(侧接盒)时，这将导致单体双链模板从所有形式的双链DNA中释放出来，并且因此可能会释放出更多的模板用于靶向整合，尤其是当头对尾和尾对头多联体的混合存在时。包括侧接盒的2个gRNA靶位点的潜在缺点是这将释放含有AAV ITR序列的小(约150个碱基对)双链线性片段。对于含有治疗性目的基因的基因盒的每个拷贝，将产生这些小(约150个碱基对)片段中的两个。预期含有短ITR的片段也将是NHEJ介导的在基因组双链断裂处靶向整合的模板，并且因此将与含有基因盒的片段竞争以在基因组的双链断裂中整合，并且由此降低发生治疗性基因盒与宿主细胞基因组的整合的期望事件的频率。鉴于此生物系统的复杂性，其中许多参数(如多联体形成的动力学和多联体的分子组成)(头对尾和尾对头多联体的含量以及多联体中单体单元的数量)尚不清楚，无法肯定地预测供体盒中的0、1或2个向导切割位点是否将实现含有治疗基因的所需供体盒的最高靶向整合，或如何通过CRISPR/Cas9基因编辑组分的递送定时来影响。我们的数据支持在如下环境中包括2个向导RNA切割位点导致可测量的靶向整合：其中CRISPR/Cas9基因编辑组分通过包封spCas9 mRNA的LNP递送，并且向导RNA在AAV供体盒给药之后至少17天给药，但当LNP在AAV供体盒给药之后4天时不给药。
实例12：不同的聚腺苷酸化信号对FVIII表达的影响
为了评估在靶向整合到小鼠白蛋白内含子1中之后不同聚腺苷酸化信号序列对FVIII基因表达的影响，我们构建了一系列如图12所示的质粒。这些质粒被设计为在5'末端处具有mALbT1 gRNA的单个靶位点，这将导致在使用流体动力学注射(HDI)递送到小鼠后，体内环状质粒DNA线性化。HDI是一种将质粒DNA递送到小鼠肝脏的成熟技术(Budker等人,1996；《基因疗法(Gene Ther.)》,3,593-598)，其中将盐水溶液中的裸质粒DNA快速注射到小鼠的尾静脉中(在5到7秒内达到2到3ml的体积)。
向6只血友病A小鼠的组中，每只小鼠分别以25μg的水动力注射pCB065、pCB076或pCB077。二十四小时后，通过眶后注射对小鼠给药包封spCas9 mRNA和mAlbT1 gRNA的C12-200 LNP，剂量为每种RNA 1mg/kg。在LNP给药后第10天测量小鼠血液中的FVIII活性。在第10天，处死小鼠，将全肝匀浆，并且从匀浆中提取基因组DNA。使用定量实时PCR量化FVIII供体盒以正向定向靶向整合到白蛋白内含子1的频率。在这种实时PCR分析中，一个引物位于预期整合位点(mAlbT1 gRNA的切割位点)的小鼠白蛋白基因5'的基因组序列中，并且第二个PCR引物位于供体质粒中的FVIII编码序列的5'末端处。荧光探针位于两个引物之间。当整合发生在正向定向(其中FVIII基因与基因组小鼠白蛋白基因的方向相同)时，此分析将特异性检测小鼠基因组与供体盒之间的连接。将由天然小鼠肝基因组DNA中的连接片段的预测序列组成的合成DNA片段用作拷贝数标准以计算肝基因组DNA中的整合事件的绝对复本。第2组(注射pCB065)、第3组(注射pCB076)和第4组(注射pCB077)的小鼠中的FVIII活性分别是5.5％、4.2％和11.4％。注射了pCB077的第4组的FVIII活性最高。因为在小鼠之间通过流体动力注射将DNA递送到肝脏是高度可变的，所以我们计算了FVIII活性除以每只单独小鼠的靶向整合频率，如图13所示。此比率表示每FVIII基因整合拷贝的FVIII表达，并且与pCB065和pCB076相比，pCB077(第4组)的表达优良。当我们排除不表达任何FVIII的小鼠时，pCB065、pCB076和pCB077的平均FVIII/TI比分别是42、8和57。这些数据表明，与pCB076中的sPA聚腺苷酸化信号相比，pCB077中的aPA+聚腺苷酸化信号能够实现FVIII的优良表达。使用sPA+聚腺苷酸化信号的FVIII表达与使用牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号的表达相似。当使用AAV病毒递送供体时，与bGH聚A(225bp)相比，使用短的多腺苷酸化信号序列(如sPA(49bp)或sPA+(54bp))具有优势，特别是在FVIII基因的情况下它的大小为4.3Kb，接近AAV的包装限制(不包括ITR的包装为4.4Kb)。sPA+聚腺苷酸化信号与sPA聚腺苷酸化信号的区别仅在于在FVIII基因的终止密码子与合成的聚腺苷酸化信号序列(aataaaagatctttattttcattagatctgtgtgttggttttttgtgtg)之间存在5bp的间隔区(tcgcg)。虽然此合成聚腺苷酸化信号序列先前已有描述(Levitt等人,1989；《基因与发育(Genes Dev.)》(7)：1019-25)并且被其它人用于基于AAV的基因治疗载体中(McIntosh等人,2013；Blood 121：3335-3344)，尚未明确证明包括间隔序列的益处。我们的数据表明，包括5bp的短间隔区改进整合到白蛋白内含子1中的FVIII基因的表达，其中转录是从基因组中的强白蛋白启动子上驱除的。有可能的是间隔区的优势对于设定基因组中的高度表达的位点中的靶向整合是独特的。
实例13：使用LNP重复给药CRISPR/Cas9组分导致靶向小鼠白蛋白内含子1的AAV递 送的供体盒的表达不断增加
在向患者给予基于基因编辑的基因治疗的情况下，其中将治疗基因整合到白蛋白的内含子1中，将有利于达到给患者提供最佳治疗益处的基因表达水平。例如，在血友病A中，血液中最理想的FVIII蛋白质水平将在20％到100％，或30％到100％，或40％到100％，或50％到100％的范围内。FVIII水平超过100％会增加血栓形成事件的风险(Jenkins等人,2012；《英国血液学杂志(Br J Haematol.)》157：653-63)，因此是不希望的。基于标准AAV的基因疗法使用强大的启动子从AAV基因组的游离型拷贝驱动治疗基因的表达，因此无法控制达到的表达水平，因为AAV病毒只可以给药一次并且在患者之间达到的表达显著不同(Rangarajan等人,2017；《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》377：2519-2530)。对患者给药AAV病毒之后，他们基于临床前模型开发出针对病毒衣壳蛋白质的高滴度抗体，有望阻止病毒的有效重新给予(Petry等人,2008；《基因疗法》15：54-60)。一种方法，其中通过AAV病毒递送的治疗性基因在安全港口位点(如白蛋白内含子1)处整合到基因组中，并且此靶向整合经由基因组中的双链断裂的产生而发生，提供控制靶向整合的水平并且因此控制治疗性基因产物水平的机会。在通过包封AAV基因组的AAV转导肝脏之后，所述AAV基因组含有编码治疗性目的基因的供体DNA盒，AAV基因组将以游离形式保持在转导的细胞的细胞核内。这些游离型AAV基因组在一段时间内相对稳定，因此在CRISPR/Cas9创建的双链断裂处提供了靶向整合的供体模板库。使用包封在C12-200 LNP中的AAV8-pCB0047和spCas9 mRNA和mALbT1 gRNA评估了使用重复剂量的在非免疫原性LNP中递送的CRISPR/Cas9组分诱导AAV提供的供体模板上编码的蛋白质表达逐步增加的潜力。向一组5只小鼠的尾静脉中注射2e12 vg/kg的AAV8-pCB0047，并且在4天后静脉内注射基于C12-200的LNP，所述LNP包封1mg/kg的spCas9 mRNA和1mg/kg的mAlbT1 gRNA。在接下来的4周中每周测量一次血液中SEAP的水平，并且平均为3306微单位/毫升(表16)。在第4周进行最后一次SEAP测量后，向相同的小鼠重新投药C12-200 LNP包封的spCas9 mRNA和mALbT1 gRNA各1mg/kg。在接下来的3周中每周测量一次血液中SEAP的水平，并且平均为6900微单位/毫升，比首次LNP剂量之后每周的平均水平高2倍。然后向相同的5只小鼠第三次注射C12-200 LNP包封的spCas9 mRNA和mALbT1 gRNA各1mg/kg。在接下来的4周中每周测量一次血液中SEAP的水平，并且平均为13117微单位/毫升，比第二次LNP剂量之后每周的平均水平高2倍。这些数据证明，重复剂量的CRISPR/Cas9基因编辑组分(包含包封在LNP中的spCas9mRNA和gRNA)可能导致AAV递送的供体模板的基因表达逐步增加。编码于供体模板上的SEAP基因依赖于与启动子的共价连接和表达的信号肽序列这一事实强烈表明，表达的增加是由于白蛋白内含子1中的靶向整合增加。在第12周，处死小鼠，将全肝脏匀浆，并且提取基因组DNA，并且使用DD-PCR在正向定向(产生功能SEAP蛋白质所必需的定向)中侧接所预测的5'连接点的引物来分析白蛋白内含子1处的靶向整合。整合频率平均为0.3％(每100白蛋白等位基因0.3个拷贝)。
表16：在AAV之后4天、4周和7周，注射AAV8-pCB0047，接着是注射包封spCas9 mRNA和mAlbT1 gRNA(各1mg/kg)的C12-200 LNP的小鼠血液中的SEAP活性
Figure BDA0003117691830001211
实例14：将SEAP供体靶向整合到由CRISPR/Cas9介导的原代人类肝细胞中的白蛋 白内含子1中产生SEAP表达
为了证明由CRISPR/Cas9裂解介导的基因盒靶向整合到白蛋白内含子1在人类细胞中也使用对人类基因组具有特异性的向导RNA起作用，我们在原代人类肝细胞中进行了实验。原代人类肝细胞是从人类供体肝脏处收集的人类肝细胞，为了维持其正常表现型，它们经历了基本体外操作。如图14所示，构建了两个供体模板，并且包装成AAV-DJ血清型(Grimm等人,2008；《病毒学杂志(J Virol.)》82：5887-5911)，其在体外转导肝细胞方面特别有效。使用位于相关基因(FVIII或mSEAP)编码序列内的引物和探针，通过定量PCR滴定AAV-DJ病毒，得到的滴度表示为基因组拷贝(GC)/ml。
将原代人类肝细胞(从纽约州韦斯特伯里的BioIVT获得)解冻，转移到冷冻保存的肝细胞恢复培养基(CHRM)(Gibco)，低速沉淀，然后在预先用胶原蛋白IV(康宁)包被的24孔板中以0.7x106个细胞/ml的密度接种于InVitroGROTMCP培养基(BioIVT)加TorpedoTM抗生素混合物(BioIVT)中。将板在5％CO2中在37℃下培育。在细胞粘附之后(铺板之后3-4小时)，洗去未粘附在板上的死细胞，并向细胞中添加新鲜温热的完全培养基。通过将RNA添加到最终浓度为0.02μg/μl的mRNA的OptiMem培养基(Gibco)和0.2μ摩尔向导中来制备spCas9mRNA(由Trilink制造)和hAlb T4向导RNA(由加利福尼亚州门洛帕克的Synthego公司制造)的基于脂质的转染混合物。向其中添加在Optimem中稀释30倍的相等体积的脂染胺，并且在室温下培育20分钟。将AAV-DJ-pCB0107或AAV-DJ-pCB0156以各种感染复数，感染范围从每个细胞1,000GC到每个细胞100,000GC，随后立即(在5分钟内)用spCas9 mRNA/gRNA脂质横切混合物添加到相关孔中。然后将板在5％CO2下在37℃下培育72h，之后收集培养基并且使用生色分析(Diapharma，Chromogenix Coatest SP因子FVIII，目录号#K824086试剂盒)分析FVIII活性，或使用商业试剂盒分析SEAP活性(英杰)。结果概括于图15和16中。仅用spCas9 mRNA和gRNA或仅用SEAP病毒或仅用FVIII病毒转染的对照的SEAP活性水平低，其表示细胞中的背景活性。当同时感染AAV-DJ-pCB0107病毒和Cas9 mRNA/hAlbT4 gRNA时，SEAP活性显著高于50,000和100,000的较高的MOI下的背景水平。这些数据表明，CRISPR/Cas9基因编辑组分与含有相同gRNA切割位点的AAV递送的供体的组合可能导致供体编码的转基因的表达。因为编码于AAV供体中的SEAP基因不具有启动子或信号肽并且因为SEAP表达需要基因编辑组分，所以有可能SEAP由整合到人类白蛋白内含子1中的供体的拷贝表达。进-退PCR是一种可以用于确认SEAP供体整合到人类白蛋白内含子1中的方法。
仅用100,000MOI的AAV-DJ-pCB0107或AAV-DJ-pCB0156病毒(无Cas9 mRNA或gRNA)转染的对照在72h的培养基中展现出低水平或无法检测到的FVIII活性(图16)。在不同MOI浓度下用AAV-DJ-pCB0156病毒转染的细胞以及spCas9 mRNA和hAlbT4 gRNA在72h的培养基中均具有可测量的FVIII活性水平，范围为0.2到0.6mIU/ml。这些数据表明，CRISPR/Cas9基因编辑组分与含有相同gRNA切割位点的AAV递送的供体的组合可能导致供体编码的FVIII转基因的表达。因为编码于AAV供体中的FVIII基因不具有启动子或信号肽并且因为SEAP表达需要基因编辑组分，所以有可能FVIII由整合到人类白蛋白内含子1中的供体的拷贝表达。进-退PCR是一种可以用于确认FVIII供体整合到人类白蛋白内含子1中的方法。
实例15：将因子IX供体靶向整合到由CRISPR/Cas9介导的NSG小鼠模型中的白蛋白 内含子1中导致因子IX的表达
为了证明将由CRISPR/Cas9裂解介导的基因盒靶向整合到白蛋白内含子1中可以用于其它目的基因，设计了其它实验以评估在给予含有FIX供体序列和LNP的基于AAV的载体后NSG小鼠中凝血因子IX(F9，FIX)的表达，所述LNP含有Cas9 mRNA和gRNA靶向白蛋白内含子1(SEQ ID NO:80)。FIX的生物学重要性已在血友病B(圣诞病)中得到证实，血友病B是由于FIX功能缺陷、定量(低活性和低抗原)和/或定性(低活性和正常抗原)缺陷导致的X连锁先天性出血性疾病。
在这些实验(CB1022)中所使用的AAV8载体的示意图展示于图17A中。将衍生自人类微小外围组织序列的填充片段并入到AAV载体中，以保持与上述实例14中所描述的编码FVIII的载体相似的大小，以便进行更直接的比较。序列表中的SEQ ID NO：105提供了编码FIX的密码子优化序列。在这些实验中，如Sharma等人所描述，通过使用来自亲和力生物试剂(Affinity Biologicals)的VisuLize hFactor IX抗原ELISA试剂盒评估FIX的表达。(《白蛋白位点的体内基因组编辑作为蛋白质替代疗法的平台(In vivo genome editing of the albumin locusas a platformfor proteinreplacement therapy.)》《血液》,126 (15)：1777-1784,2015)。据预测，相比于FVIII，FIX是一种较小的蛋白质，FIX相比于FVIII应该以更高的水平表达，这很可能是由于较小的AAV供体的整合效率更高。通过尾静脉注射在15只小鼠(三组，每组5只)中测试了三种不同剂量的AVV载体，以研究FIX的表达水平，如下所示：
表17：
Figure BDA0003117691830001231
四周之后，将冷冻LNP的总RNA剂量定为2mg/kg。这些实验中使用的LNP是包封Cas9mRNA或mALbgRNA_T1(SEQ ID NO:80)的冷冻LNP调配物，其中在注射前，按RNA质量计算，gRNA LNP和Cas9 mRNA LNP以1:1的比例混合。在单独的研究中显示相同的冷冻LNP调配物以2mg/kg产生33％的插入缺失。FIX表达水平是在LNP给药之后第10天和第24天经由眶后(RO)抽血测量的，方法是使用如Sharma等人所描述(2015，同上)的来自亲和力生物试剂的VisuLize hFactor IX抗原ELISA试剂盒，使用三种不同的抗原稀释：1:50、1:200；和1:400。如下表18所概括，在第10天，以1×1013(大约4％)和2×1012(大约1.5％)vg/kg的AAV8-CB1022载体给药的NSG小鼠中检测到低水平的hFIX活性。在第24天，在NSG小鼠中维持低水平的FIX，剂量为1×1013。在第24天评估靶向整合(TI)效率，并且结果概括于下表18和图17B中。
表18：
Figure BDA0003117691830001241
在该实施例中描述的结果证明，通过CRISPR/Cas9裂解介导的基因盒靶向整合到白蛋白内含子1中可以用于其他目的基因。
实例16：将Serpin G1供体靶向整合到由CRISPR/Cas9介导的NSG小鼠模型中的白 蛋白内含子1中导致Serpin G1的表达
本实例描述了用于证明CRISPR/Cas9介导的裂解可以用于小鼠Serpin G1/C1抑制剂基因的基因盒靶向整合到白蛋白内含子1中的实验结果。这些实验中使用的AVV载体(CB1045)的示意图如图18A所示，其中将来源于人类微小外围组织序列的填充片段并入到AAV载体中，以维持与以上实例14-15中所描述的编码FVIII和FIX的载体相似的大小，以允许进行更直接的比较。SERPING1基因编码C1抑制剂，所述C1抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)。C1抑制剂对于控制涉及维持血管(包括炎症)的一系列过程非常重要。炎症是对感染、刺激或其它伤害的正常身体反应。确切地说，C1抑制剂阻断血液中几种蛋白质的活性，包括血浆激肽释放酶和因子XII的活化形式。SERPING1中的突变导致遗传血管性水肿(HAE)，这是一种非常罕见且可能危及生命的遗传病，大约每50,000人中就有1到10,000人发生这种遗传病。
实验设计为经由AAV8将成熟的SERPIN G1 CDS递送到NSG小鼠中的白蛋白位点，并且经由CRISPR/Cas9整合。如图18A所示，与FVIII相比，SERPIN G1也是较短的供体序列，因此，AAV载体各自包括填充片段以维持包装能力。在这些实验中，通过来自艾博抗(Abcam)(ab224883)的人类C1抑制剂ELISA试剂盒测量了白蛋白的C1抑制剂表达。在这些实验中使用的成熟的SERPING1编码序列(CDS)在序列表中以SEQ ID NO：106的形式提供。通过尾静脉注射在15只小鼠(三组，每组5只)中测试了两种不同剂量的AVV载体CB1045，以研究SERPING1的表达水平，如下所示：
表20：
Figure BDA0003117691830001251
在四周之后，将冷冻的LNP以1mg/kg的总RNA向第1组和第2组中的动物给药。这些实验中使用的LNP是包封Cas9 mRNA或mALB gRNA(SEQ ID NO:80)的冷冻C12-200LNP调配物，其中在注射前，按RNA质量计算，gRNA LNP和Cas9 mRNA LNP以1:1的比例混合。使用来自艾博抗(ab224883)的人类C1抑制剂ELISA试剂盒，在LNP给药之后第11天和第17天经由眶后(RO)抽血测量SERPING1表达水平。如图18B中所概括，在第11天，在第1组和第2组的NSG小鼠中观察到了从小鼠mALB位点表达出的SERPING1活性。
本实例中所描述的结果进一步证实，CRISPR/Cas9介导的裂解可以用于将其它目的基因的基因盒靶向整合到白蛋白内含子1中，例如小鼠SERPING1基因。
尽管已经相对于几个所描述实施例以一定长度和一定特定性描述了本公开，但是本公开并不旨在应当限于任何此类细节或实施例或者任何特定实施例，而是应当参考所附权利要求书进行解释，以便根据现有技术提供对这种权利要求书的尽可能广泛的解释并且因此有效地涵盖本公开的预期范围。
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Claims (114)

1.一种系统，其包含：
脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸；
包含来自SEQ ID NO:22、21、28、30、18-20、23-27、29、31-44和104中的任一者的间隔序列的向导RNA(gRNA)，或编码所述gRNA的核酸；和
供体模板，其包含编码目的基因(GOI)或其功能衍生物的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:22、21、28和30中的任一者的间隔序列。
3.根据权利要求2所述的系统，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:22的间隔序列。
4.根据权利要求2所述的系统，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:21的间隔序列。
5.根据权利要求2所述的系统，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:28的间隔序列。
6.根据权利要求2所述的系统，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:30的间隔序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述DNA核酸内切酶识别具有序列NGG或NNGG的原间隔区相邻基序(PAM)，其中N是任何核苷酸或其功能衍生物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的系统，其中所述DNA核酸内切酶是II型Cas核酸内切酶或其功能衍生物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的系统，其中所述DNA核酸内切酶是Cas9。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的系统，其中编码所述DNA核酸内切酶的所述核酸经密码子优化以用于在宿主细胞中表达。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的系统，其中编码所述GOI或其功能衍生物的所述核酸序列经密码子优化以用于在宿主细胞中表达。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的系统，其中所述GOI编码选自由以下组成的组的多肽：治疗性多肽和预防性多肽。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的系统，其中所述GOI编码选自由以下组成的组的蛋白质：因子VIII(FVIII)蛋白质、因子IX(FIX)蛋白质、α-1-抗胰蛋白酶、因子XIII(FXIII)蛋白质、因子VII(FVII)蛋白质、因子X(FX)蛋白质、蛋白质C、丝氨酸蛋白酶抑制剂G1(serpin G1)其任一者的功能衍生物。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述GOI编码FVIII蛋白质其任一者的功能衍生物。
15.根据权利要求13所述的系统，其中所述GOI编码FIX蛋白质其任一者的功能衍生物。
16.根据权利要求13所述的系统，其中所述GOI编码丝氨酸蛋白酶抑制剂G1蛋白质其任一者的功能衍生物。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的系统，其中编码所述DNA核酸内切酶的所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的系统，其中编码所述DNA核酸内切酶的所述核酸是核糖核酸(RNA)。
19.根据权利要求18所述的系统，其中编码所述DNA核酸内切酶的所述RNA是mRNA。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的系统，其中所述供体模板在AAV载体中编码。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述供体模板包含供体盒，所述供体盒包含编码所述GOI或功能衍生物的所述核酸序列，并且其中所述供体盒的一侧或两侧上侧接gRNA靶位点。
22.根据权利要求21所述的系统，其中所述供体盒的两侧上侧接gRNA靶位点。
23.根据权利要求21或22所述的系统，其中所述gRNA靶位点是所述系统中gRNA的靶位点。
24.根据权利要求23所述的系统，其中所述供体模板的所述gRNA靶位点是所述系统中gRNA的基因组gRNA靶位点的反向补体。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的系统，其中所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。
26.根据权利要求25所述的系统，其中所述脂质体或脂质纳米颗粒还包含所述gRNA。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的系统，其包含与所述gRNA预复合的所述DNA核酸内切酶，形成核糖核蛋白(RNP)复合物。
28.一种编辑细胞中基因组的方法，所述方法包含：
向所述细胞提供以下各者：
(a)包含来自SEQ ID NO:22、21、28、30、18-20、23-27、29、31-44和104中的任一者的间隔序列的gRNA，或编码所述gRNA的核酸；
(b)DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸；和
(c)供体模板，其包含编码目的基因(GOI)或功能衍生物的核酸序列。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:22、21、28和30中的任一者的间隔序列。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:21的间隔序列。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:22的间隔序列。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:28的间隔序列。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:30的间隔序列。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述DNA核酸内切酶识别具有序列NGG或NNGG的原间隔区相邻基序(PAM)，其中N是任何核苷酸或其功能衍生物。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述DNA核酸内切酶是II型Cas核酸内切酶或其功能衍生物。
36.根据权利要求28至35中任一项所述的方法，其中所述DNA核酸内切酶是Cas9。
37.根据权利要求28至36中任一项所述的方法，其中编码所述DNA核酸内切酶的所述核酸经密码子优化以用于在所述细胞中表达。
38.根据权利要求28至37中任一项所述的方法，其中编码所述GOI或其功能衍生物的所述核酸序列经密码子优化以用于在所述细胞中表达。
39.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其中所述GOI编码选自由以下组成的组的多肽：治疗性多肽和预防性多肽。
40.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其中所述GOI编码选自由以下组成的组的蛋白质：FVIII蛋白质、FIX蛋白质、α-1-抗胰蛋白酶、FXIII蛋白质、FVII蛋白质、FX蛋白质、蛋白质C、serpin G1或其任一者的功能衍生物。
41.根据权利要求28至40中任一项所述的方法，其中编码所述DNA核酸内切酶的所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
42.根据权利要求28至40中任一项所述的方法，其中编码所述DNA核酸内切酶的所述核酸是核糖核酸(RNA)。
43.根据权利要求42所述的方法，其中编码所述DNA核酸内切酶的所述RNA是mRNA。
44.根据权利要求28至43中任一项所述的方法，其中所述供体模板在AAV载体中编码。
45.根据权利要求28至44中任一项所述的方法，其中所述供体模板包含供体盒，所述供体盒包含编码所述GOI或功能衍生物的所述核酸序列，并且其中所述供体盒的一侧或两侧上侧接gRNA靶位点。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述供体盒的两侧上侧接gRNA靶位点。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述gRNA靶位点是(a)的所述gRNA的靶位点。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述供体模板的所述gRNA靶位点是(a)的所述gRNA的所述细胞基因组中的gRNA靶位点的反向补体。
49.根据权利要求28至48中任一项所述的方法，其中所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述脂质体或脂质纳米颗粒还包含所述gRNA。
51.根据权利要求28至50中任一项所述的方法，其包含向所述细胞提供与所述gRNA预复合的所述DNA核酸内切酶，形成RNP复合物。
52.根据权利要求28至51中任一项所述的方法，其中在将(c)的所述供体模板提供到所述细胞之后超过4天，将(a)的所述gRNA和(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸提供到所述细胞。
53.根据权利要求28至52中任一项所述的方法，其中在将(c)提供到所述细胞之后至少14天，将(a)的所述gRNA和(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸提供到所述细胞。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其中在第一剂量的(a)的所述gRNA和(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸之后，向所述细胞提供一个或多个额外剂量的(a)的所述gRNA和(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸。
55.根据权利要求54所述的方法，其中在所述第一剂量的(a)的所述gRNA和(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸之后，向所述细胞提供一个或多个额外剂量的(a)的所述gRNA和(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸，直到达到编码所述GOI或功能衍生物的所述核酸序列的靶向整合的目标水平和/或编码所述GOI或功能衍生物的所述核酸序列的表达的目标水平。
56.根据权利要求28至55中任一项所述的方法，其中编码所述GOI或功能衍生物的所述核酸序列在内源性白蛋白启动子的控制下表达。
57.根据权利要求28至56中任一项所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
58.一种遗传修饰的细胞，其中所述细胞的基因组通过根据权利要求28至57中任一项所述的方法编辑。
59.根据权利要求58所述的遗传修饰的细胞，其中编码所述GOI或功能衍生物的所述核酸序列在所述内源性白蛋白启动子的控制下表达。
60.根据权利要求58或59所述的遗传修饰的细胞，其中编码所述GOI或其功能衍生物的所述核酸序列经密码子优化以用于在所述细胞中表达。
61.根据权利要求58至60中任一项所述的遗传修饰的细胞，其中所述细胞是肝细胞。
62.一种治疗受试者的病症或健康状况的方法，所述方法包含：
向所述受试者中的细胞提供以下各者：
(a)包含来自SEQ ID NO:22、21、28、30、18-20、23-27、29、31-44和104中的任一者的间隔序列的gRNA，或编码所述gRNA的核酸；
(b)DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸；和
(c)供体模板，其包含编码目的基因(GOI)或功能衍生物的核酸序列。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:22、21、28和30中的任一者的间隔序列。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:22的间隔序列。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:21的间隔序列。
66.根据权利要求63所述的方法，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:28的间隔序列。
67.根据权利要求63所述的方法，其中所述gRNA包含来自SEQ ID NO:30的间隔序列。
68.根据权利要求62至67中任一项所述的方法，其中所述GOI编码选自由以下组成的组的多肽：治疗性多肽和预防性多肽。
69.根据权利要求62至67中任一项所述的方法，其中所述GOI编码选自由以下组成的组的蛋白质：FVIII蛋白质、FIX蛋白质、α-1-抗胰蛋白酶、FXIII蛋白质、FVII蛋白质、FX蛋白质、蛋白质C、serpin G1其任一者的功能衍生物。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述GOI编码FVIII蛋白质其任一者的功能衍生物。
71.根据权利要求69所述的方法，其中所述GOI编码FIX蛋白质其任一者的功能衍生物。
72.根据权利要求69所述的方法，其中所述GOI编码丝氨酸蛋白酶抑制剂G1其任一者的功能衍生物。
73.根据权利要求62至72中任一项所述的方法，其中所述受试者是患有或疑似患有选自由以下组成的组的病症或健康状况的患者：血友病A、血友病B、MPS II、MPS1H、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、FXIII缺乏、FVII缺乏、FX缺乏、蛋白质C缺乏和HAE。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述受试者是患有或疑似患有血友病A的患者。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述受试者是患有或疑似患有血友病B的患者。
76.根据权利要求73所述的方法，其中所述受试者是患有或疑似患有HAE的患者。
77.根据权利要求62至72中任一项所述的方法，其中所述受试者诊断为具有选自由以下组成的组的病症或健康状况的风险：血友病A、血友病B、MPS II、MPS1H、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、FXIII缺乏、FVII缺乏、FX缺乏、蛋白质C缺乏和HAE。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述受试者是诊断为具有血友病A的风险的患者。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述受试者是诊断为具有血友病B的风险的患者。
80.根据权利要求77所述的方法，其中所述受试者是诊断为具有HAE的风险的患者。
81.根据权利要求62至80中任一项所述的方法，其中所述DNA核酸内切酶识别具有所述序列NGG或NNGG的原间隔区相邻基序(PAM)，其中N是任何核苷酸；或其功能衍生物。
82.根据权利要求62至81中任一项所述的方法，其中所述DNA核酸内切酶是II型Cas核酸内切酶或其功能衍生物。
83.根据权利要求62至82中任一项所述的方法，其中所述DNA核酸内切酶是Cas9。
84.根据权利要求62至83中任一项所述的方法，其中编码所述DNA核酸内切酶的所述核酸经密码子优化以用于在所述细胞中表达。
85.根据权利要求62至84中任一项所述的方法，其中编码所述GOI或其功能衍生物的所述核酸序列经密码子优化以用于在所述细胞中表达。
86.根据权利要求62至85中任一项所述的方法，其中编码所述DNA核酸内切酶的所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
87.根据权利要求62至85中任一项所述的方法，其中编码所述DNA核酸内切酶的所述核酸是核糖核酸(RNA)。
88.根据权利要求87所述的方法，其中编码所述DNA核酸内切酶的所述RNA是mRNA。
89.根据权利要求62至88中任一项所述的方法，其中(a)的所述gRNA、(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸和(c)的所述供体模板中的一种或多种调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。
90.根据权利要求62至89中任一项所述的方法，其中所述供体模板在AAV载体中编码。
91.根据权利要求62至90中任一项所述的方法，其中所述供体模板包含供体盒，所述供体盒包含编码所述GOI或功能衍生物的所述核酸序列，并且其中所述供体盒的一侧或两侧上侧接gRNA靶位点。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述供体盒的两侧上侧接gRNA靶位点。
93.根据权利要求91或92所述的方法，其中所述gRNA靶位点是(a)的所述gRNA的靶位点。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述供体模板的所述gRNA靶位点是(a)的所述gRNA的所述细胞基因组中的所述gRNA靶位点的所述反向补体。
95.根据权利要求62至94中任一项所述的方法，其中向所述细胞提供所述供体模板包含向所述受试者给予所述供体模板。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述给予是经由静脉内途径。
97.根据权利要求62至96中任一项所述的方法，其中所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸调配于脂质体或脂质纳米颗粒中。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述脂质体或脂质纳米颗粒还包含所述gRNA。
99.根据权利要求98所述的方法，其中向所述细胞提供所述gRNA和所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸包含向所述受试者给予所述脂质体或脂质纳米颗粒。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述给予是经由静脉内途径。
101.根据权利要求62至100中任一项所述的方法，其包含向所述细胞提供与所述gRNA预复合的所述DNA核酸内切酶，形成RNP复合物。
102.根据权利要求62至101中任一项所述的方法，其中在将(c)的所述供体模板提供到所述细胞之后超过4天，将(a)的所述gRNA和(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸提供到所述细胞。
103.根据权利要求62至102中任一项所述的方法，其中在将(c)的所述供体模板提供到所述细胞之后至少14天，将(a)的所述gRNA和(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸提供到所述细胞。
104.根据权利要求102或103所述的方法，其中在所述第一剂量的(a)的所述gRNA和(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸之后，将一个或多个额外剂量的(a)的所述gRNA和(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸提供到所述细胞。
105.根据权利要求104所述的方法，其中在所述第一剂量的(a)的所述gRNA和(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸之后，向所述细胞提供一个或多个额外剂量的(a)的所述gRNA和(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸，直到达到编码所述GOI或功能衍生物的所述核酸序列的靶向整合的目标水平和/或编码所述GOI蛋白质或功能衍生物的所述核酸序列的表达的目标水平。
106.根据权利要求102至105中任一项所述的方法，其中向所述细胞提供(a)的所述gRNA和(b)的所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸包含向所述受试者给予脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含编码所述DNA核酸内切酶的核酸和所述gRNA。
107.根据权利要求102至106中任一项所述的方法，其中向所述细胞提供(c)的所述供体模板包含向所述受试者给予在AAV载体中编码的所述供体模板。
108.根据权利要求62至107中任一项所述的方法，其中编码所述GOI或功能衍生物的所述核酸序列在所述内源性白蛋白启动子的控制下表达。
109.根据权利要求62至108中任一项所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
110.根据权利要求62至109中任一项所述的方法，其中编码所述GOI或功能衍生物的所述核酸序列在所述受试者的肝脏中表达。
111.一种治疗受试者的血友病A、血友病B或遗传性血管性水肿的方法，其包含：
向所述受试者给予根据权利要求58至61中任一项所述的遗传修饰的细胞。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述遗传修饰的细胞对受试者是自体的。
113.根据权利要求111或112所述的方法，其进一步包含：
从所述受试者获得生物样本，其中所述生物样本包含肝细胞，其中所述遗传修饰的细胞由所述肝细胞制备。
114.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至27中任一项所述的系统的一个或多个元件，并且进一步包含使用说明书。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114496063A (zh) * 2022-01-13 2022-05-13 北京博康健基因科技有限公司 基于天然氨基酸序列的信号肽设计与二级结构从头算建模方法和装置
WO2024094009A1 (zh) * 2022-10-31 2024-05-10 苏州荷光科汇生物科技有限公司 用于目的基因的表达盒及其应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202111256XA (en) 2019-06-07 2021-11-29 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized albumin locus
WO2022093863A1 (en) * 2020-10-26 2022-05-05 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Chimeric antigen receptor (car) nk cells and uses thereof
WO2024006960A1 (en) * 2022-06-29 2024-01-04 Juno Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
WO2024157194A1 (en) * 2023-01-25 2024-08-02 Crispr Therapeutics Ag Methods and assays for off-target analysis

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014186585A2 (en) * 2013-05-15 2014-11-20 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
CN105567735A (zh) * 2016-01-05 2016-05-11 华东师范大学 一种凝血因子基因突变的定点修复载体系统及方法
WO2017077386A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of glycogen storage disease type 1a

Family Cites Families (136)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
WO1988010264A1 (en) 1987-06-24 1988-12-29 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
EP0745689A3 (en) 1990-05-11 1996-12-11 Microprobe Corporation A dipstick for a nucleic acid hybridization assay
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
DE69126530T2 (de) 1990-07-27 1998-02-05 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad, Calif. Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
BR9106729A (pt) 1990-08-03 1993-07-20 Sterling Winthrop Inc Composto,processos para inibir a degradacao por nuclease de compostos e para estabilizar sequencias de nicleotideos ou oligonucleosideos,composicao utilizavel para inibir expressao de genes e processo para inibir expressao de genes em um mamifero necessitando de tal tratamento
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
CA2092002A1 (en) 1990-09-20 1992-03-21 Mark Matteucci Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
KR930702373A (ko) 1990-11-08 1993-09-08 안토니 제이. 페이네 합성 올리고누클레오티드에 대한 다중 리포터(Reporter)그룹의 첨합
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
WO1995013365A1 (en) 1993-11-09 1995-05-18 Targeted Genetics Corporation Generation of high titers of recombinant aav vectors
JP3952312B2 (ja) 1993-11-09 2007-08-01 メディカル カレッジ オブ オハイオ アデノ関連ウイルス複製遺伝子を発現可能な安定な細胞株
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
CA2625279A1 (en) 1995-08-30 1997-03-06 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and aav
AU715543B2 (en) 1995-09-08 2000-02-03 Genzyme Corporation Improved AAV vectors for gene therapy
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
CA2830694C (en) 1997-09-05 2018-02-27 Genzyme Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
CA2406743A1 (en) 2000-04-28 2001-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US9209196B2 (en) 2011-11-30 2015-12-08 Sharp Kabushiki Kaisha Memory circuit, method of driving the same, nonvolatile storage device using the same, and liquid crystal display device
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
DE202013012241U1 (de) 2012-05-25 2016-01-18 Emmanuelle Charpentier Zusammensetzungen für die durch RNA gesteuerte Modifikation einer Ziel-DNA und für die durch RNA gesteuerte Modulation der Transkription
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
EP3757116A1 (en) * 2013-12-09 2020-12-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for genome engineering
JP6202701B2 (ja) 2014-03-21 2017-09-27 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及びプログラム
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法
JP6976249B2 (ja) * 2015-11-23 2021-12-08 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫を工学操作するための方法および組成物
WO2017093804A2 (en) * 2015-12-01 2017-06-08 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of alpha-1 antitrypsin deficiency
WO2018170150A2 (en) * 2017-03-16 2018-09-20 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Engraftable cell-based immunotherapy for long-term delivery of therapeutic proteins
KR20200067190A (ko) * 2017-10-17 2020-06-11 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 A형 혈우병을 위한 유전자 편집용 조성물 및 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014186585A2 (en) * 2013-05-15 2014-11-20 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
WO2017077386A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of glycogen storage disease type 1a
CN105567735A (zh) * 2016-01-05 2016-05-11 华东师范大学 一种凝血因子基因突变的定点修复载体系统及方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114496063A (zh) * 2022-01-13 2022-05-13 北京博康健基因科技有限公司 基于天然氨基酸序列的信号肽设计与二级结构从头算建模方法和装置
WO2024094009A1 (zh) * 2022-10-31 2024-05-10 苏州荷光科汇生物科技有限公司 用于目的基因的表达盒及其应用

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